ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ: «ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΖΩΗΣ» ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ: «ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΖΩΗΣ» ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΟΥΣΤΕΝΗΣ Διπλωματική εργασία με τίτλο Στατιστική Ανάλυση Σχέσης Δομής Δράσης Πουρινικών και Οξινδολικών παραγώγων Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας Τμήμα Φαρμακευτικής Επιβλέπων Καθηγητής Σ. Νικολαρόπουλος ΠΑΤΡΑ 212 1

Περιεχόμενά ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 3 Ο ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ... 4 Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου... 5 Έλεγχος του κυτταρικού κύκλου... 6 Ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου... 7 CDKs... 8 Δομή και δράση... 8 Η οικογένεια CDK... 9 Ο ρόλος των CDK στον κυτταρικό κύκλο... 15 Ρύθμιση των CDK... 19 Αναστολείς CDK... 22 ΣΚΟΠΟΣ... 38 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 4 Ανεύρεση βιβλιογραφίας... 41 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 43 Οξινδόλικα παράγωγα:... 44 Πουρίνες... 64 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 85 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ:... 87 2

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3

Ο ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Ο κυτταρικός κύκλος είναι η διαδικασία με την οποία ένα κύτταρο διαιρείται σε δύο κύτταρα. Θεματικά, μπορούμε να διακρίνουμε ανάμεσα στο χρωμοσωμικό κύκλο (αντιγραφή του DNA, ακολουθούμενη από φυσικό διαχωρισμό των δύο πλήρες γενωμάτων σε θυγατρικά χρωμοσώματα) και τον αναπτυξιακό κύκλο (αντιγραφή όλων των μονάδων και συστατικών ενός κυττάρου πρωτεΐνες, μεμβράνες, οργανίλια και ο φυσικός τους διαχωρισμός σε θυγατρικά κύτταρα. Είναι βασικό το γεγονός πως το γονιδίωμα αντιγράφεται επακριβώς και καταμερίζεται προσεκτικά στους θυγατρικούς πυρήνες, έτσι ώστε κάθε νέο κύτταρο να περιέχει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες για να διαιωνίσει τον κυτταρικό τύπο. Ο κύκλος ανάπτυξης μπορεί να είναι λίγο πιο αδέξιος. Το νέο κύτταρο χρειάζεται ένα συγκεκριμένο ελάχιστο συμπλήρωμα δομών και μηχανικής για να επιβιώσει, αλλά μικρές αλλαγές στον διαχωρισμό μπορούν να αντισταθμιστούν από τη σύνθεση μακρομορίων από το γονιδίωμα. Παρόλα αυτά, είναι βασικό οι κύκλοι των χρωμοσωμάτων και της ανάπτυξης συντονίζονται μακροπρόθεσμα, έτσι ώστε τα κύτταρα να αντιγράφουν το γενετικό τους υλικό και να διαιρούνται σε δύο από έναν παράγοντα. Όπου δεν συμβαίνει αυτό, τα κύτταρα θα γίνονται σταδιακά μεγαλύτερα ή μικρότερα σε κάθε γενιά, με θανάσιμες επιπτώσεις σε κάθε περίπτωση. 4

Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ο χρωμοσωμικός κύκλος αποτελείται από δύο βασικές διαδικασίες: τη σύνθεση του DNA (φάση S) και τη μίτωση (φάση Μ). Κατά τη φάση S, τα διπλής αλυσίδας μόρια του DNA αντιγράφονται για να παράγουν τις αδελφές χρωματίδες, οι οποίες συνδέονται με πρωτεΐνες που λέγονται κοχεσίνες. Η φάση Μ αποτελείται από 4 υποφάσεις: την πρόφαση, όπου τα αντιγραμμένα χρωμοσώματα συμπυκνώνονται σε συμπαγείς δομές, την μετάφαση, όπου τα συμπυκνωμένα χρωμοσώματα αντιπαρατίθενται στο μεσαίο επίπεδο της μιτωτικής ατράκτου, την ανάφαση, όπου οι κοχεσίνες αποικοδομούνται και οι αδελφές χρωματίδες διαχωρίζονται σε δύο χωριστές δέσμες και η τελόφαση, όπου σχηματίζεται ο θυγατρικός πυρήνας και το κύτταρο ξεκινάει τη διαίρεση του. Οι φάσεις S και M διαχωρίζονται χρονικά από τις φάσεις G1 και G2. Έτσι ο κυτταρικός κύκλος δομείται ως εξής: G1-S- G2-M[1-3]. Εικόνα 1: Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Ο κυτταρικός κύκλος αποτελείται από 4 φάσεις, την G1, την S, την G2 και την M. 5

Έλεγχος του κυτταρικού κύκλου Η εναλλαγή των φάσεων S και M χρονικά είναι κρίσιμη. Αν ένα απλοειδές κύτταρο προσπαθήσει δύο πυρηνικούς μιτωτικούς διαχωρισμούς στη σειρά, χωρίς να παρεμβαίνει η φάση S, οι απόγονοι του θα κληρονομήσουν μη ολοκληρωμένα γονιδιώματα και θα πεθάνουν. Επαναλαμβανόμενες φάσεις S, χωρίς παρεμβαλόμενες μιτωτικές φάσεις, δεν είναι άμεσα θανατηφόρες (παράγονται μεγάλα, πολυπλοειδή κύτταρα) αλλά είναι ασυνήθιστα για τα κύτταρα (γίνεται μόνο σε πολύ συγκεκριμένα κύτταρα). Η σωστή πρόοδος του κυτταρικού κύκλου, δηλαδή η εναλλαγή των φάσεων S και M και ο συντονισμός της ανάπτυξης και του διαχωρισμού, διαβεβαιώνεται από τα σημεία ελέγχου (checkpoints), που ελέγχουν κρίσιμες μεταφορές από τη μια φάση στην άλλη του χρωμοσωμικού κύκλου. Το σημείο ελέγχου G1 ελέγχει την είσοδο στη φάση S, κάνοντας σίγουρο πως: 1) Τα κύτταρα είναι αρκετά μεγάλα για να εγγυηθούν ένα νέο γύρο σύνθεσης DNA, 2) Όποια ζημιά έχει υποστεί το DNA έχει επιδιορθωθεί 3) Οι εξωτερικές συνθήκες είναι κατάλληλες για μιτωτική διαίρεση των κυττάρων. Το σημείο ελέγχου G2 ελέγχει την είσοδο στην φάση M σιγουρεύοντας ότι: 6

1) Το DNA έχει αντιγραφεί πλήρως 2) Κάθε νέα βλάβη έχει επιδιορθωθεί 3) Το κύτταρο είναι αρκετά μεγάλο για να διαιρεθεί Το σημείο ελέγχου της μετάφασης ελέγχει την μεταφορά από την μετάφαση στην ανάφαση. Τα χρωμοσώματα πρέπει να είναι κατάλληλα διατεταγμένα στη μιτωτική άτρακτο, με τις αδελφές χρωματίδες να βρίσκονται σε αντίθετους πόλους πριν αποικοδομηθούν οι κοχεσίνες. Αν προκύψουν προβλήματα στην δημιουργία της μιτωτικής ατράκτου ή στη διάταξη των χρωμοσωμάτων, το σημείο ελέγχου της μετάφασης μπλοκάρει την ενεργοποίηση του δικτύου εξόδου από τη μίτωση[2-6]. Ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου Επειδή ο κυτταρικός κύκλος παίζει κεντρικό ρόλο σε όλες τις διαδικασίες της βιολογικής ανάπτυξης, αναπαραγωγής και ανάπτυξης, οι κυτταρικοί βιολόγοι επένδυσαν μεγάλη προσπάθεια στην ανακάλυψη των μοριακών κομματιών και των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο. Τα κύρια μόρια του κυτταρικού κύκλου είναι ένζυμα που καλούνται πρωτεϊνικές κινάσες εξαρτώμενες από τις κυκλίνες (cyclins-dependent protein kinases, CDKs). Όπως υποδεικνύει το όνομα τους, οι CDKs για να είναι ενεργές απαιτούν την παρουσία μια κυκλίνης. Όταν οι CDKs συνδέονται με τις κατάλληλες κυκλίνες τότε ενεργοποιούν κύριες διεργασίες του χρωμοσωμικού κύκλου (αντιγραφή DNA, αποδόμηση πυρηνικού φακέλου, συμπύκνωση χρωμοσωμάτων, σχηματισμός ατράκτου) μέσω φωσφορυλίωσης συγκεκριμένων πρωτεϊνών στα χρωμοσώματα και αλλού. Η πτώση της μιτωτικής δράσης των CDK στην ανάφαση επιτρέπει στα κύτταρα να διαιρεθούν και να εισέλθουν στη φάση G1 του επόμενου κυτταρικού κύκλου. Έτσι, η 7

πρόοδος των ευκαρυωτικών κυττάρων μέσα από αυτές τις μεταφορές μεσολαβείται από την διαδοχική ενεργοποίηση και απενεργοποίηση των CDK[7, 8]. CDKs Οι CDK είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών με δράση κινάσης σερίνης/θρεονίνης των οποίων η δράση εξαρτάται από επικοινωνία με μια μη καταλυτική ρυθμιστική υπομονάδα την κυκλίνη. Οι κυκλίνες ονομάστηκαν έτσι αρχικά λόγω της περιοδικής τους ενεργοποίησης και αποδόμησης κατά τον κυτταρικό κύκλο[9]. Αυτή η περιοδική έκφραση ρυθμίζεται από την de novo σύνθεση και αποικοδόμηση[1]. Δομή και δράση Οι CDK καταλύουν τη μεταφορά του γ-φωσφορικού του ATP στις υδροξυλικές ομάδες των πλαϊνών αλυσίδων των καταλοίπων σερίνης ή θρεονίνης των πρωτεϊνών στόχων. Γενικά οι CDK αποτελούνται από έναν «καταλυτικό πυρήνα» κινάσης πρωτεΐνης περίπου 3 αμινοξέων. Οι CDK χαρακτηρίζονται από την ομοιότητα της αλληλουχίας τους και από την εξάρτηση τους κατά την σύνδεση της κυκλίνης για πλήρη ενεργότητα. Συγκεκριμένα χαρακτηριστικά των αλληλουχίων τους περιλαμβάνουν ένα εκφυλισμένο μοτίβο PSTAIRE, ο βρόγχος γλυκίνης και ένα ειδικό ένθεμα CDK. Το μοτίβο PSTAIRE αποτελεί τις πρώτες στροφές της «C-έλικας» στην Ν-τελική περιοχή της κινάσης, ενώ το ειδικό ένθεμα τοποθετείται στο C-τελικό άκρο μετά την «G-έλικα». Ο βρόγχος γλυκίνης περιέχει το GXGXXG μοτίβο που είναι συντηρημένο μέσα στην πρωτεϊνική οικογένεια και είναι σημαντικό για τη δέσμευση του ATP[11]. 8

Εικόνα 2: Η δομή των CDKs. Η οικογένεια CDK Τα θηλαστικά περιέχουν 21 γονίδια που κωδικοποιούν CDKs και πρόσφατα προτάθηκε η νέα ονομασία τους[12]. Τα πρώτα μέλη της οικογένειας ανακαλύφθηκαν σε γενετικές μελέτες σε μεταλλαγμένα είδη των Saccharomyces Pombe και Saccharomyces cerevisiae, όπου βρέθηκε πως εμπλέκονται σε συγκεκριμένα στάδια της κυτταρικής διαίρεσης[13]. Αυτές οι πρωτεΐνες που απομονώθηκαν ονομάστηκαν cdc2 και cdc28 και χαρακτηρίστηκαν έπειτα από εφαρμογή μεθόδων γενετικής και μοριακής βιολογίας. Κατόπιν αντίστοιχα ομόλογες πρωτεΐνες της cdc2 αναγνωρίστηκαν και στα θηλαστικά[14]. Έπειτα αναγνωρίστηκε από τον Hanks που το όρισε ως PSK-13[15], αργότερα η Cdk2[16-19] και κατόπιν χάρη στην εφαρμογή της μεθόδου PCR ανακαλύφθηκαν και άλλα μέλη της οικογένειας των CDK[2-23]. Η cdc2 μετονομάστηκε σε Cdk1, η PSK-13 σε Cdk4, ενώ τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας είναι τα Cdk5, Cdk6, Cdk7, Cdk8, Cdk9, Cdk1 και Cdk11[24-28]. 9

Όπως αναφέρθηκε οι CDK πάντα συνδέονται με μια κυκλίνη για να δράσουν. Οι κυκλίνες ανακαλύφθηκαν σε μελέτες που έγιναν σε αυγά αχινού και επίσης έδειξαν να επάγουν τη μείωση στο Xenopus laevis[29]. Επιπλέον, απομονώθηκαν συγγενείς πρωτεΐνες από το S. Pombe, το S.cerevisiae αλλά και ανθρώπινα κύτταρα. Η βιοχημική σύνδεση ανάμεσα στις CDK και τις κυκλίνες βρέθηκε πρώτη φορά στα ωοκύτταρα του Xenopus laevis όταν οι επιστήμονες είδαν τη σύνδεση ανάμεσα στη Cdk1 και την κυκλίνη Α αλλά και την κυκλίνη Β[3]. Οι κυκλίνες χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες: 1

Εικόνα 3: Η οικογένεια των CDKs των θηλαστικών. 11

Κυκλίνες Α: Υπάρχουν δύο κυκλίνες Α, η Α1 και Α2 και ο ρόλος τους είναι να διεγείρουν την έναρξη αντιγραφής του DNA, προωθώντας διάφορα γεγονότα μέσα στο στάδιο της μίτωσης. Κυκλίνες Β: Αυτή η ομάδα κυκλινών έχει πρωταγωνιστικό ρόλο στη μίτωση, καθώς αυξάνονται κατά τη διάρκεια της και όταν καταστρέφονται μαζί με τις κυκλίνες Α το κύτταρο φεύγει από τη φάση της μίτωσης. Κυκλίνες D ή G1: Ο ρόλος τους είναι να διεγείρουν την έναρξη ενός νέου κυτταρικού κύκλου με το τέλος της φάσης G. Υπάρχουν τρεις κυκλίνες D, η D1, η D2 και η D3 και τα σύμπλοκα τους εκφράζονται ανάλογα με την εξειδίκευση του ιστού. Κυκλίνη Ε: Ο ρόλος της είναι να επάγει την αντιγραφή του DNA και των κεντροσωμάτων. Οι κυκλίνες είναι λιγότερο συντηρημένες από ότι οι CDKs. Διακρίνονται για την συσσώρευση τους στην μεσόφαση και την γρήγορη πρωτεόλυση τους στη μίτωση[31]. Η ομοιότητα ανάμεσα στις κυκλίνες από διαφορετικά είδη περιορίζεται σε μια περιοχή περίπου 1 αμινοξέων που καλείται «cyclin box». Ενζυματικές μετρήσεις ενεργότητας της κινάσης μονομερών CDK και CDK με προσδεμένη κυκλίνη δείχνουν μια αύξηση 4 φορές στην ενεργότητα της κινάσης[32]. Η σύγκριση της δομής της μονομερούς Cdk2 με το σύμπλοκο Cdk2-Cyclin Α δείχνει πως η πρόσδεση της κυκλίνης προκαλεί δραματικές αλλαγές στη δομή. Η επίπτωση είναι μια αναδιάταξη των καταλυτικών καταλοίπων μέσα στην περιοχή που προσδένεται το ΑΤΡ στη CDK οδηγώντας στην ενεργοποίηση της. Επίσης, έχει δειχτεί πως διαφορετικές κυκλίνες μπορούν να προσδέσουν 12

την ίδια CDK in vivo και in vitro. Η σημασία του «cyclin box» αποδείχτηκε μετά από ανάλυση μεταλλάξεων καθώς είναι σημαντικό για την αλληλεπίδραση κυκλίνης και CDK. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από την κρυσταλλική δομή του συμπλόκου Cdk2/Cyclin A[33,34]. Οι CDKs για να δράσουν δημιουργούν σύμπλοκα με τις κυκλίνες και ρυθμίζουν τη μεταφορά από τη μια φάση του κυτταρικού κύκλου στην άλλη. Τα σύμπλοκα των Cdk4-CyclinD, Cdk6-CyclinD και Cdk2- CyclinE ελέγχουν τη μεταφορά από τη φάση G στη φάση G1 και τις πρώιμες φάσεις της G1 μέσω της φωσφορυλίωσης της Rb. Τα σύμπλοκα Cdk2-CyclinE εμπλέκονται, επίσης, στην μεταφορά από τη φάση G1 στη φάση S. Η Cdk2 μπορεί επίσης να αλληλεπιδρά με την κυκλίνη Α κατά τη διάρκεια της φάσης S. Το σύμπλοκο Cdk1-CyclinA συμμετέχει στην μεταφορά από τη φάση S στη φάση G2 και το σύμπλοκο Cdk1-CyclinB ελέγχει τη μεταφορά από τη φάση G2 στην φάση Μ[35]. Η Cdk3 επίσης συμμετέχει στη φωσφορυλίωση της Rb. Είναι αρκετά όμοια με τις Cdk2 και Cdk1 και αλληλεπιδρά με τις κυκλίνες Ε και Α. Η Cdk5 ενεργοποιείται από τις πρωτεΐνες p35 και p39, οι οποίες δεν είναι κυκλίνες και εκφράζονται κυρίως στον εγκέφαλο. Η Cdk5 κυρίως ενεργεί στα νευρικά κύτταρα και εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης, της μεταγραφής, της μετανάστευσης και της μεμβρανικής μεταφοράς[36]. Η Cdk7 είναι μια μονάδα του γενικού μεταγραφικού παράγοντα TFIIH και εμπλέκεται στη μεταγραφή[37]. Η Cdk8 συνδέεται με την κυκλίνη C και η Cdk9 με την κυκλίνη T και εμπλέκονται και οι δύο στη ρύθμιση της μεταγραφής. Ως τώρα, καμία κυκλίνη δεν βρέθηκε να δημιουργεί σύμπλοκο με την Cdk1. Παρόλα αυτά, αυτή η κινάση φέρεται να μετέχει στη ρύθμιση της μεταφοράς από τη φάση G2 στη φάση Μ[38]. Η Cdk11 συνδέεται με την κυκλίνη L και εμπλέκεται στο 13

μάτισμα του mrna[39]. Επίσης αλληλεπιδρά με την κυκλίνη D και καταστέλλει την διαίρεση[4]. Εικόνα 4: Η οικογένεια των κυκλινών στα θηλαστικά. 14

Ο ρόλος των CDK στον κυτταρικό κύκλο Το πρωταρχικό σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που συντονίζει την κυτταρική ανάπτυξη με κυτταρική διαίρεση καλείται «START» στις ζύμες και «σημείο περιορισμού» στα κύτταρα των θηλαστικών. Πέρα από αυτό το σημείο τα κύτταρα εισέρχονται σε ένα νέο κύκλο κυτταρικής διαίρεσης[41]. Οι γενετικές αναλύσεις έδειξαν πως εκεί ενεργεί η Cdk1, η ενεργότητα της οποίας είναι απαραίτητη, όχι μόνο για την είσοδο στη φάση S, αλλά και για τη μίτωση. Στις ζύμες, ο χρόνος του START προσδιορίζεται από την ενεργότητα των κυκλινών G1(κυκλίνες C, D1 και Ε) που ονομάζονται Clns. Ο έλεγχος των Cln1 και Cln2 παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση του περάσματος μέσα από αυτό το σημείο. Η μεταγραφή αυτών των δύο κυκλινών μπορεί να προσδιορίσει πότε τα κύτταρα υπόκεινται στο START. Μελέτες έδειξαν πως η Cln3 είναι αποτελεσματική για την ενεργοποίηση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων του START, ενώ οι Cln1 και Cln2 έχουν πιο ειδικό ρόλο στην ρύθμιση άλλων γεγονότων που ρυθμίζονται από το START, όπως η αντιγραφή του DNA, η απόκτηση της αντίστασης στη φερομόνη και αναστολή του Clb2[43,44]. Στα κύτταρα των θηλαστικών τα σύμπλοκα των κυκλίνων D1 και E φαίνεται να ελέγχουν το σημείο περιορισμού[45]. Και οι δύο κυκλίνες συντίθενται κατά το διάστημα της φάσης G1 και περιορίζουν τον ρυθμό για την είσοδο στη φάση S[46]. Η υπερβολική παραγωγή της κυκλίνης D ή της κυκλίνης E ατομικά έχει μια μέτρια επίδραση στη διάρκεια της φάσης G1, ενώ η υπερπαραγωγή και των δύο ταυτοχρόνως συντομεύει την συγκεκριμένη περίοδο του κυτταρικού κύκλου σημαντικά[47-49]. Οι κυκλίνες D σχηματίζουν σύμπλοκα με τις Cdk4 και Cdk6 και ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα όπως αυξητικοί παράγοντες, αντιμιτογονικοί παράγοντες, επαφή αναστολής και άλλους παράγοντες. Σε αντίθεση, η κυκλίνη Ε, η κυκλίνη Α και η κυκλίνη Β ρυθμίζονται περιοδικά μέσα στον κυτταρικό κύκλο. 15

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο Rb αποτελεί τον κύριο στόχο των συμπλόκων Cdk/CyclinD[5-51]. Η φωσφορυλίωση του Rb από τα σύμπλοκα Cdk/CyclinD στο σημείο ελέγχου, ή κοντά σε αυτό προκαλεί την λειτουργική του απενεργοποίηση, επιτρέποντας έτσι την μεταγραφή των γονιδίων που μεσολαβούν πριν το κύτταρο εισέλθει στη φάση S. Τα σύμπλοκα Cdk2/CyclinE συμβάλλουν στη φωσφορυλίωση του Rb αργά κατά τη φάση G1 και έχουν ρόλο στην ενεργοποίηση της ακριβής έναρξης της αντιγραφής του DNA μόλις τα κύτταρα περάσουν το σημείο ελέγχου[]. Μόλις τα κύτταρα περάσουν το σημείο START, τα σύμπλοκα Cdk/Cyclin της φάσης S φωσφορυλιώνται και ενεργοποιούν πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του DNA. Στις ζύμες, η ενεργότητα της κινάσης που συνδέεται με την Clb5 και τα σύμπλοκα Clb6/Cdc28 εμπλέκεται στην προώθηση της μεταγραφής του DNA αν και, όταν απουσιάζουν και οι δύο κυκλίνες, οι κυκλινες Clb1-Clb4 μπορούν να αντικαταστήσουν αυτή τη λειτουργία[52]. Αν τα κύτταρα στερούνται και τις έξι Clbs, τότε αποτυγχάνει να μπει στη φάση S[53]. Τα γονίδια CLB3 και CLB4 κωδικοποιούν δύο κυκλίνες Β που εκφράζονται πριν την έναρξη της φάσης S μέχρι αργά στη μίτωση[54,55]. Η δράση της κινάσης που σχετίζεται με αυτές τις κυκλινες προάγεται από την πρώιμη S φάση ως και τη μίτωση. Αυτή η ενεργότητα απαιτείται να εμπλέκεται στην αντιγραφή του DNA αν και η διαγραφή και των δύο γονιδίων δεν διαταράσσει καθόλου τον κυτταρικό κύκλο. Οι Clb3 και Clb4 παίζουν επίσης ρόλο στην πρώιμη δημιουργία της ατράκτου καθώς και στη μείωση ΙΙ[56]. 16

