Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 9-10 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΩΝ & ΦΑΡΜΑΚΟΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΟΥΣ Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 541 24 Θεσσαλονίκη
Εισαγωγή ü Οι στόχοι της διάλεξης είναι να περιγράψει σε αδρές γραμμές : Ø Τα βιολογικά συστήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων θεραπευτικών πρωτεϊνών & να υπογραμίσει τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα τους Ø Οι διαφορές στην φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική των πεπτιδικών φαρμάκων από τα «κλασσικά» φαρμακευτικά μόρια Ø Η σχέση μεταξύ των συνθηκών παραγωγής μιάς θεραπευτικής πρωτεΐνης και των φαρμακοκινητικών και φαρμακοδυναμικών της ιδιοτήτων
Έχουμε ήδη αναφέρει κάποια στοιχεία σχετικά με την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Παραδείγματα πρωτεϊνικής έκφρασης Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε βακτήρια με χρήση προκαρυωτικών φορέων έκφρασης Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε μήκυτες (κυρίως σε Saccharomyces cereviciae και Pichia pastoris) με χρήση καταλλήλων φορέων έκφρασης Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα εντόμων μολυσμένων με ανασυνδυασμένους βακουλοϊούς Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε φυτικά κύτταρα Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα θηλαστικών με χρήση καταλλήλων φορέων έκφρασης (κυρίως πλασμιδιακών αλλά και ιικών)
Ανακεφαλαιώνοντας vμπορούμε να χρησιμοποιήσουμε είτε κυτταρικά συστήματα είτε ολόκληρους οργανισμούς για την παραγωγή θεραπευτικών πρωτεϊνών vτα κυτταρικά συστήματα μπορεί να είναι είτε βακτηριακά κύτταρα, ή μονοκύτταροι ευκαρυώτες, κύτταρα θηλαστικών ή φυτών σε καλλιέργειες vοι οργανισμοί μπορεί να είναι είτε ζωικά συστήματα (π.χ. παραγωγικά ζώα) είτε φυτικά συστήματα
Πως επιλέγουμε το σύστημα έκφρασης; Για ένα συγκεκριμένο θεραπευτικό πεπτιδικό μόριο μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε μόνο ένα σύστημα παραγωγής ή έχουμε επιλογές;
Παράγοντες που επηρεάζουν την επιλογή του συστήματος έκφρασης ü ü ü ü ü ü ü Υψηλά επίπεδα έκφρασης της επιθυμητής πρωτεΐνης Βιολογική ενεργότητα παραγόμενης πρωτεΐνης Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Δυνατότητα εύκολος, γρήγορο και «οικονομικός» καθαρισμός της πρωτεΐνης Βιοδιαθεσιμότητα της παραγομένης πρωτεΐνης Ασφάλεια Οικονομικοί παράγοντες
Το γενετικό υλικό που περιέχει την πληροφορία για την έκφραση της θεραπευτικής πρωτεΐνης πρέπει πρώτα να εισαχθεί στα κύτταρα στα οποία θα πραγματοποιηθεί η έκφραση
Τρόποι εισαγωγής γενετικού υλικού Ο τρόπος εισαγωγής γενετικού υλικού διαφέρει ανάλογα με το κύτταρο-στόχο Απλή ανάμιξη (σε κάποια βακτηριακά κύτταρα) Σύξευξη (βακτηριακά κύτταρα χρειάζονται ειδικά συζευτικά πλασμίδια σε κύτταρα-δότες, τα οποία κατόπιν μεταφέρονται από βατήριο σε βακτήριο) Agrobacterium tumefaciens/πλασμίδιο Ti : Μιά ειδική μέθοδος σύζευξης για τη μεταφορά γενετικού υλικού σε φυτικά κύτταρα) Εισαγωγή με τη βοήθεια ιών (φάγοι-βακτηριακά κύτταρα, ιοί (DNA ή RNA ιοί) σε ευκαρυωτικά Εισαγωγή με τη βοήθεια κάποιας χημικής επεξεργασίας (βακτηριακά και ευκαρυωτικά κύτταρα) Ηλεκτροδιάτρηση [electroporation] (βακτηριακά και ευκαρυωτικά κύτταρα) Βιολιστική μέθοδος εισαγωγής DNA (φυτικά και ζωικά κύτταρα ή ιστοί) Μικροέγχυση DNA στον πυρήνα των ζωικών κυττάρων
Eισαγωγή και έκφραση γενετικού υλικού
Η έκφραση του γενετικού υλικού που περιέχει την πληροφορία για την έκφραση της θεραπευτικής πρωτεΐνης προϋποθέτει την ύπαρξη σωστού υποκινητή που επιτρέπει την έκφραση του στο επιθυμητό σύστημα Ας θυμηθούμε ένα παράδειγμα
Χρήση βασικής γνώσης μοριακής βιολογίας μας επιτρέπει να επιλύουμε προβλήματα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Ø Η ισχυρή ρύθμιση της έκφρασης του οπερονίου της λακτόζης είναι αποτέλεσμα της συνδυασμένη δράσης ενός καταστολέα και ενός μεταγραφικού ενεργοποιητή Ø Εφαρμογή της παραπάνω γνώσης στην ρύθμιση της έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Ø ΠΡΟΣΟΧΗ: Ένας βακτηριακός υποκινητής δεν θα μπορέσει να κατεύνει την έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο Ø ΜΠΟΡΕΙ ΕΝΑΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΣ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗΤΗΣ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΕΙ ΓΙΑ ΝΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΕΙ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΜΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΣΕ ΚΑΠΟΙ ΑΛΛΟ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ;
Ας θυμηθούμε κάποιους παράγοντες που επηρεάζουν αρνητικά την παραγωγή μιάς ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης
Γιατί κάποιες φορές αποτυγχάνουμε να παράξουμε ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες; Τι φταίει; Τοξικότητα της πρωτεΐνης- Ενεργοποίηση των μηχανισμών άμυνας του κυττάρου στο στρες Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Χαμηλά επίπεδα μεταγραφής Αστάθεια του mrna Προβλήματα στη μετάφραση ü Έναρξη Παρουσία θέσης πρόσδεσης ριβοσωματίου Επιμήκυνση Ποια είναι τα αποτελέσματα του φαινομένου codon bias ; ü Τερματισμός
Σημασία της ορθής αναδίπλωσης στην βιολογική ενεργότητα αλλά και στις φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές ιδιότητες της ανασυνδυασμένης θεραπευτικής πρωτεΐνης
Τα συσσωματώματα των πρωτεϊνών είναι ανοσογόνα ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: Η ιντερφερόνη β που παράγεται σε βακτήρια είναι περισσότερο ανοσογόνος από αυτή που παράγεται σε κύτταρα θηλαστικών. ΕΞΗΓΗΣΗ: Διότι η βακτηριακώς παραγόμενη πρωτεΐνη εμφανίζει μεγαλύτερο βαθμό συσσωμάτωσης (λόγω και του γεγονότος ότι δεν είναι γλυκοζυλιωμένη)
Αρκετές θεραπευτικές πρωτεΐνες προάγουν ανοσολογικές αντιδράσεις
Παράγοντες που μπορεί να επηρεάζουν την ανοσογονικότητα θεραπευτικών πρωτεϊνών
Αντιδράσεις που επηρεάζουν τη σταθερότητα των παραγομένων πρωτεϊνών
Σημασία των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων στην βιολογική ενεργότητα και στις φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές ιδιότητες της ανασυνδυασμένης θεραπευτικής πρωτεΐνης Πως επηρεάζει το παραπάνω την επιλογή του σωστού συστήματος έκφρασης;
Τα συσσωματώματα των πρωτεϊνών είναι ανοσογόνα ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: Η ιντερφερόνη β που παράγεται σε βακτήρια είναι περισσότερο ανοσογόνος από αυτή που παράγεται σε κύτταρα θηλαστικών. ΕΞΗΓΗΣΗ: Διότι η βακτηριακώς παραγόμενη πρωτεΐνη εμφανίζει μεγαλύτερο βαθμό συσσωμάτωσης (λόγω και του γεγονότος ότι δεν είναι γλυκοζυλιωμένη)
Παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Πως καθαρίζονται οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες; ΕΧΟΥΜΕ ΗΔΗ ΑΝΑΦΕΡΕΙ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ ΤΙΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΕΣ ΕΤΙΚΕΤΕΣ ΠΙΘΑΝΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΗΣ ΕΤΙΚΕΤΑΣ Ποιά άλλα είδη χρωματογραφίας μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε; Υπάρχουν άλλες τεχνολογίες κλασμάτωσης των πρωτεΐνών που χρησιμοποιούνται στον καθαρισμό τους; Γιατί η μεγάλη καθαρότητα μιας θεραπευτικής πρωτεΐνης είναι τόσο σημαντική;
Απαραίτητες διεργασίες στον καθαρισμό ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Πιθανές προσμίξεις σε παρασκευάσματα ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Μέθοδοι απομάκρυνσης ιικών προσμίξεων από παρασκευάσματα ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
Επεξεργασία γλυκοζυλιωμένης ανασυνδυασμένης ιντερφερόνης
Οι βιοτεχνολογικώς παραγόμενες ανασυνδυασμένες θεραπευτικές πρωτεΐνες θα πρέπει να είναι ελέυθερες ενδοτοξινών Γενική δομή μιάς ενδοτοξίνης
Συστατικά που απαντώνται σε παρασκευάσματα παρεντερικώς χορηγουμένων θεραπευτικών πρωτεϊνών Ενεργό συστατικό Ενισχυτές διαλυτότητας Παράγοντες ελάττωσης της συσσωμάτωσης ή/και της προσρόφησης Ρυθμιστικά διαλύματα Προστατευτικοί και αντιοξειδωτικοί παράγοντες Παράγοντες προστασίας κατά την λυοφίληση Οσμωτικοί παράγοντες Συστήματα μεταφοράς Προσοχή: Δεν είναι απαραίτητο ότι όλοι οι παραπάνω παράγοντες θα πρέπει να βρίσκονται σε κάθε παρασκεύασμα θεραπευτικής πρωτεΐνης που χορηγείται παρεντερικά.
