Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΟΥΡΑΝΙΑ ΚΩΣΤΟΠΟΥΛΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, 2013

Αφιερωμένο στους γονείς μου και τη γιαγιά μου [2]

Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή 1. Καθηγητής Δημήτριος Καλπαξής (Επιβλέπων καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Αναπληρωτής καθηγητής Γεώργιος Ντίνος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Καθηγήτρια Θεοδώρα Χολή-Παπαδοπούλου (Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Καθηγητής Δημήτριος Καλπαξής (Επιβλέπων καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Αναπληρωτής καθηγητής Γεώργιος Ντίνος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Καθηγήτρια Θεοδώρα Χολή-Παπαδοπούλου (Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) 4. Καθηγητής Διονύσιος Παπαϊωάννου (Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών) 5. Καθηγήτρια Αθανασία Μουζάκη (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 6. Καθηγητής Διονύσιος Συνετός ( Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 7. Καθηγητής Διονύσιος Δραΐνας ( Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) [3]

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Εφαρμογές των Βασικών Ιατρικών Επιστημών και στην κατεύθυνση της Παθοβιοχημείας, για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς τoν επιβλέποντα «δάσκαλο» Καθηγητή Δημήτριο Καλπαξή, για την τιμή που μου έκανε όλα αυτά τα χρόνια να είμαι μέλος του εργαστηρίου του. Θα του είμαι πάντα ευγνώμων για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε τόσο ως άνθρωπος, όσο ως συνεργάτιδα και ως ερευνήτρια. Υπήρξε δίπλα μου για να με ενθαρρύνει στις δυσκολίες και για να μοιραστεί τη χαρά μου στις επιτυχίες, διδάσκοντάς με την επιμονή και την υπομονή. Του είμαι ευγνώμων για τη βοήθειά του και τις παρατηρήσεις του τόσο κατά τη διάρκεια του πειραματικού μέρους όσο και κατά τη συγγραφή της εργασίας μου. Ήταν ο άνθρωπος που ήταν πάντα δίπλα μου και με στήριζε σε κάθε ανησυχία μου τόσο επιστημονική όσο και προσωπική. Όσα ευχαριστώ να πω σε αυτόν τον άνθρωπο είναι λίγα. Ένα θερμό ευχαριστώ στον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Ντίνο, μέλος της Τριμελούς Επιτροπής, του οποίου το ουσιαστικό ενδιαφέρον για την εξέλιξη της μελέτης καθώς και οι πολύ χρήσιμες παρατηρήσεις του με βοήθησαν για την ολοκλήρωση της προσπάθειάς μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, Θεοδώρα Χολή-Παπαδοπούλου για την βοήθεια, την υποστήριξη αλλά και την τιμή που μου έκανε να συμμετάσχει στην Τριμελή Επιτροπή. Ευχαριστώ πολύ τον Καθηγητή Διονύσιο Παπαϊωάννου για τις χρήσιμες παρεμβάσεις του, τη συνεργασία, την υποστήριξη και την κατανόηση καθόλη τη διάρκεια της διατριβής μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την Καθηγήτρια Αθανασία Μουζάκη για όλη τη βοήθεια και την υποστήριξή της σε όλη μου αυτή την προσπάθεια. Χωρίς τη βοήθειά της θα ήταν δύσκολο να διεκπεραιωθεί ένα κομμάτι αυτής. Ευχαριστώ πολύ τον Καθηγητή Διονύσιο Δραΐνα για την υποστήριξή του κατά την πορεία της διατριβής μου καθώς και για τη δημιουργία αυτού του ευχάριστου κλίματος στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον Καθηγητή Διονύσιο Συνετό για τις χρήσιμες παρεμβάσεις του, την άψογη συνεργασία, την υποστήριξη και την κατανόηση καθόλη τη διάρκεια της διατριβής μου. [4]

Ευχαριστώ τα υπόλοιπα μέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας για το καλό κλίμα επικοινωνίας και συνεργασίας που έχει αναπτυχθεί. Ιδιαίτερα θα ήθελα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στον Αναπληρωτή Καθηγητή Κωνσταντίνο Σταθόπουλο, ο οποίος μου έκανε την τιμή να συμμετάσχω στο ερευνητικό πρόγραμμα Αριστεία Ι, να ασχοληθώ με ένα άλλο ερευνητικό πεδίο και να γνωρίσω νέες τεχνικές. Ευχαριστώ τους φίλους και συναδέλφους στο εργαστήριο: τη διδάκτορα Σοφία Πυθαροπούλου, την υποψήφια διδάκτορα Γωγώ Κουρνούτου και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Σοφία Κόκκορη Η άψογη συνεργασία, το ευχάριστο κλίμα, η βοήθειά τους σε θεωρητικά και πρακτικά προβλήματα που αντιμετώπισα κατά τη διάρκεια των πειραμάτων και η ειλικρινής φιλία που μας έδεσε αυτό το διάστημα αποτελούν για μένα πολύτιμη παρακαταθήκη για το μέλλον. Ευχαριστώ τη Δρ. Αικατερίνη Κούβελα για τη βοήθεια στην εκμάθηση των πρώτων τεχνικών του Εργαστηρίου και τις φοιτήτριες: Μαρίνα Μπαρτσακούλια, Σκεύη Αδάμου, Γαρυφαλλιά Μακρυνίτσα, με τις οποίες συνεργάστηκα κατά τη διάρκεια της διπλωματικής τους εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον υποψήφιο διδάκτορα Δημήτρη Αναστασάκη και την υποψήφια διδάκτορα Μαρία Αποστολίδη για τη βοήθειά τους και την άψογη συνεργασία μας, καθώς και τα υπόλοιπα παιδιά του εργαστηρίου της Βιολογικής Χημείας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στο μεταδιδάκτορα Γιώργο Μαγουλά, του εργαστηρίου Οργανικής Χημείας του Τμήματος Χημείας, με τον οποίο συνεργάστηκα άψογα και η βοήθειά του στη σύνθεση των αναλόγων ήταν καθοριστική. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Λέκτορα Κωνσταντίνο Αθανασόπουλο για τη σημαντική βοήθειά του στη σύνθεση των αναλόγων. Ευχαριστώ θερμά τα παιδιά του εργαστηρίου της κυρίας Α. Μουζάκη: ιδιαίτερα την υποψία διδάκτορα Μαρία Ρόδη, τον υποψήφιο διδάκτορα Ιωάννη Παναγούλια, και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ιωάννα Αγγελατοπούλου για όλη τη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια αυτών των χρόνων. Απέκτησα εκτός από συνεργάτες και πολύ καλούς φίλους. Ευχαριστώ επίσης τον Αναπληρωτή καθηγητή Γιώργο Σταθόπουλο καθώς και τα παιδιά του εργαστηρίου του για τη βοήθειά τους. Επίσης, ευχαριστώ τα παιδιά του εργαστηρίου της Φαρμακολογίας, της Γενικής Βιολογίας και της Μικροβιολογίας για τις τόσες ώρες που έχουμε περάσει όλοι μαζί και για τη συνεργασία μας αυτά τα χρόνια. [5]

Δε νομίζω ότι υπάρχουν λόγια για να ευχαριστήσω τους γονείς μου για όσα έχουν κάνει μέχρι σήμερα για μένα. Είναι δεδομένο ότι τους αγαπώ πολύ και πάντα θα προσπαθώ να τους κάνω περήφανους. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την αξιολάτρευτη γιαγιά μου, το φίλο μου και την κολλητή μου για την αγάπη και τη συμπαράσταση που μου προσφέρουν η οποία είναι απαραίτητη για κάθε βήμα της ζωής μου. [6]

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13 1. Δομή ριβοσώματος 15 1.1 Γενικά χαρακτηριστικά ριβοσωμάτων 15 1.2 Δομή ριβοσωματικών υπομονάδων 16 1.3 Κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTC) 19 1.4 Κανάλι εξόδου 21 2. Πρωτεϊνοσύνθεση 23 2.1 Έναρξη πρωτεϊνοσύνθεσης 24 2.2 Επιμήκυνση πρωτεϊνοσύνθεσης 27 2.3 Τερματισμός πρωτεϊνοσύνθεσης 30 2.4 Ανακύκλωση πρωτεϊνοσύνθεσης 32 3. Μιτοχόνδρια 33 3.1 Μιτοχονδριακά ριβοσώματα 34 3.2 Δομή μιτοχονδριακών ριβοσωματικών υπομονάδων 35 3.3 Μιτοχονδριακή πρωτεϊνική σύνθεση 36 4. Αντιβιοτικά και αναστολή της ριβοσωματικής λειτουργίας. 39 4.1 Εισαγωγικά 39 4.2 Πουρομυκίνη 42 4.3 Χλωραμφαινικόλη 43 4.4 Κατάταξη των αναστολέων 49 5. Πολυαμίνες 54 5.1 Βιοσύνθεση πολυαμινών 54 5.2 Δράσεις πολυαμινών 57 6. Στόχος εργασίας 62 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 63 7. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 64 7.1.Α.Υλικά-Διαλύματα 64 Χημικές ουσίες, οργανικά και βιοχημικά αντιδραστήρια 64 [7]

mrnas, trnas 66 Ραδιενεργές ουσίες 66 Αντιβιοτικά 66 Ένζυμα 66 Εκκινητές 66 Βακτηριακά στελέχη 66 Κυτταρικές σειρές 67 Διαλύματα Ηλεκτροφόρησης και Χρώσης 68 Διαλύματα για λειτουργικές μελέτες και παρασκευές 68 Διαλύματα για μικροβιολογικές και μοριακές μεθόδους 69 Διαλύματα τροποποιητών 69 Διαλύματα αντιβιοτικών 69 7.1.Β. Σύνθεση πολυαμινικών και διμερών αναλόγων της CAM 70 8. Μέθοδοι-Τεχνικές 71 8.1 Βιοχημική παρασκευή ριβοσωμάτων 71 8.1.1 Καλλιέργειες άγριου τύπου και μεταλλαγμένων κυττάρων E.coli 71 8.1.2 Παρασκευή κλάσματος S-30 71 8.1.3 Παρασκευή κλάσματος S-100 72 8.1.4 Παρασκευή κλάσματος FWR 73 8.1.5 Παρασκευή πλυμένων ριβοσωμάτων 73 8.1.6 Συνοπτική διαδικασία 74 8.2 Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών (Μέθοδος Bradford) 78 8.3 Απομόνωση trna εμπλουτισμένου σε trna Phe 78 8.4 Λειτουργικές μελέτες- In vitro συστήματα σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού 79 8.4.1 Παρασκευή Ac[ 3 H]Phe-tRNA 79 8.4.2 Σχηματισμός του εναρκτήριου τριμερούς συμπλόκου (Complex C) 81 8.4.3 Αντίδραση πουρομυκίνης 82 8.4.4 Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης και εύρεση των καταλυτικών παραμέτρων 83 8.4.5 Αναστολή της αντίδρασης πουρομυκίνης από τα ανάλογα της χλωραμφαινικόλης 86 8.4.6 Προσδιορισμός της σταθεράς αναστολής K i 87 [8]

8.4.7 Προσδιορισμός της σταθεράς k eq για την αποκατάσταση των χημικών ισορροπιών που υπεισέρχονται στο κινητικό σχήμα. 87 8.5 Ανάλυση αποτυπώματος (footprinting analysis) 88 8.5.1 Παρασκευή δειγμάτων 88 8.5.2 Χημική Τροποποίηση 89 8.5.3 Εκχύλιση του rrna 91 8.6 Μελέτες σε βακτηριακές καλλιέργειες κ ανθρώπινες κυτταρικές σειρές 94 8.6 Α. Καλλιέργειες στελεχών E. coli και S. aureus, παρουσία ή απουσία αντιβιοτικών 94 8.6.Β.1. Ανθρώπινες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές 94 8.6.Β.1.1 Συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας ανθρώπινων λευχαιμικών κυτταρικών σειρών 95 8.6.Β.1.2. Μέτρηση νέκρωσης λευχαιμικών κυττάρων με την χρήση ιωδιούχου προπίδιου (Ρi) 96 8.6.Β.1.3 Μέτρηση αναστολής πολλαπλασιασμού σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές 96 8.6.Β.2 Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα 99 8.6.Β.2.1.Ανακαλλιέργεια 99 8.6.Β.2.2 Μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων με Trypan blue 99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 102 9. 1 Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης απουσία των παραγώγων της CAM 103 9.1.1 Πειραματική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης 103 9.2 Κινητική της αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από πολυαμινικά ανάλογα της CAM 106 9.2.1 Θεωρητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία ενός πολυαμινικού παραγώγου της CAM, του ΚΑ-240 106 9.2.2 Πειραματική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία του πολυαμινικού παραγώγου ΚΑ-240 108 9.2.2.A1 Ανάλυση της αρχικής και τελικής φάσης αναστολής109 9.2.2.A2 Υπολογισμός των σταθερών αναστολής στις δύο φάσεις αναστολής με ανάλυση επαναδιαγραμμάτων [9]

κλίσης (slope replots) για την ΚΑ-240 111 9.2.2.A3 Υπολογισμός του λόγου k 6 /k 7 112 9.2.2.A4 Υπολογισμός των ειδικών ταχυτήτων k 6 και k 7 113 9.3 Κινητική της αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από τα διμερή παράγωγα της CAM. 117 9.3.1 Ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία ενός διμερούς παραγώγου της CAM, του mag240 117 10. Ανάλυση αποτυπώματος (footprinting analysis) 123 11. Επίδραση των πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της CAM σε βακτηριακές καλλιέργειες κ ανθρώπινες κυτταρικές σειρές 131 11.1 Αντιβακτηριακή δράση 131 11.2 Δράση έναντι ανθρώπινων κυτταρικών σειρών 133 11.2.1 Μελέτη της επίδρασης της CAM, του ΚΑ240 κ του mag240 σε κύτταρα ανθρώπινου αίματος και λευχαιμικές κυτταρικές σειρές 133 11.2.1Α Τοξικότητα της CAM και των παραγώγων της σε λευχαιμικές σειρές 135 A.1 Jurkat (Τ-λευχαιμικά κύτταρα) 136 Α.2 HS-Sultan (Β-λευχαιμικά κύτταρα) 137 Α.3 U937 (μονοκυτταρική σειρά) 138 11.2.1Β Μέτρηση του ποσοστού νεκρών λευχαιμικών κυττάρων μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (Pi) 139 11.2.1C Μέτρηση αναστολής πολλαπλασιασμού σε κυτταρικές σειρές μετά από επισήμανση με CFSE 142 11.2.2 Επίδραση της CAM, του ΚΑ240 και του mag240 στις κυτταρικέςσειρές Μet5Α και ZL34 145 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 147 12 Α. In vitro μελέτες 148 12 Β. Μελέτες της επίδρασης των παραγώγων της CAM σε βακτηριακές καλλιέργειες και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές 155 13. ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY 158 14. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 165 15. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 185 [10]

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Ǻ A260 αα-trna AcPheβ-ETSH BSA cpm Da dntp D.r Angstrom Οπτική απορρόφηση στα 260nm Αμινοακυλο-tRNA Ακετυλ-φαινυλαλανίνη Βήτα-μερκαπτοαιθανόλη Αλβουμίνη ορού βοός counts per minute Dalton Δεόξυ-τριφωσφορικά νουκλεζίδια Deinococcus radiodurans E. coli Escherichia coli EFG EF-Ts EF-Tu Et-OH fmet- H.m. I IC 50 IF K d K i Μ mq o/n Παράγοντας επιμήκυνσης G Παράγοντας επιμήκυνσης Ts Παράγοντας επιμήκυνσης Τu Αιθανόλη Φoρμυλ-μεθειονυλο- Haloarcula marismortui αναστολέας Συγκέντρωση αντιβιοτικού για 50% αναστολή Παράγοντας έναρξης Σταθερά διάστασης Σταθερά αναστολής molarity milliq Η 2 Ο overnight [11]

Phe PI Poly(U) PTC PTάση Puro RF rpm RRF S s SD TCA trna f Met UV Φαινυλαλανίνη Προεπώαση poly-uridine mrna Κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης Πεπτιδυλοτρανσφεράση Πουρομυκίνη Παράγοντας απελευθέρωσης rounds per minute Παράγοντας Ανακύκλωσης Μονάδα Svedberg seconds Αλληλουχία Shine-Dalgarno Τριχλωρο οξεικό Ειδικό trna για τη φoρμυλο-μεθειονίνη Υπεριώδης ακτινοβολία [12]

[13]

Οι πρωτεΐνες είναι βιολογικά πολυμερή μικρών μορίων, των αμινοξέων. Είναι πολύ σημαντικά μόρια στους ζώντες οργανισμούς και εξυπηρετούν βασικές λειτουργίες σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες. Λειτουργούν ως καταλύτες, μεταφορείς, και αποθήκες άλλων μορίων, όπως το οξυγόνο, παρέχουν μηχανική στήριξη και ανοσοπροστασία, δημιουργούν κίνηση, διαβιβάζουν νευρικές ώσεις και ρυθμίζουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση. Η γενετική πληροφορία που περιέχεται στη σειρά των νουκλεοτιδίων στο αγγελιαφόρο RNA (mrna) αποκωδικοποιείται για να παράγει τις αλληλουχίες των αμινόξεων στις πρωτεΐνες. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται μετάφραση. Αν και ο βασικός μηχανισμός της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι αρκετά συντηρημένος, ωστόσο όσο προχωράμε εξελικτικά η πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή γίνεται πιο πολύπλοκη. Τα βασικά οργανίδια της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι τα ριβοσώματα. Τα ριβοσώματα παρατηρούνται είτε ελεύθερα στο κυτταρόπλασμα και στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων και χλωροπλαστών είτε είναι προσκολλημένα στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου. Οι πρώτες μελέτες με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία ριβοσωματικών υπομονάδων και ολόκληρων ριβοσωμάτων στα βακτήρια και στα αρχαία έδωσαν πληροφορίες για την αρχιτεκτονική τους καθώς και για τις διεργασίες που επιτελούνται σε αυτά (Ban et al., 2000; Wimberly et al., 2000; Yusupov et al., 2001; Harms et al., 2001; Schuwirth et al., 2005; Selmer et al., 2006). Η δομή των μεγαλύτερων και πιο πολύπλοκων ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έχει μελετηθεί κυρίως με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (Melnikov et al., 2012). Τα δύο τελευταία, όμως, χρόνια αρκετές ερευνητικές ομάδες δραστηριοποιούνται με την κρυσταλλογραφική ανάλυση των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων (Ben-Shem et al., 2010; Klinge et al., 2011). Στη συνέχεια, ακολουθεί περιγραφή της δομής και λειτουργίας του προκαρυωτικού και του μιτοχονδριακού ριβοσώματος, με τα οποία ασχοληθήκαμε στην παρούσα εργασία. [14]

1. Δομή ριβοσώματος 1.1 Γενικά χαρακτηριστικά ριβοσωμάτων Ο όρος ριβόσωμα προτάθηκε από το Richard B. Roberts το 1958. Το ριβόσωμα είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που μεταφράζει το γενετικό κώδικα σε πρωτεΐνες σε όλους τους οργανισμούς. Το μοριακό βάρος των ριβοσωμάτων μπορεί να ποικίλει από 2,3 MDa στα βακτήρια μέχρι 4,3 MDa στους ανώτερους ευκαρυώτες. Σε όλα τα είδη το ριβόσωμα αποτελείται από δύο διακριτές υπομονάδες διαφορετικού μεγέθους, τη μικρή και τη μεγάλη. Tα προκαρυωτικά ριβοσώματα με 70S συντελεστή καθίζησης, είναι ασύμμετρα δομημένα με πρωτεΐνες (30S: 21 πρωτεΐνες, 50S: 36 πρωτεΐνες) (Εικόνα 1.1.1) και τρεις RNA αλυσίδες (70S: 23S rrna, 5S rrna και 16S rrna). Οι διαφορές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων εντοπίζονται κυρίως στην εξωτερική επιφάνεια των υπομονάδων και όχι στη διεπιφάνεια μεταξύ αυτών με την οποία οι δύο υπομονάδες αλληλεπιδρούν (Armache et al., 2010; Ben-Shem et al., 2011). Εικόνα 1.1.1: Χάρτες in vitro συναρμολόγησης της μικρής και της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (Shajani et al., 2012). a) Ο χάρτης συναρμολόγησης του Nomura απεικονίζει τη θερμοδυναμική σειρά σύνδεσης των πρωτεϊνών της 30S υπομονάδας. Υπάρχει μία ιεραρχία των αρχικών πρωτεϊνών (1 ο ), οι οποίες προσδένονται σταθερά και απευθείας στο rrna. Η δεύτερη σειρά πρωτεϊνών πρόσδεσης (2 ο ), στηρίζονται στις πρώτες και η τρίτη κατηγορία πρωτεϊνών (3 ο ) συνδέεται στη δεύτερη. Ο χάρτης επίσης χωρίζεται σε 5 (κόκκινη), κεντρική (πράσινη) και 3 (μπλε) περιοχή με βάση τις θέσεις πρόσδεσης στο 16S rrna (Mizushima et al., 1970; Held et al., 1974; Grondek and Culver, 2004). b) Ο χάρτης συναρμολόγησης του Nierhaus απεικονίζει τη θερμοδυναμική σειρά πρόσδεσης των πρωτεϊνών της 50S υπομονάδας. Το 5S rrna (πορτοκαλί) προσδένεται στις L5, L15 και L8. Το 23S rrna διακρίνεται αντίστοιχα σε 5, κεντρική και 3 περιοχή όπως και το 16S rrna της μικρής υπομονάδας (Herold and Nierhaus, 1987). [15]

1.2 Δομή ριβοσωματικών υπομονάδων Η 30S υπομονάδα του E. coli ριβοσώματος έχει μοριακή μάζα 0.85 ΜDa και αποτελείται από 21 διαφορετικές ριβοσωματικές πρωτεΐνες (S1 έως S21) και ένα είδος rrna, το 16S rrna (1542 νουκλεοτίδια). H μικρή υπομονάδα του προκαρυωτικού ριβοσώματος παρουσιάζει ανθρωπόμορφη μορφή με: κεφαλή (head), λαιμό (neck) και σώμα (body). Στην κεφαλή (head) διακρίνεται η μύτη (nose) με μία μεγαλύτερη προεξοχή και το ράμφος (beak). Το σώμα (body) απαρτίζεται από την ωμοπλάτη (shoulder), την πλατφόρμα (platform) και το πόδι (foot) με ένα δάχτυλο (toe), το λεγόμενο spur (Schluenzen et al., 2000). Κάθε μια από τις περιοχές περιέχει ένα από τους βασικούς τομείς της δευτεροταγούς δομής του 16S rrna: o 5 τομέας αντιστοιχεί στο σώμα, ο κεντρικός τομέας στην πλατφόρμα και ο 3 τομέας στην κεφαλή της μικρής υπομονάδας και μια εκτεταμένη έλικα (h44) που διατρέχει το σώμα και αλληλεπιδρά με την 50S υπομονάδα (Εικόνα 1.2.1). Tα κύρια λειτουργικά στοιχεία της υπομονάδας αποτελούνται από RNA. Οι πρωτεΐνες φαίνεται να παίζουν κυρίως συνδετικό και στηρικτικό ρόλο. Μόνο η S12 βρίσκεται στην πλούσια σε RNA διεπιφάνεια και συμμετέχει στη συγκρότηση του κέντρου αποκωδικοποίησης. Δύο άλλες πρωτεΐνες, η S7 και η S15 συμμετέχουν επίσης στη δέσμευση trna. Λίγες πρωτεΐνες, όπως η S4, η S5, η S8 και η S12 φαίνεται να συμβάλλουν στην πιστότητα της μετάφρασης και την μετατόπιση των υποστρωμάτων. Η μικρή υπομονάδα περιέχει το κέντρο αποκωδικοποίησης, όπου αλληλεπιδράσεις μεταξύ κωδικονίων του mrna και αντικωδικονίων των trnas προσδιορίζουν τη σειρά με την οποία τα αμινοξέα θα ενσωματωθούν στη νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη, εξασφαλίζοντας την πιστότητα της μετάφρασης (Wimberly et al., 2000; Gao et al., 2003). [16]

Εικόνα 1.2.1: Δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του rrna της 30S υπομονάδας. Οι περιοχές της δευτεροταγούς δομής του 16S rrna παρουσιάζονται φαινομενικά σαν απομακρυσμένες αναδιπλωμένες δομές. Κάθε περιοχή έχει το ίδιο χρώμα στη δευτεροταγή και τριτοταγή της δομή (Ramakrishnan and Moore, 2001). Η 50S υπομονάδα του E.coli ριβοσώματος μάζας 1.45 ΜDa, αποτελείται από δυο είδη rrna, το 23S (2908 νουκλεοτίδια) (Εικόνα 1.2.2) και το 5S (120 νουκλεοτίδια), καθώς και 36 πρωτεΐνες (L1 ως L36). Έχει πιο συμπαγή δομή συγκρινόμενη με τη μικρή υπομονάδα και χαρακτηρίζεται από μία σφαιρική βάση με τρεις προεξοχές: την κεντρική και δύο επιπλέον πλευρικές, την L7/L12 στην πλευρά της εισόδου του trna και την L1 στην πλευρά της εξόδου (Noller et al., 2001). Η μεγάλη υπομονάδα περιλαμβάνει το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης που καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, και το κανάλι εξόδου, από το οποίο εξέρχεται η νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Το μήκος του, από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης μέχρι την έξοδο, είναι περίπου 100 Å και έχει πλάτος 10-20 Å (Stark et al., 1995; Ban et al., 2000). [17]

Οι πρωτεΐνες στη μεγάλη υπομονάδα έχουν δομικό ρόλο, ωστόσο δεν αποκλείεται μερικές από αυτές να έχουν και λειτουργικό ρόλο (Wilson and Nierhaus, 2003). Για παράδειγμα, οι L2 και L3 παίζουν σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση της καταλυτικής δράσης του ριβοσώματος, ενώ οι L4 και L22 συμμετέχουν στο σχηματισμό του καναλιού εξόδου. Η περιοχή όπου οι προεκτάσεις των L4 και L22 συναντούν το κανάλι εξόδου μοιάζει να είναι λειτουργικά σημαντικό σημείο (hot spot), όπου σειρά μελετών υποστηρίζει ότι η περιοχή αυτή εμπλέκεται στο μηχανισμό μετατόπισης της πεπτιδικής αλυσίδας, ελέγχοντας τη δίοδο της πεπτιδικής αλυσίδας μέσω αλλοστερικών μηνυμάτων. Επίσης, οι L1, L5, L7, και L16 παίζουν ρόλο στη δέσμευση των trnas στις Ρ- και Α- θέσεις (Ban et al., 2000; Nissen et al., 2000). Εικόνα 1.2.2: Οι δευτεροταγείς δομές του 23S και 5S rrna στο E.coli. a) Παλαιότερη δευτεροταγής δομή που χωρίζεται σε δύο τμήματα και περιέχει μια κεντρική μονόκλωνη περιοχή και έξι domains (Τομέας Ι: μωβ, Τομέας ΙΙ: μπλε, Τομέας ΙΙΙ: φούξια, Τομέας ΙV: κίτρινο, Τομέας V: ροζ, Τομέας VI: πράσινο). b) Νεότερη έκδοση της δευτεροταγούς δομής που αναπαριστά όλες τις έλικες [18]

και περιέχει επτά περιοχές (Τομέας 0: πορτοκαλί, οι άλλοι τομείς αναπαριστάνονται με τα ίδια χρώματα με το a). Το 5S παρουσιάζεται με πράσινο ανοιχτό, και τοποθετείται στον τομέα ΙΙ (Petrov et al., 2013). 1.3 Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTC) βρίσκεται στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα και παίζει καθοριστικό ρόλο στην πρωτεϊνοσύνθεση, καταλύοντας το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Η πρωταρχική λειτουργία του είναι να συνδέει ομοιοπολικά τα αμινοξέα μέσω πεπτιδικών δεσμών σε πολυπεπτίδια. Η αντίδραση της α-αμινομάδας του αα-trna στην Α-θέση με την καρβονυλομάδα του πεπτιδυλο-trna στην P-θέση οδηγεί στη μεταφορά της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το πεπτιδυλο-trna στο αα-trna και στην επιμήκυνση του πεπτιδίου κατά ένα αμινοξικό κατάλοιπο. Δομικές και βιοχημικές μελέτες οδήγησαν σε σειρά υποθέσεων για τον καταλυτικό μηχανισμό σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού (Wintermeyer et al., 2004; Polacek and Mankin, 2005; Sato et al., 2006). Μία πρόσφατη υπόθεση (Weinger et al., 2004) είναι η υποβοηθούμενη από το υπόστρωμα κατάλυση, κατά την οποία η 2 -ΟΗ ομάδα στην 3 τελική αδενοσίνη του πεπτιδυλο-trna συμμετέχει στη μετακίνηση πρωτονίου κατά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Εάν αυτή η 2 -ΟΗ ομάδα αφαιρεθεί ή αντικατασταθεί στο πεπτιδυλο-trna, παρατηρείται μείωση περίπου 10 6 φορές στο σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού. Το μηχανισμό αυτό υποστηρίζει και η κρυσταλλογραφική ανάλυση του 70S ριβοσώματος από T. thermophilus, που περιλαμβάνει ένα αα-trna προσδεμένο στην Α-θέση. Η μελέτη έδειξε ότι η 2 -ΟΗ ομάδα της Α76 του πεπτιδυλο-trna είναι σε απόσταση δεσμού υδρογόνου από την αμινομάδα του ααtrna στην Α-θέση (Voorhees et al., 2009) (Εικόνα 1.3.1Α). Κινητική ανάλυση ισοτοπικού φαινομένου υποστηρίζει την εμπλοκή στο μηχανισμό ενός μορίου ύδατος, το οποίο διευκολύνει τη διαμετακίνηση πρωτονίων (Rodnina, 2013) (Εικόνα 1.3.1Β). [19]

Εικόνα 1.3.1: Προτεινόμενοι μηχανισμοί για τη συμμετοχή της 2'-ΟΗ ομάδας της 3'-τελικής αδενοσίνης του πεπτιδυλο-trna κατά την πεπτιδική μεταφορά (Rodnina, 2013). Η δεύτερη χημική αντίδραση που λαμβάνει χώρα στην PTC είναι η υδρόλυση του πεπτιδυλο-trna, η οποία απαιτείται για τον τερματισμό της μετάφρασης και την απελευθέρωση του πλήρως συντιθέμενου πολυπεπτιδίου από το ριβόσωμα. Η αντίδραση τερματισμού συνεπάγεται τη μεταφορά της πεπτιδυλικής ομάδας του πεπτιδυλο-trna της Ρ-θέσης σε ένα μόριο νερού (Tate and Brown, 1992). Εικόνα 1.3.2: Δομή της 50S υπομονάδας όπως προκύπτει από κρυσταλλογραφικές μελέτες. Αποτελείται από την κεντρική, την αριστερή (L1) προεξοχή και τη δεξιά (L7/L12). Στο κέντρο κάτω από την κεντρική προεξοχή βρίσκεται το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Ramakrishnan, 2001). [20]

Μελέτες σταυροσύνδεσης (cross-linking studies) εμφάνιζαν το PTC στην περιοχή V του 23S rrna (Noller, 1991). Στη συνέχεια, υψηλής ανάλυσης κρυσταλλικές δομές ριβοσωμάτων από αρχαία επιβεβαίωσαν ότι το PTC αποτελείται μόνο από RNA και εντοπίζεται στη βάση της κεντρικής προεξοχής της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (Εικόνα 1.3.2). Έτσι τα CCA άκρα των trna των Ρ- και Α- θέσεων δεσμεύονται και εγκαθίστανται στο καταλυτικό κέντρο μέσω του 23S rrna (Nissen et al., 2000; Moore and Steitz, 2003). Το γεγονός ότι η PTase είναι ένα RNA ένζυμο κατατάσσει το ριβόσωμα στην κατηγορία των ριβοενζύμων που επιβίωσαν από τη μετάβαση από τον προβιοτικό κόσμο RNA στη σύγχρονο κόσμο. Οι συντηρημένες βάσεις Α2451, U2506, C2452 και A2602 είναι ο κορμός του PTC (Bashan et al., 2003; Schmeing et al., 2005 a,b). Γενικά, ο σκελετός του rrna στο PTC φαίνεται να έχει παρόμοια διαμόρφωση στις 50S υπομονάδες από διαφορετικούς οργανισμούς. Κατά συνέπεια, προκάλεσε έκπληξη η εύρεση μιας απροσδόκητα υψηλού βαθμού ποικιλίας στον τρόπο σύνδεσης των αντιβιοτικών στο PTC στους διάφορους οργανισμούς. 1.4 Το κανάλι εξόδου Το κανάλι εξόδου αποτελεί απαραίτητο στοιχείο του ριβοσώματος καθώς απαντάται σε όλους τους οργανισμούς. Ξεκινά από το PTC, στο κάτω τμήμα της κεντρικής προεξοχής, και καταλήγει σε 4 εναλλακτικά σημεία εξόδου στην κυτταροπλασματική πλευρά της μεγαλης υπομονάδας ανάλογα με τον προορισμό της νεοσυντιθέμενης πρωτεϊνικής αλυσίδας (Εικόνα 1.4.1). Το μήκος του καναλιού σχετίζεται με το μέγεθος της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας και του rrna του: στα βακτηριακά ριβοσώματα είναι 90 Å (Nissen et al., 2000; Harms et al., 2001), στα ευκαρυωτικά 100 Å (Rospert, 2004) και στα μιτοχονδριακά ριβοσώματα 60 Å (Mears et al., 2002; Sharma et al., 2009). Η διάμετρος του καναλιού εξόδου είναι ίδια σε όλα τα είδη ριβοσωμάτων. Είναι 15 Å στο αρχικό τμήμα, στη συνέχεια στενεύει λίγο ( 10 Å) και μετά διευρύνεται στο τελικό τμήμα φτάνοντας μέχρι και τα 25 Å. Το τοίχωμά του αποτελείται από νουκλεοτίδια των περιοχών II-V του 23S rrna και από αμινοξικά κατάλοιπα της β θηλιάς των ριβοσωματικών πρωτεϊνών L4 και L22 (Nissen et al., 2000) καθώς και της L23 (Harms et al., 2001; Schuwirth et al., 2005; Selmer et al., 2006). [21]

Η κύρια λειτουργία του είναι ο έλεγχος της εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το ριβόσωμα στο κυτταρόπλασμα (ενδοπλασματικό δίκτυο) (Ban et al., 2000; Yap and Berstein, 2009). Ωστόσο βοηθάει επίσης στα πρώτα στάδια αναδίπλωσης της πρωτεΐνης, διευκολύνοντάς την να υιοθετήσει τη δευτεροταγή της δομή, και προστατεύει τη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα από πιθανή πρωτεόλυση μέχρι να αποκτήσει ένα σημαντικό μέγεθος (Seidelt et al., 2009; Wilson and Beckman, 2011). Εικόνα 1.4.1: Το κανάλι εξόδου των βακτηριακών ριβοσωμάτων. Εγκάρσια τομή της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας που αποκαλύπτει στοιχεία του καναλιού εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Το πεπτιδυλο-trna παρουσιάζεται με πορτοκαλί χρώμα, το 23S rrna με γκρι και οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες L4 με κόκκινο, L22 με μπλε, L23 με κίτρινο, L29 με μωβ, L24 με πράσινο και η L32 με σκούρο πράσινο (Wilson and Beckman, 2011). [22]

2. Πρωτεϊνοσύνθεση Η πρωτεϊνοσύνθεση αποτελεί δραστηριότητα ζωτικής σημασίας όλων των κύτταρων και αυτό αποδεικνύεται από το γεγονός ότι η παρεμπόδισή της έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή τους. Η διαδικασία αυτή δεν πρέπει να είναι μόνο ακριβής, αλλά και αρκετά γρήγορη για να ανταποκριθεί στις ανάγκες του κυττάρου. Η ταχύτητα μετάφρασης στα βακτήρια είναι 20 αμινοξέα/s, ενώ στα ευκαρυωτικά 2 αμινοξέα/s. Η μειωμένη ταχύτητα μετάφρασης του ευκαρυωτικού γονιδιώματος πιθανώς σχετίζεται με την αυξημένη πολυπλοκότητα της οργάνωσής του, αλλά και στην ύπαρξη επιπρόσθετων μηχανισμών επιδιόρθωσης και ελέγχου της πιστότητας. Τα κυτταρικά οργανίδια που κυρίως συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση είναι τα ριβοσώματα. Ένα κύτταρο E. coli περιέχει περίπου 20000 ριβοσώματα, ενώ ένα κύτταρο θηλαστικού περιέχει περίπου 10 εκατομμύρια. Ριβοσώματα υπάρχουν επίσης στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες. Εκτός από τα ριβοσώματα στην πρωτεϊνοσύνθεση συμμετέχουν: το mrna που μεταφέρει τη γενετική πληροφορία, τα trnas που μεταφέρουν τα αμινοξέα στο ριβόσωμα, οι συνθετάσες των αα-trnas, ένζυμα που ενεργοποιούν και συνδέουν κάθε αμινοξύ με το trna και οι μεταφραστικοί παράγοντες. Όλα τα trnas είναι μικρά μόρια μήκους 75-85 νουκλεοτιδίων, το 3 άκρο τους καταλήγει πάντα σε CCA, ενώ το 5 καταλήγει σε γουανίνη. Αρχικές μελέτες είχαν προτείνει δυο θέσεις πρόσδεσης των trna στο ριβόσωμα: την Α-θέση και την Ρ- θέση (για το αα-trna και για το πεπτιδυλο-trna αντίστοιχα) (Watson, 1963). Ωστόσο, στις αρχές του 80 λειτουργικές και δομικές μελέτες αποκάλυψαν και μια τρίτη θέση πρόσδεσης trna, την Ε- θέση (Exit site) (Rheinberger et al., 1981; Grajevskaja et al., 1982) όπου μέσω αυτής το αποακυλιωμένο trna εγκαταλείπει το ριβόσωμα (Wadzack et al., 1997; Nierhaus et al., 1998ab; Agrawal et al., 2000; Yusupov et al., 2001; Korostelev et al., 2006; Selmer et al., 2006; Yusupova et al., 2006). Μία πρωτεΐνη συντίθεται με κατεύθυνση από το αμινο-τελικό προς το καρβοξυ-τελικό άκρο, με διαδοχική προσθήκη αμινοξέων στο καρβοξυ-τελικό άκρο της αυξανόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας. [23]

Η διαδικασία της βιοσύνθεσης των πρωτεϊνών χωρίζεται με βάση τις επιμέρους διεργασίες σε τέσσερα στάδια: την έναρξη, την επιμήκυνση, τον τερματισμό και την ανακύκλωση (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1: Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεϊνοσύνθεσης στους προκαρυωτικούς οργανισμούς. Πραγματοποιείται σε τέσσερα στάδια: το στάδιο της έναρξης, της επιμήκυνσης, του τερματισμού και της ανακύκλωσης των ριβοσωματικών υπομονάδων 30S (γαλάζιο) και 50S (κίτρινο). Στην εικόνα εκτός από τις υπομονάδες παρουσιάζονται οι θέσεις πρόσδεσης του εναρκτήριου trna (πράσινο), του αα-trna, και των μεταφραστικών παραγόντων (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). 2.1 Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Η έναρξη είναι το καθοριστικό και πιο πολύπλοκο σε ρύθμιση στάδιο της πρωτεϊνικής σύνθεσης, τόσο στους προκαρυωτικούς, όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η έναρξη στους προκαρυωτικούς προϋποθέτει δύο βασικά χαρακτηριστικά: i) τη φορμυλίωση του εναρκτήριου trna, που απαιτείται για υψηλής συγγένειας αλληλεπιδράσεις μεταξύ fmet-trna fmet - IF2 και ii) την πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία Shine-Dalgarno (SD) που προηγείται 7-10 νουκλεοτίδια του εναρκτήριου AUG κωδικονίου, που είναι συμπληρωματική της 16S rrna (αντι-sd) [24]

αλληλουχίας πλησίον του 3 άκρου του και βοηθάει στην ανεύρεση του εναρκτήριου AUG κωδικονίου (Gualerzi and Pon, 1990). Συνοπτικά, η έναρξη περιλαμβάνει το σχηματισμό τριών κύριων συμπλόκων: i) του 30S προεναρκτήριου συμπλόκου (pre-30sic) που αποτελείται από την 30S υπομονάδα, το εναρκτήριο trna (fmet-trna fmet ) και το mrna (30S υπομονάδα mrna fmet-trna fmet ), ii) του 30S εναρκτήριου σύμπλοκο (30SIC) που δημιουργείται μέσω διαμορφωτικών αλλαγών του pre-30sic που διαμεσολαβούν στην αλληλεπίδραση του πρώτου κωδικονίου-αντικωδικονίου στην Ρ- θέση της 30S υπομονάδας (Εικόνα 2.1.1) και iii) του 70S εναρκτήριου συμπλόκου (70S ριβόσωμα mrna fmet-trna). Για τη διεκπεραίωση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης απαιτείται η συνδρομή τριών παραγόντων έναρξης, του IF1 (Initiation Factor 1), του IF2 (Initiation Factor 2) και του IF3 (Initiation Factor 3) (Carter et al., 2001; Simonetti et al., 2009) (Εικόνα 2.1.2). Εικόνα 2.1.1: Το 30SIC, όπως προέκυψε από κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία. Δύο προσανατολισμοί του κρυο-ηλεκτρονικού χάρτη για το 30SIC. Η 30S υπομονάδα αποδίσεται με γκρι χρώμα, ο IF2 με πράσινο, ο IF1 με μπλε, το fmet-trna fmet με κόκκινο, και ο IF3 με πορτοκαλί (Julian et al., 2011). Ο IF1 είναι ο μικρότερος σε μέγεθος παράγοντας έναρξης (8.2 kda στο E.coli). Ανήκει στην οικογένεια των OB (oligomer binding) πρωτεϊνών, εντοπίζεται στην περιοχή του λαιμού της 30S και μάλιστα καλύπτει την Α- θέση (Carter et al., 2001). Προάγει την αποδοτικότερη σύνδεση των IF2 και IF3 στην 30S υπομονάδα και ελέγχει την επιλογή του mrna και fmet-trna fmet διαμορφώνοντας κατάλληλα την 30S υπομονάδα (Gualerzi et al., 1977; Milon et al., 2008; Milon et al., 2010). [25]

O IF2 είναι ο μεγαλύτερος σε μέγεθος από τους τρεις παράγοντες (~97.3 kda στο E.coli). Αποτελείται από τρεις περιοχές: τη Ν-τελική περιοχή (NTD:N-terminal domain) που είναι αρκετά συντηρημένη ανάμεσα στους προκαρυωτικούς οργανισμούς και συγκριτείται από δύο υποπεριοχές (Ν1 και Ν2) που αναγνωρίζονται από την 30S υπομονάδα, την περιοχή πρόσδεση του GTP (G-domain) που συγκροτείται από τρεις υποπεριοχές (G1, G2 και G3) και την C-τελική περιοχή (CTD:C-terminal domain) που έχει δύο υποπεριοχές (C1 και C2). Οι υποπεριοχές G2, G3, C1 και C2 είναι συντηρημένες. Η G2 είναι η περιοχή πρόσδεσης του GTP, ενώ η C2 περέχει τη θέση πρόσδεσης για το 3 άκρο του fmet-trna fmet (Guenneugues et al., 2000). Ο IF2 δεσμεύεται στη μικρή υπομονάδα και επάγει τη δημιουργία της κατάλληλης διαμόρφωσης στην υπομονάδα, ώστε να υποδεχθεί το fmet-trna fmet στην Ρ- θέση (Milon et al., 2010). Ο IF3 (20kDa) δομείται από δύο περιοχές: τη Ν-τελική (N-terminal domain) και τη C-τελική περιοχή (C-terminal domain). Οι δύο υπομονάδες συνδέονται με ένα πλούσιο σε λυσίνη συνδέτη (linker). Ο IF3 επιτελεί διάφορες λειτουργίες κατά την έναρξη: επηρεάζει τη σύνδεση των ριβοσωματικών υπομονάδων (Debey et al., 1975), ρυθμίζει τη σύνδεση και αποσύνδεση του trna από την Ρ- θέση (Wintermeyer and Gualerzi, 1983; Antoun et al., 2006), ελέγχει την πιστότητα της έναρξης της μετάφρασης (Hartz et al., 1990; Lomakin et al., 2006; Milon et al., 2008) και είναι απαραίτητος για τη διάκριση μεταξύ των trnas με μη ευνοϊκές TIRs (translational initiation regions) (Grigoriadou et al., 2007; Milon et al., 2008). [26]

Εικόνα 2.1.2: Έναρξη μετάφρασης προκαρυωτικών. Απλοποιημένο σχήμα με τα κυριότερα στάδια της έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης στους προκαρυωτικούς. Ο IF3 προσδεδεμένος στην 30S ριβοσωματική υπομονάδα στρατολογεί το mrna, τους παράγοντες έναρξης IF1 και IF2, και το fmettrna fmet, γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό του 30S προεναρκτήριου και 30S εναρκτήριου συμπλόκου. Μετά την αλληλεπίδραση του συμπλόκου με την 50S υπομονάδα, ο IF2 υδρολύει το GTP, το 70SIC σχηματίζεται και οι παράγοντες έναρξης IF3 και IF1 απελευθερώνονται. Επακολουθεί απελευθέρωση του IF2-GDP και το 70S εναρκτήριο σύμπλοκο (***) είναι έτοιμο για το στάδιο της επιμήκυνσης Τα σύμπλοκα που σημειώνονται με αστέρια έχουν αναλυθεί με κρυο-em (Myasnikov et al., 2009). 2.2 Επιμήκυνση της πρωτεϊνοσύνθεσης Το τέλος της έναρξης βρίσκει το εναρκτήριο αα-trna στην Ρ- θέση και την Α- θέση άδεια, έτοιμη να υποδεχτεί ένα αα-trna για να αρχίσει το στάδιο της επιμήκυνσης. Ο παράγοντας EF-Tu στα βακτήρια σχηματίζει με τα αα-trnas και το GTP ένα τριμερές σύμπλοκο, το οποίο μεταφέρεται πλησίον της Α- θέσης του ριβοσώματος. Η αναγνώριση του κωδικονίου από το trna προκαλεί υδρόλυση του GTP, η οποία επάγει διαμορφωτικές αλλαγές τόσο στον EF-Tu, όσο και στο ααtrna. Οι αλλαγές αυτές έχουν ως αποτέλεσμα αφ ενός την απελευθέρωση του EF- Tu GTP, άμινο-άκυλο άκρου του αφ ετέρου την εγκατάσταση του αα-trna στο καταλυτικό κέντρο της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Το PTC καταλύει στη συνέχεια το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού ανάμεσα στο νεοεισερχόμενο αμινοξύ και το πεπτιδυλο-trna. Η αντίδραση της α-αμινομάδας του αα-trna στην Α-θέση με την καρβονυλομάδα του πεπτιδυλο-trna στην P-θέση οδηγεί στη μεταφορά της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το πεπτιδυλο-trna [27]

στο αα-trna και στην επιμήκυνση του πεπτιδίου κατά ένα αμινοξικό κατάλοιπο (Εικόνα 2.2.1). Πρόσφατες κρυσταλλογραφικές αναλύσεις του ριβοσώματος 80S του S. cerevisiae και της 60S υπομονάδας του T. Thermophila έδειξαν ότι η δομή του rrna του PTC είναι σχεδόν συγκρίσιμη μεταξύ ευκαρυωτικών και βακτηριακών ριβοσωμάτων (Ben-Shem et al., 2010; 2011; Klinge et al., 2011), υποστηρίζοντας ότι ο μηχανισμός σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, που είναι η καρδιά της πρωτεϊνοσύνθεσης, είναι καθολικά συντηρημένος. Εικόνα 2.2.1: Σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού. Η α-αμινοομάδα του αα-trna στη Α- θέση (κόκκινη) επιτίθεται στον άνθρακα καρβονυλίων του πεπτιδυλο-trna στη Ρ- θέση (μπλε) για να παραγάγει ένα νέο πεπτιδυλο-trna κατά ένα αμινοξύ μακρύτερο στη Α- θέση και ένα αποακυλιωμένο trna στη Ρ- θέση. Η 50S υπομονάδα, όπου το PTC βρίσκεται, παρουσιάζεται με ανοικτό γκρι και η 30S με σκούρο γκρι (Beringer and Rodnina,2007). Μετά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού έχουμε ένα αποακυλιωμένο trna σε μία υβριδική κατάσταση με το 3 άκρο στην E-θέση της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας και τη θηλειά του αντικωδικονίου στην P-θέση της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας (Ρ/Ε) (Green and Noller, 1997). Το πεπτιδυλοtrna είναι σε μία παρόμοια υβριδική κατάσταση με το 3 του άκρο στην P-θέση της μεγάλης υπομονάδας και τη θηλειά του αντικωδικονίου στην A-θέση της μικρής υπομονάδας (Α/Ρ). [28]

Εικόνα 2.2.2: Σχηματική αναπαράσταση της μετατόπισης. Η μετατόπιση μπορεί να διαιρεθεί σε δύο στάδια: το πρώτο στο οποίο τα trnas μεταβαίνουν από τις κανονικές διαμορφώσεις (σχήμα a) σε σχέση με την υπομονάδα 50S (σχήμα b), και το δεύτερο, που καταλύεται από τον παράγοντα επιμήκυνσης EF-G (καφέ χρώμα), στο οποίο το αγγελιοφόρο RNA (mrna) και trnas κινούνται σε σχέση με την υπομονάδα 30S (σχήμα c και d). Αν και μια υψηλής ανάλυσης κρυσταλλική δομή του EF-G που δεσμεύεται στο ριβόσωμα στη μετά-gtp κατάσταση υδρόλυσης (σχήμα d) πρόσφατα προσδιορίστηκε (Gao et al., 2009), οι λεπτομερείς δομές του Α/Ρ trna και EF-G που δεσμεύεται στη GTP κατάσταση στο ριβόσωμα δεν είναι γνωστές (σχήμα b και c) (Voorhees and Ramakrishnan, 2013). Όπως αποκαλύφθηκε πρόσφατα με FRET- ανάλυση, οι υβριδικές καταστάσεις βρίσκονται σε ισορροπία με τις κλασικές καταστάσεις Ρ/Ρ και Α/Α, το σημείο της οποίας εξαρτάται από τη φύση των trnas και την παρουσία του παράγοντα EF-G. Ανεξαρτήτως κατάστασης τα trnas πρέπει να μετατοπισθούν, έτσι ώστε το αποακυλιωμένο trna να βρεθεί εξ ολοκλήρου στην E-θέση (Ε/Ε), το πεπτιδυλο-trna να βρεθεί εξ ολοκλήρου στην P-θέση (Ρ/Ρ) και το mrna να μετατοπισθεί κατά τρία νουκλεοτίδια, εγκαθιστώντας το επόμενο κωδικόνιό του στην Α-θέση. Η μετατόπιση των trnas στις Ε-Ε και Ρ-Ρ θέσεις απαιτεί τον παράγοντα επιμήκυνσης EF-G στα βακτήρια. Πρόσδεση του EF-G-GTP στο ριβόσωμα σταθεροποιεί τις υβριδικές καταστάσεις Ρ/Ε και Α/Ρ και προωθεί τη γρήγορη υδρόλυση του GTP. Αλλαγές διαμόρφωσης στον EF-G συνοδεύουσες την υδρόλυση του GTP και την απελευθέρωση του Pi, φαίνεται να ξεκλειδώνουν το ριβόσωμα επιτρέποντας στο trna και mrna να μετατοπισθούν και έπειτα να κλειδώνουν τις [29]

υπομονάδες στην κατάσταση μέτα-μετατόπισης (posttranslocational state) (Εικόνα 2.2.2). Εικόνα 2.2.3: Συνοπτική αναπαράσταση της επιμήκυνσης στα βακτήρια: Στην καρδιά της πρωτεϊνικής σύνθεσης είναι το στάδιο της επιμήκυνσης, που περιλαμβάνει την προσθήκη αμινοξέων για το σχηματισμό της πεπτιδικής αλυσίδας, η οποία διευκολύνεται από τους παράγοντες επιμήκυνσης G (EF-G) και Tu (EF-Tu) που παρουσιάζονται με καφέ και κόκκινο χρώμα αντίστοιχα (Voorhees and Ramakrishnan, 2013). 2.3 Τερματισμός της πρωτεϊνοσύνθεσης Ο τερματισμός της πρωτεϊνικής σύνθεσης συμβαίνει, όταν ένα κωδικόνιο τερματισμού (UAA, UAG και UGA) εισέρχεται στην Α- θέση του ριβοσώματος. Η διαδικασία τερματισμού περιλαμβάνει την αναγνώριση του κωδικονίου τερματισμού και την υδρόλυση του εστερικού δεσμού του πεπτιδυλο-trna που βρίσκεται στην P- θέση του ριβοσώματος. Αποτέλεσμα της διαδικασίας αυτής είναι η απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, τα κωδικόνια λήξης αναγνωρίζονται από δύο παράγοντες απελευθέρωσης τύπου Ι (παράγοντες που δεν καταναλώνουν ενέργεια), τον RF1 (Release Factor 1) (ειδικός για την [30]

αναγνώριση των UAA και UAG) και τον RF2 (Release Factor 2) (ειδικός για την αναγνώριση UGA και UAA). Στους ευκαρυώτες, στα αρχαία και στα μιτοχόνδρια, όλα τα κωδικόνια λήξης αναγνωρίζονται από τον erf1, arf1, και mtrf1, αντίστοιχα (Konecki et al., 1977; Kisselev et., 2003). Όλοι οι RFs της τάξης I έχουν ένα μοτίβο GGQ (γλυκίνη-γλυκίνη-γλουταμίνη) που απαιτείται για την πυροδότηση της υδρόλυσης του πεπτιδυλο-trna. Ένας άλλος παράγοντας τερματισμού, ο RF3 στα προκαρυωτικά ή erf3 στα ευκαρυωτικά (παράγοντες απελευθέρωσης τύπου ΙΙ), έχει δράση GTPάσης και βοηθά τους RF1/2 ή erf1 στην αναγνώριση του κωδικονίου λήξης και την επακόλουθη απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Συνοπτικά, στα ευκαρυωτικά κύτταρα, οι erf1 και erf3 αλληλεπιδρούν σχηματίζοντας ένα ετεροδιμερές σύμπλοκο, προτού προσδεθούν στην Α-θέση του ριβοσώματος. Ο προσχηματισμός του συμπλόκου πάντως δεν αποτελεί προϋπόθεση για την πρόσδεση των παραγόντων στο ριβόσωμα, αν και ο erf3 έχει καθοριστικό ρόλο τόσο στην ενίσχυση της απελευθέρωσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, όσο και στην ανακύκλωση του ριβοσώματος. Αντίθετα, στα προκαρυωτικά ο RF3 δεν σχηματίζει σύμπλοκο με τον RF1/2 πριν την πρόσδεση τους στο ριβόσωμα και δεν είναι απαραίτητος για την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, υποδεικνύοντας ότι οι RF1/2 είναι δυνατόν να λειτουργήσουν και απουσία RF3 (Freistroffer et al.,1997). Η πρόσδεση του RF3 στο προκαρυωτικό ριβόσωμα γίνεται με τη μορφή του διμερούς συμπλόκου RF3 GDP. Στη συνέχεια, το GDP ανταλλάσσεται με GTP, γεγονός που πυροδοτεί αλλαγές στη διαμόρφωση του RF3 και προκαλεί απελευθέρωση των παραγόντων RF τύπου Ι. Ακολουθεί υδρόλυση του GTP, απελευθέρωση του RF3 GDP και δέσμευση του παράγοντα ανακύκλωσης RRF (Εικόνα 2.3.1). [31]

Εικόνα 2.3.1: Σχηματική αναπαράσταση του τερματισμού της μετάφρασης. (1) Αναγνώριση κωδικονίου λήξης και πρόσδεση των RFs τύπου Ι. (2) Οι RFs τύπου Ι επάγουν την υδρόλυση του εστερικού δεσμού του πετιδυλο-trna και την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. (3) Σύνδεση του RF3-GDP.(4) Η αντικατάσταση του GDP με GTP προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση του RF3 και απελευθέρωση του RF1 ή RF2 από τις ριβοσωματικές υπομονάδες. (5) Υδρόλυση του GTP στον RF3 οδηγεί σε αποσύνδεση του ίδιου, ακολουθούμενη από δέσμευση του RRF. (6) Η δέσμευση του EF-G και η υδρόλυση του GTP έχει ως αποτελέσματα την παροδική αποσύνδεση των ριβοσωματικών υπομονάδων. (7) Η 30S υπομονάδα είναι προσβάσιμη στον IF3 που οδηγεί σε απελευθέρωση του trna της P θέσης και του mrna (Karimi et al., 1999; Peske et al., 2005). 2.4 Ανακύκλωση πρωτεϊνοσύνθεσης Για να ξεκινήσει το ριβόσωμα τον επόμενο κύκλο πρωτεϊνοσύνθεσης πρέπει να γίνει απελευθέρωση του RRF (Ribosome Recycling Factor), του mrna, του απακυλιωμένου trna, καθώς και ο διαχωρισμός του 70S ριβοσώματος στις υπομονάδες του. Ο RRF (Ribosome Recycling Factor) είναι ο κύριος παράγοντας της ανακύκλωσης που αλληλεπιδρά με τη ratched κατάσταση του ριβοσώματος (με ένα αποακυλιωμένο trna συνδεδεμένο στην Ρ/Ε κατάσταση) και αποσταθεροποιεί τις γέφυρες αλληλεπίδρασης μεταξύ των υπομονάδων (Gao et al. 2005; Dunkle et al. 2011). Δέσμευση του EF-G:GTP προωθεί το διαχωρισμό των υπομονάδων και την απομάκρυνση του RRF. Ο IF3 συνδέεται στη μικρή ριβοσωματική υπομονάδα σταθεροποιώντας αυτό το διαχωρισμό και βοηθάει στην απελευθέρωση του αποακυλιωμένου trna και του mrna (Hirokawa et al. 2005; Peske et al., 2005; Zavialov et al., 2001). Σε αυτό το στάδιο, οι ριβοσωματικές υπομονάδες έχουν διαχωριστεί και είναι έτοιμες για τον επόμενο γύρο έναρξη της διαδικασίας (Εικόνα 2.3.1). [32]

3. Μιτοχόνδρια Τα αερόβια ευκαρυωτικά κύτταρα με εξαίρεση ορισμένα πολύ διαφοροποιημένα κύτταρα (πχ. ώριμα ερυθροκύτταρα), περιέχουν ένα ή περισσότερα μιτοχόνδρια που καταλαμβάνουν το 20% του κυτταρικού τους όγκου. Η μορφή και το μέγεθος των μιτοχονδρίων ποικίλουν και εξαρτώνται από τον τύπο και τη μεταβολική κατάσταση του κυττάρου. Ένα τυπικό μιτοχόνδριο έχει σωληνοειδές σχήμα με διάμετρο 0,2 1,0 μm και μήκος 3-10 μm (Εικόνα 3.1). Περιβάλλονται από δύο μεμβράνες. Η εξωτερική (ΟΜ: outer membrane) δίνει το γενικό σχήμα και σχηματίζει έναν φάκελο, ο οποίος αποτελεί ένα φραγμό για τη μετακίνηση μικρών μορίων. Η εσωτερική (IM: inner membrane) είναι πολλές φορές αναδιπλωμένη και σχηματίζει ένα μεγάλο αριθμό εγκολπώσεων που ονομάζονται πτυχές. Η εσωτερική μεμβράνη αποτελείται από δύο περιοχές: την IBM (inner boundary membrane) που βρίσκεται σε στενή επαφή με την OM με την οποία έχει πολλές θέσεις επαφής και την CM (cristal membrane) που αποτελεί το μεγαλύτερο μέρος της ΙΜ (Vogel et al., 2006). Εικόνα 3.1: Μιτοχόνδριο. Α) Απεικόνιση της δομής του. Β) Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο όπου διακρίνεται η διπλή μεμβράνη που το περιβάλλει και η συνέχεια που υπάρχει μεταξύ της εσωτερικής μεμβράνης και των πτυχών. Οι κύριες μεταβολικές διεργασίες που επιτελούνται στα μιτοχόνδρια είναι ο κύκλος του Krebs, η μεταφορά ηλεκτρονίων και η οξειδωτική φωσφορυλίωση. Η συνεργασία των τριών μεταβολικών διεργασιών έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ATP, CO 2, και Η 2 Ο. Πολλά χαρακτηριστικά του μιτοχονδρίου υποστηρίζουν ότι είναι απόγονος ενός αερόβιου προκαρυώτη ο οποίος εγκολπώθηκε και δημιούργησε μία συμβιωτική [33]

σχέση στο εσωτερικό ενός ευκαρυωτικού κυττάρου. Μέρος της ανεξαρτησίας του και του προκαρυωτικού του χαρακτήρα έχει διατηρηθεί. Τα μιτοχόνδρια των θηλαστικών έχουν το δικό τους γονιδίωμα που αποτελείται από 16.569 ζεύγη βάσεων DNA και κωδικοποιούν 2 rrnas (12S και 16S rrna), 22 trnas και 13 πρωτεϊνες. Οι περισσότερες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται στο πυρηνικό DNA, συντίθενται στο κυτταροδιάλυμα και εισάγονται στο οργανίδιο. Όλες οι πρωτεΐνες που συντίθενται από το πρωτεϊνοσυνθετικό σύστημα των μιτοχονδρίων βρίσκονται στην ΙΜ. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι συστατικά ολιγομερών συμπλόκων που είναι απαραίτητα για την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Τα κύτταρα πρέπει να συντονίσουν την πρωτεϊνοσύνθεση εντός του μιτοχονδρίου με τη σύνθεση των πρωτεϊνών που προορίζονται για εισαγωγή στα μιτοχόνδρια, στο κυτταροδιάλυμα. Ο μηχανισμός της πρωτεϊνικής σύνθεσης στα μιτοχόνδρια περιλαμβάνει τα trnas και τα ριβοσώματα, τα οποία διαφέρουν εκείνων του κυτταροδιαλύματος. Τα μιτοχονδριακά ριβοσώματα είναι μικρότερα και τα rrnas είναι βραχύτερα από εκείνα του ευκαρυωτικού κυτταροδιαλύματος, ή των προκαρυωτών. Το μιτοχονδριακό εναρκτήριο MettRNA met i τροποποιείται από μία τρανσφομυλάση που χρησιμοποιεί ένα Ν 10 -φόρμυλο Η 4 φολικό για να παράγει ένα fmet-trna met i. Ο γενετικός κώδικας είναι ελάχιστα διαφορετικός. Η ομοιότητα της μιτοχονδριακής πρωτεϊνοσυνθετικής μηχανής με την προκαρυωτική την κάνει συχνά ευάλωτη σε αντιβιοτικά (Tenson and Mankin, 2006). Επιπλέον, η επιφάνεια των μιτοχονδρίων εμφανίζει πολυανιοντικό χαρακτήρα (Hahn et al., 2008) που προσελκύει κατιοντικές ενώσεις. 3.1 Μιτοχονδριακά ριβοσώματα Τα μιτοχόνδρια των θηλαστικών περιέχουν ριβοσώματα με συντελεστή καθίζησης 55S. Τα μιτοχονδριακά ριβοσώματα αποτελούνται από την 28S μικρή υπομονάδα και την 39S μεγάλη υπομονάδα, έχουν μοριακή μάζα 2,7 ΜDa, ομοιάζοντας στο μέγεθος και στο σχήμα με τα E.coli ριβοσώματα. Τα μιτοχονδριακά ριβοσώματα έχουν δύο τύπους rrna (12S στη μικρή υπομονάδα και 16S στη μεγάλη) και αποτελούν μόνο το 25-30% της συνολικής ριβοσωματικής μάζας, σε αντίθεση με τα βακτηριακά, όπου ο λόγος RNA/πρωτεΐνη ισούται με 2 (Pietromonaco et al., 1991) (Πίνακας 3.1). Πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι τα μιτοχονδριακά ριβοσώματα φέρουν και 5S rrna, το οποίο δεν κωδικοποείται από το γονιδίωμα του [34]