Στα κύτταρα των θηλαστικών, η Cdk2 είναι κλειδί για την έναρξη της αντιγραφής του DNA[57]. Οι κυκλίνες Ε και Α διαδοχικά ενεργοποιούν την Cdk2 για να οδηγήσουν τα κύτταρα στη φάση S[58-6]. Η εξουδετέρωση της λειτουργίας της κυκλίνης Α με μικροέγχυση αντισωμάτων μπλοκάρει τον κυτταρικό κύκλο στη μετάβαση G1/S[61]. Επιπλέον, τα σύμπλοκα Cdk2/CyclinA συν-εντοπίζονται με τις περιοχές στους πυρήνες της αντιγραφής του DNA στην S φάση[62] δείχνοντας ένα πιθανό άμεσο ρόλο στην αρχική ρύθμιση της αντιγραφής. Όταν τα ειδικά αντισώματα για την κυκλίνη Α εγχέονται κατά τη διάρκεια της φάσης S ή μετά από αυτή, τα κύτταρα που ολοκληρώνουν την σύνθεση του DNA δεν είναι ικανά να εκκινήσουν τη μίτωση και σταματάνε στην φάση G2[61]. Όλα αυτά αποδίδουν διπλό ρόλο στην πρωτεΐνη αυτή, τη ρύθμιση της σύνθεσης του DNA και συμμετοχή στην προαγωγή της μίτωσης. Η έναρξη της φάσης Μ ρυθμίζεται από ένα σύμπλοκο δίκτυο θετικών και αρνητικών δραστηριοτήτων που οργανώνονται σε ένα καταρράκτη που συντίθεται από πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες. Αυτό το μονοπάτι ρυθμίζει την δραστηριότητα της CDK κινάσης. Η Cdk1 σχηματίζει σύμπλοκα με διαφορετικές κυκλίνες της μίτωσης (Α και Β στα θηλαστικά και cdc13, Clb1-Clb2 στις ζύμες). Η Cdk1/CyclinB κινάση διατηρείται σε μια ανασταλμένη κατάσταση κατά τη διάρκεια της μεσόφασης και αυξάνεται δραματικά στη μετάβαση G2/M[63]. Η ενεργοποίηση αυτής της κινάσης είναι απαραίτητη αλλά όχι αρκετή για την ολοκλήρωση της μίτωσης. Η καταστροφή αυτών των μιτωτικών συμπλόκων είναι απαραίτητη για την έξοδο από τη μίτωση[64]. Μελέτες τόσο σε ζύμες όσο και σε θηλαστικά έδειξαν πως η πρωτεόλυση της Clb περιορίζεται στην μιτωτική περίοδο του κυτταρικού κύκλου αλλά συνεχίζεται και κατά τη διάρκεια της φάσης G1[65,66]. 17

Η δράση του συμπλόκου Cdk1/Cyclin στη φάση S και στη φάση G2 είναι επίσης αναγκαία για να εμποδίσει έναν ακόμα γύρο αντιγραφής του DNA μέσα στον ίδιο κυτταρικό κύκλο. Σε μελέτες που έγινα στις ζύμες για μεταλλαγμένα κύτταρα που υπόκεινται σε επαναλαμβανόμενη μεταγραφή έδειξαν μεταλλάξεις στα γονίδια cdc2 και cdc13[67,68]. Μια εξήγηση για τη σύζευξη της μίτωσης με την υποκείμενη αντιγραφή του DNA προάγεται από την καταστροφή της κυκλίνης και την απενεργοποίηση της CDK. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, η παρουσία των μιτωτικών συμπλόκων προσδιορίζει τα κύτταρα στην G2 φάση και η καταστροφή τους στη μίτωση επαναφέρει τα κύτταρα στην G1 επιτρέποντας μια νέα φάση S[69,7]. Εικόνα 5: Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. 18

Ρύθμιση των CDK Η προαγωγή από το ένα στάδιο του κυτταρικού κύκλου σε ένα άλλο ρυθμίζεται από την μεταγραφή των γονιδίων των κυκλινών, την υποβάθμιση των κυκλινών και την τροποποίηση των υπομονάδων κινάσης μέσω φωσφορυλίωσης. Παρόλο που οι CDKs που παράγονται βακτηριακά in vitro σχηματίζουν σύμπλοκα με τις κυκλίνες εν απουσία κάθε φωσφορυλίωσης, δείχνουν ελάχιστα ανιχνεύσιμη δράση κινάσης Η1[71]. Αυτή η δράση αυξάνεται κατά 1 φορές μόλις φωσφορυλιωθεί ένα υψηλά συντηρημένο αμινοξύ θρεονίνης (Τ16 στη Cdk2) στην περιοχή VIII (περιλαμβάνει το βρόγχο Τ) όλων των μελών της οικογένειας CDK από μια κινάση ενεργοποίησης της CDK (CAK)[72,73]. Αυτή η διαδικασία ευνοείται πάρα πολύ από την πρόσδεση της κυκλίνης, επειδή η πρόσδεση προκαλεί μια σημαντική αλλαγή σε αυτή την περιοχή. Η αλλαγή απομακρύνει τον αποκλεισμό που επιβάλλεται από τον βρόγχο T στην καταλυτική σχισμή και περαιτέρω εκθέτει το κατάλοιπο θρεονίνης, κάνοντας το πιο προσβάσιμο στην CAK[33]. Επίσης, αυτή η φωσφορυλίωση βοηθάει στη σταθεροποίηση του συμπλόκου Cdk/Cyclin[74,75]. Μελέτες έδειξαν την CAK ως ένα πολυμερικό ένζυμο που αποτελείται από ένα σύμπλοκο Cdk/Cyclin (μέτρια παρόμοιο με αυτά που περιγράφηκαν πιο πάνω) του οποίου τα επίπεδα δείχνουν καμία ταλάντωση μέσα στον κυτταρικό κύκλο[76,77]. Επίσης είναι μονάδα του συμπλόκου του μεταγραφικού παράγοντα TFIIH και είναι ικανό να φωσφορυλιώσει το καρβόξυ-τελικό άκρο της μεγάλης υπομονάδας της RNA πολυμεράσης ΙΙ[78]. Αυτό υποδεικνύει την ύπαρξη της διασταύρωσης ανάμεσα στη μηχανή της μεταγραφής και τους ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου που μεσολαβείται από αυτό το ένζυμο. Στα κύτταρα των θηλαστικών, αυτές οι μονάδες είναι οι Cdk7 και η Cyclin H[79-81]. Μια τρίτη μονάδα του συμπλόκου είναι είναι μια πρωτεΐνη που 19

καλείται MATI και η οποία λειτουργεί ως συνδετικός παράγοντας που σταθεροποιεί τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην CDK και την κυκλίνη. Η καταλυτική υπομονάδα της CAK περιέχει ένα κατάλοιπο θρεονίνης παρόμοιο με αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως, το οποίο φέρεται να είναι σημαντικό για τον έλεγχο της δράσης της CAK. Μεταλλαγμένες μορφές που στερούνται του συγκεκριμένου αμινοξέος έχουν μειωμένη δραστικότητα[82]. Πειράματα έδειξαν πως τα σύμπλοκα Cdk2/CyclinA μπορούν να λειτουργήσουν ως κινάσες ενεργοποίησης της CAK. Η σταθεροποίηση του συμπλόκου συνοδεύεται σημαντική αύξηση της της δραστηριότητας της CAK. Έτσι πιθανόν, υπάρχει μια θετική ανατροφοδότηση στην οποία οι στόχοι του ενζύμου είναι οι ενεργοποιητές του. Ένας άλλος ρυθμιστικός μηχανισμός που λειτουργεί κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και αφορά τις μιτωτικές CDKs εμπλέκει τη φωσφορυλίωση της CDK[83,84]. Στις ζύμες, η cdc2 φωσφορυλιώνεται στο κατάλοιπο Tyr15 οδηγώντας σε απενεργοποίηση από την κινάση τυροσίνης Wee/Myt1 κατά τη διάρκεια της μεσόφασης. Στα θηλαστικά οι CDKs φωσφορυλιώνονται κατά τον ίδιο τρόπο στα κατάλοιπα Tyr14 και Tyr15. Η ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk/Cyclin πραγματοποιείται με τη δράση της cdc25 φωσφατάσης στη μίτωση αφαιρώντας τις φωσφορικές ομάδες από τα κατάλοιπα[85]. Οι cdc25 και Wee1 ρυθμίζονται από τη δραστηριότητα άλλων κινασών και φωσφατασών[85]. Το N-τελικό άκρο και των δύο πρωτεϊνών περιέχει μια ρυθμιστική περιοχή με υψηλή πυκνότητα μοτίβων Ser/Thr-Pro που φωσφορυλιώνονται σε διαφορετικές στιγμές του κυτταρικού κύκλου για να ελέγχουν τις δραστηριότητες τους. Και οι δύο πρωτεΐνες υποφωσφορυλιώνονται στη μεσόφαση, σύμφωνα με την υψηλή ή χαμηλή δράση τους αντίστοιχα. Οι cdc25 και Wee1 2

φωσφορυλιώνονται από την Cdc2/CyclinB δημιουργώντας ένα ανατροφοδοτικό βρόγχο, ο οποίος είναι σημαντικός για την απότομη ενεργοποίηση του συμπλόκου CDK/Cyclin στη μίτωση. Δομικές αλλαγές ή διαφορετικοί ενδοκυτταρικοί εντοπισμοί της πρωτεΐνης μπορεί να συμβαίνουν ως ένα επακόλουθο όλων αυτών των τροποποιήσεων(εικόνα 5)[86]. Εικόνα 6: Ρύθμιση των CDKs από άλλες κινάσες. Ο υποκυτταρικός προσδιορισμός των CDKs και των ρυθμιστικών τους πρωτεϊνών είναι ένα αμφισβητούμενο θέμα. Μελέτες έδειξαν ότι κάποια από τα σύμπλοκα μπορεί να ρυθμίζονται εν μέρει από τη θέση τους στο κύτταρο, προσθέτοντας ένα επιπλέον επίπεδο πολυπλοκότητας στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Με τις αλλαγές στον εντοπισμό, οι κυκλίνες μπορούν να τροποποιήσουν την ειδικότητα του υποστρώματος 21

των CDK συντρόφων τους ή να επιτρέπουν την πρόσβαση σε διαφορετικά υποσύνολα των υποστρωμάτων τους[87]. Αναστολείς CDK Επιπρόσθετα με τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που περιγράφηκαν, η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου επηρεάζεται από εξωγενούς παράγοντες, επιτρέποντας την ολοκλήρωση της κυτταρικής διαίρεσης με περιβαλλοντικά και αναπτυξιακά ερεθίσματα (Εικόνα 6). Σε συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές των θηλαστικών, η πρόσθεση του TGFβ σταματάει τις καλλιέργειες στην όψιμη G1 φάση[88]. Μια παρόμοια κατάσταση συμβαίνει στις ζύμες αν προσθέσουμε σεξουαλικές φερομόνες[89]. Οι πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την κράτηση του κυτταρικού κύκλου είναι οι αναστολείς των CDK (CKIs). Σε κάποιες περιπτώσεις, μοιάζουν να αποκρίνονται σε εξωκυττάρια μηνύματα, αλλά σε άλλες φαίνεται να είναι μέλη του εγγενή κυτταρικού κύκλου[9,91]. Οι CKIs χωρίζονται σε δύο κύριες οικογένειες: Την INK4 (αναστολέα την CDK4) οικογένεια, που περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες p16 ink4a, p15 ink4b, p18 ink4c και p19 ink4d, οι οποίες αναστέλουν τις κινάσες που σχετίζονται με την κυκλίνη D, CDK4 και CDK6. Την Cip/Kip (kinase inhibitor protein) οικογένεια που αναστέλλει τις περισσότερες CDKs και αποτελείται από τις p21, p27 και p57. Οι CKIs είναι ικανές να προσδένονται in vivo με την υπομονάδα της CDK, την κυκλίνη ή το σύμπλοκο CDK/Cyclin αναστέλλοντας την δράση τους. Διάφορες μελέτες δείχνουν διαφορετικούς τρόπους μέσω των οποίων αυτοί οι αναστολείς καταργούν την δράση των CDK: αναστολή της δράσης του συμπλόκου CDK/Cyclin, αλληλεπίδραση με την ενεργοποίηση της CDK που μεσολαβείται από την CAK ή 22

ανταγωνισμός με τις κυκλίνες για την πρόσδεση στην καταλυτική υπομονάδα. Η ανασταλτική διαδικασία μπορεί να πραγματοποιείται από έναν ή από ένα συνδυασμό μηχανισμών[41]. Η p16 πρωτεΐνη μπορεί να μπλοκάρει τη δράση των CDK4 και CDK6 χωρίζοντας την καταλυτική υπομονάδα ή μπλοκάροντας τη δράση της κινάσης στα σύμπλοκα πριν τον σχηματισμό τους[92]. Η υπερέκφραση της p16 προάγει την διακοπή στη φάση G1 σε διάφορες κυτταρικές σειρές αλλά δεν έχει καμία δράση σε κύτταρα που λείπει η prb. Αυτό αποτελεί την υπόθεση στην οποία η prb είναι το μόνο βασικό υπόστρωμα των συμπλόκων της κυκλίνης D και τοποθετεί τις p16 και prb σε ένα απλο ρυθμιστικό μονοπάτι[93]. Τα υπόλοιπα γονίδια p15, p18 και p19 επάγονται από μόρια TGFβ και εκφράζονται σε πολλούς ιστούς. Και οι 4 CDK αναστολείς έχουν παρόμοιες βιοχημικές ιδιότητες και ρυθμίζουν την κυτταρική απόκριση σε μηνύματα έναντι του πολλαπλασιασμού του κυττάρου[94]. Τόσο η p16 όσο και η p18 σταματούνε τον κυτταρικό κύκλο στην G1 φάση αλλά μόνο σε κύτταρα με ενεργή την prb[95]. Οι p21, p27 και p57 περιέχουν μια διατηρημένη άμινο-τελική περιοχή σημαντική για την αλληλεπίδραση με την CDK και για την αναστολή της δράσης της[45]. Η p21 αναστέλλει αποτελεσματικά τις CDK2, CDK4 και CDK6 κινάσες και είναι ικανή να προάγει την διακοπή του κύκλου στη φάση G1 όταν υπερεκφράζεται[96,97]. Η πρωτεΐνη φαίνεται να επικοινωνεί σε τεταρτοταγή σύμπλοκα περιέχοντας cyclin/cdk/p21 και το πολλαπλασιαστικό πυρηνικό αντιγόνο PCNA, που είναι μια υπομονάδα της DNA πολυμεράσης δ και ενεργεί στην αντιγραφή και την επιδιόρθωση του DNA[98]. 23

Η p21 προσδένεται στον PCNA ανεξάρτητα από τα σύμπλοκα CDK/Cyclin και μπορεί να μπλοκάρει την ικανότητα του PCNA να ενεργοποιεί τη δράση της DNA πολυμεράσης δ για την επιμήκυνση της αλυσίδας του DNA χωρίς να διακόπτει το αντιγραφικό σύμπλοκο. Η επιδιορθωτική ικανότητα του PCNA πάνω στο DNA δεν επηρεάζεται από την 21[99]. Η p21 αναστέλλει τα σύμπλοκα των κυκλινών D και E προάγοντας την διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 με υποφωσφορυλίωση της prb[99]. Η δράση της p21 προάγεται από την p53 σε περίπτωση ύπαρξης παραγόντων που βλάπτουν το DNA[96]. Η p27 προσδένεται και αναστέλλει τη δράση του συμπλόκου CDK2/CyclinE[1]. Επίσης αναστέλλει τα σύμπλοκα των CDK3, CDK4 και CDK6[11]. Επιπλέον η p27 μπορεί να μπλοκάρει την ενεργοποίηση της CDK εμποδίζοντας την φωσφορυλίωση της από την CAK. Η p27 δεν προσδένεται στον PCNA και δεν ρυθμίζεται από την p53. Επίσης, έχει προταθεί ως βασική μονάδα του μονοπατιού που συνδέει τα μιτογόνα σήματα με τον κυτταρικό κύκλο και το σημείο περιορισμού, συσχετίζοντας τη συσσώρευση της πρωτεΐνης με την αδρανοποίηση των συμπλόκων των CDK της G1 φάσης ακολουθούμενη από τη μείωση των μιτογόνων[12]. Η p57 αναστέλλει διάφορα σύμπλοκα των CDKs. Για την δράση της δεν απαιτείται ούτε η p53, ούτε η prb. Η p57 εκφράζεται ειδικά σε κάποιους ιστούς σε αντίθεση με την p27 που εκφράζεται σε διαφορετικούς ιστούς[13,14]. 24

Αναστολείς ευρέως φάσματος 1. Φλαβοπιριδόλη: είναι ένας αναστολέας ευρέου φάσματος των CDKs (επίσης L-868275, HMR-1275, Alvocidib ή NSC-64989). Αναστέλλει τις CDK1, CDK2, CDK4 και CDK7 με την τιμή IC5 να κυμαίνεται μεταξύ,4-,4 μμ[15]. Αρχικά ανακαλύφθηκε ως αναστολέας του επιδερμικού υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (EGFR), ο οποίος αναστέλλει σε IC5 τιμή των 21 μμ. Αργότερα δείχτηκε πως η φλαβοπιριδόλη μπορούσε να αναστείλει την αύξηση των κυτταρικών σειρών του καρκίνου του στήθους και του πνεύμονα[93], του προστάτη, του εγκεφάλου και του αυχένα και των ξενομοσχευμάτων της λευχαιμίας[16-18]. Επειδή η συγκέντρωση του που χρειαζόταν για να δράσει ήταν κατά πολύ μικρότερη από αυτή για τον EGFR ερευνήθηκαν οι πιθανοί στόχοι του και βρέθηκε πως δρα στις CDKs. Εικόνα 7: Ο χημικός τύπος της φλαβοπυριδόλης. Πιο συγκεκριμένα, τόσο in vivo όσο και in vitro μελέτες έδειξαν πως η φλαβοπιριδόλη αναστέλει το σύμπλοκο Cdk1/CyclinB (IC5=3-4nM), Cdk2/CyclinA και Cdk2/CyclinE (IC5=1nM), Cdk4/CyclinD (IC5=2-4nM), Cdk6/CyclinD (IC5=6nM) και Cdk7/CyclinH 25

(IC5=11-3nM)[19]. Η ανάλυση των κρυσταλλικών δομών ακτινών Χ έδειξαν πως το L868276 (ένα αποχλωροφαινυλικό παράγωγο της φλαβοπιριδόλης συνδέεται στην θέση σύνδεσης του ΑΤΡ της CDK2[11]. Όπως οι μοριακές δομές των CDKs είναι παρόμοιες, είναι πιθανό η φλαβοπιριδόλη να αναστέλλει τη δράση των περισσοτέρων CDKs με απευθείας κατάληψη της περιοχής σύνδεσης του ΑΤΡ, μια λειτουργία που μπλοκάρεται ανταγωνιστικά με υπερβολική συγκέντρωση ATP[111]. Πράγματι, σε διαλυτά εκχυλίσματα κυττάρων, οι CDKs 1, 2, 4 και 7 συνδέονται στην ακινητοποιημένη φλαβοπιριδόλη μόνο εν απουσία του ATP. Επιπλέον, η φλαβοπιριδόλη αναστέλλει το σύμπλοκο Cdk7/CyclinΗ, οδηγώντας σε αλληλεπίδραση με φωσφορυλιωσή συγκεκριμένων καταλοίπων θρεονίνης των περισσοτέρων CDKs (π.χ. Thr161 στη Cdk1, Thr16 στη Cdk2, Thr172 στη Cdk4, Thr177 στη Cdk6), ένα γεγονός που απαιτείται για την πλήρη ενεργοποίηση τους. Η αναστολή των CDKs 1, 2, και 4 από την φλαβοπιριδόλη οδηγεί απευθείας σε σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου στις μεταβάσεις G1/S και G2/M, και σε μια καθυστέρηση στην πρόοδο της φάσης S[112]. Στα καρκινικά κύτταρα που στερούνται της CDK4, η φλαβοπιριδόλη προάγει το σταμάτημα της φάσης G1 αναστέλλοντας την CDK6[111]. Η καταστολή της κυκλίνης D1 επίσης συνεισφέρει στην παύση του κυτταρικού κύκλου έπειτα από χορήγηση φλαβοπιριδόλης. Τα μοτίβα των παύσεων του κυτταρικού κύκλου που προάγονται από την φλαβοπιριδόλη (G1/S ή/και G2/M παύση) φαίνεται να είναι ειδικά σε σχέση με τον τύπο του κυττάρου[19]. Η φλαβοπιριδόλη είναι ένας κοινός διαθέσιμος αναστολέας που χρησιμοποείται ευρέως στην έρευνα. Είναι επίσης ο πρώτος αναστολέας για CDK που χρησιμοποιήθηκε από σε κλινικές δοκιμές. Διάφορες κλινικές μελέτες φάσης Ι έδειξαν ότι η φλαβοπιριδόλη έχει αντκαρκινική 26

δράση σε ασθενείς με καρκίνο στο νεφρό, στον προστάτη, στο κόλον, σε μεταστατικούς καρκίνους του γαστρικού και στο non-hodgkin λέμφωμα[113-114]. Μια άλλη κλινική μελέτη φάσης Ι διαδοχικών paclitaxel και φλαβοπιριδόλης έδειξε κλινική δράση σε ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου, του πνεύμονα και του προστάτη, περιλαμβάνοντας ασθενείς που δεν είχαν απόκριση όταν χορηγούταν paclitaxel μόνο[115]. Επίσης, έχουν διεξαχθεί κλινικές μελέτες φάσης ΙΙ. Όμως, η φλαβοπιριδόλη δεν είχε άμεσες συνέπειες σε ανεπτυγμένο καρκίνωμα του γαστρικού, στον καρκίνο του πνεύμονα, σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου, του καρκίνου του προστάτη που εξαρτάται από τα ανδρογόνα, το μελάνωμα, το ενδοθηλιακό καρκίνωμα και στο ανεπτυγμένο καρκίνωμα του μαλακού ιστού[116-122]. Είχε μια μέτρια επίδραση στο λέμφωμα των κυττάρων του μανδύα και σε προχωρημένο καρκίνωμα του νεφρού[123,124]. Επίσης, η φλαβοπιριδόλη πέτυχε σημαντική κλινική δράση σε ασθενείς με υπότροπη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία[125]. Η φλαβοπιριδόλη μπλοκάρει δυναμικά την μεταγραφική δραστηριότητα της RNAPII in vitro αναστέλλοντας την P- TEFb(Cdk9/CyclinT), μια διαδικασία που αρχικά σχετιζόταν με την αναστολή της αντιγραφής του HIV[126,127]. Η φλαβοπιριδόλη αναστέλλει τη δράση κινάσης του C-τελικού άκρου της P-TEFb πιο δυναμικά από ότι οι CDKs. Επιπλέον, η αναστολή της CDK9 από τη φλαβοπιριδόλη είναι μη ανταγωνιστική κατ αντιστοιχία με το ATP. Δομικές πληροφορίες δείχνουν πως η φλαβοπιριδόλη συνδέεται στο βρόγχο πρόσδεσης του ATP της CDK9 με υψηλότερη συγγένεια από ότι προσδένεται στη CDK2. Η αναστολή της CDK7 απαιτεί μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (IC5>1nM) φλαβοπιριδόλης, από αυτές που απαιτούνται για την αναστολή της μεταγραφής, τουλάχιστον σε 27

περιπτώσεις όπως της μεταγραφής του HIV Tat. Έχει δειχτεί με μικροσυστοιχίες DNA πως η φλαβοπιριδόλη αναστέλλει γενικά την γονιδιακή έκφραση[128]. Όμως, παραμένει άγνωστο αν η κύρια επίδραση της φλαβοπιριδόλης στην γονιδιακή έκφραση προκύπτει από την ικανότητα της να αναστέλλει την P-TEFb, ειδικά σε συστήματα κυττάρων των θηλαστικών. Οι δυναμικές ανασταλτικές δράσεις στην μεταγραφή των γονιδίων των ιών αυξάνουν την πιθανότητα οι CDKs αναστολείς μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως κλινικά αντιικά φάρμακα[129]. 2. Olomoucine: είναι ένας άλλος αναστολέας CDK ευρέου φάσματος. Αναστέλλει την CDK1 (IC5=7μΜ), την CDK2 (IC5=7μΜ) και την CDK5 (IC5=7μΜ). Επίσης, σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις μπορεί να αναστείλει την κινάση ERK1 (IC5=25μΜ). Η ολομουσίνη είναι επίσης ένας εμπορικά διαθέσιμος αναστολέας και ανακαλύφθηκε πρώτα ως μια πουρίνη αναστολέας της CDK. Η olomoucine δεν χρησιμοποιήθηκε ποτέ σε κλινικές δοκιμές, αφού η προτίμηση δόθηκε στο παράγωγο της την roscovitine[19]. Εικόνα 8: Χημικός τύπος της olomoucine. 28

3. Roscovitine: (επίσης CY-22, (R)-Roscovitine, Seliciclib). Είναι μια πουρίνη αναστολέας ευρέου φάσματος, ο οποίος αναστέλλει τις CDK1, CDK2, CDK5 και CDK7 (IC5=.2-.5μΜ) αλλά είναι ένας φτωχός αναστολέας για τις CDK4 και CDK6 (IC5=1μΜ). Είναι εμπορικά διαθέσιμος και χρησιμοποιείται κατά κόρον στην έρευνα. Παραδόξως, στην βιβλιογραφία αναφέρεται ως εκλεκτικός αναστολέας της CDK5, παρόλο που αναστέλλει τουλάχιστο 3 άλλες CDKs. Μια κλινική δοκιμή φάσης Ι με την Roscovitine δεν έδειξε αντικειμενικές αποκρίσεις σε όγκο, αλλά η ασθένεια σταθεροποιήθηκε σε 8 άτομα[13]. Σε μια άλλη κλινική δοκιμή φάσης Ι, ένας ασθενής με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα έδειξε μερική απόκριση και 6 ασθενείς πέτυχαν τον όγκο[131]. Η roscovitine είναι υπό έρευνα σε διάφορες κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙ στη λευχαιμία ως μονοθεραπεία και σε συνδυαστικές δοκιμές εναντίον της NCLC (με gemcitabine/cisplatin, ή docetaxel) και του μεταστατικού καρκίνου του στήθους (με capecitabine)[132]. Εικόνα 9: Χημικός τύπος της Roscovitine. 29

4. Kenpaullone: (επίσης NSC 66474, 9-Bromopaullone). Ένας ακόμα εμπορικά διαθέσιμος αναστολέας των CDK ευρέου φάσματος που ανήκει στην οικογένεια των paullones αναστολέων. Αναστέλλει την CDK1 (IC5=,4μΜ), την CDK2 (IC5=,7μΜ) Εικόνα 1: Χημικός τύπος της Kenpaulone και την CDK5 (IC5=,9μΜ). Είναι κατά πολύ λιγότερο δυναμική η αναστολή για την CDK4 (IC5>1μΜ). Επίσης αναστέλλει και την GSK3β (IC5=,23μΜ). Η kenpaullone βρέθηκε in vitro ως ένα μόριο κατά του πολλαπλασιασμού και μελέτες μοριακής μοντελοποίησης έδειξαν πως προσδένεται στο βρόγχο σύνδεσης του ATP στην CDK2 όπως και οι άλλοι CDK2 αναστολείς. Επίσης τόσο η kenpaullone όσο και το παράγωγο της η alsterpaullone έχουν μεγάλη δράση απέναντι στο σύμπλοκο CDK1/CyclinB, όπου είναι ανταγωνιστικές για τη θέση με το ATP[112]. Παρόλο που είναι εμπορικά διαθέσιμος και χρησιμοποιείται στην έρευνα, έως τώρα δεν έχει μπει σε κλινική δοκιμή[19]. 5. SNS-32: (επίσης BMS-38732). Είναι ένας ευρέως φάσματος αναστολέας, ο οποίος αναστέλλει την CDK9 (IC5=,4μΜ), την CDK2 (IC5=,38μΜ) και την CDK7 (IC5=,62μΜ). Αναστέλλει και άλλες CDKs σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (IC5=,3μΜ), αλλά σε αυτή τη συγκέντρωση επίσης αναστέλλει και την κινάση GSK3. Η SNS-32 στην αρχή παρασκευάστηκε σε μια προσπάθεια να παραχθεί ένας εκλεκτικός αναστολέας της CDK2. Δυο κλινικές δοκιμές φάσης ένα διεξήχθησαν για 3

μεταστατικούς καρκίνους και μια για λέμφωμα. Και οι τρεις δοκιμές έδειξαν πως αυτό το φάρμακο ανεχόταν πλήρως από τους ασθενείς. Σε τρεις ασθενείς η κατάσταση σταθεροποιήθηκε[133]. Η μελέτη για το λέμφωμα έγινε σε 19 ασθενείς, από τους οποίους ο ένας με χρόνια λεμφοκυτταρική αναιμία είχε πάνω από 5% μείωση στην ασθένεια και σε δύο ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα σταθεροποιήθηκε η κατάσταση ενώ σε έναν ασθενή παρατηρήθηκε κανονικοποίηση του μεγέθους της σπλήνας. Εικόνα 11: Χημικός τύπος της SNS-32. 6. AT7519: είναι ένας αναστολέας CDK ευρέως φάσματος ο οποίος αναστέλλει την CDK1 (IC5=,21μΜ), την CDK2 (IC5=,13μΜ), την CDK4 (IC5=,1μΜ), την CDK5 (IC5=,13μΜ), την CDK6 (IC5=,17μΜ) και την CDK9 (IC5,1μΜ). Αυτή η ένωση έχει μικρότερη δραστικότητα έναντι άλλων CDKs όπως οι CDK3 και CDK7 και είναι αδρανής απέναντι στις μη CDK κινάσες, με μόνη εξαίρεση την GSK3β (IC5=,89μΜ). Σε 28 ασθενείς έγινε κλινική δοκιμή φάσης Ι με επίμονο συμπαγή όγκο. 4 ασθενείς έδειξαν σταθεροποίηση για πάνω από 6 μήνες και ένας είχε μια μερικώς εκτεταμένη απόκριση[19]. Εικόνα 12:Χημικός τύπος της AT7519. 31

7. AG-24322: είναι ένας ευρέως φάσματος αναστολέας, ο οποίος αναστέλλει τις CDK1, CDK2 και CDK4 (IC5=,1-,3μΜ). Η AG-24322 μπήκε σε κλινική δοκιμή φάσης Ι αλλά τερματίστηκε εξαιτίας της ανικανότητας της ουσίας να διακρίνει αποτελεσματικά από άλλες θεραπευτικές λεπτομέρειες[19]. Εικόνα 13: Χημικός τύπος της AG-24322 8. (S)-Roscovitine: είναι ένας αναστολέας η δραστικότητα του οποίου αναστέλλει τις CDK1 (IC5=,55μΜ), CDK5 (IC5=,35μΜ) και CDK9 (IC5=,96μΜ). Έχει απορριφθεί ως θεραπευτικό μέσο χάρη του ισομερούς (R)-Roscovitine[19]. Εικόνα 14: Χημικός τύπος της (S)- Roscovitine 9. R547: (επίσης Ro-458482). Είναι ένας αναστολέας εκλεκτικός για τις CDK1 (IC5=,1μΜ), CDK2 (IC5=,3μΜ) και CDK4 (IC5=,4μΜ). Παρόλο που το 26 ξεκίνησε η κλινική δοκιμή φάσης Ι, τα αποτελέσματα δεν δημοσιεύθηκαν ακόμα. Από την άλλη, 8 γονίδια που εκφράζονται σε δείγματα αίματος των 32

ασθενών (FLJ44342, CD86, EGR1, MKI67, CCNB1, JUN, HEXIM1 και PFAAPS) εκλέχθηκαν ως φαρμακοδυναμική παράμετρος απόκρισης στη δόση για κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙ[19]. Εικόνα 15: Χημικός τύπος της R547 Εκλεκτικοί αναστολείς 1. Fascaplysin: είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας για την CDK4 (IC5=,35μΜ) και την CDK6 (IC5=3,4μΜ) και μη εκλεκτικός για τις υπόλοιπες CDKs ή άλλες κινάσες. Αρχικά απομονώθηκε από το σπόγγο Fascaplysinopsis sp., δείχνοντας αντιμικροβιακή δράση. Είναι μια εμπορικά διαθέσιμη ένωση που χρησιμοποιείται ευρέως για ευρευνητικούς σκοπούς. Δεν έχει εισαχθεί σε κλινικές δοκιμές[19]. Εικόνα 16: Χημικός τύπος της Fascaplysin 2. Ryuvidine: εκλεκτικός αναστολέας για την CDK4 (IC5=6,μΜ) και δείχνει μια εκλεκτικότητα >33 φορές στη CDK2 (IC5>2μΜ). Παρά το γεγονός ότι είναι εμπορικά διαθέσιμος, δεν χρησιμοποιείται ιδιαίτερα στην έρευνα, ούτε έχει μπει σε 33

κλινικές δοκιμές. Όμως, με δεδομένη την εκλεκτικότητα του για την CDK4, καθώς και την κυτταροτοξικότητα απέναντι στα διάφορα καρκινικά κύτταρα (IC5=,61, 1,8,,3 και 1,21mg/ml έναντι των Α 549, Col 1, HL-6, και HepG2 καρκινικά κύτταρα αντίστοιχα) φαίνεται να είναι ένα δυναμικό εργαλείο στην έρευνα του καρκίνου[19]. Εικόνα 17: Χημικός τύπος της Ryuvidine 3. Purvalanol: υπάρχουν 2 τύποι οι Α και Β και είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας της CDK2 (IC5=4-7μΜ) και της CDK5 (IC5=75μΜ), αλλά λιγότερο εκλεκτικός για την CDK4 (IC5=85μΜ). Και οι δύο τύποι είναι παράγωγα της olomoucine και η εκλεκτικότητα τους είναι 1 φορές μεγαλύτερη για το σύμπλοκο CDK2/CyclinA συγκριτικά με την olomoucine. Η purvalanol αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη και προάγει την παύση στην μεταφορά G2/S. Αυτές οι επιδράσεις οφείλονται στην αναστολή της CDK1 και της p42/p44 πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από το μιτογόνο, όπου και οι δύο είναι ενδοκυτταρικοί στόχοι της purvalanol[19]. Εικόνα 18: Χημικός τύπος της Purvanol A. 34

4. NU258: είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας για την CDK2 (IC5=17μΜ) και την CDK1 (IC5=26μΜ). Η NU258 είναι ανταγωνιστικός αναστολέας που προσδένεται στο βρόγχο πρόσδεσης του ATP με μια διαφορετική οριοθέτηση από άλλους αναστολείς τύπου πουρίνης, όπως η olomoucine και η roscovitine. Μέχρι στιγμής μόνο προκλινικές μελέτες έχουν γίνει, δείχνοντας τη δυναμική της ένωσης έναντι διάφορων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Είναι εμπορικά διαθέσιμος και δεν έχει μπει σε στάδιο κλινικών μελετών[19]. Εικόνα 19: Χημικός τύπος της NU258. 5. BML-259: είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας για την CDK5 (IC5=64μΜ) και την CDK2 (IC5=98μΜ). Είναι ένας ανταγωνιστικός αναστολέας του ATP για τη CDK που ανακαλύφθηκε από μελέτες μοριακής μοντελοποίησης. Είναι εμπορικά διαθέσιμος παρόλο που χρειάζεται επιπλέον μελέτες εκτίμησης και προκλινικές δοκιμές[19]. Εικόνα 2: Χημικός τύπος της BML-259. 35

