ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΦΩΤΟΦΥΣΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΠΟΣΒΕΣΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΝΙΚΟΛΙΤΣΑ Α.Μ.:431 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΜΙΧΑΛΗΣ ΦΑΚΗΣ 2015
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με την ολοκλήρωση της παρούσας ειδικής ευρενητικής εργασίας μου δίνεται η ευκαιρία να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που με στήριξαν σε όλες μου τις προσπάθειες κατά την εκπόνησή της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή κ. Μιχάλη Φακή, Επίκουρο του Τμήματος Φυσικής του Πανεπιστημίου Πατρών για την συνεργασία που είχαμε και τον χρόνο που διέθεσε σε αυτήν, δίνοντας μου τις συμβουλές του. Ευχαριστώ, τους καθηγητές κ. Βασίλειο Γιαννετα και κ. Πέτρο Περσεφόνη για τα υποστηρικτικά τους λόγια κατά την διάρκεια των σπουδών μουκαθώς και τον κ. Λεωνίδα Παλλίλη μέλος της τριμελούς επιτροπής της εργασίας μου. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο Διδάκτορα Κωνσταντίνο Σεϊντή για την καθημερινή βοήθειά του σε όποια δυσκολία και να αντιμετώπιζα. Τους συναδέρφους μου Ευρυπίδη Μιχαήλ, Δαμιανό Αγαθαγγέλου και Νίκο Δροσερό για τις φιλικές τους συμβουλές. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου και την αδερφή μου που πίστευαν και συνεχίζουν να πιστεύουν στις δυνατότητες μου, την φίλη μου Ευαγγελία Παπαδοπούλου για την ανεξάντλητη υπομονή και κατανόηση της καθώς και τους φίλους μου στην Αθήνα που όταν βρίσκομαι εκεί με κάνουν να αισθάνομαι σα να μην έχει περάσει ούτε μια μέρα από τότε που έφυγα. i
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα Ειδική Ερευνητική Εργασία μελετόνται οι φωτοφυσικές ιδιότητες γνωστών χρωμοφόρων μορίων. Συγκεκριμένα μελετάται η Coumarin 30, η Fluorescein Isothiocyanate και η Dichlorofluorescein, τόσο με φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης όσο και με φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης μέσω της τεχνικής Time Correlated Single Photon Counting. Η διερεύνηση γίνεται με τα μόρια αυτά να βρίσκονται σε μορφή διαλυμάτων με στόχο τον προσδιορισμό της συμπεριφοράς τους όταν αυτά βρισκονται σε διαφορετικά περιβάλλοντα (διαλύτες). Επιπλέον ερευνώνται οι αλληλεπιδράσεις των μορίων αυτών μέσω της φασματοσκοπίας σταθερής κατάστασης και χρονικής ανάλυσης όταν βρίσκονται σε μορφή μειγματών. ABSTRACT In this Master Thesis, the phophysical properties of chromophrores are investigated. Specifically, Coumarin 30, Fluorescein Isothiocyanate and Dichlorofluorescein are studied with steady state spectroscopy as well as with time resolved spectroscopy via the technique of Time Correlated Single Photon Counting. The study of these molecules focuses also on solvent solute effects. Finally, interactions between them are also studied through steady state spectroscopy and time resolved spectroscopy. ii
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Eυχαριστίες......i Περίληψη....ii Κεφάλαιο 1. Οι βασικές αρχές του φθορισμού... 1 1.1 Εισαγωγή. Αλληλεπίδραση ύλης-φωτός... 1 1.2 Μηχανισμοί μεταβάσεων ενός μορίου μετά την διέγερσή του... 2 1.2.1 Δονητική αποδιέγερση... 4 1.2.2 Εσωτερική μετατροπή... 4 1.2.3 Φθορισμός... 5 1.2.4 Σταθμική διασταύρωση... 6 1.2.5 Φωσφορισμός... 6 1.2.6 Φθορισμός με χρονική καθυστέρηση... 7 1.2.7 Μετάβαση από κατάσταση triplet σε κατάσταση triplet... 7 1.3 Χρόνος ζωής και κβαντική απόδοση... 8 1.3.1 Χρόνος ζωής διεγερμένης κατάστασης... 8 1.3.2 Κβαντική απόδοση... 10 1.4 Απόσβεση φθορισμού... 11 1.4. 1 Δυναμική απόσβεση φθορισμού... 11 1.4.2 Στατική απόσβεση φθορισμού... 13 1.4.3 Μεταφορά ενέργειας... 15 1.4.4 Άλλα φαινόμενα που προκαλούν την απόσβεση φθορισμού... 18 1.5 Η επίδραση της δομής των μορίων στον φθορισμό... 20 Κεφάλαιο 2. Η επίδραση του περιβάλλοντος στον φθορισμό... 23 2.1 Εισαγωγή... 23 2.2 Ομοιογενής και ανομοιογενής διεύρυνση φασμάτων απορρόφησης και εκπομπής φθορισμού... 23 2.3 Η Επίδραση της πολικότητας του διαλύτη στο φθορισμό... 24 2.4 Γενικές αλληλεπιδράσεις διαλύτη φθοροφόρου μορίου... 25 2.4.1 Η εξίσωση Lippert Mataga... 28 2.5 Ειδικές αλληλεπιδράσεις διαλύτη - φθοροφόρου... 30 2.6 Ενδομοριακήμεταφοράφορτίου (Intramolecular charge transfer)... 32 Κεφάλαιο 3. Ανισοτροπία φθορισμού... 34 3.1 Εισαγωγή. Πόλωση φθορισμού... 34 iii
3.2 Προσδιορισμός της ανισοτροπίας φθορισμού... 36 3.3 Θεωρητικός προσδιορισμός της ανισοτροπίας φθορισμου... 38 3.4 Πειραματικός προσδιορισμός της ανισοτροπίας φθορισμού... 41 3.4.1Γεωμετρία L... 42 3.4.2Γεωμετρία Τ... 44 3.5 Η επίδραση της περιστροφής των μορίων στον προσδιορισμό της ανισοτροπίας... 44 3.6 Η επίδραση του περιβάλλοντος στην περιστροφή και την ανισοτροπία ενός φθοροφόρου μορίου... 45 Κεφάλαιο 4. Πειραματική μελέτη. Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης... 48 4.1 Εισαγωγή... 48 4.2 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης στην C30... 49 4.2.1 Γενικές πληροφορίες για την C30... 49 4.2.2 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής της C30... 49 4.2.3 Διάγραμμα Lippert Mataga για την C30... 51 4.3 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης για την FITC... 53 4.3.1 Γενικές πληροφορίες για την Fluorescein (FL)... 53 4.3.2 Γενικές πληροφορίες για την FITC... 54 4.3.3 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής της FITC... 54 4. 4 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης για την DCF... 56 4.4.1 Γενικές πληροφορίες για την DCF... 56 4.4.2 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής για την DCF... 56 4.5 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης σε μείγματα C30 με τα δύο παράγωγα μόρια fluorescein (FITC και DCF)... 59 4.5.1 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής μειγμάτων C30 με FITC... 62 4.5.2 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής μειγμάτων C30 με DCF... 66 Κεφάλαιο 5. Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης... 75 5.1 Εισαγωγή... 75 5.2 H τεχνική time correlated single photon counting (TCSPC)... 75 5.3 Προσδιορισμός μηχανισμών αποδιέγερσης από την καμπύλη μείωσης του φθορισμού (fittings)... 77 5.4 Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης στη C30. Καμπύλες αποδιέγερσης φθορισμού... 77 iv
5.5 Προσδιορισμός βέλτιστης καμπύλης από τα πειραματικά δεδομένα για την ανισοτροπία (fitting)... 82 5.6 Μελέτη της ανισοτροπίας για την C30... 82 5.7 Προσδιορισμός της ακτίνας της C30 με την βοήθεια της ανισοτροπίας... 84 5.8 Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης στην FITC. Καμπύλες αποδιέγερσης φθορισμού... 88 5.9 Μελέτη της ανισοτροπίας για τη χρωστική FITC... 92 5.10 Προσδιορισμός της ακτίνας της FITC με την βοήθεια της ανισοτροπίας... 94 5.11 Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης στην DCF. Καμπύλες αποδιέγερσης φθορισμού... 96 5.12 Μελέτη της ανισοτροπίας για την DCF... 101 5.13 Προσδιορισμός της ακτίνας της DCF με την βοήθεια της ανισοτροπίας... 103 5.14 Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης στα μείγματα της C30 με την FITC. Καμπύλες αποδιέγερσης φθορισμού... 105 5.15 Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης στα μείγματα της C30 με την DCF. Καμπύλες αποδιέγερσης φθορισμού... 108 5.16 Συμπεράσματα και μελλοντικήέρευνα....110 Βιβλιογραφία.. 111 v
Κεφάλαιο 1. Οι βασικές αρχές του φθορισμού 1.1 Εισαγωγή. Αλληλεπίδραση ύλης-φωτός Οι δύο βασικές διεργασίες που μπορούν να συμβούν μετά την πρόσπτωση του φωτός σε κάποιο υλικό είναι η σκέδασή του και η απορρόφησή του από αυτό. Η σκέδαση διακρίνεται σε ελαστική (Rayleigh) και ανελαστική (Raman, Brillouin) ενώ μετά την απορρόφησή του φωτός είναι δυνατό να ακολουθήσει η εκπομπή φωτός από αυτό (φθορισμός, φωσφορισμός) (Εικόνα 1.1). Από πολύ παλιά έχουν γίνει αναφορές για την ιδιότητα των υλικών να ακτινοβολούν μετά την έκθεσή τους στο φώς, όμως ο GeorgeGabrielStokes (Φυσικός και καθηγητής Μαθηματικών στο Πανεπιστήμιο του Cambridge, 1849-1903) ήταν ο πρώτος που ανέφερε ότι το εκπεμπόμενο φως είναι πάντα μεγαλύτερου μήκους κύματος από το προσπίπτον. Ο Stokes επικεντρώθηκε στο φαινόμενο του φθορισμού και ήταν αυτός που έδωσε και το όνομα του στο φαινόμενο, κατά το οποίο το μήκος κύματος του εκπεμπόμενου φθορισμού πρέπει να είναι πάντα μεγαλύτερο από το μήκος κύματος απορρόφησης. Εικόνα 1. 1 Αλληλεπίδραση ύλης φωτός. Η πιο γόνιμη περίοδος μελέτης των φαινομένων του φθορισμού και του φωσφορισμού ήταν από το 1918 έως το 1935 όπου αναπτύχθηκαν και οι βασικότερες αρχές τους. Η έρευνα πάνω στα φαινόμενα αυτά συνεχίζεται όμως μέχρι και σήμερα και αφορά σε δύο τομείς: (α) την μελέτη και καταγραφή πληροφοριών για τη δομή των υλικών καθώς και για την δυναμική τους συμπεριφορά και (β) την ανάπτυξη νέων μεθόδων και τεχνικών που βασίζονται στον φθορισμό ή φωσφορισμό (το Nobel Χημείας για το 2014, δώθηκε στους Eric Betzig, Stefan W. Hell και William E. Moerner, για την ανάπτυξη μιας τεχνικής μιρκοσκοπία φθορισμού που ονομάστηκε development of super resolved 1
fluorescence microscopy). Μια από τις βασικότερες μεθόδους για την συλλογή δεδομένων που αφορά σε νέα υλικά αποτελεί η μελέτη της απόσβεσης του φθορισμού. Αναφορικά, μερικά από τα φαινόμενα που προκαλούν την απόσβεση του φθορισμού είναι η εσωτερική μετατροπή, η σταθμική διαστάυρωση που πιθανόν ακολουθείται από την εκπομπή του φωσφορισμού, η διαμοριακή και ενδομοριακή μεταφορά ηλεκτρονίου, η μεταφορά πρωτονίων, η μεταφορά ενέργειας, η φωτοχημική μετατροπή ενέργειας,η δημιουργία διεγερμένων συμπλόκων (excimer, excited dimer) και η δημιουργία διεγερμένων διμερών διαφορετικών μορίων (exciplex, excited complex). Τα περισσότερα από τα παραπάνω θα αναλυθούν λεπτομεριακά στις παραγράφους που ακολουθούν. Όσον αφορά τα ακτινοβολούντα υλικά, αυτά μπορούν να διακριθουν σε τρείς βασικές κατηγορίες: Τα οργανικά υλικά: αρωματικοί υδρογονάνθρακες (ναφθαλένιο, ανθρακένιο, πυρένιο, περυλένιο κ.α.), φλουορεσκείνες, ροδαμίνες, κουμαρίνες, οξαζίνες, αμινοξέα (τρυπτοφάνη, τυροσίνη, φαινυλανίνη) κ.α. Τα ανόργανα υλικά: ιόν ουρανυλίου, ιόντα λανθανίδης, εμποτισμένα γυαλιά, κρύσταλλοι κ.α. Τα οργανομεταλικά υλικά: σύμπλοκα ρουθηνίου, σύμπλοκα με ιόντα λανθανίδης κ.α. 1.2 Μηχανισμοί μεταβάσεων ενός μορίου μετά την διέγερσή του Τα μόρια εκτός από ηλεκτρονιακές ενεργειακές στάθμες εμφανίζουν επίσης ενεργειακές δονητικές στάθμες (ή στάθμες ταλάντωσης) καθώς και ενεργειακές στάθμες περιστροφής οι οποίες προκαλούνται αντίστοιχα εξαιτίας ταλάντωσης και περιστροφής των μορίων. Σε κάθε ηλεκτρονιακή κατάσταση αντιστοιχούν αρκετές στάθμες ταλάντωσης και σε κάθε στάθμη ταλάντωσης αντιστοιχούν αρκετές στάθμες περιστροφής. Όλα αυτά φαίνονται σε ένα διάγραμμα Perrin -Jablonski όπως παρουσιαζεται στην εικόνα 1.2. 2
Εικόνα 1.2 Ηλεκτρονιακές στάθμες, δονητικές στάθμες και στάθμες περιστροφής ενός μορίου (διάγραμμα Perrin - Jablonski). Όταν ένα υλικό απορροφήσει ακτινοβολία, τα μόρια που το αποτελούν διεγείρονται δηλαδή μεταβαίνουν από την θεμελιώδη κατάσταση σε κάποια υψηλότερης ενέργειας. Η απορρόφηση του φωτός είναι πολύ γρήγορο φαινόμενο ( 10-15 s). Η αποδιέγερση των μορίων μπορεί να γίνει είτε ακτινοβολητικά είτε μη ακτινοβολητικά μέσω διαφόρων φαινομένων, τα οποία μπορουν να γίνουν ευκολότερα κανοητά με τη βοήθεια των διαγραμμάτων Perrin-Jablonski (σχήμα εικόνας 1.3). Στην συγκεκριμένη παράγραφο θα θεωρήσουμε ότι τα διεγερμένα μόρια βρίσκονται εντός διαλύματος, και θα αποφύγουμε τις φωτοφυσικές διεργασίες μεταξύ διαφορετικών μορίων όπως την μεταφορά ηλεκτρονίων, την μεταφορά πρωτονίων, την δημιουργία των excimer και exciplex κ.α. Επομένως, οι διεργασίες που μπορούν να ακολουθήσουν μετά την διέγερση ενός μορίου φαίνονται σχηματικά στην εικόνα 1.3 και περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω. [1] 3
Εικόνα 1.3 Δυνατοί τρόποι αποδιέγερσης ενός μορίου μέσω διαγράμματος Perrin - Jablonski. 1.2.1 Δονητική αποδιέγερση Όταν ένα μόριο είναι διεγερμένο σε κάποια στάθμη ταλάντωσης μιας ηλεκτρονιακής στάθμης είτε αυτή είναι singlet είτε triplet, το μόριο αυτό χάνει πολύ γρήγορα ενέργεια με έναν μηχανισμό που είναι γνωστός σαν δονητική αποδιέγερση, δηλαδή με διαδοχική μετάπτωση σε ενεργειακά χαμηλότερες δονητικές στάθμες. Η χρονική κλίμακα του φαινομένου αυτού κυμαίνεται μεταξύ των 10-12 με 10-10 s. 1.2.2 Εσωτερική μετατροπή Η εσωτερική μετατροπή είναι μια μη ακτινοβολητική μετάβαση μεταξύ δύο ηλεκτρονιακών καταστάσεων ίδιας πολλαπλότητας spin (Singlet-Singlet). Σε διαλύματα, η διαδικασία αυτή ακολουθείται μετά από την δονητική αποδιέγερση προς το χαμηλότερο δονητικό επίπεδο. Η περίσσεια δονητικής ενέργειας μπορεί να μεταφερθεί στα μόρια του διαλύτη μέσω συγκρούσεων αυτών με το διεγερμένο μόριο. Η εσωτερική μετατροπή είναι δυνατόν να συμβεί από το ενεγρειακό επίπεδο S 1 στο ενεργειακό επίπεδο S 0 αλλά είναι λιγότερο αποδοτική σε σύγκριση με την εσωτερική μετατροπή από το ενεγρειακό επίπεδο S 2 στο ενεργειακό επίπεδο S 1, λόγω του μεγαλύτερου ενεργειακού χάσματος. Επομένως, η εσωτερική μετατροπη μπορεί να αποτελέσει ανταγωνιστικό μηχανισμό για την εκπομπή φωτονίων (είτε φθορισμού είτε φωσφορισμού). Η εσωτερική μετατροπή έχει χαρακτηριστικό χρόνο 10-11 με 10-9 s. 4
1.2.3 Φθορισμός Η αποδιέγερση με εκπομπή φωτονίου από το ενεργειακό επίπεδο S 1 στο ενεργειακό επίπεδο S 0 ονομάζεται φθορισμός. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η εκπομπή του φθορισμού συμβαίνει από την S 1 (εκτός από μερικές εξαιρέσεις) και επομένως τα χαρακτηριστικά της είναι ανεξάρτητα από το μήκος κύματος διέγερσης (εκτός από την πόλωσή της). Ο χαρακτηριστικός χρόνος του φθορισμού είναι 10-10 -10-7 s. Το φάσμα του φθορισμού βρίσκεται σε μεγαλύτερα μήκη κύματος (χαμηλότερη ενέργεια) από αυτό της απορρόφησης. Αυτό οφείλεται στην απώλεια ενέργειας στην διεγερμένη κατάσταση λόγω της δονητικής αποδιέγερσης αλλά και από άλλες αλληλεπιδράσεις του διεγερμένου μορίου με το περιβάλλον του. Όπως ειπώθηκε στη παράγραφο 1.1, σύμφωνα με τον νόμο του Stokes, το μήκος κύματος του φθορισμού πρέπει πάντα να είναι μεγαλύτερο από αυτό της απορρόφησης. Η διαφορά μεταξύ του μέγιστου μήκους κύματος της απορρόφης με το μέγιστο μήκος κύματος την εκπομπής (φθορισμού) ονομάζεται μετατόπιση Stokes. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις το φάσμα απορρόφησης επικαλύπτει μερικώς το φάσμα εκπομπής, δηλαδή ένα μέρος του εκπεμπόμενου φωτός είναι σε μικρότερα μήκη κύματος από το απορροφούμενο.το φαινόμενο αυτό σύμφωνα με την εξήγηση που έδωσε για πρώτη φορά ο Einstein, οφείλεται στο γεγονός ότι σε θερμοκρασία δωματίου ένας μικρός πληθυσμός των μορίων βρίσκεται σε υψηλότερο από το θεμελιώδες δονητικό επίπεδο της S 0 στάθμης (η κατανομή των μορίων στα ενεγειακά επίπεδα υπακούει τον νόμο του Boltzmann). Γενικά, οι ενεργειακές διαφορές μεταξύ των δονητικών επιπέδων στις διεγερμένες και στη θεμελιώδη κατάσταση είναι παρόμοιες, με αποτέλεσμα το φάσμα εκπομπής να μοιάζει με το φάσμα απορρόφησης. Αυτή η συμπεριφορά είναι γνωστή ως κανόνας κατοπτρικού ειδώλου (mirror image rule, εικόνα 1.4). Πρέπει να γίνει κατανοητό ότι η εκπομπή φωτονίου είναι το ίδιο γρήγορη με την απορρόφησή του. Ωστόσο τα διεγερμένα μορία παραμένουν σε αυτή την κατάσταση για ένα συσκεκριμένο χρονικό διάστημα (από δεκάδες picosecondsέως μερικές εκαντοντάδες nanoseconds). Η διάρκεια αυτή εξαρτάται από το είδος του μορίου καθώς και το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται. Η εκπομπή του φθορισμού είναι μια αυθόρμητη διεργασία, όμως κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες είναι δυνατόν να παρατηρηθεί και εξαναγκασμένη εκπομπή (π.χ. σε lasers). 5