μιτοχονδρίου (Smirnov et al., 2011). Το μικρό ποσοστό του RNA αντισταθμίζεται από την αύξηση των πρωτεϊνών (Koc et al., 2001). Πίνακας 3.1: Διαφορές βακτηριακού και μιτοχονδριακού ριβοσώματος (Koc and Koc, 2012). 2:1 1:2 3.2 Δομή των μιτοχονδριακών ριβοσωματικών υπομονάδων Η 28S υπομονάδα περιέχει 29 διαφορετικές ριβοσωματικές πρωτεΐνες (MRPS2 έως MRPS36), από τις οποίες οι 14 είναι ομόλογες με εκείνες των προκαρυωτικών ριβοσωμάτων, ενώ οι 15 είναι μοναδικές των μιτοχονδριακών ριβοσωμάτων (Christian and Spremulli, 2010). Επίσης περιέχει ένα είδος rrna, το 12S rrna (954 νουκλεοτίδια). Οι πρωτεΐνες που σχηματίζουν την πλατφόρμα της 28S μικρής υπομονάδας είναι οι MRPS2, MRPS6, MRPS11, MRPS18 και MRPS21, ενώ η περιοχή πρόσδεσης του mrna στην άλλη πλευρά της υπομονάδας σχηματίζεται από ειδικές πρωτεΐνες των μιτοχονδρίων και την S5 ομόλογη MRPS5. Δομές από κρυο-εμ παρουσιάζουν τον ώμο της μικρής υπομονάδας να αποτελείται από μία δομή πλούσια σε πρωτεΐνες ειδικές για τα ριβοσώματα των μιτοχονδρίων. Η χαρακτηριστική αυτή δομή περιγράφεται ως mrna-gate και πιθανώς σταθεροποιεί τα μιτοχονδριακά mrnas στην 28S υπομονάδα (Sharma et al., 2003; Agrawal et al., 2011). Η 39S υπομονάδα δομείται από 50 διαφορετικές ριβοσωματικές πρωτεΐνες (MRPL1 έως MRPL57), από τις οποίες οι 28 είναι ομόλογες με εκείνες των προκαρυωτικών ριβοσωμάτων, ενώ οι 20 είναι μοναδικές των μιτοχονδριακών (Koc et al., 2001). Επίσης, περιέχει και 2 είδη rrna (16S και 5S rrna). [35]

Οι MRPL2 και MRPL27, ομόλογες των αντίστοιχων βακτηριακών L2 και L27, είναι σημαντικές για τη δραστικότητα της PTase στη μεγάλη υπομονάδα. Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες που σχηματίζουν το βακτηριακό κανάλι εξόδου, L22, L23, L24 και L29, υπάρχουν και στο μιτοχονδριακό ριβόσωμα (Koc et al., 2010). Οι MRPL22, MRPL23, και MRPL24 είναι δύο φορές μεγαλύτερες σε μέγεθος από τις ομόλογες βακτηριακές, ενώ η μιτοχονδριακή ομόλογη της L29, MRPL47, είναι τέσσερις φορές μεγαλύτερη. Η δομή του μιτοχονδριακού ριβοσώματος, όπως προέκυψε από κρυο-εμ, δίνεται στην Εικόνα 3.2.1. Εικόνα 3.2.1: Η δομή του 55S μιτοχονδριακού ριβοσώματος με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (Agrawal et al., 2011). Παρουσιάζεται η πλευρά του ώμου της 28S μικρής υπομονάδας (πράσινες και κίτρινες περιοχές) και η L7/12 πρωτεϊνική πλευρά της 39S υπομονάδας (σκούρο και ανοιχτό μπλε). Τα πράσινα και σκούρα μπλε σημεία είναι οι ειδικές πρωτεϊνικές περιοχές των μιτοχονδρίων. Οι συντηρημένες περιοχές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων παρουσιάζονται με κίτρινη και ανοιχτή μπλε σκιά. 3.3 Μιτοχονδριακή πρωτεϊνική σύνθεση Η πρωτεϊνοσύνθεση στα μιτοχόνδρια είναι παρόμοια με εκείνων των προκαρυωτικών. Όμως, διαφέρει σε ορισμένα σημεία, όπως: περιγράφεται στη συνέχεια. Ο μιτοχονδριακός μεταφραστικός παράγοντας IF3mt διατηρεί διαχωρισμένες τις δύο υπομονάδες του 55S ριβοσώματος, σχηματίζοντας σύμπλοκο με τη μικρή υπομονάδα. Η είσοδος του mrna στο IF3mt: 28S σύμπλοκο ακολουθείται από παύση, πριν το φορμυλμεθειονυλ-trna (fmet-trna), το πρώτο κατάλοιπο σε όλες τις μιτοχονδριακές πολυπεπτιδικές αλυσίδες, συνδεθεί στη μικρή υπομονάδα. Η παύση αυτή αφήνει ευρύ χρονικό περιθώριο, ώστε να αναγνωριστεί το [36]

κατάλληλο κωδικόνιο έναρξης. Το κωδικόνιο έναρξης που κωδικοποιεί τη μεθειονίνη στα μιτοχόνδρια των θηλαστικών μπορεί να είναι το AUG ή το AUA. Εάν αυτό το βήμα αποτύχει, το σύμπλοκο διίσταται. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα μιτοχονδριακά mrnas δεν έχουν τη Shine-Dalgarno που έχουν οι προκαρυωτικοί, ώστε να διευκολυνθούν στην αναγνώριση του κωδικονίου έναρξης. Ο τερματισμός της μετάφρασης λαμβάνει χώρα, όταν το μετατοπισμένο μιτοχονδριακό ριβόσωμα συναντά ένα κωδικόνιο τερματισμού είτε το UAA ή το UAG. Έχει αναφερθεί πρόσφατα ότι αν συναντήσει AGA ή το AGG κωδικόνιο, το μιτοχονδριακό ριβόσωμα εκτελεί μετατόπιση πλαισίου κατά -1 για να φέρει ένα κλασικό UAG κωδικόνιο λήξης στην Α- θέση, προκαλώντας κανονικό τερματισμό (Temperley et al., 2010). Μόλις το κωδικόνιο τερματισμού εισέλθει στην Α- θέση, ο mtrf1a αναγνωρίζει το κωδικόνιο και συνδέεται με το ριβόσωμα στη GTPδεσμευμένη μορφή του. Αυτό το γεγονός επάγει την υδρόλυση του πεπτιδυλο-trna στην Α- θέση, μέσω της δραστηριότητας της PTase της 39S υπομονάδας, απελευθερώνοντας έτσι το ώριμο πολυπεπτίδιο από το ριβόσωμα. Τέλος, γίνεται πρόσδεση των παραγόντων ανακύκλωσης mtrrf1 και mtrrf2 στην Α-θέση του ριβοσώματος, οι οποίες προκαλούν απελευθέρωση του mrna και αποσύζευξη των υπομονάδων. Εικόνα 3.3.1: Μιτοχονδριακή πρωτεϊνική σύνθεση. Έναρξη: το εναρκτήριο σύμπλοκο αποτελείται από την 28S υπομονάδα, fmet-trna, mrna και τους IF2/3 mit μεταφραστικούς παράγοντες. Το σύμπλοκο αυτό συνδέεται με την 39S υπομονάδα, ενώ οι παράγοντες έναρξης [37]

απελευθερώνονται. Επιμήκυνση: το αα-trna σε σύμπλοκο με το EF-TU mit GTP στην Α-θέση του ριβοσώματος. Σχηματίζεται πεπτιδικός δεσμός και η αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα περνάει από το trna της Ρ- θέσης στο νέο αα-trna της Α- θέσης. Το ριβόσωμα μετατοπίζεται κατά μήκος του mrna με κατεύθυνση 5-3 μέσω της δράσης του EGF1 που επιτρέπει σε ένα νέο κωδικόνιο να εισέλθει στην Α θέση. Τερματισμός: ο παράγοντας τερματισμού mtrf1a συνδέεται όταν ένα κωδικόνιο τερματισμού (είτε UAA ή UAG) αναγνωρίζεται στο mrna. Η πρόσδεση του mtrf1a οδηγεί στην απελευθέρωση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Πρόσθετοι παράγοντες ομόλογοι με τον mtrf1a, δηλαδή ο ICT1, ο C12ORF65 και ο mtrf1, μπορούν επίσης να διεκπεραιώνουν τον τερματισμό της μετάφρασης στο μιτοχόνδριο. Ανακύκλωση του ριβοσώματος: το 55S μονόσωμα διασπάται μέσω της δέσμευσης του mtrrf1 και του mtrrf2 (επίσης γνωστός ως EFG2) στην Α- θέση, απελευθερώνοντας το mrna και το trna. Οι παράγοντες που δείχνονται με μαύρο/κόκκινο κύκλο συνδέονται με ασθένειες που οφείλονται σε μιτοχονδριακές διαταραχές μετάφρασης (Pearce et al., 2013). [38]

4. Αντιβιοτικά και αναστολή ριβοσωματικής λειτουργίας 4.1 Εισαγωγικά Σύμφωνα με τον κλασικό ορισμό, αντιβιοτικά καλούνται τα μεταβολικά προϊόντα μικρού μοριακού βάρους (<3000 D), που παράγονται από μικροοργανισμούς, και αναστέλλουν σε μικρή συγκέντρωση (< 200 μg/ml) την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών. Ωστόσο, η ανάπτυξη χημικών μεθόδων, με τις οποίες είναι δυνατή η σύνθεση ενώσεων που μοιάζουν στη δομή και στις ιδιότητες με τα αντιβιοτικά, είχε σαν αποτέλεσμα την επέκταση του ορισμού των αντιβιοτικών. Έτσι ένα αντιβιοτικό μπορεί να είναι φυσικό, δηλαδή προϊόν ενός μικροοργανισμού, συνθετικό, δηλαδή προϊόν χημικής σύνθεσης ή ημισυνθετικό, που είναι αποτέλεσμα χημικής τροποποίησης ενός φυσικού αντιβιοτικού (Κολιαής, 2001). Τα πρώτα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν στη σύγχρονη ιατρική απομονώθηκαν από ζωντανούς οργανισμούς, όπως η πενικιλίνη που απομονώθηκε από μύκητες του γένους Penicillium ή η στρεπτομυκίνη από βακτήρια του γένους Streptomyces. Τα αντιβιοτικά σε κυτταρικό ή υποκυτταρικό επίπεδο λειτουργούν με έναν από τους παρακάτω τρόπους, παρεμποδίζοντας: i) τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος π.χ. β- και μόνο λακτάμες (Spratt and Cromie, 1988), ii) τη σύνθεση του DNA π.χ. μετρονιδαζολη, iii) τη σύνθεση του RNA π.χ. ριφαμπικίνη, iv) τη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης π.χ. γραμμισιδίνη, και v) τη βακτηριακή πρωτεϊνική σύνθεση (Brisson-Noel et al., 1988) (Εικόνα 4.1.1). [39]

β-lactamins Bacitracin Cycloserine Ethambutol Ethionamide Fosfomycin Glycopeptides isoniazid Aminoglycosides Chloramphenicol Fusidic acid Macrolides Oxazolidinones Streptogramins Tetracyclines Εικόνα 4.1.1: Στόχοι των αντιβιοτικών. Τα αντιβιοτικά παρεμποδίζουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, τροποποιούν τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης, παρεμποδίζουν την πρωτεϊνοσύνθεση ή αναστέλλουν τη σύνθεση των νουκλεϊκών οξέων (Chorpa, 2001). Πρωτεύουσα θέση μεταξύ των αντιβιοτικών κατέχουν εκείνα που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση (Spahn and Prescott, 1996; Tenson and Mankin, 2006; Wilson, 2009). Για δεκαετίες, οι αναστολείς της πρωτεϊνικής σύνθεσης βρίσκονται ανάμεσα στα πιο επιτυχημένα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται κλινικά. Τα τελευταία χρόνια έχει επιτευχθεί μεγάλη πρόοδος στην κατανόηση της πρόσδεσής τους στο ριβόσωμα και των μηχανισμών, μέσω των οποίων αναστέλλουν τη μετάφραση. Έχουν βρεθεί αντιβιοτικά-αναστολείς για κάθε στάδιο της μετάφρασης, όμως τα περισσότερα εξ αυτών στοχεύουν το PTC και το κανάλι εξόδου στη μεγάλη υπομονάδα (Schlünzen et al., 2001) ή το κέντρο αποκωδικοποίησης της μικρής υπομονάδας (Brodersen et al., 2000; Carter et al., 2000). Στην εικόνα 4.1.2 παρουσιάζονται διάφορες κατηγορίες αντιβιοτικών που εμπλέκονται στην πρωτεϊνοσύνθεση. Στην παρούσα εργασία, δίνουμε ιδιαίτερη προσοχή στους αναστολείς της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTάσης), στους οποίους συγκαταλέγονται η πουρομυκίνη και η χλωραμφαινικόλη. [40]

Εικόνα 4.1.2: Σχηματική αναπαράσταση που παρουσιάζει τις περιοχές δράσης των αντιβιοτικών σε διαφορετικά στάδια της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Wilson, 2009). Το μπλε βέλος τονίζει τη χλωραμφαινικόλη, με την οποία ασχολούμαστε στην παρούσα εργασία. [41]

4.2 Πουρομυκίνη Η πουρομυκίνη παράγεται από το Streptomyces alboniger. Δρα και στα τρία βασίλεια ειδών ως αναστολέας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Nathans, 1964). Γι αυτό το λόγο δε χρησιμοποιείται κλινικά, αλλά είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη της αντίδρασης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Wilson, 2009). Η δομή της μοιάζει με το 3 άκρο του αα-trna (Εικόνα 4.2.1). Έτσι η πουρομυκίνη εισέρχεται στην Α-θέση και αναστέλλει συναγωνιστικά την πρόσδεση του αα-trna στη θέση αυτή. Στη συνέχεια, η PTase καταλύει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού με την αμινομάδα της πουρομυκίνης και σχηματίζονται η πεπτιδυλοπουρομυκίνη ή η fmetπουρομυκίνη. Επειδή, όμως, η πουρομυκίνη δεν μπορεί να δράσει ως υπόστρωμα της Ρ- θέσης, αφού ο δεσμός μεταξύ αμινοξέος και της νουκλεοζιτικής ομάδας της πουρομυκίνης είναι ένα αμίδιο και όχι ο ενεργός ακετυλεστέρας των φυσιολογικών αα-trna υποστρωμάτων, η δράση του αντιβιοτικού επιφέρει την πρόωρη διακοπή της σύνθεσης των πολυπεπτιδικών αλυσίδων και προκαλεί την παραγωγή ατελών πεπτιδίων που έχουν πουρομυκίνη στο καρβοξυτελικό τους άκρο. Εικόνα 4.2.1: Δομές πουρομυκίνης και τελικής αδενίνης (Α76) ενός αμινοακυλιωμένου trna με φαινυλαλανίνη. Οι διαφορές μεταξύ πουρομυκίνης και φυσιολογικού υποστρώματος trna φαίνονται με κόκκινο χρώμα. [42]

4.3 Χλωραμφαινικόλη Η χλωραμφαινικόλη (CAM) απομονώθηκε από το Streptomyces venezuelae το 1947 και χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1949 στις Η.Π.Α. Η χημική της ονομασία είναι 2,2-διχλωροακεταμίδιο 1-νιτροφαινυλ-1-3-προπανοδιόλης (Εικόνα 4.3.1). Το μόριό της αποτελείται από τρία μέρη: Ι) την Π-νιτροφαινυλική περιοχή, ΙΙ) τη διχλωρο-ακέτυλο περιοχή, και ΙΙΙ) την 2-αμινο-προπανοδιόλο περιοχή. Συνοπτικά, το μέρος Ι αναπαριστά τον αρωματικό δακτύλιο του συστήματος και το ΙΙ την αλειφατική διχλωροακετυλο πλευρική αλυσίδα. Η CAM έχει βακτηριοστατική δράση στα περισσότερα gram θετικά και gram αρνητικά βακτήρια, ενώ in vitro μελέτες έδειξαν ότι έχει βακτηριοκτόνο δράση έναντι των Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, και Neisseria meningitides. Παρόλο που η χρήση της είναι περιορισμένη εξαιτίας των παρενεργειών που προκαλεί, όπως καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του μυελού των οστών ή σε μερικές περιπτώσεις σοβαρή απλαστική αναιμία, αποτελεί ένα εναλλακτικό αντιβιοτικό για την θεραπεία λοιμώξεων, του τυφοειδούς πυρετού και της βακτηριακής μηνιγγίτιδας (Wareham and Wilson, 2002). Εικόνα 4.3.1: Συντακτικός τύπος της χλωραμφαινικόλης. αποτελείται από τρία μέρη: Ι) την p-νιτροφαινυλική περιοχή, ΙΙ) τη διχλωρο-ακέτυλο περιοχή, και ΙΙΙ) την 2-αμινο-προπανοδιόλ περιοχή. Η CAM συμπεριφέρεται ως χωροδιαταξικό ανάλογο του 3 άκρου των αμινοακυλο trnas (Coutsogeorgopoulos, 1966). Προσδένεται στην 50S ριβοσωματική υπομονάδα και αναστέλλει θεμελιώδεις ριβοσωματικές λειτουργίες, όπως την ενεργότητα της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης (Pestka, 1970; Fernandez-Muñoz and Vazquez, 1973; Bhuta et al., 1980; Drainas et al., 1987; Kalpaxis and Coutsogeorgopoulos, 1989; Michelinaki et al., 1997), την πρόσδεση και την [43]

μετακίνηση των υποστρωμάτων του ριβοσώματος (Steiner et al., 1988; Rheinberger and Nierhaus, 1990; Kirillov et al., 1999), καθώς και τον τερματισμό της μετάφρασης (Beaudet and Caskey, 1971; Lin et al., 1997; Polacek et al., 2003). Επίσης, μειώνει την ακρίβεια της μεταφραστικής διαδικασίας, επάγοντας τη δημιουργία μεταφραστικών σφαλμάτων in vivo (Thompson et al., 2002). Μελέτες κινητικής της αναστολής της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού από την CAM έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα, ότι η αναστολή μπορεί να είναι απλή συναγωνιστική (Pestka, 1970; Coutsogeorgopoulos, 1972), μη-συναγωνιστική (Pestka, 1972) ή μικτή μη συναγωνιστική (Fernandez-Muñoz and Vazquez 1973; Drainas et al., 1987; Kalpaxis and Coutsogeorgopoulos, 1989) εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση του αναστολέα ή το ιοντικό περιβάλλον της αντίδρασης. Με μελέτες χημικής προστασίας (Moazed and Noller, 1987; Rodriguez-Fonseca et al., 1995) έχουν ταυτοποιήσει τουλάχιστον 6 βάσεις στoν κεντρικό βρόγχο της περιοχής V του 23S rrna που παίζουν ρόλο στην πρόσδεση της CAM (Εικόνα 4.3.2). Επίσης, μεταλλάξεις στις βάσεις G2447, A2451, C2452, A2503 και U2504 σε μιτοχονδριακά ριβοσώματα ποντικών προκαλούν ανθεκτικότητα στη CAM (Kearsey and Craig, 1981; Blanc et al., 1981). Κρυσταλλογραφικές μελέτες στο βακτήριο D. radiodurans (Schluenzen et al., 2001) επιβεβαίωσαν τις κινητικές μελέτες αναστολής στο ριβόσωμα. Σύμφωνα με τις μελέτες αυτές, η χλωραμφαινικόλη φέρει ομάδες με τις οποίες έχει την δυνατότητα να δημιουργεί δεσμούς υδρογόνου με νουκλεοτίδια του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Εικόνα 4.3.3). Η πληροφορία για τη θέση πρόσδεσης της CAM έγινε πιο περίπλοκη, όταν το 2003 οι Long και Porse ταυτοποίησαν με ανάλυση σταυροσύνδεσης μια νέα θέση πρόσδεσης της CAM στο ριβόσωμα του E.coli πλησίον της εισόδου του καναλιού εξόδου της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Η μελέτη αυτή επιβεβαίωσε προηγούμενο εύρημα των Hansen et al., (2003), το οποίο είχε προκύψει με κρυσταλλογραφική ανάλυση συμπλόκων της CAM με ριβοσώματα από το αρχαίο H. marismortui (Εικόνα 4.3.4) και είχε αποδοθεί σε ιδιοσυγκρατική συμπεριφορά των ριβοσωμάτων από αρχαία. [44]

Εικόνα 4.3.2: Δευτεροταγής δομή της θηλειάς της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και οι γειτονικές περιοχές στο 23S rrna του E. coli. Νουκλεοτίδια που φαίνεται να επηρεάζονται από την πρόσδεση της CAM φαίνονται ως κύκλοι (Moazed, and Noller, 1987; Garrett and Rodriguez-Fonseca, 1995). Οι μαυρισμένοι κύκλοι αναπαριστούν νουκλεοτίδια τα οποία προστατεύονται κατά την πρόσδεση της CAM από χημικούς τροποποιητές, ενώ οι ανοιχτοί κύκλοι επισημαίνουν νουκλεοτίδια των οποίων η δραστικότητα έναντι χημικών τροποποιητών αυξάνεται. Μεταλλάξεις που παρέχουν ανθεκτικότητα ή μειωμένη ευαισθησία στη χλωραμφαινικόλη παρουσιάζονται με τους σχετικούς οργανισμούς σε παρένθεση. E.c.: E. coli, H.h.: H. halobium, H.s.: Homo sapiens, M.m.: Mus musculus, R.r.: Rattus rattus, S.a.: S. acidocaldarius, S.c.: Saccharomyces cerevisiae. Όλες οι μεταλλάξεις στα ευκαρυωτικά αναφέρονται σε μιτοχονδριακό rrna. Εικόνα 4.3.3: Κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου ριβόσωμα-cam στο βακτήριο D. Radiodurans (Schlunzen et al.,2001). [45]

Εικόνα 4.3.3: Θέσεις πρόσδεσης της CAM στο ριβόσωμα στο αρχαίο H. marismortui. Tα νουκλεοτίδια G2099 και A2100 αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια Α2058 και Α2059 στην είσοδο του καναλιού εξόδου στο E.coli (Hansen et al., 2003). Σημαντικό ρόλο στη δράση της CAM φαίνεται να διαδραματίζουν και τα ιόντα Mg 2+ που απαντώνται στον κρύσταλλο του ριβοσώματος μόνο όταν είναι προσδεδεμένη η CAM. Φαίνεται δηλαδή, ότι η παρουσία των δύο ενυδατωμένων αυτών ιόντων Mg 2+ συνδέεται άμεσα με τη δέσμευση της CAM στο ριβόσωμα, διαμεσολαβώντας στην αλληλεπίδραση χημικών ομάδων της χλωραμφαινικόλης με νουκλεοτίδια του καταλυτικού κέντρου (Schluenzen et al., 2001). Πρόσφατες μελέτες στα βακτήρια T. thermophilus (Bulkley et al., 2010) και E. coli (Dunkle et al., 2010) αποκάλυψαν πολλά λάθη στην αρχική αυτή κρυσταλλογραφική μελέτη, κυρίως στον προσανατολισμό του μορίου της χλωραμφαινικόλης εντός του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος (Εικόνα 4.3.4). Είναι όμως σημαντικό, ότι στη μελέτη του T. thermophilus εντοπίζεται ξανά ένα μεταλλικό θετικό φορτίο πλησίον της θέσης πρόσδεσης του αντιβιοτικού. [46]

Εικόνα 4.3.4: Κρυσταλλογραφική τοποθέτηση της χλωραμφαινικόλης στο καταλυτικό κέντρο (Α) του βακτηρίου T. thermophilus (Bukley et al., 2010) και (Β) του βακτηρίου E. coli (Dunkle et al., 2010). Eκτός από τα μονοσθενή και τα δισθενή ιόντα, είναι επίσης απαραίτητη και η παρουσία των πολυαμινών για την αποκατάσταση ενός ιοντικού περιβάλλοντος που προάγει την πρόσδεση της CAM στο ριβόσωμα (Xaplanteri et al., 2003). Τέλος, πρέπει να αναφέρουμε ότι πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου (Kostopoulou et al., 2011) απεκάλυψε ότι η CAM, μέσω διαδοχικών αναδιατάξεων προκαλεί μετάδοση αλλοστερικών μηνυμάτων στην είσοδο του καναλιού εξόδου. Πολλά παράγωγα της CAM έχουν δοκιμασθεί για τις ανασταλτικές τους ιδιότητες. Η σχετική ευκολία ως προς τη σύνθεση των παραγώγων έχει δώσει το έναυσμα για πολλές μελέτες, με την προσδοκία να δημιουργηθούν παράγωγα αποτελεσματικότερα και με λιγότερες παρενέργειες σε σχέση με τη μητρική ένωση. Τα συνθετικά παράγωγα της CAM ταξινομούνται σε τρείς ομάδες παράγωγα με την λειτουργική περιοχή του μορίου της CAM η οποία έχει τροποποιηθεί. Στην πρώτη ομάδα ανήκουν συνθετικά παράγωγα τα οποία προέρχονται μετά από ολική ή μερική υποκατάσταση της αλυσίδας αμινοπροπανοδιόλης του μορίου της CAM (Shemyakin et al., 1961). Στην δεύτερη ομάδα ανήκουν τα συνθετικά παράγωγα, τα οποία προέρχονται μετά από τροποποίηση της π-νιτροφαίνυλο ομάδας του μορίου της χλωραμφαινικόλης (Shemyakin et al., 1954; 1955). Τέλος, στην τρίτη ομάδα ανήκουν τα συνθετικά παράγωγα τα οποία προκύπτουν μετά από μερική ή ολική υποκατάσταση του διχλωροακέτυλο- καταλοίπου του μορίου της CAM (Shemyakin et al., 1961; Drainas et al., 1993; Michelinaki et al., 1997; Kostopoulou et al., 2011; Mamos et al., 2013). [47]

Συμπερασματικά οι μελέτες αυτές οδήγησαν στα εξής συμπεράσματα. Ο αρωματικός δακτύλιος και η διχλωροακετυλομάδα μπορούν να αντικατασταθούν, χωρίς η χλωραμφαινικόλη να χάσει την αντιβακτηριακή της δράση. Αντιθέτως αλλαγές στην περιοχή της προπανοδιόλης καταργούν τη δράση του αντιβιοτικού (Pongs, 1979). Απόπειρες σύνθεσης παραγώγων της χλωραμφαινικόλης, τα οποία εμφανίζουν μειωμένη τοξικότητα και παρενέργειες στους ασθενείς στους οποίους χορηγούνται, οδήγησαν στην παρασκευή τόσο της νιτροδω-χλωραμφαινικόλης (Miller, 1982), όσο και της θειαμφαινικόλης ή θειομυκετίνης (Bonner, 1954; Yunis, 1988). H θειαμφαινικόλη παρουσίαζει in vitro δέκα φορές ασθενέστερη βακτηριοκτόνο δράση έναντι των βακτηρίων S. aureus, E. coli και S. typhi, ενώ παράλληλα παρουσιάζει in vitro τρείς φορές ισχυρότερη βακτηριοκτόνο δράση έναντι της B. abortus. Ένα άλλο ανάλογο, η φθοριομφαινικόλη, χρησιμοποιούμενο ευρέως στην κτηνιατρική, εμφανίζει μεγαλύτερη δραστικότητα από την μητρική ένωση στις ίδιες συγκεντρώσεις και παρουσιάζει ευρύτερο φάσμα δράσης, το οποίο συμπεριλαμβάνει και μικροβιακά στελέχη παραδοσιακά ανθεκτικά στην CAM. Επίσης, έχουν συντεθεί πυρρολικά παράγωγα της χλωραμφαινικόλης, τα οποία όμως απεδείχθησαν αδρανή (Krajewska, 2009). Εκτός από τα παραπάνω παράγωγα, παρασκευάσθηκαν και φωτο-δραστικά παράγωγα της CAM, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως αντιδραστήρια φωτοσήμανσης συγγενείας, σε μια προσπάθεια ταυτοποίησης αμινοξέων που συμμετέχουν στο ενεργό καταλυτικό κέντρο της πεπτίδυλο-τρανσφεράσης (Νielsen, 1975), καθώς και στην εκτίμηση της δραστικότητας του ενζύμου ακέτυλοτρανσφεράση της χλωραμφαινικόλης (Υoung et al, 1991). Το ένζυμο αυτό απαντάται μόνο σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς και προσδίδει ανθεκτικότητα έναντι της CAM. Αμινο-ακυλο- ή πεπτιδυλο- παράγωγα της CAM παρασκευάσθηκαν για τη μελέτη του μηχανισμού δέσμευσης του αντιβιοτικού στο ενεργό καταλυτικό κέντρο της PTase. Τέτοια συνθετικά παράγωγα προέκυψαν μετά από υποκατάσταση της διχλωροακετάμιδο ομάδας του μορίου της CAM, από L-φαινυλαλανίνη, D- φαινυλαλανίνη, L-λευκίνη, L-p-O-μεθυλο-φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, φαινυλοπροπιονυλο-ομάδα, L-(D)-p-NO2-φαινυλαλανίνη, D-(L)-p-NO2-φαινυλαλανίνη και Ν-ακετυλο-L-φαινυλαλανίνη (Vince et al., 1975). Συνθετικά παράγωγα της CAM στα οποία η διχλωροακετυλομάδα έχει αντικατασταθεί από μια L-φαινυλαλανίνη, γλυκίνη, L-φαινυλαλανίνη-γλυκίνη και γλυκίνη-l-φαινυλαλανίνη, έχουν [48]

χρησιμοποιηθεί για να ελεγχθεί ο μηχανισμός δράσης της CAM (Drainas et al., 1993; Michelinaki et al., 1997; Kostopoulou et al., 2011; Mamos et al., 2013). 4.4 Κατάταξη των αναστολέων Γενικά στη βιβλιογραφία υπάρχουν διάφοροι τρόποι κατάταξης των αναστολέων (Frieden et al, 1980; Morrison and Walsh, 1988). Οι κύριες παράμετροι, με βάση τις οποίες κατατάσσουμε τους αναστολείς, είναι η αντιστρεπτότητα ή μη της αλληλεπίδρασης ενζύμου-αναστολέα και η ταχύτητα της αλληλεπίδρασής τους. Με βάση τα κριτήρια αυτά, οι αναστολείς διακρίνονται σε: α) ταχέως αντιστρεπτούς αναστολείς, β) μη αντιστρεπτούς και γ) βραδέως αντιστρεπτούς αναστολείς οι οποίοι χωρίζονται σε περαιτέρω υποκατηγορίες, όπως φαίνεται στον παρακάτω διάγραμμα. [49]

Ταχέως αντιστρεπτοί αναστολείς Συναγωνιστικοί Μη Συναγωνιστικοί Ασυναγώνιστοι Μεικτοί Κατάταξη των αναστολέων με βάση την αντιστρεπτότητα ή μη της αλληλεπίδρασης ενζύμου-αναστολέα και την ταχύτητα αλληλεπίδρασή Βραδέως αντιστρεπτοί αναστολείς Βραδέως ισχυρά προσδενόμενοι Βραδέως προσδενόμενοι Ιt Et Ιt>>Et αργή αποκατάσταση της αργή αποκατάσταση της ισορροπίας ισορροπίας Ε + Ι ΕΙ Ε + Ι ΕΙ [50] Μη αντιστρεπτοί Μη αντιστρεπτοί αναστολείς με σχηματισμό ενδιάμεσου συμπλόκου Μη αντιστρεπτοί με μη σχηματισμό ενδιάμεσου συμπλόκου

Στις αρχές της δεκαετίας του 1980 ο Morrison περιγράφει μια νέα τάξη αντιστρεπτών αναστολέων, τους αποδίδει τον όρο βραδέως προσδενόμενοι (slow binding inhibitors) και τους ταξινομεί: α) ανάλογα με τη σχέση μεταξύ ολικής συγκέντρωσης του ενζύμου (E t ) και της ολικής συγκέντρωσης του αναστολέα (I t ), ώστε το φαινόμενο αναστολής να είναι μετρήσιμο και β) ανάλογα με την ταχύτητα αποκατάστασης ισορροπίας μεταξύ Ε, Ι και ΕΙ (Πίνακας 4.1). Ο όρος βραδέως προσδενόμενος αναστολέας αποδίδεται, κατά τον Morrison, σε αναστολείς κατά την δράση των οποίων παρατηρείται αύξηση της αναστολής με την πάροδο του χρόνου (Williams and Morrison, 1979; Morrison, 1982). Και ενώ ο χρόνος για την αποκατάσταση της ισορροπίας ανάμεσα στα ένζυμα και στα υποστρώματά τους ή τους κλασσικούς αναστολείς είναι της τάξεως των msec, για τους βραδέως προσδενόμενους είναι της τάξεως των δευτερολέπτων ή λεπτών (Williams and Morrison, 1979; Morrison, 1982; Morrison and Walsh, 1988). Η χλωραμφαινικόλη ανήκει στην κατηγορία των βραδέως προσδενόμενων αναστολέων (slow binding inhibitors). Πίνακας 4.1: Ταξινόμηση αντιστρεπτών ενζυμικών αναστολέων κατά Morrison Διάφοροι μηχανισμοί έχουν προταθεί για να περιγραφεί η χρονοεξαρτώμενη αναστολή (ή βραδέως εκδηλούμενη αναστολή), η οποία προκαλείται από αντιστρεπτούς (reversible) αναστολείς (Cha, 1975; Cha et al, 1975; Morrison, 1982; Morrison and Stone, 1985; Morrison and Walsh, 1988; Schloss, 1988). Οι μηχανισμοί αυτοί διακρίνονται ως εξής: i) Mηχανισμός με μία ισορροπία. Σε αυτή την περίπτωση, η δέσμευση του αναστολέα (Ι) επί του ενζύμου (Ε) περιγράφεται από μία ισορροπία της μορφής: [51]

