Γενετική ποικιλότητα και πιθανή εξέλιξη τεσσάρων πληθυσμών της οξιάς στη Ροδόπη

Γενετική ποικιλότητα και πιθανή εξέλιξη τεσσάρων πληθυσμών της οξιάς στη Ροδόπη ΒΙΔΆΛΗ ΑΜΑΡΥΛΛΊΣ (1), ΠΑΠΑΓΕΩΡΓΊΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΈΛΗΣ (1), GAILING OLIVER (2), ΤΣΙΡΙΠΊΔΗΣ ΙΩΆΝΝΗΣ (3) και FINKELDEY REINER (2) 1) Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Τμήμα Δασολογίας και Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανταζίδου 193, 68200 Ορεστιάδα 2) Georg-August Universität Göttingen, Abteilung Forstgenetik, Büsgenweg 2, D- 37077 Göttingen, Γερμανία 3) Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Τμήμα Βιολογίας, 54124 Θεσσαλονίκη Περίληψη Το γένος της οξιάς (Fagus ssp.) αποτελεί ένα από τα πιο αντιπροσωπευτικά και σημαντικά, από οικολογική και οικονομική άποψη, πλατύφυλλα για την περιοχή της Ευρώπης. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η γενετική ποικιλότητα τεσσάρων πληθυσμών της οξιάς στην ελληνική Ροδόπης με τη χρήση μοριακών δεικτών. Χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι των AFLPs και των μικροδορυφόρων (SSR) για τη γενετική ανάλυση 25 ατόμων από τέσσερις πληθυσμούς. Για την περίπτωση των AFLP, ο συνδυασμός εκκινητών που έδωσε τον μεγαλύτερο πολυμορφισμό είναι ο Ε37/Μ68, με τη χρήση του οποίου 34 από τους γενετικούς τόπους που εξετάσθηκαν βρέθηκαν πολυμορφικοί. Το ποσοστό των πολυμορφικών γενετικών τόπων παρουσίασαν αύξηση από τα δυτικά προς τα ανατολικά. Στην περίπτωση των μικροδορυφόρων χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικοί εκκινητές χλωροπλαστικού DNA (ccmp7 και ccmp10), η ανάλυση των οποίων οδήγησε στην αναγνώριση 16 απλοτύπων, με τους ανατολικότερους πληθυσμούς της Δαδιάς και του Παπίκιου να περιέχουν τον μεγαλύτερο αριθμό αυτών. Τα αποτελέσματα της έρευνας δείχνουν τη γενετική ποικιλότητα και την ποικιλομορφία απλοτύπων να σχετίζεται με τη γεωγραφική θέση και το υψόμετρο των πληθυσμών. Επιπλέον, ενισχύεται η άποψη ότι η περιοχή μελέτης αποτελεί πιθανό σημείο συνάντησης της δασικής F.sylvatica ssp.sylvatica και της ανατολικής F.sylvatica ssp. orientalis οξιάς.

Genetic diversity and possible evolution of four beech populations in Rodopi VIDALIS AMARYLLIS (1), PAPAGEORGIOU ARISTOTELIS (1), GAILING OLIVER (2), TSIRIPIDIS IOANNIS (3), and FINKELDEY REINER (2) 1) Democritus University of Thrace, Department of Forestry and Management of the Environment and Natural Resources, Pantazidou 193, GR-68200, Greece 2) Georg-August Universität Göttingen, Abteilung Forstgenetik, Büsgenweg 2, D- 37077 Göttingen, Germany 3) Aristotle University of Thessaloniki, Department of Biology, GR-54124 Thessaloniki, Greece Abstract Fagus is one of the most represented tree genera in Europe and the Balkan countries and one of the most important, ecologically and economically, broadleaved tree in western Eurasia. Bud samples were collected from four Fagus populations (25 individuals sampled from each population) in the area of Rodopi Mountains in northeastern Greece. Genetic diversity within and between these populations was estimated by the use of DNA molecular markers (AFLPs and cpdna SSR). For AFLPs the primer combination E37/M68 showed the largest polymorphism compared to all other primer combinations tested. As many as 34 loci were found polymorphic whereas the percentage of the polymorphic loci had an increasing trend from the west to the east. In the case of SSR, two different primers of cpdna were used to assess genetic diversity within and among the populations sampled. The analysis of the results demonstrated 16 different haplotypes. The majority of these haplotypes occurred in the eastern most populations (Papikio and Dadia). The results of this study indicate that diversity parameters and haplotype richness are strongly correlated with the existence of geographical races. Moreover, in Rodopi, the introgression between the two species probably occurs in a longitudinal and altitudinal gradient.

