ΑΣΚΗΣΗ ΝΑΝΟΒΙΟΥΛΙΚΩΝ Νο 5: ΜΕΛΕΤΗ BIΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΑΤΑΛΥΣΗΣ: ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ Ι: ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όπως έχουμε δει στο μάθημα της Βιοχημείας, τα ενζυμα είναι ισχυροί και εξειδικευμένοι βιολογικοί καταλύτες. Στις εισαγωγικές διαλέξεις του μαθήματος, θα γίνει υπενθύμιση των γενικών γνώσεων για τα ενζυμα (κεφάλαιο 8 της Βιοχημείας του Stryer) και θα συζητήσουμε επίσης αναλυτικά τις κινητικές ιδιότητες των ενζύμων (ειδικότερα τα υποκεφάλαια 8.4, 8.4.1 και 8.4.2). Θα συζητήσουμε επίσης τους αναστολείς και τις κινητικές τους υπογραφές (υποκεφάλαιο 8.5.1) καθώς και τις γραφικές παραστάσεις οι οποίες χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων (παράρτημα του κεφαλαίου 8). Η ΒΗΤΑ-ΓΑΛΑΚΤΟΣΙΔΑΣΗ Η βήτα-γαλακτοσιδαση είναι ένα ενζυμο το οποίο καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης σε γλυκόζη και γαλακτόζη in vivo. Όταν βακτηρίδια E.coli καλλιεργούνται παρουσία λακτόζης σαν πηγής άνθρακα, περιέχουν περίπου 10000 μόρια βήταγαλακτοσιδασης ανά κύτταρο. Αντίθετα, όταν καλλιεργούνται παρουσία μιας άλλης πηγής άνθρακα, περιέχουν λιγότερο από 10 μόρια βήτα-γαλακτοσιδασης ανά κύτταρο. Την αποκαλούμε λοιπόν επαγόμενο ενζυμο (δηλαδή η παρουσία ενός υποστρώματος η ενός αναστολέα αυξάνει τα επίπεδα βιοσύνθεσης του ενζύμου). CH 2 CH 2 H, lactose H 2 β-galactosidase galactose CH 2 H, + CH 2 H, glucose 1
Η βήτα-γαλακτοσιδαση (αριθμός ταξινόμησης, EC number 3.2.1.23 ) είναι μια πρωτεΐνη που αποτελείται από 4 υπομονάδες, είναι λοιπόν ένα τετραμερές. Κάθε μονομερές είναι μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακής μάζας 115 000 Da (1023 αμινοξέα). Κάθε μονομερές φέρει ένα ενεργό κέντρο, αλλά η ενζυμική δραστικότητα κερδίζεται μόνο στην τετραμερή μορφή. Η ενζυμική δραστικότητα ενισχύεται από ιόντα μαγνησίου. Η εξειδίκευση του ενζύμου είναι πολύ ισχυρή για τον βήταγαλακτοπυρανοζικό δακτύλιο, είναι όμως πολύ λιγότερο ισχυρή για το υπόλοιπο κομμάτι: R- μπορεί να είναι ένα σάκχαρο, μια αλκοόλη η μια φαινόλη: CH 2 R CH 2 β-galactosidase + H 2 H, + R Στην άσκηση μας λοιπόν θα εκμεταλλευθούμε αυτό το γεγονός και θα χρησιμοποιήσουμε ένα συνθετικό υπόστρωμα, το -nitrophenyl-β-dgalactopyranoside (NPG), το οποίο υδρεύεται σε -nitrophenol (NP) και γαλακτόζη. NPG ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 1. Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας και της ειδικής δραστικότητας του ενζύμου. Η βήτα-γαλακτοσιδαση ακoλουθεί το μοντέλο Michaelis-Menten. Όσον αφορά την υδρόλυση του NPG σε υδατικό περιβάλλον, μπορούμε να θεωρήσουμε ότι το δεύτερο υπόστρωμα (το νερό) βρίσκεται σε μεγάλη περίσσεια, οπότε μπορούμε να περιγράψουμε την αντίδραση σύμφωνα με το σχήμα: E + S ES E + P 1 + P 2 2
Για να προσδιορίσουμε την ενζυμική δραστικότητα σε ένα δεδομένο δείγμα ενζύμου που θα μας δοθεί, θα καταγράψουμε τις κινητικές υδρόλυσης του NPG από διαφορετικούς όγκους του δείγματος, ακλουθώντας την αύξηση της απορρόφησης που οφείλεται στην παραγωγή του προϊόντος (ΟΝΡ) σε συνάρτηση με τον χρόνο. Προσδιορίζουμε τις αρχικές ταχύτητες v 0 (εκφρασμένες σε μεταβολή της απορρόφησης ανά λεπτό, ΔA.min -1 ) και εκφράζουμε τις τιμές σε συνάρτηση του όγκου του δείγματος. Η κλίση αυτής της ευθείας αντιστοιχεί στην ενζυμική δραστικό τητα (ΕΔ), με μονάδες ΔA.min-1.mL-1. Κατόπιν, χρησιμοποιώντας τον συντελεστή απορρόφησης (ε M )του προϊόντος, θα την εκφράσουμε σε μmoles NP.min-1.mL-1 1α) Προσδιορισμός των φασματοφωτομετρικών παραμέτρων του NP και NPG Στον πάγκο σας θα βρείτε ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0, 1 Μ ph 7.6 που περιέχει επίσης 1 mm MgCl 2. -Καταγράψτε τα φάσματα απορρόφησης του NP και του NPG σε συγκέντρωση 0.25 mμ σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών στα μήκη κύματος από 300 μέχρι 550 nm. Προσδιορίστε κατόπιν σε ποιο μήκος κύματος πρέπει να τοποθετηθείτε για να καταγράψετε την υδρόλυση του NPG σε βέλτιστες συνθήκες. -Υπολογίστε τον συντελεστή απορρόφησης του NP στο μήκος κύματος που επιλέξατε με μια από τις εξής μεθόδους : 1) Από ένα αρχικό διάλυμα NP συγκέντρωσης 4 mm, κάντε διαφορετικές αραιώσεις, μετρήστε τη απορρόφηση τους στο μήκος κύματος που διαλέξατε και χαράξτε την ευθεία Α σε συνάρτηση της συγκέντρωσης NP. Υπολογίστε τον συντελεστή απορρόφησης. 2) Ξεκινώντας από τις κινητικές υδρόλυσης του NPG: καταγράψτε τρεις η τέσσερις κινητικές υδρόλυσης του NPG σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,1 μέχρι 0,4 mm. -καταγράψτε την απορρόφηση στο πλατώ όταν η υδρόλυση έχει τελειώσει -χαράξτε την καμπύλη Α σε συνάρτηση της συγκέντρωσης του NPG. -υπολογίστε τον συντελεστή απορρόφησης. 1β). Πρωτόκολλο μέτρησης της ενζυμικης δραστικότητας Το τεστ διεξάγεται στο φασματοφωτόμετρο σε θερμοκρασία δωματίου. Στην κυψελίδα του φασματοφωτομέτρου (για όγκο αντίδρασης 3 ml) αναμίξτε: -V1 ml NPG αρχικής συγκέντρωσης 2,5 mm ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,25 mm -V2 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών και αναμίξτε -V3 ml από το διάλυμα της βήτα-γαλακτοσιδασης που θα σας δοθεί 3
1γ). Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας του δείγματος της βήταγαλακτοσιδασης που θα σας δοθεί. -Μετρήστε 4 η 5 κινητικές υδρόλυσης του NPG σε σταθερή συγκέντρωση υποστρώματος 0.25 mm, σε διαφορετικούς όγκους του δείγματος βήταγαλακτοσιδασης που σας δόθηκε. -Υπολογίστε τις αρχικές ταχύτητες υδρόλυσης (v 0 ) σε μεταβολή απορρόφησης (ΔΑ) αν λεπτό. -Χαράξτε την καμπύλη v 0 σε συνάρτηση του όγκου δείγματος της βήταγαλακτοσιδασης που προσθέσατε στα 3 ml του μίγματος της αντίδρασης. Υπολογίστε την κλίση της ευθείας (V 0 ) σε μονάδες ΔΑ. min -1. Υπολογίστε κατόπιν την ενζυμική δραστικότητα (ΕΔ), εκφρασμένη σε μmoles σχηματισμένου NP.min - 1.mL -1. -Γνωρίζοντας την συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο δείγμα που σας δόθηκε, υπολογίστε την ειδική ενζυμική δραστικότητα (ΕΕΔ), εκφρασμένη σε μmoles σχηματισμένου NP. min -1.mg -1. 2. Προσδιορισμός των παραμέτρων Κ Μ και Vmax της βήταγαλακτοσιδάσης και της σταθεράς Κ i του αναστολέα IPTG. 2.1 Προσδιορισμός των παραμέτρων Κ Μ και Vmax της βήτα-γαλακτοσιδάσης ως προς το υπόστρωμα NPG. Θα πραγματοποιήσετε μια σειρά κινητικών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του υποστρώματος (NPG), θα μετρήσετε τις αρχικές ταχύτητες και θα προσδιορίσετε γραφικά τις παραμέτρους Κ Μ και Vmax. Ακoλουθώντας το πρωτόκολλο μέτρησης της ενζυμικής δραστικότητας που περιγράψαμε παραπάνω, μετρήστε τρεις προκαταρκτικές κινητικές στις έξης συνθήκες: - συγκέντρωση NPG ίση με 0.25 mm* - συγκέντρωση NPG μικρότερη από 0.25 mm - συγκέντρωση NPG μεγαλύτερη από 0.25 mm * σε συγκέντρωση 0,25 mm, η συγκέντρωση του ενζύμου πρέπει να είναι τέτοια, ώστε οι αρχικές ταχύτητες που μετρούνται να είναι της τάξης του 0,1 ΔA.min-1 -Χαράξτε την καμπύλη των αρχικών ταχυτήτων V 0 σε συνάρτηση της συγκέντρωσης του NPG και μετρήστε επιπλέον κινητικές (συνολικά 8 τουλάχιστον) σε ενδιάμεσες συγκεντρώσεις. 4
-μετατρέψτε τις μετρήσεις σας σε παράσταση διπλού αντιστρόφου (Lineweaver- Burk), δηλ. 1/V 0 σε συνάρτηση 1/[S 0 ] και υπολογίστε γραφικά τις παραμέτρους Κ Μ και Vmax. 2.2 Προσδιορισμός της σταθεράς Κ i του αναστολέα IPTG. IPTG (Isopropryl-β-D-thiogalactopyranoside) Η αντικατάσταση του οξυγόνου από το θειο καταστά αδύνατη την υδρόλυση του IPTG, το οποίο δρα σαν αναστολέας της βήτα-γαλακτοσιδάσης. Θα επαναλάβουμε λοιπόν τα ίδια πειράματα όπως προηγουμένως αλλά παρουσία σταθερής συγκέντρωσης IPTG. Μετρήστε τις αρχικές ταχύτητες και χαράξτε την καμπύλη V 0 σε συνάρτηση της συγκέντρωσης του NPG. Υπολογίστε τις σταθερές Κ M app και V M app χρησιμοποιώντας την παράσταση διπλού αντιστρόφου (Lineweaver-Burk). Το είδους αναστολέας είναι το IPTG? Προσδιορίστε την Κi του αναστολέα. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ-ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1) Πηγαίνετε στον ιστότοπο της Proteopedia (www.proteopedia.org) και αναζητείστε το λήμμα της βήτα-γαλακτοσιδάσης. Επιθεωρήστε την τριτοταγή δομή, το ενεργό κέντρο και εάν υπάρχουν, και τα σύμπλοκα με υποστρώματα. 2) Εξηγήστε την σημασία του αριθμού ταξινόμησης της βήτα-γαλακτοσιδάσης 3) Το σύνδρομο της «δυσανεξίας στην λακτόζη» είναι πολύ συνηθισμένο στους ενήλικες. Συνίσταται την αδυναμία ενζυμικής διάσπασης της λακτόζης με αποτέλεσμα την αδυναμία πέψης και την πρόκληση γαστρεντερικών διαταραχών. Μία λύση σε αυτό το πρόβλημα είναι η παρασκευή γάλακτος με μειωμένη λακτόζη (τέτοια προϊόντα υπάρχουν πλέον στα ράφια των σουπερμάρκετ). Μόλις πήρατε το πτυχίο του ΤΕΤΥ και προσληφθήκατε από μεγάλη εταιρεία γαλακτοκομικών η οποία θέλει να παρασκευάσει τέτοιο γάλα. Τι διαδικασία θα προτείνατε? 5
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ -Lubert Stryer et al.,, Βιοχημεία, τόμος Ι, κεφάλαιο 8.4, 8.4.1, 8.4.2, 8.5.1, παράρτημα του κεφαλαίου 8, Ελληνική μετάφραση, Πέμπτη έκδοση, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2004 -JK Tillotson, Introduction to Enzyme Kinetics: Assay of β-galactosidase Sci. STKE, 10 July 2007 [DI: 10.1126/stke.3942006tr4] (nline Tutorial) http://stke.sciencemag.org/feature/tillotson/intro_enzyme_kinetics/enzyme_0.htm 6