όπου το μοναδικό αντιστρεπτό σύμπλοκο ΕΙ σχηματίζεται σχετικά αργά και διΐσταται επίσης αργά. Tόσο η τιμή της φαινομενικής ειδικής σταθεράς ψευδοπρώτης τάξεως, δηλαδή το γινόμενο k 4 [I], όσο και η τιμή της ειδικής σταθεράς k 5 είναι μικρές (Cha, 1975; Wentworth and Wolfenden, 1975; Williams and Morrison, 1979; Frieden et al., 1980; Morrison, 1982). Τα όρια του γρήγορου και του αργού προσδιορίζονται συγκριτικά με τις τιμές των κινητικών σταθερών δευτέρας τάξεως (k on ) με τις οποίες αλληλεπιδρούν το ένζυμο και το υπόστρωμα στην κλασσική ενζυμολογία. Οι τιμές αυτές ελέγχονται από τους νόμους της διαχύσεως (diffusion controlled) και κυμαίνονται πειραματικά από 10 6 10 8 Μ -1 s -1 (Fersht, 1985). ii) Μηχανισμός με δύο ισορροπίες. Σε αυτή την περίπτωση, η δέσμευση του αναστολέα (Ι) επί του ενζύμου (Ε) περιγράφεται από δύο διαδοχικές ισορροπίες του παρακάτω κινητικού σχήματος: k 4 k 6 Ε + Ι ΕΙ Ε*Ι k 5 k 7 Σύμφωνα με το κινητικό σχήμα, σχηματίζεται ταχέως ένα ενδιάμεσο αντιστρεπτό σύμπλοκο ΕΙ, το οποίο στη συνέχεια με βραδύ ισομερισμό αλλάζει διαμόρφωση προς μία μορφή συμπλόκου Ε*Ι (Cha, 1975; Cha et al., 1975; Morrison, 1982; Morrison and Walsh, 1988; Schloss, 1988). Όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία (Morrison and Walsh, 1988; Badet et al., 1986), σε αυτές τις περιπτώσεις η τιμή της κινητικής σταθεράς δευτέρας τάξεως k 4 που αφορά το σχηματισμό του αρχικού συμπλόκου (ΕΙ) κυμαίνεται από 10 5-10 7 Μ -1 s -1, δηλαδή βρίσκεται πολύ κοντά στις τιμές (10 6-10 8 M -1 s -1 ) των αντιστοίχων σταθερών δευτέρας τάξεως που αφορούν τον σχηματισμό του συμπλόκου μεταξύ Ε και S των κλασσικών ενζυμικών αντιδράσεων (Fersht, 1985). Αντίθετα, η φαινομενική σταθερά πρόσδεσης του αναστολέα στο ένζυμο, (k 6 + k 7 )/ K i, είναι δύο τάξεις μεγέθους μικρότερη (< 10 4 Μ -1 s -1 ). [52]

iii) Mηχανισμός δεσμεύσεως του αναστολέα επί του ενζύμου μέσω μιάς ισορροπίας και ταυτόχρονης αλλαγής διαμορφώσεως (Erion and Walsh, 1987; Morrison and Walsh, 1988; Schloss, 1988; 1989). k 4 E + I E*I Μολονότι ο μηχανισμός αυτός έχει χρησιμοποιηθεί για την κινητική ανάλυση αναστολής διαφόρων ενζύμων, εντούτοις δεν έχουν παρουσιασθεί μέχρι σήμερα στην βιβλιογραφία ικανές αποδείξεις για την ύπαρξή του. Σύμφωνα με τους Erion και Walsh (1987) και Morrison και Walsh (1988), η περίπτωση αυτή δεν αποτελεί αυτοτελή μηχανισμό, αλλά είναι αποτέλεσμα μεταπτώσεως από τον μηχανισμό με δύο ισορροπίες, όταν λόγω της μεγάλης τιμής της σταθεράς διαστάσεως Κ i, το ενδιάμεσο σύμπλοκο ΕΙ είναι ασταθές, με συνέπεια η συγκέντρωσή του στη σταθερά κατάσταση να είναι ασήμαντη και έτσι να μπορεί να θεωρηθεί ότι το Ε μετατρέπεται απευθείας σε Ε*Ι. iv) Μηχανισμός βραδέως ισομερισμού του ενζύμου πριν από την ταχεία δέσμευση του αναστολέα. k 5 Ε Ε* + Ι Ε*Ι Μολονότι, ο μηχανισμός αυτός προβλέπεται θεωρητικά (Cha, 1975; Erion and Walsh, 1987; Schloss, 1988), δεν έχει μέχρι στιγμής επαληθευθεί πειραματικά. [53]

5. Πολυαμίνες 5.1 Βιοσύνθεση πολυαμινών Οι πολυαμίνες είναι πολυκατιοντικές ενώσεις, που απαιτούνται για την κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, τη σύνθεση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, τόσο στους προκαρυωτικούς όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Agostinelli, 2010). Σε φυσιολογικό pη είναι θετικά φορτισμένες και προσδένονται σε όξινες θέσεις κυτταρικών μακρομορίων συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και φωσφολιπιδίων των μεμβρανών, εξουδετερώνοντας το αρνητικό τους φορτίο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση και προστασία των μακρομορίων από υδρολυτικές επιδράσεις, οξειδωτικές διεργασίες και ακτινοβολία (Tabor and Tabor, 1985; Cohen, 1998; Igarashi and Kashiwagi, 2000). Οι πιο κοινές πολυαμίνες είναι η πουτρεσκίνη (2 αμινομάδες), η σπερμιδίνη (3 αμινομάδες) και η σπερμίνη (4 αμινομάδες) (Εικόνα 5.1.1). Η πουτρεσκίνη σχηματίζεται de novo από την αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης (ODC) (Pegg, 2006). Η αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης είναι το πρώτο ρυθμιστικό ένζυμο στη σύνθεση των πολυαμινών. Επίσης, σημαντικό ένζυμο είναι η αποκαρβοξυλάση της S- αδενοσυλμεθειονίνης (dcadomet) που αποκαρβοξυλιώνει την S-αδενοσυλμεθειονίνη (AdoMetDC), προμηθεύοντας έτσι αμινοπροπυλομάδες για τη σύνθεση των πολυαμινών (Urdiales et al., 2001). Εικόνα 5.1.1: Δομή των πολυαμινών. Η ομοιόστασή τους στο κύτταρο ρυθμίζεται από την βιοσύνθεση, την αποικοδόμηση αλλά και τη διαμεμβρανική τους μεταφορά. Μεταξύ των οργανισμών, [54]

οι συγκεντρώσεις των πολυαμινών τους διαφέρουν. Στα προκαρυωτικά κύτταρα παρατηρούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις πουτρεσκίνης σε σχέση με την σπερμιδίνη, ενώ η σπερμίνη είναι σχεδόν αμελητέα. Αντίθετα, στους ευκαρυωτικούς παρατηρούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις σπερμιδίνης και σπερμίνης (Casero and Pegg, 1993; Holtta, 1997; Janne et al., 2004; Vujcic et al., 2002). Η είσοδος των πολυαμινών στο κύτταρο του βακτηρίου E. coli πραγματοποιείται μέσω δύο μεταφορέων που ανήκουν στους ATP προσδενόμενους (ΑΒC) μεταφορείς: i) της σπερμιδίνης που αποτελείται από τις πρωτεΐνες PotA (ATPαση), τις PotB και PotC (σχηματίζουν τα κανάλια μεταφοράς σπερμιδίνης πουτρεσκίνης), και την PotD (υποδέχεται τη μεταφερόμενη πολυαμίνη) και ii) της πουτρεσκίνης που αποτελείται από την PotF (υποδέχεται τη μεταφερόμενη πολυαμίνη), την PotG (ATPαση), και τις PotH και PotI (σχηματίζουν τα κανάλια μεταφοράς της πολυαμίνης) (Igarashi and Kashiwagi, 2010) (Εικόνα 5.1.2). Εικόνα 5.1.2: Συστήματα μεταφοράς πολυαμινών στο Ε.coli (Igarashi and Kashiwagi, 2010). Στα κύτταρα των θηλαστικών, έχει αναφερθεί ότι η είσοδος των πολυαμινών επιτυγχάνεται, εν μέρει, μέσω γλυπικάνης-1 και ενός μηχανισμού ενδοκύττωσης που εξαρτάται από καβεολίνη-1 (Belting et al., 2003; Roy et al., 2008). Σε πρόσφατες μελέτες ταυτοποιήθηκε ο SLC3A2, γνωστός ως μία γλυκοσυλιωμένη βαριά αλυσίδα ενός κατιονικού μεταφορέα αμινοξέων, σα μέρος του συστήματος εκροής πουτρεσκίνης και ακετυλοπολυαμίνης (Εικόνες 5.1.3, 5.1.4). Συγκεκριμένα, ο SLC3A2 σε σύμπλοκο με μια άλλη πρωτεΐνη, την y+lat δρα ως αντιμεταφορέας αργινίνης και πουτρεσκίνης/ ακετυλοσπερμιδίνης (Uemura et al., 2008). Ωστόσο, η μεταφορά των πολυαμινών στα θηλαστικά δεν είναι ενδελεχώς μελετημένη. [55]

Εικόνα 5.1.3: Συστήματα μεταφοράς πολυαμινών στα θηλαστικά κατά Igarashi και Kashiwagi (2010). Εικόνα 5.1.4: Υποθετικά μοντέλα ενδοκύττωσης των πολυαμινών σε θηλαστικά κύτταρα. Το μοντέλο Α (Soulet et al., 2004) δείχνει ένα μηχανισμό δύο σταδίων για τη μεταφορά των πολυαμινών Το μοντέλο Β (Belting et al., 2003) προτείνει ότι η σπερμίνη προσδένεται αρχικά σε ομάδες θειϊκής ηπαρίνης σε γλυπικάνη-1 και συνεπώς εισέρχεται και απελευθερώνεται από τη γλυπικάνη μέσω μη [56]

διαμεσολαβούμενης οξείδωσης. NOS2: συνθάση του νιτρικού οξειδίου-2, PA: πολυαμίνες, PUT: πουτρεσκίνη, SPM: σπερμίνη. Το μοντέλο C (Uemura et al., 2010) προτείνει μια εξαρτώμενη από καβεολίνη-1 είσοδο των πολυαμινών που συνδέονται σε ένα πιθανό πολυαμινικό υποδοχέα. Η πουτρεσκίν, όχι όμως οι ανώτερες πολυαμίνες, ίσως εξέρχονται από τα κυστίδια μέσω των SLC3A2- συνδεόμενων διαμινικών εξαγωγέων (Poulin et al., 2012). O πολυκατιοντικός χαρακτήρας των πολυαμινών και η παρουσία ενεργών διαμεμβρανικών μεταφορέων, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα, έχει καταστήσει τη σύζευξη των πολυαμινών με διάφορα φάρμακα (polyamine-drug conjugates) ελκυστική λύση για τη μεταφορά φαρμάκων στο κύτταρο (Wang et al., 2003; Sol et al., 2006; Jin et al., 2007; Dallavalle et al., 2006; Wu et al., 2007; Tian et al., 2009; Kaur et al., 2008). Μεταξύ των φαρμάκων που έχουν εισαχθεί στο κύτταρο ως πολυαμινικά συζεύγματα, συγκαταλέγονται και διάφορα αντιβιοτικά (Kurylo-Borowska and Heaney-Kieras, 1983; Moore et al., 1993; Hainrichson et al., 2008; Khan et al., 2008). H μεθοδολογία σύζευξης των αντιβιοτικών με πολυαμίνες προτιμάται επίσης, ως όχημα ενδοκυττάρωσης των αντιβιοτικών λόγω του ότι οι πολυκατιοντικές ενώσεις δρουν και ως αποδιοργανωτές του κυτταρικού τοιχώματος (outer membrane) των βακτηρίων, καθιστώντας τα ευάλωτα στα αντιβιοτικά (Vaara, 1992; Imamura et al., 2005). Tέλος, πρέπει να σημειωθεί ότι ο πολυκατιοντικός χαρακτήρας των πολυαμινών καθιστά τα συζεύγματά τους με αντιβιοτικά επιλεκτικά έναντι ενδοκυτταρικών στόχων πολυανιοντικού χαρακτήρα. π.χ. η επιφάνεια των μιτοχονδρίων εμφανίζει πολυ-ανιοντικό χαρακτήρα (Hahn et al., 2008). Αν αυτό συνδυασθεί με το γεγονός ότι ταχέως διαιρούμενα κύτταρα, όπως τα καρκινικά, διαθέτουν ιδιαιτέρως ενεργούς διαμεμβρανικούς μεταφορείς πολυαμινών (Chen and Rinehart, 1981) και κατά συνέπεια μεγαλύτερη ικανότητα πρόσληψης εξωγενών πολυαμινών, τότε τα πολυαμινικά παράγωγα αντιβιοτικών θα μπορούσαν δυνητικά να χρησιμοποιηθούν και ως αντικαρκινικά φάρμακα. 5.2 Δράσεις των πολυαμινών Οι πολυαμίνες είναι πολυλειτουργικά μόρια, παίζοντας σημαντικό ρόλο σε διάφορες διαδικασίες που εκτελούνται στο κύτταρο, όπως η μεταγραφή, η μετάφραση, η υπουσινοποίηση του eif5a, η ρύθμιση ιοντικών καναλιών, τα [57]

σηματοδοτικά μονοπάτια, ο κυτταροσκελετός και οι κυτταρικές αλληλεπιδράσεις (Εικόνα 5.2.1). Εικόνα 5.2.1: Λειτουργίες των πολυαμινών. Τα επίπεδα πολυαμίνης επηρεάζουν τους διαύλους ιόντων, τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, του κυτταροσκελετού, τη σηματοδότηση μέσω φωσφορυλίωσης και άλλων μηχανισμών, τη δραστικότητα του eif5a μέσω του ρόλου της σπερμιδίνης στην υπουσινοποίηση, τη μεταγραφή και τη μετάφραση του mrna. Οι συνέπειες για τη μεταγραφή και μετάφραση (άμεσες και έμμεσες) μεταβάλλουν τα κυτταρικά επίπεδα πολλών πρωτεϊνών που απαρτίζουν ένα σύμπλεγμα κυτταρικής απόκρισης (polyamine-responsive modulon), όπως περιγράφεται από τον Igarashi και τους συνεργάτες του (Yoshida et al., 2004; Higashi et al., 2006). Η μελέτη του βιολογικού ρόλου των πολυαμινών στην πρωτεϊνική σύνθεση υπήρξε πεδίο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας. Οι πολυαμίνες επηρεάζουν σε διάφορα σημεία την πρωτεϊνοσύνθεση. Η δομή της Shine-Dalgarno στο mrna αναδιαμορφώνεται παρουσία των πολυαμινών, ώστε να διευκολύνει το σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης στους προκαρυωτικούς (Yoshida et al., 1999). Μια άλλη λειτουργία τους είναι ότι δεσμεύονται ισχυρά σε μεταφραστικούς παράγοντες (Marczynski, 1985) αλλάζοντας τη δομή και τη λειτουργία τους. Για παράδειγμα η σπερμιδίνη επηρεάζει το σχηματισμό των 70S ριβοσωμάτων, μέσω ρύθμισης της δράσης του IF3 στην έναρξη της μετάφρασης (Umekage and Ueda, 2006). Οι πολυαμίνες σε συνεργασία με δισθενή και μονοσθενή κατιόντα (Mg +2, K + ) αποτελούν το κατάλληλο ιοντικό περιβάλλον, ώστε να επιτευχθεί η βέλτιστη ριβοσωματική ενεργότητα (Kalpaxis and Drainas, 1993; Drainas and Kalpaxis, 1994). Σε [58]

συγκεντρώσεις 6 mm Mg 2+, η σπερμίνη επηρεάζει τόσο το τελικό σημείο, όσο και την κινητική φάση της αντίδρασης πουρομυκίνης. Έχει βρεθεί πως οι πολυαμίνες ιδιαίτερα η σπερμίνη, επηρεάζουν τη βιοσύνθεση των αα-trnas. Δε δρουν στη συνθετάση των αα-trnas αλλά δεσμεύονται στο trna, βελτιώνοντας την ικανότητά του να προσδένεται στο ένζυμο. Η δέσμευση πολυαμινών στο trna βελτιώνει επίσης την πρόσδεσή του στο ριβόσωμα (Amarantos et al., 2002). Θετική είναι η επίδραση των πολυαμινών στη μετατόπιση των υποστρωμάτων (translocation), παρουσία ή απουσία του παράγοντα EFG (Xaplanteri et al., 2005). Είναι χαρακτηριστικό, ότι η βέλτιστη in vitro συγκέντρωση του EF-G ελαττώνεται παρουσία σπερμίνης. Επίσης αυξάνουν την πιστότητα της μετάφρασης. Η σπερμιδίνη παρουσία 6 mm Mg 2+, ενισχύει την ειδικότητα στην αλληλεπίδραση κωδικονίου-αντικωδικονίου και μειώνει σημαντικά την ενσωμάτωση λανθασμένων αμινοξέων. Η δράση τους έγκειται κυρίως στην ακρίβεια της μετάφρασης (Igarashi et al., 1982; Ito and Igarashi, 1986). Η σπερμιδίνη δρα ως υπόστρωμα για την τροποποίηση της υπουσίνης [Ν8-(4- αμινο-2-υδροξυβουτυλ) λυσίνη], ενός σπάνιου αμινοξέος απαραίτητου για την ενεργοποίηση του eif5a (Park, 2006). Αρχικά η συνθάση της δεοξυ-υπουσίνης (DHS) τροποποιεί τον eif5a τοποθετώντας το αμινοβουτυλικό άκρο της σπερμιδίνης σε ένα ειδικό υπόλειμμα λυσίνης και στη συνέχεια η υδροξυλάση της δεοξυυπουσίνης (DOHH) σχηματίζει τον eif5a (Εικόνα 5.2.2) (Pegg, 2009). Αναστολείς της DHS και της DOHH ασκούν ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε κύτταρα θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένων διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών σειρών (Hanauske-Abel et al., 1994; Park et al., 1994; Chen et al., 1996; Clement et al., 2002; Nishimura et al., 2005). Εικόνα 5.2.2: Βιοσύνθεση της υπουσίνης στον eif5a. Η σπερμιδίνη που συντίθεται από πουτρεσκίνη είναι πηγή της αποβουτυλιωμένης ομάδας της υπουσίνης. Η σύνθεση της υπουσίνης συμβαίνει σε ένα συγκεκριμένο κατάλοιπο λυσίνης της πρόδρομης πρωτεΐνης του eif5a, eif5a (Lys), [59]

σε δύο στάδια, που καταλύονται διαδοχικά από τη συνθάση της δεοξυυπουσίνης (DHS) και την υδροξυλάση της δεοξυυπουσίνης (DOHH) (Park et al., 2010). Τέλος, οι πολυαμίνες επηρεάζουν την πρόσδεση των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα. Μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες διεγείρουν την πρόσδεση της χλωραμφαινικόλης στο ριβόσωμα (Xaplanteri et al., 2003), ευνοούν την ανασταλτική δράση της κλινδαμυκίνης και της βλαστισιδίνης (Kouvela et al., 2006), ενώ αντίθετα, επηρεάζουν αρνητικά την δράση των μακρολιδίων (τυλοσίνη, σπιραμυκίνη και ερυθρομυκίνη) και κετολιδίων (τελιθρομυκίνη) (Petropoulos et al., 2004; 2008). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με παλαιότερες μελέτες που ανέφεραν ότι προεπώαση των ριβοσωμάτων με σπερμίνη περιορίζει την ικανότητά του να προσδένει ερυθρομυκίνη, λόγω αλλαγών που προκαλεί στη ριβοσωματική διαμόρφωση (Teraoka and Tanaka, 1973). Η επίδραση των πολυαμινών στη διαμόρφωση του ριβοσώματος έχει ενδελεχώς μελετηθεί στο βακτήριο E.coli, με τη χρήση φωτοδραστικών αναλόγων της σπερμίνης (Xaplanteri et al., 2005; Amarantos et al., 2002). Η χλωραμφαινικόλη έχει μεγάλη σημασία τόσο σε κλινικό θεραπευτικό επίπεδο στην αντιμετώπιση βακτηριακών λοιμώξεων, όσο και σε επίπεδο βασικής έρευνας στην μελέτη της σχέσης δομής λειτουργίας του ενεργού καταλυτικού κέντρο της πεπτίδυλοτρανσφεράσης. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση του ριβοσώματος ήταν καθοριστική στην ταυτοποίηση της θέσης πρόσδεσης της CAM. Ανάλυση κρυστάλλων ριβοσωμάτων από το αρχαιοβακτήριο H. marismortui έδειξε ότι η CAM προσδένεται στην αρχή του καναλιού εξόδου της νεοσυντιθέμενης πρωτεϊνικής αλυσίδας (Hansen et al., 2003). Παρόμοια θέση πρόσδεσης της CAM ταυτοποιήθηκε βιοχημικά και στο βακτηριακό ριβόσωμα (Long and Porse, 2003). Αντίθετα, κρυσταλλογραφικές μελέτες στο E. coli αποκάλυψαν, ότι το αντιβιοτικό δεσμεύεται στο καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος (Dunkle et al., 2010). Με βάση τις δύο θέσεις δέσμευσης της CAM που παρουσιάζουν τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα πραγματοποιήθηκε σύνθεση διμερών παραγώγων της CAM, ώστε να βελτιωθεί η πρόσδεσή της στο ριβόσωμα. Επίσης, οι πολυαμίνες είναι βιογενή μόρια με ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες (Κarigiannis et al., 2000), που απαντώνται τόσο στους προκαρυωτικούς, όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. O πολυκατιοντικός τους χαρακτήρας και [60]

η παρουσία ενεργών διαμεμβρανικών μεταφορέων, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα, έχει καταστήσει τη σύζευξη των πολυαμινών με διάφορα φάρμακα (polyamine-drug conjugates) ελκυστική λύση για τη μεταφορά φαρμάκων στο κύτταρο. Με βάση λοιπόν τα παραπάνω δεδομένα συνθέσαμε μία σειρά πολυαμινικών παραγώγων της CAM, ώστε να εισέρχονται πιο εύκολα στα κύτταρα. Συνοπτικά, οι στόχοι της παρούσας εργασίας είναι: α) η επανεξέταση της πολύπλοκης συμπεριφοράς της χλωραμφαινικόλης χρησιμοποιώντας την τεχνική της χρονο-διαβαθμισμένης αποτύπωσης β) και η σύνθεση και εκτίμηση της αντιβακτηριακής δράσης μιας σειράς πολυαμινικών και μιας σειράς διμερών παραγώγων της χλωραμφαινικόλης με αναμενόμενη ισχυρότερη συγγένεια προς το ριβόσωμα και βελτιωμένη ικανότητα εισόδου στα βακτηριακά και καρκινικά κύτταρα, συγκριτικά με τη μητρική ένωση. [61]

6. ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η χλωραμφαινικόλη έχει μεγάλη σημασία τόσο σε κλινικό θεραπευτικό επίπεδο στην αντιμετώπιση βακτηριακών λοιμώξεων, όσο και σε επίπεδο βασικής έρευνας στην μελέτη της σχέσης δομής λειτουργίας του ενεργού καταλυτικού κέντρο της πεπτίδυλοτρανσφεράσης. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση του ριβοσώματος ήταν καθοριστική στην ταυτοποίηση της θέσης πρόσδεσης της CAM. Ανάλυση κρυστάλλων ριβοσωμάτων από το αρχαιοβακτήριο H. marismortui έδειξε ότι η CAM προσδένεται στην αρχή του καναλιού εξόδου της νεοσυντιθέμενης πρωτεϊνικής αλυσίδας (Hansen et al., 2003). Παρόμοια θέση πρόσδεσης της CAM ταυτοποιήθηκε βιοχημικά και στο βακτηριακό ριβόσωμα (Long and Porse, 2003). Αντίθετα, κρυσταλλογραφικές μελέτες στην E. coli αποκάλυψαν, ότι το αντιβιοτικό δεσμεύεται στο καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος (Dunkle et al., 2010). Με βάση τις δύο θέσεις δέσμευσης της CAM που παρουσιάζουν τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα πραγματοποιήθηκε σύνθεση διμερών παραγώγων της CAM, ώστε να βελτιωθεί η πρόσδεσή της στο ριβόσωμα. Επίσης, οι πολυαμίνες είναι βιογενή μόρια με ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες (Κarigiannis et al., 2000), που απαντώνται τόσο στους προκαρυωτικούς, όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. O πολυκατιοντικός τους χαρακτήρας και η παρουσία ενεργών διαμεμβρανικών μεταφορέων, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα, έχει καταστήσει τη σύζευξη των πολυαμινών με διάφορα φάρμακα (polyamine-drug conjugates) ελκυστική λύση για τη μεταφορά φαρμάκων στο κύτταρο. Με βάση λοιπόν τα παραπάνω δεδομένα συνθέσαμε μία σειρά πολυαμινικών παραγώγων της CAM, ώστε να εισέρχονται πιο εύκολα στα κύτταρα. Συνοπτικά, οι στόχοι της παρούσας εργασίας είναι: α) η επανεξέταση της πολύπλοκης συμπεριφοράς της χλωραμφαινικόλης χρησιμοποιώντας την τεχνική της χρονο-διαβαθμισμένης αποτύπωσης β) και η σύνθεση και εκτίμηση της αντιβακτηριακής δράσης μιας σειράς πολυαμινικών και μιας σειράς διμερών παραγώγων της χλωραμφαινικόλης με αναμενόμενη ισχυρότερη συγγένεια προς το ριβόσωμα και βελτιωμένη ικανότητα εισόδου στα βακτηριακά και καρκινικά κύτταρα, συγκριτικά με τη μητρική ένωση. [62]

[63]

7. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 7.1.Α.ΥΛΙΚΑ-ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Χημικές ουσίες, οργανικά και βιοχημικά αντιδραστήρια Aluminium oxide (Al 2 O 3 ), από Sigma- Aldrich Ammonium chloride (NH 4 Cl), από Merck Ammonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4, από Merck ATP, από Sigma- Aldrich Bacto-tryptone, από Serva Bacto-peptone, από Serva Boric acid, από Merck Bovine Serum Albumin (BSA), από Sigma- Aldrich β- Μercaptoethanol (β-etsh), από Sigma- Aldrich Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), από Invitrogen Chloroform (CCl 3 ), από Sigma- Aldrich CMCT, από Fluca Biochemichals Deoxynucleotides (dntps), από HT Biotechnology 1,4-bis(5-phenyloxazol-2-yl) benzene, από Merck Dideoxynucleotides (ddntps), από Jena Bioscience Dimethyl Sulfate, από Sigma- Aldrich Dimethyl Sulfoxide, από Serva 2,5-Diphenyloxazole, από Merck Dioxane, από Merck Dulbecco s Modified Eagle Medium-DΜΕΜ, από Sigma- Aldrich Ethylendiamino-tetraacet acid (EDTA), από Sigma- Aldrich Ethanol absolute, από Merck Εthylene glycol, από Sigma-Aldrich Fetal Bovine Serum (FBS), από Sigma-Aldrich D-Glucose, από Merck Glycerol, από Serva GTP, από Sigma- Aldrich Hydrochloride 37% (HCl), από Merck Isocistric phenol, από Sigma- Aldrich [64]

Isopropanol, από Merck Kethoxal, από MP Biomedicals Lysogeny broth (LB), από Applichem Magnesium acetate [(CH 3 COO) 2 Mg] από Merck Magnesium chloride (MgCl 2 ), από Merck Methanol, από Merck Naphthalene, από Merck Optifluor, από PerkinElmer Peptone from meat, από Serva Phenylalanine, από Sigma- Aldrich Propidium iodide (PI), από Fluka Potassium acetate (CH 3 COOK), από Merck Potassium dihydrogen phosphate (ΚΗ 2 PO 4 ), από Merck di- Potassium hydrogen phosphate (Κ 2 ΗPO 4 ), από Merck Potassium hydroxide (KOH), από Merck RPMI-1640, από Sigma- Aldrich Safefluor, από Lumac-LSc Sodium acetate (CH 3 COONa), από Ferak Sodium Chloride (NaCl), από Merck Sodium hydroxide (NaOH), από Merck Τrichloroacetic acid, από Merck Tris-acetate (Tris-AcOH), από Merck Tris-Base, από Merck Trypsin 10x, από BioSera Urea, από Sigma- Aldrich Yeast extract, από Serva Φίλτρα κυτταρίνης 3ΜΜ, από Whatman, UK Φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης τύπου ΗΑ, διαμέτρου 24 nm, μέγεθος πόρου 0,45 μm, από Millipore, USA [65]

mrnas, trnas poly-uridic acid [poly(u)], από Sigma- Aldrich trna Phe (E.coli), από Sigma- Aldrich trna crude (E.coli), από Sigma-Aldrich Ραδιενεργές ουσίες [α- 32 P]ATP, από Izotop, ειδικής ραδιενέργειας 111 Tbq/mmol, 3000 Ci/mmol L-[2,3,4,5,6-H 3 ]Phenylalanine, ειδικής ραδιενέργειας 4,70 Tbq/mmol, 118 Ci/mmol, από Αmershan Biosciences Inc. Αντιβιοτικά Puromycin, από Sigma - Aldrich Chloramphenicol, από Sigma - Aldrich Ένζυμα AMV reverse transcriptase, από Roche DNase I, από Sigma-Aldrich Εκκινητές K 10.5 : ATCCTACACATCAAGGC K 3 : CAACCCGAACACCAGTG K 4 : CGCGTACCACTTTAAATG Βακτηριακά στελέχη E.coli K12 wild type E.coli CAN/20-12EpBR32 Staphylococcus aureus wild type [66]

Κυτταρικές σειρές HS-Sultan (Β-λευχαιμική σειρά) Jurkat (Τ-λευχαιμική σειρά) U937 (μονοκυτταρική σειρά) Zl-34 (κύτταρα από καρκίνο μεσοθηλιώματος) MeT-5A (επιθηλιακά μετασχηματισμένα κύτταρα) [67]

Διαλύματα Ηλεκτροφόρησης και Χρώσης Διαλύματα Συστατικά Ποσότητες Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6% (sequencing gel) TBE 10x Urea 50% Acrylamide 19:1 mq-h 2 O 20% APS TEMED 50% Διάλυμα ακρυλαμιδίου 19:1 Acrylamide Bis-acrylamide RNA ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (RNA loading buffer) TBE (10x) Bradford (5x) Formamide 1% Xylen Cyanol 1% Bromophenol blue Tris-Base Boric acid EDTA mq-h 2 O Brilliant Blue-G EtOH abs H 3 PO 4 mq-h 2 O 5ml 25g 6 ml 14 ml 120 μl 12 μl 190g 10g μέχρι 400 ml 900 μl 50 μl 50 μl 108g 55g 9,3g μέχρι 1lt 0,1g 52,5 ml 100 ml 47,5 ml Διαλύματα για λειτουργικές μελέτες και παρασκευές Διαλύματα Συστατικά C τελικές (mm) Ρυθμιστικό διάλυμα A 1Μ Tris-HCl ph 7,2 (CH 3 COO) 2 Mg KCl β-etsh Ρυθμιστικό διάλυμα B 1Μ Tris-HCl ph 7,2 (CH 3 COO) 2 Mg 1 M NH 4 Cl ph 7,2 Ρυθμιστικό διάλυμα Έκπλυσης Bray s β-etsh 1 M Tris-HCl ph 7,2 1 M NH 4 Cl ph 7,2 β-etsh MgCl 2 PPO POPOP Naphthalene Ethylenoglycol Methanol Dioxane 10 mm 10 mm 60 mm 6 mm 10 mm 10 mm 500 mm 6 mm 100 mm 100 mm 6 mm 6 mm 8 g 0.4 g 120 g 40 ml 200 ml 1760 ml [68]

Διαλύματα για μικροβιολογικές και μοριακές μεθόδους: Διαλύματα Συστατικά C τελικές (mm) Διάλυμα υβριδοποίησης (4.5 x) Hepes-KOH ph 7,4 KCl Ρυθμιστικό διάλυμα προέκτασης Tris-AcOH ph 8,3 (Extension buffer) DTT MgCl 2 225 mm 450 mm 637,5 mm 127,5 mm dntps Chase Mix Διάλυμα κατακρύμνισης Διάλυμα διακοπής της αντίδρασης CMCT (CMCT stop) Διάλυμα διακοπής της αντίδρασης DMS (DMS stop) Διάλυμα διακοπής της αντίδρασης KE (KE stop) datp dttp dctp dgtp datp dttp dctp dgtp mqh 2 O EDTA CH 3 COONa CH 3 COONa ph=5,5 Tris-AcOH ph 7,5 β-etsh CH 3 COONa EDTA CH 3 COONa ph=5,5 127,5 mm 0,741 mm 2,856 mm 2,856 mm 2,856 mm 1 mm 1 mm 1 mm 1 mm 1 mm 300 mm 0,3 M 1M 1M 1,5 M 0,1 mm 0,3 M Διαλύματα τροποποιητών Τροποποιητές DMS CMCT KE Αραιώσεις 1:5 σε EtOH 63 mg/ml σε διάλυμα ριβοσωμάτων 35 mg/ml αραιωμένη σε 20% Et-OH Διαλύματα αντιβιοτικών Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη διαλυτοποιήθηκαν ως εξής: η πουρομυκίνη σε Η 2 Ο (ph=7, με ΚΟΗ) και η χλωραμφαινικόλη και τα παράγωγά της σε DMSO. [69]

7.1.Β. Σύνθεση πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της χλωραμφαινικόλης Τα ανάλογα που αξιολογήθηκαν ως προς την βιολογική τους δράση, συντέθηκαν στο εργαστήριο του καθηγητή κ. Δ. Παπαϊωάννου και διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει πολυαμινικά παράγωγα της βάσης της χλωραμφαινικόλης (CAM), ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει διμερή παράγωγα αυτής. Πιο αναλυτικά, στην πρώτη κατηγορία, η βάση της CAM αντιδρά με κατάλληλους ανυδρίτες (σουκινικό ή φθαλικό) που παίζουν το ρόλο του συνδέτη και τα σχηματιζόμενα καρβοξυλικά οξέα αντιδρούν ακολούθως σε αντιδράσεις μιας φιάλης, με κατάλληλα προστατευμένες πολυαμίνες. Έτσι προκύπτουν τα πλήρως προστατευμένα πολυαμινικά συζεύγματα της CAM. Τα τελικά προϊόντα παραλαμβάνονται μετά από αντιδράσεις αποπροστασίας, με τη μορφή τριφθοροοξικών αλάτων. Όσον αφορά στη δεύτερη κατηγορία, αυτή περιλαμβάνει τη σύνθεση διμερών παραγώγων της CAM, με τη χρήση κατάλληλων συνδετών (linkers). Οι συνδέτες αυτοί είναι κυμαινόμενου μήκους ανθρακικής αλυσίδας ή εμφανίζουν διαμορφωτικό περιορισμό, επαγόμενο από την παρουσία διπλών δεσμών ή/και βενζολικού δακτυλίου. Η σύνθεση τους επιτεύχθηκε με απευθείας σύζευξη της βάσης της CAM με δικαρβοξυλικά οξέα παρουσία αντιδραστηρίων σύζευξης και καθαρισμό των προϊόντων με χρωματογραφία στήλης ταχείας ανάπτυξης (flash chromatography). Όλα τα ανάλογα έχουν πλήρως ταυτοποιηθεί με χρήση φασματοσκοπικών μεθόδων ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, ESI-MS, IR) και η καθαρότητά τους έχει ελεγχθεί με RP-HPLC. [70]

Β. ΜΕΘΟΔΟΙ-ΤΕΧΝΙΚΕΣ 8.1 Βιοχημική παρασκευή ριβοσωμάτων 8.1.1 Καλλιέργειες άγριου τύπου κ μεταλλαγμένων κυττάρων E. coli Χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα του άγριου στελέχους Κ12 του εντεροβακτηρίου E.coli που έχουν την ιδιότητα να εκφράζουν RNA-νουκλεάσες σε μικρό ποσοστό, έτσι ώστε η απομόνωση των ριβοσωμάτων να γίνει υπό ασφαλέστερες συνθήκες. Από stock κυττάρων εμβολιάστηκε προκαλλιέργεια σε αποστειρωμένο θρεπτικό LB (περιείχε ανά 1lt τα ακόλουθα συστατικά: 10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl) και τέθηκε υπό ανάδευση σε ανακινούμενη τράπεζα (orbital incubator, 120 στροφές/min) στους 37 ο C για 16 h για την ενεργοποίηση των κυττάρων. Την επόμενη μέρα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κωνικές φιάλες 2L σε περιστροφικά ανακινούμενο επωαστή (orbital incubator, 120 στροφές/min) στους 37 ο C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στο μέσο της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξής τους (Α560 nm = 0,5-0,6), μετά από φυγοκέντρηση σε ειδική ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall RC-5B, GSA κεφαλή) στις 10000 rpm, για 15 min στους 4 o C (Dohme et al., 1976; Kalpaxis et al., 1995). Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό διάλυμα 0,9 M KCl (ώστε να παραμένει σταθερή η ωσμωτική τους πίεση) και ξαναφυγοκεντρήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 20 ο C μέχρι τη στιγμή της χρησιμοποίησής τους. 8.1.2 Παρασκευή κλάσματος S-30 Το κύτταρα που φυλάσσονταν στους -20 ο C, αποψύχθηκαν στους 4 ο C και τοποθετήθηκαν εντός ιγδίου πορσελάνης και αναμείχθηκαν με διπλάσια ποσότητα αλουμίνας και ρυθμιστικό διάλυμα A, σε αναλογία 3 ml ρυθμιστικού/gr κυττάρων, μέχρι σχηματισμού ενιαίας πάστας. Ακολούθησε θραύση των κυττάρων της πάστας για 10 min και το ομογενές αιώρημα που προέκυψε φυγοκεντρήθηκε σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall RC-5B σε κεφαλή SS34 στις 15000 rpm (30000g), για 20 min ώστε να απομακρυνθούν η αλουμίνα, τα μεμβρανικά κατάλοιπα και τα άθραυστα κύτταρα. Το υπερκείμενο επαναφυγοκεντρήθηκε για 20 min στις ίδιες συνθήκες φυγοκέντρησης. Στο νέο υπερκείμενο προστέθηκε δεοξυριβονουκλεάση Ι (DNase I) [71]

σε τελική συγκέντρωση 3 μg/ml και το διάλυμα επωάστηκε στους 4 ο C για 5 min, ενώ αναδευόταν κατά διαστήματα. Το προϊόν της πέψης υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34), σε 15000 rpm, για 40 min, 4 ο C, ώστε να απαλλαχθεί από τα κυτταρικά υπολείμματα με το υπερκείμενο να αποτελεί το κλάσμα S-30. Το κλάσμα αυτό χρησιμοποιήθηκε στα επόμενα στάδια για την παρασκευή του κλάσματος S-100, του κλάσματος FWR που περιείχε τους παράγοντες μετάφρασης, και των πλυμένων ριβοσωμάτων. 8.1.3 Παρασκευή κλάσματος S-100 Το κλάσμα S-100 περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες και άλλους απαραίτητους για την πρωτεϊνοσύνθεση παράγοντες, όπως μεταφραστικούς παράγοντες, συνθετάσες των αα-trna και trnas. Το κλάσμα S-30 φυγοκεντρήθηκε σε ψυχόμενη υπερφυγόκεντρο Beckman, σε κεφαλή Ti 75, στις 40000 rpm (100000g), στους 4 ο C για 4 h. Για την αποφυγή προσμίξεων ριβοσωματικής φύσης χρησιμοποιήθηκαν μόνο τα 2/3 του υπερκειμένου, ενώ το 1/3 αυτού που απέμεινε απομακρύνθηκε με προσοχή. Το ίζημα φυλάχθηκε για την παρασκευή των ριβοσωμάτων. Στα 2/3 του υπερκειμένου προστέθηκε θειϊκό αμμώνιο (52,7 gr στερεό θειϊκό αμμώνιο/100ml υπερκειμένου), υπό συνεχή ανάδευση σε πάγο. Μετά την προσθήκη μικρής ποσότητας 1 Ν NaOH (ρύθμιση του pη στο 7,2), ακολούθησε φυγοκέντρηση στη Sorvall, σε κεφαλή SS34 και σε 15000 rpm, για 30 min. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης απομακρύνθηκε, ενώ το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε ¼ του αρχικού υπερκειμένου με ρυθμιστικό διάλυμα A. Το δείγμα μεταφέρθηκε σε μεμβράνες διαπίδυσης και υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος A, για την απαλλαγή μορίων μικρού μοριακού βάρους (< 3000 kda), για μία νύχτα (o/n) στους 4 ο C με ανανέωση του διαλύματος διαπίδυσης 4 φορές (για αποδοτικότερη διαπίδυση). Έπειτα, το δείγμα φυγοκεντρήθηκε (Sorvall, στην κεφαλή SS34, σε 15000 rpm, για 15 min) και το υπερκείμενο (κλάσμα S-100) χωρίστηκε σε κλάσματα των 0,5-1 ml. Ακολούθησε ανάλυση πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford. Τα κλάσματα ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους 80 ο C. [72]

8.1.4 Παρασκευή κλάσματος FWR Το κλάσμα FWR περιέχει τους παράγοντες που είναι απαραίτητοι για την πρωτεϊνική σύνθεση (IFs, EFs και RRFs). Στο ίζημα της πρώτης υπερφυγοκέντρησης προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα B και επωάστηκε για μία νύχτα (o/n) στους 4 o C. Την επόμενη μέρα πραγματοποιήθηκε αναδιάλυση του ιζήματος για 10 min και ακολούθησε φυγοκέντρηση σε υπερφυγόκεντρο Beckman (κεφαλή Ti 75), στις 40000 rpm (100000 g), στους 4 ο C για 6 h. Στη συνέχεια, το ίζημα αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα B και φυλάχθηκε για την παρασκευή ριβοσωμάτων, ενώ το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του κλάσματος FWR. Στο υπερκείμενο προστέθηκε θειϊκό αμμώνιο (52,7gr στερεό θειϊκό αμμώνιο/100 ml αυτού), υπό συνεχή ανάδευση σε πάγο. Πραγματοποιήθηκε ρύθμιση του ph στο 7,2 και ακολούθησε φυγοκέντρηση στη Sorvall, σε κεφαλή SS34 και 15000 rpm, για 30 min. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης απομακρύνθηκε, ενώ το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 1/4 του αρχικού υπερκειμένου με ρυθμιστικό διάλυμα A. Έπειτα, το δείγμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος A για μία νύχτα (o/n) στους 4 ο C. Την επόμενη μέρα ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall, κεφαλή SS34) στις 15000 rpm (30000 g), για 5 min. Στο υπερκείμενο (κλάσμα FWR) προστέθηκε γλυκερόλη (5% τελική συγκέντρωση) και χωρίστηκε σε κλάσματα των 0,05-0,2 ml που διατηρήθηκαν στους 80 ο C. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο κλάσμα προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford. 8.1.5 Παρασκευή πλυμένων ριβοσωμάτων Το ίζημα που προκύπτει από την ανωτέρω υπερφυγοκέντρηση αναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα B για 10 min και φυγοκεντρήθηκε σε υπερφυγόκεντρο Beckman (κεφαλή Ti 75), στις 40000 rpm (100000 g), στους 4 ο C για 6 h. Στη συνέχεια, απορρίφθηκε το υπερκείμενο, στο ίζημα προστέθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα A και επωάστηκε στους 4 ο C, όλο το βράδυ (o/n). Την επόμενη μέρα έγινε αναδιάλυση του ιζήματος για 10 min και το δείγμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος A για 4 ώρες, στους 4 ο C. Μετά από ήπια φυγοκέντρηση στη Sorvall (κεφαλή SS34, στις 2000 rpm, για 10 min), ακολούθησε συλλογή του υπερκειμένου σε μικρά κλάσματα και φωτομέτρησή του στα 260 nm και 280 nm. Τα κλάσματα όγκου 0,1-0,2 ml ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκαν στους -80 ο C. [73]

8.1.6 Συνοπτική διαδικασία Καλλιέργειες κυττάρων E. coli Συλλογή κυττάρων με φυγοκέντρηση (Sorvall RC-5B, GSA κεφαλή στις 10000 rpm) για 15 min στους 4 o C Θραύση κυττάρων σε ιγδίο με προσθήκη διπλάσιας ποσότητας αλουμίνας και Buffer A για 10 min Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 20 min, 4 o C) Ίζημα Υπερκείμενο (απομάκρυνση) Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 20 min) Ίζημα Υπερκείμενο (απομάκρυνση) Προσθήκη DNase I (3 μg/ml) και επώαση στους 4 ο C για 5 min Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 40 min, 4 ο C) Ίζημα (απομάκρυνση) Υπερκείμενο Κλάσμα S-30 [74]

Κλάσμα S-30 Χρησιμοποιείται για παραγωγή ριβοσωμάτων και FWR Υπερφυγοκέντρηση (Beckman, κεφαλή Ti 75, 40000 rpm, 4 h, 4 ο C) Ίζημα Υπερκείμενο Προσθήκη ~1ml Buffer B Το κατώτερο 1/3 Τα ανώτερα 2/3 * Επώαση overnight στους 4 ο C απομακρύνεται Προσθήκη 52,7gr (NH 4 ) 2 SO 4 /100 ml υπερκειμένου και ρύθμιση σε ph=7,2 με προσθήκη NaOH. Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 30min) Υπερκείμενο (απομάκρυνση) Ίζημα Προσθήκη ρυθμιστικού διαλ. A, όγκου ίσου με το ¼ του αρχικού υπερκειμένου Διαπίδυση σε 4l Buffer A 4 ο C, overnight Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 10000 rpm, 30 min) Ίζημα (απομάκρυνση) Υπερκείμενο Κλάσμα S-100 [75]

*Μετά την επώαση overnight στους 4 ο C ανάδευση για 10 min Χρησιμοποιείται για παραγωγή ριβοσωμάτων Υπερφυγοκέντρηση (Beckman, κεφαλή Ti 75, 40000 rpm, 6 h, 4 ο C) Ίζημα Υπερκείμενο Χρησιμοποιείται για παραγωγή FWR Προσθήκη ~1ml Buffer B Επώαση overnight στους 4 ο C ** Προσθήκη 52,7gr (NH 4 ) 2 SO 4 /100 ml υπερκειμένου και ρύθμιση σε ph=7,2 με προσθήκη NaOH. Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 30min) Υπερκείμενο (απομάκρυνση) Ίζημα Προσθήκη Buffer A όγκου ίσου με το ¼ του αρχικού υπερκειμένου Διαπίδυση σε 4l Buffer A 4 ο C overnight Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 10000 rpm, 5 min) Υπερκείμενο (απομάκρυνση) Ίζημα Κλάσμα FWR [76]

Επώαση overnight στους 4 ο C ** και ανάδευση για 10 min Χρησιμοποιείται για παραγωγή ριβοσωμάτων Υπερφυγοκέντρηση (Beckman, κεφαλή Ti 75, 40000 rpm, 6 h, 4 ο C) Ίζημα Υπερκείμενο Προσθήκη ~1ml Buffer Α (απομάκρυνση) Επώαση overnight στους 4 ο C Ανάδευση για 10 min Διαπίδυση σε 4l Buffer A Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 2000 rpm, 5 min) Ίζημα (απομάκρυνση) Υπερκείμενο Πλυμένα ριβοσώματα [77]

8.2 Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών (Μέθοδος Bradford) Η μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση των πρωτεϊνών με τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250, που προκαλεί μετατόπιση της μέγιστης απορρόφησης της χρωστικής από τα 465 στα 595 nm (Bradford). Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης ενός άγνωστου δείγματος υπολογίζεται βάσει μιας πρότυπης καμπύλης, η οποία προκύπτει από την απορρόφηση στα 595 nm μιας σειράς δειγμάτων που περιέχουν γνωστές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης, προστίθενται 100 μl αυξανόμενων συγκεντρώσεων αλβουμίνης (BSA) σε 3 ml αντιδραστηρίου Bradford (περιέχει τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250). Κατά τον ίδιο τρόπο παρασκευάζεται και το δείγμα που περιέχει την άγνωστη συγκέντρωση πρωτεΐνης, ενώ ως τυφλό χρησιμοποιείται ένα μείγμα που περιέχει 3 ml αντιδραστηρίου Bradford και 100 μl H 2 O. 8.3 Απομόνωση trna εμπλουτισμένου σε trna Phe Χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα του στελέχους E. coli CAN/20-12EpBR32 που υπερεκφράζει το trna Phe και είναι απαλλαγμένο από νουκλεάσες (RNase I -, RNase II -, RNase D -, RNase BN -, RNase T - ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε LB θρεπτικό μέσο υλικό σε περιστροφικά ανακινούμενο επωαστή (orbital incubator, 120 στροφές/min) στους 37 o C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, όταν η οπτική απορρόφηση στα 600 nm έφτασε την τιμή 0,6 (Α 600 =0,6). Η συλλογή των κυττάρων έγινε με φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall RC-5B, κεφαλή GSA) στις 10000 rpm, για 15 min, στους 4 o C. Με τον τρόπο αυτό συλλέχθηκαν περίπου 3 g κυττάρων ανά λίτρο καλλιέργειας. Τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε 5 ml διαλύματος λύσης Β/gr κυττάρων και ομογενοποιήθηκαν σε συσκευή υπερήχων. Το κυτταρικό διάλυμα που παραλήφθηκε εκχυλίστηκε με προσθήκη ίσου όγκου φαινόλης κορεσμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών ph=7. Ακολούθησε ισχυρή ανάδευση για 20 min στους 25 o C και φυγοκέντρηση σε θερμοκρασία δωματίου (Sorvall, κεφαλή SS34, στις 8500 rpm) για 20 min. Η υδατική φάση εκχυλίστηκε με προσθήκη ίσου όγκου χλωροφορμίου, ανακινήθηκε ισχυρά για 5 min σε 25 o C και φυγοκεντρήθηκε για 10 min στις 5000 rpm. Η υδατική φάση υποβλήθηκε σε κατακρήμνιση με προσθήκη 2,5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία 1/10 του όγκου 3Μ CH 3 COOΚ ph=5,2 για 30 min στους -70 o C. Το ίζημα παραλήφθηκε με φυγοκέντρηση στις 13000 rpm, 30 min, [78]

4 o C, εκπλύθηκε με 70% αιθανόλη και ξαναφυγοκεντρήθηκε στις 13000 rpm, 30 min, 4 o C. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης απορρίφθηκε, ενώ το ίζημα αναδιαλύθηκε σε 0,2 Μ Tris-AcOH ph=9 και επωάστηκε στους 37 o C για 30 min για την αποακυλίωση των trnas. Αφού προστέθηκαν 1/10 του όγκου 3 Μ CH 3 COOΚ, ph=5,2 και 2,5 όγκοι 100% αιθανόλη, το διάλυμα αφέθηκε στους -70 o C για 1 h. Έπειτα φυγοκεντρήθηκε (8500 rpm, 15 min, 4 o C), και το παραληφθέν ίζημα αναδιαλύθηκε σε 1 Μ NaCl και επωάστηκε o/n στους 4 o C. Την επόμενη μέρα έγινε φυγοκέντρηση (12000 rpm, 10 min, 4 o C) για απομάκρυνση των νουκλεϊκών οξέων μεγάλου μοριακού βάρους. Συλλέχθηκε το υπερκειμένο και προστέθηκαν 1/10 του όγκου 3 Μ CH 3 COOΚ, ph=5,2 και 2,5 όγκοι 100% αιθανόλης. Το διάλυμα επωάστηκε στους -70 o C για 1 h και πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση (10000 rpm, 15 min, 4 o C). Τέλος, το ίζημα ξεπλύθηκε με 70% αιθανόλη και αναδιαλύθηκε σε mq H 2 O. 8.4 Λειτουργικές μελέτες- In vitro σχηματισμοί πεπτιδικού δεσμού 8.4.1 Παρασκευή Ac[ 3 H]Phe-tRNA Το Ac[ 3 H]Phe-tRNA αποτέλεσε το υπόστρωμα της P θέσης του ριβοσώματος στα in vitro πειράματα. Παρασκευάσθηκε προσθέτοντας στο CCA άκρο του trna Phe το αμινοξύ φαινυλαλανίνη (Phe), το οποίο στη συνέχεια ακετυλιώθηκε. Η ακετυλίωση αυτή είχε ως στόχο την παρασκευή ενός αα-trna που προσομοιάζει το εναρκτήριο fmet-trna Met. Η παρασκευή του Ac[ 3 H]Phe-tRNA πραγματοποιείται σε δύο στάδια: Α)in vitro παρασκευή [ 3 H]-Phe-tRNA, Β)ακετυλίωση του [ 3 H]Phe-tRNA Α) In vitro παρασκευή [ 3 H]-Phe-tRNA. Σε εσμυρισμένο δοκιμαστικό σωλήνα προστέθηκαν σε τελικό όγκο 5 ml, τα ακόλουθα συστατικά: Tris/HCl, ph=7,2 (100 mm), (CH 3 COO) 2 Mg (10 mm), KCl (10 mm), β -EtSH (6 mm), trna (από E.coli) 156 A 260nm /ml και trna Phe (E.coli) 4 A 260nm /ml. Ακολούθησε ενεργοποίηση του trna με επώαση για 20 min στους 37 ο C και στη συνέχεια προστέθηκαν ακόμα στο διάλυμα: ATP (4 mm), GTP (0,1 mm), [ 3 H]-Phe (5 nmole/ 5 ml), L-Phe (ψυχρή) (17 nmole/ 5 ml), κλάσμα S-100 (8,6 mg/ml). Η ποσότητα του κλάσματος S100 και ο [79]

χρόνος επώασης σε κάθε παρασκευή καθορίστηκαν από πιλοτικά πειράματα σύνθεσης [ 3 H]-Phe-tRNA μικρής κλίμακας (50μl). Ανάλογα με την ενεργότητα του εκάστοτε παρασκευάσματος S-100, χρησιμοποιήθηκε ποσότητα γύρω στα 5-10 μl και το μίγμα επωάσθηκε στους 37 ο C για 30-45 min. Ο έλεγχος της ενεργότητας των συνθετασών πραγματοποιήθηκε με λήψη μικρής ποσότητας (συνήθως 10 μl) από το δοκιμαστικό μίγμα (50 μl) και τοποθέτηση αυτής σε φίλτρο κυτταρίνης Whatman 3MM. Το φίλτρο, αφού ξηράνθηκε, υποβλήθηκε τρεις φορές σε πλύση με ψυχρό διάλυμα 5% ΤCA και μια φορά με ψυχρή 95% αιθανόλη. Ο υπολογισμός της προσδεδεμένης στο φίλτρο ραδιενέργειας έγινε μετά από εμβάπτιση του φίλτρου σε σπινθηριστικό υγρό τολουολίου και μέτρηση σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Όταν η διαδικασία ήταν επιτυχής, ακολουθούσε η παρασκευή [ 3 Η]Phe-tRNA σε μεγάλη κλίμακα (5 ml). Το προϊόν ([ 3 Η]Phe-tRNA) καθαρίστηκε με εκχύλιση του μείγματος επώασης με ίσο όγκο φαινόλης 90% και ισχυρή ανάδευση για 3 min σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την ανάδευση το μείγμα φυγοκεντρήθηκε (Sorvall, σε κεφαλή SS34, στις 3000 rpm) για 10 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Η υδατική φάση συλλέχθηκε, ενώ στην φαινολική φάση προστέθηκαν 2 ml H 2 O. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν δύο ακόμα εκχυλίσεις στις ίδιες συνθήκες, ώστε να ανακτηθεί η μέγιστη ποσότητα προϊόντος και συλλέχθησαν οι υδατικές φάσεις από την καθεμία. Για να απομονωθεί το [ 3 H]Phe-tRNA, το σύνολο των τριών υδατικών φάσεων κατακρημνίστηκε με προσθήκη 2,5 όγκων απόλυτης Et-OH παρουσία 1/10 του όγκου 20% οξικού καλίου ph=6,58, στους -20 ο C, o/n. Μετά από φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 10 min, 4 ο C), το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα πλύθηκε με 70% Et-OH και ξαναφυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες. Το ίζημα αναδιαλύθηκε σε αποστειρωμένο, απιονισμένο H 2 O και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε H 2 O για 4h στους 4 ο C (με δύο αλλαγές του H 2 O) για περαιτέρω απαλλαγή του τελικού προϊόντος κυρίως από υπολείμματα φαινόλης και άλατα. Μετά το τέλος της διαπίδυσης, το τελικό διάλυμα φωτομετρήθηκε στα 260 nm και έγινε μέτρηση της ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Β) Ακετυλίωση του [ 3 H]Phe-tRNA. Στο [ 3 H]Phe-tRNA προστέθηκε ίση ποσότητα κορεσμένου διαλύματος CH 3 COOK, ph=5 και 1,16 ml ψυχρού οξικού ανυδρίτη/8,1 ml διαλύματος [ 3 H]Phe-tRNA, σε πέντε ισόποσες δόσεις ανά 15 min, υπό συνεχή ανάδευση στους 0 ο C. Έπειτα, προστέθηκαν 1/10 του όγκου του δείγματος 20% [80]

CH 3 COOK στους 4 ο C και 2,5 όγκοι ψυχρής αιθανόλης 95%. Το διάλυμα παρέμεινε στους -20 ο C όλο το βράδυ, για να κατακρημνιστεί το Ac[ 3 Η]-Phe-tRNA. Το δείγμα φυγοκεντρήθηκε (Sorvall, κεφαλή SS34, 15000 rpm, 10 min, 4 ο C). Το ίζημα αναδιαλύθηκε με mq Η 2 Ο και υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε Η 2 Ο (4 lt, 4 h, 4 o C, με δυο αλλαγές). Ακολούθησε φωτομέτρηση στα 260 nm (200-300 Α 260 /ml), και υπολογισμός της ειδικής ραδιενέργειας (250000-300000 dpm/α 260 ). Το δείγμα χωρίσθηκε σε κλάσματα των 0,5 ml και διατηρήθηκε στους 20 o C. H απόδοση ανάκτησης του trna σε προϊόν (Ac[ 3 H]Phe-tRNA) ήταν 80-85%. 8.4.2 Σχηματισμός του εναρκτήριου τριμερούς συμπλόκου (Complex C) Με τον όρο εναρκτήριο τριμερές σύμπλοκο C καλούμε το σύμπλοκο που δημιουργείται από το Ac-[ 3 H]Phe-tRNA, το poly(u) και το 70S ριβόσωμα, με το Ac[ 3 H]Phe-tRNA προσδεδεμένο στην Ρ-θέση του ριβοσώματος. Το σύμπλοκο C σχηματίστηκε με την παρακάτω διαδικασία (Drainas and Kalpaxis, 1994) : Τα ριβοσώματα που χρησιμοποιήθηκαν προεπωάστηκαν για 10 min στους 37 o C για να ενεργοποιηθούν. Στη συνέχεια ετοιμάσθηκε το παρακάτω διάλυμα: Tris-HCl ph 7,2 (100 mm) NH 4 Cl ph 7,2 (100 mm) β-etsh (6 mm) (CH 3 COO) 2 Mg (10 mm) GTP (0,4 mm) Ριβοσώματα (32,3 OD/ml) FWR (400 μg/ml) poly U (0,37 mg/ml) Ac[ 3 Η]-Phe-tRNA (13,3 OD/ml) Η 2 Ο Το παραπάνω διάλυμα, επωάσθηκε στους 25 ο C για 15 min και η αντίδραση διακόπηκε με τη μεταφορά του μείγματος σε πάγο. Για να ελεγχθεί το ποσοστό του συμπλόκου που είχε σχηματιστεί, πραγματοποιήθηκε διήθηση μικρής ποσότητας του μείγματος (25 μl) μέσω φίλτρου νιτρικής κυτταρίνης. Το φίλτρο πλύθηκε δύο φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος έκπλυσης κάθε φορά, ώστε το σύμπλοκο C που [81]

προσροφήθηκε στη μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης να διαχωρισθεί από την περίσσεια του Ac[ 3 H]Phe-tRNA, η οποία δεν συγκρατείται στη μεμβράνη. Η μέτρηση της δέσμευσης του AcPhe-tRNA στο ριβόσωμα (binding) έγινε μέσω διαλυτοποίησης του φίλτρου της νιτρικής κυτταρίνης σε 14 ml σπινθηριστικού υγρού Bray s και υπολογισμού της ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Για την αντίδραση πουρομυκίνης ακολουθήθηκε η ίδια πορεία, διηθώντας όμως 120 μl κάθε φορά και τα φίλτρα κόπηκαν στη μέση πριν χρησιμοποιηθούν. 8.4.3 Αντίδραση πουρομυκίνης Για τον προσδιορισμό των καταλυτικών παραμέτρων σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού από την PTase χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση πουρομυκίνης. Στην αντίδραση πουρομυκίνης, το AcPhe-tRNA κατέχει το ρόλο του πεπτυδυλο-trna, ενώ η πουρομυκίνη κατέχει το ρόλο του αα-trna. Η σημασία του πειραματικού αυτού πρωτοκόλου είναι μεγάλη, διότι με την αντίδραση αυτήν μπορεί: i) να ελεγχθεί η ενεργότητα της πεπτιδυλoτρανσφεράσης, ii) να ελεγχθεί η θέση πρόσδεσης στο ριβόσωμα του πεπτιδυλο- trna, καθώς και των αναλόγων του, iii) να τιτλοδοτηθεί η ποσότητα του ενεργού συμπλόκου C σε ένα διάλυμα. Τα βήματα της αντίδρασης ήσαν τα εξής: φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης με 60 μl συμπλόκου C (αφού έχει κοπεί στη μέση το φίλτρο) τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια (vials), τα οποία περιείχαν ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης: 100 mm Tris-HCl ph 7,2 100 mm NH 4 Cl ph 7,2 6 mm β'-etsh 6 mm MgCl 2 και ορισμένη ποσότητα πουρομυκίνης (0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm και 2 mm) (συνολικός όγκος = 1ml). Η αντίδραση πουρομυκίνης έγινε σε ανακινούμενο υδατόλουτρο, στους 25 ο C για καθορισμένο χρονικό διάστημα. Στη συνέχεια, διακόπηκε με την προσθήκη 1ml 1Ν ΝaΟΗ και τα φιαλίδια παρέμειναν στο υδατόλουτρο για τουλάχιστον 20 min μετά την προσθήκη ΝaΟΗ, ώστε να γίνει πλήρης υδρόλυση της περίσσειας AcPhe-tRNA που δεν αντέδρασε. Μετά το τέλος της αντίδρασης 0,8 ml από το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρθηκαν σε φιαλίδιο, στο οποίο προστέθηκε υγρό σπινθηρισμού Optifluor (10 [82]

ml) και ακολούθησε μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή β- ακτινοβολίας. Η τιμή αυτή της ραδιενέργειας (Ν 0 ) αντιστοιχεί στο ολικό ποσό του AcPhe-tRNA που είναι προσδεδεμένο στο σύμπλοκο C. Σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 2 ml οξικού αιθυλεστέρα μεταφέρθηκαν άλλα 0,8 ml από το μίγμα της αντίδρασης. Ακολούθησε έντονη ανάδευση σε vortex για 2 min και φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για 1 min. Κατ αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται διαχωρισμός του μίγματος σε δύο φάσεις: η υπερκείμενη οργανική φάση περιέχει το προϊόν της αντίδρασης (AcPhe-πουρομυκίνη), ενώ η κατώτερη φάση περιέχει την περίσσεια του ραδιενεργού AcPhe-tRNA που δεν αντέδρασε. Από την ανώτερη φάση, 1,5 ml μεταφέρθηκαν σε φιαλίδιο που περιείχε 10 ml υγρό σπινθηρισμού Optifluor και ακολούθησε μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή β-ακτινοβολίας. Η τιμή της ραδιενέργειας αντιστοιχεί στο ποσό του σχηματισμένου προϊόντος AcPhe-πουρομυκίνη. Για να υπολογιστεί το ποσό της ραδιενέργειας που αντιστοιχεί στο προϊόν της αντίδρασης (N), πολλαπλασιάστηκε η προηγούμενη μέτρηση με το συντελεστή 1,33 (2 ml/1,5 ml). Ο λόγος Ν/N 0 x 100 έδωσε το ποσοστό μετατροπής του Ac[ 3 H]Phe-tRNA σε προϊόν (x). Παράλληλα με την αντίδραση πουρομυκίνης, πραγματοποιήθηκαν και τυφλά πειράματα, ώστε να προσδιοριστεί το ποσοστό μόλυνσης της οργανικής φάσεως απουσία πουρομυκίνης. Η τιμή του ποσοστού στο τυφλό ήταν περίπου 2% και βρίσκεται στα όρια του φυσιολογικού σφάλματος. Επειδή κατά τη σύνθεση του συμπλόκου C δημιουργούνται και άλλα σύμπλοκα που δεν αντιδρούν με την πουρομυκίνη, το ποσοστό μετατροπής x διορθώθηκε με τον παράγοντα α. Αυτός ήταν ίσος με την έκταση (extent) της αντίδρασης πουρομυκίνης. Με τη διόρθωση αυτή, οι τιμές του x ανάγονται στη θεωρητική κατάσταση, όπου 100% του προσδενόμενου Ac-Phe-tRNA αντιδρά ποσοτικά με την πουρομυκίνη (Synetos et al., 1987). 8.4.4 Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης και εύρεση των καταλυτικών παραμέτρων Η αντίδραση που πραγματοποιείται μεταξύ του ριβοσωματικού συμπλόκου Αc[ 3 Η]Phe-tRNA 70S ριβόσωμα poly(u) και της πουρομυκίνης περιγράφεται με το παρακάτω κινητικό σχήμα: [83]