Εικόνα 1.4 Επικάλυψη φασμάτων απορρόφης και εκπομπής, mirrorimagerule. 1.2.4 Σταθμική διασταύρωση Η σταθμική διασταύρωση αποτελεί μία μη ακτινοβολιτική μετάβαση μεταξύ δύο δονητικών επιπέδων σχεδόν ίδιας ενέργειας που ανήκουν σε ηλεκτρονιακές καταστάσεις διαφορετικής πολλαπλότητας (Singlet-Triplet). Η σταθμική διασταύρωση είναι σχετικά αργό φαινόμενο (10-6 s) μη ικανό να ανταγωνιστεί τον φθορισμό και αυτό διότι η μετάβαση μεταξύ επιπέδων διαφορετικής πολλαπλότητας θεωρείται απαγορευμένη. Όμως η σύζευξη spin τροχιάς μπορεί να την κάνει ιδιαίτερα αποδοτική και ειδικά σε οργανομεταλλικές ενώσεις γίνεται ιδιαίτερα γρήγορα ( 10-12 ps). 1.2.5 Φωσφορισμός Στα διαλύματα, σε θερμοκρασία δωματίου, ο κυρίαρχος μηχανισμός αποδιέγερσης ενός μορίου που βρίσκεται στην Τ 1 είναι μη ακτινοβολητικός. Ωστόσο, η μετάβαση από Τ 1 στην S 0 μπορεί να γίνει και απευθείας με την εκπομπή φωτονίου. Η ακτινοβολία αυτή ονομάζεται φωσφορισμός. Στην πραγματικότητα, η συγκεκριμένη μετάβαση θεωρείται απαγορευμένη, αλλά είναι πιθανή μέσω της σύζευξης spin τροχιάς. Το φάσμα φωσφορισμού βρίσκεται σε μεγαλύτερα μήκη κύματος σε σύγκριση με αυτό του φθορισμού, αφού το χαμηλότερο δονητικό επίπεδο της triplet κατάστασης βρίσκεται χαμηλότερα από αυτό της singlet. Η χαρακτηριστική χρονική κλίμακα του φωσφορισμού είναι 10-6 με 1 s. 6
1.2.6 Φθορισμός με χρονική καθυστέρηση Δύο βασικές διεργασίες είναι δυνατόν να συμβούν με αποτέλεσμα την εκπομπή φθορισμού με χρονική καθυστέρηση. Η πρώτη αποτελεί την ανάστροφη μετάβαση σταθμικής διασταύρωσης (Τ 1 S 1 ), η οποία πραγματοποιείται όταν το ενεργειακό χάσμα των δύο καταστάσεων είναι πολύ μικρό και ο χρόνος παραμονής του μορίου στην Τ 1 είναι αρκετά μεγάλος. Το φάσμα εκπομπής σε αυτή την περίπτωση είναι ίδιο με αυτό του φθορισμού, ενώ ο χαρακτηριστικός χρόνος αποδιέγερσης είναι αρκετά μεγαλύτερος (λόγω παραμονής του μορίου στην Τ 1 ). Η αποδοτικότητα αυτού του φαινομένου εξαρτάται από την θερμοκρασία στην οποία βρίσκεται το μόριο (με αύξηση της θερμοκρασίας αυξάνεται και η αποδοτικότητα). Φθορισμός με χρονική καθυστέρηση παρατηρείται επίσης όταν μόρια που βρίσκονται σε triplet καταστάσεις συγκρούονται μεταξυ τους. Η σύγκρουση είναι ικανή να προσδώσει ενέργεια σε ένα από τα δύο μόρια με αποτέλεσμα αυτό να βρεθεί στην κατάσταση S 1. Ο χαρακτηριστικός χρόνος φθορισμού σε αυτήν την περίπτωση είναι ο μισός από τον χρόνο παραμονής του μορίου στην triplet κατάσταση. 1.2.7 Μετάβαση από κατάσταση triplet σε κατάσταση triplet Όταν ένα μόριο είναι διεγερμένο σε μία κατάσταση triplet είναι δυνατον να απορροφήσει επιπλέον φωτόνιο, διαφορετικού μήκους κύματος και να μεταβεί σε μία υψηλότερη κατάσταση triplet (πρόκειται για επιτρεπτή μετάβαση, Τ 1 Τ 2 ). Η συγκεκριμένη μετάβαση μπορεί να παρατηρηθεί όταν η triplet κατάσταση έχει μεγάλο πληθυσμό, ενώ η ακτινοβολία διέγερσης είναι παλμική. Στο πίνακα που ακολουθεί δίνονται συνοπτικά οι χαρακτηριστικοί χρόνοι των βασικότερων από τους παραπάνω μηχανισμών καθώς και η αγγλική τους ορολογία. [2] Χαρακτηριστικοί χρόνοι απορρόφηση / absorption 10-15 s δονητική αποδιέγερση / vibrational relaxation 10-12 -10-10 s εσωτερική μετατροπή / internal conversion 10-11 -10-9 s φθορισμός / fluorescence 10-10 -10-7 s σταθμική διασταύρωση / intersystem crossing 10-10 -10-8 s φωσφορισμός / phosphorescence 10-6 -1 s Πίνακας 1.1 Χαρακτηριστικοί χρόνοι μεταβάσεων των μορίων. 7
1.3 Χρόνος ζωής και κβαντική απόδοση Η μελέτη του χρόνου παραμονής ενός μορίου σε κάποια διεγερμένη κατάσταση (χρόνος ζωής), είναι απαραίτητη αφού μέσα σε αυτό το χρονικό διάστημα παρατηρούνται όλες οι δυναμικές διεργασίες που προκαλούνται από την αληλεπίδραση του μορίου με το περιβάλλον του. Η κβαντική απόδοση αποτελεί ένα βασικό χαρακτηριστικό των μορίων, αφού μπορεί να προσφέρει επιπλέον πληροφορίες, όπως για παράδειγμα στη στατική απόσβεση του φθορισμού η οποία δεν επηρεάζει τον χρόνο ζωής του μορίου. 1.3.1 Χρόνος ζωής διεγερμένης κατάστασης Στην εικόνα 1.5 φαίνονται όλοι οι πιθανοι τρόποι αποδιέγερσης ενός μορίου όταν αυτό βρίσκεται στο ενεργειακό επίπεδο S 1. Εικόνα 1.5Απλοποιημένο διάγραμμαperrin -Jablonski για την αποδιέγερση μορίου από την S 1. Oι σταθερές που εκφράζουν τους ρυθμούς με οποίους μειώνεται ο πληθυσμός της S 1 είναι:, μείωση του πληθυσμού μέσω εκπομπής φωτονίου φθορισμου, S 1 S 0 (ακτινοβολητική διεργασία)., μείωση του πληθυσμού μέσω εσωτερικής μετατροπής, S 1 S 0 (μη ακτινοβολητική διεργασία)., μείωση του πληθυσμού μέσω σταθμικής διασταύρωσης, S 1 Τ 1 (μη ακτινοβολητική διεργασία). Ενώ, οι σταθερές που εκφράζουν τους ρυθμούς με τους οποίους μειώνεται ο πληθυσμός της Τ 1 είναι: 8
, μείωση του πληθυσμού μέσω εκπομπής φωτονίου φωσφορισμού, Τ 1 S 0 (ακτινοβολητική διεργασία)., μείωση του πληθυσμού μέσω σταθμικής διασταύρωσης, Τ 1 S 0 (μη ακτινοβολητική διεργασία). Για τον υπολογισμό του χρόνου ζωής της S 1, θεωρούμε ένα διάλυμα μορίων συγκέντρωσης, το οποίο ακτινοβολείται από παλμικό φως με αποτέλεσμα ένας πληθυσμός των μορίων να διεγείρεται με απορρόφηση φωτονίων. Η αποδιέγερσή τους γίνεται είτε ακτινοβολητικά ), είτε μη ακτινοβολητικά ( ), επομένως ο ρυθμός μείωσης του πληθυσμού της S 1 περιγράφεται από τη παρακάτω διαφορική εξίσωση (1.1). (1-1) όπου, Με ολοκλήρωση της εξίσωσης (1-1), παρατηρούμε ότι η μείωση του πληθυσμού της καταστάσεωςs 1 συναρτήσει του χρόνου έχει εκθετική μορφή (εξίσωση 1.2). (1-2) όπου, είναι ο χρόνος ζωής της S 1 : (1-3) Επειδή πειραματικά δεν μετράται η συγκέντρωση των μορίων αλλά η ένταση του φθορισμού είναι απαραίτητο η εξίσωση (1-2) να μετατραπεί σε όρους εντάσεως. Η ένταση του φθορισμού ορίζεται ως το πλήθος των φωτονίων που εκπέμπονται ανα μονάδα χρόνου και ανα μονάδα όγκου. (1-4) Εάν ο μόνος τρόπος αποδιέγερσης από την S 1 στην S 0 ήταν με εκπομπή φωτονίου (φθορισμό), τότε ο χρόνος ζωής θα γινόταν. Ο χρόνος ονομάζεται ακτινοβολητικός χρόνος ζωής ή φυσικός χρόνος ζωής, ενώ μπορεί να υπολογιστεί και θεωρητικά με την βοήθεια των φασμάτων απορρόφησης και φθορισμού χρησιμοποιώντας την σχέση Strickler-Berg. 9
Ο χρόνος ζωής σε ομοιογενή δείγματα χρωμοφόρων όπως και το φάσμα εκπομπής είναι συνήθως ανεξάρτητα από το μήκος κύματος διέγερσης, (αφού η εσωτερική μετατροπή και η δονητική αποδιέγερση είναι γρήγορος μηχανισμός με αποτέλεσμα το φάσμα εκπομπής να προέρχεται από το χαμηλότερο δονητικό επιπεδο). Με παρόμοια διαδικασία μπορεί να υπολογιστεί και ο χρόνος ζωής της triplet καταστασης: (1-5) Ο χρόνος ζωής της triplet κατάστασης είναι αρκετά μεγαλύτερος από αυτόν της singlet. Επομένως είναι δύνατον να μελετηθούν φαινόμενα μεγαλύτερης διάρκειας είτε μετρώντας τον φωσφορισμό είτε μετρώντας φθορισμό με χρονική καθυστέρηση. 1.3.2 Κβαντική απόδοση Η κβαντική απόδοση του φθορισμού Φ F είναι το ποσοστό των μορίων που επιστρέφουν στην θεμελιώδη κατάσταση S 0 με εκπομπή φωτονίων φθορισμού. (1-6) Πιο συγκεκριμένα, η κβαντική απόδοση του φθορισμού είναι ο λόγος του πλήθους των φωτονίων που εκπέμπονταιπρος το πλήθος των φωτονίων που απορροφόνται. Μπορεί επίσης να εκφραστεί συναρτήσει του ακτινοβολητικού χρόνου ζωης: (1-7) Η κβαντική απόδοση της σταθμικής διασταύρωσης και του φωσφορισμού ορίζονται με όμοιο σκεπτικό και δίνονται: (1-8) (1-9) Τέλος, ο χρόνος ζωής και η κβαντική απόδοση αποτελούν βασικά χαρακτηριστικά για την μελέτη του φθορισμού. Προφανώς, όσο πιο μεγάλη είναι η κβαντική απόδοση τοσο πιο φθορίζον είναι ένα μόριο. Οι βασικότεροι παράμετροι που μπορούν να επηρεάσουν 10
τον χρόνο ζωής και την κβαντική απόδοση του φθορισμούείναι η θερμοκρασία, το ph, το ιξώδες, οι δεσμοί υδρογόνου και η παρουσία αποσβεστών. [3] 1.4 Απόσβεση φθορισμού Οποιαδήποτε διεργασία η οποία προκάλει μείωση της έντασης φθορισμού ενός μορίου χαρακτηρίζεται ως απόσβεση φθορισμού. Στο μεγαλύτερο πλήθος αυτών των διεργασιών παρατηρείται αλληλεπίδραση του διεγερμένου μορίου (Μ*) με ένα άλλο μόριο το οποίο συχνά ονομάζεται αποσβέστης (Q, quencher). Οι κυριότερες διαμοριακές διεργασίες που προκαλούν την απόσβεση του φθορισμού είναι οι συγκρούσεις με βαρέα άτομα (όπως το ιώδιο και το βρώμιο), η δημιουργία συμπλόκων,η μεταφορά ηλεκτρονίων, η δημιουργία διεγερμένων διμερών (excimer, excited dimer), η δημιουργία διεγερμένων συμπλόκων (exciplex, excited complex), η μεταφορά πρωτονίων και η μεταφορά ενέργειας. Ο χρόνος ζωής και η κβαντική απόδοση του διεγερμένου μορίου επηρεάζονται από την παρουσία του αποσβέστη. Συγκεκριμένα, ανάλογα με το είδος της απόσβεσης ο χρόνος ζωής συνήθως μειώνεται λόγω του αποσβέστη, ενώ παρατηρείται μείωση και στην κβαντική απόδοση του φθορισμού του μορίου. Η μελέτη των παραπάνω χαρακτηριστικών παρέχει τόσο ποσοτικές όσο και ποιοτικές πληροφορίες για το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται το διεγερμένο μόριο. 1.4. 1 Δυναμική απόσβεση φθορισμού Η δυναμική απόσβεση φθορισμού ή αλλιώς η απόσβεση φθορισμού λόγω συγκρούσεων είναι η διεργασία όπου ένα διεγερμένο μόριο ( ) έρχεται σε επαφή με ένα άλλο μόριο (Q), με αποτέλεσμα την αποδιέγερσή του με μη ακτινοβολητικό τρόπο. Ένα από τα πιο γνωστά μόρια που χρησιμοποιούνται για αποσβέστες στην συγκεκριμένη περίπτωση αποτελεί το οξυγόνο. Ο χρόνος ζωής όταν μελετάται η δυναμική απόσβεση μπορεί να προσδιοριστεί από την παρακάτω διαφορική εξίσωση. (1-10) όπου είναι η συγκέντρωση του διεγερμένου μορίου, είναι η συγκέντρωση του αποσβέστη και, είναι οι ρυθμοι μείωσης του πληθυσμού του ακτινοβολητικά και μη ακτινοβολητικά (λόγω αποσβέστη) αντίστοιχα. Η λύση της (1-10) δίνει την συγκέντρωση του και κατά συνέπεια την ένταση του φθορισμού αφού είναι ανάλογη της συγκέντρωσης. 11
(1-11) όπου είναι ο ακτινοβολητικός χρόνος ζωής, απουσία του αποσβέστη. Επομένως ο χρόνος ζωής στην περίπτωση της δυναμικής αποδιέγερσης είναι: (1-12) ή καλύτερα, (1-13) Από τις σχέσεις (1-12) και (1-13) παρατηρούμε ότι ο χρόνος ζωής μειώνεται παρουσία του αποσβέστη και αυτό φαίνεται και στο διάγραμμα της εικόνας 1.6α. Η κβαντική απόδοση του φθορισμού παρουσία του αποσβέστη είναι: (1-14) ενώ απουσία του αποσβέστη είναι: Από τις σχέσεις (1-14) και (1-15) έχουμε: (1-15) (1-16) όπου P 0 και P είναι οι εντάσεις του φθορισμού απουσία και παρουσία του αποσβέστη αντίστοιχα. Η σχέση (1-16) ονομάζεται εξίσωση Stern Volmer. O λόγος συναρτήσει της συγκέντρωσης του αποσβέστη έχει γραμμική μορφή επομένως η κλίση του διαγράματος ισοδυναμεί με την σταθερά Stern Volmer (εικόνα 1.6β). Οι παραπάνω σχέσεις ικανοποιούν όλες τις περιπτώσεις όπου η απόσβεση φθoρισμού προκαλείται από την αλληεπίδραση του διεγερμένου μορίου με τον αποσβέστη χωρίς να επηρεάζεται αυτή η διαδικασία από άλλους παράγοντες. Στην περίπτωση, όμως, που εισάγονται και άλλα φαινόμενα όπως η περιστροφή των μορίων (φθορίζοντος και αποσβέστη), ο μη ακτινοβολητικός ρυθμός μείωσης του πληθυσμού του διεγερμένου μορίου ( ) παύει να 12
είναι σταθερός και είναι πλέον χρονοεξαρτώμενος ( ). Αυτή η χρονο - εξαρτώμενη επίδραση στην απόσβεση του φθορισμου (transient effect), προκαλεί απόκλιση του διαγράμματος Stern Volmer από την γραμμικότητα. Συγεκριμένα, εμφανίζεται μια μικρή καμπύλωση προς τα πάνω (εικόνα 1.6γ). [4] Εικόνα 1.6 Δυναμική απόσβεση φθορισμού (α) Ένταση φθορισμού συναρτήσει του χρόνου, (β) διάγραμμα Stern - Volmer, (γ) διάγραμμα Stern - Volmer παρουσία χρονοεξαρτώμενων επιδράσεων (transienteffects). 1.4.2 Στατική απόσβεση φθορισμού Η απόσβεση φθορισμού μπορεί να προκληθεί μέσω της δημιουργίας συμπλόκου του διεγερμένου μορίου με τον αποσβέστη. Όταν αυτό το σύμπλοκο απορροφά φως επιστρέφει αμέσως στην θεμελιώδη κατάσταση χωρίς την εκπομπή φωτονίου. Αυτού του είδους η απόσβεση φθορισμού ονομάζεται στατική απόσβεση. Σε αυτήν, ο χρόνος ζωής του διεγερμένου μορίου δεν επηρεάζεται, μειώνεται όμως η ένταση του φθορισμού και κατά συνέπεια η κβαντική απόδοσή του (εικόνα 1.7α). Χρησιμοποιώντας τον συντελεστή σταθερότητας του συμπλόκου έχουμε: (1-17) όπου,, οι συγκεντρώσεις του συμπλόκου, του διεγερμένου μορίου και του αποσβέστη αντίστοιχα. Η συνολική συγκέντρωση του διεγερμένου μορίου είναι: (1-18) Από τις σχέσεις (1-17) και (1-18) έχουμε: (1-19) 13
και αφού η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη της συγκέντρωσης (ισχύει για αραιά διαλύματα) μπορούμε να καταλήξουμε στην σχέση: (1-20) Εικόνα 1.7 Στατική απόσβεση φθορισμού (α) Ένταση φθορισμού συναρτήσει του χρόνου, (β) διάγραμμα Stern Volmer. Παρατηρούμε ότι στην περίπτωση της στατικής απόσβεσης, η έντασή φθορισμού έχει γραμμική εξάρτηση με την συγκέντρωση του αποσβέστη όπως συμβαίνει και στην περίπτωση της δυναμικής απόσβεσης (σχέση (1-16)). Αυτό φαίνεται και στο διάγραμμα της εικόνας 1.7β. Επομένως τα διαγράμματα Stern Volmer από μόνα τους δεν είναι ικανά να προσδιορίσουν το είδος της απόσβεσης. Για να διακρίνουμε μεταξύ στατικής και δυναμικής απόσβεσης φθορισμού εκμεταλλευόμαστε το γεγονός ότι τα δύο είδη απόσβεσης έχουν διαφορετική συμπεριφορά στην αλλαγή της θερμοκρασίας ή του ιξώδους του περιβάλλοντος στο οποίο βρίσκεται το διεγερμένο μόριο. Συγκεκριμένα υψηλότερες θερμοκρασίες προκαλούν ταχύτερες κινήσεις μορίων και κατά συνέπεια περισσότερες συγκρούσεις. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του φαινομένου της δυναμικής απόσβεσης. Αντιθέτως, η αύξηση της θερμοκρασίας αποδυναμόνει τους δεσμούς των συμπλόκων, με αποτέλεσμα την μείωση του φαινομένου της στατικής απόσβεσης. Στην εικόνα 1.8 δίνονται τα διαγράμματα Stern Volmer στις περιπτώσεις της δυναμικής και στατικής απόσβεσης του φθορισμού και της μεταβολής τους με την αύξηση της θερμοκρασίας. 14
Εικόνα 1. 8 Διαγράμματα Stern - Volmer στατικής και δυναμικής απόσβεσης φθορισμού. Τέλος, είναι δυνατόν να παρατηρηθεί απόσβεση φθορισμού ενός διεγερμένου μορίου λόγω συγκρούσεων αλλά και λόγω δημιουργίας συμπλόκων την ίδια χρονική στιγμή. Δήλαδη να υπάρξει ταυτόχρονη εμφάνισηδυναμικής και στατικής απόσβεσης φθοερισμού. Τα διαγράμματα Stern Volmer αποκλίνουν από την γραμμική μορφή τους, εμφανίζουν μια καμπύλωση προς τα πάνω ακριβώς όπως και στην περίπτωση της δυναμικής απόσβεσης φθορισμού παρουσία χρονοεξαρτόμενων επιδράσεων (εικόνα 1.6γ). 1.4.3 Μεταφορά ενέργειας Είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί μεταφορά ενέργειας από ένα διεγερμένο μόριο σε ένα άλλο είτε αυτό είναι όμοιό του (homotransfer) είτε διαφορετικό του (heterotransfer). Επιπλέον, η μεταφορά της ενέργειας μπορεί να συμβαίνει σε παραπάνω από δύο μόρια (energy migration ή excitation transport). Η μεταφορά ενέργειας προκαλείται είτε ακτινοβολητικά είτε μη ακτινοβολητικά και αποτελεί και αυτή ένα είδος απόσβεσης του φθορισμού. Συγκεκριμένα, ακτινοβολητικά μπορεί να συμβεί όταν ένα μόριο (αποδέκτης) απορροφάει φωτόνιο το οποίο έχει εκπεμφθεί από ένα άλλο μόριο (δότης). Στην περίπτωση αυτή δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων ενώ η απόσταση τους πρέπει να είναι μεγαλύτερη από το μήκος κύματος εκπομπής. Κατά την μη ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας δεν παρατηρείται εκπομπή φωτονίου αλλά μικρής και μεγάλης εμβέλειας αλληλεπιδράσεις μορίων. Για τον λόγο αυτό η απόσταση τους πρέπει να είναι μικρότερη από το μήκος κύματος εκπομπής. Με την μελέτη της μεταφοράς ενέργειας μπορούν να προσδιοριστούν ποσοτικές και ποιοτικές πληροφορίες για τα μόρια και για την αλληλεπίδρασή τους. Τέλος, η ακτινοβολητική και η μη ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας μπορούν να διακριθούν δεδομένου ότι εμφανίζονται 15
διαφορετικά χρακτηριστικά στο φάσμα εκπομπης φθορισμού του δότη, ενώ οι παράγοντες που προσδιορίζουν την αποδοτικότητά τους εμφανίζουν επίσης αρκετές διαφορές. Μη ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας Για να πραγματοποιηθεί μη ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας μεταξύ δύο μορίων πρέπει να μπορούν να αλληλεπιδρούν. Αυτό συμβαίνει όταν το φάσμα εκπομπής του δότη επικαλύπτει το φάσμα απορρόφησης του δέκτη (εικόνα 1.9). Στην περίπτωση αυτή αρκετές δονητικές κατάστασεις του δότη έχουν ίδια ενέργεια με τις αντίστοιχες κατάστασεις του αποδέκτη. Αυτές οι καταστάσεις είναι συζευγμένες και μπορούν να χαρακτηριστούν ως συντονισμένες, για αυτόν τον λόγο το συγκεκριμένο είδος μεταφοράς ενέργειας συχνά χαρακτηρίζεται ως συντονισμένη μεταφορά ενέργειας (RET, resonance energy transfer) ή ως συντονισμένη μεταφορά ενέργειας φθορισμού (FRET, fluorescence resonance energy transfer). Η τελευταία έκφραση δεν θεωρείται σωστή αφού δεν μεταφέρεται ακτινοβολητικά η ενέργεια του φθορισμού αλλά η ηλεκτρονιακή ενέργεια του δότη. Ο όρος FRET είναι πολύ διαδεδομένος καθώς σημαίνει επίσης και Fröster Resonance Energy Transfer, όπου ο Fröster ήταν ο πρώτος που ανέφερε την μεταφορά ενέργειας Εικόνα 1.9 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής δότη και αποδέκτη όπου φαίνεται και η επικάλυψη του φάσματος εκπομπής του δότη με το φάσμα απορρόφησης του δέκτη. Η μεταφορά ενέργειας μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω δύο βασικών μηχανισμών,των αλληλεπιδράσεων Coulomb (όπου πρόκειται για μεγάλης εμβέλειας αλληλεπιδράσεις διπόλου διπόλου) και της επικάλυψης των μοριακών τροχιακών (όπου πρόκειται για μικρής εμβέλειας αλληλεπιδράσεις). Για τις μεγάλης εμβέλειας αλληλεπιδράσεις ο 16
Förster ήταν ο πρώτος που έδωσε την έκφραση της σταθεράς το ρυθμό μεταφοράς ενέργειας για αλληλεπριδράσεις διπόλου διπόλου:, η οποία χαρακτηρίζει (1-21) όπου και ο ρυθμός αποδιέγερσης του δότη και ο χρόνος ζωής του απουσία του αποδέκτη αντίστοιχα, r η απόσταση μεταξύ δότη αποδέκτη (η οποία θεωρείται ότι δεν αλλάζει κατά τον χρόνο ζωής του δότη) και είναι μια απόσταση γνωστή ως απόστασηförster (η απόσταση όπου ο ρυθμός μεταφοράς της ενέργειας ισούται με τον ρυθμό αποδιέγερσης του δότη ). Η απόσταση μπορεί να προσδιοριστεί με την φασματοσκοπική μελέτη του φαινομένου της μεταφοράς ενέργειας βρίσκεται μεταξύ 15 60 Å και δίνεται: (1-22) όπου ο όρος ονομάζεται παράγοντας προσανατολισμού (orientationfactor) και προσδιορίζεται από τις διπολικές ροπές του δότη και του αποδέκτη. Ο παράγοντας προσανατολισμού παίρνει τιμές από 0 έως 4. Την τιμή 0 παίρνει όταν οι διπολικές ροπές του δότη και του αποδέκτη είναι κάθετες την τιμή 4 παίρνει για συγγραμικές διπολικές ροπές,η τιμή του είναι 1 για παράλληλες διπολικές ροπές. Στην σχέση (1-22): είναι η κβαντική απόδοση του φθορισμού του δότη απουσία του αποδέκτη, n είναι η μέση τιμή του δείκτη διάθλασης του υλικού στο οποίο βρίσκονται τα μόρια μέσα στο εύρος των μηκών κύματος της επικάλυψης των φασμάτων,, είναι το κανονικοποιημένο φάσμα εκπομπής φθορισμού του δότη,, είναι οσυντελεστής μοριακής απορροφητικότητας του αποδέκτη (molar absorption coefficient), ο οποίος δείχνει πόσο ισχυρά απορρόφαται το φως από ένα μόριο. [5] Τέλος, για τις μικρής εμβέλειας αλληλεπιδράσεις ο Dexter έδωσε την έκφραση του ρυθμούk, ο οποίος εξαρτάται εκθετικά από τη απόσταση των μορίων δότη αποδέκτη. 17
1.4.4 Άλλα φαινόμενα που προκαλούν την απόσβεση φθορισμού Φωτοεπαγόμενη μεταφορά ηλεκτρονίου Η φωτοεπαγόμενη μεταφορά ηλεκτρονίου (photo induced electron transfer, PET), είναι μια διεργασία που μπορεί να προκαλέσει την απόσβεση του φθορισμού. Η διεργασία αυτή παρατηρείται σε φωτοχημικές αντιδράσεις μεταξύ οργανικών μορίων, συγκεκριμένα είναι η κυρίαρχη διεργασία που πραγματοποιείται κατά την φωτοσύνθεση. Επιπλέον, αποτελεί βασικό φαινόμενο για την μετατροπή της ηλιακής ενέργειας σε ηλεκτρική (π.χ. στα οργανικά φωτοβολταϊκά). Επομένως, η μελέτη της απόσβεσης του φθορισμού στην περίπτωση της φωτοεπαγόμενης μεταφοράς ηλεκτρονίων παρέχει πολλές πληροφορίες χρήσιμες για την παραγωγήκαι την βελτίωση συστημάτων μετατροπής της ηλιακής ενέργειας. Δημιουργία των excimers και exciplexes Όπως έχει ήδη αναφερθεί, τα excimers είναι διμερή τα οποία βρίσκονται σε διεγερμένη κατάσταση. Η δημιουργία τους κυρίως προκαλείται από την σύγκουση δύο όμοιων μορίων(μονομερή) εκ των οποίων το ένα είναι διεγερμένο ενώ το δεύτερο βρίσκεται στην θεμελιώδη κατάσταση. Είναι επίσης δυνατόν να δημιουργηθουν όταν τα δύο μονομερή συνδέονται με μικρή εύκαμπτη αλυσίδα.στην περίπτωση αυτή τα μόρια πλησιάζουν μέσω εσωτερικών περιστροφών κατά την διάρκεια του χρόνου ζωής της διεγερμένης κατάστασης. Σε μερικές περιπτώσεις, ένα μονομερές στην θεμελιώδη κατάσταση μπορεί να βρίσκεται πολύ κοντά σε ένα άλλο με αποτέλεσμα την παρατήρηση συμπεριφοράς όμοιας με αυτή των excimers, ωστόσο δεν πρόκειται για ακριβή δημιουργία excimers. Για το λόγο αυτό συχνά αποκαλούνται excimer-like. Το φάσμα φθορισμού ενός excimer βρίσκεται σε μήκη κύματος μεγαλύτερα από το φάσμα του μονομερούς, ενώ δεν είναι δυνατόν να διακρίθουν οι δονητικές καταστάσεις (εικόνα 1.9α). Η ένταση του φθορισμού στο πεδίο του χρόνου των excimers ξεκινάει από το μηδέν για αφού δεν απορροφούν φως αλλά δημιουργούνται από τα διεγερμένα μονομερή (εικόνα 1.9β). 18
Εικόνα 1.10 (α) Φάσμα εκπομπής φθορισμού μονομερούς και excimer (β) ένταση φθορισμού μονομερούς και excimer συναρτήσει του χρόνου. Η δημιουργία των exciplexes, δηλαδή των διεγερμένων συμπλόκων, είναι παρόμοια με αυτή των excimers. Δημιουργούνται λόγω σύγκρουσης ενός διεγερμένου μορίου (δότης ή αποδέκτης ηλεκτρονίου) με ένα διαφορετικό μόριο που βρίσκεται στη θεμελιώδη κατάσταση (αποδέκτης ή δότης ηλεκτρονίου αντίστοιχα) και όχι ίδιου μορίου όπως στην περίπτωση των excimers. Το φάσμα εκπομπής φθορισμού των exciplexes βρίσκεται σε μεγαλύτερα μήκη κύματος σε σύγκριση με αυτό των μορίων που τα αποτελούν, ενώ δεν παρατηρείται συγκεκριμένη δομή (λόγω δονητικών επιπέδων). Κατά την αποδιέγερση των exciplexes, εκτός από την εκπομπή φωτονίων φθορισμού είναι δυνατόν να ελευθερωθούν ιόντα στο περιβάλλον (συνήθως διαλύτη). Η τελευταία διεργασία είναι περισσότερο αποδοτική σε πολικά περιβάλλοντα, όπου η μεταφορά των ηλεκτρονίων από δότη σε αποδέκτη για τη δημιουργία των exciplexes είναι πιο αποδοτική (φωτοεπαγόμενη μεταφορά ηλεκτρονίων, PET). Προφανώς, η παρουσία των excimers και των exciplexes προκαλεί την απόσβεση του φθορισμού. Η δημιουργία τους εξαρτάται άμεσα από την συγκέντρωση των μορίων. Συγκεκριμένα απαιτείται μεγάλη συγκέντρωση έτσι ώστε να ευνοούνται οι συγκρούσεις των μορίων εντός του χρόνου ζωής της διεγερμένης κατάστασης. Βασικοί παράμετροι αποτελούν επίσης η βρίσκονται τα μόρια. Φωτοεπαγόμενη μεταφορά πρωτονίου θερμοκρασία και το ιξώδες του περιβάλλοντος στο οποίο Η φωτοεπαγόμενη μεταφορά πρωτονίου (photo induced proton transfer) αποτελεί διεργασία που μπορεί να επηρεάσει τόσο την κβαντική απόδοση του φθορισμού όσο και 19
το φάσμα εκπομπής του. Η εμφάνιση της διεργασίας αυτής οφείλεταιστο γεγονός ότι τα μόρια έχουν διαφορετικές βασικές ή οξινες ιδιότητες όταν βρίσκονται στην θεμελιώδη κατάσταση από όταν βρίσκονται σε κάποια διεγερμένη. Αυτό οφείλεται εν μέρει στο ότι η απορρόφηση του φωτός ουσιαστικά προκαλεί μια ανακατανομή του ηλεκτρονιακού νέφους των μορίων. Πιο ενδιαφέρουσες περιπτώσεις αποτελούν αυτές όπου τα μόρια έχουν ισχυρότερες βασικές ή όξινες ιδιοτητες στην διεγερμένη κατάσταση συγκριτικά με τη θεμελιώδη. Σε αυτές τις περιπτώσεις είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί η φωτοεπαγώμενη μεταφορά πρωτονίου. Τέλος, η διεργασία αυτή ευνοείται σε μόρια που βρίσκονται εντός διαλυτών (διαλύματα). Τα μόρια του διαλύτη λειτουργούν είτε ως δότες είτε ως αποδέκτες πρωτονίων. 1.5 Η επίδραση της δομής των μορίων στον φθορισμό Τα μόρια που χρησιμοποιούνται περισσότερο για την μελέτη του φθορισμού είναι αυτά που αποτελούνται από αρωματικούς δακτυλίους.ένας αρωματικός δακτύλιος αποτελείται από έξι άτομα άνθρακα τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με απλούς και διπλούς ομοιοπολικούς δεσμούς. Ο σχηματιζόμενος δακτύλιος μπορεί να συνδέεται με άλλους δακτυλίους ή με αλυσίδες ατόμων. Μια αύξηση της αλυσίδας των αρωματικών ενώσεων με έναν ακόμη δακτύλιο (εικόνα 1.10) προκαλεί μετατόπιση στο φάσμα απορρόφησης και εκπομπής φθορισμού σε μεγαλύτερα μήκη κύματος, ενώ παράτηρείται και αύξηση στην κβαντική απόδοση του φθορισμού. Εικόνα 1.11 Μόρια με αρωματικούς δακτυλίους. Στις αλυσίδες αρωματικών υδρογοναθράκων είναι επίσης δυνατόν να προστεθούν ομάδες ατόμων οι οποίες προκαλούν αλλαγές στα χαρακτηριστικά του εκπεμπόμενου φθορισμού. Μερικές από αυτές είναι: Βαρέα άτομα, όπως το Βρώμιο και το Ιώδιο. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η ύπαρξη βαρέων ατόμων προκαλεί την απόσβεση του φθορισμού, αφού αυξάνεται η 20
πιθανότητα πραγματοποίησης της σταθμικής διασταύρωσης. Ωστόσο η επίδραση ενός βαρέως ατόμου στην περίπτωση των αρωματικών ενώσεων μπορεί να είναι μικρή εάν (i) η κβαντική απόδοση του φθορισμού είναι πολύ μεγάλη ώστε να επικρατεί ο φθορισμός, (ii) η κβαντική απόδοση του φθορισμού είναι πολύ μικρή ώστε να μειώνεται και η πιθανότητα της σταθμικής διασταύρωσης ή (iii) να μην υπάρχει triplet κατάσταση ενεργειακά κοντά στην διεγερμένη singlet κατάσταση. Δότες ηλεκτρονίων. Οι πιο γνωστές ομάδες ατόμων που λειτουργούν ως δότες ηλεκτρονίων είναι: -OH, -OR, -NH 2 NHR, -NR 2. Η προσθήκη των ομάδων αυτών στις αλυσίδες εισάγει μια αύξηση στον συντελεστή μοριακής απορροφητικότητας, ενώ μετατοπίζει το φάσμα απορρόφησης και εκπομπής φθορισμού. Επιπλέον, τα φάσματα διευρύνονται και χάνουν την δομή τους σε σύγκριση με αυτά των αρωματικών υδρογονανθράκων μη συνδεδεμένων με τις ομάδες. Δέκτες ηλεκτρονίων. Στη κατηγορία αυτή ανήκουν οι ομάδες που αποτελούνται από έναν άνθρακα ενωμένο με διπλό δεσμό με οξυγόνο (carbonylcompounds, εικόνα 1.12α) και οι ομάδες αζώτου όπως ΝΟ 2 (εικόνα 1.12 β). Εικόνα 1.12 Δομές όμαδων (α) Άνθρακα και (β) Αζώτου που λειτουργούν ως αποδέκτες ηλεκτρονίων. Σουλφονικές ομάδες (sulfonates). Οι ομάδες αυτές προστίθονται συνήθως στα μόρια για να τα κάνουν υδατοδιαλυτά. Η παρουσία τους δεν προκαλεί μεγάλες αλλαγές στα χαρακτηριστικά του φθορισμού. Συγκεκριμένα, η κβαντική απόδοση παρουσιάζει μια πολύ μικρή μείωση, ενώ το φάσμα εκπομπής φθορισμού εμφανίζει μια μικρή μετατόπιση προς το κόκκινο χωρίς να χαλάει ιδιαίτερα η δομή του (κορυφές λόγω δονητικών καταστάσεων). Δεν είναι δυνατόν να προβλεφθούν τα χαρακτηριστικά του φθορισμού όταν υπάρχουν στα αρωματικά μόρια παραπάνω από μια από αυτές τις ομάδες. Ενδιαφέροντα μόρια για την μελέτη του φθορισμού αποτελούν και τα αρωματικά μόρια που περιέχουν έναν ή παραπάνω ετεροκυκλικούς δακτυλίους (heterocyclic compounds). 21
Για παράδειγμα, εάν το άζωτο είναι ένα από τα άτομα που αντικαθιστούν τον άνθρακα σε έναν αρωματικό δακτύλιο κάνοντάς τον ετεροκυκλικό, (εικόνα 1.13) τα χαρακτηριστικά του φθορισμού εξαρτόνται άμεσα από το περιβάλλον του μορίου (διαλύτης), αφού μπορούν να σχηματιστούν ενώσεις μεταξύ του αζώτου και των μορίων του διαλύτη. Ακόμη πολλά φθοροφόρα μόρια πρακτικού ενδιαφέροντος είναι ετεροκυκλικά, όπως οι κουμαρίνες, οι ροδαμίνες, οι φλουρεσκεΐνες, οι οξαζίνες κ.α.. [6] Εικόνα 1. 13 Αρωματικές ετεροκυκλικές ενώσεις Αζώτου. 22
Κεφάλαιο 2. Η επίδραση του περιβάλλοντος στον φθορισμό 2.1 Εισαγωγή Ο φθορισμός που εκπέμπεται από τα μόρια επηρεάζεται άμεσα από το περιβάλλον στο οποίο βρίσκονται. Αυτή η ιδιότητα του φθορισμού αποτελεί τον κυρίαρχο λόγο που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και μελέτη του περιβάλλοντος των φθοροφόρων μορίων (μελέτη δηλαδή του τοπικού περιβάλλοντός τους). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, τα κύρια χαρακτηριστικά του φθορισμού τα οποία μπορούν να μεταβάλλονται είναι το φάσμα εκπομπής, ο χρόνος ζωής και η κβαντική απόδοση. Οι φυσικοί και χημικοί παράμετροι του περιβάλλοντος που μπορούν να επηρεάσουν τον φθορισμό ενός μορίου είναι η πολικότητα, το ph, η θερμοκρασία, το ιξώδες, η ύπαρξη ιόντων, η ύπαρξη μορίων αποσβεστών, η πίεση, η ύπαρξη ηλεκτρικού δυναμικού και η δυνατότητα σχηματισμού δεσμών υδρογόνου. Στο συγκεκριμένο κεφάλαιο θα γίνει η μελέτη του φθορισμού που προέρχεται από διαλύματα, επομένως το φθοροφόρο μόριο θεωρείται η διαλυμένη ουσία ενώ το περιβάλλον του μορίου θεωρούνται τα μόρια κάποιου διαλύτη. 2.2 Ομοιογενής και ανομοιογενής διεύρυνση φασμάτων απορρόφησης και εκπομπής φθορισμού Το εύρος των φασμάτων απορρόφησης και εκπομπής ενός φθοροφόρου μορίου το οποίο βρίσκεται σε κάποιο περιβάλλον οφείλεται σε δύο βασικές επιδράσεις, οι οποίες καλούνται ομοιογενής και ανομοιογενής διεύρυνση. Η ομοιογενής διεύρυνση οφείλεται στην ύπαρξη των συνεχών δονητικών καταστάσεων εντός των ηλεκτρονιακών σταθμών. Επομένως, τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής ενός σχετικά μεγάλου και άκαμπτου μορίου εντός διαλύματος φαίνονται χωρίς συγκεκριμένη δομή (λόγω των δονητικών επίπεδων). Η ανομοιογενής διεύρυνση οφείλεται στις διακυμάνσης της δομής του στρώματος διαλύτη που περικλείει το μόριο. Η κατανομή διαλύτη και διαλυμένου μορίου συνεπάγεται μεταβολές στο τοπικό ηλεκτρικό πεδίο με αποτέλεσμα την απόσβεση της ενέργειας των ηλεκτρονιακών καταστάσεων των μορίων. Συνήθως, η διεύρυνση των φασμάτων λόγω αλληλεπίδρασης φθοροφόρου διαλύτη (ανομοιογενής διεύρυνση) είναι μεγαλύτερης έκτασης από την ομοιογενή διεύρυνση. Σε πολικά άκαμπτα μέσα όπως παγωμένα διαλύματα ή πολυμερικές μήτρες, η ανομοιογενής διεύρυνση μειώνεται αλλά συνεχίζει να εμφανίζεται. Η ύπαρξή της είναι και ο λόγος εμφάνισης των ιδιαίτερων 23
