Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία

Transcript

1 Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 7-8 ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Θεσσαλονίκη

2 Εισαγωγή üο στόχος της διάλεξης είναι: Ø Να δώσει την ελάχιστη αναγκαία γνώση για την κατανόηση και εφαρμογή μιάς επιτυχημένης στρατηγικής πρωτεϊνικής έκφρασης.

3 Στόχος της συζήτησης üνα εισάγει σε συστήματα έκφρασης πρωτεϊνών τα οποία χρησιμοποιούνται συχνά για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και να εξηγήσει: $Τις βιολογικές αρχές πάνω στις οποίες βασίζεται, $Τη σχέση μεταξύ πρωτεϊνικής έκφρασης και καθαρισμού της πρωτεΐνης FΜε την ελπίδα ότι με αυτή τη γνώση θα μπορέσετε και εσείς να μπορείτε να κάνετε σωστό σχεδιασμό όταν (και αν) θελήσετε να εκφράσετε την «αγαπημένη» σας πρωτεΐνη.

4 Ορισμός πρωτεϊνικής έκφρασης & Η πρωτεϊνική έκφραση μπορεί να έχει δύο αλληλεπικαλυπτόμενα νοήματα :! 1. Το "ευρύ" νόημα: Πρωτεϊνική έκφραση είναι η παραγωγή μιας πρωτεΐνης σε οποιοδήποτε ετερόλογο σύστημα, προκειμένου να μελετηθούν οι βιολογικές ή φυσικοχημικές της ιδιότητες ή/και λειτουργίες!2. Το "στενό" νόημα: : Πρωτεϊνική έκφραση είναι η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων μιας πρωτεΐνης η οποία είναι εύκολο να καθαρισθεί, με κλωνοποίηση του γονιδίου της σε ένα φορέα που επιτρέπει την υπερπαραγωγή του προϊόντος του γονιδίου

5 Παραδείγματα πρωτεϊνικής έκφρασης σύμφωνα με τον "ευρύ" ορισμό Ø Παραγωγή με in vitro μετάφραση, χρησιμοποιώντας προκαρυωτικά ή ευκαρυωτικά συστήματα Ø Παραγωγή διαλυτών ή μεμβρανικών πρωτεϊνών σε συστήματα in vitro μεταγραφής/μετάφρασης Ø Ιικοί φορείς που επιτρέπουν μερική έκφραση ετερόλογων γονιδίων Ø Πλασμιδιακοί φορείς που επιτρέπουν έκφραση προϊόντων γονιδίων ενδιαφέροντος για λειτουργικές μελέτες Ø Όλα τα παραδείγματα που εμπίπτουν και στην κατηγορία του «στενού» ορισμού

6 Παραδείγματα πρωτεϊνικής έκφρασης σύμφωνα με τον "στενό" ορισμό Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε βακτήρια με χρήση προκαρυωτικών φορέων έκφρασης Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε μήκυτες (κυρίως σε Saccharomyces cereviciae και Pichia pastoris) με χρήση καταλλήλων φορέων έκφρασης Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα εντόμων μολυσμένων με ανασυνδυασμένους βακουλοϊούς Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε φυτικά κύτταρα Ø Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα θηλαστικών με χρήση καταλλήλων φορέων έκφρασης (κυρίως πλασμιδιακών αλλά και ιικών)

7 Η «επανάσταση» των φορέων έκφρασης πρωτεϊνών & Γιατί είναι «επανάσταση»? J Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά τα οποία χαρακτηρίζουν έναν «καλό» φορέα έκφρασης πρωτεϊνών;

8 Είναι επανάσταση διότι: JΈχει επιτρέψει την έκφραση και τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σε μέρες αντί για χρόνια. ΑΠΛΑ ΚΡΑΤΗΣΤΕ ΣΤΟ ΜΥΑΛΟ ΣΑΣ ΟΤΙ: ¾Μέχρι και την δεκαετία του 1980 ο χαρακτηρισμός των συνθηκών καθαρισμού μιας πρωτεΐνης έπαιρνε χρόνια και πολλά από τα διδακτορικά στο πεδίο της βιοχημείας αφιερώνονταν σχεδόν αποκλειστικά στον καθαρισμό και χαρακτηρισμό μιας και μοναδικής πρωτεΐνης (κάτι που σήμερα μπορεί να επιτευχθεί σε μερικές μέρες)

9 Ιδιότητες ενός «καλού» φορέα έκφρασης J Ένας «καλός» φορέας έκφρασης θα πρέπει να επιτρέπει: ü ü ü ü ü Υψηλά επίπεδα έκφρασης της επιθυμητής πρωτεΐνης Ρυθμιζόμενη έκφραση Παραγωγή ενεργού πρωτεΐνης Ορθό εντοπισμό της πρωτεΐνης Εύκολο, γρήγορο και «οικονομικό» καθαρισμό της πρωτεΐνης

10 Γενικές ιδιότητες ενός φορέα έκφρασης % Οι πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης θα πρέπει να κατέχουν τις ιδιότητες που είναι απαραίτητες σε όλους τους πλασμιδιακούς φορείς 1. Aλληλουχίεςέναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ. αντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισμού (polylinker) 4. ( Υποκινητής που επιτρέπει ρυθμιζόμενη έκφραση)

11 Υποκινητές και ρυθμιζόμενη έκφραση Ø Γιατί η ρυθμιζόμενη έκφραση είναι απαραίτητη ιδιότητα ενός καλού φορέα έκφρασης; Ø Τι είναι υποκινητής και ποια είναι τα χαρακτηριστικά ενός ρυθμιζόμενου υποκινητή; Ø Τι συστήματα χρησιμοποιούνται για την ενεργοποίηση της έκφρασης (επαγωγή) και πως αυτά μπορούν να επηρεάσουν τα επίπεδα της έκφρασης ή την ποιότητα της παραγόμενης πρωτεΐνης;

12 Προκαρυωτικοί υποκινητές που ρυθμίζονται από καταστολείς Καταστολέας είναι μία πρωτεΐνη που μπορεί να επιτρέψει το «άναμμα» ή το «σβήσιμο» της γονιδιακής έκφρασης

13 Υποκινητές που χρησιμοποιούνται σε κοινούς προκαρυωτικούς φορείς έκφρασης ü Υποκινητές Trc/Tac: Τεχνητά υβρίδια των υποκινητών trp/lac, ρυθμίζονται από τον καταστολέα του οπερονίου, επάγονται από IPTG ü Υποκινητής του φάγου T7: Χρησιμοποιείται στο σύστημα του Studier, στην οικογένεια των φορέων pet. Το γονίδιο της πολυμεράσης T7 είναι ενσωματωμένο στο γονιδίωμα ενός προφάγου και επάγεται με IPTG (έμμεση επαγωγή) ü Υποκινητές του λ φάγου (PL, PR): Ρυθμίζονται από τον καταστολέα του φάγου λ (ci) Επάγονται με αύξηση της θερμοκρασίας ή με τρυπτοφάνη ü Υποκινητής teta: Επάγεται με ανυδροτετρακυκλίνη

14 Γιατί η πολύ καλή ρύθμιση της έκφρασης είναι απαραίτητη για ένα «καλό» φορέα έκφρασης; N Μη ξεχνάτε ποτέ ότι πολλές «ξένες» ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες μπορεί να είναι τοξικές για τον βακτηριακό ξενιστή που τις παράγει I Επομένως, η πολύ καλή ρύθμιση της έκφρασης μπορεί να μας προφυλάξει από προβλήματα όπως η συσσώρευση μεταλλάξεων είτε στην κωδική περιοχή του υπό έκφραση γονιδίου, ή στον υποκινητή ή ακόμη και σε περιοχές του βακτηριακού χρωμοσώματος που επηρεάζουν την έκφραση

15 Χρήση βασικής γνώσης μοριακής βιολογίας μας επιτρέπει να επιλύουμε προβλήματα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Ø Η ισχυρή ρύθμιση της έκφρασης του οπερονίου της λακτόζης είναι αποτέλεσμα της συνδυασμένη δράσης ενός καταστολέα και ενός μεταγραφικού ενεργοποιητή Ø Εφαρμογή της παραπάνω γνώσης στην ρύθμιση της έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

16 Γιατί κάποιες φορές αποτυγχάνουμε να παράξουμε ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες; Τι φταίει; Τοξικότητα της πρωτεΐνης- Ενεργοποίηση των μηχανισμών άμυνας του κυττάρου στο στρες Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Χαμηλά επίπεδα μεταγραφής Αστάθεια του mrna Προβλήματα στη μετάφραση ü Έναρξη Παρουσία θέσης πρόσδεσης ριβοσωματίου Επιμήκυνση Ποια είναι τα αποτελέσματα του φαινομένου codon bias ; ü Τερματισμός