6. SU 9516: είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας για τις CDK2 (IC5=,22μΜ) και CDK1 (IC5=,4μΜ), αλλά λιγότερο εκλεκτικός για τη CDK4 (IC5 1μΜ). Ανήκει στους αναστολείς που έχουν ως βάση τις ινδολονόνες. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις μπορεί να αναστείλει επίσης την PKC (IC5 1μΜ), την p38 (IC5 1μΜ), τον PDGFR (IC5 18μΜ) και τον EGFR (IC5 1μΜ). Έγιναν δοκιμές σε καρκινικές κυτταρικές σειρές από το κόλον και έδειξε πως μείωνε την προαγωγή του κυτταρικού κύκλου και προήγαγε την απόπτωση[19]. Εικόνα 21: Χημικός τύπος της SU 9516. 7. PD-332991: είναι ένας υψηλά εκλεκτικός αναστολέας της CDK4 (IC5=.11μΜ) και της CDK6 (IC5=,16μΜ), χωρίς να έχει δράση έναντι 36 άλλων πρωτεϊνικών κινασών[134]. Ήταν αποτελεσματικός αντιπολλαπλασιαστικός παράγοντας κατά των θετικών κυττάρων ρετινοβλαστώματος, προάγοντας την διακοπή της φάσης G1 και μειώνοντας τη φωσφορυλίωση της Rb πρωτεΐνης. Διάφορες κλινικές δοκιμές φάσεων Ι και ΙΙ με την PD- 332991 πραγματοποιήθηκαν των οποίων τα αποτελέσματα δεν είναι ακόμα γνωστά. Μια άλλη μελέτη φάσης Ι διαδοχικού συνδυασμού της PD-32991 με bortezomib και dexamethasone έγινε σε 21 ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα. Ένας ασθενής είχε πολύ καλή μερική απόκριση, ένας είχε μερική απόκριση και 3 είχανε σταθεροποίηση της κατάστασης για πάνω από 3 μήνες. Μια 36

ακόμη κλινική δοκιμή έγινε σε 12 ασθενείς[135]. Οι ασθενείς είχαν μερική απόκριση και 9 από αυτούς είχαν σταθεροποίηση. Εικόνα 22: Χημικός τύπος της PD 332991. 8. P276-: είναι ένας υψηλά εκλεκτικός αναστολέας της CDK2 (IC5=1nM), ο οποίος είναι πολύ λιγότερο εκλεκτικός για τις CDK1 (IC5=11nM) και την CDK4 (IC5=13nM), με ασήμαντη δράση σε άλλες 12 κινάσες που δοκιμάστηκαν (IC5=2μΜ). Έδειξε δυναμικές επιδράσεις κατά του πολλαπλασιασμού σε διαφόρες καρκινικές κυτταρικές σειρές όπως η MCF-7 και η Η-46[136]. Διάφορες φάσεις δοκιμών Ι και ΙΙ ξεκίνησαν για την P276- των οποίων τα αποτελέσματα ακόμα επεξεργάζονται[19]. Εικόνα 23: Χημικός τύπος της P76-. 37

ΣΚΟΠΟΣ 38

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσης εργασίας είναι η στατιστική ανάλυση της σχέσης δομής-δράσης των χημικών ενώσεων που παράγονται από οξινδόλια και πουρίνες πάνω στα σύμπλοκα CDKs/Cyclins και η εξαγωγή συμπερασμάτων πάνω στις σχέσεις αυτές. Για το σκοπό αυτό ανατρέξαμε στην διεθνή βιβλιογραφία για να συλλέξουμε όσες πληροφορίες έχουν δημοσιευτεί έως τώρα για τις δύο αυτές ομάδες ενώσεων. Έπειτα μέσω ειδικών προγραμμάτων έγινε η επεξεργασία τους και η ανάλυση τους. Σκοπός είναι να συσχετίσουμε τη δομή των ενώσεων αυτών με τη δράση και τη βιολογική τους απόκριση πάνω στα σύμπλοκα των CDKs με τις κυκλίνες. 39

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4

Ανεύρεση βιβλιογραφίας Για την πραγματοποίηση της στατιστικής ανάλυσης έπρεπε να συλλεχθούν κάποιες βασικές πληροφορίες για τα ινδόλια και τις πουρίνες. Για την ανεύρεση αυτών των πληροφοριών έγινε αναζήτηση σε δημοσιευμένα άρθρα που αφορούν την σύνθεση και την εκτίμηση της βιολογικής απόκρισης των παραγώγων των οξινδολίων και των πουρινών. Τα άρθρα πρέπει να περιλαμβάνουν τις εξής πληροφορίες: 1. Τη χημική δομή του μορίου 2. Τα σύμπλοκα των CDKs με τις κυκλίνες στα οποία παρατηρείται η δράση τους 3. Οι συγκεντρώσεις στις οποίες τα σύμπλοκα των CDKs και των κυκλινών προκαλούν μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων της τάξης του 5% (IC5) μετά τη χορήγηση του αναστολέα 4. Τις κυτταρικές σειρές στις οποίες πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα Για την ανεύρεση της βιβλιογραφίας χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SciFinder αλλά και το Pubmed. Για το σχεδιασμό των μορίων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ChemOffice 21 (ChemBioDraw Ultra 12.), το οποίο είναι ένα πρόγραμμα που σχεδιάζει κανείς εύκολα ενώσεις και μόρια, ενώ παράλληλα παρέχει πληθώρα πληροφοριών για την κάθε ένωση ή μόριο. 41

Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Microsoft Excel 27. Στο συγκεκριμένο πρόγραμμα καταχωρήθηκαν οι συγκεντρώσεις στις οποίες παρατηρείται μείωση κατά 5% του πολλαπλασιασμού των κυττάρων έπειτα από χορήγηση των αναστολέων σε σχέση με τον συνολικό αριθμό ενώσεων για κάθε ομάδα αναστολέων. Κατόπιν, δημιουργείται το γράφημα κατανομής, προκειμένου να αποκτήσουμε σαφή εικόνα της κατανομής των αναστολέων σε σχέση πάντα με τη δράση τους για το εκάστοτε σύμπλοκο CDK και κυκλίνης. Αυτή είναι και η σχέση δομής-δράσης των ενώσεων αυτών. 42

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 43

Οξινδόλικα παράγωγα: Στην βιβλιογραφική έρευνα βρέθηκαν 177 ενώσεις που είναι παράγωγα του οξινδολίου. Ο χημικός τύπος του οξινδολίου είναι ο εξής (Εικόνα 24): Εικόνα 24: Χημικός τύπος του οξινδολίου. Τα περισσότερα παράγωγα αφορούν υποκαταστάσεις στις θέσεις R4, R5, R6 και R7, ενώ στη θέση Χ υπάρχουν διάφορες ομάδες που καθορίζουν την οδηγό-ένωση για κάθε κατηγορία όπως θα δούμε παρακάτω. Η βιολογική εκτίμηση για τα παράγωγα του οξινδολίου αφορούσε κυρίως το σύμπλοκο CDK2/CyclinE. Ανάλογα του οξινδολίου 7: 2 διαφορετικές ομάδες παραγώγων υπάρχουν σε αυτή την κατηγορία ενώσεων και συνολικά 36 διαφορετικές ενώσεις. Στο γράφημα 1 φαίνεται η συνολική συσχέτιση δομής-δράσης αυτής της κατηγορίας. 44

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 ΓΡΑΦΗΜΑ 1 1 2 3 4 5 6 Εικόνα 25: Γράφημα που αναπαριστά τη σχέση δομής-δράσης όλων των παραγώγων της κατηγορίας των αναλόγων 7 του οξινδολίου. Η συσχέτιση γίνεται ανάμεσα στις συγκεντρώσεις στις οποίες το σύμπλοκο προκαλεί αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά 5% και τον συνολικό αριθμό των ενώσεων. 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 Εικόνα 26: Το γράφημα με μείωση της κλίμακας στα 5nM. 45

IC5: CDK2/CCyclinE 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 Εικόνα 27: Τελική εικόνα του γραφήματος με μείωση στα 5nM. Η υποκατάσταση στη θέση R αφορά αρωματικη πυρηνόφιλη υποκατάσταση με κορεσμένες κυκλικές αμίνες για την πρώτη ομάδα των αναλόγων 7. Η σχέση δομής-δράσης της πρώτης ομάδας ενώσεων φαίνεται στα παρακάτω γραφήματα: 46

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 5 1 15 2 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 5 1 15 2 Εικόνα 28: Σχέση δομής-δράσης της πρώτης ομάδας των αναλόγων του οξινδολίου 7. Η πρώτη παρατήρηση που προκύπτει για αυτήν την ομάδα είναι πως η υποκατάσταση στη θέση 4 με κορεσμένο κυκλικό τμήμα αυξάνει κατά πολύ τη δράση έναντι του συμπλόκου. Επίσης, ένα κορεσμένο κυκλικό τμήμα, αμινικά υποκατεστημένο, αυξάνει τη δράση έναντι ενός αμιδικά ή υδρόξυ υποκατεστημένου τμήματος. Για τη δεύτερη ομάδα ενώσεων, που είναι 4-αλκυλινικά παράγωγα, η σχέση δομής δράσης είναι η εξής: 47

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 Εικόνα 29:Σχέση δομής-δράσης της δεύτερης ομάδας των οξινδλιών 7 Πίνακας 1: Ονομασία και δομή της δεύτερης ομάδας των οξινδολίων 7 7a 7d 7g 7b 7e 7h 48

7c 7f 7i 7j 7n 7r 7k 7o 7s 7l 7p 7t 7m 7q Σε αυτήν την ομάδα παρατηρούμε πως τα περισσότερα παράγωγα είναι δραστικοί αναστολείς των CDKs. Τα ανάλογα που υποκαθίστανται στο προπαργυλικό ετεροάτομο από μια ομάδα μεγαλύτερη από ένα μεθυλικό κομμάτι είναι λιγότερο δραστικά από ότι τα ανάλογα που δεν έχουν τέτοιες ομάδες. Για παράδειγμα, τα ανάλογα 7i και 7j είναι λιγότερο δραστικά από ότι τα αλκυνυλικά οξινδόλια 7g και 7h. Τα παράγωγα 7m και 7n είναι λιγότερο δραστικά από τα αντίστοιχα τους des-methyl ή τα μεθυλικά υποκαταστημένα 7k και 7l. 49

IC5: CDK2/CCyclinE Ανιλινικά παράγωγα: Μια τρίτη ομάδα παραγώγων του οξινδολίου έχει να κάνει με υποκατάσταση όχι μόνο στη θέση 4, όπως τα ανάλογα 7 παραπάνω, αλλά και στις θέσεις 5, 6, 7 και Χ όπως φαίνεται στο σχήμα της ένωσης-οδηγού παρακάτω: Η σχέση δομής-δράσης φαίνεται στα παρακάτω γραφήματα: Χ-υποκαταστημένα ανιλίνια: Χ sub 8 7 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 1 Εικόνα 3: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση Χ. Η υποκατάσταση στη θέση Χ, με ομάδες μεγαλύτερες του υδρογόνου, δεν επηρεάζει αρνητικά την δραστικότητα έναντι του συμπλόκου. 5

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 4-υποκατεστημένα ανιλίνια: 4 sub 25 2 15 1 5 5 1 15 2 4 sub 15 13 11 9 7 5 3 1-1 5 1 15 2 Εικόνα 31: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 4. Παρατηρούμε πως ενώσεις με λιποφιλικά υποκατάστατα όπως αυθύλιο, ισοπροπύλιο, ισοβουτύλιο και ισοβουτενύλιο είναι πολύ ισχυροί αναστολείς. Αντίθετα, υποκατάσταση με υδροφιλικές ομάδες μειώνουν τη δραστικότητα, όπως φαίνεται στο πάνω μέρος της εικόνας 31. 51

IC5: CDK2/CYCLINE IC5: CDK2/CYCLINE 5-υποκαταστημένα ανιλίνινια: 35 3 25 2 15 1 5 2 4 6 8 1 12 3 25 2 15 1 5 5 1 15 Εικόνα 32: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 5. Στο πάνω γράφημα φαίνονται τα 11 πρώτα παράγωγα και στο κάτω γράφημα τα άλλα 12 παράγωγα. Εδώ βλέπουμε πως οι καρβοξυλικοί εστέρες στη θέση 5 αυξάνουν πολύ τη δραστικότητα έναντι του συμπλόκου. Παρατηρούμε πως η αμιδική ομάδα είναι η καλύτερη υποκατάσταση στη θέση 5 αυξάνοντας πολύ τη δραστικότητα. Τα φορτισμένα υποκατάστατα όπως σουλφονικά και καρβοξυλικά αμινοξέα δεν προσφέρουν κάποιο πλεονέκτημα έναντι παρόμοιων ουδέτερων υποκατάστατων. 52

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 6-υποκαταστημένα ανιλίνια: 6 sub 12 1 8 6 4 2 2 4 6 8 6 sub 12 1 8 6 4 2 2 4 6 8 Εικόνα 33: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 6. Αυτό που παρατηρούμε σε αυτή την ομάδα είναι πως μικρότερες ομάδες όπως αιθυλικές, ισοπροπυλικές και υδροξυμεθυλικές έχουν μια καλή δραστικότητα, ενώ όταν αυξάνεται το μέγεθος της ομάδας υποκατάστασης μειώνεται πολύ η αναστολή του συμπλόκου (πάνω μέρος της εικόνας 33). 53

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 7-υποκαταστημένα ανιλίνια: 7 sub 12 1 8 6 4 2 1 2 3 4 Εικόνα 34: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 7. Εδώ δεν υπάρχει κάποιο ιδιαίτερη παρατήρηση αφού τα παράγωγα δείχνουν έλλειψη δραστικότητας έναντι του συμπλόκου. 4,5-διυποκαταστημένα ανιλίνια: 4,5 sub 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 1 12 Εικόνα 35: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 4 και 5. 54

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE Η διπλή υποκατάσταση στις θέσεις 4 και 5 παρατηρούμε πως αυξάνει την δραστικότητα των ενώσεων. Ειδικά όταν στη θέση 4 μπαίνουν υδροφοβικές ομάδες και στη θέση 5 ετερόκυκλες ομάδες τότε η δραστικότητα έναντι του συμπλόκου αυξάνεται πολύ. Υποκαταστημένα σουλφοναμίδια: Y sub 12 1 8 6 4 2 1 2 3 ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΝΩΣΣΕΩΝ Y sub 12 1 8 6 4 2 5 1 15 2 25 3 Εικόνα 36: Ανιλικά παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση Υ. Στο κάτω γράφημα η κλίμακα μειώθηκε στα 12nM. 55

83 91 99 84 92 1 85 93 11 86 94 12 87 95 13 88 96 14 89 97 15 9 98 16 56

IC5: CDK2/CCyclinE 17 18 19 Παρατηρούμε πως οι ενώσεις στις οποίες η σουλφοναμίδη συνδέεται με τον φαινυλικό δακτύλιο μέσω μιας μεθυλενικής ομάδας έχουν ααυξημένη δραστικότητα. Ινδολινόνια: υπάρχουν 2 κατηγορίες παραγώγων ινδολινονίων, τα πυρολλυλακτόνικα και τα πυρολλυλακταμικά. Τα πυρολλακτονικά ινδολινόλια έχουν υποκαταστάσεις στις θέσεις C4, C5 και C6 του οξινδολικού πυρήνα. Η σχέση δομής-δράσης των παραγώγων αυτών είναι η εξής: 12 1 8 6 4 2 2 4 6 8 1 12 14 16 Εικόνα 37: Σχέση δομής-δράσης των πυρολλυλακτνικών ινδολινολίων 57

IC5: CDK2/CCyclinE 3 25 2 15 1 5 2 4 6 8 1 12 14 16 Εικόνα 38: Σχέση δομής-δράσης των πυρολλυλακτνικών ινδολινολίων με μείωση κλίμακας στα 3nM Όσον αφορά τα παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 5 τα σουλφοναμιδικά παράγωγα είναι πιο δραστικά από τα αλογόνα παράγωγα με μόνη εξαίρεση την υποκατάσταση με Cl. Η υποκατάσταση στη θέση 4 με ενώσεις με πολικό υποκατάστατο είναι κατά πολύ δραστικότερα από ότι το ανάλογο με μεθυλική υποκατάσταση στη θέση αυτή. Τέλος η θέση 6 δεν συνεισφέρεται για υποκατάσταση, καθώς, όπως φαίνεται και στο διάγραμμα τα παράγωγα είναι πολύ λιγότερο δραστικά από ότι τα παράγωγα με υποκατάσταση στη θέση 4 και 5. Για τα πυρολλυλακταμικά ινδολινόλια παίρνουμε την παρακάτω σχέση δομής-δράσης: 58

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 1 Εικόνα 39: Σχέση δομής-δράσης των πυρολλυλακταμικών ινδολινολίων 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 1 Εικόνα 4: Σχέση δομής-δράσης των πυρολλυλακταμικών ινδολινολίων με μείωση της κλίμακας στα 6nM. Ανάμεσα στα 5 υποκαταστ ημένα πυρολυλλακταμικά ινδολινόλια, τα 5- σουλφοναμιδικά και τα 5-καρβοξυλικά υποκαταστημένα είναι πιο δραστικά από ότι τα 5-halo υποκαταστημένα ανάλογα. Η 4-πιπεριδινική ένωση δείχνει δραστική αναστολή. Τα 6-φενυλικά ανάλογα είναι σημαντικά λιγότερο δραστικά από ότι τα 4- και 5- υποκαταστημένα παράγωγα. 59

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 3,5,6-trisubstituted naphthostyril: Βλέπουμε τη σχέση δομής-δράσης αυτής της κατηγορίας παρακάτω: 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 3 Εικόνα 41: Σχέση δομής-δράσης των 3,5,6-trisubstituted naphthostyril 4-series 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 Εικόνα 42: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 4 των 3,5,6-trisubstituted naphthostyril με μείωση της κλίμακας στα 4nM. 6

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 6-series 12 1 8 6 4 2 2 4 6 8 6-series 12 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 6 7 Εικόνα 43: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 6 των 3,5,6-trisubstituted naphthostyril 61

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 6 7-series 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 7-series 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 Εικόνα 44: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 7 των 3,5,6-trisubstituted naphthostyril 62

IC5: CDK2/CCyclinE IC5: CDK2/CCyclinE 8-series 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 1 2 3 4 5 Εικόνα 45: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 8 των 3,5,6-trisubstituted naphthostyril 9-1-series 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 Εικόνα 46: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 9 και 1 των 3,5,6-trisubstituted naphthostyril Η σύγκριση των σειρών 6, 7 και 8 με δεν αποφέρει κάποια σημαντική διαφορά μεταξύ τους, ως προς τη δραστικότητα τους. Για την ομάδα 6 των υποκαταστημένων παραγώγων βλέπουμε πως η προσθήκη μιας αλκυλικής πλευρικής ομάδας ενισχύει δραματικά την δραστικότητα, όπως όταν προστίθεται μια μεθόξυ-ομάδα στην 5 θέση υποκατάστασης. Αυξάνοντας τον κορμό της αλκυλικής ομάδας τείνει να μειωθεί η δραστικότητα. Η ενσωμάτωση όμως λειτουργικών ομάδων όπως ΟΗ και ΝΗ 2 στο άκρο της αλυσίδας αυξάνει τη δραστικότητα. Οι ενώσεις 63

με αλκυλική υποκατάσταση στη θέση 5 είναι πολύ δραστικές και η προσθήκη λειτουργικών ομάδων στο άκρο αυξάνουν ακόμα περισσότερο τη δραστικότητα. Η ακυλοποίηση όμως των λειτουργικών ομάδων μειώνει δραματικά τη δραστικότητα. Η δραστικότητα επίσης μειώνεται με την αλκυλοποίηση των ομάδων αυτών. Η 7b είναι η πιο δραστική ένωση και η αύξηση του μήκους της πλευρικής αλυσίδας (7c) ή η εισαγωγή διμεθυλικής ομάδας δίπλα στην τελική αμινομάδα (7d) μειώνει τη δραστικότητα. Για τις ομάδες παραγώγων 8, 9 και 1 που έχουν θειοαιθερικές, σουλφοξιδικές και σουλφονικές λειτουργικές ομάδες παρατηρείται παρόμοια δραστικότητα με τα υπόλοιπα ανάλογα. Πουρίνες Από τη βιβλιογραφική έρευνα προέκυψαν 224 ενώσεις, παράγωγα των πουρινών. Οι ενώσεις αυτές μελετήθηκαν για τα σύμπλοκα CDK1/CyclinB, CDK2/CyclinA, CDK2/1CyclinE, CDK4/CyclinD1, CDK7/CyclinH και για την CDK5. Σύμπλοκο CDK1/CyclinB: δύο ομάδες παραγώγων ανήκουν στην κατηγορία αυτή. Το γράφημα μας δείχνει τη σχέση δομής δράσης των παραγώγων που δρουν έναντι στο σύμπλοκο CDK1/CyclinB. 64

IC5: CDK1/CYCLINB IC5: CDK1/CYCLINB cdk1/cyclinb 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 Εικόνα 47: Σχέση δομής-δράσης των παραγώγων των πουρινών έναντι στο σύμπλοκο CDK1/CyclinB. cdk1/cyclinb 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 7 Εικόνα 48: Σχέση δομής-δράσης των παραγώγων των πουρινών έναντι στο σύμπλοκο CDK1/CyclinB με μείωση κλίμακας στα 5μΜ. 65

IC5: CDK1/CYCLINB IC5: CDK1/CYCLINB cdk1/cyclinb 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.5 1 2 3 4 5 6 7 Εικόνα 49: Σχέση δομής-δράσης των παραγώγων των πουρινών έναντι στο σύμπλοκο CDK1/CyclinB με μείωση κλίμακας στα 5μΜ. Η πρώτη ομάδα είναι οι 2,6,9-τρισυποκαταστημένες πουρίνες. Η ένωσηοδηγός είναι η παρακάτω: Η σχέση δομής-δράσης φαίνεται στο παρακάτω γράφημα. cdk1/cyclinb 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 5 1 15 2 25 3 35 4 Εικόνα 5: Σχέση δομής-δράσης των 2,6,9-τρισυποκαταστημένων πουρινών. 66

IC5: CDK1/CYCLINB IC5: CDK1/CYCLINB cdk1/cyclinb 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 5 1 15 2 25 3 35 4 Εικόνα 51: Σχέση δομής-δράσης των 2,6,9-τρισυποκαταστημένων πουρινών με μείωση κλίμακας στα 5μΜ. 5 4 3 2 1 cdk1/cyclinb 1 2 3 4 Εικόνα 52: Σχέση δομής-δράσης των 2,6,9-τρισυποκαταστημένων πουρινών με μείωση κλίμακας στα 5μΜ. Πίνακας 2: Τα ανάλογα παράγωγα των τρισυποκαταστημένων πουρινών. 3f 14 4b 15 67

5a 16 5b 17 5c 18 5d 19 5e 2 5f 21 6 22 7 23 68

8 24 9 25 1 26 11 27 12 28 13 Παρατηρούμε πως η αντικατάσταση της βενζυλικής ομάδας στο άζωτο που βρίσκεται στη θέση 6, είτε από μια Ν-μέθυλ αλλυλάμινο ομάδα (ένωση 7) είτε από μια 1,2,3,6-τετραϋδροπυριδινιλικό σύστημα (ένωση 8) μειώνει πάρα πολύ την ανασταλτική δραστηριότητα. Από την άλλη πρέπει να παρατηρηθεί η δράση του C-6-(3-ιοδοβενζυλάμινο) παραγώγου 21 συγκριτικά με το ισοπροπυλικό παράγωγο 1. Η αντικατάσταση του 9-μέθυλ υποκατάστατου της ολομουκίνης από μια ισοπροπυλική ομάδα αυξάνει τη δραστικότητα έναντι της CDK1. Με εξαίρεση το παράγωγο 24 το οποίο έχει την ίδια ανασταλτική δραστικότητα με το ανάλογο 1, μια περαιτέρω αύξηση της μεγέθους της αλυσίδας και/ή της υδροφοβικότητας στο Ν-9 μειώνει φανερά την 69

IC5: CDK1/CYCLINB IC5: CDK1/CYCLINB ανασταλτική δράση. Ενδιαφέρουσα είναι η παρατήρηση ανάμεσα στα παράγωγα 9 και 1 που είναι οι S και R μορφές του ίδιου παραγώγου, και όπου το παράγωγο 1 με την R μορφή είναι πιο δραστική από ότι το παράγωγο 9 με την S μορφή. Αυτό ισχύει και για τις υπόλοιπες R και S μορφές των παραγώγων της κατηγορίας αυτής: 15>14, 17>16, 19>2 και 28>27. Το πιο δραστικό παράγωγο είναι το 6-(3-ιωδοβενζυλικό)-άμινο παράγωγο 21. Η δεύτερη ομάδα είναι οι 6-πυριδυλμεθυλαμινοπουρίνες. Η σχέση δομής-δράσης φαίνεται στο επόμενο γράφημα. 25 2 15 1 5 5 1 15 2 25 3 35 4 Εικόνα 53: Σχέση δομής-δράσης των 6-πυριδυλμεθυλαμινοπουρίνων. 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 5 1 15 2 25 3 35 4 Εικόνα 54: Σχέση δομής-δράσης των 6-πυριδυλμεθυλαμινοπουρίνων με μείωση κλίμακας στα 5μΜ. 7

IC5: CDK1/CYCLINB IC5: CDK1/CYCLINB IC5: CDK1/CYCLINB 2-pyridyl 25 2 15 1 5 2 4 6 8 3-pyridyl 25 2 15 1 5 2 4 6 8 Phenyl 35 3 25 2 15 1 5 2 4 6 8 Εικόνα 55: Σχέση δομής-δράσης των 6-πυριδυλμεθυλαμινοπουρίνων ανάλογα με τη θέση υποκατάστασης. 71

IC5: CDK2/CYCLINA Παρατηρούμε πως τα πιο δραστικά παράγωγα είναι οι β-μέθυλ υποκαταστημένες αλκοόλες 15, 21 και 27, οι πρωτογενείς αλκοόλες 1, 14, 2 και 26, και οι τριτογενείς αλκοόλες 19, 25, 31. Οι ενώσεις με β- ισο-προπυλικές ομάδες, 17, 23 και 29 αλλά και οι ενώσεις με β-tertβουτυλικές ομάδες, 18, 24 και 3, έχουν πολύ μικρότερη ανασταλτική δράση, ενώ οι β-αιθυλικές υποκαταστημένες ενώσεις 16, 22 και 28 παρουσιάζουν μια μέτρια δραστικότητα. Σύμπλοκο CDK2/CyclinA: για αυτό το σύμπλοκο υπάρχει μόνο μια κατηγορία παραγώγων, οι δυάρυλο πουρίνες. Η σχέση δομής δράσης φαίνεται στο παρακάτω γράφημα. 12 cdk2/cyclina 1 8 6 4 2 5 1 15 2 Εικόνα 56: Σχέση δομής-δράσης στις δυαριλικές πουρίνες. 72

IC5: CDK2/CYCLINA IC5: CDK2/CYCLINA cdk2/cyclina 12 1 8 6 4 2 5 1 15 2 Axis Title Εικόνα 57: Σχέση δομής-δράσης στις δυαριλικές πουρίνες με μείωση κλίμακας στα 12μΜ. cdk2/cyclina 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.8.6.4.2 5 1 15 2 Εικόνα 58: Σχέση δομής-δράσης στις δυαριλικές πουρίνες με μείωση κλίμακας στα 2μΜ. Από τη σειρά 3 των ενώσεων αυτών (3a-q), όπου στη θέση C-2 προστίθεται μια ποικιλία άκυκλων και κυκλικών αμινών ενώ διατηρούνται οι C-6 διφενυλμεθυλαμινική και N-9 ισοπροπυλική ομάδα, η πιο δραστική ένωση είναι η 3k όπου προστέθηκε η trans-4- αμινοκυκλοεξυλαμινική ομάδα. 73

IC5: CDK2/CYCLINA 3-series 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 Εικόνα 59: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 3 των δυαρυλικών παραγώγων. Πίνακας 3: Ονομασία και δομή των δυαρυλικών παραγώγων. 3a 3j 3b 3k 3c 3l 3d 3m 3e 3n 3f 3o 74

IC5: CDK2/CYCLINA 3h 3p 3i 3q Τα μόνο-αλκυλικά παράγωγα 1a-d δείχνουν καλή δράση, αλλά η προσθήκη δύο αλυσίδων στον trans δεσμό μειώνει τη δραστικότητα. 1-series 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 Εικόνα 6: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 1 των δυαρυλικών παραγώγων. Η εισαγωγή μιας ακετυλικής ομάδας, όπως στην 11a, διατηρεί μια καλή δραστικότητα, ενώ η αύξηση του μεγέθους της ακυλικής ομάδας μειώνει τη δραστικότητα στα ανάλογα 11b και 11c. Το μεθυλσουλφονυλικό ανάλογο 11d δείχνει μια μέτρια δραστικότητα, αλλά το τριφλουορομεθυλσυλφονιλικό ανάλογο 11e είναι πολύ λιγότερο δραστικό έναντι της CDK. 75

IC5: CDK2/CYCLINA IC5: CDK2/CYCLINA 11-series 5.5 4.5 5 3.5 4 2.5 3 1.5 2.5 1 1 2 3 Εικόνα 61: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 11 των δυαρυλικών παραγώγων. Στη σειρά 13, στην οποία ποικίλλει το υποκατάστατο στη θέση Ν-9, το Ν-αιθυλικό παράγωγο δεν μπορεί να εξαχθεί κάποιο συμπέρασμα από τα παρόντα αποτελέσματα. 13-series 1.2 1.8.6.4.2 1 2 3 4 Εικόνα 62: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 13 των δυαρυλικών παραγώγων. Για τις ενώσεις 18a-b, στις οποίες μεταβάλλεται η σύνδεση του C-6 αμινομεθυλενίου με τη διφαινυλική ομάδα, η αύξηση της πλαϊνής αλυσίδας μειώνει τη δραστικότητα. 76

IC5: CDK2/CYCLINA IC5: CDK2/CYCLINA 18 series 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 3 35 4 Εικόνα 63: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 18 των δυαρυλικών παραγώγων. Οι ενώσεις 21a-k που υποκαθίστανται στον απομακρυσμένο φαινυλικό δακτύλιο δείχνουν την καλύτερη δράση όταν η υποκατάσταση γίνεται στην 3 θέση Πολύ δραστικά είναι τα ανάλογα που υποκαθίστανται με μεθυλική ομάδα στη θέση 3, όπως οι ενώσεις 21d και 21h. 21 series 7 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 1 12 Εικόνα 64: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 21 των δυαρυλικών παραγώγων. 77

IC5: CDK2/CYCLINA IC5: CDK2/CYCLINA Η πρόσθεση διαφόρων ετερόκυκλων στον απομακρυσμένο φαινυλικό δακτύλιο δείχνει ισχυρή ανασταλτική δράση όπως στη σειρά 4 (a, b, f, h- j) και 5 (c-e) και συγκεκριμένα στα παράγωγα όπου προστίθενται οι ομάδες 2-πυριδίλιο στην 4a, 2-θυενύλιο στην 4f, 2-φουρανύλιο στην 4j και 1-πυρρολίλιο στην 5d. Συγκριτικά με το ανάλογο 4f άλλα ανάλογα με 2-θυενύλιο, όπως τα 4h, 5e και 5g, δεν έχουν τόσο ισχυρή ανασταλτική δράση. 4 series.45.4.35.3.25.2.15.1.5 2 4 6 8 1 Εικόνα 65: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 4 των ετεροδυαρυλικών παραγώγων. 5-series.7.6.5.4.3.2.1 5 1 15 2 Εικόνα 66: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 5 των έτεροδυαρυλικών παραγώγων. Για τις ενώσεις 8a, 8b, 9d, 13, 14 και 15a-e, στις οποίες υπάρχει αντικατάσταση του κοντινού φαινυλικού δακτυλίου από άλλο ετεροαρυλικό δακτύλιο και διατήρηση του απομακρυσμένου φαινυλικού 78

IC5: CDK2/CYCLINA IC5: CDK2/CYCLINA δακτυλίου, τα ανάλογα 8a, 9c και 9d έχουν την πιο αυξημένη δραστικότητα. Για την σειρά αναλόγων 15 παρατηρούμε πως η υποκατάσταση στη θέση 3 του ακραίου βενζενικού δακτυλίου έχει μεγαλύτερη δραστικότητα από ότι η υποκατάσταση σε άλλες θέσεις. 8-9-13-14 series.8.7.6.5.4.3.2.1 5 1 15 2 Εικόνα 67: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 8, 9, 13 και 14 των ετεροδυαρυλικών παραγώγων. 15 series.8.7.6.5.4.3.2.1 5 1 15 2 25 3 Εικόνα 68: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 15 των ετεροδυαρυλικών παραγώγων. Στις σειρές 16, 17 και 18 αντικαθίστανται και οι δύο φενυλικοί δακτύλιοι από ετεροαρυλικούς. Μεγαλύτερη δραστικότητα δείχνει η σειρά 17 όπου υπάρχει ένας 3-πυριδυλικός δακτύλιος υποκαταστημένος με ετεροκυκλικές ενώσεις, ενώ η σειρά 16 με την ύπαρξη 2-θυενυλικού δακτυλίου έχει μικρότερη δραστικότητα. 79

IC5: CDK2/CYCLINA IC5: CDK2/CYCLINA 16 series.7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 Εικόνα 69:Σχέση δομής-δράσης της σειράς 16 και 17 των ετεροδυαρυλικών παραγώγων. 17 series.12.1.98.96.94.92.9.88 2 4 6 8 1 Εικόνα 7: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 17 των ετεροδυαρυλικών παραγώγων. Η σειρά 18 δείχνει και αυτή όπως και η 17 πολύ καλή ανασταλτική δράση, ειδικά τα δύο πρώτα ανάλογα με 2-θυενυλικό δακτύλιο και το τελευταίο με 3-πυριδυλικό δακτύλιο. 8

IC5: CDK2/CYCLINΕ IC5: CDK2/CYCLINA 18 series 1.6 1.4 1.2.8 1.6.4.2 1 2 3 4 Εικόνα 71: Σχέση δομής-δράσης της σειράς 18 των ετεροδυαρυλικών παραγώγων. Σύμπλοκο CDK2/1CyclinE: οι ενώσεις που υπάρχουν για το σύμπλοκο αυτό, είναι οι ίδιες που αναφέραμε για το σύμπλοκο CDK2/CyclinA και οι 8-αζαπουρίνες. Όσον αφορά τις δυαριλικές και ετεροδυαριλικές πουρίνες, η σχέση δομής-δράσης φαίνεται στα επόμενα γραφήματα. 1.9.8.7.6.5.4.3.2.1 5 1 15 2 25 3 35 4 ΑΡΙΘΜΟΣ ΑΤΟΜΩΝ Εικόνα 72: Σχέση δομής-δράσης για τις ετεροδυαρυλικές πουρίνες για το σύμπλοκο CDK2/1CyclinE. Βλέπουμε πως ισχύουν οι ίδιες παρατηρήσεις με την ανασταλτική δράση πάνω στο σύμπλοκο CDK2/CyclinA με τις ενώσεις 17e, 17f, 18a-d και 18g να δείχνουν εξαιρετική ανασταλτική δραστηριότητα. 81