φαινομένων που προκαλούνται όταν το μόριο διεγερθεί από ακτινοβολία μήκους κύματος του κόκκινου κομματιού του φάσματος απορρόφησης (red edge effects). 2.3 Η Επίδραση της πολικότητας του διαλύτη στο φθορισμό Οι πρώτοι που ανέφεραν ότι τα μόρια του διαλύτη μπορούν να επηρεάσουν ένα διεγερμένο μόριο ήταν ο Berthelot και ο PéandeSaint Gilles το 1862. Επομένως αλλαγές στο είδος ή την σύσταση ενός διαλύτη σημαίνει και αλλαγές στο φάσμα απορρόφησης και εκπομπής φθορισμού ενός μορίου (solvatochromic shifts). Αυτό που ουσιαστικά συμβαίνει όταν ένα φθοροφόρο μόριο περιβάλλεται από κάποιον διαλύτη, είναι να βρίσκεται σε μια κατάσταση ισορροπίας με τα μόρια του διαλύτη τόσο όταν είναι στην θεμελιώδη κατάσταση όσο και όταν βρίσκεται σε κάποια διεγερμένη. Η κατάσταση ισορροπίας εμφανίζεται λόγω των αλληλεπιδράσεων του μορίου με τα μόρια του διαλύτη και εξαρτάται άμεσα από την χημική δομή και των δύο. Οι αλληλεπιδράσεις φθοροφόρου μορίου μορίων διαλύτη αποτελούνται από τις αλληλεπιδράσεις Van der Waals και μερικές πιο ειδικές αλληλεπιδράσεις όπως ο σχηματισμός δεσμού υδρογόνου. Οι αλληλεπιδράσεις Van der Waals διακρίνονται σε τρεις βασικές κατηγορίες: αλληλεπίδραση μεταξύ μορίων με μόνιμες διπολικές ροπές, αλληλεπίδραση της διπολικής ροπής ενός μορίου με την επαγόμενη από αυτήν διπολική ροπή σε ένα άλλο μόριο και οι δυνάμεις διασποράς κατά London (ένα μόριο μπορεί να έχει μέση διπολική ροπή μηδέν αλλά η στιγμιαία διπολική ροπή είναι δυνατόν να μην είναι μηδέν. Έτσι τα μόρια αυτά προκαλούν ένα είδος αλληλεπίδρασης με τα γειτονικά τους μόρια. Πρόκειται δηλαδή για αλληλεπίδραση στιγμιαίας επαγόμενης διπολικής ροπής με διπολική ροπή γειτονικού μορίου). Συνεπώς οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ φθοροφόρου μορίου και μορίων διαλύτη προέρχονται όχι μόνο από μόρια με μόνιμες διπολικές ροπές αλλά και από μόρια με μηδενική μέση διπολική ροπήη τα οποία έχουν όμως χαρακτηριστικήπολωσιμότηταa, (η πολωσιμότητα για σφαιρικό μόριο ορίζεται από την διπολική ροπή η οποία επάγεται στο μόριο λόγω εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου ). Στην εικόνα 2.1 φαίνονται σχηματικά όλες οι βασικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του φθοροφόρου μορίου με τα μόρια του διαλύτη. Τα βασικά χαρακτηριστικά που συντελούν στις αλληλεπιδρασεις φθοροφόρου μορίου μορίων διαλύτη είναι η διπολική ροπή των μορίων του διαλύτη (μ s ), η διπολική ροπή του φθοροφόρου μορίου (μ Μ ), η πολωσιμότητα του διαλύτη (α s ) και η πολωσιμότητα του φθοροφόρου μορίου (α Μ ). Ο αντίσοτοιχος συνδυασμός αυτών των χαρακτηριστικών μπορεί να δώσει διαφορετικά φαινόμενα αλληλεπίδρασης μεταξύ του φθοροφόρου μορίου και των μορίων του διαλύτη. Συνεπώς, η πολικότητα των μορίων 24
του διαλύτη έχει επίδρασεις στον φθορισμό των μορίων και αυτές μπορούν να διακριθούν σε δύο βασικές κατηγορίες: γενικές επιδράσεις πολικότητας διαλύτη και ειδικές επιδράσεις πολικότητας διαλύτη. Εικόνα 2.1 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ φθοροφόρου μορίου - μορίων διαλύτη. 2.4 Γενικές αλληλεπιδράσεις διαλύτη φθοροφόρου μορίου Το φάσμα φθορισμού ενός μορίου βρίσκεται πάντα σε μήκη κύματος μεγαλύτερα από αυτά του φάσματος απορρόφησης. Έχουν ήδη αναφερθεί μερικές διεργασίες που οδηγούν σε αυτό το αποτέλεσμα. Mια ακόμη από αυτές αποτελεί και η αλληλεπίδραση του φθοροφόρου μορίου με μόρια του περιβάλλοντός του. Συγκεκριμένα, μετά την διέγερση ενός μορίου είναι δυνατόννα αποδοθεί μέρος της ενέργειάς του προς τα μόρια του διαλύτη. Αυτή η μεταφορά ενέργειας είναι εύκολο να κατανοηθεί με την βοήθεια της διπολικής ροπής των μορίων. Γενικά, ένα φθοροφόρο μόριο έχει μεγαλύτερη διπολική ροπή όταν βρίσκεται σε κάποια διεγερμένη κατάσταση ( ) από όταν βρίσκεται στην θεμελιώδη ( ). Μετά την διέγερση τα μόρια του διαλύτη (τα οποία έχουν κάποια διπολική ροπή) θα προσανατολιστούν ή θα χαλαρώσουν ανάλογα με την διπολική ροπή του φθοροφόρου μορίου (εικόνα 2.2). Η διεργασία αυτή προκαλεί μείωση της ενέργειας της διεγερμένης κατάστασης και ονομάζεται χαλάρωση λόγω διαλύτη (solvent relaxation). Εικόνα 2.2 Προσανατολισμός των διπολικών ροπών των μορίων του διαλύτη μετά την διέγερση του φθοροφόρου μορίου. 25
Με αύξησητης πολικότητας του διαλύτη αυξάνεται και η αποδοτικότητα της διεργασίας αυτής, με αποτέλεσμα να μειώνεται όλο και περισσότερο η ενέργεια της διεγερμένης κατάστασης. Βασική παράμετρος για την εμφάνιση του φαινομένου αυτού αποτελεί η πολικότητα του φθοροφόρου μορίου. Στα πολικά μόρια η χαλάρωση λόγω διαλύτη παρατηρείται εύκολα, το αντίθετο όμως συμβαίνει σε μη πολικά μόρια (όπως οι αρωματικοί υδρογονάνθρακες χωρίς ομάδες υποκατάστασης). Ο χρόνος που απαιτείται για τον προσανατολισμό των μορίων του διαλύτη είναι 10 100 ps. Για αυτό το λόγο το φάσμα απορρόφησης δεν επηρεάζεται από την διεργασία αυτή (αφου η απορρόφηση του φωτονίου συμβαίνει περίπουεντός 10-15 s). Η εκπομπή του φθορισμού όμως συμβαίνει εντός 1 10 ns, επομένως είναι απαραίτητο να διακριθουν δύο περιπτώσεις: Όταν ο χρόνος προσανατολισμού των μορίων του διαλύτη είναι μικρότερος από τον χρόνο του φθορισμού, τότε ο φθορισμός εκπέμπεται από το φθοροφόρο το οποίο βρίσκεται σε ισορροπία με το περιβάλλον του (εικόνα 2.3 εκπομπή F 3 ). Όταν ο χρόνος προσανατολισμού των μορίων του διαλύτη είναι συγκρίσιμος με τον χρόνο του φθορισμού, τότε τα φωτόνια που εκπέμπονται στην αρχή της διεργασίας θα αντιστοιχούν σε μήκη κύματος μικρότερα από αυτά που εκπέμπονται στο τέλος της (εικόνα 2.3 εκπομπή F 2 ). Αυτό το φαινόμενο είναι δυνατόν να παρατηρηθεί σε περιπτώσεις όπου η θερμοκρασία του διαλύματος είναι χαμηλή (αφού τα μόρια του διαλύτη περιστρέφονται με πιο αργό ρυθμό). Επιπλέον, η χαλάρωση λόγω διαλύτη εξαρτάται άμεσα από το ιξώδες του διαλύτη, αφού αυτό καθορίζει το πόσο εύκολα ή δύσκολα μπορούν να περιστραφούν τα μόρια. Είναι επομένως δυνατόν σε διαλύτες με υψηλό ιξώδες να μην παρατηρηθεί η διεργασία αυτή (εικόνα 2.3 εκπομπή F 1 ). 26
Εικόνα 2.3 (α) Διάγραμμα Jablonskiστην περίπτωση της χαλάρωσης λόγω διαλύτη (β) φάσμα εκπομπής φθορισμού συναρτήσει του χρόνου στην περίπτωση που ο χρόνος προσανατολισμού των μορίων του διαλύτη είναι συγκρίσιμος με τον χρόνο φθθορισμού. Συνοπτικά, όσο αυξάνεται η πολικότητα του διαλύτη, τόσο πιο έντονη είναι η μείωση της ενέργειας της διεγερμένης κατάστασης με αποτέλεσμα όλο και μεγαλύτερη μετατόπιση του φάσματος εκπομπής προς μεγαλύτερα μήκη κυματος (κόκκινο κομμάτι του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος, red - shift). Στην εικόνα 2.4 φαίνεται η μετατόπιση του φάσματος εκπομπής φθορισμού του μορίου 4-dimethylamino-4 -nitrostilbene (DNS) σε διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας, καθώς και η σχεδόν μηδενική μετατόπιση του φάσματος απορρόφησης σε δύο χαρακτηριστικούς διαλύτες (αυτόν με τη μικρότερη και αυτόν με την μεγαλύτερη πολικότητα). 27
Εικόνα 2.4(α) Χημική δομή μορίου DNS, (β) Φάσματα απορρόφησης του μορίου DNS σε εξάνιο (1) και βουτανόλη (2). Φάσματα εκπομπής φθορισμού του μορίου DNS σε εξάνιο (3) σε κυκλοεξάνιο (4) σε τολουόλιο (5) σε αιθυλική ακετόνη (6) και σε βουτανόλη (7). 2.4.1 Η εξίσωση Lippert Mataga Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ του φθοροφόρου μορίου και των μορίων του διαλύτη μπορούν να περιγραφούν και μαθηματικά μέσω της εξισώσεως Lippert Mataga (γενικές επιδράσεις διαλύτη). Η εξίσωση αυτή αποδίδει την μετατόπιση του φάσματος εκπομπής φθορισμού λόγω διαλύτη (solvatochromic shift), μελετώντας τις αλλήλεπιδράσεις διπόλου διπόλου. Συγκεκριμένα, για την εξαγωγή της εξίσωσης Lippert Mataga θεωρείται ότι το φθοροφόρο μόριο είναι ένα δίπολο εντός ομογενούς μέσου με συγκεκριμένη διηλεκτρική σταθερά (εικόνα 2.5). Αυτό το μοντέλο δεν περιέχει χημικές αλληλεπιδράσεις. Επομένως δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση που υπάρχουν και άλλες επιδράσεις λόγω διαλύτη (ειδικές επιδράσεις, όπως σχηματισμοί δεσμών υδρογόνου ή ενδομοριακη μεταφορά φορτίου). Εικόνα 2.5 Προσέγγιση φθοροφόρου μορίου και περιβάλλοντος για την εξαγωγή της εξίσωσης Lippert Mataga. 28
Η θέση των μεγίστων των φασμάτων απορρόφησης και φθορισμού εκφράζεται σε κυματάριθμους και δίνονται στις εξισώσεις (2-1) και(2-2). (2-1) (2-2) όπου h είναι η σταθερά του Plank, c είναι η ταχύτητα του φωτός, a είναι η ακτίνα της κοιλότητας στην οποία βρίσκεται το φθοροφόρο και Δf είναιη πολωσιμότητα του διαλύτη η οποία εξαρτάται από τον δείκτη διάθλασης (n) και την διηλεκτρική σταθερά (ε) (σχέση 2-3). (2-3) Η πολωσιμότητα στο μοντέλο που περιγράφεται μέσω της εξίσωσης Lippert Mataga αποτελεί βασική παράμετρο αφού χαρακτηρίζει πλήρως τις ιδιότητες του διαλύτη. Στην σχέση (2-3) φαίνεται ότι η πολώσιμότητα διακρίνεται σε δύο όρους: Τον, ο οποίος εξαρτάται από την κίνηση των ηλεκτρονίων εντός του διαλύτη. Η κίνηση αυτή είναι πολύ γρήγορη για αυτό και ο όρος αυτός ονομάζεται υψηλής συχνότητας πολωσιμότητα (high frequency polarizability). Τον, ο οποίος εξαρτάται από την κίνηση τόσο των ηλεκτρονίων όσο και των μορίων του διαλύτη. Πρόκειται για πιο αργή διεργασία για αυτό και ονομάζεται χαμηλής συχνότητας πολωσιμότητα (low frequency polarizability). Η τιμή της πολωσιμότητας κυμαίνεται από 0.001 (cyclohexane) έως 0.320 (νερό). Η εξίσωση Lippert Mataga δίνεται από την αφαίρεση των σχέσεων (2-1) και (2-2): (2-4) Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι στην εξίσωση (2-4) η μετατόπιση Stokes εξαρτάται από την απόλυτη τιμή της διαφοράς των διπολικών ροπών και όχι από την γωνία την οποίασχηματίζουν μεταξύ τους. [7] Επιπλέον, πολλές πληροφορίες μπορούν να εξαχθούν από την γραφική παράσταση Lippert Mataga. Όταν παρατηρείται γραμμική συμπεριφορά στην γραφική παράσταση τότε είναι εύκολο να προσδιοριστεί η διαφορά των διπολικών ροπών της διεγερμένης κατάστασης από την θεμελιώδη, μέσω της κλίσης. Ωστόσω, 29
υπάρχουν περιπτώσεις που δεν παρατηρείται γραμμική συμπεριφορά. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι δεν λαμβάνεται υπόψιν η πολωσιμότητα του φθοροφόρου μορίου. Συνήθως διαλύτες που δεν σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου μπορούν να παρουσιάσουν γραμμική συμπεριφορά (απροτικοί διαλύτες, δηλαδή οι διαλύτες που δεν έχουν ομάδες υδροξυλίου ή άλλες ομάδες ικανές να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με το φθοροφόρο μόριο). Ένας ακόμη περιορισμός που εισάγεται στην μελέτη των γενικών επιδρασεων του διαλύτη μέσω της εξίσωσης Lippert Mataga, είναι ότι η κοιλότητα στην οποία βρίσκεται το μόριο θεωρείται σφαιρική με ακτίνα a. Για μόρια διαφορετικών σχημάτων μια καλύτερη προσέγγιση αποτελεί η θεωρία των ελλειψοειδών μορίων. Ο Suppan το 1983 πρότεινε μια σχέση (σχέση (2-5)), η οποία προέρχεται από τις (2-1) και (2-2) θεωρώντας ότι οι διπολικές ροπές (διεγερμένης και θεμελιώδους κατάστασης ) είναι συγγραμικές, απαλλαγμένη όμως από κάποια θεώρηση για την ακτίνα της κοιλότητας ή το είδος της πολικότητας του διαλύτη. Η εξίσωση αυτή εμπεριέχει τις διαφορές των κυματάριθμων στην απορρόφηση και εκπομπή δύο διαλυτών: (2-5) Τέλος, όπως η εξίσωση Lippert Mataga έτσι και η σχέση (2-5) μπορεί να προσδιορίσει τις διπολικές ροπές αλλά ισχύει μόνο όταν (i) οι διπολικές ροπές της αρχικώς διεγερμένης κατάστασης (κατάσταση (1) του σχήματος 2.3) και της κατάστασης που προκύπτει από την αλληλεπίδραση με το διαλύτη (relaxed state, κατάσταση (2) του σχήματος 2.3) είναι ίδιες (ii) η ακτίνα της κοιλότητας παραμένει αμετάβλητη κατά την διέγερση του μορίου και (iii) οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται είναι ίδιου δείκτη διάθλασης αλλά διαφορετικής διηλεκτρικής σταθεράς. 2.5 Ειδικές αλληλεπιδράσεις διαλύτη - φθοροφόρου Η θεωρία των γενικών επιδράσεων του διαλύτη συχνά δεν είναι αρκετή για την περιγραφή της συμπεριφοράς ενός φθοροφόρου εντός κάποιου περιβάλλοντος. Συγκεκριμένα, το φθοροφόρο μπορεί να έχει διαφόρων είδων αλληλεπιδράσεις με το περιβάλλον του οι οποίες προκαλούν μετατοπίσεις τόσο στο φάσμα εκπομπής φθορισμού όσο και στο φάσμα απορρόφησης. Σε αντίθεση με τις γενικές επιδράσεις πολικότητας του 30
διαλύτη, οι οποίες προκαλούνται από μεγάλο πλήθος γειτονικών μορίων, οι ειδικές επιδράσεις προκαλούνται από ένα ή δύο γειτονικά στο φθοροφόρο μόρια. Ένα από τα πιο χαρακτηριστικά παραδείγματα ειδικών επιδράσεων πολικότητας του διαλύτη αποτελεί ο σχηματισμός δεσμού υδρογόνου (ο δεσμός του υδρογόνου σχηματίζεται λόγω ασθενών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ατόμου του υδρογόνου με ένα ηλεκτραρνητικό άτομο ενός άλλου μορίου). Η παρουσία των δεσμών υδρογόνου μπορεί να προκαλέσει μετατόπιση στο φάσμα απορρόφησης του φθοροφόρου (συνήθως μετατόπιση προς το μπλέ κομμάτι του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος, blue - shift). Η μετατόπιση αυτή είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της ενέργειας των δεσμών υδρογόνου. Είναι απαραίτητο να αναφερθεί ότι για πολύ μικρές ποσότητες διαλύτη, ικανού να σχηματίσει δεσμούς υδρογόνου μπορεί να εμφανιστεί έντονη διαφορά στο φάσμα εκπομπής φθορισμού. Για παράδειγμα, η προσθήκη μόλις 0.2 % αιθανόλης σε κυκλοεξάνη προκαλεί έντονη διαφορά στο φάσμα εκπομπής του φθορισμού του μορίου 2-anilinonaphthalene (εικόνα 2.6), ενώ με επιπλέον 3% αύξηση της αιθανόλης, το φάσμα φθορισμού του μορίου αλλάζει ελάχιστα. Η συμπεριφορά αυτή αποτελεί μια ακόμη κατηγορία στις ειδικές επιδράσεις του διαλύτη και συχνά χαρακτηρίζεται ως επιλεκτική αλληλεπίδραση διαλύτη (interaction via preferential solvation). Εικόνα 2.6 Μόριο παραδείγματος επιλεκτικής αλληλεπίδρασης διαλύτη. Τέλος, υπάρχουν αρκετές ακόμη επιδράσεις του διαλύτη στο φθορισμό οι οποίες μελετώνται μεμονωμένα σε κάθε περίπτωση. Συγκεκριμένα, οι αλληλεπιδράσεις λόγω μεταφοράς φορτίου (charge transfer interactions), η μελέτη χημικών φαινομένων που προκαλούνται από αντιδράσεις όξινων και βασικών διαλυμάτων (acid basechemistry) και η αντιστροφή ενεργειακών επιπέδων (συνήθως της S 2 με την S 1 ) με την αύξηση της πολικότητας του διαλύτη (polarity inducedinversion, εικόνα 2.7) αποτελούν μερικά ακόμη χαρακτηριστικά παραδείγματα ειδικών επιδράσεων του διαλύτη στο φθοροφόρο. 31
Εικόνα 2.7 Αντιστροφή ενεργειακών επιπέδων λόγω αύξησης της πολικότητας του διαλύτη. 2.6 Ενδομοριακήμεταφοράφορτίου (Intramolecular charge transfer) Η ενδομοριακή μεταφορά φορτίου είναι ένα ακόμη φαινόμενο το οποίο προκαλεί μεταβολές στο φάσμα εκπομπής του φθορισμού. Η εμφάνιση του φαινομένου αυτού εξαρτάται από την δομή του φθοροφόρου μορίου και από την πολικότητα του διαλύτη. Όταν ο διαλύτης είναι μη πολικός η εκπομπή του φθορισμού προέρχεται από το χαμηλότερο αρχικώς διεγερμένο ενεργειακό επίπεδο το οποίο είναι γνωστό ως Frank - Condon state (FC) ή locally excited state (LE). Στην περίπτωση όμως πολικού διαλύτη δεν υπάρχει θερμοδυναμική ισορροπία μεταξύ των μορίων του φθοροφόρου και των μορίων του διαλύτη. Συγκεκριμένα, η διέγερση του φθοροφόρου σημαίνει μετάβαση ενός ηλεκτρονίου από μία ηλεκτρονιακή τροχιά σε μια άλλη. Εάν η αρχική και η τελική τροχιά είναι διαχωρισμένες στον χώρο, ταυτόχρονα με την ηλεκτρονιακή μετάβαση παρατηρείται και μεταβολή στη διπολική ροπή του φθοροφόρου. Όταν στο φθοροφόρο υπάρχει ομάδα δοτών ηλεκτρονίου (όπως ΝΗ2, -ΝΜe2, -CH3O) συζευγμένη με ομάδα δεκτών ηλεκτρονίου (όπως >C=O, -CN), η αύξηση της διπολικής ροπής μπορεί να είναι ιδιαίτερα μεγάλη. Εντός όμως του διαλύματος τα μόρια του διαλύτη έχουν τη δυνατότητα να περιστρέφονται κατά την διάρκεια του χρόνου ζωής της διεγερμένης κατάστασης και έτσι να φτάνουν σε θερμοδυναμική ισσοροπία με το φθοροφόρο μόριο. Η παραπάνω διεργασία δημιουργεί μια νέα κατάσταση χαμηλότερης ενεργείας γνωστή ως στάθμη ενδομοριακής μεταφοράς φορτίου (intramolecular charge transfer state, ICT). Αυτού του είδους η μείωση της ενέργειας της διεγερμένης κατάστασης (χαλάρωση) λόγω διαλύτη 32
εξηγεί την μετατόπιση του φάσματος φθορισμού προς το κόκκινο κομμάτι του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος με την αύξηση της πολικότητας του διαλύτη καθώς και την πιθανή εμφάνιση μιας δεύτερης κορυφής επίσης στο φάσμα εκπομπής (η πρώτη οφείλετε στη LE κατάσταση και η δεύτερη στην ICT κατάσταση). Τα φάσματα εκπομπής φθορισμού του μορίου fluorazene (FPP, εικόνα 2.8α) αποτελούν χαρακτηριστικό παράδειγμα για την μελέτη της κατάστασης ICT. Σε μη πολικούς διαλύτες όπως το εξάνιοτο μόριο αυτό δεν εμφανίζει ICT κατάσταση ενώ σε πολικούς διαλύτες όπως το ακετονιτρίλιο παρατηρείται μια δεύτερη κορυφή στο φάσμα εκπομπής του φθορισμού η οποία οφείλεται στην δημιουργημένη πλέον ICT κατάσταση (εικόνα 2.8β και 2.8γ). Σε πολλές περιπτώσεις κατά την διάρκεια αυτού του είδους χαλάρωσης λόγω διαλύτη είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί εσωτερική περιστροφή μιας ομάδας του φθοροφόρου. Σε αυτήν την περίπτωση το νέο ενεργειακό επίπεδο που εμφανίζεται, ονομάζεται στραμμένη στάθμη ενδομοριακής μεταφοράς ενέργειας (twisted intramolecular charge transfer state (TICT)). Το φάσμα φθορισμού και σε αυτήν εμφανίζει δύο κορυφές όπου η μια προέρχεται από την LE στάθμη ενώ η δεύτερη από την TICT.[8] Εικόνα 2.8 (α) Χημική δομή φθοροφόροουfluorazene (FPP) (β) φάσμα απορρόφησης και εκπομπής του FPP σε εξάνιο (β) φάσμα απορρόφησης και εκπομπής του FPP σε ακετονιτρίλιο. 33