17 Επίδραση της θέσης πρόσδεσης ριβοσωματίου (RBS) στην αποτελεσματικότητα της έναρξης της μετάφρασης Επίδραση του δεύτερου κωδικονίου: raaa = λυσίνη (απαντάται στο 13.9% των γονιδίων της E.coli) Η έκφραση μπορεί να αυξηθεί μέχρι και 15 φορές Πρέπει να αποφεύγονται οι φουρκέτες στο 5 άκρο του γονιδίου και οι υψηλές περιεκτικότητες σε GC

18 Προτίμηση κωδικονίων ή codon bias Διαφορετικοί οργανισμοί χρησιμοποιούν διαφορετικά κωδικόνια για το ίδιο αμινοξύ ΕΠΟΜΕΝΩΣ Κάποια γονίδια μπορεί να μη μπορούν να εκφρασθούν σε υψηλά επίπεδα όταν ο ξενιστής δεν έχει τις αναγκαίες ποσότητες των trnas που είναι απαραίτητα για την αναγνώριση των κωδικονίων του υπό έκφραση γονιδίου ΓΙΑΤΙ;

19 Χρήση κωδικονίων στην E. coli και στον άνθρωπο

20 Στρατηγικές βελτίωσης κωδικονίων ØΧημική σύνθεση του γονιδίου Αλλαγή της αλληλουχίας του υπό έκφραση με αντικατάσταση των «σπάνιων» κωδικονίων με κωδικόνια που είναι άφθονα στον ξενιστή ØΈκφραση σε διαφορετικό ξενιστή Επιλογή ξενιστή με συμβατή χρήση κωδικονίων ØΧρήση τροποποιημένου ξενιστή Έκφραση των σπάνιων κωδικονίων στον ξενιστή με χρήση γενετικής μηχανικής

21 Λύση στο πρόβλημα του codon bias Χρήση στελεχών E. coli που εκφράζουν γονίδια των trnas με σπάνια αντικωδικόνια BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (συμβατή με AT-rich) BL21 (DE3) CodonPlus-RP (συμβατή με GC-rich) αργινίνη (AGG, AGA), ισολευκίνη (AUA) και λευκίνη (CUA) αργινίνη (AGG, AGA) προλίνη (CCC) Rosetta or Rosetta (DE3) (συμβατή με GC- & AT-rich) AGG/AGA (αργινίνη ), CGG (αργινίνη ), AUA (ισολευκίνη) CUA (λευκίνη )CCC (προλίνη), and GGA (γλυκίνη)

22 Η ταχύτητα της μετάφρασης επηρεάζει τον ρ-εξαρτώμενο τερματισμό της μεταγραφής

23 ΓΙΑΤΙ ΠΟΛΛΕΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΣΥΧΝΑ ΑΠΟΤΥΓΧΑΝΟΥΝ ΝΑ ΑΝΑΔΙΠΛΩΘΟΥΝ ΟΡΘΑ ΟΤΑΝ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ; ΓΙΑΤΙ ΣΧΗΜΑΤΙΖΟΝΤΑΙ ΤΑ ΕΓΚΛΕΙΣΤΑ?

24 Το πρόβλημα των εγκλείστων Ø Πολλές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες είναι αδιάλυτες όταν εκφράζονται σε βακτήρια Ø Αυτές οι πρωτεΐνες εναποτίθενται στα έγκλειστα (inclusion bodies) Ø Τα έγκλειστα είναι αδιάλυτα ενδοκυτταρικά πρωτεϊνικά συσσωματώματα που μπορούν να φθάσουν και στο 80% της κυτταρικής μάζας Ø Οι πρωτεΐνες των εγκλείστων μπορούν να διαλυτοποιηθούν με χρήση χαοτροπικών παραγόντων και να αναδιπλωθούν in vitro, αλλά η αποτελεσματικότητα της αναδίπλωσης είναι συχνά «φτωχή»

25 Το πρόβλημα του μακρομοριακού συνωστισμού in vitro <0.1 mg/ml Κυτταρόπλασμα E. coli ~340 mg/ml Ellis and Hartl (1996) FASEB J. 10:20-26 ριβοσωμάτιο πρωτεΐνες μοριακοί συνοδοί νουκλεϊνικά οξέα άλλα μακρομόρια