Εισαγωγή Η οξιά είναι ένα από τα πιο διαδεδομένα και σημαντικά, τόσο από οικολογική όσο και από οικονομική άποψη, πλατύφυλλα της Ευρώπης (Widmer και Lexer 2001, Denk et al. 2002). Συστηματικά ανήκει στην οικογένεια Fagaceae και στο γένος Fagus. Στην περιοχή της Ευρώπης και της νοτιοδυτικής Ασίας εκπροσωπείται σύμφωνα με πολλούς ερευνητές από δύο είδη: Fagus sylvatica και Fagus orientalis (π.χ. Tutin et al. 1964). H σύγχρονη και επικρατούσα άποψη θέλει το δεύτερο ως υποείδος του πρώτου (Greuter et al. 1984). Ένα τρίτο είδος, η Fagus moesiaca θεωρείται φυλογενετικός σύνδεσμος μεταξύ των δύο άλλων ειδών (Mišic 1957) ή ακόμα και υβρίδιο της Fagus sylvatica και της Fagus orientalis (Stoyanoff 1932) και σπανιότερα ξεχωριστό είδος της περιοχής (Czeczott 1933). Η ταξινομική οντότητα της F. moesiaca αμφισβητείται (Greuter et al. 1984). Πιστεύεται ότι οι σημερινοί πληθυσμοί της οξιάς στην Ευρώπη έχουν κοινή προέλευση από προγενέστερους πληθυσμούς που επέζησαν σε περιοχές καταφύγια (refugia) κατά τη διάρκεια των τελευταίων παγετώνων. Σε ότι αφορά τη Fagus sylvatica η περιοχή της Βαλκανικής χερσονήσου θεωρείται ότι αποτελεί ένα από τα βασικότερα καταφύγια (Demesure et al. 1996, Vettori et al. 2004). Οι γενετικές αναλύσεις με βιοχημικούς και μοριακούς δείκτες στην οξιά έχουν συμβάλλει στην προσπάθεια κατανόησης της μεταναστευτικής διαδρομής της μετά τους παγετώνες. Οι Comps et al. (1990), ερευνώντας την οξιά σε επίπεδο αλληλομόρφων και γενοτύπων ισοενζυμικών δεικτών, παρατήρησαν ότι η ποικιλότητα μεταξύ των πληθυσμών είναι χαμηλότερη από αυτή εντός πληθυσμών, με την περιοχή της Μεσογείου να εξαιρείται από αυτήν την τάση. Επιπλέον οι Demesure et al. (1996) βρήκαν μεγάλη ομοιομορφία στo χλωροπλαστικό DNA στην ευρύτερη περιοχή της κεντρικής Ευρώπης με μόνους γενετικά απομακρυσμένους τους πληθυσμούς της Ιταλίας. Η χρήση ισοενζύμων από τους Hazler et al. (1997) παρουσίασε μεγάλο βαθμό ποικιλομορφίας. Ένα χρόνο αργότερα, οι Gallois et al. (1998) δεν βρήκαν συσχετισμούς μεταξύ γεωγραφικών και γενετικών αποστάσεων σε πληθυσμούς οξιάς με τη χρήση RAPDs. Ωστόσο, οι Comps et al. (2000) παρατήρησαν σημαντικές σχέσεις μεταξύ γεωγραφικού πλάτους, μήκους και ποικιλότητας. Συγκεκριμένα στην ελληνική Ροδόπη παρατηρήθηκε σημαντική γεωγραφική ποικιλότητα για την οξιά σε μορφολογικούς χαρακτήρες (Tsiripidis και Athanasiadis, 2003, Μπούτσιος κ.α. 2004). Οι ίδιοι θεωρούν ότι η περιοχή της Ροδόπης αποτελεί πιθανό σημείο συνάντησης των F. sylvatica και F. orientalis. Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη της γενετικής ποικιλότητας της οξιάς στην περιοχή της Ροδόπης με διαφορετικούς μοριακούς δείκτες (SSR, AFLPs) και η διερεύνηση της μεταναστευτικής πορείας των εκπροσώπων του γένους στην περιοχή. Υλικά και μέθοδοι Η συλλογή των δειγμάτων διενεργήθηκε στην περιοχή της Ροδόπης, σε τέσσερις αντιπροσωπευτικούς πληθυσμούς (Πίνακας 1). Από κάθε πληθυσμό συλλέχθηκαν οφθαλμοί 25 ατόμων. Η εκχύλιση DNA από αυτούς πραγματοποιήθηκε με βάση το πρωτόκολλο Dneasy TM 96 Plant Protocol For Isolation of DNA For Plant Tissue ενώ η εξέταση της ποιότητας και της ποσότητας του DNA πραγματοποιήθηκε σε 0,8% gel αγαρόζης χρωματισμένου με βρωμιούχο αιθίδιο.

Πίνακας 1: Γεωγραφική θέση και υψόμετρο των πληθυσμών Table 1: Geographical position and altitude of the populations Γεωγρ. πλάτος Γεωγρ. Μήκος Υψόμετρο (m) Ελατιά 41º 28 24º 18 1200 Εχίνος 41º 17 24º 58 800 Παπίκιο 41º 14 25º 25 900 Δαδιά 41º 17 26º 01 700 Για την εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας σε όλο το γένωμα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των «Πολυμορφισμών Μήκους Πολλαπλασιασμένων Τμημάτων DNA» ή αλλιώς AFLPs. Ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο των Vos et al. (1995), με μικρές διαφοροποιήσεις. Η κοπή του γενετικού υλικού έγινε με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και MseI. Ο προεπιλεκτικός πολλαπλασιασμός πραγματοποιήθηκε με το συνδυασμό εκκινητών E01/M03 με έναν κύκλο των 2 λεπτών στους 72 C και 20 κύκλους ως εξής: 10 δευτερόλεπτα στους 94 C, 30 δευτερόλεπτα στους 56 C, 2 λεπτά στους 72 C και τελικά 30 λεπτά στους 60 C. Για την επιλεκτική αντίδραση (selective reaction) χρησιμοποιήθηκε ο συνδυασμός εκκινητών E38/M64. Ιδιαίτερα χρήσιμη για την περιγραφή της μετακίνησης των πληθυσμών θεωρείται η μελέτη του χλωροπλαστικού DNA σε πλατύφυλλα είδη. Για το σκοπό αυτό εφαρμόσαμε τη μεθοδολογία των «μικροδορυφόρων» (SSR), όπου δοκιμάστηκαν τα ζεύγη των εκκινητών ccmp4, ccmp7 και ccmp10 (Weising and Gardner 1999). Από αυτά το πρώτο ήταν μονομορφικό, ενώ τα άλλα εμφάνισαν ποικιλότητα. Το υλικό πολλαπλασιάστηκε με PCR κάτω από θερμοκρασία συγκόλλησης Ta=49,2 C για τον ccmp7 και Ta=50 C για τον ccmp10. Ο έλεγχος μεγέθους των πολλαπλασιασμένων τμημάτων DNA πραγματοποιήθηκε στο ABI 3100 Genetic Analyser με Hi Di Formamid και δείκτη Gene Scan 500 ROX. Για την εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας στα αποτελέσματα των AFLPs υπολογίστηκε η αναμενόμενη ετεροζυγωτία (H), η συνολική ποικιλότητα (Ht), η μέση ποικιλότητα εντός πληθυσμών (Hs) και η συνολική διαφοροποίηση (Gst) κατά Nei (1987). Για το χλωροπλαστικό DNA χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα οι δείκτες ποικιλότητας Hs, Ht και Gst (Pons και Petit 1995). Για την εκτίμηση της διαφοροποίησης μεταξύ πληθυσμών υπολογίστηκαν γενετικές αποστάσεις (Nei 1972) και με βάση αυτές έγιναν δενδρογράμματα UPGMA. Αποτελέσματα Οι αναλύσεις του γενώματος με AFLPs έδωσαν υψηλά ποσοστά ποικιλότητας για την οξιά της Ροδόπης, αφού από τους 34 διαφορετικούς γονιδιακούς τόπους που εξετάσθηκαν οι 33 ήταν πολυμορφικοί. Για το χλωροπλαστικό DNA βρέθηκε επίσης μεγάλη ποικιλότητα με συνολική καταγραφή 14 απλοτύπων σε συνδυασμό δύο εκκινητών. Για τα AFLPs, το μεγαλύτερο μέρος της ποικιλότητας φαίνεται να βρίσκεται εντός των πληθυσμών, ενώ για το χλωροπλαστικό DNA η ποικιλότητα βρίσκεται τόσο μέσα στους πληθυσμούς, όσο και μεταξύ αυτών (Πίνακας 2).

Πίνακας 2: Ποικιλότητα και διαφοροποίηση της οξιάς στη Ροδόπη Table 2: Diversity and differentiation of beech in Rodopi Hs Ht Gst AFLPs 0,234 0,255 0,089 cpdna SSR 0,551 0,925 0,405 Εξετάζοντας την ποικιλότητα μέσα στους πληθυσμούς διαπιστώνουμε μια βαθμιαία άνοδο της γενετικής ποικιλότητας από τα δυτικά προς τα ανατολικά ιδιαίτερα για τη Δαδιά τόσο στο σύνολο του γενώματος όσο και στο χλωροπλαστικό DNA (Πίνακας 3). Ιδιαίτερη εντύπωση προκαλεί ο υψηλός αριθμός των απλοτύπων του cpdna στα ανατολικά. Πίνακας 3: Γενετική ποικιλότητα εντός πληθυσμών σε AFLPs και cpdna-ssr Table 3: Genetic diversity within populations at AFLPs and cpdna-ssr Ελατιά Εχίνος Παπίκιο Δαδιά Αριθμός πολυμορφικών θέσεων AFLPs 26 26 28 33 Ποσοστό πολυμορφικών θέσεων 76,47 76,47 82,35 97,06 AFLPs Αναμενόμενη ετεροζυγωτία - AFLPs 0,212 0,213 0,243 0,269 Αριθμός απλοτύπων cpdna 3 4 8 9 Αναμενόμενη ετεροζυγωτία cpdna 0,153 0,438 0,707 0,813 Η χαμηλή διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμών που έδωσε η ανάλυση με AFLPs είναι ο λόγος για τον οποίο γενικά εμφανίζονται χαμηλές γενετικές αποστάσεις ανάμεσα στους πληθυσμούς (Πίνακας 4). Αν και οι ομαδοποιήσεις των πληθυσμών στην περίπτωση αυτή είναι δύσκολες λόγω μικρών αποστάσεων, διακρίνουμε μια τάση διαφοροποίησης του πιο δυτικού πληθυσμού «Ελατιά» από τους υπόλοιπους. Όπως φαίνεται και στο σχετικό δενδρόγραμμα (Σχήμα 1), οι πιο ανατολικοί πληθυσμοί φαίνεται να σχετίζονται περισσότερο μεταξύ τους, ενώ η διαφοροποίηση αυξάνει προς τα δυτικά. Η τάση αυτή φέρνει τις γενετικές αποστάσεις σε συμφωνία με τις γεωγραφικές Πίνακας 4: Γενετικές αποστάσεις μεταξύ πληθυσμών Table 4: Genetic distances between populations AFLPs Ελατιά Εχίνος Παπίκιο Δαδιά Ελατιά 0,000 Εχίνος 0,040 0,000 Παπίκιο 0,070 0,030 0,000 Δαδιά 0,056 0,018 0,013 0,000 CpDNA-SSR Ελατιά Εχίνος Παπίκιο Δαδιά Ελατιά 0,000 Εχίνος 6.068 0,000 Παπίκιο 4.966 0,276 0,000 Δαδιά 1,522 3,619 3,028 0,000

Σχήμα 1: UPGMA δενδρόγραμμα των πληθυσμών στα AFLPs Image 1: UPGMA dendrogramme of the populations based on AFLPs Αντίθετα, για το χλωροπλαστικό DNA εμφανίζονται μεγάλες γενετικές αποστάσεις, κάτι που είναι αναμενόμενο σε δείκτη που δεν ανασυνδυάζεται κατά την αναπαραγωγή. Στην περίπτωση αυτή, οι αποστάσεις είναι τόσο μεγάλες, που οι ομαδοποιήσεις των πληθυσμών είναι πολύ χαλαρές (Σχήμα 2). Διακρίνουμε μια τάση σχετικής ομοιότητας μεταξύ των δύο κεντρικών πληθυσμών του Εχίνου και του Παπίκιου. Σε αντίθεση με τις γεωγραφικές αποστάσεις, οι ακραίοι πληθυσμοί Δαδιά και Ελατιά φαίνονται να σχηματίζουν επίσης ομάδα, σε απόσταση όμως που είναι εξαιρετικά μεγάλη. Σχήμα 2: UPGMA δενδρόγραμμα των πληθυσμών στο χλωροπλαστικό DNA Image 1: UPGMA dendrogramme of the populations at the chloroplast DNA Συζήτηση- συμπεράσματα Οι πληθυσμοί οξιάς της ελληνικής Ροδόπης έδειξαν υψηλή ποικιλότητα εντός πληθυσμών τόσο στο συνολικό γένωμα (AFLPs) όσο και στο χλωροπλαστικό DNA (SSR), σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των γενετικών ερευνών σε πληθυσμούς της Ευρώπης γενικότερα (Demesure et al. 1996, Comps et al. 1990). Οι ανατολικοί πληθυσμοί έδειξαν υψηλότερη ποικιλότητα σε όλα τα επίπεδα σε σχέση με τους

δυτικούς. Η μετάβαση της ποικιλότητας στην κατεύθυνση αυτή γίνεται βαθμιαία και έντονα για όλους τους δείκτες. Ειδικά για το χλωροπλαστικό DNA, τα επίπεδα των απλοτύπων που μετρήθηκαν στους συγκεκριμένου εκκινητές της εργασίας αυτής είναι τα υψηλότερα στην Ευρώπη για την οξιά (Demesure et al. 1996, Vettori et al. 2004, Gailing και von Wühlisch 2004), κάτι που δικαιολογεί την άποψη ότι η περιοχή της νοτιοανατολικής Βαλκανικής υπήρξε καταφύγιο (refugium) της οξιάς κατά τη διάρκεια των τελευταίων παγετώνων (Filipova-Marinova 1995, Pott 1997, Taberlet et al. 1998). Τα υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης που μετρήθηκαν ανάμεσα στους πληθυσμούς στο χλωροπλαστικό DNA οφείλεται πιθανότατα στη μονογονική κληρονόμηση του cpdna από το μητρικό γονέα. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα της ποικιλότητας που εμφανίζει η οξιά στην ελληνική Ροδόπη και ιδιαίτερα όσο αφορά τους απλότυπους του χλωροπλαστικού DNA στους ίδιους εκκινητές με πληθυσμούς της Ευρώπης και της Τουρκίας, προκύπτει το συμπέρασμα ότι ο πιο δυτικός πληθυσμός της Ελατιάς εμφανίζει γενετικά χαρακτηριστικά που μοιάζουν με τη F. sylvatica, ενώ οι τύποι που εμφανίζονται συγκεντρωμένοι στην ανατολική Ροδόπη υπάρχουν διάσπαρτοι σε άλλα μέρη της εξάπλωσης της F. orientalis (Gailing και von Wühlisch 2004). Αυτό το γεγονός μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι εκτός από refugium, η Ροδόπη απετέλεσε το σημείο άφιξης της ανατολικής οξιάς στην Ευρώπη. Φαίνεται ότι σε αντίθεση με την ευρωπαϊκή οξιά η ανατολική οξιά αποτελείται από μια πληθώρα φυλών που καλύπτουν διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές, όπως είναι η Μαύρη Θάλασσα, ο Καύκασος και το Ιράν (Denk 1999β). Αυτό πρέπει πιθανόν να συνέβη κατά την κίνηση της ανατολικής οξιάς από τα καταφύγια προς τη σημερινή της εξάπλωση, όπου συναντήθηκαν οι διάφορες φυλές και το είδος εξελίχτηκε συμπατρικά (Huntley και Birks 1983, Duty 1985, Denk 1999α). Μπορούμε δηλαδή να υποθέσουμε ότι λόγω του γεωγραφικού εμποδίου της Μαύρης θάλασσας, η Ροδόπη πιθανόν να λειτούργησε σαν «χοάνη» όπου κατέληξαν οι διάφορες φυλές της ανατολικής οξιάς. Αντίθετα, η δυτική οξιά που εξαπλώθηκε σε νέες περιοχές πιθανόν να έχασε την ποικιλότητά της λόγω εκτροπής. Αυτό φαίνεται να έγινε ειδικά σε περιοχές, όπου η οξιά συνάντησε ορεινούς όγκους και αναγκάστηκε να εποικίσει θέσεις μεγάλου υψομέτρου. Συμπεραίνουμε δηλαδή ότι η μεταπαγετώδης κίνηση της οξιάς έγινε πιθανότατα τόσο σε οριζόντιο όσο και σε κατακόρυφο επίπεδο. Το συμπέρασμα αυτό επιβεβαιώνουν έρευνες της ποικιλότητας της οξιάς στη Ροδόπη σε μορφολογικούς χαρακτήρες (Μπούτσιος κ.α. 2004). Ευχαριστίες Επιθυμούμε να ευχαριστήσουμε θερμά την Olga Artes από το Πανεπιστήμιο του Göttingen για τη βοήθεια που μας παρείχε στις εργαστηριακές εργασίες, τους Δημήτρη Κασιμιάδη και Αρτέμιδα Καυκαλέτου Ντιέζ για τη βοήθειά τους στις δειγματοληψίες, και τους Σεραφείμ Χατζησκάκη και Ανδρέα Δρούζα για τις συμβουλές τους στο σύνολο της εργασίας. Μέρος των εργασιών υποστηρίχτηκε από το πρόγραμμα Erasmus / Socrates της Ε.Ε.

Βιβλιογραφία Comps, B., Thiebaut, B., Paule, L., Merzeau, D., Letouzey, J., 1990. Allozymic variability in beechwoods (Fagus sylvatica L.) over central Europe: spatial differentiation among and within populations. Heredity 65: 407-417. Comps, B., Gömöry, D., Letouzey, J., Thiébaut, B., Petit, R.J., 2000. Diverging trends between heterozygosity and allelic richness during postglacial colonization in the European beech. Genetics 157: 389-397. Czeczott, H., 1933. Studium nad zmiennoś cia liś ci buków: Fagus orientalis Lipsky, F. sylvatica L. i form poś rednich. Cz. 1. Rocznik Dendrologiczny 5: 45 121. Demesure, B., Comps, B., Petit, R., 1996. Chlroplast DNA Phylogeography of the common Beech (Fagus sylvatica L.) in Europe. Evolution 50: 2515-2520. Denk, T., 1999α. The taxonomy of Fagus in western Eurasia, 1: Fagus sylvatica subsp. orientalis (= F.orientalis). Feddes Repertorium 110: 3-4, 117-200. Denk, T., 1999β. The taxonomy of Fagus in western Eurasia, 2: Fagus sylvatica subsp. sylvatica. Feddes Repertorium 110: 5-6, 381-412. Denk, T., Grimm, G., Stögerer, K., Langer, M., Hemleben, V., 2002. The evolutionary history of Fagus in western Eurasia: Evidence from genes, morphology and the fossil record. Plant Syst. Evol. 232: 213-236. Duty, J., 1985. Die Fagus Sippen Europas und ihre geographisch soziologische Korrelation zur Verbreitung der Assoziationen des Fagion s.l. Vegetatio 59: 177-184. Filipova-Marinova, M., 1995. The late Quaternary history of the genus Fagus L. in Bulgaria. In: Bozilova, E., Tonkov, S. (eds), Advances in Holocene Paleoecology in Bulgaria, Sophia Moscow, 84-95. Gailing, O., von Wuehlisch, G., 2004. Nuclear Markers (AFLPs) and Chloroplast Microsatellites Differ Between Fagus sylvatica and Fagus orientalis. Silvae Genetica 53: 105-110. Gallois, A., Audran, J.C. Borrus, M., 1998. Assessment of genetic relationships and population discrimination among Fagus sylvatica L. by RAPD. TAG 97: 211-219. Gömöry, D., Paule, L., Brus, R., Zhelev, P., Tomoviæ, Z., Gračan, J., 1999. Genetic differentiation and phylogeny of beech on the Balkan peninsula. J. Evol. Biol.12: 746-754. Greuter, W., Burdet, H.M., Long, G., 1984. Med-Checklist. A critical inventory of vascular plants of the circum-mediterranean countries, 1. Pteridophyta (ed. 2), Gymnospermae, Dicotyledones (Acanthaceae-Cneoraceae). - Genève & Berlin [c + 330 pp.] Hazler, K., Comps, B., Šugar, I., Melovsky, L., Tashev, A., Gračan, J., 1997. Genetic structure of Fagus sylvatica L. populations in Southeastern Europe. Silvae Genetica 46: 229-236. Huntley, B., Birks, H.J.B., 1983. An atlas of past and present pollen maps for Europe: 0 13.000 years ago. Cambridge University Press, 667 p.

Μπούτσιος, Σ., Τσιριπίδης, Ι., Παπαγεωργίου, Α.Χ., Γαλατσίδας, Σ., 2004. Ποικιλότητα μορφολογικών χαρακτήρων των φύλλων οξιάς της Ροδόπης. Πρακτικά 1ου Πανελλήνιου Περιβαλλοντικού Συνεδρίου, «Σύγχρονα Περιβαλλοντικά Προβλήματα», Ν. Ορεστιάδα, 7-9 Μαίου 2004, ΓΕΩΤΕΕ, Θεσσαλονίκη. Mišic, V. 1957. Ecological variability of European beech in Yugoslavia. Inst. N. R. Serbiji Beograd. Nei, M. 1972. Genetic distance between Populations. American Naturalist 106: 283-292. Nei, M. 1987. Molecular Population Genetics and Evolution. Columbia University Press, New York. Pons, O., Petit, RJ., 1995. Estimation, variance and optimal sampling of gene diversity. I. Haploid locus. Theoretical and Applied Genetics 90: 462-470. Pott, R., 1997. Invasion of beech and establishment of beech forests in Europe. Annali di Botanica LV: 27-58. Stoyanoff, N., 1932. The beech woods of the Balkan Peninsula, Die Buchenwälder Europas, 182-219, Vlg Hans Huber, Berne. Taberlet, P., Fumagalli, L., Wust-Sausy, A., Cosson, J., 1998. Comparative phylogeography and postglacial colonization routes in Europe. Molecular Ecology 7: 453-464. Tsiripidis, I., Athanasiadis, N., 2003. Contribution to the knowledge of the vascularflora of NE Greece: Floristic composition of the beech (Fagus sylvatica L.) forests in the greek Rodopi. Willdenowia 33: 273-298. Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges, N.A., Valentine, D.A., 1964. Flora Europaea, vol. 1 Lycopodiaceae to Platanaceae. Cambridge University Press, Cambridge. Vettori, C., Vendramin, G.G., Anzidei, M., Pastorelli, R., Paffetti, D., Giannini, R. 2004. Geographic distribution of chloroplast variation in Italian populations of Beech (Fagus sylvatica L.). TAG 109: 1-9. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research 23: 4407-4414. Weising, K., Gardner, R.C. 1999. A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of decotyledonous angiosperms. Genome 42: 9-19. Widmer, A, Lexer, C. 2001. Glacial refugia: sanctuaries for allelic richness, but not for gene diversity. TREE 16: 267-269.