Κεφάλαιο 3. Ανισοτροπία φθορισμού 3.1 Εισαγωγή. Πόλωση φθορισμού Όπως είναι ήδη γνωστό το φως αποτελείται από ηλεκτρικό και μαγνητικό πεδίο τα οποία ταλαντώνονται κάθετα μεταξύ τους καθώς και κάθετα στην διεύθυνση διάδοσης του φωτός. Γραμμικά πολωμένο φως χαρακτήριζεται αυτό όπου το ηλεκτρικό πεδίο ταλαντώνεται σε μια καθορισμένη διεύθυνση. Το κυκλικά πολωμένο φως παράγεται από το άθροισμα δυο γραμμικά πολωμένων διανυσμάτων ηλεκτρικού πεδίου με ίδιο πλάτος και διαφορά φάσης 90 μοίρες, ενώ για οποιαδήποτε ενδιάμεση κατάσταση το φως θεωρείται ελλειπτικά πολωμένο (εικόνα 3.1). [9] Εικόνα 3.1(α) Ηλεκτρικό και μαγνητικό πεδίο ταλαντούμενα κάθετα, (β) γραμμικά, (γ)κυκλικάκαι (δ) ελλειπτικά πολωμένο φως. Πολλά φθοροφόρα μόρια απορροφούν φως το οποίο είναι πολωμένο σε μια συγκεκριμένη κατεύθυνση η οποία καθορίζεται από την διπολική ροπή μετάβασής τους. Συγκεκριμένα, η διπολική ροπή μετάβασης είναι ένα διάνυσμα το οποίο καθορίζεται από τους πυρήνες των ατόμων του μορίου. Στην εικόνα 3.2 φαίνονται οι διπολικές ροπές μεταβάσεων S 0 S 1 και S 0 S 2 διαφόρων μορίων. 34
Εικόνα 3.2 Δομές γνωστών μορίων και οι διπολικές ροπές μεταβάσεων S 0 S 1 και S o S 2 διαφόρων μορίων. Εάν το προσπίπτον φως είναι γραμμικά πολωμένο,η πιθανότητα διέγερσης ενός μορίου δίνεται από το εσωτερικό γινόμενο του διανύσματος του ηλεκτρικού πεδίου με το διάνυσμα της διπολικής ροπής μετάβασης ( την γωνία μεταξύ τους ( ) και επομένως εξαρτάται άμεσα από ). Η πιθανότητα διέγερσης είναι μέγιστη όταν τα διανύσματα είναι παράλληλα, μειωμένη όταν έχουν κάποια γωνία και ελάχιστη όταν είναι κάθετα. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται photoselection (εικόνα 3.3α). Ένα μόριο είναι δυνατόν να μεταβεί σε διαφορετικές καταστάσεις κατά την διέγερση του (π.χ. είτε S 1 είτε S 2 ) αναλόγως με το μήκος κύματος διέγερσης. Κατά την αποδιέγερσή του όμως λόγω της εσωτερικής μετατροπής,η μετάβαση που ακολουθείται από εκπομπή φθορισμού είναι η S 1 S 0. Επομένως, η διπολική ροπή που χαρακτηρίζει την εκπομπή του φθορισμού είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση στην οποία θα βρεθεί το μόριο κατά την διέγερσή του (εικόνα 3.3β). Όταν ένα πλήθος φθοροφόρων μορίων βρίσκεται εντός διαλύματος η κατανομή τους δεν είναι ισοτροπική, με αποτέλεσμα η ακτινοβόληση του διαλύματος με γραμμικά πολωμένο φώς να προκαλεί την διέγερση μερικών μόνο μορίων. Οποιαδήποτε αλλαγή στην διεύθυνση των διπολικών ροπών κατά την διάρκεια του χρόνου ζωης της διεγερμένης κατάστασης σημαίνει αύξηση αυτής της ανισότροπης κατανομής των μορίων και κατά συνέπεια αλλαγή στην πόλωση του εκπεμπόμενου 35
φθορισμού. Η μελέτη της πόλωσης του φθορισμού και πιο συγκεκριμένα της ανισοτροπίας μπορεί να προσφέρει χρήσιμες πληροφορίες για τα μόρια όπως το μέγεθος, το σχήμα, η κίνηση και η περιστροφή τους εντός διαλυμάτων ή άλλων μέσων. Η μεταβολή στην πόλωση του φθορισμού σε σύγκριση με την πόλωση του φωτός διέγερσης μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, οι βασικότεροι εκ των οποίων είναι:οι μη παράλληλες διπολικές ροπές μεταξύ μεταβάσεων απορρόφησης και εκπομπής, η περιστροφή των μορίων, η κίνηση Brown, και η μεταφορά της ενέργειας διέγερσης σε ένα άλλο μόριο διαφορετικά προσανατολισμένο. [10], [11] Εικόνα 3. 3 (α) Φαινόμενο photoselection, (β) Χαρακτηριστικές διπολικές ροπές μεταβάσεων απορρόφησης και εκπομπής. 3.2 Προσδιορισμός της ανισοτροπίας φθορισμού Με την μελέτη της ανισοτροπίας του φθορισμού προσδιορίζεται η γωνιακή διαφορά μεταξύ της διπολικής ροπής απορρόφησης και της διπολικής ροπής εκπομπής ενός μορίου. Στα περισσότερα πειράματα μέτρησης της ανισοτροπίας το υπό μελέτη δείγμα διεγείρεται με κατακόρυφα γραμμικά πολωμένο φώς, ενώ ο εκπεμπόμενος φθορισμός του δείγματος μετράται αφού διέλθει από έναν πολωτή. Όταν ο πολωτής είναι προσανατολισμένος παράλληλα στην διεύθυνση πόλωσης του φωτός διέγερσης τότε η μετρούμενη ένταση φθορισμού συμβολίζεται ως. Ομοίως, όταν ο πολωτής είναι προσανατολισμένος κάθετα στην διεύθυνση πόλωσης του φωτός διέγερσης τότε η μετρούμενη ένταση φθορισμού συμβολίζεται ως τρόπος μέτρησης αυτών των εντάσεων.. Στην εικόνα 3.4 δίνεται σχηματικά ο 36
Εικόνα 3.4 Μέτρηση παράλληλα και κάθετα γραμμικά πολωμένων εντάσεων φθορισμού. Οι δύο αυτές εντάσεις του φθορισμού χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της ανισοτροπίας. Συγκεκριμένα η ανισοτροπία πειραματικά προσδιορίζεται από την παρακάτω σχέση: (3-1) Η ανισοτροπία είναι μια αδιάστατη ποσότητα η οποία δεν εξαρτάται από την ολική ένταση φθορισμού του δείγματος, αφού η διαφορά είναι κανονικοποιημένη ως προς την ολική ένταση ( ). Επιπλεόν με απουσία προσμείξεων στο δείγμα, η ανισοτροπία είναι ανεξάρτητη και από την συγκέντρωση του φθοροφόρου μορίου. Οι πληροφορίες που δίνονται από την ανισοτροπία για ένα μόριο μπορούν επίσης να ληφθούν από το μέγεθος που ονομάζεται πολωσιμότητα, η οποία ορίζεται ως: (3-2) Προτιμάται όμως η μελέτη των μορίων μέσω της ανισοτροπίας αφού είναι κανονικοποιημένη ως προς την ολική ένταση και οι εξισώσεις έχουν πιο απλουστευμένη μορφή. Η πολωσιμότητα και η ανισοτροπία συνδέονται μέσω των σχέσεων: (3-3) (3-4) Στην περίπτωση όπου το φως που ανιχνεύεται είναι πολωμένο παράλληλα στον πολωτή, τότε και. Αυτό δεν είναι δυνατόν να παρατηρηθεί σε ομοιογενές δείγμα με τυχαία προσανατολισμένα φθορίζοντα μόρια. Παρατηρείται όμως σε δείγμα το οποίο σκεδάζει πλήρως το προσπίπτον φως. Στην περίπτωση όπου ο εκπεμπόμενος φθορισμός ενός δείγματος είναι μη τότε, άρα. Σε ενδιάμεσες περιπτώσεις οι τιμές των και διαφέρουν. 37
3.3 Θεωρητικός προσδιορισμός της ανισοτροπίας φθορισμού Σε ένα απλουστευμένο θεωρητικό μοντέλο η ανισοτροπία φθορισμού μπορεί να μελετηθεί με την βοήθεια ενός μορίου το οποίο έχει παράλληλες διπολικές ροπές απορρόφησης και εκπομπής.ο προσανατολισμός του μορίου αυτού είναι τυχαίος ως προς το σύστημα αναφοράς που ορίζεται από την διεύθυνση πόλωσης του φωτός διέγερσης (παράλληλη στον άξονα z). Στην εικόνα 3.5 φαίνεται το σύστημα συντεταγμένων και ο τυχαίος προσανατολισμός ενός φθοροφόρου μορίου. Είναι γνωστό ότι τα φθοροφόρα μόρια μέτα την διέγερσή τους συμπεριφέρονται ως ταλαντούμενα δίπολα τα οποία ακτινοβολούν. Με τις υποθέσεις επομένως των παράλληλων διπολικών ροπών, την μη περιστροφή του μορίου, του τυχαίου προσανατολισμού του μορίου όταν βρίσκεται στην θεμελιώδη κατάσταση και της χρήσης του συστήματος αναφοράς που ορίζεται από την πόλωση του φωτός διέγερσης είναι δυνατόν να απλοποιηθούν οι υπολογισμοί για τον προσδιορισμό της ανισοτροπίας. Εικόνα 3.5Σύστημα συντεταγμένων και ο τυχαίος προσανατολισμός ενός φθοροφόρου μορίου. Το ηλεκτρικό πεδίο που παράγεται από ένα ταλαντούμενο δίπολο σε διεύθυνση θ ως προς τον άξονα του ταλαντούμενου διπόλου δίνεται από την σχέση: (3-5) όπου k είναι μια σταθερά, r είναι η απόσταση ενός σημείου που βρίσκεται πάνω στην διεύθυνση που έχει η γωνία θ από το φθοροφόρο μόριο (ταλαντούμενο δίπολο) και 38
είναι το μοναδιαίο διάνυσμα πάνω στην διεύθυνση που μας ενδιαφέρει. Η ένταση του εκπεμπόμενου φωτός είναι ανάλογη του τετραγώνου του ηλεκτρικού πεδίου, δηλαδή: (3-6) όπου είναι το μοναδιαίο διάνυσμα κατά μήκος του άξονα διάδοσης του εκπεμπόμενου φωτός και k μια σταθερά. Η ένταση του εκπεμόμενου φωτός το οποίο είναι πολωμένο σε κάποιον άξονα είναι ανάλογη της προβολής της διπολικής ροπής μετάβασης σε αυτόν τον άξονα. Έτσι με την βοήθεια της εικόνας 3.5 μπορούν να οριστούν οι εντάσεις: (3-7) (3-8) Η ανισοτροπία υπολογίζεται λαμβάνοντας υπόψιν τις μέσες τιμές των εντάσεων. Για τυχαία προσανατολισμένα φθοροφόρα μόρια όταν αυτά έχουν μια γωνία φ με τον άξονα y, η πιθανότητα διέγερσης τους από γραμμικά πολωμένο φως παράλληλα στον άξονα z είναι η ίδια. Επομένως υπάρχει αζιμουθιακή ανεξαρτησία και η μέση τιμή του μπορεί να δωθεί ως: (3-9) Επομένως οι εντάσεις γίνονται: (3-10) (3-11) Τα μόρια που είναι προσανατολισμένα με κάποια γωνία θ ως προς τον άξονα z έχουν πιθανότητα διέγερσης. Επομένως οι εντάσεις μπορούν να υπολογιστούν ως εξής: (3-12) (3-13) όπου k είναι μία σταθερά. Επομένως με την χρήση των σχέσεων (3-1), (3-12), (3-13) και της ταυτότητας, η ανισοτροπία μπορεί να υπολογιστεί συναρτησει της γωνίας θ (που ορίζεται από τον άξονα z και την διπολική ροπή τόσο της απορρόφησης όσο και της εκπομπής αφού είναι παράλληλες): 39
(3-14) Για ένα μόνο φθοροφόρο μόριο με προσανατολισμό παράλληλο στον άξονα z ως προς το επίπεδο πόλωσης του φωτός διέγερσης η γωνία θ ισούται με μηδέν και η ανισοτροπία είναι 1.0. Ωστόσο δεν είναι δυνατόν να υπάρχουν πλήρως προσανατολισμένα μόρια επομένως η ανισοτροπία είναι πάντα μικρότερη της μονάδας. Για μηδενική ανιστοτροπία η μέση τιμή του τετραγώνου του cosθ πρέπει να ισούται με, αυτό σημαίνει ότι η γωνία θ είναι 54.7. Πιο συγκεκριμένη μελέτη της ανισοτροπίας μπορεί να γίνει αν προσδιοριστεί η πιθανότητα διέγερσης του μορίου. Η πιθανότητα αυτή είναι ανάλογη του, όπου θ είναι η γωνία μεταξύ της διπολικής ροπής απορρόφησης και του αξονα z (αυτό μπορεί να γίνει κατανοητό εάν ληφθεί υπόψιν το φαινόμενο photoselection). Επιπλέον είναι ανάλογη του. Ο όρος αυτός οφείλεται σε τυχαία προσανατολισμένα μόρια που βρίσκονται στην θεμελιώδη κατάσταση. Άρα: (3-15) H σχέση (3-15) καθορίζει την μέγιστη πιθανότητα διέγερσης του μορίου με την απορρόφηση ενός μόνο φωτονίου από αυτό. Η ανισοτροπία εξαρτάται από το επομένως: (3-16) με αντικατάσταση της (3-15) στην (3-16), το ισούται με. Επιπλέον από την σχέση (3-14) μπορεί να προσδιοριστεί η τιμή της μέγιστης ανισοτροπίας που είναι δυνατόν να έχει ένα μόριο η οποία είναι 0.4. Αυτή η τιμή είναι δυνατόν να παρατηρηθεί για παράλληλες μεταξύ τους διπολικές ροπές απορρόφησης και εκπομπής και όταν δεν υπάρχουν άλλα φαινόμενα που να επηρεάζουν την ανισοτροπία (όπως η περιστροφή του μορίου). Μεγαλύτερες τιμές ανισοτροπίας από 0.4 μπορούν να οφείλονται είτε στο γεγονός ότι εκτός από τον εκπεμπόμενο φθορισμό υπάρχει και σκεδαζόμενο φως, είτε σε απορρόφηση περισσοτέρων από ένα φωτόνιων από το μόριο ή πλήηρως προσανατολισμένα μόρια. 40
Η ανισοτροπία εξαρτάται από το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί με τον διαφορετικό προσανατολισμό των διπολικών ροπών απορρόφησης και εκπομπής του μορίου. Οι εξισώσεις (3-5)-(3-16) χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της ανισοτροπίας όταν το μόριο είχε τυχαίο προσανατολισμό της διπολικής ροπής εκπομπής από τον άξονα z (γωνία θ, ). Με όμοιο τρόπο εάν η γωνία μεταξύ των διπολικών ροπών απορρόφησης και εκπομπής είναι β, τότε η ανισοτροπία θα είναι: (3-17) όπου ο όρος οφείλεται στο φαινόμενο photoselection. Αφού ο προσανατολισμός της διπολικής ροπής απορρόφησης διαφέρει για κάθε διεγερμένο επίπεδο, η γωνία β είναι διαφορετική για κάθε μήκος κύματος διέγερσης και επομένως η ανισοτροπία εξαρτάται από αυτό. Η ανισοτροπία συνήθως είναι ανεξάρτητη από το μήκος κύματος εκπομπής (φθορισμού), αφού η εκπομπή του φθορισμού προέρχεται σχεδόν πάντα από την χαμηλότερη διεγερμένη κατάσταση. Συνοπτικά, για οποιοδήποτε μόριο τυχαία προσανατολισμένο σε κάποιο διάλυμα και με διέγερση μόνο από ένα φωτόνιο, η ανισοτροπία μπορεί να πάρει τιμές από -0.20 έως 0.4. Όταν γωνία β μεταξυ των διπολικών ροπών απορρόφησης και εκπομπής είναι μηδέν τότε η τιμή της ανισοτροπίας είναι 0.4. Όταν ηγωνία είναι 54.7 η ανισοτροπία είναι μηδενική, και τέλοςόταν η γωνία είναι 90 η ανισοτροπία είναι -0.20 Εάν η εκπομπή του φθορισμού προέρχεται από παραπάνω από ένα διεγερμένα επίπεδα τα οποία έχουν διαφορετικά φάσματα εκπομπής, τότε μόνο η ανισοτροπία εξαρτάται από το μήκος κύματος εκπομπής. Αύτη η εξάρτηση μπορεί να προκληθεί κυρίως από το φαινομένο της χαλάρωσης λόγω διαλύτη. Ουσιαστικά αυτόπου συμβαίνει είναι να αυξάνεται ο χρόνος ζωής στα μεγαλύτερα μήκη κύματος με αποτέλεσμα να γίνεται μεγαλύτερη αποπόλωση των μορίων. Αυτό οδηγεί και στην μείωση της ανισοτροπίας στα μεγαλύτερα μήκη κύματος εκπομπής συγκριτικά με μικρότερα. Ως φάσμα ανισοτροπίας ορίζεται η ανισοτροπία συναρτήσει του μήκους κύματος διέγερσης. Από το φάσμα αυτό είναι δυνατόν να προσδιοριστεί η γωνία β μεταξύ των διπολικών ροπών μετάβασης, ωστόσο δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί ο προσανατολισμός τους ξεχωριστά. 3.4 Πειραματικός προσδιορισμός της ανισοτροπίας φθορισμού Δύο είναι οι βασικές πειραματικές μέθοδοι προσδιορισμού της ανισοτροπίας, η γεωμετρία L και η γεωμετρία T. Η διαφορά των δύο αυτών γεωμετριών είναι ότι στην 41
Lμετρώνται ξεχωριστά η παράλληλη και κάθετη συνιστώσα της έντασης του φθορισμού, ενώ στην T γεωμετρία μετρώνται ταυτόχρονα. 3.4.1 Γεωμετρία L Εικόνα 3.6(α) Μέτρηση της ανισοτροπίας και (β) προσδιορισμός του G - factorμε την Γεωμετρία L. Στην εικόνα 3.6 φαίνεται σχηματικά η μέτρηση της ανισοτροπίας με την χρήση της γεωμετρίας L. Κατά την γεωμετρία L, η ανισοτροπία μελετάται από την ανίχνευση της έντασης του εκπεμπόμενου φθορισμού μέσω ενός μονοχρωμάτορα.όταν το δείγμα διεγείρεται από κατακόρυφα γραμμικά πολωμένο φως η διαπερατότητα του μονοχρωμάτορα στην παράλληλη και κάθετη διεύθυνση της έντασης του φθορισμού είναι διαφορετική. Οι μετρούμενες εντάσεις συνεπώς δεν είναι αυτές που απαιτούνται για τον υπολογισμό της ανισοτροπίας αλλά είναι ανάλογες της διαπερατότητας του μονοχρωμάτορα. Για τον σωστό προσδιορισμό της ανισοτροπίας είναι απαραίτητο να υπολογιστούν οι εντάσεις ανεπηρέαστες από το σύστημα ανίχνευσης. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί με την εισαγωγή ενός διορθωτικού παράγοντα ο οποίος ονομάζεται G factor. Η σημασία του G factor μπορεί να γίνει κατανοητή με το ακόλουθο παράδειγμα, όταν ο εκπεμόμενος φθορισμός στην κατακόρυφη διεύθυνση μετράται με διπλάσια αποδοτικότητα από ότι στην οριζόντια αυτό σημαίνει ότι ο G factor είναι 2. Ο G factor εξαρτάται από το μήκος κύματος της εκπομπής του φθορισμού και προσδιορίζεται από τις εντάσεις του φθορισμού ως εξής: Για κάθετη διέγερση του φθοροφόρου μορίου οι ανιχνεύσιμες εντάσεις είναι είτε κάθετη είτε παράλληλη ( ) και δίνονται αντίστοιχα από τις σχέσεις: (3-18) 42
(3-19) όπου k είναι ένας παράγοντας ανάλογος της κβαντικής απόδοσης φθορισμού του φθοροφόρου μορίου και είναι παράγοντες σχετικοί με την ευαισθητοποίηση του μονοχρωμάτορα στις αντίστοιχες διευθύνσεις ανίχνευσης του φθορισμού. Η διαίρεση των παραπάνω σχέσεων δίνει: (3-20) όπου, και, είναι οι μετρούμενες και οι πραγματικές εντάσεις του φθορισμού αντίσοιχα. Επομένως: (3-21) Όμοίως ο G factor μπορεί να προσδοιριστεί και όταν το δείγμα διεγείρεται με οριζόντια γραμμικά πολωμένο φως. Δηλαδή: Από το συνδυασμό των σχέσεων και (3-22) (3-23) Η ανισοτροπία από την σχέση (3-1) μπορεί να υπολογιστεί ως: (3-24) Επομένως: (3-25) 43
3.4.2 Γεωμετρία Τ Εικόνα 3.7(α) Μέτρηση της ανισοτροπίας και (β) προσδιορισμός του G - factor με την Γεωμετρία Τ. Στην εικόνα 3.7 φαίνεται σχηματικά η μέτρηση της ανισοτροπίας με την χρήση της γεωμετρίας Τ, όπου οι παράλληλες και κάθετες συνιστώσες της εντάσεως εκπομπής του φθορισμού μετρόνται ταυτόχρονα. Με μετρήσεις των εντάσεων φθορισμού για κάθετη και παράλληλη πόλωση μπορεί να προσδιοριστεί οι λόγοι: (3-26) (3-27) Από την διαίρεση των σχέσεων (3-18) με (3-19) και σε συνδυασμό με την σχέση (3-24) μπορεί να προσδιοριστεί η ανισοτροπία. 3.5 Η επίδραση της περιστροφής των μορίων στον προσδιορισμό της ανισοτροπίας Ένας από τους βασικότερους λόγους μεταβολής της πόλωσης φθορισμού ενός φθοροφόρου μορίου είναι η περιστροφή του κατά την διάρκεια που αυτό είναι διεγερμένο. Η μεταβολή αυτή είναι δυνατόν να εκφραστεί μαθηματικά μέσω της εξίσωσης Perrin: (3-28) όπουr είναι η μετρούμενη ανισοτροπία,r 0 είναι η ανισοτροπία του μορίου (για t=0), τ είναι ο χρόνος ζωής του φθορισμού, θ είναι ο χρόνος περιστροφής του μορίου και D είναι 44
ο συντελεστής διάχυσης περιστροφής (rotational diffusion coefficient). Εάν ο χρόνος περιστροφής είναι πολύ μεγαλύτερος από τον χρόνο ζωής του μορίου ( )τότε η μετρούμενη ανισοτροπία (r) ισούται με την αρχική ανισοτροπία (r 0 ). Αντιθέτως, εάν ο χρόνος περιστροφής είναι πολύ μικρότερος από τον χρόνο ζωής του μορίου τότε η μετρούμενη ανισοτροπία είναι μηδέν. Σε μια ενδιάμεση περίπτωση, όπου ο χρόνος περιστροφής του μορίου είναι συγκρίσιμος με τον χρόνο ζωής του ( ), μέσωτης εξίσωσης Perrin μπορεί να προσδιοριστεί η ανισοτροπία συναρτήσει του χρόνου. Συγεκριμένα, για σφαιρικό μόριο η ανισοτροπία δίνεται: (3-29) Η ανισοτρόπια εμφανίζει ένα μόνο εκθετικό για σφαιρικά μόρια αφού σε αυτά υπάρχει ένας μόνο τρόπος περιστροφής. Τα μη σφαιρικά μόρια (π.χ. ελληψοειδή) έχουν περισότερούς από έναν άξονες περιστροφής και κατά συνέπεια είναι λογικό η ανισοτροπία να εμφανίζει περισσότερα από ένα εκθετικά. Η ανισοτροπία σταθερής κατάστασης δίνεται από την ολοκλήρωση: (3-30) 3.6 Η επίδραση του περιβάλλοντος στην περιστροφή και την ανισοτροπία ενός φθοροφόρου μορίου Μια από τις πιο ενδιαφέρουσες μελέτες που μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της μέτρησης της ανισοτροπίας ενός φθοροφόρου μορίου είναι αυτή του περιβάλλοντος στο οποίο βρίσκεται. Συγκεκριμένα εάν ένα μόριο βρίσκεται εντός διαλύματος η περιστροφή του εξαρτάται άμεσα από το ιξώδες του διαλύματος. Κατά συνέπεια η ανισοτροπία του μορίου επηρεάζεται από την αλληλεπίδραση φθοροφόρου μορίου με τα μόρια του διαλύτη. Η δυνατότητα μέτρησης της ανισοτροπίας μπορεί να δώσει τόσο πληροφορίες για το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται το φθοροφόρο μόριο όσο και για το ίδιο το φθοροφόρο μόριο. [12] Ο Stokes το 1851 ήταν ο πρώτος που διατύπωσε τη σχέση μεταξύ της δύναμης που ασκείται από ένα υγρό σε ένα σφαιρικό μόριο συναρτήσει του ιξώδους του υγρού αυτού: (3-31) 45
όπου n το ιξώδες του υγρού, r και u είναι η ακτίνα και η ταχύτητα περιστροφής του σφαιρικού μορίου αντίστοιχα. Η μελέτη του Einstein στην διάχυση των σωματιδίων (1960) οδήγησε σε μια νέα σχέση γνωστή ως Stokes Einstein η οποία δίνει τον συντελεστη διάχυσης D μιας σφαίρας συναρτήσει του ιξώδους: (3-32) όπου k είναι η σταθερά Boltzmann, Τ η θερμοκρασία σε βαθμούς Kelvin και ξ o συντελεστης τριβής ( ). Η διάχυση των σφαιρικών σωματιδίων μπορεί να είναι είτε μεταφορική είτε περιστροφική. Επομένως οι αντίστοιχοι συντελεστές διάχυσης μεταφοράς και περιστροφής δίνονται: (3-33) (3-34) όπου r και V η υδροδυναμική ακτίνα και όγκος του σωματιδίου αντίστοιχα. Οι εξισώσεις (3-33) και (3-34) ισχύουν μόνο στην περίπτωση όπου το σωματίδιο θεωρείται σφαιρικό, οι διαστάσεις του είναι αρκετά μεγάλες συγκριτικά με τις μοριακές διαστάσεις, κινείται εντός ομογενούς Νευτώνιου υγρού και πληρείται ο υδροδυναμικός νόμος του Stokes. Συνεπώς, είναι δύσκολο να προσδιοριστεί μια ακριβής σχέση μεταξύ του συντελεστή διάχυσης και του ιξώδους. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το ιξώδες αποτελεί μια μακροσκοπική παράμετρο ενώ τα μόρια βρίσκοται σε μικροσκοπική κλίμακα. Πολλά μοντελά έχουν αναπτυχθεί για τον καλύτερο προσδιορισμό της σχέσεως αυτής. Ένα από αυτά αποτελεί και το μοντέλο Stokes Einstein Debye. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό ο συντελεστής διάχυσης περιστροφής δίνεται από τον τύπο: (3-35) όπου f είναι ένας συντελεστής ο οποίος προσδιορίζεται από το σχήμα του μορίου. Συγκεκριμένα, για σφαιρικά μόρια και για μη σφαιρικά μόρια. Ο όροςc στην σχέση (3-35) είναι ένας παράγοντας που προσδιορίζει τον τρόπο αλληλεπίδρασης του μορίου με το περιβάλλον του. Η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να προσεγγιστεί με δύο διαφορετικούς τρόπους οι οποίοι αποτελούν και τις αντίστοιχες συνοριακές συνθήκες στο μοντέλο Stokes Einstein Debye: 46
Συνοριακή συνθήκη stick: Στην περίπτωση αυτή ένα λεπτό στρώμα διαλύτη θεωρείται ότι είναι κολημένο πάνω στο φθοροφόρο μόριο το οποίο εμποδίζει και προκαλεί επιβράδυνση στην περιστροφή του μορίου. Ο συντελεστής C για την συνοριακή συνθήκη stick ισούται με 1. Συνοριακή συνθήκη slip: Στην περίπτωση αυτή μελετάται η αλληλεπίδραση φθοροφόρου μορίου με τα μόρια του διαλύτη. Το φθοροφόρο μόριο μετατοπίζει τα μόρια του διαλύτη κατά την περιστροφή του. Ο παράγοντας C βρίσκεται μεταξύ ανάλογα με το σχήμα του μορίου. Στην περίπτωση των σφαιρικών φθοροφόρων μορίων δεν είναι δυνατόν να μετατοπιστούν μόρια διαλύτη και επομένως.επομένως η προσέγγιση αυτή δεν ισχύει για σφαιρικά μόρια καθώς αυτό σημαίνει ότι περιστρέφονται με άπειρη σταθερά διάχυσης. Η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιείται στα ελλειπτικά μόρια ενώ στα σφαιρικά μόρια γίνεται προσέγγιση με την συνοριακή συνθηκη stick.[13],[14] Στην εικόνα 3.8 φαίνονται σχηματικά οι δύο προσεγγίσεις για τις συνοριακές συνθήκες slip και stick (α) και (β) αντίστοιχα. Εικόνα 3. 8 Σχηματικά οι συνοριακές συνθήκες (α) stick και (β) slip. Είναι προφανές από τις σχέσεις (3-29) και (3-35) ότι για σφαιρικό μόριο ο χρόνος περιστροφής του (ο οποίος προσδιορίζεται από την μελέτη της ανισοτροπίας) συνδέεται με το ιξώδες ως εξής: (3-36) όπου για σφαιρικά μόρια και λαμβάνοντας υπόψιν την συνοριακή συνθήκη stick: (3-37) 47
Κεφάλαιο 4. Πειραματική μελέτη. Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης 4.1 Εισαγωγή Η φασματοσκοπική μελέτη μορίων μπορεί να διακριθεί σε δύο βασικές κατηγορίες: (α) την φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης και (β) την φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης. Στην περίπτωση της φασματοσκοπίας σταθερής κατάστασης τα υπό μελέτη μόρια ακτινοβολούνται από συνεχές φως διέγερσης. Τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής που λαμβάνονται συνήθως από αυτά είναι χρονικά ανεξάρτητα, δίνουν δηλαδή πληροφορίες για την δομή των μορίων αφού αυτά έχουν έρθει σε μια ισσοροπία με το περιβάλλον τους μετά την διέγερση. Πειραματικά έγινε η φασματοσκοπική μελέτη σταθερής κατάστασης των ιδιοτήτων τριων οργανικών χρωστικών τα ονόματα των οποίων είναι: coumarin 30 (C30) fluorescein isothiocyanate (FITC) dichlorofluorescein (DCF) Τα μόρια αυτά μελετήθηκαν μεμονωμένα σε μορφή διαλυμάτων καθώς και σε μείγματα μεταξύ τους με στόχο τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεών τους. Στην εικόνα 4.1 φαίνονται οι χημικές δομές τους. Εικόνα 4.1Χημικές δομές μορίων (α) coumarin 30 (C30) (β) fluoresceinisothiocyanate (FITC) (γ) dichlorofluorescein (DCF). 48
4.2 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης στην C30 4.2.1 Γενικές πληροφορίες για την C30 Όπως έχει ήδη αναφερθεί το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται ένα μόριο επηρεάζει άμεσα τις φωτοφυσικέςτουιδιότητές. Περιβάλλον για ένα χρωμοφόρο μόριο στην περίπτωση που γίνεται μελέτη διαλυμάτων θεωρείται ο διαλύτης. Οι διαλύτες μπορούν να διακριθούν σε τρεις βασικές κατηγορίες: τους μη πολικούς, τους μέτριας πολικότητας και τους πολικούς διαλύτες. Οι πολικοί διαλύτες επιπλέον μπορούν να είναι είτε προτικοί είτε απροτικοί. Προτικός διαλύτης είναι αυτός που περιέχει ένα άτομο υδρογόνου δεμένο με ένα άτομο οξυγόνου (ομάδα υδροξυλίου) ή με ένα άτομο αζώτου (αμινομάδα). Οι προτικοί διαλύτες μπόρουν να δώσουν ιόντα υδρογόνου στα χρωμοφόρα μόρια και να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου. Ο σχηματισμός δεσμών υδρογόνου μεταξύ χρωμοφόρων διαλύτη αποτελεί ειδική αλληλεπίδραση και επιφέρει σημαντικές αλλαγές στις ιδιότητες του χρωμοφόρου. Αντιθέτως, οι απροτικοί διαλύτες δεν μπορούν να δώσουν ιόντα υδρογόνου στα χρωμοφόρα μόρια. Οι φωτοφυσικές ιδιότητες της C30 (μετατόπιση Stokes, κβαντική απόδοση, χρόνος ζωής, μη ακτινοβολητικός και ακτινοβολητικός ρυθμός αποδιέγερσης) εμφανίζουν στους περισσότερους διαλύτες γραμμική εξάρτηση με την πολικότητα. Σε συγκεκριμένες όμως περιπτώσεις η μορφολογία της C30 αλλάζει με αποτέλεσμα την παρατήρηση διαφορετικών από το αναμενόμενο μεταβολών στις φωτοφυσικές της ιδιότητες. Συγκεκριμένα, (α) σε μη πολικούς διαλύτες η C30 παρουσιάζει μη πολική μορφή, (β) σε μέτριας πολικότητας διαλύτες η C30παρουσιάζει πολική μορφή με αποτέλεσμα την εμφάνιση της στάθμης ενδομορικής μεταφοράς φορτίου (intramolecular charge transfer state, ICT) (γ) σε προτικούς διαλύτες πραγματοποιείται δεσμός υδρογόνου μεταξύ της C30 και των μορίων του διαλύτη και (δ) σε πολύ πολικούς προτικούς διαλύτες προκαλέιται στρέψη του μορίου της C30με αποτέλεσμα την εμφάνιση της ενεργειακής στάθμης Twisted intramolecular charge transfer state (TICT). [15] 4.2.2 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής της C30 Η C30 μελετήθηκε σε τέσσερις διαφορετικούς διαλύτες: Τολουόλιο (Toluene, TOL), μη πολικός διαλύτης Τετραϋδροφουράνιο (Τetrahydrofuran, THF), μέτρια πολικός απροτικός διαλύτης Ακετόνη (Acetone, ACT), πολικός απροτικός διαλύτης 49
Απορρόφηση Φθορισμός Αιθανόλη (Ethanol, EtOH), πολικός προτικός διαλύτης Η συγκέντρωση της C30στους τρείς πρώτους διαλύτες ήταν 10-6 Μ, ενώ στην αιθανόλη η C30 μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις 10-3 Μ, 10-4 Μ, 10-5 Μ, 10-6 Μ, 10-7 Μ. Στο σχήμα 4.1 φαίνονται τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής (με διέγερση στα 400 nm) της C30 στους διάφορους διαλύτες σε συγκέντρωση 10-6 Μ. Στην περίπτωση της αιθανόλης στις διάφορες συγκεντρώσεις τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής είναι όμοια με εκείνα της συγκέντρωσης 10-6 Μ. Για τον λόγο αυτό δεν παρουσιάζονται. 1,0 απορρόφηση C 30 σε TOL απορρόφηση C 30 σε THF απορρόφηση C 30 σε ACT απορρόφηση C 30 σε EtOH εκπομπή C 30 σε TOL εκπομπή C 30 σε THF εκπομπή C 30 σε ACT εκπομπή C 30 σε EtOH 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 350 400 450 500 550 600 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.1 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής τηςc30στους διαλύτες Τολουόλιο, Τετραϋδροφουράνιο, ακετόνη, Αιθανόλη σε συγκέντρωση 10-6 Μ. Στο σχήμα 4.1 παρατηρείται μια μετατόπιση προς μεγαλύτερα μήκη κύματος στο φάσμα φθορισμού της C30 με την αύξηση της πολικότητας του διαλύτη. Αυτό οφείλεται στην πολική μορφή που έχει το μόριο της C30 και τη δημιουργία στάθμης ενδομοριακής μεταφοράς φορτίου η οποία χαλαρώνει ενεργειακά λόγω διαλύτη (παράγραφος 2.4). Στον πίνακα που ακολουθεί (πίνακας 4.1) δίνονται τα μέγιστα απορρόφησης και εκπομπής της C30 στους διάφορους διαλύτες για συγκέντρωση ίση με10-6 Μ. 50
Διαλύτης λ max,απορρόφησης (nm) λ max,εκπομπής (nm) Τολουόλιο 407 465 Τετραϋδροφουράνιο 407 468,5 Ακετόνη 407 471 Αιθανόλη 412 478 Πίνακας 4.1 Μέγιστα απορρόφησης και εκπομπής C30 σε διάφορους διαλύτες για συγκέντρωση 10-6 Μ. 4.2.3 Διάγραμμα Lippert Mataga για την C30 Στην παράγραφο 2.4.1 έγινε η περιγραφή της εξισώσεως Lippert Mataga: (4-1) όπου είναι η μετόπιση Stokes, h η σταθερά του Plank, c η ταχύτητα του φωτός, η διαφορά των διπολικών ροπών της διεγερμένης με την θεμελιώδη κατάσταση, a η ακτίνα του μορίου και Δf πολωσιμότητα του διαλύτη, η οποία εξαρτάται από την διηλεκτρική σταθερά και από τον δείκτη διάθλασής του και δίνεται από την σχέση: (4-2) Σύμφωνα με την εξίσωση (4-1), με πραγματοποίηση των πράξεων στο σύστημα C.G.S. είναι δυνατον να προσδιοριστεί η διαφορά των διπολικών ροπών της C30. Συγκεκριμένα, με την σχεδίαση της γραφικής παράστασης όπου στον κατακόρυφο άξονα είναι η μετατόπιση Stokes σε cm-1 ενώ στον οριζόντιο άξονα είναι η πολωσιμότητατων διαλυτών είναι δυνατόν να ληφθεί η κλίση της ευθείας:. Η κλίση αυτή πρέπει να προσδιοριστεί με προσοχή, αφού διαφορετική γραφική παράσταση δημιουργείται από προτικούς και διαφορετική από απροτικούς διαλύτες [16]. Η ταχύτητα του φωτός και η σταθερά Plank έχουν γνωστές τιμές. H ακτίνα του μορίου της C30 που πρέπει να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμός της διαφοράς της διπολικής ροπής μέσω του διαγράμματος Lippert Mataga ονομάζεται Onsager radius και προσδιορίζεται από μια μέθοδο γνωστή ως atomic increment method. Η τιμή της Onsager radius για την C30 προσδιορίζεται από την βιβλιογραφία στα 4.2. Στο πίνακα που ακολουθεί (πίνακας 4.2) δίνονται η διηλεκτρική σταθερά, ο δείκτης διάθλασης, η πολωσιμότητα των διαλυτών και η μετατόπιση Stokes στις περιπτώσεις όπου η C30 είχε διαλυθεί σε τολουόλιο, 51
Mετατόπιση Stokes (cm -1 ) τετραϋδροφουράνιο και ακετόνη. Στη μελέτη αυτή δεν μπορούν να συνυπολογιστούν τα αποτελέσματα της C30 σε Αιθανόλη, αφού πρόκειται για προτικό διαλύτη. Διαλύτης ε n Δf λ max,απορ (nm) λ max,εκπ (nm) Δν (cm -1 ) τολουόλιο 2,4 1,494 0,0159 407 465 3064,6 Τετραϋδροφουράνιο 7,58 1,405 0,21033 407 468,5 3225,3 ακετόνη 20,6 1,356 0,28514 407 471 3338,6 Πίνακας 4.2 Χαρακτηριστικές τιμές διηλεκτρικής σταθεράς, δείκτη διάθλασης, πολωσιμότητας και μετατόπισης Stokes για την κατασκευή του διαγράμματος Lippert - Mataga Στο σχήμα που ακολουθεί (σχήμα 4.2) φαίνεται το διάγραμμα Lippert Mataga για την C30η κλίση του οποίου είναι:979,31 cm -1. 3350 3300 3250 3200 3150 3100 κλίση = 979,31cm -1 3050 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Δf Σχήμα 4.2 Διάγραμμα Lippert Mataga για την C30 σε διαλύτες τολουόλιο, τετραϋδροφουράνιοκαι ακετόνη. Επομένως, όπου,, 52
Η διπολική ροπή έχει μονάδες Debye όπου. H διαφορά της διπολικής ροπής της διεγερμένης κατάστασης με την θεμελιώδη για την C30 δίνεται Δμ = 2.9 D. Στην βιβλιογραφία έχει προσδιοριστεί η διπολική ροπή της διεγερμένης κατάστασης της C30 μέσω της εξίσωσης Lippert Mataga στα 10.9 D. Ενώ η διπολική ροπή της θεμελιώδους κατάστασης της C30 προσδιορίστηκε μέσω ημιεμπειρκών υπολογισμών των μοριακών τροχιακών και είναι 8.06 D (semi-emperical molecular orbital calculations). Η διαφορά των διπολικών ροπών από την βιβλιογραφία συνεπώς είναι στα 2.84 D η οποία είναι πολύ κοντά σε αυτήν που προσδιορίστηκε από τα παραπάνω πειραματικά δεδομένα.[17] 4.3Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης για την FITC 4.3.1Γενικές πληροφορίες για την Fluorescein (FL) Η χρωστική φλουορεσκίνη (fluorescein, FL) είναι μία από τις πλέον γνωστές χρωστικές με πληθώρα εφαρμογών από τα lasers μέχρι τη βιολογία και συναντάται σε μια μεγάλη ποικιλία παραγώγων μορφών της [18]. Ο πρώτος που παραγματοποιήσε την συνθεσή της ήταν ο Von Bayer το 1871.Ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τόσο της FL όσο και της πλειοψηφίας των παραγώγων της FL αποτελεί το γεγονός ότι εμφανίζει διαφορετικές μορφές όταν βρίσκεται σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Συγκεκριμένα με την αύξηση του ph του περιβάλλοντος που βρίσκεται (όξινο βασικό) είναι δυνατόν να υπάρξουν οι εξής μορφές της FL: κατιόν, ουδέτερο, μονοανιόν και διανιόν. Στην εικόνα 4.2 δίνονται οι χημικές δομές των της FL. H βασική τους διαφορά είναι η απομάκρυνση ενός υδρογόνου από την μια μορφή στην άλλη. Στον πίνακα 4.3 φαίνεται πoιά δομή της fluorescein επικρατεί περισσότερο σε περιβάλλοντα με χαρακτηριστική τιμή ph. Εικόνα 4.2 Χημικές δομές διανιόν, μονοανιόν, ουδέτερο και κατιόν τηςfl. 53
Κυρίαρχη μορφή FL ph Κατιόν Ουδέτερο Μονοανιόν Διανιόν Πίνακας 4.3 Κυρίαρχη χημική δομή της FL σε περιβάλλοντα με χαρακτηριστική τιμή ph. Ένας τρόπος προσδιορισμού της ύπαρξης των χημικών αυτών μορφών εντός διαλυμάτων αποτελεί η φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης. Συγκεκριμένα στα φάσματα απορρόφησης είναι δυνατόν να υπάρξουν διαφορετικές κορυφές απορρόφησης οι οποίες αποδίδονται στις διαφορετικές δομές της FL. Συνήθως στην απορρόφηση εμφανίζονται τρείς κορυφές εκ των οποίων αυτή που βρίσκεται στα μικρότερα μήκη κύματος αποδίδεται στην ουδέτερη μορφή, η αμέσως επόμενη αποδίδεται στο μονοανιόν και αυτή που βρίσκεται στα μεγαλύτερα μήκη κύματος αποδίδεται στο διανιόν. Επιπλέον,οι διαφορετικές μορφές είναι δυνατόν να διαχωριστούν και από τα φάσματα εκπομπής αφού το διανιόν και το μονοανιόν έχουν μεγαλύτερη κβαντική απόδοση (μεγαλύτερη ένταση εκπομπής). [19] 4.3.2Γενικές πληροφορίες για την FITC H FITC αποτελεί ένα παράγωγο μόριο της FL. Συγκεκριμένα η διαφορά τους είναι ότι στο μόριο της FITC έχει αντικατασταθεί ένα άτομο υδρογόνου με την ομάδα. Η ομάδα αυτή αλληλεπιδρά έντονα με αμινομάδες (amine) και σουλφυδρυλομάδες (sulfhydryl) οι οποίες εμπεριέχονται κυρίως σε πρωτεΐνες. Για τον λόγο αυτό η FITC χρησιμοποιούνται σε βιολογικές εφαρμογές και κυρίως για την επισήμανση (label) του μορίου DNA. [20], [21] 4.3.3Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής της FITC HFITC μελετήθηκε σε τρείς διαφορετικούς διαλύτες: Αιθανόλη (Ethanol, EtOH), πολικός προτικός διαλύτης Μεθανόλη (Methanol, MeOH), πολικός προτικός διαλύτης Νερό (Water), πολικός προτικός διαλύτης Στο σχήμα 4.3 φαίνονται τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής (με διέγερση στα 420 nm) της FITC στους τρείς διαλύτες σε συγκέντρωση 10-5 Μ. Οι τρείς αυτοί διαλύτες έχουν ph υψηλότερο από 6.0 και είναι αναμενόμενο στο φάσμα απορρόφησης να εμφανίζεται μόνο η κορυφή της διανιόν μορφής. Παρόλα αυτά τα 54
Aπορρόφηση Φθορισμός φάσματα απορρόφησης των τριών διαλυτών (κυρίως στην αιθανόλη και την μεθανόλη) εμφανίζουν παραπάνω από μια κορυφή. Πιο εκτενής μελέτη για αυτή την μη αναμενόμενη συμπεριφορά έχει γίνει με το μόριο DCF σε αιθανόλη και παρουσιάζεται στην επόμενη παράγραφο. Η εξήγηση που δίνεται για αυτή τη συμπεριφορά της DCF μπορεί ομοίως να δωθεί και για τη FITC. Επιπλεόν, στο σχήμα 4.3 παρατηρείται μετατόπιση στο φάσμα φθορισμού της FITC, προς μεγαλύτερα μήκη κύματος, της FITC με την αύξηση της πολικότητας του διαλύτη. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο φαινόμενο της χαλάρωσης λόγω διαλύτη. [22] 1,0 απορρόφηση FITC σε EtOH απορρόφηση FITC σε MeOH απορρόφηση FITC σε water εκπομπή FITC σε EtOH εκπομπή FITC σε ΜeOH εκπομπή FITC σε water 1,0 0,5 0,5 0,0 400 600 Μήκος κύματος (nm) 0,0 Σχήμα 4.3 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής της FITCστους διαλύτες αιθανόλη, μεθανόλη, νερό σε συγκέντρωση 10-5 Μ. Στον πίνακα που ακολουθεί (πίνακας 4.5) δίνονται τα μέγιστα απορρόφησης και εκπομπής της FITC στους τρείς διαλύτες. 55
Διαλύτης λ max, απορ. (nm) ουδέτερο μονοανιόν διανιόν λ max, εκπ. (nm) Αιθανόλη 430 457 484,5 516,5 Μεθανόλη 430 457 484,5 519,5 Νερό - 460 493,5 521 Πίνακας 4.4 Μέγιστα απορρόφησης και εκπομπής της FITC στους τρείς διαλύτες για συγκέντρωση 10-5 Μ. 4. 4 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης για την DCF 4.4.1 Γενικές πληροφορίες για την DCF Η DCF αποτελεί επίσης ένα παράγωγο μόριο της FL. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση της DCF έχουν προστεθεί δύο άτομα χλωρίου στην χημική δομή μιας απλής FL. Η δομή φαίνεται στο σχήμα 4.1. Ομοίως με την περίπτωση της FITC έτσι και η DCF εμφανίζει διαφορετικές χημικές μορφές (κατιόν, ουδέτερο, μονοανιόν και διανιόν) σε περιβάλλοντα με διαφορετικό ph. [23] 4.4.2 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής για την DCF Hdichofluorescein μελετήθηκε σε έναν μόνο διαλύτη: Αιθανόλη (Ethanol, EtOH), πολικός προτικός διαλύτης σε διάφορες συγκεντρώσεις: Στο σχήμα 4.4 και στο σχήμα 4.5 φαίνονται τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής (με διέγερση στα 490 nm) της DCF στις πέντε αυτές συγκεντρώσεις αντίστοιχα. Στον πίνακα 4.5 παρουσιάζονται τα μέγιστά τους. 56
Φθορισμός Aπορρόφηση 1,0 0,8 0,6 DCF 5 10-4 M DCF 10-4 M DCF 5 10-5 M DCF 10-5 M DCF 5 10-6 M 0,4 0,2 0,0 400 450 500 550 600 650 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.4 Φάσματα απορρόφησης της DCF σε αιθανόλη για πέντε διαφορετικές στυγκεντρώσεις. 1,0 0,8 DCF 5 10-4 M DCF 10-4 M DCF 5 10-5 M DCF 10-5 M DCF 5 10-6 M 0,6 0,4 0,2 0,0 500 550 600 650 700 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.5 Φάσματα εκπομπής με διέγερση στα 490 nm της DCF σε αιθανόλη για πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις. 57
Συγκέντρωση λ max, απορ. (nm) ουδέτερο μονοανιόν Διανιόν λ max, εκπ. (nm) 5 10-4 M 463 493-524 10-4 M 463 493-529 5 10-5 M 463 493 518 534 10-5 M - 487 518 534 5 10-6 M - 487 518 534 Πίνακας 4.5 Μέγιστα απορρόφησης και εκπομπής της DCF σε αιθανόλη για πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις Στην συγκεκριμένη μελέτη από το φάσμα απορρόφησης (σχήμα 4.4) παρατηρούμε ότι η DCF εμφανίζει διαφορετικές μορφές σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ενώ το ph του περιβάλλοντος στο οποίοβρίσκεται παραμένει το ίδιο. Η DCF είναι σε αιθανόλη ( ) όπου σε αυτήν την περίπτωση αναμένεται να υπάρχει σε μεγαλύτερο ποσοστό μόνο το διανιόν στοιχείο της DCF. Αυτό όμως παρατηρείται στις πολύ αραιές συγκεντρώσεις (10-5 Μ και 5 10-6 Μ), ενώ για τις υψηλές συγκεντρώσεις (5 10-4 Μ, 10-4 Μ, 5 10-5 Μ) φαίνεται να συνεισφέρουν στην απορρόφηση και οι άλλες δύο μορφές της DCF. Μια εξήγηση που θα μπορούσε να δωθεί είναι ότι όταν τα μόρια της DCF βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις εντός της αιθανόληςσυσσωματώνονται, με συνέπεια να μην είναι δυνατόν να σχηματιστεί το διανιόν στοιχείο της DCF. Επιπλέον, στα φάσματα απορρόφησης της DCF του σχήματος 4.4 σε υψηλές συγκεντρώσεις παρατηρείται ένας ώμος στα 438 nm. Αυτός ο ώμος μπορεί να αποδωθεί σε συσσωματώματα τύπου H. Συμπεράσματα μπορούν να εξαχθούν και από τα φάσματα εκπομπής της DCF (σχήμα 4.5). Σε υψηλές συγκεντρώσεις της DCF στην αιθανόλη παρατηρείται διεύρυνση των φασμάτωνεκπομπής σε σύγκριση με αυτά των χαμηλότερων συγκεντρώσεων, αυτό επιβεβαιώνει επίσης της ύπαρξη συσσωμάτων. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση της συγκέντρωσης 5 10-4 Μ (που αποτελεί και την πιο υψηλή) παρατηρείται ένας ώμος στα 550 nm, ο οποίος μπορεί να αποδωθεί σε συσσωματώματα τύπου J, ενώ η κυρίαρχη κορυφή στα 524 nm αποδίδεται στο μονοανιόν στοιχείο της DCF. Για τις αραιές συγκεντρώσεις υπάρχει μία μόνο κορυφή εκπομπής στα 534 nm η οποία οφείλεται στο διανιόν στοιχείο της DCF. Τέλος όμοια εξήγηση μπορεί να δοθεί και στην περίπτωση της FITC,όπου και αυτή βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις εντός των διαλυτών. Στο σχήμα 4.6 που ακολουθεί δίνονται τα φάσματα εκπομπής της DCF με διέγερση στα 520 nm, δηλαδή εκεί που απορροφάει το διανιόν. [24] 58
Κανονικοποιημενη ένταση φθορισμού 1,0 0,8 5 10-6 M 10-5 M 5 10-5 M 10-4 M 5 10-4 M 0,6 0,4 0,2 0,0 540 560 580 600 620 640 660 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.6 Φάσματα εκπομπής, με διέγερση στα 520 nm, της DCF σε αιθανόλη για πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η μελέτη των φασμάτων εκπομπής με διέγερση στα 520 nm πραγματοποιήθηκε με στόχο τον προσδιορισμό του μεγίστου εκπομπής συγκεκριμένα του διανιόντος στοιχείου της DCF, αφού αυτό έχει μέγιστο απορρόφησης στα 520 nm. Το μέγιστο εκπομπής της DCF με διέγερση στα 520 nm βρίσκεται μεταξύ 534 537 nm αναλόγως με την συγκέντρωσή της. Συγκεκριμένα με αύξηση της συγκέντρωσης το μέγιστο μετατοπίζεται σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Αυτό μπορεί να αποδωθεί σε συσσωματώματα της DCF. Τέλος, είναι φανερό ότι και στο σχήμα 4.5 όσον αφορά τις αραιές συγκεντρώσεις το μέγιστο εκπομπής μπορεί να αποδοθεί στο διανιόν στοιχείο της DCF. 4.5 Φασματοσκοπία σταθερής κατάστασης σε μείγματα της C30 με τα δύο παράγωγα μόρια της fluorescein FITC και DCF Έκτος από την μελέτη των τρίων παράπανω μορίων ξεχωριστα, πραγματοποιήθηκε και μελέτη μειγμάτων μεταξύ τους με στόχο τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεών τους. Ειδικότερα το σύστημα αυτό πληρεί τις προδιαγραφές για την παρατήρηση του φαινομένου συντονισμένης μεταφοράς ενέργειας φθορισμού (fluorescence resonce energy trasnsfer, FRET), το οποίο αποτελεί ένα είδος απόσβεσης του φθορισμού και έχει 59
περιγραφεί θεωρητικά στην παράγραφο 4.2.1. Στην συγκεκριμένη περίπτωση το μόριο της C30 μπορεί να θεωρηθεί ο δότης ενώ τα δύο παράγωγα μόρια της FL (FITC και DCF) μπορούν να θεωρηθούν οι αποδέκτες για τη κάθε περίπτωση των μειγμάτων. Σε έρευνες που έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια για την μεταφορά ενέργειας μεταξύ των δύο αυτών μορίων έχει διαπιστωθεί ότι η μεταφορά είναι περισσότερο αποδοτική μεταξύ της C30 και του διανιόντος στοιχείου της FL, ενώ έχει παρατηρηθεί και μεταφορά ενέργειας μεταξύ της C30 και του μονοανιόντος στοιχείου με χαμηλότερη απόδοση. Οι μελέτες αυτές γίνονται κυρίως όταν τα δύο μόρια βρίσκονται σε φιλμ (για παράδειγμα: polymethylmethacrylate, PMMA) [25] ή σε μήτρες γιατί σε αυτές τις περιπτώσεις τα μόρια έχουν τις κατάλληλες αποστάσεις για την συντονισμένη μεταφορά ενέργειας φθορισμού. Στην συγκεκριμένη μελέτη τα μόρια της C30 και των παραγώγων της FL βρίσκονται ελεύθερα εντός των διαλυμάτων, αφού αποτελεί ενδιαφέρον ο προσδιορισμός των κατάλληλων συγκεντρώσεων των μορίων έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί η συντονισμένη μεταφορά ενέργειας. [26], [27], [28] Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν δύο ειδών μείγματα: C30 με FITC C30 με DCF και στις δύο παραπάνω περιπτώσεις ο διαλύτης που χρησιμοποιήθηκε ήταν η αιθανόλη. Επιπλέον, σε κάθε περίπτωση η συγκέντρωση της C30 παρέμενε σταθερή, ένω οι συγκεντρώσεις των παραγώγων της FL μεταβάλλονταν σταδιακά. Μια από τις βασικότερες προϋποθέσεις για την πραγματοποιήση συντονισμένης μεταφοράς ενέργειας μεταξύ δύο μορίων είναι να υπάρχει φασματική επικάλυψη του φάσματος εκπομπής του δότη με το φάσμα απορρόφησης του αποδέκτη.στα σχήματα 4.7 και 4.8, 4.9 φαίνεται η φασματική επικάλυψη της εκπομπής της C30 (δότης) με την απορρόφηση της FITC και DCF αντίστοιχα (αποδέκτες). Συγκεκριμένα, το φάσμα επικάλυψης του σχήματος 4.7 είναι για συγκέντρωση της FITC 10-5 Μ. Ενώ, στην περίπτωση των μειγμάτων της C30 με την DCF κατασκευάστηκαν δύο φάσματα επικάλυψης το πρώτο με το φάσμα απορρόφησης συγκέντρωσης της DCF (σχήμα 4.8), ενώ το δεύτερο με το φάσμα απορρόφησης συγκέντρωσης της DCF (σχήμα 4.9). 60
Aπορρόφηση Φθορισμός Aπορρόφηση Φθορισμός φάσμα εκπομπής C30 φάσμα απορρόφησης FITC 1,0 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 400 450 500 550 600 650 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.7 Επικάλυψη του φάσματος εκπομπής της C30 με το φάσμα απορρόφησης τηςfitc συγκέντρωσης 10-5 Μ. 1,0 φάσμα εκπομπής C30 φάσμα απορρόφησης DCF 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 400 450 500 550 600 650 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.8 Επικάλυψη φάσματος εκπομπής C30 με φάσμα απορρόφησης DCF συγκέντρωσης 5 10-4 Μ. 61
Φθορισμός Απορρόφηση 1,0 φάσμα εκπομπής C30 φάσμα απορρόφησης DCF 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 400 450 500 550 600 650 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4. 9 Επικάλυψη φάσματος εκπομπής C30 με φάσμα απορρόφησης DCFσυγκέντρωσης 5 10-6 M. Από τα παραπάνω σχήματα είναι δυνατόν να διαπιστωθεί ότι η επικάλυψη των φασμάτων εκπομπής του δότη με τα φάσματα απορρόφησης των αποδεκτών είναι αρκετά ικανοποιητική για την πραγματοποιήση της συντονισμένης μεταφοράς ενέργειας φθορισμού (FRET). 4.5.1 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής μειγμάτων C30 με FITC Στον πίνακα 4.6 φαίνονται οι αναλογίες μειγμάτων που μελετήθηκαν στην περίπτωση αυτή και δίνονται οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις της C30 και της FITC για κάθε αναλογία. Όλα τα μείγματα των δύο αυτών μορίων είναι σε αιθανόλη. Aναλογία μειγμάτων Συγκέντρωση C30 Συγκέντρωση FITC 1:0.1 5 10-5 M 5 10-6 Μ 1:0.5 5 10-5 M 2.5 10-5 Μ 1:1 5 10-5 M 5 10-5 Μ 1:2 5 10-5 M 10-4 Μ 1:5 5 10-5 M 2.5 10-4 Μ 1:10 5 10-5 M 5 10-4 Μ Πίνακας 4.6 Αναλογίες μειγμάτων των μορίων C30 με FITC και αντίστοιχες συγκεντρώσεις. 62
Aπορρόφηση Στα σχήματα που ακολουθούν (σχήμα 4.10) δίνονται τα φάσματα απορρόφησης των παραπάνω μειγμάτων, ενώ στον πίνακα κάτω από αυτό (πίνακας 4.7) τα μέγιστα απορρόφησης για την κάθε περίπτωση. 3 2 C30:FITC 1:10 1:5 1:2 1:1 1:0.5 1:0.1 1 0 350 400 450 500 550 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.10 Φάσματα απορρόφησης μειγμάτων C30 με FITC. Τα βέλη δείχνουν τις μεταβολές χαρακτηριστικών φασματικών περιοχών με την αύξηση της συγκέντρωσης. Αναλογία μειγμάτων Κορυφή απορρόφησης C30 (nm) Κορυφή απορρόφησης FITC (nm) 1:0.1 417 (412)* 483 (484,5)* 1:0.5 417 482 1:1 417.5 482 1:2 418 482 1:5 419 482 1:10 420 482 Πίνακας 4.7 Μέγιστα απορρόφησης μειγμάτων C30 με FITC σε αιθανόλη, (*) μέγιστο απορρόφησης των μορίων στην περίπτωση που μελετήθηκαν μεμονωμένα. Για την FITC αφορά στην κορυφή απορρόφησης του διανιόντος. Στα παραπάνω φάσματα απορρόφησης παρατηρούνται δύο κορυφές.η μια κορυφή αποδίδεται στην C30 ενώ η δεύτερη στην FITC. Η ύπαρξη της FITC προκαλεί μετατόπιση της κορυφής απορρόφησης της C30 σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Υπενθυμίζεται ότι το μέγιστο απορρόφησης της C30 (χωρίς την ύπαρξη της FITC) σε 63
Απορρόφηση αιθανόλη είναι στα 412 nm. Με την αύξηση της συγκέντρωσης της FITC αυξάνεται η κορυφή απορόφησής της και προκαλείται ακόμη μεγαλύτερη μετατόπιση στην κορυφή απορρόφησης της C30. Τέλος, η κορυφή απορρόφησης στα 482 nm αποδίδεται συγκεκριμένα στο διανιόν στοιχείο της FITC. Οι κορυφές των άλλων στοιχείων (μονοανιόν, ουδέτερο) δεν διακρίνονται (παρά μόνο στην περίπτωση πολύ υψηλής συγκέντρωσης της FITC), καθώς επικαλύπτονται με το φάσμα της C30. Συγκεκριμένα, στην αναλογία μείγματος 1:10, παρατηρείται ένας ώμος στο φάσμα απορρόφησης στα 454 nm. Αυτός οφείλεται στο μονοανιόν στοιχείο της FITC. Στο σχήμα 4.11 φαίνεται το φάσμα απορρόφησης που προκύπτει από την αφαίρεση των φάσματων απορρόφησης των μειγμάτων 1:10 και 1:0.1 και το φάσμα απορρόφησης της FITC των αρχικών διαλυμάτων. Από το σχήμα αυτό είναι δυνατόν να παρατηρηθεί ξεκάθαρα ότι τα φάσματα αυτά είναι όμοια, η κορυφή στα 454 nm που αποδίδεται στο μονοανιόν καθώς και η κορυφή στα 482 nm που αποδίδεται στο διανιόν στοιχείο της FITC. φάσμα απορρόφησης FITC σε αιθανόλη αφαίρεση φασμάτων απορρόφησης μείγματων 1:10 με 1:0.1 σε αιθανόλη 1,0 0,5 0,0 400 500 600 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4. 11 Φάσμα απορρόφησης της FITC που προέκειψε από αφαίρεση των φασμάτων απορρόφησης των μειγμάτων 1:10 με 1:0.1 Στο σχήμα 4.12 δίνονται φάσματα εκπομπής των μειγμάτων της C30 με την FITC, ενώ στον πίνακα 4.8 προσδιορίζονται τα μέγιστα εκπομπής για την κάθε περίπτωση. 64