26 Οι μοριακοί συνοδοί βοηθούν στην πρωτεϊνική αναδίπλωση

27 Χρήση μοριακών συνοδών στη βελτίωση της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης in vivo & in vitro Η εισαγωγή πρωτεϊνων με δράση μοριακού συνοδού (HSPs) ή φολδάσης σε in vitro αντιδράσεις αναδίπλωσης πρωτεϊνών βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της αναδίπλωσης Η συνέκφραση μοριακών συνοδών και ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης αυξάνει την διαλυτότητα των παραγομένων πρωτεϊνών (η εταιρεία Takara ήδη παράγει ένα τέτοια σύστημα, περισσότερα έρχονται στο μέλλον)

28 ΠΩΣ ΜΠΟΡΟΥΜΕ ΝΑ ΚΑΘΑΡΙΣΟΥΜΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΓΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ; ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΣΕ ΕΝΑ ΤΕΤΟΙΟ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΥΠΟ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ;

29 Πως καθαρίζονται οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες; Η χρήση των πεπτιδικών ετικετών

30 Χρωματογραφία αγχιστείας Οι στήλες χρωματογραφίας αγχιστείας περιέχουν μία μήτρα η οποία είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με ένα μόριο που αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος (π.χ. ένα αντίσωμα, ή ένα υπόστρωμα ενζύμου). Οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν εξειδικευμενα με μία τέτοια στήλη μπορούν να απελευθερωθούν είτε ειδικά (π.χ. με προσθήκη του προσδέματος στο διάλυμα έκλουσης) ή μη ειδικά με αλλαγή του ph ή με συμπυκνωμένα διαλύματα αλάτων. Essential Cell Biology: An Introduction to the Molecular Biology of the Cell Η χρωματογραφία αγχιστείας επιτυγχάνει συνήθως εξαιρετικό καθαρισμό των πρωτεϊνών

31 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Essential Cell Biology: An Introduction to the Molecular Biology of the Cell

32 Η οικογένεια των φορέων έκφρασης pgex - Έκφραση πρωτεϊνών ως υβρίδια με την GST M Σημαντικά στοιχεία των φορέων έκφρασης pgex 1. Ισχυρός και ρυθμιζόμενος υποκινητής (Tac promoter) 2. Παρουσία γονιδίου lac Iq 3. Ετικέτα (tag) GST (θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης)

33 Ta υβρίδια GST GST= glutathione S-transferase (θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης) από Schistosoma japonicum Μέγεθος της πεπτιδικής ετικέτας GST= 26 kda Χρήσιμες ιδιότητες της GST 1) Μπορεί να βελτιώσει τη τη διαλυτότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 2) Βοηθάει στον καθαρισμό της υβριδικής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με χρωματογραφία αγχιστείας 3) Είναι χρήσιμη για τον ανοσολογικό προσδιορισμό του υβριδίου με αντι-gst αντισώματα

34 Τα υβρίδια GST καθαρίζονται εύκολα και γρήγορα με χρωματογραφία αγχιστείας σε στήλες ακινητοποιημένης γλουταθειόνης σφαιρίδια αγαρόζης Γλουταθειόνη προσδεδεμένη στα σφαιρίδια πρωτεΐνη πρωτεΐνες που δεν προσδένονται στη γλουταθειόνη δεν συγκρατούνται Τα υβρίδια GST εκλούονται με ελεύθερη γλουταθειόνη στο διάλυμα έκλουσης

35 Καθαρισμός των υβριδίων GST πολυπεπτίδιο GST Γλουταθειόνη Σεφαρόζη Ο καθαρισμός είναι απλός: - Εκτεταμένη πλύση της στήλης - Έκλουση με αναγμένη γλουταθειόνη - Η εκλουόμενη πρωτεΐνη-υβρίδιο με GST είναι εξαιρετικά καθαρή

36 Επιλεκτική έκλουση των υβριδίων GST με αναγμένη γλουταθειόνη Γλουταθειόνη προσδεδεμένη στα σφαιρίδια υβρίδιο GST-πρωτεΐνης συνδεδεμένο σε ελεύθερη γλουταθειόνη του διαλύματος έκλουσης Ελεύθερη γλουταθειόνη Σεφαρόζη

37 Η αποτελεσματικότητα του καθαρισμού των υβριδίων GST Η GST ή τα GST-υβρίδια (π.χ. GST-DHFR) μπορούν να καθαρισθούν πολύ αποτελεσματικά σε ένα βήμα με χρωματογραφία αγχιστείας σε στήλες γλουταθειόνης αγαρόζης

