MESACUP anti-synthetase TEST

MESACUP anti-synthetase TEST Cat. No. : 48 wells Cat. No. : 48 puits Art. Nr. : 48 Auftragsstellen Cat. No. : 48 pocillos Cat. N. : 48 pozzetti Cat. N : 48 poos Aρ. Κατ. : 48 βυθισμάτων MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F 4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi, 460-0008 Japan Tel: +81 52-238-1901 Fax: +81 52-238-1440 URL http://www.mbl.co.jp

- CONTENTS - - CONTENU - - INHALTSVERZEICHNIS - - CONTENIDO - - CONTENUTI - - CONTENDO - - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ - English 1 Franais 8 Deutsch 15 Espaol 22 Italiano 29 Portugus 36 Ελληνικά 43 Symbols/Symboles/Symbole/Smbolos/Simboli/ Simbolos/Σύμβολα/ 51

English English INTENDED USE The MESACUP anti-synthetase TEST is a semi-quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of anti- aminoacyl-trna synthetase antibodies in human serum. The MESACUP anti-synthetase TEST is intended for in vitro diagnostic use, as an aid in the determination of Polymyositis / Dermatomyositis (PM/DM). SUMMARY AND EXPLANATION Anti-aminoacyl-tRNA synthetase (anti-synthetase) autoantibodies can be found in about 35% of patients who have polymyositis (PM) and dermatomyositis (DM) with a high frequency of idiopathic interstitial pneumonia (IIP). The aminoacyl-trna synthetase (Synthetase) is a group of cytoplasmic enzymes that catalyze the binding of trna to their respective amino acids, with a unique enzyme for each amino acid. Autoantibodies to six of these synthetases (histidyl-, threonyl-, alanyl-, isoleucyl-, glycyl-, and asparaginyl-trna synthetases) are known as anti-jo-1, anti-pl7, anti-pl12, anti-oj, anti-ej and anti-ks respectively. Among these anti-synthetase antibodies, anti-jo-1 is the most common, it is found in about 20% of patients with PM/DM (1). Other anti-synthetase antibodies are less common, they are found in 3-4% of such patients. Anti-Jo-1 and other anti-synthetase antibodies have each been associated with a similar syndrome marked by PM/DM and IIP (2-5). To develop an ELISA assay with the highest sensitivity to help in the diagnosis of patients with PM/DM, five recombinant antigens (Jo-1, PL7, PL12, EJ and KS) were mixed together and coated in the same well of ELISA microplate. This ELISA system is able to detect anti-synthetase autoantibodies (anti-jo-1 together with anti-pl7, anti-pl12, anti-ej and anti-ks) present in the patient s serum. PRINCIPLE The MESACUP anti-synthetase TEST is an ELISA that measures anti-synthetase antibodies present in the patient s serum. Calibrators and patient serum are added to the microwells coated with five different recombinant human Synthetase antigens (Jo-1, PL7, PL12, EJ and KS). During sample incubation, anti-synthetase antibodies will react with the immobilized antigen. After washing to remove any unbound serum proteins, horseradish peroxidase conjugated anti-human IgG is added and incubated (Conjugate incubation). After another washing step, the peroxidase substrate is added and incubated for an additional period of time (Substrate incubation). Acid solution is then added to each well to terminate the enzyme reaction and to stabilize the color development. The test result is determined photometrically by measuring the absorbance and plotting the results. BRIEF ASSAY PROCEDURE <Sample incubation> Add 100 l of diluted sample (1:101) to each well of the microwell plate (20-30 C) 60 min. Wash <Conjugate incubation> Add 100 l of Conjugate reagent to each well (20-30 C) 60 min. Wash 1

English <Substrate incubation> (20-30 C) 30 min Add 100 l of Substrate to each well Add 100 l of Stop solution to each well Read absorbance Interprete the result REAGENTS AND STORAGE 1) Synthetase Microwell strips 48 wells Microwell strips (6 x 8 wells) coated with five different recombinant human Synthetase antigens (Jo-1, PL-7, PL-12, EJ and KS). The breakaway strips are packed in a strip holder and sealed in a foil envelope with a desiccant. The strips are stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 2) Calibrator 1 (0 U/mL) One vial containing 1.5 ml of assay diluent containing 0.09% sodium azide. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 3) Calibrator 2 (100 U/mL) One vial containing 1.5 ml of anti-synthetase antibody positive human serum in assay diluent containing 0.09% sodium azide. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 4) Conjugate reagent One vial containing 8 ml of horseradish peroxidase conjugated goat anti-human IgG antibody. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 5) Assay diluent One vial containing 50 ml of PBS, containing Tween 20 and 0.09% sodium azide. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 6) Wash concentrate (20X) One vial containing 50 ml of PBS with Tween 20 concentrate (20x). Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 7) Substrate One vial containing 20 ml of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride/hydrogen peroxide (TMB/ H 2 O 2 ). Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 8) Stop solution One vial containing 20 ml of 0.5N sulfuric acid. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 9) Positive control One vial containing 1.5 ml of anti-synthetase antibody positive human serum in assay diluent containing 2

English 0.09% sodium azide. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. 10) Negative control One vial containing 1.5 ml of anti-synthetase antibody negative human serum in assay diluent containing 0.09% sodium azide. Ready to use, make no further dilution. Stable at 2-8 C until the labeled expiration date. PRECAUTIONS (1) This product is for in vitro diagnostic use only. (2) Do not use the kit components beyond the stated expiration dates. (3) Avoid contact of the reagents with eyes, skin and clothing. Reagents on skin must be washed away with plenty of water. TMB is irritating and the Stop solution consists of 0.5N sulfuric acid, which is a poison and is corrosive. (4) Calibrator 2, Positive control and Negative control are derived from human serum, in which HBs antigen, HCV antibody, HIV-1 and HIV-2 antibodies have not been detected. No test method, however, can guarantee the absence of these or any other infectious agents. These reagents and all patient samples should be handled as if they are capable of transmitting AIDS, hepatitis or any other infectious diseases. (5) Calibrator 1, Calibrator 2, Positive control, Negative control and Assay diluent contain sodium azide (0.09%) as a preservative and must be handled with caution. Do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azides. Therefore, always flush with plenty of water when disposing materials containing sodium azide into a drain. (6) Some kit components contain materials of animal origin, taken from non-infected animals. These components, however, should be treated as potential biohazards in use and for disposal. (7) Matching lot numbers of Microwell strips, Conjugate reagent and Calibrator 2 must be used together in the assay. Do not mix reagents from other kits. (8) All reagents must be brought to room temperature (20-30 C) before starting the assay. (9) Do not expose the kit to direct sun during the test and storage. (10) Avoid microbial and cross contamination of reagents or samples. (11) Incubation temperatures above or below normal room temperature (20-30 C), shorter or longer incubation times and inaccurate dilutions may give erroneous results. (12) The wells must be properly rinsed with Wash solution to avoid false positive results. (13) Carefully pipette each sample and reagent to avoid cross contamination between microwells, avoid foaming. (14) All unused Microwell strips should be returned to the ziplock pouch, which must be carefully resealed to avoid moisture absorption. (15) Wash concentrate may become turbid at 2-8 C, this does not cause inconsistent results. (16) Materials used for the test should be disposed or treated as shown below. Soak in 2% final conc. glutaraldehyde solution for more than 1 hour, soak in 0.1% sodium hypochlorite solution (available chlorine: approx. 1,000 ppm) for more than 1 hour or autoclave at 121 C for more than 20 minutes. (17) The Synthetase antibody values obtained from this assay are aids in the diagnosis only. Each 3