Φθορισμός 500 400 300 C30:FITC 1:0.1 1:0.5 1:1 1:2 1:5 1:10 200 100 0 450 500 550 600 650 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.12 Φάσματα εκπομπής μειγμάτων C30 με FITC για διέγερση στα 400 nm (μέγιστο της C30). Αναλογία μειγμάτων Κορυφή εκπομπής C30 (nm) Κορυφή εκπομπής FITC (nm) 1:0.1 476 (478)* 505 (516)* 1:0.5 476 506 1:1 475 508 1:2 474 510 1:5 474 512 1:10 473 514 Πίνακας 4.8 Μέγιστα εκπομπής μειγμάτων C30 με FITC, (*) μέγιστα εκπομπής μορίων στηνπερίπτωση που μελετήθηκαν μεμονωμένα. Στα παραπάνω φάσματα εκπομπής παρατηρούνται δύο μέγιστα εκπομπής εκ των οποίων το ένα οφείλεται στην C30 και το δεύτερο στην FITC. Στην περίπτωση των μειγμάτων τα μέγιστα εκπομπής στην αιθανόλη για την C30 και την FITC εμφανίζονται μετατοπισμένα. Υπενθυμίζεται ότι τα μέγιστα της C30 και της FITC στα αρχικά διαλύματα προσδιορίστηκαν στα 478 nm και 516 nm αντίστοιχα.στα μέιγματα παρατηρείται ότι η συνύπαρξη των δύο μορίων προκαλεί μια μετατόπιση στο μέγιστο εκπομπής της C30 σε μικρότερα μήκη κύματος και η μετατόπιση αυτή αυξάνει με την αύξηση της συγκέντρωσης της FITC. Επίσης, μετατόπιση παρατηρείται και στην 65
εκπομή της FITC στην περίπτωση των μειγμάτων. Συγκεκριμένα, το μέγιστο εκπομπής της μετατοπίζεται σε μικρότερα μήκη κύματος. Η μετατόπιση αυτή μικραίνει με την αύξηση της συγκέντρωσής της. Από τα φάσματα εκπομπής προκύπτει επίσης ότι, παρά το γεγονός πωςη συγκέντρωση της C30 είναι η ίδια σε όλες τις περιπτώσεις μειγμάτων η εκπομπή της μειώνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης της FITC. Στην εκπομπή της FITC παρατηρείται μια μικρή μόνο αύξηση η οποία είναι αναμενόμενη αφού αυξάνει και η συγκέντρωσή της. Σε περίπτωση συντονισμένης μεταφοράς ενέργειας φθορισμού (FRET) θα περιμέναμε μείωση της έντασης εκπομπής της C30 και ιδιαίτερα υψηλή αύξηση της εκομπής της FITC. Το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρείται, συνεπώς αυτό σημαίνει ότι η FITC προκαλεί απλώς απόσβεση στον φθορισμό της C30. Επιπλέον, ο συνδυασμός των παραπάνω παρατηρήσεων με τα αποτελεσμάτων που δίνονται από την μελέτη με φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης για τα μείγματα (παράγραφος 5.14) επιβεβαιώνεται η παραπάνω θεώρηση. Συνοψίζοντας η αλληλεπίδραση που πραγματοποιείται στα μείγματα της C30 με την FITC είναι η στατική απόσβεση του φθορισμού της C30 λόγω της ύπαρκης της FITC. [29] 4.5.2 Φάσματα απορρόφησης και εκπομπής μειγμάτων C30 με DCF Για τα μείγματα της C30 με την DCF οι αναλογίες και οι συγκεντώσεις των μορίων φαίνονται στον πίνακα 4.9. Η διαφορά αυτής της περίπτωσης με την προηγούμενη περίπτωση των μειγμάτων (εκτός του διαφορετικού παράγωγου μορίου της FL) είναι ότι η C30 βρίσκεται σε χαμηλότερη συγκέντρωση και κατά συνέπεια και οι διάφορες συγκεντρώσεις της DCF να είναι επίσης χαμηλότερες συγκριτικά με αυτές της FITC. Όπως και στην περίπτωση των μείγματων της C30 με την FITC έτσι και σε αυτήν την περίπτωση όλα τα μείγματα βρίσκονται σε αιθανόλη. Αναλογία μειγμάτων Συγκέντρωση C30 Συγκέντρωση DCF 1:0.1 5 10-6 M 5 10-7 M 1:0.5 5 10-6 M 2.5 10-6 M 1:1 5 10-6 M 5 10-6 M 1:2 5 10-6 M 10-5 M 1:5 5 10-6 M 2.5 10-5 M 1:10 5 10-6 M 5 10-5 M 1:20 5 10-6 M 10-4 M 1:30 5 10-6 M 1.5 10-4 M Πίνακας 4.9 Αναλογίες μειγμάτων των μορίων C30 με DCF και αντίστοιχες συγκεντρώσεις. 66
Aπορρόφηση Στο σχήμα 4.13εικονίζονται τα φάσματα απορρόφησης των μειγμάτων αυτών, ενώ στον πίνακα 4.10 καιπαρουσιάζονται τα μέγιστα απορρόφησής τους. 1,0 0,8 0,6 C30:DCF 1:0.1 1:0.5 1:1 1:2 1:5 1:10 1:20 1:30 0,4 0,2 0,0 350 400 450 500 550 600 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.13 Φάσματα απορρόφησης μειγμάτων C30 με DCF. Τα βέλη δείχνουν τις μεταβολές χαρακτηριστικών φασματικών περιοχών με την αύξηση της συγκέντρωσης. Αναλογία μειγμάτων Κορυφή απορρόφησης C30 (nm) Κορυφές απορρόφησης DCF (nm) ουδέτερο μονοανιόν διανιόν 1:0.1 413 (412)* - - 515 (518)* 1:0.5 413-485 (487)* 515 1:1 412-485 515 1:2 415-485 516 1:5 414-485 516 1:10 412-485 517 1:20 420 462 (463)* 485 517 1:30 425 462 488 518 Πίνακας 4.10 Μέγιστα απορρόφησης μειγμάτων C30 με DCF, (*) μέγιστα εκπομπής μορίων στην περίπτωση που μελετήθηκαν μεμονωμένα. Με βάση τα συγκεκριμένα φάσματα απορρόφησης είναι δυνατόν να γίνουν πολλές ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις. Με την μελέτη που έχει ήδη γίνει με τα μεμονωμένα μόρια είναι εύκολο να διαπιστωθεί ότι η περιοχή 350 450 nm αφορά την απορρόφηση της C30, ενώ η περιοχή 450 600 nm αφορά την απορρόφηση της DCF. 67
Όσον αφορά την απορρόφηση της C30 στα μείγματα, παρατηρείται μετατόπιση του μεγίστου απορρόφησής της σε μεγαλύτερα μήκη κύματος με την αύξηση της συγκέντρωσης της DCF συγκριτικά με την περίπτωση των διαλυμάτων της C30 χωρίς την ύπαρξη της DCF. Για την απορρόφηση της DCF στα μείγματα απαιτείται πιο εκτενής σύγκριση των φασμάτων απορρόφησης με αυτά των αρχικών διαλυμάτων τηςdcf και γίνεται στις παραγράφους που ακολουθούν. Από το φάσμα απορρόφησης των αρχικών διαλυμάτων της DCF σε αιθανόλη (σχήμα 4.4) είναι δυνατόν να προσδιοριστεί μια κρίσιμη τιμή συγκέντρωσής της η οποία είναι η 10-5 Μ. Συγκεκριμένα, για συγκεντρώσεις υψηλότερες από 10-5 Μ, μεγάλη συνεισφορά στο φάσμα απορρόφησης έχουν τα μονοανιόντα και ουδέτερα στοιχεία της DCF, ενώ για την συγκέντρωση 10-5 Μ καθώς και χαμηλότερες, η κυρίαρχη κορυφή απορρόφησης είναι αυτή του διανιόντος στοιχείου. Σε ερευνητικές μελέτες προτιμόνται οι χαμηλές συγκεντρώσεις τόσο για την DCF όσο και για τα υπόλοιπα παράγωγα της FL, έτσι ώστε να μελετάται κυρίως το διανιόν στοιχείο.στο σχήμα 4.14 δίνονται τα μη κανονικοποιημένα φάσματα απορρόφησης της DCF σε αιθανόλη για υψηλές συγκεντρώσεις και στο σχήμα 4.15 για χαμηλές συγκεντρώσεις έτσι ώστε να γίνει άμεσα η οπτική σύγκριση των φασμάτων τόσο μεταξύ των διαφορετικών συγκεντρώσεων όσο και μεταξύ των αρχικών διαλυμάτων της DCF με τα μείγματα. 68
Aπορρόφηση Aπορρόφηση 0,5 0,4 DCF 5 10-4 M DCF 10-4 M DCF 5 10-5 M 0,3 0,2 0,1 0,0 350 400 450 500 550 600 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.14 Φάσματα απορρόφησης DCF σε αιθανόλη για υψηλές συγκεντρώσεις. 0,1 DCF 10-5 M DCF 5 10-6 M 0,0 350 400 450 500 550 600 650 700 Mήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.15 Φάσματα απορρόφησης DCF σε αιθανόλη για χαμηλές συγκεντρώσεις. 69
Στην περίπτωση των μειγμάτων της C30 με την DCF, για τις αναλογίες 1:5 έως 1:30 η συγκεντρώση της DCF κυμαίνεται από 2.5 10-5 M έως 1.5 10-4 M αντίστοιχα (πίνακας 4.14). Συνεπώς, θα περιμέναμε τα φάσματα απορρόφησής των συγκεκριμένων αναλογιών στην περιοχή των 450 600 nm να είναι όμοια με αυτά των υψηλών συγκεντρώσεων των αρχικών διαλυμάτων της DCF (σχήμα 4.14). Αντιθέτως όμως, οι αναλογίες αυτές εμφανίζουν φάσματα απορρόφησης όμοια με αυτών των χαμηλών συγκεντρώσεων (σχήμα 4.15). Αυτό σημαίνει ότι στην συνύπαρξη της C30 με την DCF προκαλούνται κάποιες αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους ικανές να κάνουν την DCF σε υψηλές συγκεντρώσεις να συμπεριφέρεται όμοια με τις χαμηλές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, η παρατήρηση αυτής της συμπεριφοράς των φασμάτων απορρόφησης της DCF μπορεί να επιβεβαιωθεί και από την θέση των μεγίστων απορρόφησης. Με την σύγκριση των πινάκων 4.5 και 4.10 είναι εύκολο να διαπιστωθεί ότι όλες οι αναλογίες μειγμάτων έχουν μέγιστα απορρόφησης για κάθε μορφή της DCF σε θέσεις ίδιες με αυτές των χαμηλών συγκεντρώσεων (10-5 Mκαι 5 10-6 M). Iδιαίτερες περιπτώσεις αποτελούν οι αναλογίες 1:20 και 1:30. Σε αυτές τις περιπτώσεις η μετατόπιση της κορυφής απορρόφησης της C30 είναι ιδιαίτερα μεγάλη, ενώ η απορρόφηση της DCF είναι πλέον πολύ υψηλότερη συγκριτικά με τις άλλες αναλογίες. Επιπλέον, παρατηρείται αναστροφή μεταξύ των δύο αυτών αναλογιών. Η απορρόφηση του διανιόντος της DCF στην αναλογία 1:30 είναι χαμηλότερη από αυτήν της αναλογίας 1:20. Στο σχήμα 4.16 δίνεται το φάσμα απορρόφησης που προκύπτει από την αφαίρεση των φασμάτων απορρόφησης των μειγμάτων 1:30 με 1:0.1, καθώς και τα φάσματα απορρόφησης της DCF όταν μελετήθηκαν μεμονωμένα σε αιθανόλη για τις περιπτώσεις των πυκνών και αραιών συγκεντρώσεων. Ο σκοπός που κατασκευάστηκε αυτό το σχήμα είναι για την άμεση σύγκριση των φασμάτων. 70
Απορρόφηση φάσμα απορρόφησης DCF υψηλών συγκεντρώσεων φάσμα απορρόφησης DCF χαμηλών συγκεντρώσεων αφαίρεση φασμάτων απορρόφησης των μειγμάτων 1:30 με 1:0.1 1,0 0,5 0,0 400 600 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.16 Φάσμα απορρόφησης της DCF που προέκειψε από αφαίρεση των φασμάτων απορρόφησης των μειγμάτων 1:30 με 1:0.1. Από το σχήμα 4.16 είναι πλέον εύκολο να διαπιστωθεί ότι στην περίπτωση των μειγμάτων της C30 με την DCF για υψηλές συγκεντρώσεις της DCF (στην συγκεκριμένη πρίπτωση 1.5 10-4 M), το φάσμα απορρόφησης έχει όμοια μορφή με αυτών των χαμηλών συγκεντρώσεων των αρχικών διαλυμάτων (σχήμα 4.15). Συνοπτικά το συμπέρασμα που μπορεί να διαπιστωθεί είναι ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο μορίων (C30 με DCF) οδηγεί στην εξαφάνιση του ουδέτερου και μονοανιόντος στοιχείων της DCF. Στα σχήματα 4.17 και 4.18 φαίνονται τα φάσματα εκπομπής των μειγμάτων μη κανονικοποιημένα και κανονικοποιημένα ως προς την κορυφή της C30 αντίστοιχα για διέγερση στα 400 nm, ενώ στον πίνακα 4.11 δίνονται τα μέγιστα εκπομπής τους. 71
Kανονικοποιημένη ένταση φθορισμού Φθορισμός 2500 2000 1500 C30:DCF 1:0.1 1:0.5 1:1 1:2 1:5 1:10 1:20 1:30 1000 500 0 400 450 500 550 600 650 Μήκος κύματος (nm) Σχήμα 4.17 Μη κανονικοποιημένα φάσματα εκπομπής μειγμάτων C30 με DCF για διέγερση στα 400 nm. 1,0 0,8 0,6 Βύθισμα C30:DCF 1:0.1 1:0.5 1:1 1:2 1:5 1:10 1:20 1:30 0,4 0,2 0,0 450 500 550 600 650 Mήκος κύματος Σχήμα 4.18 Κανονικοποιημένα φάσματα εκπομής μειγμάτων C30 με DCF για διέγερση στα 400 nm. 72
Αναλογία μειγμάτων Κορυφή εκπομπής C30 (nm) Κορυφή εκπομπής DCF (nm) 1:0.1 478-1:0.5 477 533 1:1 477 534 1:2 477 534 1:5 476 534 1:10 476 534 1:20 475 539 1:30 475 539 Πίνακας 4. 11 Μέγιστα εκπομπής μειγμάτων C30 με DCF. Πληροφορίες μπορούν να εξαχθούν τόσο από τα παραπάνω κανονικοποιημένα όσο και από τα μη κανονικοποιημένα φάσματα εκπομπής των μειγμάτων. Συγκεκριμένα, από το σχήμα 4.17 είναι δυνατόν να παρατηρηθεί ότι η εκπομπή της C30 αυξάνεται από την αναλογία 1:0.1 έως 1:1 και φτάνει σε μια ισορροπία από την αναλογία 1:1 έως 1:10. Στις αναλογίες 1:20 και 1:30 η ένταση της εκπομπής της C30 μειώνεται απότομα. Όσον αφορά την κορυφή εκπομπής της DCF (534 nm) για τις αναλογίες 1:0.1 έως 1:10 φαίνεται σαν ώμος στα φάσματα εκπομπής των μειγμάτων, ενώ για τις αναλογίες 1:20 και 1:30 η κορυφή είναι πλέον διακριτή. Από το σχήμα 4.18 μπορεί επίσης να διαπιστωθεί ότι σε αυτές τις αναλογίες λείπει ένα κομμάτι του φάσματος εκπομπής της C30. Το βύθισμα αυτό, που παρατηρείται στα φάσματα εκπομπής των μειγμάτων των αναλογιών 1:20 και 1:30 μπορεί να αποδωθεί σε ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας. Η ακτινοβολητική μεταφορα ενέργειας έχει περιγραφεί στην παράγραφο 1.4.3 και πρόκειται για απορρόφηση φωτονίων από τον αποδέκτη το οποίο εκπέμεπει ο δότης, ενώ διαφέρει από την συντονισμένη μεταφορά ενέργειας (FRET) [30]. Η θεώρηση ότι συμβαίνει ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας στα μείγματα της C30 με την DCF μπορεί να επιβεβαιωθεί και από τη μελέτη τους μέσω της φασματοσκοπίας χρονικής ανάλυσης (παράγραφος 5.15).Επιπλέον στο σχήμα 4.18 παρατηρείται μια μικρή μετατόπιση της κορυφής της C30 προς μεγαλύτερα μήκη κύματος με την μείωση της συγκέντρωσης της DCF.Τέλος από την σύγκριση των πινάκων 4.5 και 4.18 επιβεβαιώνεται η ίδια συμπεριφορά όσον αφορά τις υψηλές συγκεντρώσεις της DCF στα μείγματα. Τα μέγιστα εκπομπής της DCF στην περίπτωση όλων των αναλογιών μειγμάτων συμπίπτουν με τα μέγιστα εκπομπής των αρχικών διαλυμάτων της DCF σε χαμηλές συγκεντρώσεις. 73
Συνοπτικά για τις δύο περιπτώσεις των μειγματων C30 με FITC και C30 με DCF μπορεί να διαπιστωθεί: στην πρώτη, οι αλληλεπιδράσεις των μορίων C30 με FITC οδηγούν στην απόσβεση του φθορισμού της C30. Τo ουδέτερο και μονοανιόν στοιχεία της FITC συνεχίζουν να υπάρχουν εντός τον μειγμάτων. Αυτό επιβεβαιώνεται από την σύγκριση των σχημάτων 4.11, 4.14 και 4.15. Το φάσμα απορρόφησης της FITC εντός των μειγμάτων έχει την αναμενόμενη μορφή, δηλαδή αυτή των πυκνών συγκεντρώσεων. στην δεύτερη, οι αλληλεπιδράσεις της C30 με την DCF οδηγούν στην εξαφάνιση του ουδέτερου και μονοανιόντος μορφής της DCF. Επίσης, παρατηρείται και ακτινοβολητική μεταφορά ενέργειας μεταξύ των δύο αυτών μορίων. 74
Κεφάλαιο 5. Φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης 5.1 Εισαγωγή Η φασματοσκοπία χρονικής ανάλυσης αποτελεί μια δεύτερη τεχνική μελέτης των μορίων. Για την πραγματοποίηση της μελέτης αυτής τα μόρια διεγείρονται με παλμικό φως και μελετάται η αποδιέγερση των μορίων μέσω του εκπομπόμενου φθορισμού. Ο λόγος ανάπτυξης αυτής της μεθόδου ήταν η κατανόηση της δυναμικής συμπεριφοράς των μορίων. Συγκεκριμένα, πολλά φαινόμενα και μεγέθη μπορούν να μελετηθούν σε χρονική κλίμακα των psec και nsec. Μερικά από τα πιο χαρακτηριστικά αποτελούν η αποδιέγερση του μορίου, ο χρόνος ζωής, η ανισοτροπία, η μεταφορά ενέργειας από ένα μόριο σε κάποιο άλλο κ.α.. 5.2 H τεχνική time correlated single photon counting (TCSPC) Στην εικόνα 5.1 φαίνεται σχηματικά η πειραματική διάταξη για την ανίχνευση του εκπεμπόμενου φθορισμού από ένα δείγμα μετά την διέγερσή του. Εικόνα 5.1 Πειραματική διάταξη TCSPC. Η καταγραφή του εκπεμπόμενου φθορισμού πραγματοποιείται με την βοήθεια ηλεκτρονικών συστημάτων και η χρονική ανάλυση περιορίζεται από την αποκριση των συστημάτων αυτών. Το σήμα που καταγράφεται είναι ουσιαστικά η χρονική διαφορά των ανιχνεύσιμων φωτονίων φθορισμού με τον παλμό διέγερσης (στην συγκεκριμένη τεχνική καταγράφεται ένα φωτόνιο ανά 100 παλμούς δίεγερσης). Συνεπώς μετά την λήψη 75
πολλών φωτονίων τα οποία αποθηκεύονται σε διαφορετικό κανάλι ανάλογα με την χρονική διαφορά είναι δυνατόν να κατασκευαστεί ένα ιστόγραμμα το οποίο δίνει τη καμπύλη αποδιέγερσης. Στην εικόνα 5.2 φαίνεται σχηματικά η κατασκευή του ιστογράμματος αυτού. Ύστερα από κατάλληλη μαθηματική επεξεργασία (συνέλιξη της εκθετικής συνάρτησης μείωσης με την συνάρτηση απόκρισης του συστήματος, παράγραφος 5.3) του ιστογράμματος αυτού (το οποίο είναι ουσιαστικά οι καμπύλη αποδιέγερσης φθορισμού) είναι δυνατόν να προσδιοριστούν οι διάφοροι μηχανισμοί που συμβάλλουν στην αποδιέγερση των μορίων. Οι πηγές διέγερσης που χρησιμοποιήθηκαν στην συγκεκριμένη τεχνική είναι δύο παλμικά διοδικά laser ημιαγωγών τα οποία εκπέμπουν στα 403 nm και 470 nm. Η χρονική διάρκεια των παλμών αυτών των laser (FWHM) είναι μεταξύ 60 psec με 70 psec. Η απόκριση της τεχνικής TCSPC εξαρτάται από το εύρος των παλμών και από το είδος του φωτοπολλαπλασιαστή που χρησιμοποιείται. Συνεπώς στην συγκεκριμένη πειρατική μελέτη ο συνδυασμός η διάρκεια των παλμών των laser με την χρήση Μicrochannel Plate Photomultiplier Tube (MCP - PMT), απέδωσε στην τεχνική απόκριση στα. Εικόνα 5.2 Ιστόγραμμα καταγραφής φωτονίων φθορισμού. 76