Ενισχυτές διαλυτότητας: Το παράδειγμα της επίδρασης της αργινίνης στην διαλυτότητα της αλτεπλάσης Αλτεπλάση: Ανασυνδυασμένος ανθρώπινος ενεργοποιητής του ιστικού πλασμινογόνου (recombinand tissue plasminogen activator, rtpa)
Παράγοντες ελάττωσης της προσρόφησης: Γιατί συχνά είναι αναγκαία η προσθήκη τους Οι παράγοντες ελάττωσης της προσρόφησης μπορεί να ελαττώσουν και την συσσωμάτωση μιας ανασυνδυασμένης θεραπευτικής πρωτεΐνης
Επίδραση του ph στη διαλυτότητα θεραπευτικών πρωτεϊνών Α. Επίδραση του ph στη διαλυτότητα διαφόρων μορφών της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης (hgh) B. Επίδραση του ph στη σταθερότητα της μονομερικής ανασυνδυασμένης α 1 -αντιτρυψίνης (rαατ)
Σχέση δόσης, συγκέντρωσης & αποτελεσματικότητας: Το κεντρικό παράδειγμα της κλινικής φαρμακολογίας ισχύει και στα πεπτιδικά φάρμακευτικά μόρια
Παράγοντες που επηρεάζουν τις φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές διαδικασίες
Σχέση μοριακού βάρους και μηχανισμών απομάκρυνσης πεπτιδικών φαρμάκων
Οδοί χορηγησης πρωτεϊνικών φαρμάκων: Γιατί η σωστή επιλογή είναι σημαντική; Η οδός χορήγησης θεραπευτικών πρωτεϊνών από του στόματος εμφανίζει σημαντικούς περιορισμούς Παρεντερικές οδοί χορήγησης: - Ενδοφλέβια (IV) - Υποδόρια (SC) - Ενδομυικά ( ΙΜ) Άλλες οδοί: - Ρινική - Πνευμονική - Παρειακή - Κολπική - Οφθαλμική - Διαδερμική
Εναλλακτικές οδοί χορήγησης θεραπευτικών πρωτεϊνών
Χορήγηση από του στόματος μπορεί να γίνει σε περιπτώσεις εμβολίων υπομονάδας
Διαδερμικά συστήματα χορήγησης
Πεγκυλίωση των θεραπευτικών πρωτεϊνών Η πεγκυλίωση των θεραπευτικών πρωτεϊνών: Α) Επιμηκύνει την ημιπερίοδο ζωής της κυκλοφορίας της πρωτεΐνης στο αίμα Β) Ελαττώνει την ανοσογονικότητα της πεγκυλιωμένης πρωτεΐνης Γ) Προστατεύει από πρωτεόλυση Δ) Αυξάνει την αποτελεσματικότητα της πεγκυλιωμένης θεραπευτικής πρωτεΐνης
Πεγκυλιωμένες θεραπευτικές πρωτεΐνες Ονομασία Προϊόντος Ονομασία φαρμάκου Πατρικό φάρμακο Ένδειξη Έτος έγκρισης Adagen Pegadamase Απαμινάση αδενοσίνης Βαριά συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) Oncaspar Pegaspargase Ασπαραγινάση Λευκαιμία 1994 PEG-INTRON Peginterferon-a2b IFN-a2B Ηπατίτιδα C 2000 PEGASYS Peginterferon-a2a IFN-a2A Ηπατίτιδα C 2001 Neulasta Pegfilgrastim Παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων (GCSF) Somavert Pegvisomant Ανταγονιστής αυξητικής ορμόνης 1990 Ουδετεροπενία 2002 Ακρομεγαλία 2003 Macugen Pegaptanib αντι-vegfc απταμερές Ηλικιακή εκφύλιση της ωχρας 2004 Mircera Epoetin beta-methoxy polyethylene glycol Ερυθροποιητίνη(EPO) Αναιμία σχετιζόμενη με νεφροπάθεια 2007 Cimzia PEG-Certolizumab pegol αντι-tnf Fab Ρευματοειδής αρθρίτιδα και νόσος του Crohn 2008
Συστήματα μεταφοράς με μεγέθη στη περιοχή των κολλοειδών ή των νανοσωματιδίων
Χρήση λιποσωματίων στη χορήγηση θεραπευτικών πρωτεϊνών
Η πεγκυλίωση μπορεί να επιμηκύνει τη διάρκεια παραμονής των λιποσωματίων στο κυκλοφορία του αίματος
Ανοσοσολιποσωμάτια: Εξειδικευμένη στόχευση & απόθεση του φορτίου των λιποσωματίων
Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας