Η πεπτιδυλοτρανσφεράση είναι τό ενζυμο το οποίο καταλύει τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού.το ενζυμο διερευνάται εντατικά τα τελευταία 30 χρόνια και εχουν αναπτυχθεί ποικίλες απόψεις οσον αφορά την δομή του Μέχρι το 1980 πιστευόταν οτι μιά σειρά ριβοσωμικές πρωτείνες μεταξύ των οποίων εξέχουσα θέση κατείχαν οι L7 και οι L12 μαζί με το 23S RNA συγκροτούσαν το ενεργό κέντρο του ενζύμου Από το 1980 ομως και μετά ολοένα και περισσότερο φαίνεται να κερδίζει η αποψη οτι τμήμα του 23S RNA λειτουργεί ως ριβοένζυμο και αποτελεί το μοναδικό συστατικό του ενεργού κέντρου του ενζύμου

Κρυσταλλογραφικές μελέτες της 50S ριβοσωμικής υπομονάδος που απομονώθηκε από το αρχαιοβακτηριο Haloarcula marismortui σε ανάλυση 5 Α εχουν συνεισφέρει ουσιαστικά στην διαλευκανση της δομής της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Στον κρυσταλλογραφικό χάρτη εντοπίζονται περιοχές αυξημένης και περιοχές μειομένης πυκνότητος πού αντιστοιχούν σε δίκλωνα και μονοκλωνα RNA αντίστοιχα Στις δίκλωνες δομές του RNA εχωμε δεξιοστροφες ελικες που δεν συνδέονται πάντα μεταξύ τους με την συγκρότηση ζευγών σύμφωνα με τους κανόνες των Watson και Crick και φαίνεται να παρουσιάζονται διαφορετικές από τον Α τυπο RNA που είναι η συνηθης δομή

Πιστευεται Π ακόμη οτι οι περιοχές αυξημένης πυκνοτητος αντιπροσωπευουν δομικά κέντρα στα οποία το RNA είναι σφικτά πακεταρισμένο και σχηματίζε διπλές ελικες και ψευδοκόμπους. Σε μια πληθώρα οργανισμών αποκαλυπτεται ακόμη η υπαρξη ενός καναλιού διώρυγος που φαίνεται να αποτελεί το κανάλι εξόδου από το ριβόσωμα των πρωτεινών που συντίθενται κατα την διάρκεια της πορείας της πρωτεινοσυνθέσεως

Στο βακτηριο H marismortui με την βοήθεια κρυσταλλογραφικών μεθόδων τοποθετείται το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης στον πυθμένα μιας βαθειας σχισμής που σχηματίζεται στο κέντρο της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδος και διαπιστώθηκε οτι σε απόσταση μικρότερη από 18 Α από τό υπόστρωμα δεν απαντά κανένα πρωτεινικό μόριο Για τις μελέτες αυτές χρησιμοποιούνται ειδικοί αναστολείς που είναι ανάλογα του τετραεδρικού ενδιαμέσου μορίου της πρωτεινοσύνθεσης και κατευθυνονται ειδικά στα ενεργά κέντρα των ενζύμων και προσδένονται σ αυτά μιμούμενα τις δομές των ενζυμικών υποστρωμάτων

Με την βοήθεια των αντιδραστηρίων CCdApPuro επιτευχθηκε η απομόνωση ολιγοριβονουκλεοτιδίων στα οποία προσδένεται ο παραπάνω αναστολέας.τα νουκλεοτίδια αυτά εχουν τα εξής χαρακτηριστικά Αποτελούν τμήματα του ενεργού κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Προσδένονται με πολύ μεγάλη ειδικότητα στην CCdApPuro οπως και τα νουκλεοτίδια του ενεργού κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Φέρουν μιά περιοχή αποτελούμενη από 17 νουκλεοτιδικά κατάλοιπα η οποία ταυτίζεται με μια υποπεριοχή της λειτουργικής περιοχής V του 23S RNA στην οποία αποδίδεται η ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά φέρουν την αλληλουχία ενός συντηρητικού οκταμερους του AUAACAGG πού απαντα στην καρδιά της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδος

Χαρακτηριστικά της πεπτιδυλοτρανσφεράσης οπως προκύπτουν με την χρήση των αναστολέων Οι αναστολείς προσδενονται στην βάση μιας σχισμής πού σχηματίζεται κατα μήκος του καναλιού εξόδου της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο οπίσθιο τμήμα της μεγαλης ριβοσωμικής υπομονάδος Η περιοχή περιβάλλεται αποκλειστικά από νουκλεοτίδια που ανήκουν στην κεντρική θηλειά του 23S RNA της περιοχής V H περιοχή V του rrna απαντά στο κέντρο της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και είναι σφικτά πακεταρισμένο ανάμεσα στις περιοχές ΙΙ και IV

Η περιοχή V του rrna μπορεί να χωρισθεί σε 3 υποπεριοχές Υποπεριοχή πρώτη αποτελείται κύρια από την ελικα 75 του 23S rrna και σχηματίζει την περιοχή πρόσδεσης για την πρωτείνη L1 Υποπεριοχή δεύτερη αποτελείται από τις ελικες 80 εως 88 σχηματίζει την κεντρική περιοχή της ριβοσωμικής υπομονάδας.στηρίζεται στο πίσω μέρος από το 5S RNA και την περιοχή ΙΙ του 23S rrna Yποπεριοχή τρίτη περιλαμβάνει τις ελικες 89 εως 93 προεκτείνεται ως την περιοχή VI και βοηθά στην σταθεροποίηση της περιοχής πρόσδεσης των παραγόντων επιμήκυνσης στο ριβόσωμα κατα την διάρκεια της πρωτεινοσύνθεσης

Στην περιοχή V της πεπτιδυλοτρανσφεράσης αλληλεπιδρούν πρωτεινικά μόρια με τα εξης χαρακτηριστικά Τα 15 πρωτεινικά μόρια δεν παρατηρούνται στις περιοχές στις οποίες προσδένονται οι αναστολείς της πρωτεινοσύνθεσης Στο ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κοντά βρίσκονται οι προεκτάσεις των ριβοσωμικών πρωτεινών L2,L3,L4 και L10 που διαπερνούν την περιοχή V Οι προεκτάσεις των πρωτεινών καλύπτουν πολλά από τα κενά πού σχηματίζονται μεταξύ των διαφόρων ελίκων του 23S RNA Οι πρωτεινικές προεκτάσεις πιθανόν εξουδετερώνουν το φορτίο του φωσφορικού σκελετου των νουκλεοτιδίων και πιθανόν σταθεροποιούν την δομή της περιοχής και τη διασύνδεση αυτής με αλλες ριβοσωμικές περιοχές Κανένα από τα πρωτεινικά μόρια δεν πλησιάζει σε απόσταση μικρότερη από 18 Α την περιοχή του ενεργού κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Φαινεται οτι μόνο οι ριβοσωμικές πρωτεινες L2 και L3 ειναι σημαντικές για την δράση

Δεν είναι δυνατή η εμφάνιση της εικόνας. Ίσως να μην επαρκεί η μνήμη του υπολογιστή για το άνοιγμα της εικόνας ή ίσως η εικόνα να έχει καταστραφεί. Επανεκκινήστε τον υπολογιστή και ανοίξτε ξανά το αρχείο. Αν εμφανίζεται ακόμα το κόκκινο x, ίσως να πρέπει να διαγράψετε την εικόνα και να την εισαγάγετε ξανά.

Σημερα εχουν συσσωρευθεί σοβαρές ενδείξεις που υποστηρίζουν οτι νουκλεοτίδια πού βρίσκονται σε μια συντηρημένη θηλειά στο 23S S RNA παίζουν σημαντικό ρόλο για την λειτουργία της πεπτιδυλοτρανσφεράσης μεταξυ των ενδείξεων αυτών περιλαμβάνονται Τα νουκλεοτίδια U2619 και U2620 του 23S RNA στην Haloarcula marismortui σχηματίζουν δεσμούς με το CCA ακρο του t-rna που βρίσκεται δεσμευμένο στην Ρ θέση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Μεταλλαγές των νουκλεοτιδίων στην θηλειά αυτή καθιστούν τα κύτταρα ανθεκτικά σε μια σειρά αναστολέων της ενεργότητος της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Παρασκευάσθηκαν συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια τα οποία μπορούν να καταλύσουν In vitro την δημιουργία πεπτιδικού δεσμού αρα εχουν ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης

Στο 23S RNA που τοποθετείται στην περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης εχει εντοπισθεί ψευδόκομπος με τα εξής χαρακτηριστικά Η δομή του ψευδοκόμπου είναι εξαιρετικά συντηρημένη γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή συμμετοχή του στην ενεργότητα του μορίου Η δομή του ψευδοκόμπου συνίσταται στα προκαρυωτικά από 48 νουκλεοτίδια και εχει διαπιστωθεί σε 134 περιπτωσεις Καταλαμβάνει την περιοχή που εκτείνεται από το νουκλεοτίδιο Α2459 μεχρι του U2505 της επικρατείας V του 23S rrna οπου περιέχεται το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης

Οι απόψεις για την λειτουργία του 23S ως ενζύμου ως ριβοενζύμου κερδίζουν συνεχώς εδαφος παρ ολο που εξακολουθούν να υπάρχουν επιφυλάξεις μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται Δεν εχει ακόμη επιτευχθεί η Παρασκευή ριβοσωμικών σωματιδίων πλήρως απαλλαγμένων από ριβοσωμικές πρωτείνες.σήμερα πιστευεται οτι τουλάχιστον ρόλο στην ενζυμική ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης εχουν οι πρωτείνες L2 και L3 Δεν εχει γίνει ακόμη κατορθωτή η απομόνωση 23S rrna το οποίο να μπορεί αυτόνομα να καταλύσει τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού

Στα ευκαρυωτικά εχει διαπιστωθεί μια πολύ συντηρητική περιοχή στον ψευδικόμπο η οποία αποτελείται απο το επτανουκλεοτίδιο 2700 UCGAUGU2706 που απαντά στο κέντρο της θηλειάς της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Ολες οι αλληλουχίες των 28S RNA μορίων των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων πού εχουν μελετηθεί ως σήμερα περιλαμβάνουν το παραπάνω επτανουκλεοτίδιο στην επικράτεια V που επιτρέπει τον σχηματισμό του ψευδοκόμπου

Μελέτες εχουν αποκαλύψει την παρουσία πολλών τροποποιημενων νουκλεοτιδικών βάσεων στην περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης ετσι εχει αποκαλυφθεί Ολες οι τροποποιημένες βασεις συγκεντρώνονται στο κέντρο της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδος σχηματίζοντας ένα κέλυφος Σημαντικός αριθμός τετοιων βάσεων εντοπίζονται στην περιοχή V του 23S RNA της E.coli οπου εντοπίζεται το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Ενας μεγάλος αριθμός τροποποιημένων βάσεων εντοπίζεται ακόμη στις περιοχές II και IV και ιδιαίτερα στην περιοχή ενωσης με την περιοχή V

Η αντεπίδραση της αλληλουχίας CCA στο 3 ακρο του trna με τα νουκλεοτίδια της Α και Ρ θέσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην πορεία της πρωτεινοσύνθεσης Εχει δειχθεί ότι υπάρχουν συντηρητικά νουκλεοτίδια στο 23S RNA που φαίνεται να εμπλέκονται στην αντεπίδραση αυτή τετοια είναι G2252,G2253,U2506 και U2585

Διερευνάται σήμερα εντατικά η επίδραση των τροποποιημένων βάσεων πού υπάρχουν στο ριβοσωμικό RNA στον μηχανισμό δράσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Οι ενδείξεις πού και σήμερα εξακολουθούν να Οι ενδείξεις πού και σήμερα εξακολουθούν να υπάρχουν είναι εμεσες και σχετίζονται με τον εντοπισμό μεγάλου αριθμού τετοιων βάσεων στην περιοχή πού γίνεται η πρωτεινοσύνθεση. Η πιό αμεση ενδειξη είναι ο σχηματισμός υδρογονοδεσμών μεταξύ του CCA του t-rna και ενός Nm νουκλεοτιδίου στο ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης

Για την πρόσδεση των t-rna μορίων στην θέση Ρ της μεγάλης. ριβοσωμικής υπομονάδος ιδιαίτερο ρόλο διαδραματίζουν τα νουκλεοτίδια C74 και C75 των t-rna μορίων και τα νουκλεοτίδια G2252 και G2253 του 23S rrna H επιβεβαιωση της σημασίας της αντεπίδρασης εγινε με κατευθυνομενες σημειακές μεταλλάξεις στα κωδικόνια G2252 και G2253.Μεταλάσοντας τα συγκεκριμένα νουκλεοτίδια σε A,C,ή U προεκυψαν ατομα τα οποία μπορουσαν να συγκροτήσουν 70S ριβοσώματα αλλά δεν ηταν ικανά να πρωτεινοσυνθέτουν. Κατι που υποδηλώνει οτι οι παραπάνω μεταλλαγές επηρεάζουν ενα η περισσότερα βηματα της φάσης επιμηκυνσης

Με τετοια πειράματα κατευθυνομένης μεταλλαξογενεσης εχουν προκύψει μια σειρά συμπεράσματα οσον αφορά τις αντεπιδράσεις του t-rna και του 23S S RNA μεταξύ των οποίων οι σημαντικώτερη είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ C74 και G2252 Μεταλλαγμένα μόρια t-rna μπορούν να προσδένονται σε ριβοσώματα που φέρουν μεταλλαγμένα 23S rrna στην περίπτωση που οι μεταλλαγμένες βάσεις είναι συμπληρωματικές Το Α75 του t-rna αντεπιδρά φυσιολογικά με το U2252 του 23S RNA οδηγώντας σε φυσιολογικό φαινότυπο C75 στο t-rna και G2253 στο 23S S RNA παρ ολο πού είναι εξαιρετικά συντηρημένα δεν συνδέονται τόσο στενά μεταξυ τους με δεσμό υδρογόνου Μεταλλαγη στην θέση G2253 δεν επιφέρει θανατο στο κύτταρο Μεταλλαγή του C74 του trna επιφέρει ιδιαίτερα σοβαρές βλάβες οσον αφορά τον μηχανισμό πρωτεινοσύνθεσης

Σύμφωνα με το μοντέλλο πού σήμερα γίνεται αποδεκτό κατα την διαδικασία δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού επισυμβάινουν τα εξης γεγονότα Η αμινομάδα του αμινοακυλο t-rna που είναι προσδεδεμένο στην Α θέση πλησιάζει το καρβοξυτελικό ακρο του αμινοξέος που βρίσκεται στο t-rna που είναι προσδεδεμένο στην Ρ θέση Η αμινομάδα πλησιάζει κοντά στο Ν3 της Α2486(Hm Hm) η Α2451(Ec Ec) ετσι ωστε να σχηματίζεται δεσμός υδρογόνου Για τον δεσμό υδρογόνου σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει η Α76 του t-rna που βρίσκεται στην Ρ θέση μια και αντικατάσταση της Α76 με δεσοξυριβόζη οδηγεί σε ανενεργό υποστρωμα για την πεπτιδυλοτρανσφεράση

Επειδη δεν εχει επιτευχθεί η απομόνωση 50S ριβοσωμικης υπομονάδος που να φέρει και τα δύο υποστρώματα στην Α και Ρ θέση Τα μοντέλλα που αναπτύσσονται βασίζονται στην σύγκριση και την αντιπαραβολή των δομών των 50 S ριβοσωμικών υπομονάδων που διαμορφώνονται οταν εχουν δεσμευμενα χωριστά τα t-rna στις Α και Ρ θέσεις του ριβοσώματος