English physician must interpret these results in light of the patient s history, physical findings, and other diagnostic procedure. (18) In the event of damage to the protective packaging, the kit components should be treated or disposed of in accordance with the relevant instructions and regulations of each country. MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader (wavelength: 450 nm, 620 nm/reference) Multichannel micropipette (e.g. 100 l - 300 l) Single channel pipette (e.g. 10 l & 100 l) Reagent reservoir Autowasher or washing bottle Deionized or distilled water One liter graduated cylinder for preparation of Wash solution Test tubes for patient sample dilutions (e.g. 1,000 l) Disposable pipette tips Paper towels Microplate cover PROCEDURE PREPARATION OF REAGENTS 1. Bring all assay materials to room temperature (20-30 C) prior to use. 2. Microwell strips: Remove required Microwell strips from the pouch and place them in the frame. Promptly return unused strips to the refrigerated storage. 3. Wash solution: Prepare 1:20 dilution of the Wash concentrate prior to use (ex. add 50 ml of Wash concentrate to 950 ml of distilled water). The diluted Wash solution is stable for 2 weeks at 2-8 C. 4. Do not dilute Calibrator 1, Calibrator 2, Positive control, Negative control, Conjugate reagent, Assay diluent, Substrate and Stop solution. These reagents are ready-to-use. PREPARATION OF SAMPLES 1. Use fresh patient sera. Samples should be tested as soon as possible after collection. If storage is needed after the test, they should be stored at -20 C or lower. Do not repeat freezing and thawing. 2. Dilute each patient serum 1:101 by adding 10 l of serum to 1 ml of Assay diluent. Diluted samples must be used within a day. Assay diluent may form precipitates, which does not cause inconsistent results. ASSAY PROCEDURE STEP 1. (SAMPLE INCUBATION) Transfer 100 l of Calibrator 1, Calibrator 2, Positive control, Negative control and each diluted sample, with a multichannel micropipette, into the appropriate microwells of the antigen test plate. (Do not dilute Calibrator 1, Calibrator 2, Positive control and Negative control.) Incubation starts on pipetting into the antigen coated microwells. Pipetting should be completed as quickly as possible. Cover the wells with a plate sealer and incubate for 60 minutes at room temperature (20-30 C). 4

English STEP 2. (WASHING) Aspirate or discard the well contents. Fill the well with Wash solution and then completely aspirate or discard the contents. Wash 4 times. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash solution. When autowasher is used, wash 4 times. Each laboratory is recommended to confirm its own appropriate washing times and set- up. Wash solution should be used at 20-30 C. STEP 3. (CONJUGATE INCUBATION) Pour Conjugate reagent into a reservoir. Add 100 l of the Conjugate reagent to each well with a multichannel micropipette. Cover the wells with the plate sealer and incubate for 60 minutes at room temperature (20-30 C). STEP 4. (WASHING) Wash the microplate as described in STEP 2. STEP 5. (SUBSTRATE INCUBATION) Pour Substrate into a reservoir and pipette 100 l of the Substrate to each well with a multichannel micropipette. The reservoir should be different from the one, used for distributing the Conjugate reagent. A new disposable reservoir should be used because Substrate is easily oxidized by metal ion. The Substrate, once put in a reservoir, should not be returned to the vial. Cover the wells with the plate sealer and incubate for 30 minutes at room temperature (20-30 C). STEP 6. (STOP REACTION) Pour Stop solution into a reservoir. Pipette 100 l of the solution to each well with a multichannel micropipette. READING Read the absorbance of each well at 450 nm. If a dual wavelength plate reader is used, set the test wavelength at 450 nm and the reference at 620 nm. Reading should be done within 20 minutes after stopping the reaction. Before reading the plate, ensure that the bottom of the plate is clean and dry, and that no air bubbles are present on the surface of the liquid in the wells. CALCULATION OF RESULT Unit value (U/ml) = QUALITY CONTROL (A 450 <Sample> - A 450 <Calibrator 1>) (A 450 <Calibrator 2> - A 450 <Calibrator 1>) A 450 is abbreviation of absorbance value at 450 nm. x 100 An international reference material for anti-synthetase antibodies is not available. The assay is calibrated in relative arbitrary units. Each assay result should meet the following criteria. A 450 of Calibrator 1: 0.100 A 450 of Calibrator 2: 0.500 The Positive control and the Negative control must give the following results: 5

English Anti-Synthetase value (U/ml): As described in each label. If any of these criteria are not met, the results are invalid and the test should be repeated. Before repeating the test, check the following the following points. Incubation Temperature Incubation Time Washing TEST INTERPRETATION AND EXPECTED VALUE The following is intended only as a guide for interpretation. Each laboratory is recommended to establish its own criteria for test interpretation based on the sample populations that are typically found. Anti-Synthetase value (U/ml) Interpretation < 25 Negative for anti-synthetase Ab Greater than or equal to 25 Positive for anti-synthetase Ab LIMITATIONS As with other diagnostic test procedures, the results obtained with the MESACUP anti-synthetase TEST serve only as an aid in the diagnosis and should not be interpreted as diagnostics in themselves. PERFORMANCE CHARACTERISTICS CLINICAL SPECIFICITY AND SENSITIVITY Disease Positive sample Positive rate PM/DM 32/103 31.1% Others 2/138 1.4% IIP 7/62 11.0% Normal Serum 0/30 0.0% PRECISION PM/DM: Polymyositis / Dermatomyositis IIP: Idiopathic interstitial pneumonia Reproducibility was determined by testing 3 samples 8 times. CV(%) values for reproducibility were equal or below 10% for each sample. LIMITS OF DETECTION 5 U/ml INTERFERING SUBSTANCES Hemoglobin (up to 494.0 mg/dl), Bilirubin C (up to 21.6 mg/dl), Bilirubin F (up to 19.1 mg/dl), chyle (up to 1,590 FTU) and/or Rheumatoid factor (up to 550 IU/ml) are not affective on the assay result, but avoid using highly hemolysed samples or highly lipemic samples. 6

English REFERENCES 1. Nishikai M, Reichlin M: Heterogeneity of precipitating antibodies in polymyositis and dermatomyositis: characterization of Jo-1 antibody system. Arthritis Rheum 23: 881-888, 1980 2. Targoff IN, Arnett FC, Reichlin M: Antibody to threonyl-transfer RNA synthetase in mypsitis sera. Arthritis Rheum 31: 515-524, 1988 3. Hirakata M, Suwa A, Nagai S, Korn MA, Trieu EP, Mimori T, Aizuki M, Targoff IN: Anti-KS: Identification of autoantibodies to asparaginyl-transfer RNA synthetase associated with interstitial lung disease. J. Immunol. 162: 2315-2320, 1999 4. Targoff IN, Trieu EP, Plotz PH, Miller FW: Antibodies to glycyl-transfer RNA synthetase in patients with myositis and interstitial lung disease. Arthritis Rheum 35: 821-820, 1992 5. Targoff IN: Autoantibodies to aminoacyl-transfer RNA synthetases for isoleucine and glycine. J. Immunol. 144: 1737-1743, 1990 7

Franais Franais BUT DU DOSAGE Le MESACUP anti-synthetase TEST est un dosage d'immuno-adsorption par enzyme lie (ELISA) semi-quantitatif pour la dtection des anticorps anti- aminoacyl-arnt synthtase dans le srum humain. Le MESACUP anti-synthetase TEST ne peut tre utilis qu'in vitro. Il est une aide au diagnostic de la polymyosite/dermatomyosite (PM/DM). INFORMATIONS GNRALES Les auto-anticorps anti-aminoacyl-arnt synthtase (anti-synthtase) se rencontrent chez environ 35% des patients souffrant de polymyosite (PM) et de dermatomyosite (DM) ayant trs souvent une pneumopathie interstitielle idiopathique (PII) associe. L'aminoacyl-ARNt synthtase est un groupe d'enzymes cytoplasmiques qui catalysent la liaison entre les ARNt et leurs acides amins respectifs. Chaque acide amin a son enzyme spcifique. Les auto-anticorps dirigs contre chacune de ces six synthtases (histidyl-, thronyl-, alanyl-, isoleucyl-, glycyl- et asparaginyl-trna synthtases) sont respectivement appels anti-jo-1, anti-pl7, anti-pl12, anti-oj, anti-ej et anti-ks. L'anti-Jo-1 est l'anticorps anti-synthtase le plus connu. Il se retrouve chez environ 20% des patients souffrant de PM/DM (1). D'autres anticorps anti-synthtase sont moins frquents: ils se retrouvent chez 3 4% de ces patients. Les anticorps anti-jo-1 et d'autres anticorps anti-synthtase ont t tous les deux associs des symptmes cliniques similaires chez des patients souffrant de PM/DM et d'une PII associe (2-5). Pour obtenir un essai ELISA permettant d'aider au diagnostic des patients souffrant de PM/DM avec une sensibilit la plus leve possible, cinq antignes recombinants (Jo-1, PL7, PL12, EJ et KS) ont t mlangs et adsorbs sur le mme puits de la plaque de microtitration. Ce systme ELISA est capable de dtecter des auto-anticorps (l'anti-jo-1 en mme temps que l'anti-pl7, l'anti-pl12, l'anti-ej et l'anti-ks) prsents dans le srum des patients. PRINCIPE Le MESACUP anti-synthetase TEST est un ELISA qui mesure les auto-anticorps anti-synthtase prsents dans le srum des patients. Des calibrateurs et le srum des patients sont ajouts des puits de microtitration tapisss de cinq antignes synthtase humaine recombinants diffrents (Jo-1, PL7, PL12, EJ et KS). Pendant l'incubation de l chantillon, les anticorps anti-synthtase ragissent avec l'antigne immobilis. Aprs un lavage pour liminer toutes les protines du srum non lies, on ajoute un anticorps anti-igg humaine conjugu une peroxydase de raifort et on incube une nouvelle fois (incubation du conjugu). Aprs une autre tape de lavage, le substrat peroxydase est ajout et incub pendant une priode supplmentaire (incubation du substrat). Une solution acide est ensuite ajoute dans chaque puits pour arrter la raction enzymatique et stabiliser le dveloppement de la couleur. Le rsultat de l'analyse est dtermin de manire photomtrique en mesurant l'absorbance et reportant les rsultats dans un graphique. PROTOCOLE SIMPLIFIE <Incubation de l chantillon> Ajouter 100 l d'chantillon dilu (1:101) chacun des puits de la plaque de microtitration (20-30 C) 60 min. Laver 8

Franais <Incubation du conjugu> (20-30 C) 60 min. <Incubation du substrat> (20-30 C) 30 min. Ajouter 100 l de Conjugu (prt l emploi) chacun des puits Laver Ajouter 100 l de Substrat chacun des puits Ajouter 100 l de Solution d'arrt chacun des puits Lecture de l absorbance Interprtation des rsultats REACTIFS FOURNIS ET STOCKAGE 1) Micro plaque tapisse de Synthtase 48 barrettes de puits de microtitration (6 x 8 puits) tapisss de cinq antignes synthtase humaine recombinants diffrents (Jo-1, PL-7, PL-12, EJ et KS). Les barrettes scables sont emballes dans un porte-barrettes et scelles dans une pochette d'aluminium contenant un agent de dessiccation. Elles sont stables entre 2 et 8 C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 2) Calibrateur 1 (0 U/ml) Un flacon contenant 1,5 ml de diluant de l essai contenant 0,09% d azoture de sodium. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 3) Calibrateur 2 (100 U/ml) Un flacon contenant 1,5 ml de srum humain positif d anticorps anti - Synthtase dans le diluant de l essai contenant 0,09% d azoture de sodium. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 4) Conjugu (prt l emploi) Un flacon contenant 8 ml d anticorps de chvre anti-igg humaine conjugus de la peroxydase de raifort. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 5) Diluant srum Un flacon contenant 50 ml de PBS, de Tween 20 et 0,09% d azoture de sodium. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 6) Solution de lavage (20X) Un flacon contenant 50 ml de PBS, de Tween 20, concentr 20 x. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 7) Substrat Un flacon contenant 20 ml de 3,3',5,5'-ttramthylbenzidine dihydrochloride/peroxyde d hydrogne (TMB/ H 2 O 2 ). Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique 9

Franais sur l'tiquette. 8) Solution d arrt Un flacon contenant 20 ml d'acide sulfurique 0,5N. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 9) Contrle positif Un flacon contenant 1,5 ml de srum humain positif d anticorps anti-synthtase dans le diluant de l essai contenant 0,09% d'azoture de sodium. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. 10) Contrle ngatif Un flacon contenant 1,5 ml de srum humain ngatif d anticorps anti-synthtase dans le diluant de l essai contenant 0,09% d'azoture de sodium. Prt l emploi, ne plus diluer. Stable entre 2 et 8 o C jusqu la date d expiration indique sur l'tiquette. PRCAUTIONS (1) Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. (2) Ne pas utiliser les lments de la trousse aprs la date de premption indique. (3) viter tout contact des ractifs avec les yeux, la peau ou les vtements. En cas de contact des ractifs avec la peau, laver avec beaucoup d eau. Le TMB est irritant et la Solution d arrt est de l'acide sulfurique 0,5N, qui est toxique et corrosif. (4) Le Calibrateur 2, le Contrle positif et le Contrle ngatif sont prpars partir de srums humains, qui ont t tests ngatifs pour l antigne HBs, les anticorps anti-hcv, HIV-1 et HIV-2. Aucune mthode ne pouvant garantir l absence de ces virus ou d autres virus pathognes. Ces ractifs et tous les chantillons des patients doivent tre manipuls comme s ils taient capables de transmettre le SIDA, l hpatite ou d autres maladies infectieuses. (5) Le Calibrateur 1, le Calibrateur 2, le Contrle positif, le Contrle ngatif et le Diluant srum contiennent 0,09% d'azoture de sodium comme conservateur et doivent tre manipuls avec prcaution ne pas ingrer ou permettre du contact avec la peau ou avec les membranes muqueuses. L'azoture de sodium peut provoquer des ractions explosives dans les conduites en fer ou cuivre. Faire couler l eau en abondance lorsqu on se dbarrasse de ces produits. (6) Certains composants de la trousse contiennent des matires d origine animale, provenant d animaux non-infects. Cependant, ces composants doivent tre manipuls comme des dangers biologiques potentiels, lors de l utilisation ainsi que lors du traitement des dchets. (7) Utiliser obligatoirement les mmes lots de Micro plaque, de Conjugu (prt l emploi) et de Calibrateur 2. Ne pas substituer des ractifs d autres trousses. (8) Ramener tous les composants de la trousse temprature ambiante (20-30 C) avant emploi. (9) Ne pas exposer les lments de la trousse la lumire pendant son utilisation ou sa conservation. (10) viter la contamination croise et microbienne des ractifs ou des chantillons. (11) Une temprature d incubation en de ou au-del de la temprature ambiante (20-30 C) ainsi que des temps d incubation augments ou raccourcis ou des dilutions imprcises peuvent donner des rsultats errons. (12) Les puits doivent tre lavs de faon correcte et suffisante avec le tampon de lavage pour viter d obtenir des rsultats faux positifs. 10

Franais (13) Pipeter avec soin chacun des chantillons et des ractifs pour viter une contamination croise entre les puits de microtitration et la formation de mousse. (14) Remettre dans le sachet fermeture clair les barrettes non utilises, bien refermer cet tui pour empcher une hydratation des ractifs. (15) La Solution de lavage (20x) peut tre trouble 2-8 C, sans pour autant influencer la qualit des rsultats obtenus. (16) Le matriel utilis pour le test doit tre jet ou trait comme indiqu ci-dessous. Tremper dans une solution glutaraldhyde concentration finale 2% pendant plus d une heure ou tremper dans une solution sodium hypochlorite 0,1% (chlorine disponible: approx. 1000 ppm) pendant plus d une heure ou autoclaver 121 C pendant plus de 20 minutes. (17) Les valeurs d anticorps anti-synthtase obtenus par ce test ne sont qu un moyen de diagnostic. Chaque mdecin doit interprter ces rsultats dans le cadre de l histoire du patient, des constats mdicaux et d autres procdures diagnostiques. (18) Si l'emballage de protection est endommag, les composants de la trousse doivent tre traits ou jets en respectant les instructions pertinentes et la rglementation du pays. MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI Lecteur de micro plaque (longueur d onde: 450 nm, 620 nm/rfrence) Micropipette multicanaux (p.e. 100 l 300 l) Pipette automatique (p.e. 10 l & 100 l) Rservoir des ractifs Laveur de micro plaque ou flacon pour le tampon de lavage Eau dsionise ou dstille Verre gradu d un litre pour la prparation du tampon de lavage prouvettes pour la dilution des chantillons du patient (p.e. 1000 l) Pointes de pipette jetables Serviettes en papier Couverture de micro-plaque PROCEDURE PREPARATION DES REACTIFS 1. Amener tous les ractifs temprature ambiante (20-30 C) avant utilisation. 2. Plaque de microtitration: retirer le nombre de barrettes ncessaire du sachet et les placer dans le support. Remettre immdiatement au rfrigrateur les barrettes non utilises 3. Solution de lavage: la Solution de lavage (20x) doit tre dilue avant emploi. Diluer la Solution de lavage (20x) en ajoutant 950 ml d eau distille 50 ml la Solution de lavage (20x). Ce tampon de lavage est stable 15 jours 2-8 C. 4. Ne pas diluer le Calibrateur 1, le Calibrateur 2, le Contrle positif, le Contrle ngatif, le Conjugu (prt l emploi), le Diluant srum, le Substrat et la Solution d arrt. Ces ractifs sont prts l'emploi. PREPARATION DES PRELEVEMENTS 1. Utiliser des srums frachement prlevs. Les chantillons doivent tre traits aussi rapidement que possible avec le prlvement. S'ils doivent tre conservs aprs l'analyse, ils doivent l'tre -20 C ou 11

Franais moins. viter les tapes de conglation-dconglation. 2. Diluer chaque srum de patient au 1: 101 en ajoutant 10 l de srum 1 ml de Diluant srum. Les chantillons dilus doivent tre utiliss le jour mme. Le Diluant srum peut prcipiter, ce qui ne provoque pas de rsultats inconsistants. PROTOCOLE PHASE 1. (INCUBATION DE L ECHANTILLON) Transfrer, en utilisant la micropipette multicanaux, 100 l du Calibrateur 1, du Calibrateur 2, du Contrle positif, du Contrle ngatif et de chacun des chantillons dilus dans les puits respectifs de la plaque de microtitration tapisse de l'antigne. (Ne pas diluer le Calibrateur 1, le Calibrateur 2, le Contrle positif et le Contrle ngatif.) L incubation dmarre au moment o les chantillons sont dposs dans les micro-puits. Procder le plus rapidement possible cette tape. Recouvrir les puits avec une couverture et incuber temprature ambiante (20-30 C) pendant 60 minutes. PHASE 2. (LAVAGE) Aspirer ou liminer le contenu des puits. Remplir les puits avec la Solution de lavage et aspirer compltement pour liminer le liquide. Faire 4 lavages. Retourner la plaque sur un papier absorbant et tapoter pour liminer tout la Solution de lavage. Si un laveur automatique est utilis, laver 4 fois. On recommande chaque laboratoire d tablir ses propres conditions de lavage (mise en place et temps). La Solution de lavage doit tre temprature ambiante (20-30 C). PHASE 3. (INCUBATION DU CONJUGUE) Transfrer le Conjugu (prt l emploi) dans le rservoir. Pipeter 100 l du Conjugu (prt l emploi) dans chaque puits l aide d une micropipette multicanaux. Recouvrir les puits avec une couverture et incuber temprature ambiante (20-30 C) pendant 60 minutes. PHASE 4. (LAVAGE) Laver la micro-plaque selon la procdure de la PHASE 2. PHASE 5. (INCUBATION DU SUBSTRAT) Transfrer le Substrat dans un rservoir. Pipeter 100 l du Substrat dans chaque puits l aide d une micropipette multicanaux. Ce rservoir doit tre diffrent de celui utilis pour le Conjugu (prt l emploi). Un rservoir neuf doit tre utilis car le Substrat est facilement oxyd par la prsence d ions mtalliques. Le Substrat, ds qu il a t transfr dans un rservoir, ne peut pas tre remis dans la bouteille. Recouvrir les puits avec une couverture de micro-plaque et incuber temprature ambiante (20-30 C) pendant 30 minutes. PHASE 6. (ARRET DE LA REACTION) Transfrer la Solution d arrt dans un rservoir. Pipeter 100 l de cette solution dans chaque puits avec une micropipette multicanaux. LECTURE Lire l absorbance de chaque puits 450 nm. Si on utilise un lecteur avec un double faisceau, lire les puits 450 nm et la rfrence 620 nm. La lecture doit se faire dans les 20 minutes aprs l'arrt de la raction. 12

Franais Vrifier si le fond de la plaque est propre et sec, et s il n y a pas de bulles la surface du liquide des puits avant de lire la plaque. CALCUL DES RESULTATS Valeur (U/ml) = A 450 nm Ech - A 450 nm Cal. 1 A 450 nm Cal. 2 - A 450 nm Cal. 1 x 100 A 450 nm est la valeur de l absorbance 450 nm. Il n y a pas de donnes de rfrence internationales pour des anticorps anti- synthtase; le test est calibr en units relativement arbitraires. CONTRLE DE QUALIT Pour valider le test, tenir compte des indications suivantes: L A 450 nm du Calibrateur 1: 0,100 L A 450 nm du Calibrateur 2: 0,500 Le Contrle positif et le Contrle ngatif doivent donner les rsultats suivants: Anti-synthtase valeur (U/ml): voir les tiquettes. Si une de ces conditions n est pas remplie, les rsultats sont non valables et le test doit tre rpt. Avant de rpter le test, vrifier les points suivants. Temprature d Incubation Dlai d Incubation Lavage INTERPRTATION ET VALEURS ATTENDUES Les donnes suivantes sont fournies afin de faciliter l interprtation. On recommande chaque laboratoire d laborer ses propres critres pour l interprtation du test bass sur des populations d chantillons typiques. LIMITATIONS Anti-synthtase (U/ml) Interprtation < 25 Ngatif pour les Anti-synthtase Suprieur ou gal 25 Positif pour les Anti-synthtase Comme dans d autres procdures de test diagnostiques, les rsultats obtenus avec le MESACUP anti-synthetase TEST ne peuvent tre qu un moyen diagnostique qui ne peut pas tre interprt lui-mme comme un diagnostic. PERFORMANCE SPCIFICIT ET SENSIBILIT CLINIQUE Maladie chantillon positif Valeur positive PM/DM 32/103 31,1% 13

Franais Autres 2/138 1,4% PII 7/62 11,0% Srum normal 0/30 0,0% PRCISION PM/DM: Polymyose / Dermatomyosite PII: Pneumopathie interstitielle idiopathique La reproductibilit a t dtermine en testant 8 fois 3 chantillons. Le CV (%) pour la reproductibilit pour chacun des chantillons tait gal ou infrieur 10%. LIMITES DE DTECTION 5 U/ml INTERFRENCES L Hmoglobine (jusque 494,0 mg/dl), la Bilirubine C (jusque 21,6 mg/dl), la Bilirubine F (jusque 19,1 mg/dl), le chyle (jusque 1590 FTU) et/ou le facteur rhumatode (jusque 550 IU/ml) n influencent pas le rsultat de l analyse, mais viter d utiliser des chantillons fortement hmolyss ou fortement lipmiques. RFRENCES 1. Nishikai M, Reichlin M: Heterogeneity of precipitating antibodies in polymyositis and dermatomyositis: characterization of Jo-1 antibody system. Arthritis Rheum 23: 881-888, 1980 2. Targoff IN, Arnett FC, Reichlin M: Antibody to threonyl-transfer RNA synthetase in mypsitis sera. Arthritis Rheum 31: 515-524, 1988 3. Hirakata M, Suwa A, Nagai S, Korn MA, Trieu EP, Mimori T, Aizuki M, Targoff IN: Anti-KS: Identification of autoantibodies to asparaginyl-transfer RNA synthetase associated with interstitial lung disease. J. Immunol. 162: 2315-2320, 1999 4. Targoff IN, Trieu EP, Plotz PH, Miller FW: Antibodies to glycyl-transfer RNA synthetase in patients with myositis and interstitial lung disease. Arthritis Rheum 35: 821-820, 1992 5. Targoff IN: Autoantibodies to aminoacyl-transfer RNA synthetases for isoleucine and glycine. J. Immunol. 144: 1737-1743, 1990 14

Deutsch Deutsch VERWENDUNGSZWECK Der MESACUP anti-synthetase TEST ist ein semi-quantitativer Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis von anti-aminoacyl-trna-synthetase-antikrpern in Humanserum. Der MESACUP anti-synthetase TEST kann in der In-vitro-Diagnostik als Hilfsmittel bei der Diagnose von Polymyositis/Dermatomyositis (PM/DM) eingesetzt werden. ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLRUNG Anti-Aminoacyl-tRNA-Synthetase (anti-synthetase)-autoantikrper knnen in etwa 35% der Patienten, die an Polymyositis (PM) und Dermatomyositis (DM) mit einer hohen Inzidenz idiopathischer interstitieller Pneumonie (IIP) leiden, nachgewiesen werden. Die Aminoacyl-tRNA Synthetase (Synthetase) besteht aus einer Gruppe von zytoplasmatischen Enzymen, welche die Bindung der trna mit einem speziellen Enzym fr jede Aminosure an ihre jeweiligen Aminosuren katalysieren. Die Autoantikrper gegen sechs dieser Synthetasen (Histidyl-, Threonyl,- Alanyl-, IARS2-, Glycyl- und NARS2-tRNA Synthetasen) werden als anti-jo-1, anti-pl7, anti-pl12, anti-oj, anti-ej und anti-ks bezeichnet. Unter diesen anti-synthetase-antikrpern ist anti-jo-1 der hufigste, er lsst sich in etwa 20% der Patienten mit PM/DM nachweisen(1). Andere anti-synthetase-antikrper sind weniger verbreitet, man findet sie in 3 bis 4% dieser Patienten. Anti-Jo-1 und andere anti-synthetase-antikrper wurden jeweils mit einem hnlichen Syndrom in Verbindung gebracht, das sich PM/DM und IIP zuordnen lsst (2-5). Um ein ELISA-Assay mit der hchsten Empfindlichkeit zu entwickeln, das bei der Diagnose von Patienten mit PM/DM eingesetzt werden kann, wurden fnf rekombinante Antigene (Jo-1, PL7, PL12, EJ und KS) gemischt. Mit dieser Mischung wurden die Vertiefungen einer ELISA Mikrotiterplatte beschichtet. Dieses ELISA-System kann anti-synthetase-autoantikrper (anti-jo-1 zusammen mit anti-pl7, anti-pl12, anti-ej und anti-ks) im Serum des Patienten nachweisen. TESTPRINZIP Der MESACUP anti-synthetase TEST ist ein ELISA-Assay, der anti-synthetase-antikrper im Serum des Patienten nachweist. Kalibratoren und Patientenserum werden zu den mit fnf verschiedenen rekombinanten menschlichen Synthetase-Antigenen (Jo-1, PL7, PL12, EJ und KS) beschichteten Vertiefungen hinzugefgt. Whrend der Inkubationsphase der Probe reagieren die anti-synthetase-antikrper mit dem immobilisierten Antigen. Nach einem Waschschritt, zur Entfernung nicht gebundener Serumproteine, werden mit Meerrettichperoxidase markierte Antikrper gegen Human-IgG hinzugefgt und inkubiert (Konjugatinkubation). Nach einem zweiten Waschschritt wird das Peroxidasesubstrat hinzugefgt. Es folgt die Substratinkubation. Dann wird Sure in die Vertiefungen gegeben, um die Enzymreaktion zu stoppen und die Farbentwicklung zu stabilisieren. Anschlieend werden die Vertiefungen photometrisch gemessen und die Ergebnisse in quantitativen Einheiten ermittelt. KURZFASSUNG DER TESTDURCHFHRUNG <Probeninkubation> In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte (20-30 C) 60 Min. 100 l verdnnte Probe (1:101) hinzufgen Waschen <Konjugatinkubation> In jede Vertiefung 100 l Konjugatreagenz geben 15

Deutsch (20-30 C) 60 Min. <Substratinkubation> (20-30 C) 30 Min. Waschen In jede Vertiefung 100 l Substrat geben In jede Vertiefung 100 l Stopplsung geben Photometrieren Ergebnisse auswerten REAGENZIEN UND IHRE LAGERUNG 1) Synthetase-Mikrotiterstreifen Mikrotiterstreifen mit 48 Vertiefungen (6 x 8 Vertiefungen), die mit fnf verschiedenen rekombinanten menschlichen Synthetase-Antigenen (Jo-1, PL-7, PL-12, EJ und KS) beschichtet sind. Die Streifen mit Halterahmen sind in einem Folienbeutel mit Trockenmittel verpackt. Sie sind bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 2) Kalibrator 1 (0 U/ml) Eine Flasche mit jeweils 1,5 ml Probendiluent. Enthalten 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 3) Kalibrator 2 (100 U/ml) Eine Flasche mit jeweils 1,5 ml Anti-Synthetase positiven Humanserum und Probendiluent. Enthalten 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 4) Konjugatreagenz Eine Flasche (8 ml) mit Meerrettichperoxidase markierten Ziegenantikrpern gegen Human-IgG. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 5) Probendiluent Eine Flasche (50 ml) mit PBS, Tween 20 und 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 6) Waschkonzentrat (20X) Eine Flasche (50 ml) mit PBS und Tween 20; Konzentrat (20x). Bei 2-8 oc bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 7) Substrat Eine Flasche (20 ml) mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid/Wasserstoffperoxid (TMB/H 2 O 2 ). Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 16

Deutsch 8) Stopplsung Eine Flasche (20 ml) mit 0,5 N Schwefelsure. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 9) Positivkontrolle Eine Flasche mit jeweils 1,5 ml Anti-Synthetase positiven Humanserum und Probendiluent. Enthalten 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 10) Negativkontrolle Eine Flasche mit jeweils 1,5 ml Anti-Synthetase negativen Humanserum und Probendiluent. Enthalten 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig, nicht verdnnen. Bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN (1) Nur fr in-vitro Diagnostik. (2) Die Bestandteile eines Testkits nicht ber ihr Verfallsdatum hinaus verwenden. (3) Berhrung der Reagenzien mit Augen, Haut und Bekleidung vermeiden. Bei Berhrung mit der Haut sofort mit viel Wasser splen. TMB ist irritierend und die Stopplsung enthlt 0,5 N Schwefelsure, einen giftigen und tzenden Stoff. (4) Kalibrator 2, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle sind aus Humanseren hergestellt, die mit negativem Ergebnis auf HBs-Antigen, HCV- sowie HIV 1 und HIV 2-Antikrper untersucht wurden. Indes kann kein Testverfahren gewhrleisten, dass diese oder andere infektise Erreger nicht vorhanden sind. Diese Reagenzien und alle Patientenproben sollten daher so behandelt werden, als knnten sie AIDS, Hepatitis oder andere Infektionskrankheiten bertragen. (5) Der Kalibrator 1, der Kalibrator 2, die Positivkontrolle, die Negativkontrolle und der Probendiluent enthalten Natriumazid (0,09%) als Konservierungsstoff. Sie mssen mit Vorsicht behandelt werden. Nicht einnehmen und nicht mit Haut und Schleimhuten in Berhrung bringen. Natriumazid kann mit Kupfer- oder Bleirohren unter Ausbildung explosiver Metallazide reagieren. Falls Natriumazid-haltige Lsungen in den Ausguss entsorgt werden, sollte daher mit viel Wasser gesplt werden. (6) Einige Bestandteile des Kits enthalten Materialien aus nicht-infizierten Tieren. Trotzdem sollten diese Bestandteile als potentiell biogefhrlich gehandhabt und entsorgt werden. (7) Nur die Mikrotiterstreifen zusammen mit Konjugat und Kalibrator 2 aus Kits der gleichen Charge verwenden. Die Reagenzien aus unterschiedlichen Kitchargen nicht gegenseitig austauschen. (8) Vor Gebrauch mssen alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20-30 C) gebracht werden. (9) Whrend der Lagerung und Testdurchfhrung den Kit und seine Reagenzien vor der Sonne schtzen. (10) Reagenzien und Proben vor Verunreinigung durch Mikroorganismen und gegenseitigen Kontakt schtzen. (11) Entgegen den Empfehlungen in der Testanleitung vernderte Inkubationstemperaturen, Inkubationszeiten und Verdnnungen knnen die Ergebnisse verflschen. (12) Die Vertiefungen mssen sorgfltig mit der Waschlsung gewaschen werden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. (13) Beim Pipettieren der Proben und Reagenzien Schaumbildung vermeiden, um einer Verschleppung auf benachbarte Vertiefungen vorzubeugen. 17

Deutsch (14) Nicht bentigte Mikrotiterstreifen mssen sofort wieder in den Folienbeutel gelegt und dieser sorgfltig versiegelt werden, damit kein Kondenswasser gebildet wird. (15) Das Waschkonzentrat (20x) kann bei 2-8 C trb werden. Fr die Ergebnisse ist das unerheblich. (16) Im Test benutzte Gefe etc. sollten wie folgt behandelt werden: 1. 1 Stunde in eine Glutaraldehyd-Lsung (2% Endkonzentration) legen oder lnger als 1 Stunde mit einer 0,1%igen Natriumhypochloritlsung (verfgbarer Chlorgehalt ca. 1000 ppm) behandeln oder lnger als 20 Minuten bei 121 C autoklavieren. (17) Die mit diesem Test ermittelten Synthetase-Autoantikrperspiegel sind nur als Hilfestellung zur Diagnosefindung zu betrachten. Bei der Beurteilung der Ergebnisse muss der Arzt die anamnestische Erhebung, die Befunde der krperlichen Untersuchung und die Daten anderer diagnostischer Verfahren bercksichtigen. (18) Wenn die Schutzverpackung beschdigt wurde, mssen die Kit-Komponenten gem den entsprechenden lokalen Richtlinien und Vorschriften entsorgt werden. BENTIGTE, ABER NICHT GELIEFERTE MATERIALIEN Mikrotiterplatten Reader (Wellenlnge: 450 nm, 620 nm/referenzfilter) Multikanal Mikropipette (z.b. 100 l 300 l) Pipette (z.b. 10 l und 100 l) Gefe fr Reagenzien Waschgert oder Spritzflasche Entionisiertes oder destilliertes Wasser Messzylinder (1 Liter) zur Herstellung der Waschlsung Rhrchen fr die Probenverdnnungen (z.b. 1000 l) Einmal-Pipettenspitzen Papierhandtcher Klebefolie TESTDURCHFHRUNG VORBEREITUNG DER REAGENZIEN 1. Vor Gebrauch alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur (20-30 C) bringen. 2. Mikrotiterstreifen: Bentigte Mikrotiterstreifen dem Folienbeutel entnehmen und im Halterahmen verankern. Beutel mit den nicht bentigten Mikrotiterstreifen sofort wieder versiegeln und im Khlschrank aufbewahren. 3. Waschlsung: Waschkonzentrat (20x) 1:20 verdnnen (z.b. 50 ml Waschkonzentrat (20x) in 950 ml Aqua dest. geben). Die gebrauchsfertige Waschlsung ist 2 Wochen bei 2-8 C haltbar. 4. Kalibrator 1, Kalibrator 2, Positivkontrolle, Negativkontrolle, Konjugatreagenz, Probendiluent, Substrat und Stopplsung sind gebrauchsfertig. Sie drfen nicht verdnnt werden. VORBEREITUNG DER PROBEN 1. Frische Patientenseren verwenden. Die Proben mssen nach der Entnahme sobald wie mglich getestet werden. Falls sie nach dem Test aufbewahrt werden mssen, knnen sie bei -20 C oder klter aufbewahrt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. 2. Jedes Patientenserum wird 1:101 verdnnt (10 l Serum mit 1 ml Probendiluent) Verdnnte Proben innerhalb des selben Tages aufbrauchen. 18

Deutsch Probendiluent kann Przipitate bilden, die keinen Einfluss auf die Resultate haben. TESTABLAUF SCHRITT 1. (PROBENINKUBATION) Mit einer Multikanal Mikropipette werden je 100 l von Kalibrator 1, Kalibrator 2, der Positivkontrolle, der Negativkontrolle und den verdnnten Patientenseren in die entsprechenden Vertiefungen der Antigen Testplatte pipettiert. (Verdnnen Sie Kalibrator 1, Kalibrator 2, Positivkontrolle und die Negativkontolle nicht.) Die Inkubation startet mit dem Pipettieren in die antigenbeschichtet Mikrotiterplatte. Das Pipettieren sollte so schnell wie mglich durchgefhrt werden. Streifen mit Klebefolie abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-30 C) inkubieren. SCHRITT 2. (WASCHEN) Inhalt in den Vertiefungen absaugen oder auskippen. Mit Waschlsung fllen und vollstndig absaugen oder auskippen. Insgesamt viermal waschen. Abschlieend Streifen gegen Papierhandtcher ausklopfen, um die letzten Reste an Waschlsung zu entfernen. Bei Einsatz eines automatischen Waschgerts viermal waschen. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Waschzeiten und bedingungen festlegt. Die Waschlsung sollte bei (20-30 C) verwendet werden. SCHRITT 3. (KONJUGATINKUBATION) Das Konjugatreagenz in eine Wanne geben. Mit einer Multikanal Mikropipette 100 l Konjugatreagenz in jede Vertiefung pipettieren. Mit Klebefolie abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-30 C) inkubieren. SCHRITT 4. (WASCHEN) Die Streifen wie im SCHRITT 2. beschrieben waschen. SCHRITT 5. (SUBSTRATINKUBATION) Das Substrat in eine Wanne geben. Mit einer Multikanal Mikropipette 100 l in jede Vertiefung pipettieren. Nicht dieselbe Wanne wie jene fr das Konjugatreagenz verwenden. Am besten eignet sich eine neue Einwegwanne, da das Substrat leicht durch Metallionen oxidiert wird. Ggf. in der Wanne brig gebliebenes Substrat darf nicht in die Substratflasche zurckgefhrt werden. Mit Klebefolie abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-30 C) inkubieren. SCHRITT 6. (ABSTOPPEN) Die Stopplsung in eine Wanne geben. Mit einer Multikanal Mikropipette 100 l in jede Vertiefung pipettieren. PHOTOMETRISCHE MESSUNG Die Extinktion jeder Vertiefung bei 450 nm messen. Bei Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlngen erfolgt die Extinktionsmessung bei 450 nm, die Referenzmessung bei 620 nm. Die Messung sollte innerhalb von 20 Minuten nach Beendigung der Reaktion erfolgen. Stellen Sie vor dem Ablesen sicher, dass die Unterseite der Platte sauber und trocken ist und dass sich in den Vertiefungen keine Luftblasen auf der Flssigkeitsoberflche befinden. 19

Deutsch BERECHNUNG DER ERGEBNISSE (A 450 <Probe> - A 450 <Kalibrator 1>) Einheiten (U/ml) = x 100 (A 450 <Kalibrator 2> - A 450 <Kalibrator 1>) A 450 bedeutet: Extinktion bei 450 nm. Da eine internationale Referenzprparation fr Synthetase-Autoantikrper nicht verfgbar ist, ist der Test in relativen arbitrren Einheiten kalibriert. QUALITTSKONTROLLE Bei jedem Testansatz mssen folgende Kriterien erfllt sein: A 450 vom Kalibrator 1: 0,100 A 450 vom Kalibrator 2: 0,500 Die Positivkontrolle und die Negativkontrolle mssen folgende Ergebnisse zeigen: Anti-Synthetase Wert (U/ml): Wie auf jedem Etikett beschrieben. Wird einer dieser Werte nicht erreicht, sind die Ergebnisse ungltig. Der Testlauf sollte wiederholt werden. Ehe der Testlauf wiederholt wird, sind folgende Parameter zu berprfen. Inkubationstemperatur Inkubationszeiten Waschverfahren BEURTEILUNG DER ERGEBNISSE UND ERWARTETE WERTE Die folgenden Daten dienen nur der Orientierung. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Grenzwerte auf der Grundlage der von ihm betreuten Patientenpopulationen erstellt. Anti-Synthetase Wert (U/ml) Beurteilung < 25 Negativ fr Anti- Synthetase grsser oder gleich als 25 GRENZEN DES VERFAHRENS Positiv fr Anti- Synthetase Wie bei anderen diagnostischen Verfahren sind die mit dem ermittelten MESACUP anti-synthetase TEST Ergebnisse nur eine Hilfestellung bei der Diagnostik und nicht diagnostisch an sich zu werten. LEISTUNGSMERKMALE KLINISCHE SPEZIFITT UND SENSITIVITT Erkrankung Positive Proben Positivrate PM/DM 32/103 31,1% Andere 2/138 1,4% IIP 7/62 11,0% Normales Serum 0/30 0,0% 20

Deutsch PRZISION PM/DM: Polymyositis/Dermatomyositis IIP: idiopathische interstitielle Pneumonie Die Reproduzierbarkeit wurde durch 8-maliges Testen von 3 Proben bestimmt. Die CV(%) Werte fr die Reproduzierbarkeit waren fr jede Probe gleich oder kleiner als 10%. NACHWEISGRENZEN 5 U/ml INTERFERENZEN Hmoglobin (bis 494,0 mg/dl), Bilirubin C (bis 21,6 mg/dl), Bilirubin F (bis 19,1 mg/dl), Chylus (bis 1590 FTU) und / oder Rheumafaktoren (bis 550 IU/ml) beeintrchtigen die Testergebnisse nicht. Stark hmolytische und stark lipmische Proben sollten aber vermieden werden. LITERATUR 1. Nishikai M, Reichlin M: Heterogeneity of precipitating antibodies in polymyositis and dermatomyositis: characterization of Jo-1 antibody system. Arthritis Rheum 23: 881-888, 1980 2. Targoff IN, Arnett FC, Reichlin M: Antibody to threonyl-transfer RNA synthetase in mypsitis sera. Arthritis Rheum 31: 515-524, 1988 3. Hirakata M, Suwa A, Nagai S, Korn MA, Trieu EP, Mimori T, Aizuki M, Targoff IN: Anti-KS: Identification of autoantibodies to asparaginyl-transfer RNA synthetase associated with interstitial lung disease. J. Immunol. 162: 2315-2320, 1999 4. Targoff IN, Trieu EP, Plotz PH, Miller FW: Antibodies to glycyl-transfer RNA synthetase in patients with myositis and interstitial lung disease. Arthritis Rheum 35: 821-820, 1992 5. Targoff IN: Autoantibodies to aminoacyl-transfer RNA synthetases for isoleucine and glycine. J. Immunol. 144: 1737-1743, 1990 21

Espaol Espaol INDICACIONES La MESACUP anti-synthetase TEST es un ensayo semi cuantitativo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) para la deteccin de anticuerpos contra la aminoacil-tarn sintetasa en suero humano. La MESACUP anti-synthetase TEST est destinada al uso de diagnstico in vitro, como ayuda en la determinacin de Polimiositis/Dermatomiositis (PM/DM). RESUMEN Y EXPLICACIN Se pueden encontrar auto anticuerpos anti aminoacil tarn sintetasa (anti Sintetasa) en alrededor de 35% de los pacientes que presentan polimiositis (PM) y dermatomiositis (DM) con una frecuencia alta de Neumona intersticial idioptica (PII). La aminoacil tarn sintetasas (Sintetasa) son un grupo de enzimas citoplasmticas que catalizan la unin del tarn a sus aminocidos respectivos, con una enzima nica para cada aminocido. Auto anticuerpos para seis de estas sintetasas (histidil-, treonil-, alanil-, isoleucil-, glicil-, y asparaginil-tarn sintetasas) se conocen como anti Jo-1, anti PL7, anti PL12, anti OJ, anti EJ y anti KS respectivamente. Entre estos anticuerpos anti Sintetasa, el anti Jo-1 es el ms comn, se encuentra en alrededor de 20% de los pacientes con PM/DM (1). Los otros anticuerpos anti Sintetasa son menos comunes y se encuentran en alrededor de 3-4% de dichos pacientes. El anti Jo-1 y otros anticuerpos anti Sintetasa han sido asociados, cada uno, con un sndrome similar marcado por PM/DM y PII (2-5). Para desarrollar un ensayo ELISA con la ms alta sensibilidad para ayudar al diagnstico de pacientes con PM/DM, se mezclaron y se utilizaron cinco antgenos recombinantes (Jo-1, PL7, PL12, EJ y KS) para recubrir el mismo pocillo de la microplaca ELISA. Este sistema ELISA es capaz de detectar los auto anticuerpos anti Sintetasa (anti-jo-1 junto con anti PL7, y anti PL12, y anti EJ y anti KS) presentes en el suero del paciente. FUNDAMENTO La MESACUP anti-synthetase TEST es un ELISA que mide anticuerpos anti Sintetasa presentes en el suero del paciente. Los calibradores y el suero del paciente se agregan a los pocillos recubiertos con cinco antgenos diferentes de sintetasa humana recombinante (Jo-1, PL7, PL12, EJ y KS). Durante la incubacin de la muestra los anticuerpos anti Sintetasa reaccionarn con el antgeno inmovilizado. Tras lavar para eliminar las protenas del suero no unidas, se aade anti-igg humana conjugada con Peroxidasa horseradish y se incuba la mezcla (incubacin del conjugado). Tras lavar de nuevo, se aade el sustrato de la Peroxidasa y se incuba (incubacin del sustrato). Por ltimo, se detiene la reaccin enzimtica aadiendo solucin cida, permitiendo as que se estabilice el desarrollo del color. El ensayo se puede cuantificar por determinacin fotomtrica, pudiendo despus representar los resultados grficamente. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO <Incubacin: Muestra> Aadir 100 l de muestra diluida (1:101) a cada pocillo de la microplaca (20-30 C) 60 min. <Incubacin: Conjugado> Lavar Aadir 100 l de Reactivo conjugado a cada pocillo 22