38 Γιατί να χρησιμοποιήσω πεπτιδικές ετικέτες; *Ένας μεγάλος αριθμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών εκφράζεται με τη μορφή υβριδίου με κάποια πεπτιδική ετικέτα συνδεδεμένη είτε στο N- ή στο C- άκρο της. ΓΙΑΤΙ? $Διότι οι πεπτιδικές ετικέτες επιτρέπουν: 1. Εύκολο καθαρισμό 2. Ανίχνευση της πρωτεΐνης 3. Κατεύθυνση στην επιθυμητή περιοχή του κυττάρου 4. Αυξημένη σταθερότητα ή διαλυτότητα της πρωτεΐνης 5. Εισαγωγή περιοχών μεταμεταφραστικής τροποποίησης

39 Δημοφιλείς πεπτιδικές ετικέτες PΘειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST): καθαρισμός με χρωματογραφία αγχιστείας σε γλουταθειόνη αγαρόζη PΕτικέτες πολυ-ιστιδίνης (6x or 10x): Χηλικά σύμπλοκα με μέταλα, καθαρισμός με χρωματογραφία αγχιστείας σε στήλες αγαρόζης που περιέχουν καθηλωμένο νικέλιο PMaltose binding protein (MBP): καθαρισμός με χρωματογραφία αγχιστείας σε στήλες καθηλωμένης αμυλόζης PΠρωτεΐνη A: καθαρισμός σε IgG αγαρόζη PCalmodulin-binding peptide (CBP): καθαρισμός σε καλμοδουλίνη αγαρόζη PΠεπτιδικές Ετικέτες (HSV, myc, flag κλπ): Επιτρέπουν ανοσολογικό προσδιορισμό

40 Πολυιστιδίνες: Οι δημοφιλέστερες ετικέτες Πλεονεκτήματα 1) Μικρό μέγεθος (συνήθως 6 ή 10 ιστιδίνες) 2) Συνήθως δεν επηρεάζουν τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης 3) Ισχυρή σύνδεση σε στήλες καθηλωμένου νικελίου που λαμβάνει χώρα ακόμη και όταν η πρωτεΐνη είναι ξεδιπλωμένη (π.χ. παρουσία 8Μ ουρίας που χρησιμοποιείται για τη διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών των εγκλείστων)

41 Καθαρισμός πρωτεϊνών με ετικέτες πολυιστιδινών Καθαρισμός σε στήλες νικελίου καθηλωμένου σε χηλικά σύμπλοκονιτριλοξικούοξέως (NTA) Ιστιδίνη Οι 6 ή 10 διαδοχικές ιστιδίνες εξασφαλίζουν σύνδεση σε στήλες καθηλωμένου νικελίου (π.χ. σε χηλικό σύμλοκο με νιτριλοξικό οξύ (NTA) Η χημική συγγένεια της παραπάνω αλληλεπίδρασης είναι εξαιρετικά υψηλή και επιτρέπει υψηλό βαθμό καθαρισμού σε ένα χρωματογραφικό στάδιο

42 Το σύστημα φορέων έκφρασης pet που χρησιμοποιεί την Τ7 RNA πολυμεράση! Η οικογένεια των φορέων έκφρασης pet χρησιμοποιεί στο σύστημα έκφρασης των Moffat & Studier που χρησιμοποιεί το σύστημα της T7 RNA πολυμεράσης για εξαιρετική ρύθμιση της έκφρασης

43 Η ετικέτα CBP (πεπτίδιο που συνδέεται με την καλμοδουλίνη) 1) Μικρό μέγεθος (4kDa) 2) Συνδέεται σε στήλες που περιέχουν καθηλωμένη καλμοδουλίνη παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων ιόντων ασβεστίου 3) Η έκλουση επιτυγχάνεται με 2mM EDTA σε διαλύματα με ουδέτερο ph.

