Περίληψη Διατριβής Ειρήνη Φρυλίγγον Κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής έγινε προσπάθεια, με βάση την κατανόηση της παθοφυσιολογίας της ΣΚΠ, να ελεγχθεί η ανοσολογική επίθεση στη μνελίνη, χωρίς να κατασταλεί ευρύτερα το ανοσοποιητικό σύστημα. Συγκεκριμένα, έγιναν: (α) Σύνθεση γραμμικών πεπτιδικών αναλόγων, τα οποία είναι υπεύθυνα για εμφάνιση ΣΚΠ (Πίνακας 1). (β) Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων, γραμμικών και κυκλικών, που φέρουν το δεκαπεπτίδιο (Lys-Gly)5 ως γέφυρα σύνδεσης με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη (Πίνακας 2). (γ) Σύνθεση πολνπεπτιδίον με βάση το copolymer-] και το δεκαπεπτίδιο (Lys-Gly)5 ως γέφυρα σύνδεσης με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη (Πίνακας 2). (δ) Σύνθεση πεπτιδικών δενδριμερών (MAPs) που φέρουν το τετραπεπτίδιο (LysGly)Ζ ως γέφυρα σύνδεσης με τον πολυσακχαρίτη μαωάνη (Πίνακας 3). (ε) Σύνθεση αναλόγων ανθρακινονών (Σχ. 1) και σύζευξή τους με πεπτιδικά ανάλογα (Σχ. 2). H σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων έγινε είτε με το συμβατικό τρόπο είτε με τη χρήση μικροκυμάτων. ι ρητίνες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι CLTR-C1, Wang και NovaSynTGA, οι οποίες συνδυάζονται με την Fmoc/tBu μεθοδολογία. Μερικά από τα πεπτιδικά ανάλογα που συντέθηκαν συζεύχθηκαν με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη στην οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή τον (Πίνακας 4). H σύζευξη με τη μαννάνη έγινε σε υγρή φάση και ο έλεγχος της σύζευξης έγινε με RP-HPLC χρωματογραφία.
Πίνακας 1: Πεπτιδικά ανάλογα που συντέθηκαν και είναι υπεύθυνα για εμφάνιση ΣΚΠ. Αριθ. Συμβολισμός αναλ. Πίνακας 2: Πεπτιδικά ανάλογα που συντέθηκαν και φέρουν το δεκαπεπτίδιο (Lys-Gly)5. Αριθ. Συμβολισμός αναλ. `1) (Lys-Gly)5- Βοc-ΜG ια6-ι5α HUMAN (3) ΜOG35-55 RAT ΜG ια6-ι5α ΗUΜΑΝ (4) ΒC-ΜΒΡ83-99 (5) BOC-ΜΒΡ83-99(Α1α88) (6) ΜΒΡ83-99(Α1α88) (7) ΒOc-ΜΒΡ83-99(Α1α86) (9) ΜΒΡ83_99 (Ala86) (10) ΜG97-ιο8 (14) MOG35-55HUMAN (17) ΒOC-Μ0G35 RAT Τ (Lys-Gly)5- Μ0G35-55 RAT-βΑΙa-Lys-(Gly-Lys)2 Μ0G35-55 RAT-βΑΙa MΒΡ83_99-βΑ1α-Lyys-(Gly-Lys)2 ΜΒΡS3_99-βΑΙa ΜΒΡ83_99-βΑ1α-Lys-(Gly-Lys)2 Μ35-55 RΑΤ-βΑΙa (8) ΜΒΡ83-99(Α1α88) (Lys-Gly)5ΜΒΡ83-99(Α1α86) Πίνακας 3: Πεπτιδικά δενδριμερή (MAPs) που συντέθηκαν και φέρουν το τετραπεπτίδιο (Lys-Gly)2. Συμβολισμός (2) Αριθ. (Lys-Gly)5-ΜΒΡ87-99 (Arg91, Ala96) (12) (Lys-Gly)5-cyclO(91-99) ΜΒΡ83 (13) (Lys-Gly)5-Μ0G97_108 (15) [(Lys-Gly)5-(Glu, Ala, Lys, Tyr)]Χ (18) (Lys-Gly)5-ΜOG35-5512ΑΤ (16) Πίνακας 4: Πεπτιδικά ανάλογα που συζεύχθηκαν με τη μαωάνη. αναλ Συμβολισμός (Lys-Gly)5-ΜOG35-55 RAT (19) (Lys-Gly)5-ΜΒΡ83-99(Α1α88) (20) (11) (Lys-GIy)5-ΜΒΡ83-99(ΑΙα8b) 9ι (Lys-Gly)5-ΜΒΡ87-99(Αrg, Ala96) (Lys-Gly)5-cyclO(91-99)ΜΒΡ83_99 (Lys-Gly)5-ΜOG97_ ι ο8 (21) (Lys-Gly)5-MOG35-55HUMΆN (Lys-Gly)5-ΡLΡ ι39-ι 5 ι [(Lys-Gly)5-(Glu, Ala, Lys, Tyr)]Χ ΜOG35-55 RAT-βΑ1α-Lys-(GIy-Lys)2 ΜOG35-55 RAT-βΑlα ΜΒΡ83_ς9-β Α1α-Lys-(G ly-lys)2 ΜΒΡ83-99-βΑ1α
29 1, 4-δις-(4-αμινο-βουτυλαμιυο)-ανθρακινόνη Η 30 I -(αμwο.βουτυλαμινο)-4-υδροξυ-ανθρακινόνη 33 I,4-διφθορο-5 8-διυδpοξνανΘρακινόνη 36 3,6-διμεθοξυφθαλικός αωδρίτης Σχήμα 1: Ανάλογα που συντέθηκαν για τη σύνθεση αναλόγων ανθρακινονών. NH-MOGasss OH 32 Σχήμα 2: Ανάλογο ανθρακινόνης που συζεύχθηκε με πεπτιδικό ανάλογο. Τέλος, έγινε προσπάθεια σύνθεσης MAPs με ορθογωνική σύνδεση (chemical ligation) μέσω Θειοαιθέρα. Για το σκοπό συντέθηκαν τα πεπτιδικά ανάλογα Cys(StBu)-ΜΒΡ83-99 (22), Cys(StBu)-MOG3s-ssRAT (23) και (BrAc)2-Lys-(Gly-Lys)2-Η (24). Μερικά από τα πεπτιδικά ανάλογα που συζεύχθηκαν με τη μαωάνη δοκιμάστηκαν: (i) In vivo σε πειραματόζωα για την ικανότητά τούς να προκαλούν ή να αναστέλλουν την εμφάνιση της ΕΑΕ σε τρία διαφορετικά μοντέλα και μας οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η προστασία των ζώων πραγματοποιείται από τους εγκεφαλιτογόνους επιτόπονς συζευγμένους στη μαωάνη (antigen specific) και όχι
από επιτόπους προερχόμενούς από τις πρωτεΐνες της μνελίνης οι οποίοι δεν εμφανίζουν εγκεφαλιτογόνο δράση. (ii) In vitro σε αίματα ασθενών με ΣΚΠ ως προς την ικανότητά τους να αυξάνουν τον πληθυσμό των Τ-ρυθμιστικών (Tr) κυττάρων. Τα πεπτιδικά ανάλογα που αυξάνουν σημαντικά τον πληθυσμό των Tr κυττάρων είναι τα Μαη`α -(Lys- Gly)5-ΜG35.55(Ser42) και Μαη Χ -(Lys-Gly)5-ΜΒΡ83_99(Α1α88). ~
Summary The aim of this thesis was to immunologically control the attack of myelin sheath in MS patients without the total suppression of the immune system. The thesis was focused on the synthesis of the following molecules: (a) Linear peptide analogues based on myelin epitopes (Table 1). (b) Linear and cyclic peptide analogues conjugated with mannan via the decapeptide (Lys-Gly)5 as a bridge (Table 2, 4). (c) A polypeptide, based on copolymer-1, conjugated with mannan via the decapeptide (Lys-Gly)5 as a bridge (Table 2, 4). (d) Peptide dendrimers (MAPs) conjugated with mannan via the tetrapeptide (LysGly)2 as a bridge (Table 3, 4). (e) Anthraquinone type analogues (Fig. 1) in combination with peptide analogues (Fig. 2). The synthesis of peptide analogues was achieved either conventionally or with microwave irradiation. The resins utilized were CLTR-Cl, Wang and NovaSynTGA, which are combined with Fmoc/tBu methodology. The conjugation of peptides with mannan was performed in solution, while the reaction was monitored with RP-HPLC. ~
Table 1: Synthesized peptide analogues based on myelin epitopes. Νο Symbol Anal. Table 2: Synthesized peptide analogues with the decapeptide (Lys-Gly)5. No Symbol Anal. Βοc-MOG35-55 RAT (1) (Lys-Gly)s- Βοε-ΜGια6-ι5α HUMAN (3) MOG3s-55 RAT ΜGια6-ι5α HUMAN (4) B0C-ΜΒΡ83-99 (5) Βε-ΜΒΡ83-99(Α1α88) (6) ΜΒΡ83-99(Α1α88) (7) Βοε-ΜΒΡ83-99(Α1α86) (9) 1V1ΒΡ83-99 (Α1α86) (10) MOG97-ιο8 (14) MOG35-55Ι-lUMAN (17) (2) (Lys-Gly)51v1ΒΡ83-99(Α1a88 (Lys-Gly)5- Table 3: Synthesized peptide dendrimers (MAPs) with the tetrapeptide (LysGly)2 ( `g) ) 86) ΜΒΡ83-99(Α1α (11) 9i (Lys-Gly)5-ΜΒΡ87-99(Αrg, Α1α96) (12) (Lys-Gly)s-cyclo(91-99) ΜΒΡ83_99 (13) (Lys-Gly)s-ΜOG9,_ιο8 (15) [(Lys-Gly)s-(Glu, Ala, Lys, Tyr)]Χ (18) (Lys-Gly)s-MOG35-ss RAT (16) Table 4: Peptide analogues conjugated with mannan. Symbol (Lys -Gly)s-MOG35-55 RAT (Lys-G l y)s-μβρ83-99(α1 α88) (Lys-G1y)5-ΜΒΡ83-99(Α1α86) (Lys-Gly)5-ΜΒΡ87-99(ΑΓg91, Ala96) Symbol ΜOG35-55 RAT-βΑΙα-Lys-(Gly-Lys)2 MOG35-55 RΑΤ-βΑΙa ΜΒΡ83_99-βΑΙa-Lys-(G1y-Lys)2 ΜΒΡ83-99-βΑ1a ΜΒP83_99-βΑΙa-Lyys-(G1y-Lys)2 - ΜOG35 55 RAT βαια No Anal. (19) (Lys-Gly)5-cyclo(91-99)ΜΒΡ83_99 (Lys-Gly)s-MOG97-ι ο8 (Lys-Gly)s-MOG35-55ΗUΜΑΝ (Lys-Gly)s-ΡLΡι 39-ι 5 ι [(Lys-Gly)s-(Glu, Ala, Lys, Tyr)]χ (20) (21) MOG35-55 ΣΖΑΤ-βΑ1α-Lys-(Gly-Lys)2 MOG35-55 RAT-βΑ1α ΜΒP83_99-βΑ1α-Lys-(G ly-lys)2 ΜΒΡ83-99-βΑ1α
O 29 1,4-bίs(4-aminobutylamino)anthracene-9,10-dione Η 30 Ι (4-aminοbυtyΙaminο)-4-hydrοΧyanthraCefle-9, lo-dione OH Me0, OMe O OH 33 Ι,4dif1υοτο-5,8-dihydrΧyaΩthraCefle- 9,10-dione 0 36 3,6-dimethoxyphthalίc anhydride Figure 1: Analogues for the synthesis of anthraquinones. ΝΗ-MOG, σs 01-1 Table 2: Anthraquinone analogue conjugated with peptide. 32 In order to synthesize MAPs based on chemical ligation technique (thioether chemistry), the Cys(StΒu)-ΜΒΡ83.99 (22), Cys(StΒu)-ΜG3s-s5RΑΤ (23) and (ΒrΑc)2-Lys-(Gly- Lys)2-Η (24) were synthesized. Some of the peptides conjugated with mannan were tested: (i) In vivo for their ability to induce or inhibit the EAE in three different animal models and the results suggested that the protection of the animals was due to
encephalitogenic epitopes conjugated with mannan (antigen specific) rather than no encephalitogenic myelin epitopes. (ii) In vitro in peripheral blood of patient donors for their ability to induce T regulatory cells (Tr). The peptide analogues that significantly increase the proliferation of Tr were ΜanΓed -(Lys-Gly)5-Μ35-55(Ser42) and Μan " -(Lys- Gly)5-ΜΒρ83-99(Α1a88). Φ