K s k 3 C + S CS C' + P Σχήμα 8.4.4.1: Κινητικό σχήμα της αντίδρασης πουρομυκίνης. C είναι το σύμπλοκο Αc[ 3 Η]Phe-tRNA 70S ριβόσωμα poly(u), S είναι η πουρομυκίνη, P είναι το προϊόν (AcPhe-Puro) και C είναι το ριβοσωματικό σύμπλοκο C που δεν έχει AcPhe-tRNA στη θέση Ρ, με αποτέλεσμα να μην είναι δραστικό έναντι της πουρομυκίνης. Η αντίδραση πουρομυκίνης, αν και διμοριακή, ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως, διότι το υπόστρωμα πουρομυκίνη (S) προστίθεται σε περίσσεια ως προς το C, με αποτέλεσμα η συγκέντρωση πουρομυκίνης να παραμένει σχεδόν σταθερή κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Η ολική συγκέντρωση (C o ) του συμπλόκου C είναι: C o = C + CS + C, και επειδή C = P προκύπτει: C o - P = C + CS (1) Η ταχύτητα της αντίδρασης δίνεται από τη σχέση : d[p] v CS k dt 3 Διαιρώντας τις σχέσεις (2) και (1) κατά μέλη, έπεται: (2) 2 v CS k 3 1 C P [C] [CS] o (3) Η σταθερά διαστάσεως K s δίνεται από την εξίσωση: K S C S CS CS C S K S Με αντικατάσταση του [CS] στην (3) προκύπτει ο διαφορικός κινητικός νόμος της αντίδρασης πουρομυκίνης (4): [84]

C S v KS C P C C S k o K v S k C P K o S S 3 S 3 S v K k S Co P 1 K v C K S S P S k o 3 S 3 S v C P Ο διαφορικός κινητικός νόμος με ολοκλήρωσή γίνεται : o S K k S K S K S 3 S (4) d v P Co P k 3 S dt K S S P d C P o k K S S S 3 dt p p o d[p] C P o t k K t 0 S S S 3 dt ln C o k 3 S C P K S t = k t obs o S (5) Ολοκληρωμένος κινητικός νόμος Στον ολοκληρωμένο κινητικό νόμο, k obs είναι η φαινομενική σταθερά ψευδοπρώτης τάξεως και ισούται με: (6) k obs = k 3 [S] / (K s +[S]) Ο ολοκληρωμένος κινητικός νόμος μπορεί να γραφεί και στην εξής μορφή: ln 100 k 100 x όπου x = P/C o 100 αντιστοιχεί στο % ποσοστό του Ac[ 3 H]Phe-tRNA που μετατρέπεται σε προϊόν. Από τη σχέση (7) συμπεραίνεται, ότι η συνάρτηση του ln[100/(100-x)] έναντι του χρόνου t είναι ευθεία γραμμή (Σχήμα). Συνεπώς, από την κλίση της ευθείας αυτής μπορεί κανείς να υπολογίσει την τιμή της k obs για μια συγκεκριμένη συγκέντρωση πουρομυκίνης. Επαναλαμβάνοντας το πείραμα και για άλλες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης, υπολογίζονται οι αντίστοιχες τιμές της k obs. Από τις τιμές αυτές, σχεδιάζεται το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου (DR-plot), δηλαδή η γραφική παράσταση του 1/k obs έναντι του 1/[S] (εξίσωση 8). obs t (7) [85]

k 1 obs K S k S KS 1 1 S k3 S k3 3 (8) Εξίσωση διπλού αντιστρόφου Τέτοια διαγράμματα (Σχήμα 8.4.4.2) χρησιμοποιήθηκαν για υπολογισμό των σταθερών K s και k 3, που περιγράφουν την ενεργότητα της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης κατά τη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. Σχήμα 8.4.4.2: (Α) Θεωρητική λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης σε μια συγκέντρωση πουρομυκίνης, (Β) Θεωρητικό διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (DR plot) για την αντίδραση πουρομυκίνης σε διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. 8.4.5 Αναστολή της αντίδρασης πουρομυκίνης από τα ανάλογα της χλωραμφαινικόλης Σε αυτή τη σειρά πειραμάτων επαναλήφθηκε η αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία των αναλόγων της χλωραμφαινικόλης. Οι συγκεντρώσεις των αναλόγων που χρησιμοποιήθηκαν κυμαίνονταν από 1-60 μμ. Επειδή το αντιβιοτικό χρησιμοποιήθηκε σε περίσσεια, η ελάττωση της συγκέντρωσής του (depletion) λόγω πρόσδεσης του σε μη ενεργά ριβοσώματα, ήταν αμελητέα. Από τις τιμές x που προέκυψαν, σχεδιάστηκαν οι λογαριθμικές χρονοκαμπύλες ln[100/(100-x)] έναντι του t. Αναλυτικότερα, ριβοσωματικό σύμπλοκο Ac[ 3 H]PhetRNA poly(u) ριβόσωμα(c) αντέδρασε με πουρομυκίνη (S) σε περίσσεια. Επειδή η αντίδραση ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως η k obs συνδέεται με το ποσοστό x μέσω της σχέσης : ln[100/(100-x)]= k obs x t [86]

Επειδή η k obs συνδέεται με τη συγκέντρωση πουρομυκίνης μέσω της σχέσης, k obs k K cat s S S από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου, παρουσία και απουσία του αναλόγου της χλωραμφαινικόλης, σε διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης, προσδιορίσθηκαν οι τιμές της k cat και K s και προσδιορίσθηκε ο τύπος της αναστολής. 8.4.6 Προσδιορισμός της σταθεράς αναστολής K i Επειδή όλα τα ανάλογα της χλωραμφαινικόλης επέδειξαν αναστολή συναγωνιστικού τύπου, η σταθερά αναστολής K i προσδιορίσθηκε μέσω επαναδιαγραμμάτων κλίσεως (slope replots), δηλαδή διαγραμμάτων της κλίσεως των διαγραμμάτων διπλού αντιστρόφου έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα. Εφόσον ο τύπος της αναστολής είναι συναγωνιστικός, η τετμημένη των διαγραμμάτων αυτών με τον άξονα x (συγκέντρωση αναστολέα) δίνει την τιμή της σταθεράς K i. 8.4.7 Προσδιορισμός της σταθεράς k eq για την αποκατάσταση των χημικών ισορροπιών που υπεισέρχονται στο κινητικό σχήμα. Η τιμή της σταθεράς k eq για κάθε συγκέντρωση πουρομυκίνης (υπόστρωμα) και αναλόγου της χλωραμφαινικόλης (αναστολέας) προσδιορίσθηκε από την τομή της αρχικής κλίσης των αντιστοίχων χρονοδιαγραμμάτων και της κλίσης μετά την αποκατάσταση των χημικών ισορροπιών. Σύμφωνα με τη θεωρία των βραδέως προσδενόμενων αναστολέων (Morrison and Walsch, 1988), η τομή αυτή αντιστοιχεί σε χρόνο που ισούται με το αντίστροφο της k eq. Στη συνέχεια οι τιμές της k eq σχεδιάσθηκαν έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα. Ο τύπος των διαγραμμάτων που ελήφθησαν (γραμμικά ή υπερβολικά) χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση του μηχανισμού (ενός σταδίου ή δύο σταδίων) που ακολουθεί η πρόσδεση του αναστολέα στο ριβόσωμα, καθώς και για τον προσδιορισμό των σταθερών k on και k off. [87]

8.5 Ανάλυση αποτυπώματος (footprinting analysis) Η τεχνική της ανάλυσης αποτυπώματος μας δίνει τη δυνατότητα να προσεγγίσουμε πειραματικά τις θέσεις πρόσδεσης στο rrna αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση (Christiansen et al., 1990). Η βασική αρχή στην οποία στηρίζεται η τεχνική είναι ότι τα νουκλεοτίδια του rrna, όπου δεσμεύονται (απόσταση < 4.5 Ǻ) οι προσδέτες, προστατεύονται από χημική τροποποίηση. Ως χημικοί τροποποιητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν: α) διάφορες ριβονουκλεάσες (Τ1, Τ2, CV, V1), που διασπούν υδρολυτικά το ριβοσωματικό κορμό, εκτός της περιοχής που προστατεύεται από τον προσδέτη, ή β) αντιδραστήρια όπως το DMS, CMCT, KE, DEP και Pso, που τροποποιούν εκλεκτικά βάσεις του rrna, όταν οι τελευταίες είναι μονόκλωνες και βρίσκονται εκτός της περιοχής δέσμευσης του προσδέτη. Και στις δυο περιπτώσεις, οι περιοχές θραύσεως ή τροποποίησης μπορούν να ταυτοποιηθούν με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis). 8.5.1 Παρασκευή δειγμάτων Στην ανάλυση αποτυπώματος χρησιμοποιήθηκαν ριβοσώματα που απομονώθηκαν από Ε. coli K12 κύτταρα με τον ίδιο τρόπο, όπως αυτά που χρησιμοποιήθηκαν για τις κινητικές μελέτες, ώστε να είναι συγκρίσιμα τα αποτελέσματα. Το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Η 80 Ν 100 Μ 6, επειδή έχει δειχθεί ότι το Hepes είναι το πλέον ασφαλές διάλυμα (pka = 7,5) για δράση των χημικών αντιδραστηρίων. Για την ταυτοποίηση της τελικής θέσης, δηλαδή εκείνης που αντιστοιχεί στο σύμπλοκο C*I, προεπωάσαμε σύμπλοκο C με περίσσεια αντιβιοτικού (50 x K i ) στους 25 ο C μέχρι πλήρους εξισορροπήσεως. Οι χρόνοι εξισορρόπησης (6 x t 1/2 ) υπολογίστηκαν βάσει των παρακάτω σχέσεων: t 1 1/ 2 k eq k eq k 7 k K i 6 [ I] [ I] [88]

Για την ταυτοποίηση της αρχικής θέσης πρόσδεσης, δηλαδή εκείνης που αντιστοιχεί στο σύμπλοκο CI, προστέθηκε στο σύμπλοκο C το αντιβιοτικό και σχεδόν αμέσως μετά (<2 sec) ο χημικός τροποποιητής. Πίνακας 8.5.1: (Α) Συγκεντρώσεις (μμ) αντιβιοτικών που αντιστοιχούν σε 50 x K i για κάθε αντιβιοτικό. (Β) Χρόνοι (min) που απαιτούνται για την πλήρη εξισορρόπηση πρόσδεσης κάθε αντιβιοτικού στην τελική θέση πρόσδεσής του στο ριβόσωμα. (A) Αντιβιοτικά 50x Ki (μμ) Πολυαμινικά παράγωγα της CAM Διμερή ανάλογα της CAM ΚΑ-240 50 F5 100 MAG240 70 MAG234 300 (B) Αντιβιοτικά Πολυαμινικά παράγωγα της CAM Διμερή ανάλογα της CAM Χρόνος (min) πλήρους εξισορρόπησης στην τελική θέση ΚΑ-240 2,6 F5 2 MAG240 2,44 MAG234 2,31 8.5.2 Χημική Τροποποίηση Oι χημικοί τροποποιητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τρεις: το DMS που μεθυλιώνει το Ν 7 της γουανίνης, το Ν 1 της αδενίνης και το Ν 3 της κυτοσίνης, το CMCT που τροποποιεί το Ν 3 της ουρακίλης και το Ν 1 της γουανίνης και η κεθοξάλη (KE) που τροποποιεί το Ν 1 και Ν 2 της γουανίνης (Εικόνα 8.5.2). Όλες οι τροποποιημένες βάσεις αναγνωρίζονται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, το οποίο τερματίζει το σχηματισμό της cdna αλυσίδας ένα νουκλεοτίδιο πριν από αυτό που έχει τροποποιηθεί (εκτός από την τροποποίηση στη θέση Ν 7 της γουανίνης από DMS). Συνεπώς, η ανάλυση των cdna προϊόντων της αντίστροφης μεταγραφάσης με ηλεκτροφόρηση καθιστά δυνατή την ταυτοποίηση των θέσεων τροποποίησης. [89]

Εικόνα 8.5.2: (Α) Χημικοί τροποποιητές. Τα άτομα που αντιδρούν είναι σημειωμένα με αστερίσκο. (Β) Τα άτομα στις βάσεις που τροποποιούνται από ένα χημικό τροποποιητή, σημειώνονται με βέλος. (Γ) Τροποποιημένη αδενική από DMS, ουρακίλη από CMCT και γουανίνη από ΚΕ (Ehresmann et al., 1987). Η τροποποίηση του μακρομορίου-στόχου έγινε ως εξής: DMS CMCT KE Προσθήκη 3 μl DMS σε 110 μl διαλύματος Η 80 Ν 100 Μ 6 που περιείχε 3 Α260 ελεύθερου συμπλόκου στο οποίο είχε προσδεθεί αντιβιοτικό (CI ή C*I) Προσθήκη 100 μl CMCT σε 110 μl διαλύματος Η 80 Ν 100 Μ 6 που περιείχε 3 Α260 ελεύθερου συμπλόκου στο οποίο είχε προσδεθεί αντιβιοτικό (CI ή C*I) Προσθήκη 5 μl KE σε 110 μl διαλύματος Η 80 Ν 100 Μ 6 που περιείχε 3 Α260 ελεύθερου συμπλόκου στο οποίο είχε προσδεθεί αντιβιοτικό (CI ή C*I) Επώαση στους 37 ο C, για 10 min. Προσθήκη 25 μl διαλύματος DMS stop Επώαση στους 37 ο C, για 15 min. Προσθήκη 50 μl διαλύματος CMCT stop Επώαση στους 37 ο C, για 10 min. Προσθήκη 15 μl διαλύματος KE stop Ψύξη στους 0 C για 10 min Ψύξη στους 0 C για 10 min Ψύξη στους 0 C για 10 min Εκχύλιση με φαινόλη Εκχύλιση με φαινόλη Εκχύλιση με φαινόλη [90]

8.5.3 Εκχύλιση του rrna H απομόνωση του τροποποιημένου rrna έγινε με την παρακάτω διαδικασία: Προσθήκη 150 μl φαινόλης 5 min Vortex, 5 min Spin 12000 rpm Προσθήκη 75 μl φαινόλης και 75 μl CHCl 3 στο υπερκείμενο 5 min Vortex, 5 min Spin 12000 rpm Προσθήκη 150 μl CHCl 3 στο υπερκείμενο 5 min Vortex, 5 min Spin 12000 rpm Προσθήκη 1/10 V CH 3 COONa ph=5,5 και 3V Et-OH o/n στους -20 ο C ή 2 h στους 80 ο C Το τελικό υπερκείμενο που κατακρημνίσθηκε με αιθανόλη φυγοκεντρήθηκε στις 12000 rpm, για 30 min, στους 4 ο C. Στη συνέχεια, το ίζημα αποξηράθηκε για 2 min σε Speed Vac και αναδιαλύθηκε σε 10 μl mqh 2 O. Φωτομετρήθηκε στα 260 nm και αραιώθηκε περαιτέρω, ώστε να έχουμε τελική συγκέντρωση 3 μg/μl. Για τον προσδιορισμό των τροποποιημένων νουκλεοτιδίων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της προέκτασης εκκινητή, κατά την οποία η μεταγραφή του rrna σε cdna από το ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης (Reverse Transcriptase) διακόπτεται ένα νουκλεοτίδιο πριν την τροποποίηση. Η τροποποιημένη βάση εμφανίζεται ως ζώνη στα αυτοραδιογραφήματα μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 6% πολυακρυλαμιδίου/7μ ουρίας και η εύρεση της ακριβούς θέσης της βρέθηκε με ανάλυση αλληλουχίας (sequencing) που έγινε παράλληλα. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ο Κ 3, ο Κ 4, και ο Κ 10.5 (17-18 μερή DNA), περιείχαν 50% GC και επιλέχθηκαν ώστε να αναλυθεί το καταλυτικό κέντρο (Εικόνα 8.5.3). Για κάθε δείγμα παρασκευάστηκαν 9 μl διαλύματος που περιείχαν: 2 μl από τον εκκινητή (10 ng/μl), 2 μl από διάλυμα υβριδοποίησης (4,5 x), [91]

3 μl mqh 2 O και 2 μl από το εκχυλισμένο RNA (αρχικής συγκέντρωσης 3μg/μl). Το rrna αποδιατάχθηκε στους 95 o C, για 1,5 min και στη συνέχεια, έγινε υβριδοποίηση του εκκινητή στους 65-70 o C, για 10 min. Στο προϊόν προστέθηκαν 4 μl μείγματος προέκτασης (περιείχε dntps, a-[ 32 P] ATP), 2 μl από το ένζυμο AMV αντίστροφη μεταγραφάση (1,5 units) και 2 μl mqh 2 O. Η αντίδραση πολυμερισμού της αντίστροφης μεταγραφάσης έγινε στους 42 o C, για 1 h και ολοκληρώθηκε με προσθήκη 3,4 μl chase mix (1 mm για κάθε dntp) και επώαση για 30 min. To cdna που δημιουργήθηκε κατακρημνίστηκε με αιθανόλη και ψύξη στους -20 o C, o/n. Το ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στις 12000 rpm για 40 min, αποξηράνθηκε σε speed vac για 2 min, και αφού συμπληρώθηκε με 30 μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης, αφέθηκε για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. Πριν ηλεκτροφορηθεί, αποδιατάχθηκε για 2 min στους 95 ο C και ψύχθηκε σε πάγο. 10 μl από το τελικό διάλυμα ηλεκτροφορήθηκαν αμέσως σε πηκτή 6% πολυακρυλαμιδίου/7 M ουρίας, ενώ η υπόλοιπη ποσότητα φυλάχτηκε για επαναληπτικό πείραμα. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή τοποθετήθηκε προσεκτικά σε χαρτί Whatman, αποξηράνθηκε και υποβλήθηκε σε Phosphoimager αναλυτή. [92]

K 10.5 Εικόνα 8.5.3: Θέσεις πρόσδεσης των εκκινητών Κ 10.5, Κ 3, Κ 4 στο 23S rrna Οι περιοχές που είναι συμπληρωματικές των εκκινητών φαίνονται με μπλε χρώμα για τον Κ 10.5, με πράσινο χρώμα για τον Κ 3 και με κίτρινο χρώμα για το Κ 4. [93]

8.6 Μελέτες σε βακτηριακές καλλιέργειες και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές 8.6 Α. Καλλιέργειες στελεχών E. coli και S. aureus, παρουσία ή απουσία αντιβιοτικών Σε θρεπτικό υλικό LB (20 ml) έγινε εμβολιασμός με 500 μl καλλιέργειας E. coli και S. aureus κυττάρων (OD ~ 0,7). Επωάστηκαν στους 37 ο C o/n. Την επόμενη ημέρα σε 45 ml θρεπτικού υλικού προστέθηκε 1,5 ml κυττάρων από την καλλιέργεια που είχε αναπτυχθεί o/n. Πραγματοποιήθηκε επώαση σε περιστροφικά ανακινούμενο αναδευτήρα, μέχρι τα κύτταρα να αναπτυχθούν ως το μέσο της εκθετικής φάσης (OD ~ 0,7). Στη συνέχεια ποσότητα από την καλλιέργεια (0,1 ml) μεταφέρθηκε σε θρεπτικό υλικό (3 ml) και προστέθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις χλωραμφαινικόλης και των παραγώγων της: (0-200 μg/ml). Τέλος, οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ο C, μέχρις ότου η οπτική απορρόφηση (520 nm) της αντίστοιχης καλλιέργειας που δεν περιείχε το αντιβιοτικό, να φτάσει στην τιμή 0,7. Στο σημείο αυτό, η ανάπτυξη των καλλιεργειών διεκόπη με τοποθέτησή τους σε παγόλουτρο και ακολούθησε μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στο ίδιο μήκος κύματος. 8.6.Β.1. Ανθρώπινες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Οι ανθρώπινες αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι: 1) HS-Sultan (B-λευχαιμική σειρά), 2) Jurkat (Τ- λευχαιμική σειρά), 3) U937 (μονοκυτταρική σειρά), που παραχωρήθηκαν ευγενώς από το εργαστήριο της κυρίας Μουζάκη. Τα κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, διατηρήθηκαν για μεγάλα χρονικά διαστήματα, κατεψυγμένα σε δοχεία που περιείχαν υγρό άζωτο (-196 ο C). H διαδικασία κατάψυξης, που ακολουθήθηκε, ήταν η παρακάτω: Κύτταρα στην εκθετική φάση ανάπτυξής τους συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν Ακολούθησε επαναιώρηση και φυγοκέντρηση [94]

Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε στο διάλυμα κατάψυξης, που αποτελείται από 90% εμβρυϊκό ορό βοδινού (FΒS) και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) Ένα ml του παραπάνω μίγματος μεταφέρθηκε σε ειδικά σωληνάρια κατάψυξης, τα οποία ψύχθηκαν σταδιακά Αρχικά τοποθετήθηκαν σε δοχείο με πάγο για ~ 10 min, στη συνέχεια σε καταψύκτη στους -80 ο C για 48 h, ενώ αργότερα τοποθετήθηκαν στο δοχείο υγρού αζώτου, όπου και διατηρήθηκαν Η απόψυξή τους έγινε γρήγορα με μεταφορά του σωληνάριου κατάψυξης στους 37 ο C Το περιεχόμενο του σωληνάριου μεταφέρθηκε σε φυγοκεντρικό σωλήνα με 9 ml πλήρους καλλιεργητικού υλικού και φυγοκεντρήθηκε Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 10 ml πλήρους καλλιεργητικού υλικού και καλλιεργήθηκαν στις συνήθεις συνθήκες καλλιέργειας για 24 h 8.6.Β.1.1 Συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας ανθρώπινων λευχαιμικών κυτταρικών σειρών Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σαν εναιώρημα σε RPMI-1640, το οποίο περιείχε 10% εμβρυϊκό ορό βοδινού (FΒS), 100 U/ml πενικιλίνη, 100 μg/ml στρεπτομυκίνη και 6 mm β-etsh Επωάστηκαν σε κλίβανο, στον οποίο η θερμοκρασία διατηρούταν σταθερή στους 37 o C, ενώ επικρατούσαν συνθήκες υγρασίας και η ατμόσφαιρα ήταν εμπλουτισμένη με 5% CO 2. Καλλιεργήθηκαν σε τρυβλίο για έξι ημέρες παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων χλωραμφαινικόλης (0,01 μg/ml, 0,1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml), διμερούς mag240 (0,01 μg/ml, 0,1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml) και πολυαμινικού παραγώγου ΚΑ240 (0,01 μg/ml, 0,1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml). Το θρεπτικό μέσο αλλάχθηκε μετά από τρεις ημέρες έκθεσης. Για να διατηρηθούν τα επίπεδα του φαρμάκου, προστέθηκε νέα ποσότητα φαρμάκου [95]

σε κάθε αλλαγή μέσου. Κύτταρα διατηρήθηκαν ως control καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος σε RPMI, χωρίς την προσθήκη φαρμάκου. Η μέτρηση των κυττάρων έγινε σε αναλυτή αίματος CELL-DYN 3700. 8.6.Β.1.2.Μέτρηση νέκρωσης λευχαιμικών κυττάρων με την χρήση ιωδιούχου προπιδίου (Pi) Από καλλιέργεια κυττάρων Jurkat και HS-Sultan 5 ml, στην οποία είχε προστεθεί η κατάλληλη συγκέντρωση φαρμάκου και είχε επωαστεί για 72 h, παρελήφθη δείγμα 1 ml και αναλύθηκε με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής. Τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS και επωάστηκαν για 15 min με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (μία φθορίζουσα ουσία που είναι γνωστό ότι συνδέεται με το DNA των κυττάρων όταν οι κυτταρικές μεμβράνες δεν είναι ανέπαφες, σημαίνοντας έτσι τα νεκρά κύτταρα). Τα δείγματα αναλύθηκαν σε κυτταρομετρητή BD Calibur, και το ποσοστό των νεκρών κυττάρων στην καλλιέργεια προσδιορίσθηκε από την ένταση φθορισμού του ΡΙ. O προσδιορισμός της νέκρωσης έγινε με το πρόγραμμα FlowJo (Tree Star Co). 8.6.Β.1.3 Μέτρηση αναστολής πολλαπλασιασμού σε λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Κύτταρα από τις κυτταρικές σειρές Jurkat και HS-Sultan χρησιμοποιήθηκαν για μέτρηση πολλαπλασιασμού των κυττάρων με την χρήση της ουσίας CFSE. Η CFSE είναι ένας καρβοξυ-διακετυλο- ηλεκτριμιδικός εστέρας της καρβοξυφλουορεσίνης (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) και έχει τη δυνατότητα να σημαίνει σταθερά, μόρια εντός των κυττάρων. Με κάθε κυτταρική διαίρεση που προκύπτει, ο φθορισμός μειώνεται διαδοχικά κατά το ήμισυ (Εικόνα 8.6.B.1.3). [96]

Εικόνα 8.6.B.1.3a: Σχηματική αναπαράσταση των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν κατά τη σήμανση με CFSE (Parish et al., 1999). O πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων μπορεί να παρακολουθηθεί με κυτταρομετρία ροής, σύμφωνα με την παρακάτω διαδικασία: 1. Επαναιώρηση των κυττάρων σε 1 ml PBS που περιέχει 5% (ν/ν) FCS σε αποστειρωμένο σωλήνα. 2. Τοποθέτηση του σωλήνα σε οριζόντια θέση (σημαντικό για την αναστολή της κυτταρικής κίνησης και πρόωρης ανάμιξης των διαλυμάτων). 3. Προσθήκη 110 μl PBS στην κορυφή του σωλήνα (εξασφάλιση ότι δεν αναμειγνύονται τα κύτταρα), και επαναιώρηση σε 1,1 μl CFSE 5 mm. 4. Κάλυψη του σωλήνα, ώστε να μην εκτίθεται στο φως, και γρήγορη ανακίνηση αρκετές φορές. Μετά την πλήρη ανάμιξη, τα κύτταρα που είχαν σημανθεί με CFSE αφήνονται για επώαση 5 min σε T δωματίου (20 C). 5. Πλύσιμο των κυττάρων με αραίωση με δέκα όγκους PBS που περιέχει 5% (ν/ν) FBS (20 o C), και φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 10 min στους 24 ο C. Απόρριψη του υπερκειμένου. 6. Επαναιώρηση των κυττάρων σε RPMI και μοίρασμα σε διαφορετικά πιάτα (plates) με προσθήκη κατάλληλων ποσοτήτων των αντιβιοτικών. Η βέλτιστη επισήμανση των κυττάρων είναι πλήρης μέσα σε λίγα λεπτά σε θερμοκρασία Τ δωματίου. Η επώαση για μεγαλύτερες περιόδους μπορεί να είναι [97]

τοξική και να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αυτό είναι ιδιαίτερα σύνηθες σε χαμηλές συγκεντρώσεις κυττάρων, απουσία ρυθμιστικών πρωτεϊνών. Πρέπει να σημειωθεί, ότι το CFSE φθορίζει και επομένως ο φθορισμός του επηρεάζεται μετά από έκθεση σε υπερβολικό φως. Οπότε, θα πρέπει ο σωλήνας των CFSE σημασμένων κυττάρων καλύπτεται με αλουμινόχαρτο. CAM 1 μg/ml CAM 10 μg/ml CAM 100 μg/ml KA240 0,1 μg/ml KA240 1 μg/ml KA240 50 μg/ml MAG240 0,1 μg/ml MAG240 10 μg/ml MAG240 50 μg/ml CONTROL CONTROL CONTROL Εικόνα 8.6.B.1.3b: Χρησιμοποιηθείσες συγκεντρώσεις των αντιβιοτικών στα κύτταρα Jurkat. CAM 1 μg/ml CAM 10 μg/ml CAM 100 μg/ml KA240 0,1 μg/ml KA240 30 μg/ml KA240 50 μg/ml MAG240 0,1 μg/ml MAG240 10 μg/ml MAG240 50 μg/ml CONTROL CONTROL CONTROL Εικόνα 8.6.B.1.3c: Χρησιμοποιηθείσες συγκεντρώσεις των αντιβιοτικών στα κύτταρα Sultan Η ανάλυση έγινε σε κυτταρομετρητή BD Calibur, με ελάχιστο αριθμό κυττάρων, 25000 κύτταρα. Ο προσδιορισμός του πολλαπλασιασμού έγινε με το πρόγραμμα FlowJo (Tree Star Co). [98]

8.6.Β.2. Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση των πειραμάτων ήταν: 1) η Zl-34 (κύτταρα από καρκίνο μεσοθηλιώματος) και 2) η MeT-5A (επιθηλιακά μετασχηματισμένα κύτταρα). Η διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε για το ξεπάγωμα των κυττάρων ήταν όμοια με των ανθρώπινων αιμοποιητικών κυτταρικών σειρών, ωστόσο υπήρχαν διαφορές στην ανακαλλιέργεια. 8.6.Β.2.1.Ανακαλλιέργεια Όταν τα κύτταρα έχουν φθάσει σε 80% συρρέουσα ανάπτυξη, μπορούμε να τα ανακαλλιεργήσουμε. Ξεπλένουμε δύο φορές με PBS (Phosphate Buffer Saline) αναρροφώντας και απορρίπτοντας αρχικά το υγρό που υπήρχε στη φιάλη καλλιέργειας και προσθέτοντας εν συνεχεία το PBS. Ακολούθως, προσθέτουμε θρυψίνη 1x (διάλυση με το διάλυμα φωσφορικών) ώστε να καλύψει την επιφάνεια. Επωάζουμε για 10 min περίπου στους 37 o C. Αδρανοποιούμε το ένζυμο με προσθήκη DMEM, 10% FBS. Προκαλούμε πλευρική δόνηση στη φιάλη, ώστε να αποκολληθούν όλα τα κύτταρα. Με διαδοχικά πιπετταρίσματα (αναρροφήσειςαπορρίψεις) του υπερκείμενου υγρού, διευκολύνουμε την αποκόλληση των κυττάρων. Από τον ολικό όγκο του υγρού που περιέχει κύτταρα, αφήνουμε το 10-20 % στη φιάλη και τον υπόλοιπο όγκο ή τον απορρίπτουμε ή το μεταφέρουμε σε άλλες φιάλες. Μεταφέρουμε τις φιάλες καλλιέργειας στον επωαστικό κλίβανο. 8.6.Β.2.2 Μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων με Trypan blue Αφαιρείται το θρεπτικό υλικό από τις καλλιέργειες, γίνεται πλύση δύο φορές με PBS όπως έχει ήδη περιγραφεί, προστίθεται θρυψίνη ώστε να καλύψει την επιφάνεια (0,1 ml ανά πηγαδάκι), γίνεται επώαση για 10 min στους 37 o C, προστίθεται 10x όγκος θρεπτικού υλικού (1ml) για την απενεργοποίηση του ενζύμου, συλλέγονται τα κύτταρα σε φιαλίδια eppendorf και φυγοκεντρούνται στα 3000 g για 5 min. Πριν την μέτρηση των κυττάρων, αφαιρείται το υπερκείμενο, προστίθενται 100 μl trypan blue, γίνεται ήπια ανάδευση με την πιπέττα, αναμονή 5 min, μεταφέρεται ποσότητα στην πλάκα Neubauer, αναμονή 30 s ώστε να «ηρεμήσουν» τα κύτταρα, και ακολουθεί μέτρηση. [99]

Η χρωστική trypan blue δε διαπερνά τις μεμβράνες των ζώντων κυττάρων, οπότε τα κύτταρα παραμένουν άχροα. Αντιθέτως μπλε ή μερικώς χρωματισμένα σημαίνει ότι τα κύτταρα είναι νεκρά ή με σοβαρές βλάβες που οδηγούν στην απόπτωση (Εικόνα 8.6.Β.2.3). Εικόνα 8.6.Β.2.2 : Μέτρηση κυττάρων σε πλάκα Neubauer με χρήση της χρωστικής trypan blue. Στην παρατήρηση της πλάκας Neubauer, λαμβάνονται υπόψη αυστηρά οι οδηγίες ορθής μέτρησης των κυττάρων. Πρέπει να μετρηθούν τουλάχιστον εκατό κύτταρα. Αυτό σημαίνει ότι ο αριθμός των κυττάρων που μετράται δεν είναι απαραίτητα συγκεκριμένος, αρκεί η διασπορά των κυττάρων να είναι ομοιόμορφη. Ο [100]

υπολογισμός των κυττάρων γίνεται ως εξής: δεδομένου ότι κάθε μεγάλο τετράγωνο παρατήρησης που ορίζεται από τριπλή γραμμή έχει μέγεθος 1 mm, και βάθος 0,1 mm ο όγκος είναι 0,1 mm 3. Η αναγωγή του μέσου όρου των κυττάρων γίνεται στο 1 ml. Ο απόλυτος αριθμός ζωντανών και νεκρών κυττάρων δεν είναι τόσο κατατοπιστικός, όσο ο λόγος τους και ειδικότερα το επί τοις εκατό κλάσμα βιωσιμότητας που ορίζεται από τη σχέση: Ζωντανά κύτταρα % βιωσιμότητα = x 100 Ζωντανά + νεκρά κύτταρα [101]

[102]

9. 1 Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης απουσία των παραγώγων της CAM 9.1.1 Πειραματική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης Όπως αναφέρθηκε στο πειραματικό μέρος, όταν η πουρομυκίνη (S), προστίθεται σε περίσσεια προς το C, η αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, αν και διμοριακή, ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως. Η συγκέντρωση πουρομυκίνης μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και θεωρείται σταθερή. Οι ληφθείσες πειραματικές τιμές ln[100/(100-x)] σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία της αντίδρασης πουρομυκίνης, όταν αυτή πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH + 4 και για διαφορετικές συγκεντρώσεις πουρομυκίνης 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm και 2 mm, δίδονται στον Πίνακα 9.1.1. Πίνακας 9.1.1: Τιμές του ln 100/(100-x) για διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης, όταν η αντίδραση πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4 +. ln 100/(100-x) Χρόνος (min) Πουρομυκίνη 0,1 mm Πουρομυκίνη 0,2 mm Πουρομυκίνη 0,4 mm Πουρομυκίνη 2 mm 0 0 0 0 0 0,25 0,12 0,189 0,254 0,516 0,5 0,249 0,341 0,487 1 0,75 0,327 0,54 0,76 1,564 1 0,45 0,688 1 2 2 0,88 1,482 2,05 3,9 Οι τιμές έχουν διορθωθεί με την έκταση της αντίδρασης (80%) και τη σταθερότητα του συμπλόκου (95%). Oι ληφθείσες πειραματικές τιμές του παραπάνω πίνακα εισήχθησαν για επεξεργασία στο λογισμικό του προγράμματος OriginPro 6.1, προκειμένου να σχεδιαστούν οι αντίστοιχες λογαριθμικές χρονοκαμπύλες της [103]

αντίδρασης πουρομυκίνης. Στην Εικόνα 9.1.1, δίδονται τα διαγράμματα που προέκυψαν. Εικόνα 9.1.1: Αντίδραση πουρομυκίνης απουσία αναλόγων. Ριβοσωματικό σύμπλοκο C αντέδρασε με 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm και 2 mm πουρομυκίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4 +. Παρατηρούμε ότι οι λογαριθμικές χρονοκαμπύλες της αντίδρασης πουρομυκίνης απουσία αναστολέα δίνουν μονοφασικά γραμμικά διαγράμματα, επιβεβαιώνοντας τις θεωρητικές προβλέψεις. Από την κλίση κάθε ευθείας υπολογίζεται η τιμή της k obs για μια συγκεκριμένη συγκέντρωση πουρομυκίνης. Πίνακας 9.1.2: Τιμές της φαινομενικής σταθεράς ταχύτητας, K obs, της αντίδρασης πουρομυκίνης, όταν η τελευταία πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4 +. Συγκέντρωση Puro (mm) k obs (min -1 ) 0,1 0,45 0,2 0,688 0,4 1 2 2 [104]

Από τις τιμές αυτές σχεδιάζεται το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου ή DRplot (Double reciprocal plot) (Εικόνα 9.1.1), δηλαδή η γραφική παράσταση του 1/k obs έναντι του 1/[S], που ακολουθεί την εξίσωση: k 1 obs K S k S KS 1 1 S k3 S k3 3 Εικόνα 9.1.2: Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (DR plot) για την αντίδραση πουρομυκίνης, όταν αυτή πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4 +. Από το διάγραμμα της Εικόνας 9.1.2, υπολογίζονται οι σταθερές K s και k 3 που δίνουν την ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κατά τη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. Συγκεκριμένα, η τεταγμένη επί την αρχή ισούται με 1/k 3 και η τετμημένη με -1/Κ s. Οι σταθερές Κ s και k 3, βρέθηκαν να είναι: Κ s = 540 52 μμ και k 3 = 2,5 0,2 min -1. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα με παλαιότερα ευρήματα του εργαστηρίου, συμπεράναμε πως τα ριβοσώματα είχαν την απαιτούμενη ενεργότητα, ώστε να χρησιμοποιηθούν για τα επόμενα πειράματα. [105]

9.2 Κινητική της αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από πολυαμινικά ανάλογα της CAM. 9.2.1 Θεωρητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία ενός πολυαμινικού παραγώγου της CAM, του ΚΑ-240 Υποθέτοντας ότι το παράγωγο συμπεριφέρεται ως συναγωνιστικός αναστολέας τόσο στην αρχική, όσο και στην τελική φάση της αντίδρασης, και δεδομένου ότι οι αρχικές κλίσεις των χρονοδιαγραμμάτων μεταβάλλονται συναρτήσει της συγκέντρωσης του αναστολέα, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι το παράγωγο αναστέλλει την αντίδραση πουρομυκίνης, συμπεριφερόμενo ως βραδέως προσδενόμενος αναστολέας, ακολουθώντας μηχανισμό δύο σταδίων. Δηλαδή, το παράγωγο (Ι) αντιδρά αρχικά, ακαριαία με το σύμπλοκο C και σχηματίζει το σύμπλοκο CI, το οποίο στη συνέχεια σε ένα δεύτερο αργό βήμα ισομερίζεται στο πιο σταθερό σύμπλοκο C*I. Επεξήγηση συμβόλων: C: σύμπλοκο C Ι: παράγωγο ΚΑ-240 CI: αρχικό σύμπλοκο του παραγώγου με το σύμπλοκο C S: πουρομυκίνη CS: σύμπλοκο Michaelis-Menten μεταξύ πουρομυκίνης και συμπλόκου C K i : η σταθερά αναστολής στο αρχικό βήμα K S : η σταθερά διαστάσεως του συμπλόκου CS k 3 : ή k cat, δηλαδή η καταλυτική σταθερά του ενζυμικά καταλυόμενου βήματος της αντίδρασης που οδηγεί στο σχηματισμό προϊόντος [106]

C*I: ισομερισμένο και σταθερό τελικό σύμπλοκο του ΚΑ-240 με το σύμπλοκο C k 6, k 7 : καταλυτικές παράμετροι ισομερισμού, δηλαδή μετατροπής του συμπλόκου CI σε C*I και αντίστροφα Κ * i : η ολική σταθερά αναστολής C : το απενεργοποιημένο ριβοσωματικό σύμπλοκο C το οποίο δεν έχει AcPhe-tRNA στη θέση Ρ με αποτέλεσμα να μην είναι δραστικό έναντι της πουρομυκίνης, και το οποίο προκύπτει ως προϊόν της ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης πουρομυκίνης Ρ: το προϊόν (AcPhe-Puro) της ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης πουρομυκίνης τύπο: Γνωρίζουμε πως η k' obs παρουσία συναγωνιστικού αναστολέα δίνεται από τον k' obs ο οποίος με αντιστροφή δίνει: K S k3[ S] [ I] (1 ) [ S] K i 1 k' obs K S [ I] (1 ) Ki 1 1 k [ S] k 3 3 όπου η τεταγμένη επί την αρχή ισούται με 1/k 3, η τετμημένη με - 1/{Κ s [1+(I)]/K i }και η κλίση (slope) με: Slope K k S 3 K k S 3 [ I] K i Συνεπώς, το διάγραμμα της κλίσης έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα αναμένεται να δώσει το θεωρητικό διάγραμμα της Εικόνας 9.2.1, όπου η τομή της ευθείας με τον άξονα [Ι] ισούται με - Κ i. [107]

Εικόνα 9.2.1: Θεωρητικό διάγραμμα της κλίσης των DR-plots έναντι της συγκέντρωσης ενός συναγωνιστικού αναστολέα. 9.2.2 Πειραματική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία του πολυαμινικού παραγώγου ΚΑ240 Για την μελέτη αναστολής σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού πραγματοποιήθηκαν πειράματα αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία του ΚΑ240 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Χρησιμοποιώντας την εξίσωση ln [100/(100-x)] = k obs t σχεδιάστηκαν οι χρονοκαμπύλες σύνθεσης του πεπτιδικού δεσμού παρουσία 1,5 μμ, 3 μμ και 6 μμ ΚΑ240, σε συγκεντρώσεις πουρομυκίνης 0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm και 2 mm (Εικόνα 9.2.2).. [108]

Εικόνα 9.2.2: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία ΚΑ240. Ριβοσωματικό σύμπλοκο C αντέδρασε με (Α) 0,1 mm, (Β) 0,2 mm, (C) 0,4 mm, και (D) 2 mm πουρομυκίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH + 4, παρουσία ΚΑ240 σε συγκεντρώσεις 1,5 μμ, 3 μμ και 6 μμ. Διαπιστώθηκε πως τα διαγράμματα των λογαριθμικών χρονοκαμπυλών ήσαν διφασικά και χαρακτηρίζονταν από μία αρχική και μία τελική κλίση. Αυτό σημαίνει ότι ο βαθμός της αναστολής είναι χρονοεξαρτώμενος και παρουσιάζει μία αρχική και μία τελική αναστολής. Τα δεδομένα κάθε φάσης αναλύθηκαν ξεχωριστά. Από την αρχική και τελική κλίση κάθε ευθείας υπολογίζονται οι τιμές της αρχικής και τελικής k' obs για κάθε μια συγκεκριμένη συγκέντρωση πουρομυκίνης. 9.2.2.A1 Ανάλυση της αρχικής και τελικής φάσης αναστολής Από τις τιμές των k' obs που υπολογίσθηκαν με τα προηγούμενα πειράματα κατασκευάστηκαν τα διαγράμματα του διπλού αντιστρόφου 1 / k' obs(initial) έναντι του 1 / [S] και 1 / k' obs(final) έναντι του 1 / [S], (όπου S: πουρομυκίνη) για τις αρχικές και [109]

τελικές κλίσεις αντίστοιχα, για συγκεντρώσεις ΚΑ240 0 μμ (control), 1,5μΜ, 3μΜ και 6μΜ (Εικόνα 9.2.3). Εικόνα 9.2.3 : Διαγράμματα διπλού αντιστρόφου για τις αρχικές (Α) και τελικές (Β) κλίσεις k' obs(initial) των λογαριθμικών χρονοδιαγραμμάτων απουσία (control) και παρουσία ΚΑ240 σε συγκεντρώσεις 1,5 μμ, 3 μμ και 6 μμ. Στα διαγράμματα του διπλού αντιστρόφου για τις αρχικές και τελικές κλίσεις, παρατηρείται πως οι ευθείες για κάθε συγκέντρωση ΚΑ240 τέμνονται στο ίδιο σημείο [110]

του άξονα y, συμπεριφορά χαρακτηριστική απλού συναγωνιστικού αναστολέα. Αυτό σημαίνει πως η ΚΑ240 συναγωνίζεται με την πουρομυκίνη για την θέση Α του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος, τόσο κατά την αρχική, όσο και κατά την τελική φάση αναστολής. Ωστόσο, όπως προκύπτει από τις διαφορετικές τιμές που λαμβάνει η k' obs(final) συγκριτικά με την k' obs(initial), η αναστολή είναι ισχυρότερη στην τελική φάση της αντίδρασης. 9.2.2.A2 Υπολογισμός των σταθερών αναστολής στις δύο φάσεις αναστολής με ανάλυση επαναδιαγραμμάτων κλίσης (slope replots) για την ΚΑ240. Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη παράγραφο, η κλίση των διαγραμμάτων διπλού αντιστρόφου για ένα συναγωνιστικό αναστολέα δίνεται από τον τύπο: Slope K k S 3 K k S 3 [ I] K i Κατά συνέπεια, τα επαναδιαγράμματα του slope έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα αναμένονται να είναι γραμμικά. Αφού υπολογίσθηκαν οι κλίσεις αυτές κατασκευάστηκαν τα επαναδιαγράμματα τελικής κλίσης έναντι της συγκεντρώσεως της ΚΑ240. Όπως δείχνει η Εικόνα 9.2.4, ανάλυση των κινητικών δεδομένων με slope-επαναδιαγράμματα επιβεβαιώνει την πρόβλεψή μας, όπου Κ i και η Κ i * η σταθερά αναστολής στην αρχική και τελική φάση της αντίδρασης, αντίστοιχα. [111]

Εικόνα 9.2.4: Επαναδιαγράμματα αρχικών και τελικών κλίσεων (slope replots) έναντι της συγκέντρωσης του ΚΑ-240. Στα διαγράμματα της Εικόνα 9.2.4, η τεταγμένη ισούται με Κ S /k 3, και οι τετμημένες με -K i και - K * i. Με τον τρόπο αυτό βρέθηκε ότι K i = 0,975 0,08 και K * i = 0,28 0,03 9.2.2.A3 Υπολογισμός του λόγου k 6 /k 7 προβλέπει ότι: Η θεωρία των βραδέως προσδενόμενων συναγωνιστικών αναστολέων Οπότε έχουμε : k7 K i* K i( ) K i k6 k7 K i k ( k k k 6 7 6 7 1) K 0,975 1 2,482 0,28 Παρατηρούμε λοιπόν ότι, ο βαθμός αναστολής της αντίδρασης K i k 6 k ( k k C + I CI C * I i 6 6 7 k k 7 7 K K ) K i i 1 i k 7 [112]

μετά την αποκατάσταση της ισορροπίας είναι ισχυρότερος από τον βαθμό αναστολής πριν από την αποκατάσταση, αφού Κ i * < Κ i και k 6 /k 7 > 1. Επομένως στο σημείο ισορροπίας ευνοείται ο σχηματισμός του συμπλόκου C*Ι. 9.2.2.A4 Υπολογισμός των ειδικών ταχυτήτων k 6 και k 7 Σύμφωνα με τη θεωρία των βραδέως προσδενόμενων αναστολέων το σημείο τομής των διφασικών χρονοδιαγραμμάτων αντιστοιχεί επί του άξονα x με την τιμή του παράγοντα 1/k eq, όπου k eq η ειδική ταχύτητα ισορροπίας. 1/k eq Δίνεται ένα αντιπροσωπευτικό χρονοδιάγραμμα και ο τρόπος υπολογισμού της k eq. Η k eq συνδέεται με τη συγκέντρωση του αναστολέα μέσω της σχέσης: k eq k 7 [ I] k6 K i [ S] [ I] 1 K K s i Από τις τιμές της k eq σε συγκεκριμένη συγκέντρωση πουρομυκίνης, σχεδιάζεται το διάγραμμα της Εικόνας 9.2.5 [113]

Εικόνα 9.2.5: Διάγραμμα μεταβολής της k eq σε συνάρτηση με το λόγο της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού προς τη σταθερά διάστασης Κ ι. από το οποίο μπορεί να γίνει γραφική εκτίμηση των τιμών k 6 και k 7. Όμως, η μέθοδος αυτή δεν είναι ακριβής. Για το λόγο αυτό, οι τιμές των k 6 και k 7 υπολογίσθηκαν μέσω υπολογιστικής συσχέτισης (regression analysis) με προσαρμογή των πειραματικών τιμών των k eq και [I]/K i στην εξίσωση P2x y P1 P3 x όπου P1= k 7, P2= k 6, P3= 1+ [S]/K s, y= k eq και x= [I]/K i. Χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα Origin 7.5. Οι τιμές των k 6 και k 7 που υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο αυτή είναι 2,00 ± 0, 10 και 0,71 ± 0,072 αντίστοιχα. Από τις τιμές αυτές προκύπτει ότι k 6 /k 7 = 2,82 ± 0,062, η οποία δε διαφέρει σημαντικά από την τιμή k 6 /k 7 που υπολογίσθηκε μέσω της εξίσωσης k k 6 7 K K i * i Παρομοίως πραγματοποιήσαμε τα πειράματα και για τα υπόλοιπα πολυαμινικά παράγωγα. Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 9.2.1. 1 [114]

Πίνακας 9.2.1: Κινητικές παράμετροι της αλληλεπίδρασης της CAM και των πολυαμινικών παραγώγων της CAM με το ριβόσωμα. Κινητικές Σταθερές K i K i * k 6 /k 7 k 6 k 7 (μμ) (μμ) (min -1 ) (min -1 ) Αντιβιοτικά CAM 3,10 ± 0,3 0,88 ± 0,1 2,52 ± 0,45 2,29 ± 0,13 0,99 ± 0,04 KA240 0,98 ± 0,08 0,28 ± 0,03 2,48 ± 0,3 2,1 ± 0,12 0,66 ± 0,09 F5 2,2 0,2 0,75 0,06 1,93 0,35 2,3 0,01 1,19 0,06 mag221 3,6 0,3 1,2 0,1 2,00 ± 0,35 2,49 0,02 1,26 0,03 CL29 16,25 1,46 5 0,45 2,25 ± 0,41 2,89 ± 0,004 1,28 ± 0,002 [115]

CLB3 2,1 0,17 0,6 0,05 2,5 ± 0,4 2,22 ± 0,01 0,89 ± 0,01 CLB7 3,37 0,3 0,9 0,06 2,74 ± 0,42 2,88 ± 0,01 1,05 ± 0,006 CLB8 214 17,12 8,45 0,67 24,32 ± 2,85 18,24 ± 0,01 0,75 ± 0,005 mag217 Κινητικά αδρανές mag218 3 0,3 1 0,1 2 ± 0,13 2,19 0,07 1,1 0,02 mag219 17,5 1,4 6 0,48 1,92 ± 0,3 1,9 ± 0,16 0,99 ± 0,08 [116]

mag222 12 1,08 4 0,44 2 ± 0,42 1,67 ± 0,18 0,84 ± 0,08 9.3 Κινητική της αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από τα διμερή παράγωγα της CAM. 9.3.1 Ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία ενός διμερούς παραγώγου της CAM, του mag240 Με βάση τις δύο θέσεις δέσμευσης της CAM που παρουσιάζουν τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα, αποφασίσαμε τη σύνθεση των διμερών, ώστε να βελτιωθεί η ανασταλτική δράση της CAM. In silico ανάλυση των θέσεων πρόσδεσης της CAM στο ριβόσωμα, αποκάλυψε την ιδανική απόσταση μεταξύ των δύο μορίων της CAM στο υποψήφιο διμερές, ώστε να αποκαθίσταται ταυτόχρονη πρόσδεση του διμερούς στο καταλυτικό κέντρο και στην αρχή του καναλιού εξόδου (Εικόνα 10.3.1). Εικόνα 9.3.1: In silico ένθεση (Molecular Docking) δύο μορίων χλωραμφαινικόλης στο καταλυτικό κέντρο και την είσοδο του καναλιού εξόδου του ριβοσώματος Σύμφωνα με την in silico ανάλυση, η απόσταση μεταξύ των δύο ατόμων αζώτου της CAM ισούται με 9,8 Å και αντιστοιχεί σε 6-7 διαδοχικούς απλούς [117]

δεσμούς C. Με βάση το δεδομένο αυτό, σχεδιάστηκαν τα παράγωγα που παρουσιάζονται στη συνέχεια. Τα διμερή παράγωγα της CAM παρασκευάσθηκαν στο Εργαστήριο του κυρίου Δ. Παπαϊωάννου (Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Τμήματος Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών) από το μεταδιδάκτορα Γ. Μαγουλά. Τα αποτελέσματα της κινητικής ανάλυσης παρουσιάζονται διαγραμματικά στις παρακάτω Εικόνες. Εικόνα 9.3.2 : Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία mag240. Ριβοσωματικό σύμπλοκο C αντέδρασε με 0,4 mm πουρομυκίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4 +, παρουσία mag240 σε συγκεντρώσεις 8 μμ, 15 μμ και 30 μμ. Αντίστοιχα διαγράμματα ελήφθησαν, χρησιμοποιώνας 2 mm, 0,2 mm και 0,1 2 mm πουρομυκίνης. Οι αρχικές και οι τελικές κλίσεις των διφασικών χρονοκαμπλών, που αναπαριστούν τη φαινομενική ειδική ταχύτητα της αντίδρασης, επανασχεδιάσθηκαν με τη μορφή διαγραμμάτων διπλού αντιστρόφου (Εικόνα 9.3.3). [118]

Εικόνα 9.3.3: Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου για τις αρχικές (Α) κλίσεις και τις τελικές (Β) κλίσεις των λογαριθμικών χρονοδιαγραμμάτων απουσία (control) και παρουσία mag240 σε συγκεντρώσεις 0 μμ, 8 μμ, 15 μμ και 30 μμ. Από τα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου προέκυψαν τα επαναδιαγράμματα κλίσεων (slope replots), μέσω των οποίων υπολογίσθηκαν οι τιμές K i και K i * (Εικόνα 9.3.4) [119]

Εικόνα 9.3.4: Επαναδιαγράμματα αρχικών και τελικών κλίσεων (slope replots) έναντι των συγκεντρώσεων του mag240. Οι τιμές της k eq που υπολογίστηκαν από τις λογαριθμικές χρονοκαμπύλες επανασχεδιάστηκαν έναντι της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού. Αντιπροσωπευτικό διάγραμμα για συγκέντρωση πουρομυκίνης ίση με 0,1 mm δίνεται στην Εικόνα 9.3.5. Εικόνα 9.3.5: Διάγραμμα μεταβολής της k eq σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του mag240 παρουσία 0,1 mm πουρομυκίνης. [120]

Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα της κινητικής ανάλυσης της αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από τα διμερή παράγωγα της CAM δίνονται στον Πίνακα 9.3.1. Πίνακας 10.3.1: Κινητικές παράμετροι της αλληλεπίδρασης της CAM και των διμερών αναλόγων της CAM με το ριβόσωμα Κινητικές Σταθερές Αντιβιοτικά CAM K i (μμ) K i * k 6 /k 7 k 6 (μμ) (min -1 ) k 7 (min -1 ) 3,10 ± 0,3 0,88 ± 0,1 2,52 ± 0,45 2,29 ± 0,13 0,99 ± 0,04 mag234 6 0,54 1,87 0,15 2,2 ± 0,38 2,04 0,06 1 0,04 mag235 12 1,2 2,7 0,27 3,4 ± 0,62 2,89 0,03 0,84 0,02 mag239 4,5 0,36 1,2 0,09 2,75 ± 0,42 2,9 0,05 1 0,03 [121]

mag240 1,4 0,12 0,3 0,03 3,6 ± 0,7 2,245 ± 0,01 0,638 ± 0,03 mag243 Κινητικά αδρανές mag244 10,5 0,9 2,3 0,2 3,56 ± 0,56 2,8 0,09 0,8 0,04 mag261 2,4 0,24 0,6 0,05 3 ± 0,51 1,8 0,04 0,6 0,03 mag266 2,7 0,25 0,75 0,06 2,6 ± 0,46 1,7 0,07 0,7 0,05 [122]

10. Ανάλυση αποτυπώματος (footprinting analysis) Για να διαλευκάνουμε το μηχανισμό πρόσδεσης της CAM, των πολυαμινικών παραγώγων ΚΑ240, F5 και των διμερών mag240, mag234 στο ριβόσωμα εφαρμόσαμε την τεχνική της χρονο-διαβαθμισμένης αποτύπωσης. Η αρχική και η τελική θέση πρόσδεσης του αντιβιοτικού εντοπίστηκε με ανάλυση αποτυπώματος των συμπλόκων CI και C*I. Παρασκευάστηκαν δυο δείγματα: στο πρώτο, το αντιβιοτικό και ο χημικός τροποποιητής προστέθηκαν σχεδόν ταυτόχρονα (<2s) στα ριβοσώματα (πειράματα χωρίς προεπώαση), με αποτέλεσμα να αποτυπώνεται το σύμπλοκο CI που βρίσκεται σε περίσσεια (>95%). Στο δεύτερο, το αντιβιοτικό αντέδρασε με τα ριβοσώματα για 5 min (πορεία προεπώασης με το αντιβιοτικό) με συνέπεια να αποτυπώνεται κυρίως το σύμπλοκο C*I που βρίσκεται σε περίσσεια (>70%). Η θέση και ο βαθμός τροποποίησης των βάσεων του 23S rrna υπολογίσθηκαν με ανάλυση προέκτασης εκκινητή (primer extension). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση αποτυπώματος. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων που αφορούσαν τη μητρική ένωση, παρατηρήσαμε ότι η CAM προστατεύει από χημικούς τροποποιητές τα νουκλεοτίδια A2451, G2505 και U2506, που εντοπίζονται γύρω από την A-θέση του καταλυτικού κέντρου, όταν προσδένεται στην αρχική θέση (CI). Αντίθετα, όταν προσδένεται στην τελική θέση (σύμπλοκο C*I), προστατεύει τα νουκλεοτίδια Α2451, Α2062 και Α2059, προκαλεί ενίσχυση της τροποποίησης στο νουκλεοτίδιο Α2058, ενώ μειώνει ελαφρά την προστασία των νουκλεοτιδίων G2505 και U2506 (Εικόνα 10.1). [123]

Εικόνα 10.1: Προστασία έναντι χημικών τροποποιητών νουκλεοτιδίων της κεντρικής θηλιάς της περιοχής V του 23S rrna που προκαλείται από πρόσδεση της CAM στο σύμπλοκο C. Διαδρομή 1: μη τροποποιημένο σύμπλοκο C, Διαδρομή 2: τροποποιημένο σύμπλοκο C, απουσία του αντιβιοτικού, Διαδρομή 3: σύμπλοκο C που αντέδρασε με CAM για 2 s (-PI) και έπειτα τροποποιήθηκε, Διαδρομή 4: σύμπλοκο C που αντέδρασε με CAM για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποιήθηκε. Όσον αφορά τα πολυαμινικά παράγωγα παρατηρήσαμε ότι το ΚΑ240 φαίνεται να προκαλεί προστασία στο Α2451, G2505, και U2506, όταν προσδένεται στην αρχική θέση δέσμευσης (σύμπλοκο CI). Στο σύμπλοκο C*I, εμφανίζονται δύο θέσεις προστασίας (Α2059 και Α2062), ενώ η προστασία στη θέση G2505 ισχυροποιείται περαιτέρω (Εικόνες 10.2, 10.3). Το F5 στην αρχική θέση δέσμευσης εμφανίζει το ίδιο αποτύπωμα με εκείνο του ΚΑ240. Ωστόσο προστατεύει ισχυρά δύο επιπρόσθετα νουκλεοτίδια (Α2602 και U2585) στην τελική θέση πρόσδεσης, τα οποία εμπλέκονται στο μηχανισμό συστροφής (rotary motion) του αα-trna της Α θέσης γύρω από τον άξονα συμμετρίας του καταλυτικού κέντρου). Επίσης, σε αντίθεση με το ΚΑ240, δεν επηρεάζει τη δραστικότητα του A2059 έναντι του DMS. [124]

DMS Εικόνα 10.2: Προστασία έναντι χημικών τροποποιητών νουκλεοτιδίων της κεντρικής θηλιάς της περιοχής V του 23S rrna που προκαλείται από πρόσδεση του ΚΑ240 ή του F5, στο ριβόσωμα. Διαδρομή 1: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 2: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 3: με τροποποίηση, απουσία του ΚΑ240, Διαδρομή 4: με τροποποίηση, απουσία του F5, Διαδρομή 5: αντίδραση ριβοσωμάτων με ΚΑ240 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποποίηση με DMS, Διαδρομή 6: αντίδραση ριβοσωμάτων με F5 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποποίηση με DMS, Διαδρομή 7: αντίδραση ριβοσωμάτων με ΚΑ240 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποίηση με DMS, Διαδρομή 8: αντίδραση ριβοσωμάτων με F5 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποίηση με DMS. DMS DMS [125]

CMCT CMCT KE Εικόνα 10.3: Προστασία έναντι χημικών τροποποιητών νουκλεοτιδίων της κεντρικής θηλιάς της περιοχής V του 23S rrna που προκαλείται από πρόσδεση του ΚΑ240 και του F5, στο ριβόσωμα. Διαδρομή 1: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 2: με τροποποίηση, απουσία του ΚΑ240, Διαδρομή 3: αντίδραση ριβοσωμάτων με ΚΑ240 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποποίηση, Διαδρομή 4: αντίδραση ριβοσωμάτων με ΚΑ240 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποίηση, Διαδρομή 5: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 6: με τροποποίηση, απουσία του F5, Διαδρομή 7: αντίδραση ριβοσωμάτων με F5 για 2 s (- [126]

PI) και έπειτα τροποποίηση, Διαδρομή 8: αντίδραση ριβοσωμάτων με F5 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποίηση. Οι χημικοί τροποποιητές αναγράφονται δεξιά της κάθε εικόνας. Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα ανάλυσης αποτυπώματος για τα πολυαμινικά παράγωγα της CAM, KA240 και F5, στα σύμπλοκα CI και C * I δίνονται στον παρακάτω Πίνακα 10.1. Πίνακας 10.1: Συγκεντρωτικός πίνακας αποτελεσμάτων ανάλυσης αποτυπώματος για τα πολυαμινικά παράγωγα της CAM (KA240, F5). Control No drug -Pi +Pi ΚΑ240 Α2058 0 1 1 0,05 1 0,08 Α2059 0 1 1 0,06 0,60 0,03 Α2062 0 1 1 0,05 0,52 0,02 Α2451 0 1 0,48 0,024 0,53 0,055 Α2602 0 1 1 0,1 1,1 0,08 U2506 0,1 1 0,7 0,05 0,65 0,04 U2585 0 1 1 0,07 1 0,05 U2609 0 1 1 0,09 1 0,07 G2505 0 1 0,65 0,05 0,35 0,018 F5 Α2058 0 1 1,1 0,09 0,9 0,08 Α2059 0 1 0,9 0,05 1 0,08 Α2062 0 1 1 0,06 1 0,09 Α2451 0 1 0,55 0,05 0,58 0,03 Α2602 0 1 1 0,06 0,3 0,013 U2506 0 1 0,62 0,045 0,57 0,03 U2585 0 1 1 0,08 0,45 0,04 U2609 0 1 1 0,1 0,9 0,06 G2505 0 1 0,55 0,038 0,15 0,001 Αντίστοιχα πειράματα ανάλυσης αποτυπώματος για τα διμερή παράγωγα της CAM δίνονται στις Εικόνες 10.4, 10.5. [127]

DMS Εικόνα 10.4: Προστασία της περιοχής V του 23S rrna που προκαλείται από πρόσδεση του mag240 και mag234 στο ριβόσωμα. Διαδρομή 1: χωρίς τροποποίηση (control), Διαδρομή 2: με τροποποίηση, Διαδρομή 3: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag234 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποποίηση, Διαδρομή 4: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag234 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποίηση, Διαδρομή 5: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 6: με τροποποίηση, Διαδρομή 7: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag240 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποποίηση, Διαδρομή 8: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag240 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποποίηση. DMS DMS [128]

CMCT CMCT KE Εικόνα 10.5: Προστασία της περιοχής V του 23S rrna που προκαλείται από πρόσδεση του mag240 και του mag234 στο ριβόσωμα, Διαδρομή 1: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 2: με τροποποίηση, απουσία του mag240, Διαδρομή 3: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag240 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποπoίηση, Διαδρομή 4: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag240 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποπoίηση, Διαδρομή 5: χωρίς τροποποίηση, Διαδρομή 6: με τροποποίηση, Διαδρομή 7: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag234 για 2 s (-PI) και έπειτα τροποπoίηση, Διαδρομή 8: αντίδραση ριβοσωμάτων με mag234 για 5 min (+PI) και έπειτα τροποπoίηση. Οι χημικοί τροποποιητές αναγράφονται δεξιά της κάθε εικόνας. Από τις Εικόνες 10.4, 10.5, βλέπουμε ότι το mag240 και το mag234 στην αρχική θέση δέσμευσης προστατεύουν από χημικούς τροποποιητές τα νουκλεοτίδια [129]

Α2058, Α2059 και Α2062, που εδράζονται στην είσοδο του καναλιού εξόδου, ωστόσο το mag240 προκαλεί ισχυρότερη προστασία. Επίσης, προκαλούν προστασία στα νουκλεοτίδια U2506, A2451, G2505, όμως στο G2505 το mag234 επιδεικύει ισχυρότερη προστασία. Στην τελική θέση δέσμευσης, η προστασία ισχυροποιείται, σε όλες τις προαναφερόμενες θέσεις, ιδιαιτέρως παρουσία του mag240. Κατ εξαίρεση το G2505 συνεχίζει να προστατεύεται ισχυρότερα από το mag234. Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα ανάλυσης αποτυπώματος για τα διμερή παράγωγα της CAM, mag240 και mag234, δίνονται στον παρακάτω Πίνακα 10.2. Πίνακας 10.2: Συγκεντρωτικός πίνακας αποτελεσμάτων ανάλυσης αποτυπώματος για τα διμερή. Control No drug -Pi +Pi mag240 Α2058 0 1 0,72 0,06 0,35 0,02 Α2059 0 1 0,7 0,05 0,38 0,018 Α2062 0 1 0,68 0,05 0,4 0,03 Α2451 0 1 0,4 0,027 0,38 0,025 Α2602 0 1 1 0,1 0,94 0,089 U2506 0,1 1 0,5 0,04 0,15 0,01 U2585 0 1 1 0,09 1 0,076 U2609 0 1 1 0,08 1 0,078 G2505 0 1 0,47 0,05 0,42 0,03 mag234 Α2058 0 1 0,85 0,07 0,65 0,05 Α2059 0 1 0,87 0,07 0,75 0,069 Α2062 0 1 0,88 0,08 0,63 0,055 Α2451 0 1 0,45 0,04 0,48 0,039 Α2602 0 1 1 0,1 1 0,08 U2506 0 1 0,5 0,04 0,5 0,035 U2585 0 1 1 0,06 1 0,07 U2609 0,1 1 1 0,1 1 0,05 G2505 0 1 0,4 0,03 0,3 0,025 [130]

11. Επίδραση των πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της CAM σε βακτηριακές καλλιέργειες και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές 11.1 Αντιβακτηριακή δράση Για να εκτιμηθεί η αντιβακτηριακή δραστικότητα των πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της CAM μετρήθηκε η παράμετρος IC 50. Ορίζοντας ως IC 50 τη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που προκαλεί μείωση της ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων κατά 50%, οι τιμές αυτής της παραμέτρου αποτελούν μέτρο της μικροβιακής δραστικότητας του αντιβιοτικού. Οι τιμές αυτές δίνονται στους Πίνακες 11.1, 11.2. Πίνακας 11.1: Τιμές της IC 50 για E. coli και S. aureus παρουσία των πολυαμινικών παραγώγων της CAM. Aντιβιοτικά IC 50 E. coli (μg/ml) IC 50 S. aureus (μg/ml) CAM 4 2 ΚA240 20 10 Clb7 >200 >200 Clb8 >200 >200 Clb3 >200 >200 Cl29 >200 >200 mag217 >200 >200 mag218 200 100 mag219 200 50 mag221 200 30 mag222 >200 50 F5 >200 30 [131]

Πίνακας 11.2: Τιμές της IC 50 για E. coli και S. aureus παρουσία των διμερών παραγώγων της CAM. Aντιβιοτικά IC 50 E. coli (μg/ml) IC 50 S. aureus (μg/ml) CAM 4 2 mag234 >200 30 mag235 >200 50 mag239 >200 200 mag240 >200 >200 mag243 >200 50 mag244 >200 40 mag261 >200 >200 mag266 >200 >200 Στα πολυαμινικά όσο και στα διμερή παράγωγα της CAM παρατηρούμε ότι η αντιβακτηριακή δράση των παραγώγων είναι γενικά ισχυρότερη στο S. aureus από ότι στο E. coli, το οποίο δικαιολογείται από τη πολυπλοκότερη δομή του κυτταρικού τοιχώματος του E. coli. [132]

11.2 Δράση έναντι ανθρώπινων κυτταρικών σειρών 11.2.1 Μελέτη της επίδρασης της CAM, του ΚΑ240 και του mag240 σε κύτταρα ανθρώπινου αίματος και λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Επειδή οι γνωστές παρενέργειες της CAM έχουν συνδεθεί με καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του μυελού των οστών ή σοβαρή απλαστική αναιμία (Wareham and Wilson, 2002), θεωρήθηκε αναγκαίο να εξετάσουμε καταρχήν την επίδραση της CAM και των παραγώγων της σε κύτταρα ανθρωπίνου αίματος και λευχαιμικές κυτταρικές σειρές (που προέρχονται από αιμοποιητικά εμβρυϊκά κύτταρα του μυελού των οστών). Τα αποτελέσματα της επίδρασης της CAM και των δραστικότερων μελών της σειράς των πολυαμινικών (ΚΑ240) και διμερών παραγώγων (mag240) της CAM, με βάση τις in vitro κινητικές μελέτες, σε κύτταρα αίματος παρουσιάζονται στην Εικόνα 11.1 Α,Β,C,D. Α) Λευκοκύτταρα [133]

Β) Ουδετερόφιλα C) Μονοκύτταρα [134]

D) Λεμφοκύτταρα Εικόνα 11.1: Επίδραση της CAM και των παραγώγων της σε: Α) λευκοκύτταρα Β) ουδετερόφιλα C) μονοκύτταρα και D) λεμφοκύτταρα από αίμα φυσιολογικού ατόμου. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24h, 48h, 72h, 96h και 120h με καθένα από τα αντιβιοτικά. Είναι πολύ σημαντικό ότι, ούτε η μητρική ένωση, ούτε τα παράγωγά της επιδεικνύουν αρνητική επίδραση στη βιωσιμότητά των κυττάρων του αίματος από φυσιολογικό άτομο. Το ενθαρρυντικό αυτό αποτέλεσμα μας ώθησε να εξετάσουμε την τοξικότητα των υπό διερεύνηση ουσιών σε δύο ανθρώπινες λευχαιμικές σειρές (Jurkat, HS-Sultan) και μία μονοκυτταρική σειρά (U937). 11.2.1Α. Τοξικότητα της CAM και των παραγώγων της σε λευχαιμικές σειρές Η παρακολούθηση της ανάπτυξης των κυττάρων υπό την επίδραση των αντιβιοτικών έγινε με μέτρηση των κυττάρων της καλλιέργειας με αναλυτή αίματος. Τα αποτελέσματα για κάθε μία κυτταρική σειρά δίνονται στις επόμενες παραγράφους. [135]

A.1 Jurkat (Τ-λευχαιμικά κύτταρα) A B C Εικόνα 11.2: Επίδραση (Α) της CAM (B) του ΚΑ240 και του (C) mag240 σε κύτταρα Jurkat (Τ-λευχαιμικά κύτταρα). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24h, 48h, 72h, 96h και 120h με καθένα από τα αντιβιοτικά. Για διευκόλυνση της σύγκρισης της τοξικότητας μεταξύ των αντιβιοτικών, σημειώνεται ότι συγκέντρωση 50 μg/ml αντιβιοτικού αντιστοιχεί σε 154 μμ CAM, 59 μμ ΚΑ240 και 90 μμ mag240. Σύμφωνα με τα διαγράμματα της Εικόνας 11.2, τα τρία αντιβιοτικά φαίνεται να επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων, όμως σε διαφορετικό βαθμό το καθένα. Επίσης, η επίδραση ξεκινά από διαφορετικό χρονικό σημείο. Η επίδραση της CAM γίνεται εμφανής στις 48h, ενώ του ΚΑ240 στις 96h, και του mag240 στις 72h. Τέλος, συγκρινόμενη η τοξικότητα των τριών αντιβιοτικών στην ίδια συγκέντρωση (6 μμ) και για έκθεση 120 h αποκαλύπτει ότι η CAM προκαλεί μείωση του αριθμού των κυττάρων κατά 13%, το ΚΑ240 αναστολή κατά 26% και το mag240 κατά 31%. [136]

Α.2 HS-Sultan (Β-λευχαιμικά κύτταρα) A B C Εικόνα 11.3 : Επίδραση (Α) της CAM (B) του ΚΑ240 και του (C) mag240 σε κύτταρα HS- Sultan (Β-λευχαιμικά κύτταρα). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24h, 48h, 72h, 96h και 120h με καθένα από τα αντιβιοτικά. Σύμφωνα με τα διαγράμματα της Εικόνας 11.3, η CAM σε συγκέντρωση 6 μμ αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων στις 120 h έκθεσης κατά 30%, το ΚΑ240 κατά 15% και το mag240 κατά 10%. Όμως, αξιοσημείωτο είναι το εύρημα ότι το ΚΑ240 σε συγκέντρωση 60 μμ αναστέλλει πλήρως την ανάπτυξη των κυττάρων, ενώ η σειρά τοξικής δραστικότητας των αντιβιοτικών αλλάζει, συγκρινόμενη με εκείνη έναντι των Τ-λευχαιμικών κυττάρων. [137]

Α.3 U937 (μονοκυτταρική σειρά) A B C Εικόνα 11.4: Επίδραση (Α) της CAM (B) του ΚΑ240 και του (C) του mag240 σε κύτταρα U937 (μονοκυτταρική σειρά). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24h, 48h, 72h, 96h και 120h με καθένα από τα αντιβιοτικά. Από τα πειράματα ελέγχου της τοξικότητας των αντιβιοτικών έναντι των U937 κυττάρων, διαπιστώνουμε ότι, αν και η μητρική ένωση σε συγκέντρωση 6 μμ μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 40%, κανένα από τα παράγωγα δε δείχνει εμφανή τοξικότητα στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της επίδρασης των υπό εξέταση αντιβιοτικών στις τρεις κυτταρικές σειρές, πραγματοποιήσαμε μια νέα σειρά πειραμάτων για να διερευνήσουμε που οφείλεται η μείωση των κυττάρων που παρατηρήσαμε. [138]

11.2.1Β Μέτρηση του ποσοστού νεκρών λευχαιμικών κυττάρων μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (Pi) Το ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) είναι μία φθορίζουσα ουσία που συνδέεται με το DNA των κυττάρων, όταν τα κύτταρα είναι νεκρά και οι κυτταρικές τους μεμβράνες είναι διάτρητες. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε κυτταρομετρητή BD Calibur (βλέπε πειραματικό μέρος). Jurkat κυτταρική σειρά A B [139]

C Εικόνα 11.5: Αριστερή στήλη: Προσδιορισμός νεκρών κυττάρων με την χρήση κυτταρομετρίας ροής για την μελέτη της επίδρασης των αντιβιοτικών (A) CAM, (B) KA240 και (C) mag240 στη θνησιμότητα των κυττάρων Jurkat με χρήση ιωδιούχου προπιδίου (PI) (control με γκρι χρώμα, μεγαλύτερη συγκέντρωση με μπλε). Στην εικόνα εμφανίζεται το ποσοστό των κυττάρων που αναλύθηκαν έναντι της έντασης του φθορισμού για το PI. Δεξιά στήλη: Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων έναντι του χρόνου επώασης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72h, 96h, 120h και 144h. Από τα διαγράμματα της Εικόνας 11.5, διαπιστώνουμε ότι σε συγκέντρωση 6 μμ κανένα από τα τρία αντιβιοτικά δεν προκαλεί αισθητή αύξηση νέκρωσης. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις η CAM (310 μμ) προκαλεί 25% αύξηση του ποσοστού των νεκρών κυττάρων, ενώ το ΚΑ240 (60 μμ) προκαλεί αντίστοιχη αύξηση κατά 8%. Το mag240 δεν παρουσιάζει καμία αισθητή επίδραση, στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν. [140]

HS-Sultan κυτταρική σειρά A B C Εικόνα 11.6: Αριστερή στήλη: Προσδιορισμός νεκρών κυττάρων με την χρήση κυτταρομετρίας ροής για την μελέτη της επίδρασης των αντιβιοτικών (A) CAM, (B) KA240 και (C) mag240 στη θνησιμότητα των κυττάρων HS-Sultan με χρήση ιωδιούχου προπιδίου (PI) (control με γκρι χρώμα, μεγαλύτερη συγκέντρωση με μπλε). Στην εικόνα εμφανίζεται το ποσοστό των κυττάρων που πέρασαν από το FACS έναντι της έντασης του φθορισμού για το PI. Δεξιά στήλη: Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων έναντι του χρόνου επώασης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72h, 96h, 120h και 144h. [141]

Τα αποτελέσματα από τα πειράματα σε κύτταρα HS-Sultan δείχνουν ότι, ούτε η CAM, ούτε τα παράγωγά της, επηρεάζουν το ποσοστό των νεκρών κυττάρων μετά από έκθεση για 120 h (Εικόνα 11.6). 11.2.1C Μέτρηση αναστολής πολλαπλασιασμού των λευχαιμικών κυττάρων μετά από επισήμανση με CFSE. Όπως αναφέρθηκε στο πειραματικό μέρος, το CFSE είναι ένας καρβοξυδιακετυλο- ηλεκτριμιδικός εστέρας της καρβοξυ-φλουορεσίνης που έχει τη δυνατότητα να επισημαίνει ομοιοπολικά πρωτεϊνικά μόρια εντός των κυττάρων. Με κάθε κυτταρική διαίρεση που προκύπτει, ο φθορισμός κατανέμεται μεταξύ των θυγατρικών κυττάρων και κατά συνέπεια μειώνεται κατά το ήμισυ ανά κύτταρο. Jurkat κυτταρική σειρά A CAM B KA240 [142]

C mag240 Εικόνα 11.7: Αριστερή στήλη: Προσδιορισμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων με την χρήση κυτταρομετρίας για την μελέτη της επίδρασης των αντιβιοτικών (A) CAM, (B) KA240 και (C) mag240 στη θνησιμότητα των κυττάρων Jurkat με χρήση CFSE. Στην εικόνα εμφανίζεται το ποσοστό των κυττάρων που αναλύθηκαν έναντι της έντασης του φθορισμού για το CFSE. Δεξιά στήλη: Ποσοστό πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων έναντι της συγκέντρωσης των ουσιών για 96h. Με βάση τα διαγράμματα της Εικόνας 11.7 καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η CAM σε συγκέντρωση 6 μμ αναστέλλει το ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων κατά 50% (Εικόνα 11.6 Α), ενώ στην ίδια συγκέντρωση στο ΚΑ240 προκαλεί αναστολή κατά 13%. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις το ΚΑ240 προκαλεί περαιτέρω μείωση του ποσοστού που φθάνει στο 50% (Εικόνα 11.6 Β). Αντίθετα, το mag240 δε φαίνεται να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σημαντικό βαθμό (Εικόνα 11.6 C). HS-Sultan κυτταρική σειρά A CAM [143]

B KA240 C mag240 Εικόνα 11.8: Αριστερή στήλη: Προσδιορισμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων με την χρήση κυτταρομετρίας για την μελέτη της επίδρασης των αντιβιοτικών CAM, KA240 και mag240 στη θνησιμότητα των κυττάρων HS-Sultan με χρήση CFSE. Στην εικόνα εμφανίζεται το ποσοστό των κυττάρων που πέρασαν από το FACS έναντι της έντασης του φθορισμού για το CFSE. Δεξιά στήλη: Ποσοστό πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων έναντι της συγκέντρωσης των ουσιών για 96h. Στην HS-Sultan κυτταρική σειρά, η CAM μειώνει σταδιακά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 8 φορές, αυξανομένης της συγκέντρωσής της από 0 έως 300 μμ (Εικόνα 11.8 Α). Το ΚΑ240 σε συγκέντρωση 60 μμ επιδεικνύει παρόμοια δράση, προκαλώντας μείωση κατά 2,5 φορές του ποσοστού των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (Εικόνα 11.8 Β). Το mag240 επιδεικνύει μικρότερη δράση (μείωση κατά ~ 1,5 φορά), όμως η δράση αυτή εκδηλώνεται από τη μικρότερη συγκέντρωση (0,2 μg/ml) (Εικόνα 11.8 C). [144]

11.2.2 Επίδραση της CAM, του ΚΑ240 και του mag240 στις κυτταρικές σειρές Μet5Α και ZL34 Έχοντας σχηματίσει μία αδρή εικόνα για την τοξική δράση των υπό μελέτη αντιβιοτικών σε ώριμα κύτταρα του αίματος και αντίστοιχες κυτταρικές σειρές, θεωρήσαμε αναγκαίο να εξετάσουμε την τοξική τους δράση σε κυτταρικές σειρές άλλης ιστικής προέλευσης (Zl-34, κύτταρα από καρκίνο μεσοθηλιώματος - MeT-5A, επιθηλιακά μετασχηματισμένα κύτταρα). Μet5A κυτταρική σειρά ΖL34 κυτταρική σειρά 1A 2A 1B 2B [145]

1C 2C Εικόνα 11.9: επίδραση (1Α, 2Α) της CAM, (1B, 2Β) του ΚΑ240, και (1C, 2C) του mag240 στις κυτταρικές σειρές Μet5A και ZL34. Στα 1Α, 2Α τα Met5A και τα ΖL34 επωάστηκαν με τη μητρική ένωση για 24h, 72h και 96h. Παρομοίως στα 1B, 2Β και 1C, 2C τα κύτταρα επωάστηκαν με το KA240 και το mag240 αντίστοιχα, για τα ίδια χρονικά διαστήματα. Η μητρική ένωση (CAM) και το διμερές παράγωγό της (mag240) δεν επηρεάζουν την ανάπτυξη καμίας από τις δύο κυτταρικές σειρές (Εικόνες 11.9. 1Α, 2Α, 1C, 2C). Ωστόσο, το πολυαμινικό παράγωγο KA240 εμφανίζει ήπια δράση σε μικρές συγκεντρώσεις ( 10 μg/ml), ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις (>30 μg/ml) είναι ισχυρά τοξικό και για τις δύο σειρές (Εικόνες 11.9. 1B, 2B). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός, ότι η μείωση της βιωσιμότητας που παρατηρείται στις 96 h παρουσία 10 μg/ml ΚΑ240 αναιρείται, όταν η έκθεση των κυττάρων πραγματοποιείται παρουσία 100 μμ εξωγενούς σπερμιδίνης (διακεκομμένη γραμμή στην Εικόνα 11.9, 2B). [146]

[147]

Η υπερσυνταγολόγηση αντιβιοτικών κατά την τελευταία 60ετία είχε ως αποτέλεσμα την ανεξέλεγκτη διάδοση της αντίστασης των βακτηρίων έναντι των περισσοτέρων αντιβιοτικών που βρίσκονται σε κλινική χρήση. Ένα άλλο επίπεδο πολυπλοκότητας του προβλήματος συνδέεται με την υψηλή συντήρηση της δομής των λειτουργικών θέσεων του rrna, ιδιαιτέρως μεταξύ προκαρυωτικών και μιτοχονδριακών ριβοσωμάτων, η οποία δημιουργεί περιορισμούς στο σχεδιασμό νέων αντιβιοτικών από άποψη επιλεκτικότητας και τοξικότητας (Tenson and Mankin, 2006). Κάθε στρατηγική διευθέτησης του προβλήματος της αντίστασης των παθογόνων βακτηρίων έναντι των αντιβιοτικών και η μείωση των παρενεργειών τους απαιτεί μεταξύ άλλων βαθειά κατανόηση της μοριακής βάσης του μηχανισμού δράσης των αντιβιοτικών, επίσπευση του σχεδιασμού νέων ουσιών και αναζήτηση νέων θέσεων στόχων για αντιμικροβιακή δράση. Ανταποκρινόμενοι στις ανάγκες που έχουν διαμορφωθεί, σχεδιάσαμε μια σειρά πειραμάτων με σκοπό την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού δράσης της CAM, ενός αντιβιοτικού ιδιαίτερα αποτελεσματικού, αλλά με καταγεγραμμένες παρενέργειες (Wareham and Wilson, 2002). Έχοντας διαλευκάνει το μηχανισμό δράσης του προχωρήσαμε στο σχεδιασμό μιας σειράς παραγώγων του, με σκοπό τη βελτίωση της βιολογικής του δράσης. Η κινητική και η χρονοδιαβαθμισμένη αποτύπωση αποτέλεσαν τις κύριες τεχνικές διερεύνησης του μηχανισμού πρόσδεσης των υπό μελέτη ουσιών στο ριβόσωμα. Η διαλεύκανση του μηχανισμού πρόσδεσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα ήταν ο κύριος στόχος της μελέτης, αφού το στάδιο αυτό θεωρείται βασική προϋπόθεση για την εκδήλωση της βιολογικής δράσης των αντιβιοτικών (Kalpaxis, 2012). 12 Α. In vitro μελέτες Από τα πειράματα κινητικής, συμπεραίνουμε ότι τα υπό μελέτη παράγωγα της CAM συμπεριφέρονται ως συναγωνιστικοί αναστολείς, τόσο στην αρχική, όσο και στην τελική φάση της αντίδρασης. Δεδομένου ότι οι αρχικές κλίσεις των χρονοδιαγραμμάτων μεταβάλλονται συναρτήσει της συγκέντρωσης του αναστολέα, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι τα παράγωγα αναστέλλουν την αντίδραση πουρομυκίνης, συμπεριφερόμενα ως βραδέως προσδενόμενοι αναστολείς που ακολουθούν το μηχανισμό δύο σταδίων. [148]

Ι = παράγωγο της CAM C = εναρκτήριο ριβοσωματικό σύμπλοκο (φέρει AcPhe-tRNA στην P-θέση) S = πουρομυκίνη (ψευδοϋπόστρωμα της Α-θέσης) Δηλαδή, το κάθε παράγωγο (Ι) αντιδρά αρχικά σε ένα γρήγορο βήμα με το σύμπλοκο C και σχηματίζει το σύμπλοκο CI, το οποίο στη συνέχεια σε ένα δεύτερο αργό βήμα ισομερίζεται αργά στο πιο σταθερό σύμπλοκο C*I. Συγκεκριμένα, στα πολυαμινικά παράγωγα, το ΚΑ240 (Κ i = 0,975 μμ και Κ * i = 0,28 μμ), που φέρει μία σπερμιδίνη στο μόριο της CAM, με υποκαταστημένα τα πρωτόνια της Ν8-αμινομάδας από βενζυλομάδες, είναι τρεις φορές πιο δραστικό από την CAM (Κ i = 3,1 μμ και Κ * i = 0,88 μμ). Άρα, η σύζευξη της σπερμιδίνης στην CAM μέσω της Ν4-δευτεροταγούς αμινομάδας και το υδρόφοβο περιβάλλον των βενζυλομάδων επιτρέπει την ισχυρότερη πρόσδεσή του στο ριβόσωμα. Σε αντίθεση, το παράγωγο F5 (Κ i = 2,2 μμ και Κ * i = 0,75 μμ) στο οποίο η πολυαμίνη είναι προσδεδεμένη στη N 1 αμινομάδα, χάνει μέρος της δραστικότητάς του. Τα παράγωγα mag221 (Κ i = 3,6 μμ Κ * i = 1,2 μμ) και mag217, με παρόμοια δομή προς ΚΑ240, αλλά χωρίς υποκαταστημένη την Ν8-αμινομάδα από αρωματικούς δακτυλίους, είναι λιγότερο δραστικά από την CAM. Επομένως, ο αρωματικός δακτύλιος φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα του μορίου. Άλλο δραστικό πολυαμινικό παράγωγο της CAM είναι το CLB3 (Κ i = 2,1 μμ και Κ * i = 0,6 μμ) που φέρει συζευγμένη μία σπερμίνη στην ακραία πρωτοταγή αμινομάδα. Αντίθετα με τα παράγωγα που φέρουν στο μόριο της CAM προσκολλημένη σπερμίνη και σπερμιδίνη και δρουν ισχυρότερα στο ριβόσωμα από τη μητρική ένωση, τα παράγωγα που φέρουν μια πουτρεσκίνη δεν προσδένονται τόσο ισχυρά. Υπήρχε μεγάλη προσδοκία ότι η προσθήκη πολυαμίνης στην πρωτοταγή υδροξυλομάδα θα είχε θετικά αποτελέσματα στην πρόσδεση της CAM, δεδομένoυ ότι [149]

από την κρυσταλλογραφική ανάλυση της Yonath δημιουργείται και δεσμός συναρμογής μεταξύ της υδροξυλομάδας αυτής και ενός υποτιθέμενου Mg 2+ (Εικόνα 12.1). Εικόνα12.1: Αλληλεπίδραση χλωραμφαινικόλης με την πεπτιδυλoτρανσφεράση. Το σχήμα δείχνει τις αλληλεπιδράσεις (βέλη) των δραστικών ομάδων της χλωραμφαινικόλης με τα νουκλεοτίδια του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Schlunzen et al.,2001). Το παράγωγο αυτό στην πραγματικότητα συντέθηκε (CL29), αλλά η in vitro δράση του στο σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού ήταν ιδιαιτέρως ασθενής. Το αποτέλεσμα δικαιολογείται από νεότερα κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Dunkle et al., 2010; Bulkley et al., 2010), τα οποία υποστηρίζουν ότι η CAM προσδένεται στο ριβόσωμα με αντίθετο προσανατολισμό, που κατευθύνει την πρωτοταγή υδροξυλομάδα σε διαφορετική θέση από εκείνη του Mg 2+. [150]

Εικόνα 12.2: Πρόσδεση της CAM στο ριβόσωμα του E.coli. Η CAM (πορτοκαλί χρώμα) προσδένεται στην Α-θέση του ριβοσώματος του E.coli. Οι δεσμοί υδρογόνου παρουσιάζονται με μαύρες διακεκομμένες γραμμές (Dunkle et al., 2010). Για την επιβεβαίωση της κινητικής συμπεριφοράς των παραγώγων και την υποστήριξη της αξιοπιστίας των κινητικών δεδομένων, ο μηχανισμός πρόσδεσης της μητρικής ένωσης και των παραγώγων της διερευνήθηκε περαιτέρω με την τεχνική της χρονοδιαβαθμισμένης αποτύπωσης. Η εφαρμογή της τεχνικής αυτής επιβεβαίωσε καταρχήν τη δύο-βημάτων πρόσδεση της CAM, κατά την οποία αρχικά το αντιβιοτικό δεσμεύεται βαθειά στη σχισμή της A-θέσης και έπειτα στρέφεται βραδέως προς το νουκλεοτίδιο A2062, προκαλώντας σε αυτό διαμορφωτικές αλλαγές. Οι αλλαγές αυτές μεταφέρονται αλλοστερικά στα νουκλεοτίδια A2058 και A2059 που εντοπίζονται στην είσοδο του καναλιού εξόδου της πεπτιδικής αλυσίδας (Εικόνα 12.3). Επομένως, η ετερογενής αποτύπωση μπορεί να μη σχετίζεται με δύο θέσεις πρόσδεσης της CAM, αλλά με αλλοστερικά φαινόμενα (Kostopoulou et al., 2010). Το αποτέλεσμα αυτό, πέρα της βαρύτητας στην παρούσα μελέτη, τερματίζει ουσιαστικά μια πολύχρονη επιστημονική αντιπαράθεση για τη θέση δέσμευσης της CAM στο ριβόσωμα (Dunkle et al., 2010). [151]

Εικόνα 12.3: Θέση δέσμευσης της CAM στο ριβόσωμα του E.coli, όπως ανιχνεύεται με κρυσταλλογραφία, PDB ID κώδικα 30FC (Dunkle et al., 2010). Οι δεσμοί υδρογόνου εμφανίζονται ως κίτρινες παύλες. Η εφαρμογή της ανάλυσης αποτυπώματος (footprinting analysis) στο σύμπλοκο ριβοσώματος-κα240 κατέληξε σε παρόμοιο μοτίβο αποτυπώματος με εκείνο της μητρικής ένωσης. Επειδή η πολυαμινική ουρά του ΚΑ240 δεν είναι αρκούντος μακριά να φτάσει το Α2059, το φαινόμενο φαίνεται να δικαιολογείται παρομοίως από αλλοστερισμό. Θα πρέπει μάλλον να παραδεχθούμε, ότι ένας εκ των βενζολικών δακτυλίων του ΚΑ240 επιστοιβάζεται στο δακτύλιο της αδενίνης Α2062, προκαλώντας αλλαγή διαμόρφωσης, η οποία μέσω του Α2503 μεταδίδεται στην είσοδο του καναλιού εξόδου. Η αδυναμία του παραγώγου F5 να προκαλέσει αλλαγές στη δραστικότητα των νουκλεοτιδίων Α2062 και Α2059 έναντι του χημικού τροποποιητή DMS, πιθανώς οφείλεται στην αδυναμία επιστοίβαξης του βενζυλικού δακτυλίου επί της Α2062, λόγω του εκτεταμένου βραχίονα που τον διαχωρίζει από τον κορμό της CAM. Όσον αφορά τα νουκλεοτίδια που βρίσκονται προς το καταλυτικό κέντρο, το ΚΑ240 δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της Α2602 έναντι του DMS. Αντίθετα, το F5 δείχνει ισχυρή επιρροή προς το νουκλεοτίδιο αυτό, όταν έχει σχηματιστεί το σύμπλοκο C * I. Επειδή το νουκλεοτίδιο Α2602 συμμετέχει στο μηχανισμό συστροφής (rotary motion) του αα-trna της Α θέσης γύρω από τον άξονα συμμετρίας του καταλυτικού κέντρου (Agmon et al., 2004) (Εικόνα 12.4), φαίνεται ότι το παράγωγο F5 εκδηλώνει την ανασταλτική του δράση, μέσω απενεργοποίησης του μηχανισμού συστροφής. Tο F5 προστατεύει επίσης το U2585 από τον τροποποιητή CMCT μετά [152]

από προεπώαση (+Pi). Το U2585 είναι το δεύτερο νουκλεοτίδιο που συμμετέχει στο μηχανισμό συστροφής (rotary motion). Και τα δύο νουκλεοτίδια είναι συντηρημένα και αποτελούν θέσεις δέσμευσης πολυαμινών (Xaplanteri et al., 2005). Εικόνα 12.4: Μοντέλο για το μηχανισμό συστροφής (rotary motion) που έχει προταθεί από την ερευνητική ομάδα της A.Yonath. Τα εμπλεκόμενα νουκλεοτίδια Α2602 και U2585 στο μηχανισμό παρουσιάζονται με μωβ και κόκκινο αντίστοιχα (Agmon et al., 2004). Είναι σημαντικό, ότι τα δύο παράγωγα προκαλούν προστασία στο Α2451 και στο U2506, τόσο στην αρχική, όσο και στην τελική θέση πρόσδεσής τους. Η προστασία στο Α2451 δικαιολογεί το συναγωνιστικό χαρακτήρα αναστολής των αντιβιοτικών στην αντίδραση πουρομυκίνης και εξηγεί ότι η νιτροβενζυλοομάδα των παραγώγων και στις δύο περιπτώσεις τοποθετείται στην υδρόφοβη σχισμή του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος (Α2451, C2452, U2506). Παρότι οι κρυσταλλογραφικές μελέτες δείχνουν ότι η C2452 συνδέεται με τη μητρική ένωση της CAM (Dunkle et al., 2010), η συμμετοχή αυτού του νουκλεοτιδίου δεν μπορεί να αξιολογηθεί διότι δεν παρέχει αποτύπωμα. Η μητρική ένωση και το ΚΑ240 παρέχουν το ίδιο αποτύπωμα στο νουκλεοτίδιο G2505, γεγονός που υποστηρίζει περαιτέρω το κοινό μηχανισμό δράσης τους. Αντίθετα, το F5 ενισχύει το αποτύπωμα στο εν λόγω νουκλεοτίδιο, όταν καταλαμβάνει την τελική θέση πρόσδεσης. Αυτό συνεπάγεται, ότι οι πολυαμινικές ουρές του F5 και το ΚΑ240 έχουν διαφορετικό προσανατολισμό στην κάθε περίπτωση και επηρεάζουν διαφορετικούς συντελεστές του καταλυτικού μηχανισμού. Στη δεύτερη κατηγορία παραγώγων της CAM που μελετήσαμε, τα διμερή, το μήκος και η ευλυγισία του συνδέτη παίζουν καθοριστικό ρόλο στην πρόσδεση των [153]