44 Η ετικέτα θειορεδοξίνης Οι θειορεδοξίνες είναι σουλφυδρυλοοξειδοαναγωγάσες που μπορούν να μετατρέψουν δύο κοντινές σουφυδρυλομάδες σε δισουλφιδικό δεσμό Πλεονεκτήματα της θειορεδοξίνης 1) Σταθερή μέχρι και τους 80 C 2) Βελτιώνει τη διαλυτότητα της υβριδικής πρωτεΐνης 3) Στην E. coli συγκεντρώνεται στις θέσεις προσκόλλησης (adhesion zones) από τις οποίες μπορεί να απελευθερωθεί εύκολα με γρήγορο ωσμωτικό σοκ

45 Ετικέτες πεπτιδίων που αντιδρούν με εξειδικευμένα αντισώματα Επίτοπος myc (Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser- Glu-Glu-Asp-Leu-Asn) Επίτοπος Flag (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp- Asp-Lys) Επίτοπος HAτου ιού της γρίπης (Tyr-Pro- Tyr-Asp-Val-Pro-Asp Tyr-Ala) YPYDVPDYA) Επίτοπος γλυκοπρωτεΐνης D του ιού του απλού έρπητα (HSV) (Gln-Pro-Glu-Leu- Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp)

46 Μη ξεχνάτε την ετικέτα N ΠΟΤΕ δεν θα πρέπει να ξεχνάτε ότι η επικόλληση μιας ετικέτας στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μπορεί σε κάποιες περιπτώσεις να επηρεάσει την λειτουργικότητα της πρωτεΐνης αυτής. FΕάν αυτό συμβαίνει, ή αν απλά δεν θέλετε να πάρετε το ρίσκο ότι θα συμβεί, τότε θα πρέπει να απομακρύνετε την ετικέτα. "Η απομάκρυνση της ετικέτας είναι μια σχετικά απλή διαδικασία και επιτυγχάνεται με πέψη της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με μια εξειδικευμένη πρωτεάση που αναγνωρίζει μια αμινοξική αλληλουχία που βρίσκεται μεταξύ της ετικέτας και της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος (οι περισσότεροι φορείς έκφρασης περιέχουν τέτοιες θέσεις)

47 Συχνά χρησιμοποιούμενες πρωτεάσες για την απομάκρυνση των ετικετών " Θρομβίνη: Val-Pro-Arg/Gly-Ser " Παράγοντας Xa: Ile-Glu-Gly-Arg " Εντεροκινάση: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys " rtev: Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln/Gly " 3C πρωτεάση του ρινοιού ανθρώπου Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro

48 Παράδειγμα απομάκρυνσης ετικέτας με πέψη με παράγοντα Xa βελτιστοποίηση πέψης

49 ΠΟΤΕ να μη ξεχνάς την πρωτεάση ý Ποτέ δεν θα πρέπει να ξεχνάμε ότι μετά την απομάκρυνση της ετικέτας με πέψη με εξειδικευμένη πρωτεάση, η πρωτεάση εξακολουθεί να παραμένει μαζί με την πρωτεΐνη μας και μπορεί να μας δημιουργήσει προβλήματα ( ΓΙΑΤΙ? N Διότι η πρωτεάση μπορεί να αποικοδομήσει είτε την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ή άλλες πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος σε βιολογικές αντιδράσεις

50 Η νέα γενιά: Ιντεΐνες οι ετικέτες που απομακρύνονται από μόνες τους Ιντεΐνη= πρωτεΐνη που μπορεί και προκαλεί μάτισμα πρωτεϊνών αφαιρώντας τον εαυτό της από ένα πρόδρομο πολυπεπτίδιο (π.χ. η VMA-1 από S. cerevisiae Η ιντεΐνη υπόκειται σε αντίδραση αυτο-αποκοπής στο N-τελικό της άκρο σε χαμηλές θερμοκρασίες παρουσία θειολών

51 Ιντεΐνες συνδεδεμένες με άλλες ετικέτες που επιτρέπουν εύκολο καθαρισμό Στο σύστημα φορέων pcyb/impact (New England BioLabs) η ιντεΐνη χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ετικέτα που προσδένεται στη χυτίνη (CBD, chitin binding tag) Η ετικέτα που CBD είναι μία μικρή πεπτιδική αλληλουχία (5kDa) που προέρχεται από τον Bacillus circulans Η απομάκρυνση της ετικέτας λαμβάνει χώρα με επώαση στους 4 C παρουσία διθειοθρεϊτόλης (DTT) ή β-μερκαπτοαιθανόλης

52 Τελικά συμπεράσματα G Σκεφθείτε πολύ προσεκτικά πριν διαλέξετε ένα σύστημα έκφρασης για μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Δεν είναι όλα ίδια. ü Προσπαθήστε να βρείτε το βέλτιστο σύστημα και όχι απλά αυτό που είναι πιο εύκολα διαθέσιμο D Μην κατηγορείτε τα βακτήρια ή τον φορέα έκφρασης για τα δικά σας λάθη

53 Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας