Προκαταρκτικα αποτελεσματα της εκτιμησης της γενετικης ποικιλομορφιας σε πληθυσμους κεφαλοποδων (Sepia officinalis) της Μεσογειου και του Ατλαντικου

Transcript

1 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 469 Προκαταρκτικα αποτελεσματα της εκτιμησης της γενετικης ποικιλομορφιας σε πληθυσμους κεφαλοποδων (Sepia officinalis) της Μεσογειου και του Ατλαντικου Τσιγγενόπουλος Κ., Κωτούλας Γ., Οικονομάκη Α., Ξένος Χ., & Α. Μαγουλάς Ινστιτούτο θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. Κρήτης, Γούρνες Πεδιάδος, Ηράκλειο ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τρεις μικροδορυφορικοί γενετικοί τόποι χρησιμοποιήθηκαν ως γενετικοί δείκτες σε 12 πληθυσμούς σουπιάς (Sepia officinalis) από περιοχές της Μεσογείου και του Ατλαντικού, με στόχο την εκτίμηση της γενετικής ποικιλομορφίας εντός και μεταξύ των πληθυσμών, την κατανόηση της φυλογεωγραφικής δομής των πληθυσμών και την επαλήθευση της υπόθεσης της γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ Μεσογείου και Ατλαντικού. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών υποδεικνύουν γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμών του Ατλαντικού και της Μεσογείου. Επιπλέον, οι πληθυσμοί των Καναρίων Νήσων και της Μαυριτανίας διαχωρίζονται πλήρως, όχι μόνο από αυτούς της Μεσογείου, αλλά και από αυτούς του ΒΑ Ατλαντικού. Διαφοροποίηση παρατηρείται επίσης και μεταξύ των πληθυσμών της Ανατολικής και της Δυτικής Μεσογείου. Λέξεις κλειδιά: βιογεωγραφία, Sepia officinalis, μικροδορυφορικό DNA, Μεσόγειος Preliminary results of the genetic differentiation in cuttlefish (Sepia officinalis) populations from the Mediterranean Sea and the Atlantic Ocean based on microsatellite loci ABSTRACT Three microsatellite markers were used in 12 populations of the cuttlefish (Sepia officinalis) from the Mediterranean and the Atlantic in order to estimate intra- and inter- population genetic diversity, to infer the phylogeographic structure of the populations, and to verify the genetic differentiation between the Mediterranean and the Atlantic. Genetic distances between populations show weak genetic differentiation between populations from the Atlantic and the Mediterranean. Furthermore, populations from the Canary Islands and Mauritania seem to be distinct, not only from those of the Mediterranean but also from those of the NE Atlantic. The same pattern is also observed in the populations of the Mediterranean where we document a divergence between Eastern and western Mediterranean populations. Key words: biogeography, microsatellite DNA, Sepia officinalis, Mediterranean Sea

2 470 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Εισαγωγh Η σουπιά (Sepia officinalis Λινναίος 1758, Φύλο: Μαλάκια, Κλάση: Κεφαλόποδα, Οικογένεια: Σεπιοειδή) αποτελεί μια σημαντική αλιευτική πηγή για τις χώρες της Ευρώπης και της βόρειας Αφρικής, όπου η ετήσια αλιευτική παραγωγή ανέρχεται στους 70,000 τόνους (FAO 1994, βλ. αν. Pιrez Losada et al, 1999). Επομένως, η γνώση της κατανομής των πληθυσμών, καθώς και των σχέσεων μεταξύ τους, αποτελεί ζωτικό παράγοντα για την αειφόρο διαχείριση των αποθεμάτων (stocks). Η κατανομή του είδους περιλαμβάνει τις βορειοανατολικές ακτές του Ατλαντικού (από τη θάλασσα της Βαλτικής μέχρι τη Σενεγάλη) και τη Μεσόγειο θάλασσα. Πρόσφατες γενετικές έρευνες σε πληθυσμούς σουπιάς, με χρήση μικροδορυφορικών δεικτών και αλλοενζύμων, αποκάλυψαν εκτεταμένες υποδιαιρέσεις μεταξύ πληθυσμών της Μεσογείου και του Ατλαντικού (Pιrez Losada et al, 1999 και 2002, αντίστοιχα). Η απομόνωση των Μεσογειακών πληθυσμών από αυτούς του Ατλαντικού κατά τη διάρκεια των παγετωδών περιόδων (Πλειόκαινο και Τεταρτογενές), θεωρείται ότι διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη γενετική διαφοροποίηση των πληθυσμών (Pιrez Losada et al, 1999). Οι δευτερογενείς επαφές των πληθυσμών, καθώς και η γονιδιακή ροή μεταξύ πληθυσμών της Μεσογείου και του Ατλαντικού στις μεταπαγετώδεις περιόδους και στη σύγχρονη εποχή, είναι περιορισμένη, λόγω των στενών του Γιβραλτάρ και του ωκεανογραφικού μετώπου Almeria Oran (μεταξύ Ισπανίας και Αλγερίας). Τρεις μικροδορυφορικοί γενετικοί τόποι χρησιμοποιήθηκαν σαν γενετικοί δείκτες σε 12 πληθυσμούς Sepia officinalis από περιοχές της Μεσογείου και του Ατλαντικού. Κύριοι στόχοι της έρευνας ήταν η εκτίμηση της γενετικής ποικιλομορφίας εντός και μεταξύ πληθυσμών, η κατανόηση της βιογεωγραφίας και της αποθεματικής τους δομής (stock structure), η εκτίμηση της γονιδιακής ροής και τέλος η επαλήθευση της υπόθεσης της γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών της Μεσογείου και του Ατλαντικού. Υλικa και Μeθοδοι Δειγματοληψία, εξαγωγή ολικού DNA και ανάλυση μικροδορυφορικών γενετικών τόπων Συνολικά, αναλύθηκαν 670 άτομα από δώδεκα περιοχές της Μεσογείου και του Ατλαντικού, για τρεις μικροδορυφορικούς τόπους (Sof1, Sof2 και Sof4, Shaw & Pιrez Losada, 2000), ο καθένας από τους οποίους περικλείει μια περιοχή με επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων (ΑΤΤ, ΑΑΤ και ΑΤΤ, αντίστοιχα). Όλα τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε απόλυτη αιθανόλη μέχρι την ανάλυση και η εξαγωγή ολικού DNA πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο που περιλάμβανε χρησιμοποίηση πρωτεϊνάσης Κ και 5% Chelex. Ανaλυση πληθυσμιακων παραμeτρων Η εκτίμηση της γενετικής ποικιλομορφίας μέσα σε κάθε δείγμα έγινε με το λογισμικό Genetix (έκδοση 4.01, Belkhir et al., 2002) και υπολογίστηκε ο μέσος αριθμός αλληλομόρφων ανά γενετικό τόπο, η παρατηρούμενη και αναμενόμενη ετεροζυγωτία ανά γενετικό τόπο (Nei 1978), η τιμή θ που είναι μέτρο της γενετικής διαφοροποίησης ανάμεσα στους πληθυσμούς και συνάρτηση της γονιδιακής ροής (Weir & Cockerham, 1984) και τέλος οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των δειγμάτων με τη μέθοδο Nei (1972). Τα φυλογενετικά δέντρα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις γενετικές αποστάσεις κατά Nei (1972), ενώ ο βαθμός υποστήριξης των κλάδων υπολογίσθηκε με τη μέθοδο της δειγματοληψίας με επανατοποθέτηση των δεδομένων (bootstrap) στην αρχική μήτρα (matrix) των γονιδιακών συχνοτήτων με τη βοήθεια του προγράμματος Phylip (έκδοση 3.6 α 3, Felsenstein, 2002).

3 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 471 Αποτελεσματα Με βάση τις συχνότητες των αλληλομόρφων σε κάθε πληθυσμό, υπολογίσθηκαν οι μέσες τιμές ετεροζυγωτίας (αναμενόμενης, αμερόληπτης -non biased, και παρατηρούμενης) για όλους τους πληθυσμούς και για κάθε τόπο, αλλά και για όλους μαζί τους γενετικούς τόπους (Πίνακας 1). Στον γενετικό τόπο Sof-1 εντοπίστηκαν 17 αλληλόμορφα σε όλους τους πληθυσμούς, εκ των οποίων το πιο μικρό (214bp) ήταν μοναδικό στον πληθυσμό της Μαυριτανίας και το μεγαλύτερο (271bp) στον πληθυσμό των Καναρίων. Αντίστοιχα, στον τόπο Sof-2 εντοπίστηκαν 16 αλληλόμορφα σε όλους τους πληθυσμούς, από τα οποία τρία (190, 193 και 196bp) ήταν μοναδικά στον πληθυσμό της Λιβύης. Στον τόπο Sof-4 εντοπίστηκαν 19 αλληλόμορφα, από τα οποία τρία ήταν μοναδικά στον πληθυσμό της Λιβύης (105, 108 και 174bp). Τα αποτελέσματα δείχνουν πως οι πληθυσμοί της Λιβύης, των Καναρίων και των Μεσογειακών ακτών της Ισπανίας εμφανίζουν την υψηλότερη ποικιλομορφία, όπως αυτή εκτιμάται από τις μέσες τιμές αλληλομόρφων ανά τόπο. Επιπροσθέτως, η παρατηρούμενη μέση τιμή ετεροζυγωτίας σε όλους τους πληθυσμούς πλην της Λιβύης είναι χαμηλότερη της τιμής της αναμενόμενης ετεροζυγωτίας. Οι γενετικές αποστάσεις κατά Nei (1972) μεταξύ των πληθυσμών φαίνονται αναλυτικά στον Πίνακα 2. Το φυλογενετικό δέντρο (Εικόνα 1) κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Neighbor- Joining και τις γενετικές αποστάσεων κατά Nei (1972) και με υποστήριξη επαναλήψεων. Συζητηση Ο μέσος αριθμός αλληλομόρφων ανά τόπο ήταν υψηλότερος στους πληθυσμούς της Λιβύης (16.3), των Καναρίων (13) και της Μεσογειακής ακτής της Ισπανίας (11.3). Οι παρατηρούμενες μέσες τιμές ετεροζυγωτίας σε όλους τους πληθυσμούς πλην της Λιβύης ήταν χαμηλότερες από τις αναμενόμενες. Οι γενετικές αποστάσεις των πληθυσμών δείχνουν ένα ασθενή φυλογενετικό διαχωρισμό μεταξύ των πληθυσμών του Ατλαντικού και της Μεσογείου. Οι πληθυσμοί των Καναρίων Νήσων και της Μαυριτανίας διαχωρίζονται πλήρως, τόσο από αυτούς του Ατλαντικού όσο και από αυτούς της Μεσογείου. Οι πληθυσμοί της Sepia officinalis του Ατλαντικού θα μπορούσαν να χωριστούν σε τρεις ομάδες. Η πρώτη περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του καναλιού της Μάγχης και του κόλπου Morbihan, η δεύτερη τον πληθυσμό της Πορτογαλίας και η τρίτη τους πληθυσμούς από τη Μαυριτανία και τα Κανάρια νησιά. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των τριών πιο βόρεια κατανεμημένων πληθυσμών (Γαλλικές ακτές ως Μάγχη) είναι αρκετά μικρές. Κάτι αντίστοιχο έχει περιγραφεί σε γενετικές έρευνες πληθυσμών πλάνητων καλαμαριών (Loligo forbesi) των Ευρωπαϊκών ακτών του Ατλαντικού (Shaw et al, 1999), οι οποίες αποκάλυψαν μικρές γενετικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των πληθυσμών. Τα παραπάνω στοιχεία μπορούν να ερμηνευθούν με διαφορετικούς τρόπους. Όσον αφορά στη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμών Sepia officinalis της Μεσογείου και του Ατλαντικού, η ύπαρξη γεωγραφικών φραγμών σε συνδυασμό με το βιολογικό κύκλο του οργανισμού συντελούν στην πληθυσμιακή διαφοροποίηση του είδους. Επιπρόσθετα, ο διαχωρισμός των πληθυσμών κατά τη διάρκεια των παγετωδών περιόδων μπορεί να διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη γενετική διαφοροποίηση των πληθυσμών της Μεσογείου και του Ατλαντικού, αλλά και ενδεχομένως να αποτέλεσε μία εξελικτική στενωπό (evolutionary bottleneck) για τους πληθυσμούς της Μεσογείου. Οι περιορισμένες μεταναστευτικές ικανότητες του είδους είναι πιθανό να ευθύνονται για μικρές γενετικές διαφοροποιήσεις μεταξύ πληθυσμών που δεν διαχωρίζονται από γεωγραφικά όρια. Στους πληθυσμούς της Μεσογείου παρατηρείται μια διαφοροποίηση των πληθυσμών της Λιβύης

4 472 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πίνακας 1: Μέσες τιμές αναμενόμενης [Η(αναμ.)], παρατηρούμενης [Η(παρ.)] και αμερόληπτης [Η(n.b.)- non-biased) ετεροζυγωτίας, και μέσος αριθμός αλληλομόρφων για κάθε πληθυσμό/τόπο. και της Βενετίας από όλους τους υπόλοιπους. Αυτό θα μπορούσε να είναι δείγμα απομόνωσης των πληθυσμών Παρόλα αυτά, δεν είναι δυνατό να εξαχθούν συμπεράσματα, αφενός επειδή η τιμή υποστήριξης (bootstrap) στον κόμβο είναι πολύ χαμηλή (38), αφετέρου λόγω της υψηλής μέσης τιμής αλληλομόρφων ανά τόπο στον πληθυσμό της Λιβύης. Η ανάλυση πρόσθετων γενετικών τόπων θα μπορούσε να δώσει ισχυρότερες ενδείξεις για τον πραγματικό βαθμό απομόνωσης αυτών των πληθυσμών. Περαιτέρω διαφοροποιήσεις παρατηρούνται και μεταξύ των πληθυσμών της ανατολικής και της δυτικής Μεσογείου. Πιο συγκεκριμένα, υπάρχει μεγάλη γενετική απόσταση μεταξύ του πληθυσμού της Μεσογειακής ακτής της Ισπανίας και αυτών της Βενετίας, του Μεσολογγίου και του H(αναμ.) H n.b. H(παρ.) Μέσος αριθμός αλληλομόρφων/ τόπο Άγ. Νικόλαος Ηράκλειο Μεσολόγγι Βενετία Λιβύη Ισπανία - Μεσόγειος Πορτογαλία Κόλπος Morbihan Δυτικά παράλια Μάγχης Ανατολικά παράλια Μάγχης Κανάρια νησιά Μαυριτανία Αγίου Νικολάου. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών του Αγίου Νικολάου, του Μεσολογγίου και του Ηρακλείου είναι μικρές, και παραδόξως ο πληθυσμός της Βενετίας δείχνει να σχετίζεται περισσότερο με αυτόν της Λιβύης, παρά με του Μεσολογγίου. Συμπερασματικά, με τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας η γενετική διαφοροποίηση των πληθυσμών της Μεσογείου από αυτούς του Ατλαντικού δεν επιβεβαιώνεται απόλυτα. Παρόλα αυτά, σε μελλοντικές έρευνες είναι αναγκαίο να συμπεριληφθούν περισσότερα άτομα από κάθε πληθυσμό και να αναλυθούν περισσότεροι γενετικοί τόποι. έτσι ώστε να δημιουργηθεί μια πιο καθαρή εικόνα, όσον αφορά στην εκτίμηση της γενετικής ποικιλομορφίας εντός και μεταξύ πληθυσμών, την κατανόηση της φυλογεωγραφι-

5 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 473 Πίνακας 2: Γενετικές αποστάσεις μεταξύ των δειγμάτων υπολογισμένες κατά Nei (1972) Κανάρια 2 Μαυριτανία Αγ. Νικόλαος Ηράκλειο Μεσολόγγι Βενετία Ν. Ισπανία Πορτογαλία Morbihan Δ. Μάγχη Α. Μάγχη Λιβύη Αγ. Νικόλαος κής τους σχέσης, καθώς και την εκτίμηση της γονιδιακής ροής μεταξύ τους Λιβύη Νότια Ισπανία Βενετία Πορτογαλία Μαυριτανία Κανάριοι Νήσοι Μεσολόγγι Ηράκλειο Α. Μάγχη Κόλπος του Morbihan Δ. Μάγχη Εικόνα 1: Φυλογενετικό δέντρο κατασκευασμένο με τη μέθοδο Neighbor-Joining και τις γενετικές αποστάσεων κατά Nei (1972). Οι αριθμοί στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap μετά από επαναλήψεις Αναφορες Felsenstein, J PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6a3. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle Belkhir et al., GENETIX, WindowsTM software for population genetics studies. Laboratoire Gιnome et Populations, CNRS UPR 9060, Universitι de Montpellier II, Montpellier (France). Perez-Losada, M. et al, Extensive population subdivision of the cuttlefish Sepia officinalis (Mollusca: Cephalopoda) around the Iberian Peninsula indicated by microsatellite DNA variation. Heredity 89, Perez-Losada, M. et al, Allozyme differentiation in the cuttlefish Sepia officinalis (Mollusca: Cephalopoda) from the NE Atlantic and Mediterranean. Heredity 83,

6 474 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Shaw, P. W. et al Subtle population structuring within a highly vagile marine invertebrate, the veined squid Loligo forbesi, demonstrated with microsatellite DNA markers. Molecular Ecology 8, Shaw, P. W Polymorphic microsatellite DNA markers for the assessment of genetic diversity and paternity testing in the giant cuttlefish, Sepia apama (Cephalopoda). Conservation Genetics 4, Weir BS, Cockerham CC, Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38: