ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΡΟΣΟΥ ΒΙΚΤΩΡΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΟΥ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΡΟΣΟΥ ΒΙΚΤΩΡΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΣΕ ΣΩΜΑΤΙΚΑ ΚΑΙ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΡΟΣΟΥ ΒΙΚΤΩΡΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΣΕ ΣΩΜΑΤΙΚΑ ΚΑΙ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, του Τομέα Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας, του Τμήματος Χημείας, του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αν. Καθηγητής Θ. Γιαννακούρος Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Δ. Κυριακίδης Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθηγητής Τ. Γιουψάνης Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Ζ. Σκούρας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Καθηγήτρια Ν. Βαβάτση Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Αν. Καθηγήτρια Θ. Χολή-Παπαδοπούλου Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Επ. Καθηγήτρια Ε. Νικολακάκη Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

Στους γονείς μου και στον Δήμο

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Κεντρικό στόχο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε ο τρόπος σύνδεσης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης του πυρηνικού φακέλου με την χρωματίνη. Ειδικότερα η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε στην αλληλεπίδραση μιας πρωτεΐνης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, του LBR (Υποδοχέας της Β λαμίνης) με συστατικά της χρωματίνης τόσο των σωματικών όσο και των γεννητικών κυττάρων, καθώς και ο τρόπος ρύθμισης της αλληλεπίδρασης αυτής. Στην πορεία της εργασίας βρέθηκε ότι το αμινο-τελικό τμήμα του LBR αλληλεπιδρά με τις ιστόνες Η3 και Η4. Στην προσπάθεια να διερευνηθεί περισσότερο η αλληλεπίδραση αυτή, διαπιστώθηκε ότι η σύνδεση του LBR με τις συγκεκριμένες ιστόνες είναι έμμεση και πραγματοποιείται με την μεσολάβηση μορίων RNA. Το επόμενο βήμα ήταν η συστηματικότερη μελέτη της σύνδεσης των μορίων RNA στο αμινο-τελικό άκρο του LBR και ο τρόπος ρύθμισης της σύνδεσης αυτής. Επίσης, παράλληλα μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του LBR με συστατικά της χρωματίνης των σπερματοζωαρίων. Bρέθηκε ότι ο LBR αλληλεπιδρά με μόρια πρωταμίνης 1 μόνο όταν αυτά είναι φωσφορυλιωμένα, από την κινάση SRPK1, στα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης που περιέχουν. Η αλληλεπίδραση των δύο αυτών πρωτεϊνών φαίνεται να ισχύει και in vivo, αφού δοκιμασίες ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι ο LBR και η πρωταμίνη 1 συν-εντοπίζονται στην περιφέρεια του πυρήνα των σπερματικών κυττάρων στα αρχικά στάδια της σπερμιογένεσης. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κάτω από την άμεση καθοδήγηση του αναπληρωτή καθηγητή κ. Θ. Γιαννακούρου, τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την υπόδειξη του θέματος και για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εργασίας. Η συνεργασία μαζί του αποτέλεσε μία πηγή γνώσεων και σωστού τρόπου σκέψης και θεώρησης της επιστήμης της Βιοχημείας. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή κ. Δ. Κυριακίδη και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Τ. Γιουψάνη, μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για την άψογη συνεργασία, καθώς και τις πολύτιμες υποδείξεις τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τους καθηγητές κ Ν. Βαβάτση και κ. Ζ. Σκούρα, την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Δ. Χολή-Παπαδοπούλου και την επίκουρη καθηγήτρια κ. Ε. Νικολακάκη μέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις χρήσιμες παρατηρήσεις τους και το χρόνο που διέθεσαν διορθώνοντας τα κείμενα μου. i

Ιδιαίτερα ευχαριστώ την επίκουρη καθηγήτρια κ. Ε. Νικολακάκη για την ουσιαστική βοήθεια και τις γνώσεις που μου πρόσφερε ιδιαίτερα σε θέματα μοριακής βιολογίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον διδάκτορα Ηλία Μυλωνή για την εκτέλεση των πειραμάτων ανοσοφθορισμού για την εύρεση της κατανομής του LBR και της πρωταμίνης 1 στα σπερματικά κύτταρα, καθώς και τον υποψήφιο διδάκτορα Φίλιππο Πεΐδη για την βοήθεια που προσέφερε σε πειράματα έκφρασης πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Οι δοκιμασίες ανοσοφθορισμού έγιναν στο Εργαστήριο του Dr. Paolo Sassone-Corsi (IGBMC, Strasbourg, France). Ευχαριστίες οφείλω και σ όλο το προσωπικό και συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχημείας για τη συνεργασία τους και τη δημιουργία του ευχάριστου συναδερφικού κλίματος μέσα στο εργαστήριο. Ιδιαίτερα όμως θα ήθελα να ευχαριστήσω τους υποψήφιους διδάκτορες με τους οποίους μοιράστηκα τον ίδιο εργαστηριακό χώρο, την Χριστίνα Ματράγκου, τον Φίλιππο Κωττάκη, τον Φίλιππο Πεΐδη και την Κατερίνα Τσαγκάλια για τη στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συμπαράσταση και το ενδιαφέρον τους. Τις περισσότερες ευχαριστίες τις οφείλω στον Δήμο Ιωαννίδη και στον αδερφό μου Δρόσο για τη συνεχή συμπαράσταση και ενθάρρυνσή τους, αλλά ιδιαίτερα στους γονείς μου, γιατί πραγματικά χωρίς τις δικές τους προσωπικές θυσίες, την στήριξη και την αγάπη τους, η διδακτορική αυτή διατριβή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. ii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΕΛΙΔΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ i ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ iii ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ x Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Α.1 Πυρηνικός φάκελος 1 Α.2. Πυρηνική λάμινα 2 Α.3. Πυρηνικοί πόροι 5 Α.4. Πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης 7 Α.4.1. Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR) 9 A.4.1.1. Σύμπλοκο του LBR 11 A.4.1.2. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine 13 Protein Kinases, SRPKs) Α.4.2. ULUamin-UAUssociated UPUeptide 1 (LAP1) 16 Α.4.3. ULUamin -UAUssociated UPUeptide 2 (LAP2) 17 Α.4.4. Εμερίνη (Εmerin) 19 Α.4.5. ΜΑΝ1 αντιγόνο 20 Α.4.6. Νουρίμη (Nurim) 21 Α.4.7. Νεσπρίνες (UΝesprUins-UnUuclear UeUnvelope UspUectrin UrUepeat) 21 Α.5. Πυρηνικός φάκελος κατά τη διάρκεια της μίτωσης 21 Α.5.1. Διάσπαση του πυρηνικού φακέλου κατά τη διάρκεια της 22 μίτωσης Α.5.2. Επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου 22 Α.6. Ετεροχρωματίνη 23 Α.6.1. Σύσταση ετεροχρωματίνης 24 Α.6.2. Μεθυλίωση των ιστονών 26 Α.6.2.1. Μεθυλίωση της λυσίνης Κ9 της ιστόνης Η3 28 Α.6.3. Ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) 28 Α.6.4. Σύνδεση της ΗΡ1 στην μεθυλιωμένη λυσίνη 9 (Κ9) της 30 ιστόνης Η3 Α.6.5. Υποακετυλίωση των ιστονών 31 Α.6.6. Σχηματισμός και εξάπλωση της ετεροχρωματίνης 32 iii

Α.6.7. Μεθυλίωση του DNA 33 Α.6.8. RNA παρεμβολή (RNA interference, RNAi) 34 Α.6.9. Συμμετοχή του RNAi μηχανισμού στον σχηματισμό 36 ετεροχρωματίνης Α.7. Σπερματογένεση 39 Α.7.1. Δομή όρχεων και σπερματοφόρων σωληναρίων 39 Α.7.2. Διαφοροποίηση κυττάρων κατά την διάρκεια της 41 σπερματογένεσης Α.7.3. Δημιουργία συμπυκνωμένης χρωματίνης σπερματοζωαρίων 43 Α.7.4. Μεταβατικές Πρωτεΐνες (Transition Proteins -TPs ) 44 Α.7.5. Πρωταμίνες 1 και 2 46 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 48 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 50 B.1. Βιολογικό υλικό 50 B.2. Χημικά αντιδραστήρια 50 B.3. Πρωτεΐνες, ένζυμα, αντισώματα και υλικά μοριακής 51 βιολογίας Β.4. Θρεπτικά υλικά 51 Β.5. Μέθοδος προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών με την 51 μέθοδο Bradford Β.6. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) 52 Β.6.1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 53 κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Β.7. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250 55 Β.8. Αυτοραδιογραφία 55 Β.9. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη 55 Β.10. Ανοσοανίχνευση 56 Β.11. Πειράματα συγκατακρήμνισης (Pulldown assays) 58 Β.12. Φωσφορυλίωση πρωτεϊνών 60 Β.13. Παρασκευή μεσοφασικών και μιτωτικών εκχυλισμάτων από 60 HeLa κύτταρα Β.14. Επώαση του ανασυνδυασμένου αμινο-τελικού άκρου του 61 iv

LBR με πολυνουκλεοσώματα Β.15. Απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος όρχεων ποντικού 62 Β.16. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain 62 Reaction, PCR) Β.17. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης και απομόνωση 65 των τμημάτων του DNA Β.18. Κλωνοποίηση DNA 66 Β.19. Πέψη με ένζυμα περιορισμού Αντίδραση λιγάσης 68 Β.20. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων ώστε να γίνουν 69 επιδεκτικά για μετασχηματισμό (Competent Cells) Β.21. Μετασχηματισμός κυττάρων E.coli (Transformation) 70 Β.22. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση 70 Β.23. Εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του DNA 71 Β.24. Παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων 72 Β.25. Β.26. Σημειακή in vitro ολιγονουκλεοτιδίου-κατευθυνόμενη μετάλλαξη Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 74 77 Β.27. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με 6 ιστιδίνες 79 B.28. Μέθοδος παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων 80 Β.29. Απομόνωση πυρηνικού και συνολικού RNA 82 Β.30. Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων 83 Β.31. Ηλεκτροφόρηση RNA σε πηκτή αγαρόζης κάτω από 83 αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση φορμαλδεΰδης Β.32. Μεταφορά RNA από πηκτή αγαρόζης σε μεμβράνη 83 (Northern) κα χρώση της μεμβράνης Β.33. Πειράματα επώασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με RNA 84 Β.34. Πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας νουκλεϊκών οξέων (Electrophoretic shift mobility assays) 85 Β.35. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου 86 v

σωληνίσκου ποντικού Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 88 ΜΕΡΟΣ Α 88 UΓ.1. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινοτελικού τμήματος του 88 LBR με συστατικά της χρωματίνης των σωματικών κυττάρωνu Γ.1.1. Έκφραση του αμινο-τελικού τμήματος του υποδοχέα της Β λαμίνης ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt) καθώς και του μεταλλάγματος από το οποίο έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία (GST-ΔRS) Γ.1.2. Αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού τμήματος του LBR και του αμινοτελικού τμήματος από το οποίο απουσιάζει η RS ακολουθία με πολυνουκλεοσώματα Γ.1.3. Έκφραση της κινάσης SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST και φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του αμινοτελικού τμήματος του LBR Γ.1.4. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης του φωσφορυλιωμένου αμινοτελικού τμήματος του LBR με πολυνουκλεοσώματα Γ.1.5. Μελέτη της αλληλεπίδρασης ιστονών με το αμινο-τελικό τμήμα του υποδοχέα της λαμίνης Β Γ.1.6. Μελέτη του ρόλου της RS ακολουθίας στην αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού τμήματος του LBR με τις ιστόνες Η3 και Η4 UΓ.2. Προσδιορισμός του τμήματος του αμινο-τελικού άκρου του 88 90 91 93 95 98 100 LBR στο οποίο δεσμεύονται οι ιστόνες Η3 και Η4U Γ.2.1. Κατασκευή κατάλληλων ανασυνδυασμένων πλαμιδίων που 100 έχουν τη δυνατότητα να εκφράζουν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST τμήματα του αμινο-τελικού άκρου του LBR Γ.2.2. Έκφραση των μεταλλαγμένων μορφών του αμινο-τελικού 101 τμήματος του LBR και έλεγχος της φωσφορυλίωσης τους από την κινάση SRPK1 Γ.2.3. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης των ιστονών Η3 και Η4 με τις 103 μεταλλαγμένες μορφές του αμινο-τελικού άκρου του LBR Γ.2.4. Κατασκευή ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που έχει τη 104 vi

δυνατότητα να εκφράζει ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST το τμήμα που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 του αμινο-τελικού άκρου του LBR Γ.2.5. Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) και έλεγχος της φωσφορυλίωσής της από την κινάση SRPK1 Γ.2.6. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GST-(62-92) με τις ιστόνες Η3 και Η4 Γ.2.7. Αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR το οποίο προηγουμένως είχε επωαστεί με 1 Μ NaCl UΓ.3. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινο-τελικού τμήματος του LBR με νουκλεϊκά οξέαu Γ.3.1. Ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR που έχει εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα Γ.3.2. Αλληλεπίδραση διαφόρων τύπων ευκαρυωτικού RNA με το αμινο-τελικό άκρο του LBR Γ.3.3. Έλεγχος της ισχύος της αλληλεπίδρασης του ευκαρυωτικού RNA με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR Γ.3.4. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας του αμινοτελικού τμήματος του LBR στην αλληλεπίδραση του με πυρηνικό RNA Γ.3.5. Επίδραση της φωσφορυλίωσης των RS διπεπτιδίων του αμινο-τελικού τμήματος του LBR στην αλληλεπίδραση του με DNA Γ.3.6. Επίδραση της προσθήκης πυρηνικού RNA στην αλληλεπίδραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) με τις ιστόνες Η3 και Η4 Γ.3.7. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt δεν αλληλεπιδρά με τις ιστόνες Η3 και Η4, όταν έχει προηγουμένως επωαστεί με RNase A Γ.3.8. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης GST-(62-92) από μεσοφασικό και μιτωτικό εκχύλισμα στην αλληλεπίδραση της με ιστόνες 106 108 109 110 110 112 113 116 117 118 120 121 vii

ΜΕΡΟΣ Β 123 UΓ.4. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινο-τελικού τμήματος του LBR με συστατικά της χρωματίνης των σπερματοζωαρίωνu 123 Γ.4.1. Φωσφορυλίωση της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 από την 123 κινάση SRPK1 Γ.4.2. Αλληλεπίδραση της RS ακολουθίας του LBR με την 124 φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 Γ.4.3. Συγκατακρήμνιση της πρωταμίνης 1 από πυρηνικά 125 εκχυλίσματα όρχεων ποντικού με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt Γ.4.4. Υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και πρωταμίνης 126 1 σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρων σωληνίσκων ποντικού Γ.4.5. Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 6xHis-p32 127 Γ.4.6. Η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 και η πρωτεΐνη p32 128 συναγωνίζονται για την δέσμευσή τους στην RS ακολουθία του LBR Γ.4.7. Δημιουργία μεταλλάξεων στο μόριο της πρωταμίνης 1 130 Γ.4.8. Έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως 131 πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα Γ.4.9. Φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωταμίνης και των 132 μεταλλαγμάτων της από την GST-SRPK1 Γ.4.10. Έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως 133 πρωτεΐνες σύντηξης με την ακολουθία FLAG σε ευκαρυωτικά κύτταρα Γ.4.11. Έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως 134 πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP σε ευκαρυωτικά κύτταρα Γ.4.12. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωταμίνης 1 και των 135 μεταλλαγμάτων της ως πρωτεϊνες σύντηξης με την GFP με το αμινο-τελικό άκρο του LBR (GST-wtNt) Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 137 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 148 SUMMARY 150 viii

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 152 ix

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ ΑB280B,ΑB590B ΑDP ΑΤP BAF BCIP β-msh BSA Camk4 CD (Chromodomain) CDS (Chromoshadow) DAPI DNA DNase Dnmts dntp DTT EDTA FG GFP GST HABP1 HDAC Hepes His HIV HMTs :Απορρόφηση στα 280,590 nm, αντίστοιχα :Αδενοσινοδιφωσφορικό οξύ :Αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ :Barrier-to-Autointegration Factor :5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-φωσφορικό :β-μερκαπτοαιθανόλη :Αλβουμίνη ορού βοδιού ++ :Πρωτεϊνική κινάση που εξαρτάται από CaP P/καλμοδουλίνη :Χρωμοπεριοχή :Χρωμοσκιά :4, 6-διαμιδινο-2-φενυλινδόλιο :Δεοξυριβονουκλεϊνικό οξύ :Δεοξυριβονουκλεάση :DNA μεθυλτρανσφεράσες :Τριφωσφορικός εστέρας δεοξυριβονουκλεοζίτη :Διθειοθρεϊτόλη :Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ :Φαινυλαλανίνη-γλυκίνη :Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη :Τρανσφεράση της γλουταθειόνης :Πρωτεΐνη 1 που δεσμεύεται στο υαλουρονικό οξύ :Ιστονική αποακετυλάση :Ν-2-υδροξυαιθυλ-πιπεραζιν-Ν -2-αιθανοσουλφονικό οξύ :Ιστιδίνη :Ιός της ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας :Ιστονικές μεθυλτρανσφεράσες HP1 :Ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 ΙΝΜ IPTG LAP L2BP1 :Εσωτερική πυρηνική μεμβράνη :Ισοπροπυλ-1-θειο-β-D-γαλακτοπυρανοζίδιο :Πολυπεπτίδια σχετιζόμενα με την πυρηνική λάμινα :Πρωτεΐνη 1 που συνδέεται με την LAP2 x

LBR :Υποδοχέας της Β λαμίνης LSD1 :Λυσινών εξειδικευμένη απομεθυλάση 1 MAPΚ :Κινάση πρωτεϊνών που ενεργοποιείται από μιτογόνα mgcl :Μouse Germ-Cell-Less mrna :Αγγελιοφόρο RNA MOPS :2-(Ν-μορφολινο) προπανοσουλφονικό οξύ NBT :Κυανούν του νιτροτετραζολίου NLS :Σήμα πυρηνικού εντοπισμού NPCs :Σύμπλοκα πυρηνικών πόρων Νup :Νουκλεοπορίνη ONM :Εξωτερική πυρηνική μεμβράνη PAF :Παραφορμαλδεΰδη PCR :Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PEV :Αποτέλεσμα θέσης PKA :Κινάση πρωτεϊνών Α PKC :Κινάση πρωτεϊνών C PRE-SET :Ακολουθία πριν την SET περιοχή Prm1 :Πρωταμίνη 1 PRO-SET :Ακολουθία μετά την SET περιοχή RdRP :RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση RER :Αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο RISC :RNA-Induced Silencing Complex RITS :RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing RNA :Ριβονουκλεϊνικό οξύ RNAi :RNA παρεμβολή RNase :Ριβονουκλεάση RS :Αργινίνη-σερίνη SAF-B :Scaffold Attachment Factor-B SDS :Άλας με νάτριο του θειϊκού δωδεκυλίου SF2/ASF :Παράγοντας ματίσματος 2/Παράγοντας εναλλακτικού ματίσματος sirnas :Μικρά RNAs παρεμβολής snrnps :Μικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεινικά σύμπλοκα xi

SRPK SSB ssdna TEMED TGF-β TPs Tris trna Xist Ζinc-fingers :Κινάση πρωτεϊνών αργινίνης/σερίνης :Κοψιμάτα του ενός κλώνου DNA (single strand breaks) :Μονόκλωνο DNA :Ν,Ν,Ν,Ν-τετραμεθυλο-αιθυλενο-διαμίνη :Τransforming growth factor β :Μεταβατικές Πρωτεΐνες :Τρις-υδροξυμεθυλ-αμινομεθάνιο :Μεταφορικό RNA :Χ-inactivation-specific transcript :Δάκτυλα ψευδαργύρου xii

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1 Πυρηνικός φάκελος Η κύρια διαφορά μεταξύ των ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών κυττάρων είναι η ύπαρξη δύο διαφορετικών ενδοκυτταρικών διαμερισμάτων στο ευκαρυωτικό κύτταρο, του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος, τα οποία οριοθετούνται από μια διπλομεμβρανική δομή, τον πυρηνικό φάκελο. Ο πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει μεν τον πυρήνα από το κυτταρόπλασμα, αλλά ταυτόχρονα ελέγχει την επικοινωνίας τους, επιτρέποντας την συνεργασία των δύο αυτών διαμερισμάτων. Διαμορφώνει έναν εξειδικευμένο χώρο όπου φυλάσσεται και διπλασιάζεται το γενετικό υλικό και όπου μπορούν να πραγματοποιηθούν διαδικασίες, όπως η γονιδιακή ρύθμιση και η ωρίμανση του RNA. Επιπλέον, έχει μεγάλη σημασία για την εξέλιξη των ευκαρυωτικών οργανισμών επειδή σχετίζεται με τον διαχωρισμό της μεταγραφικής και μεταφραστικής δραστηριότητας (1). Ο πυρηνικός φάκελος των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών έχει κοινή οργάνωση και δομή. Δομικά συστατικά του αποτελούν οι δύο ομόκεντρες πυρηνικές μεμβράνες, η πυρηνική λάμινα και οι πυρηνικοί πόροι. Οι πυρηνικές μεμβράνες διακρίνονται σε εξωτερική και εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, ενώ ανάμεσα στις δύο μεμβράνες παρεμβάλλεται το περιπυρηνικό διάστημα, το οποίο αποτελεί συνέχεια των αγωγών του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου. Οι δύο μεμβράνες δεν παρουσιάζουν διαφορές στην λιπιδιακή σύσταση και στην κινητικότητα των φωσφολιπιδίων. Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη βλέπει προς το κυτταρόπλασμα, αποτελεί συνέχεια των μεμβρανών του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου και φέρει στην κυτταροπλασματική της επιφάνεια λειτουργικά ριβοσώματα. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη βλέπει προς το πυρηνόπλασμα και διακρίνεται από την ύπαρξη μιας ομάδας ξεχωριστών μεμβρανικών πρωτεϊνών. Επιπλέον, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη επενδύεται εσωτερικά από ένα πρωτεϊνικό δίκτυο, την λάμινα, ενώ βρίσκεται σε στενή επαφή με την μεταγραφικά ανενεργή ετεροχρωματίνη. Οι δύο πυρηνικές μεμβράνες συντήκονται στην περιοχή των πυρηνικών πόρων μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η εκλεκτική επικοινωνία του κυτταροπλάσματος και του πυρηνοπλάσματος (2). Ο πυρήνας δεν είναι μια σταθερή δομή σε όλη την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου του ευκαρυωτικού κυττάρου. Διατηρεί την ακεραιότητά του κατά την διάρκεια της μεσόφασης, ενώ στην αρχή των μιτωτικών διαιρέσεων διασπάται, προκειμένου να επιτευχθεί η σωστή κατανομή του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα. Στο τέλος της 1

μιτωτικής διαίρεσης, τα συστατικά του συναρμολογούνται και σχηματίζονται οι δύο πυρηνικοί φάκελοι των θυγατρικών κυττάρων (3). UΣχήμα Α.1.U Σχηματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Α.2. Πυρηνική λάμινα Η εσωτερική μεμβράνη του πυρηνικού φακέλου επενδύεται εσωτερικά από ένα περιφερειακό ινώδες δίκτυο, την λάμινα, το οποίο και υποστηρίζει ουσιαστικά τον πυρηνικό φάκελο. H λάμινα προκύπτει από τον πολυμερισμό των λαμινών, οι οποίες ταξινομούνται ως ενδιάμεσα ινίδια τύπου V (4). Οι λαμίνες, όπως και όλα τα ενδιάμεσα ινίδια, αποτελούνται από ένα κεντρικό ραβδόμορφο τμήμα με α-ελικοειδή διάταξη, ενώ το καρβοξυ-τελικό και το αμινο-τελικό τους άκρο είναι μη ελικοειδή. Το κεντρικό τμήμα το οποίο είναι υπεύθυνο για τον διμερισμό των λαμινών υποδιαιρείται σε τέσσερεις υποπεριοχές οι οποίες χωρίζονται με εύκαμπτους βραχίονες. Στο καρβοξυ-τελικό τμήμα υπάρχει σήμα πυρηνικού εντοπισμού και η ακολουθία CΑΑΧ (Κυστεΐνη-Αλειφατικό αμινοξύ-αλειφατικό αμινοξύ-τυχαίο αμινοξύ), η οποία αποτελεί θέση για τρεις διαδοχικές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις (ισοπρενυλίωση της κυστεΐνης, πρωτεόλυση των τριών τελευταίων αμινοξέων και καρβοξυμεθυλίωση της ισοπρενυλιωμένης κυστεΐνης) (5). 2

Οι λαμίνες στα θηλαστικά μπορούν να διακριθούν σε δύο κατηγορίες, τις τύπου Α και Β, οι οποίες έχουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης κατά την διαφοροποίηση και ανάπτυξη. Συγκεκριμένα, οι λαμίνες τύπου Β εκφράζονται σε όλα τα σωματικά κύτταρα, σε αντίθεση με τις τύπου Α οι οποίες εκφράζονται κυρίως σε διαφοροποιημένους ιστούς (6). Στα σωματικά κύτταρα των θηλαστικών απαντώνται δύο τύποι Β λαμινών, οι Β1 και Β2 οι οποίες κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια (7) και δύο τύποι Α λαμινών, οι Α και C που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα του ίδιου γονιδίου (8). Στα σπερματοκύτταρα των θηλαστικών εκφράζονται οι ειδικές λαμίνες C2 και Β3 οι οποίες προέρχονται από εναλλακτική ωρίμανση των γονιδίων των λαμινών C και Β2, αντίστοιχα (9, 10). UΣχήμα Α.2.U Σχηματική αναπαράσταση της δομής των λαμινών σε σχέση με αυτή των ενδιάμεσων ινιδίων. Οι λαμίνες, όπως και τα ενδιάμεσα ινίδια, αποτελούνται από μια κεντρική ραβδόμορφη α- ελικοειδή περιοχή η οποία περικλείεται από ένα αμινο-τελικό και ένα καρβοξυ-τελικό μη ελικοειδές άκρο. Η κεντρική περιοχή υποδιαιρείται σε υποπεριοχές (1Α, 1Β, 2Α, 2Β) οι οποίες χωρίζονται από βραχίονες (L1, L12, L2). Το καρβοξυ-τελικό άκρο των λαμινών, σε αντίθεση με αυτό των υπολοίπων ενδιαμέσων ινιδίων, περιέχει σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) και την CAAX ακολουθία που είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση των λαμινών στην πυρηνική μεμβράνη. Επίσης, η υποπεριοχή 1Β των λαμινών περιέχει 42 αμινοξέα τα οποία δεν υπάρχουν στην αντίστοιχη περιοχή των ενδιάμεσων ινιδίων. Οι λαμίνες συντίθενται στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος και στην συνέχεια μετακινούνται στον πυρήνα. Η είσοδός τους στον πυρήνα και η κατεύθυνση των 3

νεοσυντιθέμενων λαμινών στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη επιτυγχάνεται με την ύπαρξη δύο ακολουθιών στο μόριo τους, του πυρηνικού σήματος εισόδου και της CAAX ακολουθίας. Οι λαμίνες τύπου Β αλληλεπιδρούν απευθείας με τη στοιβάδα λιποειδών της μεμβράνης, διαμέσου της ισοπρενυλικής αλυσίδας που συνδέεται ομοιοπολικά στην κυστεΐνη της αλληλουχίας CAAX. Ενώ όμως η ακολουθία CΑΑX υπάρχει σε όλη την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου για τις λαμίνες τύπου B, στις λαμίνες τύπου A η συγκεκριμένη ακολουθία είτε υπάρχει μόνο στη πρόδρομη μορφή τους (λαμίνες A) και οδηγεί σε μια προσωρινή σύνδεση με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, είτε δεν υπάρχει καθόλου (λαμίνες C). Αυτό συμβαίνει διότι μετά τον πολυμερισμό τους με τις λαμίνες τύπου Β, μία μεμβρανική πρωτεάση αφαιρεί τα τελευταία 15 αμινοξέα που περιλαμβάνουν και την αλυσίδα του φαρνεσυλίου (11). H ύπαρξη της αλυσίδας του φαρνεσυλίου προσδίδει διαφορετικές βιοχημικές ιδιότητες στους δύο τύπους λαμινών και αυτό είναι ιδιαίτερα εμφανές κατά τη διάρκεια της μίτωσης όπου οι λαμίνες τύπου Β παραμένουν συνδεδεμένες με μεμβράνες, ενώ οι τύπου A (που δεν περιέχουν την ισοπρενοειδή αλυσίδα) βρίσκονται διαλυτές στο κυτταρόπλασμα. Καθοριστικής επίσης σημασίας παράγοντας, για τη σύνδεση των λαμινών σε μεμβρανικές δομές κατά τη μεσόφαση και μίτωση, αποτελεί η ύπαρξη ορισμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών που συμπεριφέρονται, λιγότερο ή περισσότερο, ως εξειδικευμένοι υποδοχείς (12). UΠίνακας 1.U Είδη λαμινών στα σωματικά και γεννητικά κύτταρα των θηλαστικών. Τύπος Λαμίνες Γονίδιο Κατανομή Χρωμόσωμα λαμινών Λαμίνες Λαμίνη Α LMNA Διαφοροποιημένοι 1q21.2-21.3 τύπου Α Λαμίνη C Λαμίνη Α (Δ) 10 Λαμίνη C2 ιστοί Καρκινικοί τύποι Σπερματοκύτταρα Λαμίνες Λαμίνη Β1 LMNB1 Σχεδόν σε όλα τα 5q23.2-31.1 τύπου Β Λαμίνη Β2 LMNB2 κύτταρα 19p13.3 Λαμίνη Β3 LMNB2 Σπερματοκύτταρα 19p13.3 Οι λαμίνες εκτός από την μηχανική υποστήριξη που προσφέρουν στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, παίζουν ρόλο και στην διαμόρφωση του σχήματος του πυρήνα. Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση ότι η έκφραση σε σωματικά κύτταρα της λαμίνης Β3 4

σπερματοκυττάρων ποντικού έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή της μορφολογίας του πυρήνα των σωματικών κυττάρων με αποτέλεσμα να εμφανίζει σχήμα αγκίστρου (9). Επίσης, έχει προταθεί ότι οι Β τύπου λαμίνες συμμετέχουν στην διάταξη και την κατανομή των πυρηνικών πόρων, καθορίζοντας τη θέση του κάθε πόρου και την μεταξύ τους απόσταση. Ειδικότερα, έχει παρατηρηθεί ότι μετάλλαξη της DmBoB λαμίνης της Drosophila melanogaster έχει ως αποτέλεσμα την συνάθροιση των πυρηνικών πόρων σε ομάδες (13), ενώ παρατηρήθηκε και απευθείας αλληλεπίδραση των λαμινών τύπου Β με το καρβοξυ-τελικό άκρο της νουκλεοπορίνης Nup153, η οποία αποτελεί συστατικό των πυρηνικών πόρων (14). Νεότερες μελέτες διευρύνουν τον ρόλο των λαμινών υποστηρίζοντας ότι δεν περιορίζονται μόνο στον πυρηνικό φάκελο, αλλά εντοπίζονται στο εσωτερικό του πυρηνοπλάσματος επηρεάζοντας διαδικασίες, όπως η αντιγραφή του DNA και η μεταγραφή του RNA (15). Α.3. Πυρηνικοί πόροι Ο μοναδικός τρόπος ανταλλαγής ουσιών μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος είναι διαμέσου των πυρηνικών πόρων, οι οποίοι είναι πρωτεϊνικές κυλινδρικές δομές που βρίσκονται βυθισμένες σε σημεία σύντηξης της εξωτερικής και της εσωτερικής μεμβράνης. Καταλαμβάνουν περίπου το 5-30% της επιφάνειας του πυρηνικού φακέλου ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο, ενώ σε ένα τυπικό ευκαρυωτικό HeLa κύτταρο υπάρχουν περίπου 2000-4000 πόροι (16). Μέσω των πυρηνικών πόρων εισάγονται στον πυρήνα πυρηνικές πρωτεΐνες, ριβοσωμικές πρωτεΐνες και ώριμα μικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεινικά σύμπλοκα (snrnps), ενώ εξάγονται στο κυτταρόπλασμα trnas, mrnas και πρόδρομες μορφές των ριβοσωμάτων. Μικρά μόρια περίπου 20-40 kda διαχέονται ελεύθερα μέσα από τους πυρηνικούς πόρους, ενώ για τα μεγαλύτερα μόρια απαιτούνται μηχανισμοί ενεργούς μεταφοράς από το ένα κυτταρικό διαμέρισμα στο άλλο (17). Με βάση νεότερες έρευνες, οι πυρηνικοί πόροι δεν αποτελούν μόνο πύλες μεταφοράς ουσιών αλλά αντίθετα, διαδραματίζουν ρόλο στην γενικότερη δομή του πυρήνα, όπως για παράδειγμα στην οργάνωση της χρωματίνης. Έχει αναφερθεί ότι σε κύτταρα ζύμης η νουκλεοπορίνη Nup153 εμπλέκεται στην εντόπιση των τελομερών στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου (18). Η μορφολογία των πυρηνικών πόρων έχει μελετηθεί με διάφορες τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και έχει βρεθεί ότι η γενικότερη αρχιτεκτονική τους είναι εξελικτικά συντηρημένη από τους μύκητες μέχρι τον άνθρωπο. Συγκεκριμένα, οι πυρηνικοί πόροι εμφανίζουν χαρακτηριστική οκταγωνική συμμετρία και αποτελούνται από τρεις δακτυλίους τον εσωτερικό, τον κυτταροπλασματικό και τον πυρηνοπλασματικό. Από τον 5

κυτταροπλασματικό και πυρηνοπλασματικό δακτύλιο προεκβάλλουν οκτώ ινίδια προς το κυτταρόπλασμα και το πυρηνόπλασμα, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα ινίδια του πυρηνοπλασματικού δακτυλίου ενώνονται με έναν τελικό δακτύλιο και σχηματίζουν ένα «καλάθι». Ανάμεσα στους παραπάνω δακτυλίους βρίσκεται ένας τρίτος δακτύλιος ο οποίος αποτελείται από οκτώ ακτινωτά διατεταγμένους κυλίνδρους. Στο κέντρο των τριών δακτυλίων σχηματίζεται ο κεντρικός δίαυλος μήκους περίπου 90 nm και πλάτους 50 nm, ενώ ανάμεσα στους κυλίνδρους του κεντρικού δακτυλίου υπάρχουν περιφερικά κανάλια που όμως έχουν μικρότερη διάμετρο από το κεντρικό. Στον δίαυλο υπάρχει ο μεταφορέας, αν και νεότερες έρευνες αμφισβητούν την ύπαρξή του, υποστηρίζοντας ότι είτε πρόκειται για την εικόνα του πυρηνικού «καλαθιού» είτε για μόρια που μεταφέρονται μέσα από τον κεντρικό δίαυλο του πόρου (19). UΣχήμα Α.3.U Δομή του συμπλέγματος των πυρηνικών πόρων. Οι πυρηνικοί πόροι αποτελούνται από δύο δακτυλίους, τον κυτταροπλασματικό και τον πυρηνοπλασματικό από τους οποίους προβάλουν οκτώ ινίδια στο κυτταρόπλασμα και το πυρηνόπλασμα, αντίστοιχα. Τα ινίδια του πυρηνοπλάσματος ενώνονται σε μια δομή που ονομάζεται πυρηνικό καλάθι. Ανάμεσα στους παραπάνω δακτυλίους υπάρχει ο εσωτερικός δακτύλιος, στο κέντρο του οποίου σχηματίζεται ένας δίαυλος που φιλοξενεί με βάση κάποιες έρευνες τον μεταφορέα (κίτρινο χρώμα). ΙΝΜ: εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, inner nuclear mebrane, ONM: εξωτερική πυρηνική μεμβράνη, outer nuclear membrane. 6

URUeceptor), Παρόλο που υπάρχουν πολλές μελέτες για την δομή των πυρηνικών πόρων, λιγότερα είναι γνωστά για την μοριακή τους σύσταση. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι οι πυρηνικοί πόροι των θηλαστικών αποτελούνται από περίπου 30 πρωτεΐνες, τις νουκλεοπορίνες, οι οποίες σχηματίζουν μεγαλομοριακά σύμπλοκα μοριακού μεγέθους περίπου 40 MDa. Η κάθε νουκλεοπορίνη αντιπροσωπεύεται από τουλάχιστον οκτώ αντίγραφα ή από αριθμό πολλαπλάσιο του οκτώ εξαιτίας της οκταγωνικής συμμετρίας των πυρηνικών πόρων (20). Οι πυρηνικοί πόροι των θηλαστικών περιέχουν τουλάχιστον δύο διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (POM 121, gp210) οι οποίες συνδέουν τους πυρηνικούς πόρους στην πυρηνική μεμβράνη. Οι υπόλοιπες νουκλεοπορίνες είναι διαλυτές και εντοπίζονται είτε στην κυτταροπλασματική πλευρά, είτε στην πυρηνοπλασματική, ενώ κάποιες απαντώνται και στις δύο πλευρές. Ένα μεγάλο ποσοστό των νουκλεοπορινών περιέχουν στο μόριό τους επαναλήψεις φαινυλαλανίνης-γλυκίνης (FG-επαναλήψεις) οι οποίες πιστεύεται ότι επάγουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των νουκλεοπορινών και των υποδοχέων-μεταφορέων (21). Α.4. Πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη περιέχει μια ομάδα διακριτών πρωτεϊνών στις οποίες περιλαμβάνεται ο LBR (ULUamin UBU οι LAP1 και LAP2 (ULUamin-UAUssociated UPUeptide) πρωτεΐνες, η εμερίνη, το MAN1 αντιγόνο, ενώ προστίθενται και νέα μέλη όπως οι νεσπρίνες, η νουρίμη, η p18 κ.α. Οι πρωτεΐνες αυτές, με την εξαίρεση της νουρίμης, χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ενός μεγάλου πυρηνοπλασματικού αμινο-τελικού τμήματος στο μόριό τους το οποίο εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις με την πυρηνική λάμινα και συστατικά της χρωματίνης. Ένα ακόμα ιδιαίτερο γνώρισμα πολλών πρωτεϊνών της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης είναι η ύπαρξη στο νουκλεοπλασματικό τους τμήμα της εξαιρετικά συντηρημένης LEM ακολουθίας και κατά συνέπεια η κατάταξή τους στην LEM οικογένεια. Τα πρώτα μέλη της οικογένειας LEM ήταν η εμερίνη, οι LAP2 πρωτεΐνες και το ΜΑΝ1 αντιγόνο, από τα αρχικά των οποίων έχει προκύψει η συγκεκριμένη ονομασία (ULUAP2, UEUmerin, UMUAN1) (22). Η LEM ακολουθία αποτελείται από περίπου 40 αμινοξέα και η σφαιρική δομή της απαρτίζεται από δύο παράλληλες α-έλικες (23). Είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών της LEM οικογένειας με τον BAF παράγοντα (UBUarrier-to- UAUutointegration UFUactor), ο οποίος συνδέεται μη εκλεκτικά με δίκλωνο DNA. Πιστεύεται ότι αυτός είναι ίσως ένας από τους τρόπους αγκίστρωσης της χρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο (24). 7

UΣχήμα Α.4.U Σχηματική απεικόνιση των πρωτεϊνών της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. ΙΝΜ: εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, inner nuclear membrane, ONM: εξωτερική πυρηνική μεμβράνη, outer nuclear membrane, NPCs: Σύμπλοκα πυρηνικών πόρων, nuclear pore complexes, RER: ενδοπλασματικό δίκτυο, rough endoplasmatic reticulum. Τα παραλληλόγραμμα με τα διάφορα χρώματα αντιστοιχούν στις διαμεμβρανικές περιοχές των πρωτεϊνών της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Με τους μικρούς κίτρινους κύκλους αναπαριστώνται τα ριβοσώματα που είναι συνδεδεμένα με την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη και το ενδοπλασματικό δίκτυο. Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης συντίθενται στους αγωγούς του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου και με πλευρική διάχυση μεταφέρονται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, αφού πρώτα περάσουν από τα πλευρικά κανάλια του συμπλέγματος των πυρηνικών πόρων. Απαραίτητη προϋπόθεση για την διέλευση μέσα από τα πλευρικά κανάλια είναι το μέγεθος του πυρηνοπλασματικού τμήματος των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών να είναι μικρότερο από 60 kda. Αξίζει εδώ να σημειωθεί ότι όλες οι μέχρι σήμερα γνωστές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης έχουν τμήματα που προεξέχουν στο πυρηνόπλασμα με μοριακή μάζα μικρότερη των 60 kda. Πιστεύεται ότι οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες μπορούν να διαχέονται ελεύθερα μεταξύ πυρηνικής μεμβράνης και ενδοπλασματικού δικτύου, αλλά οι πρωτεΐνες της 8

εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης ακινητοποιούνται στον πυρηνικό φάκελο, εξαιτίας των αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται μεταξύ του πυρηνοπλασματικού τους τμήματος και συστατικών του πυρήνα (μοντέλο ειδικής συγκράτησης). Πράγματι, οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες της εσωτερική πυρηνικής μεμβράνης αλληλεπιδρούν, άμεσα ή έμμεσα, με συστατικά της πυρηνικής λάμινας, της ετεροχρωματίνης ή με άλλους πυρηνικούς παράγοντες (25). Είναι ενδεικτικό ότι η κινητικότητα του LBR που βρίσκεται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη είναι σημαντικά μικρότερη σε σχέση με αυτήν του LBR του ενδοπλασματικού δικτύου (26). Οι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης συμμετέχουν στην σύνδεση της πυρηνικής λάμινας και της ετεροχρωματίνης με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, παίζοντας ρόλο στην γενικότερη αρχιτεκτονική δομή και οργάνωση του πυρήνα. Επίσης, διαδραματίζουν ρόλο στην επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου κατά το τελευταίο στάδιο της μίτωσης, ενώ νεότερες μελέτες τους αποδίδουν καθοριστικό ρόλο και στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (27). Η ικανότητα των πρωτεϊνών της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης να αλληλεπιδρούν με πυρηνικούς παράγοντες φαίνεται ότι ρυθμίζεται σε σημαντικό βαθμό από την φωσφορυλίωση τους. Άλλωστε, δεν είναι τυχαίο ότι πολλές από τις πρωτεΐνες αυτές βρίσκονται σε σύμπλοκο με κινάσες (28, 29). Α.4.1. Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR) Ο LBR αποτελεί την πρώτη πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης που χαρακτηρίστηκε και την καλύτερα μελετημένη έως τώρα. Η ύπαρξη του διαπιστώθηκε για πρώτη φορά το 1988 από τους Worman, Blobel και Γεωργάτο σε πειράματα κατά τα οποία ραδιενεργές λαμίνες επωάζονταν με πυρηνικούς φακέλους ερυθροκυττάρων γαλοπούλας. Στα πειράματα αυτά βρέθηκε ότι μόνο οι Β τύπου λαμίνες και όχι οι τύπου Α συνδέονταν σε μια πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, με μοριακή μάζα περίπου 58 kda, η οποία για το λόγο αυτό ονομάστηκε υποδοχέας της λαμίνης Β (30). Ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του LBR, από άνθρωπο και κοτόπουλο, έδειξε ότι είναι μια πρωτεΐνη περίπου 600 αμινοξέων (615 αμινοξέα στον άνθρωπο, 637 αμινοξέα στο κοτόπουλο) που αποτελείται από ένα υδρόφιλο πυρηνοπλασματικό αμινο-τελικό άκρο, οκτώ υδρόφοβα διαμεμβρανικά τμήματα και ένα σχετικά μικρό καρβοξυ-τελικό άκρο που επίσης προεξέχει στο πυρηνόπλασμα. Το αμινο-τελικό τμήμα του LBR είναι ιδιαίτερα βασικό, αποτελείται από περίπου 205 αμινοξέα και περιέχει ακολουθίες πιθανής φωσφορυλίωσης από διάφορες κινάσες, ακολουθίες πιθανής δέσμευσης DNA (Ser/Thr-Pro-X-X), καθώς και μία 9

P επαναλαμβανόμενη αλληλουχία από διπεπτίδια αργινίνης-σερίνης (RS ακολουθία- 75 PRSRSRSRSRSP 84 Pστο κοτόπουλο) (31, 32). Το ανθρώπινο γονίδιο του LBR εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1q42.1 και αποτελείται από 13 εξόνια. Τα πρώτα τέσσερα κωδικοποιούν το αμινο-τελικό άκρο, ενώ τα υπόλοιπα το υδρόφοβο διαμεμβρανικό τμήμα, καθώς και το μικρό καρβο-ξυτελικό άκρο. Μεταξύ των εξονίων 4 και 5 παρεμβάλλεται ένα μεγάλο εσόνιο και εξαιτίας αυτής της διάταξης πιθανολογείται ότι το γονίδιο του LBR εξελικτικά έχει προκύψει από την σύντηξη δύο γονιδίων, από τα οποία το πρώτο κωδικοποιούσε μια διαλυτή πυρηνική πρωτεΐνη, ενώ το δεύτερο μια μεμβρανική πρωτεΐνη πιθανότατα του ενδοπλασματικού δικτύου (33). Οι έρευνες που έχουν γίνει στο παρελθόν έχουν επικεντρωθεί κυρίως στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR και στις ιδιότητες του. Αυτό που είναι γνωστό για το υδρόφοβο διαμεμβρανικό του τμήμα είναι ότι παρουσιάζει ομολογία με την ακολουθία του ενζύμου C- 14 ρεδουκτάση της στερόλης, η οποία συμμετέχει στον μεταβολισμό της εργοστερόλης. Μάλιστα, όταν το υδρόφοβο τμήμα του LBR εκφραστεί σε μεταλλαγμένα κύτταρα Saccharomyces cerevisiae έχει δράση C-14 ρεδουκτάσης. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό αν το διαμεμβρανικό τμήμα του LBR έχει ενζυμική δραστικότητα στα κύτταρα των θηλαστικών (34). Επίσης, έχει βρεθεί ότι το πρώτο διαμεβρανικό τμήμα της υδρόφοβης ακολουθίας του LBR μαζί με το αμινο-τελικό άκρο είναι υπεύθυνα για την εντόπιση του LBR στον πυρηνικό φάκελο. Συγκεκριμένα, αν η κάθε μία από τις παραπάνω περιοχές συντηχθεί με μια πρωτεΐνη του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου, την οδηγεί στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη (35, 36). Σε έρευνες που αφορούσαν το αμινο-τελικό τμήμα του LBR βρέθηκε ότι φωσφορυλιώνεται in vivo και ότι η φωσφορυλίωση αυτή επάγει την ικανότητα δέσμευσης του με τη λαμίνη Β (37). Κατά τη διάρκεια της μίτωσης φωσφορυλιώνεται από την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, η οποία τροποποιεί κατά κύριο λόγο τη σερίνη που βρίσκεται στη θέση 71 (38). Επίσης, οι κινάσες SRPKs φωσφορυλιώνουν εξειδικευμένα τα RS διπεπτίδια του αμινο-τελικού τμήματος του LBR, τα οποία επάγουν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, όπως έχει βρεθεί και από την μελέτη των παραγόντων ωρίμανσης του mrna (39). Το αμινοτελικό τμήμα του LBR συνδέεται με συστατικά της χρωματίνης αφού μπορεί τουλάχιστον in vitro να δεσμεύσει DNA (40), καθώς και την ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (HP1) (41). Επιπλέον, πρόσφατα έχει βρεθεί ότι ο LBR έχει την ιδιότητα να ολιγομερίζεται μέσω του αμινο-τελικού του άκρου, με αποτέλεσμα να δημιουργεί διακριτές μικροπεριοχές στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη στις οποίες δεσμεύεται βασικά ετεροχρωματίνη (42). 10

A.4.1.1. Σύμπλοκο του LBR Ο LBR αποτελεί μέρος ενός πολυπαραγοντικού συμπλόκου. Το σύμπλοκο του LBR, το οποίο έχει απομονωθεί από ερυθροκύτταρα γαλοπούλας, αποτελείται από τις λαμίνες Α και Β, τη διαμεμβρανική πρωτεΐνη p18, τη πρωτεΐνη p32, καθώς και μια κινάση. Επειδή δεν έχει βρεθεί απευθείας αλληλεπίδραση του LBR με την λαμίνη A, εικάζεται ότι η αλληλεπίδραση των δύο αυτών πρωτεϊνών επιτυγχάνεται έμμεσα, με διαμεσολαβητικό μόριο την λαμίνη Β (43). Πρωτεΐνη p18 Η πρωτεΐνη p18 αποτελεί ένα νέο μέλος των πρωτεϊνών του πυρηνικού φακέλου, η οποία εντοπίζεται τόσο στην εξωτερική, όσο και στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Ανιχνεύεται σχεδόν αποκλειστικά στους πυρήνες των ερυθροκυττάρων των πτηνών και έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα με τον LBR και με την λαμίνη Β (44). Πρωτεΐνη p32 Η πρωτεΐνη p32 αναφέρεται επίσης στην βιβλιογραφία ως gc1q-r (UgC1qU URUeceptor) και HABP1 (Hyaluronan (UHAU)-UBUinding UPUrotein 1). Θεωρείται ως μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη η οποία εντοπίζεται σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα, όπως στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδρια, στον πυρήνα, στο ακροσωμικό κυστίδιο των σπερματίδων, ενώ υπάρχουν αναφορές για ανίχνευσή της και στην επιφάνεια των κυττάρων (45). Μετά από φθορισμομετρικό in situ υβριδισμό βρέθηκε ότι το ανθρώπινο γονίδιο της p32 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17q13.3 (46) και κωδικοποιεί την πρόδρομη μορφή της (pre-p32) η οποία μεταφέρεται στα μιτοχόνδρια, καθώς περιέχει στο αμινο-τελικό της άκρο μια ακολουθία αμινοξέων που επιτρέπει την είσοδο της στο μιτοχόνδριο. Με την πρωτεόλυση των 73 αμινοξέων του αμινο-τελικού άκρου της παραλαμβάνεται η ώριμη μορφή της πρωτεΐνης, η οποία πιστεύεται ότι συμμετέχει στην αναπνευστική αλυσίδα (47). Η κρυσταλλική δομή της ώριμης μορφής της p32 μελετήθηκε πρόσφατα και βρέθηκε ότι σχηματίζει ομοτριμερή σε σχήμα δακτυλίου και αποτελείται από 7 αντιπαράλληλα β- ελάσματα και τρεις α-έλικες, δυο στο καρβοξυ-τελικό και μια στο αμινο-τελικό της άκρο (48). Ο ρόλος της πρωτεΐνης p32 παραμένει αινιγματικός, όχι μόνο εξαιτίας της πολλαπλής εντόπισης της σε ενδοκυττάριους και εξωκυττάριους χώρους, αλλά και επειδή εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό αλληλεπιδράσεων με μια ποικιλία διαφορετικών μεταξύ τους 11

κυτταρικών, ιικών και βακτηριακών παραγόντων. Ειδικότερα, έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με τον παράγοντα μεταγραφής TFIIB (49), με τον παράγοντα ματίσματος του RNA SF2/ASF, παρεμποδίζοντας με τον τρόπο αυτό τη δέσμευση του RNA και κατά συνέπεια τη διαδικασία του ματίσματος (50), καθώς και με την RS ακολουθία του LBR (43, 51). Η p32 συνδέεται με διάφορες ισομορφές της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC), επηρεάζοντας την δράση τους (52). Αποτελεί υπόστρωμα για τις MAP κινάσες (Mitogen Activated Protein kinases) και η φωσφορυλίωση από τις συγκεκριμένες κινάσες οδηγεί σε αλλαγή της υποκυτταρικής κατανομής της, με αποτέλεσμα την είσοδο της στον πυρήνα (53). Επίσης, έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με διάφορες εξωκυττάριες πρωτεΐνες, όπως η πρωτεΐνη του συμπληρώματος gc1q (54). Η πρωτεΐνη p32 έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά ακόμα με τις ιϊκές πρωτεΐνες TAT (49) και REV (55) του HIV-1, την orf P πρωτεΐνη του απλού ερπητοϊού (56), την πρωτεΐνη V του αδενοϊού (57) και την EMNA-1 του ιού Epstein-Barr (58). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι λειτουργεί ως υποδοχέας για την είσοδο του βακτηρίου Listeria monocytogenes στα κύτταρα των θηλαστικών, αφού πρώτα συνδεθεί με την πρωτεΐνη InlB η οποία εντοπίζεται στην επιφάνεια του βακτηρίου (59). Κινάση του LBR Η δραστικότητα κινάσης η οποία συν-ανοσοκατακρημνίζεται με τον LBR ανήκει σε μια νέα οικογένεια κινασών, τις SRPK κινάσες (Serine/Arginine Protein Kinases). Η φωσφορυλίωση του LBR από την κινάση πιστεύεται ότι ρυθμίζει τις αλληλεπιδράσεις του με τις πρωτεΐνες που συγκροτούν το σύμπλοκό του. Πράγματι έχει βρεθεί ότι όταν ο LBR φωσφορυλιωθεί στην RS ακολουθία του, παρεμποδίζεται η δέσμευση της πρωτεΐνης p32 (39, 60). Οποιαδήποτε σερίνη των RS διπεπτιδίων του LBR μπορεί να αποτελέσει υπόστρωμα για την SRPK1, ενώ η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστική η κινάση είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον RS διπεπτιδίων (61). Αν και κανείς έως σήμερα δεν έχει πλήρως αποδείξει ότι η δραστικότητα κινάσης η οποία βρίσκεται δεσμευμένη με τον LBR αντιστοιχεί αποκλειστικά σε μέλος(η) των SRPKs, μια σειρά από ισχυρές ενδείξεις συνηγορούν ότι η SRPK1 είναι αυτή που συν-ανοσοκατακρημνίζεται και φωσφρυλιώνει τον LBR (62). 12

UΣχήμα Α.5.U Σχηματική αναπαράσταση του συμπλόκου του υποδοχέα της Β λαμίνης. ΙΝΜ: εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, inner nuclear membrane, ONM: εξωτερική πυρηνική μεμβράνη, outer nuclear membrane. Με τους μικρούς κίτρινους κύκλους αναπαριστώνται τα ριβοσώματα που είναι συνδεδεμένα με την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. A.4.1.2. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs) Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν μια νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών που τροποποιούν τα υποστρώματα τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες, οι οποίες αποτελούν μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες, όπως η ρύθμιση του ματίσματος του mrna, η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η ανάπτυξη βλαστικών κυττάρων, η μεταφορά πολυαμινών μέσα στα κύτταρα και η ομοιόσταση ιόντων (63). Μέχρι σήμερα τουλάχιστον εννέα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αγρινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισμούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες μορφές των SRPK1 (accession No:U09564), SRPK1a (accession No:AJ318054), SRPK2 (accession No:U88666A) και στο ποντίκι οι μορφές των SRPK1 (accession No:AJ224115) και SRPK2 (accession No:AB006036). Στη ζύμη οι Sky1 (accession No: S55098) (S. cerevisiae) και 13

P και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το ομόλογο της SRPK1 (accession No:AF01149), στο νηματοειδές C. elegans η SPK-1 (accession No:AF241656), και στα φυτά το αντίστοιχο ομόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana). Οι κινάσες SRPK1 και SRPK2 των θηλαστικών αποτελούν προϊόντα δύο διαφορετικών γονιδίων τα οποία στον άνθρωπο χαρτογραφήθηκαν στα χρωμοσώματα 6p21.2-p21 και 7q22-q31.13, αντίστοιχα (64). Ένα ιδιαίτερο γνώρισμά τους είναι ότι οι περιοχές του μορίου τους που είναι υπεύθυνες για τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από μία ασυνήθιστα μεγάλη αλληλουχία αμινοξέων, γεγονός πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης, όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισμένο σε κινάσες τυροσίνης (65). Η μεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αμινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, αλλά κυρίως στην υποκυτταρική τους κατανομή (βλ. παρακάτω). Οι διαφορές των περιοχών κινάσης (kinase domains) των SRPK1 και SRPK2 είναι πολύ μικρές και δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα και εξειδίκευση των δύο ενζύμων (πάνω από 90% ομολογία στις περιοχές κινάσης). Ωστόσο, στο αμινο-τελικό άκρο της SRPK2 υπάρχει μία μοναδική ακολουθία αμινοξέων πλούσια σε προλίνες, που περιέχει το μοτίβο P-P-L-P το οποίο έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με τις ακολουθίες SH3 ή WW άλλων πρωτεϊνών (65). Με εναλλακτική ωρίμανση του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1 προκύπτει η ισομορφή της SRPK1a, η οποία περιέχει μια επιπλέον ακολουθία 171 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο του μορίου, αμέσως μετά τα τέσσερα πρώτα αμινοξέα. Η εμβόλιμη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σημαντικό αριθμό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες με το μοτίβο L-X-X-L-L (P 148 152 PL-A-P-L-LP P 158 PL-G-R-L-LP 162 P) το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών με πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης με διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσμευσης της με την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγματος (nuclear matrix) SAF-B (USUcaffold UAUttachment UFUactor-UBU) (66). 14

UΣχήμα Α.6.U Σχηματική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος της SRPK1a (61). (Α) Αναπαράσταση της δομής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόvιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τμήμα των 513 bp το οποίο δεν περιλαμβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a με την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τμήμα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος που βρίσκονται στα όρια μεταξύ των εξονίων 1a και 1b και του τμήματος των 513 bp. Η υποκυτταρική κατανομή των μελών της οικογένειας αυτής παρουσιάζει μια αινιγματική συμπεριφορά. Αν και όλα τα, μέχρι τώρα, γνωστά υποστρώματα τους είναι πυρηνικές πρωτεΐνες, οι SRPKs μετά από μελέτες ανοσοφθορισμού σε καθηλωμένα κύτταρα παρουσιάζουν μία κυρίαρχη κυτταροπλασματική εντόπιση, δίνοντας ταυτόχρονα ένα πολύ 15

αδύνατο πυρηνικό σήμα (66, 67). Σε πειράματα που έγιναν σε ζωντανά κύτταρα χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP το αποτέλεσμα ήταν ανάλογο, αλλά αυτή τη φορά το πυρηνικό σήμα ήταν ξεκάθαρα ορατό (67). Μάλιστα, η πυρηνική εντόπισή τους ενισχύεται λίγο πριν την είσοδο του κυττάρου στο στάδιο της μίτωσης. Συγκεκριμένα, μελέτες που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την κινάση Dsk1 της ζύμης S. pompe αποκάλυψαν ότι σε κύτταρα συγχρονισμένα στη μεσόφαση η κυτταροπλασματική εντόπιση της κινάσης ήταν κυρίαρχη. Αντίθετα, σε κύτταρα λίγο πριν την είσοδο τους στη μίτωση, το σήμα ανοσοφθορισμού της κινάσης εμφανίζεται έντονα στον πυρήνα (68). Παράλληλα, στην περίπτωση της κινάσης πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Sky1p της ζύμης S. cerevisiae βρέθηκε ότι η μεγάλη ενδιάμεση ακολουθία που χωρίζει τις δραστικές περιοχές της κινάσης, παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της υποκυτταρικής εντόπισής της. Χρησιμοποιώντας τόσο τη φυσιολογική, όσο και τη μορφή της κινάσης που της είχε αφαιρεθεί η συγκεκριμένη αυτή ακολουθία βρέθηκε ότι στα κύτταρα που έφεραν τη φυσιολογική μορφή το κυτταροπλασματικό σήμα είναι έντονο, σε αντίθεση με τη μεταλλαγμένη της μορφή η οποία εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρήνα. Έτσι, φαίνεται ότι η παρουσία του ενδιάμεσου τμήματος παίζει το ρόλο μιας «κυτταροπλασματικής άγκυρας» για τις SRPKs (69). Μεταξύ των υποστρωμάτων των SRPKs συγκαταλέγονται ο υποδοχέας της λαμίνης B, παράγοντες ματίσματος, καθώς και η πρωταμίνη 1. Κατ αναλογία με τον LBR, οι SRPKs έχει βρεθεί ότι βρίσκονται σε σύμπλοκο με τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 και φωσφορυλιώνουν τα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης-σερίνης του καρβοξυ-τελικού του άκρου. Πιστεύεται ότι η φωσφορυλίωση προωθεί την μετακίνηση των παραγόντων ωρίμανσης από τις θέσεις αποθήκευσής τους (nuclear speckles) σε ενεργές περιοχές μεταγραφής στο νουκλεόπλασμα, καθώς και την δημιουργία του συμπλόκου ματίσματος (70). Είναι ενδεικτικό ότι υπερέκφραση της SRPK1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα έχει σαν αποτέλεσμα την εξαφάνιση των αποθηκευτικών χώρων των παραγόντων ωρίμανσης (71). Η φυσιολογική σημασία της φωσφορυλίωσης της πρωταμίνης 1 αποτελεί έναν από τους στόχους μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Α.4.2. ULUamin-UAUssociated UPUeptide 1 (LAP1) Οι LAP1 πρωτεΐνες είναι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, οι οποίες περιέχουν στο μόριο τους μία μόνο διαμεμβρανική περιοχή. Το αμινο-τελικό τους άκρο εντοπίζεται στο πυρηνόπλασμα, ενώ το καρβοξυ-τελικό τους άκρο εκτείνεται προς το 16

περιπυρηνικό διάστημα. Στα κύτταρα των θηλαστικών εκφράζονται τρεις διαφορετικές ισομορφές, οι LAP1A, LAP1B και LAP1C, οι οποίες προέρχονται από εναλλακτική ωρίμανση του ίδιου γονιδίου. Η LAP1C ισομορφή εκφράζεται σε όλους τους κυτταρικούς τύπους, ενώ οι LAP1A και LAP1B εκφράζονται σε διαφοροποιημένα κυρίως κύτταρα. Στον άνθρωπο το γονίδιο που κωδικοποιεί τις LAP1 πρωτεΐνες εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1p36 (72). Οι LAP1 πρωτεΐνες, όπως μαρτυρά και το όνομά τους, συνδέονται με τις λαμίνες παίζοντας ρόλο στην πρόσδεση της λάμινας στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί, σε in vitro συνθήκες, ότι οι LAP1A και LAP1B συνδέονται με τις λαμίνες A, C και B1 (73), ενώ πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι οι LAP1A και C βρίσκονται σε σύμπλοκο με την λαμίνη Β, καθώς και με μία κινάση η οποία είναι διαφορετική από την κινάση του LBR (29). Α.4.3. ULUamin -UAUssociated UPUeptide 2 (LAP2) Η οικογένεια των LAP2 πρωτεϊνών αποτελείται από αρκετές ισομορφές οι οποίες προκύπτουν από εναλλακτική ωρίμανση του ίδιου γονιδίου που στον άνθρωπο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 12q22. Συγκεκριμένα, έχουν αναφερθεί 3 ισομορφές της πρωτεΐνης (α,β,γ) στον άνθρωπο, ενώ πιστεύεται ότι είναι δυνατόν να υπάρχουν άλλες 4 στον ποντικό (β,δ,ε,ζ). Οι β,β,γ,δ,ε αποτελούνται από ένα αμινο-τελικό τμήμα που εκτείνεται προς το πυρηνόπλασμα, μία διαμεμβρανική περιοχή και ένα σχετικά μικρό καρβοξυ-τελικό άκρο που εντοπίζεται στο περιπυρηνικό διάστημα. Αντίθετα, οι LAP2α και ζ δεν περιέχουν διαμεμβρανική περιοχή και κατανέμονται στο πυρηνόπλασμα με εξαίρεση την περιοχή του πυρηνίσκου. Όλες οι LAP2 ισομορφές μοιράζονται μία κοινή αμινο-τελική περιοχή 187 περίπου αμινοξέων (74, βλ. και σχήμα Α.7). Οι LAP2α και β πρωτεΐνες, οι οποίες αποτελούν και τις καλύτερα μελετημένες ισομορφές, συνδέονται με συστατικά της πυρηνικής λάμινας και της χρωματίνης. Συγκεκριμένα, η LAP2β πρωτεΐνη έχει βρεθεί ότι συνδέεται, σε in vitro συνθήκες, αποκλειστικά με τις τύπου Β λαμίνες (73). Χρησιμοποιώντας στο σύστημα δύο υβριδίων της ζύμης ως δόλωμα (bait) διάφορες μεταλλαγμένες μορφές της LAP2β, από τις οποίες έλειπαν συγκεκριμένα κάθε φορά τμήματα από το μόριό της, βρέθηκε ότι η περιοχή της LAP2β η οποία είναι υπεύθυνη για την σύνδεση με τις λαμίνες περικλείεται από τα αμινοξέα 298 έως 370 (75). Αντίθετα, η LAP2α ισομορφή έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά μόνο με τις Α τύπου λαμίνες. Δοκιμασίες ανοσοφθορισμού και συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η LAP2α βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις Α τύπου λαμίνες, ενώ με in vitro πειράματα διαπιστώθηκε η 17

άμεση αλληλεπίδραση των δύο αυτών πρωτεινών, στην οποία συμμετέχουν τα 78 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυ-τελικού τμήματος της LAP2α (76). UΣχήμα Α.7.U Σχηματική αναπαράσταση των LAP2 ισομορφών. Με κίτρινο χρώμα απεικονίζεται η κοινή αμινο-τελική περιοχή όλων των ισομορφών, ενώ με κάθετες μαύρες γραμμές (περιοχή που περικλείεται από τα αμινοξέα 114-152) η LEM ακολουθία. Το καρβοξυ-τελικό άκρο των LAP2 ισομορφών παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες, με την εξαίρεση της LAP2α όπου το καρβοξυ-τελικό της άκρο είναι μοναδικό. Με τις διάφορες αποχρώσεις του πράσινου απεικονίζονται οι διαφορές τις καρβοξυ-τελικής περιοχής των LAP ισομορφών, ενώ με πράσινες οριζόντιες γραμμές φαίνεται η διαμεμβρανική περιοχή (74). ΙΝΜ: εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, ΟΝΜ: εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Όσον αφορά στην σύνδεση με την χρωματίνη, αρχικά είχε βρεθεί ότι η LAP2β πρωτεΐνη συνδέεται με χρωμοσώματα και ότι η σύνδεση αυτή ρυθμίζεται από μιτωτική φωσφορυλίωση (73). Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε ότι και οι δύο ισομορφές LAP2α και LAP2β συνδέονται στην επιφάνεια των χρωμοσωμάτων κατά την διάρκεια του επαναπολυμερισμού του πυρηνικού φακέλου σε μιτωτικά διαιρούμενα κύτταρα, αλλά σε διαφορετικές χρονικές στιγμές (77). Η σύνδεση με την χρωματίνη πιθανότατα επιτυγχάνεται έμμεσα με την αλληλεπίδραση της LEM ακολουθίας, η οποία υπάρχει στο αμινο-τελικό άκρο όλων των ισομορφών, με τον BAF παράγοντα. Πράγματι, έχει βρεθεί ότι η LAP2β ισομορφή αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη L2BP1 (ULUAPU2U UΒUinding UPUrotein 1) από αρουραίο, η οποία είναι ομόλογη του ανθρώπινου BAF παράγοντα (78). Επιπλέον, πρόσφατα βρέθηκε ότι και η LAP2α συνδέεται με τον BAF παράγοντα με αποτέλεσμα να συν-εντοπίζονται στην ίδια περιοχή των χρωμοσωμάτων (79). Ωστόσο, υποστηρίζεται ότι η δέσμευση στην 18

χρωματίνη είναι ένα πολύπλοκο φαινόμενο και απαιτεί την συμμετοχή και άλλων περιοχών των LAP2 πρωτεϊνών (74). Επίσης, μία σχετικά πρόσφατη εργασία ήρθε να προσθέσει ένα καινούργιο ρόλο στην LAP2β πρωτεΐνη ως ρυθμιστή της γονιδιακής μεταγραφής. Στην εργασία αυτή βρέθηκε ότι η LAP2β, μόνη της ή σε συνδυασμό με την πρωτεΐνη mgcl (UmUouse UGUerm-UCUell-ULUess) με την οποία συνδέεται άμεσα, καταστέλλει την μεταγραφική ενεργότητα του ετεροδιμερούς E2F5- DP3α. Συγκεκριμένα, σε κύτταρα που μετασχηματίστηκαν, είτε με την LAP2β μόνη της είτε με την LAP2β μαζί με την mgcl, παρατηρήθηκε ότι η μεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς που ελέγχεται από το ετεροδιμερές E2F5-DP3α μειώθηκε σε σημαντικό βαθμό και στις δύο περιπτώσεις. Ο παράγοντας mgcl έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη DP3α του συμπλόκου E2F5-DP3α, με αποτέλεσμα το τελευταίο να μετατοπίζεται στην περιφέρεια του πυρήνα και να καταστέλλεται η μεταγραφική ενεργότητά του (80). Α.4.4. Εμερίνη (Εmerin) Ένα ακόμα μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης είναι η εμερίνη, μια πρωτεΐνη πλούσια σε σερίνες που αποτελείται από 254 αμινοξέα στον άνθρωπο. Το γονίδιο της πρωτεΐνης αυτής βρίσκεται στο X χρωμόσωμα (Xq28) και όταν μεταλλαχθεί προκύπτει ένας τύπος μυϊκής δυστροφίας, η Emery Dreifuss δυστροφία. Η εμερίνη αποτελείται από ένα αμινο-τελικό άκρο που προβάλει στο πυρηνόπλασμα, μία διαμεμβρανική περιοχή, και ένα μικρό σχετικά καρβοξυ-τελικό τμήμα που προβάλει στο περιπυρηνικό διάστημα (81). Στο αμινο-τελικό της άκρο υπάρχει η LEM ακολουθία μέσω της οποίας η εμερίνη αλληλεπιδρά με τον BAF παράγοντα (82). Μάλιστα, η αλληλεπίδραση με τον BAF παράγοντα είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό της εμερίνης στην επιφάνεια των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια της επανασυγκρότησης του πυρηνικού φακέλου μετά την μίτωση και στην συνέχεια στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Μεταλλάξεις της LEM ακολουθίας της εμερίνης ή του BAF παράγοντα έχουν σαν αποτέλεσμα η εμερίνη να μην εντοπίζεται στον νεοσχηματιζόμενο πυρηνικό φάκελο, αλλά αντίθετα να παραμένει στο κυτταρόπλασμα στην φάση της μεσόφασης (83). Η ακινητοποίηση της εμερίνης στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη φαίνεται ότι εξαρτάται κατά ένα μέρος από την σύνδεση με τις λαμίνες τύπου Α, χωρίς όμως να αποκλείεται και η συμβολή άλλων πυρηνικών παραγόντων. Είναι χαρακτηριστικό ότι σε ποντίκια από τα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί τις λαμίνες τύπου Α, ένα μέρος της εμερίνης ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασμα. Όταν όμως σε κύτταρα των ποντικών αυτών, εισαχθεί το γονίδιο της λαμίνης, τότε η εμερίνη μετατοπίζεται στον πυρηνικό φάκελο 19

(84). Επιπλέον, έρευνες υποστηρίζουν την απευθείας αλληλεπίδραση της εμερίνης με την λαμίνη Α (85), η οποία πραγματοποιείται μέσω της κεντρικής περιοχής του μορίου της εμερίνης (86). Τα αποτελέσματα τριών μελετών συνηγορούν ότι, όπως ακριβώς η LAP2β, έτσι και η εμερίνη εμπλέκεται στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Στην πρώτη εργασία βρέθηκε ότι η εμερίνη συγκατακρημνίζεται μαζί με τον μεταγραφικό καταστολέα GCL σε HeLa κύτταρα και ότι αλληλεπιδρά άμεσα μαζί του. Μάλιστα, με πειράματα ανταγωνισμού διαπιστώθηκε ότι η θέση δέσμευσης του GCL συμπίπτει με αυτήν του BAF με αποτέλεσμα η εμερίνη να απαντάται με την μορφή τουλάχιστον δύο συμπλόκων: συνδεδεμένη ή με την λαμίνη Α και τον BAF ή με την λαμίνη Α και τον GCL παράγοντα (87). Στην δεύτερη εργασία διαπιστώθηκε ότι η εμερίνη αλληλεπιδρά in vivo και in vitro με τον παράγοντα ρύθμισης της ωρίμανσης του mrna, YT521-B, με αποτέλεσμα να επηρεάζεται το μάτισμα διαφόρων mrnas που ελέγχονται από τον συγκεκριμένο παράγοντα. Πιθανότατα, η σύνδεση με την εμερίνη να απενεργοποιεί τον YT521-B (88). Τέλος, έχει βρεθεί ότι ακόμα ένας μεταγραφικός καταστολέας, ο Btf, ο οποίος εκφράζεται εντονότερα σε μυϊκά κύτταρα, αλληλεπιδρά με την εμερίνη (89). Α.4.5. ΜΑΝ1 αντιγόνο Το MAN1 αντιγόνο είναι μια πρόσφατα χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης που κωδικοποιείται από γονίδιο που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 12q14. Αποτελείται από δύο διαμεμβρανικά τμήματα, ενώ το αμινο-τελικό και καρβοξυτελικό άκρο του προβάλουν στο πυρηνόπλασμα. Ανάλυση της αμινοξικής ακολουθίας αποκάλυψε ότι η πρωτεΐνη αυτή περιέχει μια LEM ακολουθία στο αμινο-τελικό της άκρο (90). Μία πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι το ΜΑΝ1 αντιγόνο συνδέεται με αρκετές πρωτεΐνες με τις οποίες συνδέεται και η εμερίνη. Έτσι, σε in vitro συνθήκες, διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση με τις λαμίνες Α και Β, με τον BAF παράγοντα, με τους μεταγραφικούς καταστολείς Btf και GCL, ενώ επιπλέον βρέθηκε και απευθείας αλληλεπίδραση με την ίδια την εμερίνη. Μάλιστα, αναφέρεται ότι η εμερίνη και το MAN1 αντιγόνο σχηματίζουν, in vivo, σύμπλοκο το οποίο συμπεριλαμβάνει την λαμίνη Α και τον BAF παράγοντα, μοριακού μεγέθους περίπου 500 kda (91). Είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτο ότι το καρβοξυ-τελικό τμήμα της MAN1 πρωτεΐνης συνδέεται με τις πρωτεΐνες Smad2 και Smad3 οι οποίες ελέγχουν την μεταγραφή περίπου 500 γονιδίων, λειτουργώντας ως μεταγωγοί σήματος του μονοπατιού που ξεκινά από την οικογένεια πρωτεϊνών TGF-β (Τransforming Growth Factor β). Μάλιστα, η έκφραση σε 20

κύτταρα HepG2 του καρβοξυ-τελικού τμήματος του ΜΑΝ1 αντιγόνου, παράλληλα με την έκφραση ενός γονιδίου αναφοράς, του οποίου η μεταγραφή ελέγχεται από το TGF-β σηματοδοτικό μονοπάτι, έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση σε σημαντικό βαθμό της μεταγραφής του γονιδίου αναφοράς (92). Α.4.6. Νουρίμη (Nurim) Η νουρίμη είναι μια ιδιαίτερη πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, αφού σε αντίθεση με όλες τις υπόλοιπες γνωστές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, στερείται ενός υδρόφιλου αμινο-τελικού τμήματος. Αρχικά, είχε προταθεί ότι αποτελείται από 5 διαμεμβρανικά τμήματα, με το αμινο-τελικό άκρο της να προεξέχει στο πυρηνόπλασμα και το καρβοξυ-τελικό στο περιπυρηνικό διάστημα (93). Ωστόσο, όμως ενδέχεται να αποτελείται από 6 διαμεμβρανικά τμήματα, με αποτέλεσμα και τα δύο άκρα της να προβάλουν στο πυρηνόπλασμα (94). Α.4.7. Νεσπρίνες (UNesprUins-UNUuclear UEUnvelope USpUectrin URUepeat) Οι νεσπρίνες είναι μια νέα κατηγορία πρωτεϊνών που δεν εντοπίζονται αποκλειστικά στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Χωρίζονται σε δύο τύπους, τις νεσπρίνες-1 και νεσπρίνες-2, οι οποίες κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια που χαρτογραφηθήκαν στον άνθρωπο στα χρωμοσώματα 6q25 και 14q23, αντίστοιχα. Με εναλλακτική ωρίμανση των παραπάνω γονιδίων προκύπτουν διάφορες ισομορφές των νεσπρινών 1 και 2. Ανάλυση της αμινοξικής ακολουθίας τους έδειξε ότι αποτελούνται από μια διαμεμβρανική περιοχή προς το καρβοξυ-τελικό άκρο του μορίου τους το οποίο προεξέχει στο περιπυρηνικό διάστημα. Αντίθετα, το αμινο-τελικό άκρο εντοπίζεται στο νουκλεόπλασμα, έχει μεγάλο σχετικά μέγεθος και περιέχει επαναλαμβανόμενες ακολουθίες σπεκτρίνης. Οι ακολουθίες σπεκτρίνης εμπλέκονται σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, καθώς και στον διμερισμό των πρωτεϊνών που τις περιέχουν (95). Με εναλλακτική ωρίμανση του γονιδίου της νεσπρίνης 1 προκύπτει η ισομορφή της, νεσπρίνη-1α, η οποία περιέχει στο αμινο-τελικό της άκρο 7 ακολουθίες σπεκτρίνης και μέσω αυτών σχηματίζει διμερή. Επίσης, βρέθηκε ότι, τουλάχιστον σε in vitro συνθήκες, αλληλεπιδρά με την λαμίνη Α και την εμερίνη, ενώ δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση με τον BAF παράγοντα, παρόλο που περιέχει ένα «διακοπτόμενο» LEM μοτίβο (96). Α.5. Πυρηνικός φάκελος κατά τη διάρκεια της μίτωσης 21

Ο πυρηνικός φάκελος είναι μια δυναμική δομή που στην πρόφαση διασπάται, ενώ η επανασυγκρότησή του γύρω από την χρωματίνη των θυγατρικών κυττάρων ξεκινά στη μέση περίπου του σταδίου της ανάφασης και ολοκληρώνεται στο στάδιο G1 της μεσόφασης. Μέχρι τώρα έχουν διατυπωθεί δύο υποθέσεις που περιγράφουν τον τρόπο διάσπασης και επανασυγκρότησης του πυρηνικού φακέλου. Με βάση την πρώτη, ο πυρηνικός φάκελος διασπάται σε διαφορετικούς ως προς το πρωτεϊνικό τους περιεχόμενο πληθυσμούς πυρηνικών κυστιδίων (97). Με βάση την δεύτερη υπόθεση, η οποία είναι και η πιο πρόσφατη, αποκλείεται η περίπτωση της δημιουργίας κυστιδίων και υποστηρίζεται ότι τα πρωτεϊνικά συστατικά του πυρηνικού φακέλου μεταφέρονται με διάχυση στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο το οποίο παραμένει άθικτο κατά την διάρκεια της μίτωσης. Στο ενδοπλασματικό δίκτυο, οι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης είναι δυνατόν να οργανώνονται σε ομάδες ή να έχουν τυχαία κατανομή (97). Α.5.1. Διάσπαση του πυρηνικού φακέλου κατά τη διάρκεια της μίτωσης Με την έναρξη της μίτωσης παρατηρείται αποπολυμερισμός της πυρηνικής λάμινας και των πυρηνικών πόρων, απόσπαση της χρωματίνης από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και τελικά διάσπαση του πυρηνικού φακέλου. Ο αποπολυμερισμός της πυρηνικής λάμινας και των πόρων προκαλείται με φωσφορυλίωση των δομικών μονάδων τους από την μιτωτική κινάση cdc2, χωρίς να αποκλείεται η δράση και άλλων κινασών. Πράγματι, έχει βρεθεί ότι οι λαμίνες υπερφωσφορυλιώνονται από την κινάση cdc2, με αποτέλεσμα τον αποπολυμερισμό και την εντόπισή τους στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Οι λαμίνες τύπου Α εντοπίζονται σε διαλυτή μορφή, ενώ αντίθετα οι λαμίνες Β παραμένουν συνδεδεμένες με μεμβρανικές δομές (98). Επίσης, πολλές νουκλεοπορίνες, όπως η διαμεμβρανική gp210, έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνονται κατά τη διάρκεια της μίτωσης και αποτελούν υποστρώματα, σε in vitro τουλάχιστον συνθήκες, της cdc2 (99). Οι διαλυτές νουκλεοπορίνες είτε διασκορπίζονται ως μονομερή στο κυτταρόπλασμα, είτε με την μορφή συμπλόκων με άλλες νουκλεοπορίνες (100). Όσον αφορά στις πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης έχει βρεθεί ότι ο LBR, η LAP2β και η LAP1C μένουν συνδεδεμένες με μεμβρανικές δομές, ενώ αντίθετα η LAP2α εντοπίζεται σε διαλυτή μορφή στο κυτταρόπλασμα (73, 77). Α.5.2. Επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου 22

Καθώς η μίτωση ολοκληρώνεται, αρχίζει η επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου. Αρχικά, τα μεμβρανικά κυστίδια ή οι μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου συνδέονται στην επιφάνεια των μιτωτικών χρωμοσωμάτων και ακολουθεί η σύντηξη των μεμβρανικών δομών, έτσι ώστε να σχηματιστεί η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Κεντρικό ρόλο στην σύνδεση των μεμβρανικών στοιχείων στην χρωματίνη παίζουν οι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, ενώ αντίθετα αμφιλεγόμενος παραμένει ο ρόλος των λαμινών (101). Είναι ενδεικτικό ότι πυρηνικά κυστίδια από τα οποία έχει ανοσοαφαιρεθεί ο LBR, χάνουν την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με την χρωματίνη (102). Πιστεύεται ότι οι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης στρατολογούνται διαδοχικά και σε διαφορετικά σημεία της επιφάνειας των χρωμοσωμάτων, ενώ με την πάροδο του χρόνου αποκτούν ομοιόμορφη κατανομή (103). Για παράδειγμα, ο LBR έχει μια πιο περιφερειακή εντόπιση σε σχέση με την εμερίνη (103), ενώ η LAP2α ισομορφή στρατολογείται στην επιφάνεια των χρωμοσωμάτων νωρίτερα από ότι η συνδεδεμένη με τις μιτωτικές μεμβράνες LAP2β (77). Όσον αφορά στην επανασυγκρότηση των πυρηνικών πόρων, έχει βρεθεί ότι αυτή ξεκινά μετά την σύνδεση των μεμβρανικών στοιχείων στην χρωματίνη και ότι πραγματοποιείται με την διαδοχική αλληλεπίδραση των νουκλεοπορινών με την επιφάνεια των χρωμοσωμάτων (104). Αν και έχει προταθεί ότι οι πυρηνικοί πόροι δημιουργούνται σε κλειστό πυρηνικό φάκελο, αφού έχει ολοκληρωθεί η σύντηξη των πυρηνικών μεμβρανών (105), κάποιοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι πρώτα αρχίζει η συναρμολόγηση των πρόδρομων μορφών των πυρηνικών πόρων στην επιφάνεια της χρωματίνης και στη συνέχεια οι πόροι περικλείονται από τις πυρηνικές μεμβράνες (105). Ωστόσο, η μία υπόθεση δεν αναιρεί την άλλη, αφού είναι δυνατόν να συμβαίνουν και τα δύο γεγονότα στην διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Σίγουρα, η πρώτη υπόθεση ισχύει όταν ο πυρηνικός φάκελος εμπλουτίζεται με πυρηνικούς πόρους κατά τη διάρκεια της μεσόφασης (105). H επανασυγκρότηση της λάμινας ξεκινά περίπου στην αρχή της τελόφασης με την σύνδεση των λαμινών τύπου Β στην επιφάνεια των χρωμοσωμάτων, οπότε και αρχίζει ο πολυμερισμός τους και η δημιουργία του πλέγματος της λάμινας. Οι λαμίνες τύπου Α εισάγονται στον πυρήνα από τους πόρους, αφού έχει δημιουργηθεί λειτουργικός πυρηνικός φάκελος και εντοπίζονται αρχικά στο νουκλεόπλασμα ως μονομερή. Αρχίζουν δε να ενσωματώνονται στην περιφερική λάμινα μόνο στην αρχή της G1 φάσης (106). Α.6. Ετεροχρωματίνη 23

Ο όρος ετεροχρωματίνη χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1928 από τον βοτανολόγο Heitz προκειμένου να περιγράψει τις χρωμοσωμικές εκείνες περιοχές που διατηρούνται συμπυκνωμένες κατά τη μετάβαση του κυττάρου από την μίτωση στην μεσόφαση, σε αντίθεση με το υπόλοιπο χρωμοσωμικό υλικό το οποίο αποσυμπυκνώνεται και χαρακτηρίζεται ως ευχρωματινικό (107). Η ετεροχρωματίνη διακρίνεται σε δύο κατηγορίες, την συστατική και περιστασιακή ετεροχρωματίνη. Η περιστασιακή ετεροχρωματίνη αναφέρεται σε γονίδια ή χρωμοσωμικές περιοχές που σε κάποια φάση της ζωής του κυττάρου είναι μεταγραφικά ενεργά και στην συνέχεια απενεργοποιούνται. Αντίθετα, ο όρος συστατική ετεροχρωματίνη αφορά τις χρωμοσωμικές περιοχές που σε όλους τους κυτταρικούς τύπους ενός οργανισμού είναι μεταγραφικά ανενεργές (108). Παράδειγμα περιστασιακής ετεροχρωματίνης αποτελεί στα θηλαστικά το ανενεργό Χ χρωμόσωμα των θηλυκών ατόμων, το οποίο απενεργοποιείται στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης, ώστε να υπάρχει η ίδια δόση γενετικού υλικού ανάμεσα στα δύο φύλα. Από την άλλη πλευρά, η συστατική ετεροχρωματίνη απαντάται κυρίως στα κεντρομερή και τα τελομερή και αποτελείται από επαναλαμβανόμενες ακολουθίες DNA τοποθετημένες στη σειρά (108). Πολλές φορές μεταξύ των επαναλήψεων βρίσκονται διάσπαρτα τοποθετημένα μεταθετά στοιχεία. Η περικεντρομερική ετεροχρωματίνη ποικίλλει σε μέγεθος ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς και κυμαίνεται από λίγα kb στην ζύμη μέχρι 100-400 αλληλοδιάδοχες επαναλήψεις νουκλεοτιδίων στα θηλαστικά, φυτά και την Drosophila, οι οποίες φτάνουν σε μέγεθος τα αρκετά Mb (109, 110). Η συστατική ετεροχρωματίνη καταλαμβάνει ένα μεγάλο ποσοστό της χρωματίνης και τα κύρια χαρακτηριστικά της είναι τα μειωμένα επίπεδα μειωτικού ανασυνδυασμού, η μικρή πυκνότητα σε γονίδια, ο εμπλουτισμός σε επαναλαμβανόμενο DNA και η αργή αντιγραφή στην S φάση. Επίσης, η συστατική ετεροχρωματίνη είναι μεταγραφικά ανενεργή σε όλη τη διάρκεια της ζωής του κυττάρου και καταστέλλει την μεταγραφή ευχρωματινικού γονιδίου που τοποθετείται κοντά της, ένα φαινόμενο που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στην Drosophila και ονομάστηκε αποτέλεσμα θέσης (Position Effect Variegation-PEV). Χαρακτηριστικό είναι ότι οι επαναλήψεις του DNA της συστατικής ετεροχρωματίνης δεν είναι εξελικτικά συντηρημένες και παρουσιάζουν μικρές ομοιότητες ανάμεσα στα διάφορα είδη (111). Α.6.1. Σύσταση ετεροχρωματίνης Η βασική δομική μονάδα της ετεροχρωματίνης, όπως και γενικότερα της χρωματίνης, είναι τα νουκλεοσώματα τα οποία σε φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μοιάζουν με 24

χάντρες σε κομπολόι. Τα νουκλεοσώματα αποτελούνται από ένα ιστονικό πυρήνα γύρω από τον οποίο περιελίσσεται περίπου 2 φορές DNA, μήκους 145-147 bp. Ο ιστονικός πυρήνας δομείται από τις ιστόνες Η3, Η4, Η2Α και Η2Β, όπου η κάθε μία αντιπροσωπεύεται από δύο αντίγραφα. Το κάθε νουκλεόσωμα διαχωρίζεται από το επόμενο με το συνδετικό DNA στο οποίο βρίσκεται προσκολλημένη η ιστόνη Η1. Το μήκος του συνδετικού DNA διαφέρει μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών τύπων και κυμαίνεται από 10 έως 90 bp (112). UΣχήμα Α.8.U Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις ιστονών. Το αμινο-τελικό τμήμα των ιστονών υφίσταται διάφορες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, ουβικιτινιλίωση. Ενώ οι σερίνες και οι θρεονίνες μπορούν να δεχτούν μόνο φωσφορικές ομάδες (κίτρινο χρώμα), οι λυσίνες και οι αργινίνες έχουν πολλαπλές επιλογές μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων. Για παράδειγμα, οι λυσίνες μπορούν να ακετυλιωθούν (κόκκινο χρώμα), να μονοουβικιτινιλιωθούν (μπλε χρώμα), να μονο-, δι- και τριμεθυλιωθούν (πράσινο χρώμα). Επίσης, οι αργινίνες μπορούν να μονο- ή διμεθυλιωθούν (πράσινο χρώμα). Οι ιστόνες αποτελούνται από ένα σφαιρικό καρβοξυ-τελικό τμήμα το οποίο συμμετέχει στον σχηματισμό του πυρήνα του νουκλεοσώματος και από ένα εύκαμπτο αμινο-τελικό άκρο το οποίο αποτελεί περίπου το 25-30% του μορίου της ιστόνης και προβάλει έξω από το νουκλεόσωμα. Το αμινο-τελικό άκρο υφίσταται διάφορες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, ουβικιτινιλίωση και ADP- 25

ριβοσυλίωση (113). Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι ο συνδυασμός των μεταμεταφραστικών αυτών τροποποιήσεων των ιστονικών ουρών διαμορφώνει έναν κώδικα (histone code) ο οποίος ρυθμίζει την μεταγραφική κατάσταση της χρωματίνης. Η δημιουργία του κώδικα στηρίζεται σε εξειδικευμένα ένζυμα που τροποποιούν τις ιστόνες, ενώ στη συνέχεια πυρηνικοί μη ιστονικοί παράγοντες αναγνωρίζουν τις συγκεκριμένες τροποποιήσεις, συνδέονται στις τροποποιημένες ιστόνες και προκαλούν κατάλληλη κάθε φορά αναδιάταξη της χρωματίνης (114). Έχει βρεθεί ότι η συστατική ετεροχρωματίνη και ιδιαίτερα η ετεροχρωματίνη γύρω από την περιοχή των κεντρομερών, αποτελείται από νουκλεοσώματα τα οποία διακρίνονται από μεγάλο ποσοστό μεθυλίωσης του DNA, μεγάλο ποσοστό μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 στην λυσίνη 9 (Κ9), μικρό ποσοστό ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4 και μικρό ποσοστό μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 στην λυσίνη 4 (Κ4) (115). Σε γενετικές μελέτες στην Drosophila προκειμένου να βρεθούν γονίδια τα οποία καταστέλλουν το φαινόμενο μεταγραφικής καταστολής λόγω γειτνίασης με την συστατική ετεροχρωματίνη (Position Effect Variegation-PEV), βρέθηκε ότι για το σχηματισμό ετεροχρωματινικών περιοχών είναι απαραίτητα τα γονίδια τα οποία κωδικοποιούν την ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) και την μεθυλτρανσφεράση Su(var)3-9, η οποία μεθυλιώνει την λυσίνη 9 στην ιστόνη Η3 (116). Επίσης, πρόσφατα διαπιστώθηκε ο απροσδόκητος ρόλος μικρών μορίων RNA που προκύπτουν μέσω του μηχανισμού της RNA παρεμβολής (RNA interference, RNAi) στην δημιουργία ετεροχρωματινικών περιοχών (117). Α.6.2. Μεθυλίωση των ιστονών Η μεθυλίωση των ιστονών λαμβάνει χώρα σε αμινοξέα λυσίνης και αργινίνης, κυρίως στις Η3 και Η4 και σε μικρότερο βαθμό στην Η1. Στην ιστόνη Η3 μεθυλιώνονται οι αργινίνες R2, R7, R16, ενώ στην ιστόνη Η4 η R3. Επίσης, η Η3 μπορεί να μεθυλιωθεί στις λυσίνες Κ4, Κ9, Κ27 και Κ36 οι οποίες βρίσκονται στο αμινο-τελικό άκρο του μορίου της και στην λυσίνη Κ79 η οποία βρίσκεται στον πυρήνα του νουκλεοσώματος. Η ιστόνη Η4 μεθυλιώνεται μόνο στην λυσίνη Κ20. Η ε-αμιδική ομάδα της λυσίνης μπορεί να δεχτεί από μια έως τρεις μεθυλομάδες, με αποτέλεσμα να προκύπτει μονο-, δι- ή τριμεθυλιωμένη λυσίνη, αντίστοιχα (118). Η μεθυλίωση των λυσινών θεωρείται μια από τις σταθερότερες τροποποιήσεις, αφού μέχρι πρόσφατα δεν ήταν γνωστά ένζυμα (απομεθυλάσες) τα οποία μπορούν να αφαιρέσουν την μεθυλομάδα. Πρόσφατα, όμως αναγνωρίστηκε το πρώτο ένζυμο το οποίο ονομάστηκε LSD1 (ULUysine USUpecific UDUemethylase 1) και το οποίο καταλύει 26

την εξειδικευμένη απομάκρυνση μεθυλομάδων, μόνο από την δι- και μονομεθυλιωμένη Κ4 της ιστόνης Η3 (119). UΣχήμα Α.9.U Διάφοροι βαθμοί μεθυλίωσης της ε-αμινομάδας της λυσίνης στις ιστόνες Η3 και Η4. Η μεθυλίωση διαφορετικών μορίων λυσινών στις ιστόνες Η3 και Η4 σχετίζεται με διαφορετικό είδος χρωματίνης. Οι μεθυλιωμένες Κ9 και Κ27 στην ιστόνη Η3 και η μεθυλιωμένη Κ20 στην ιστόνη Η4 αποτελούν χαρακτηριστικό γνώρισμα της ετεροχρωματίνης, ενώ η μεθυλίωση των Κ4, Κ36 και Κ79 στην ιστόνη Η3 απαντάται στην μεταγραφικά ενεργή χρωματίνη (120). Σε δύο έρευνες, όπου χαρτογραφήθηκε η μεθυλίωση των Κ4 και Κ9 της ιστόνης Η3 σε περιοχές γύρω από το γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης (bglobin locus) στο κοτόπουλο και στον γονιδιακό τόπο τύπου σύζευξης (mating-type loci) στην ζύμη Schizosaccharomyces pombe, βρέθηκε ότι οι περιοχές της χρωματίνης που ανιχνεύονται οι δύο αυτές τροποποιήσεις της ιστόνης Η3 είναι σαφώς διακριτές. Στις ετεροχρωματινικές περιοχές ανιχνεύεται έντονα η μεθυλίωση Κ9, ενώ η μεθυλίωση Κ4 ανιχνεύεται ελάχιστα. Αντίθετα, στις ευχρωματινικές περιοχές η κύρια τροποποίηση είναι η μεθυλίωση της Κ4, ενώ η μεθυλίωση της Κ9 ανιχνεύεται σε πολύ μικρά επίπεδα (121, 122). Η μεθυλίωση των ιστονικών λυσινών πραγματοποιείται από εξειδικευμένα ένζυμα, τις μεθυλτρανσφεράσες (ΗMTs). Η πρώτη μεθυλτρανσφεράση που αναγνωρίστηκε ήταν η ανθρώπινη Suv39Η1, η οποία βρέθηκε ότι μεθυλιώνει εκλεκτικά την λυσίνη Κ9 στην ιστόνη Η3, χρησιμοποιώντας ως δότη της μεθυλομάδας την S-αδενοσυλ-μεθειονίνη. Ομόλογες με την SUV39H1 είναι η Su(var)3-9 στην Drosophila, η Suv39h1 στον ποντικό και η Clr4 στην ζύμη Schizosaccharomyces pombe. Οι συγκεκριμένες μεθυλτρανσφεράσες χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη μιας χρωμοπεριοχής (chromodomain) στο αμινο-τελικό τους άκρο με άγνωστη λειτουργικότητα και μιας SET ((USUu(var), UEU(z) and UΤUrithorax) περιοχής που αποτελείται από 130-140 αμινοξέα στο καρβοξυ-τελικό άκρο. Η SET περιοχή είναι κυρίως υπεύθυνη για την δραστικότητα μεθυλτρανσφεράσης, αλλά στις μεθυλτρανσφεράσες Suv39 27

απαιτείται και η ύπαρξη ακολουθιών πλούσιων σε κυστεΐνες γύρω από την SET περιοχή (PRE-SET, PRO-SET) (123). Α.6.2.1. Μεθυλίωση της λυσίνης Κ9 της ιστόνης Η3 Η σημασία της μεθυλίωσης της λυσίνης Κ9 της ιστόνης Η3 στον σχηματισμό της ετεροχρωματίνης έχει επισημανθεί με πειράματα τα οποία καταδεικνύουν ότι απώλεια της συγκεκριμένης μεταμεταφραστικής τροποποίησης οδηγεί σε μεταγραφική ενεργοποίηση, κατεσταλμένων ετεροχρωματινικών περιοχών στην ζύμη S. pombe (124). Η λυσίνη Κ9 έχει βρεθεί (με αναλυτική φασματοσκοπία μαζών) να είναι μονο-, δι-, ή τριμεθυλιωμένη in vivo (125). Επίσης, με πειράματα ανοσοανίχνευσης βρέθηκε ότι οι μόνο-, δι- και τριμεθυλιωμένες λυσίνες Κ9 παρουσιάζουν διαφορετική κατανομή στον μεσοφασικό πυρήνα κυττάρων ποντικού, καθώς και στα μεταφασικά χρωμοσώματα. Συγκεκριμένα, η τριμεθυλιωμένη Κ9 εντοπίζεται κυρίως στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη, ενώ οι μονο- και διμεθυλιωμένες Κ9 της ιστόνης Η3 εντοπίζονται σε όλο τον πυρήνα, με εξαίρεση την περιοχή του πυρηνίσκου και των κεντρομερών. Στα μεταφασικά χρωμοσώματα η τριμεθυλιωμένη Κ9 ανιχνεύεται στην ετεροχρωματίνη γύρω από τα κεντρομερή, ενώ οι άλλες δύο μορφές σε όλο το μήκος των χρωμοσωμικών βραχιόνων (126, 127). Έχει προταθεί ότι ίσως η τριμεθυλίωση οριοθετεί την συστατική ετεροχρωματίνη, ενώ η μονοκαι διμεθυλίωση την περιστασιακή ετεροχρωματίνη (128). Η τριμεθυλίωση της Κ9 καταλύεται από τις μεθυλτρανσφεράσες Suv39h1 και Suv39h2. Έχει δειχθεί ότι σε μεταλλαγμένα εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού, από τα οποία απουσιάζουν οι συγκεκριμένες αυτές μεθυλτρανσφεράσες, μειώνονται τα επίπεδα της τριμεθυλιωμένης K9 στην ετεροχρωματίνη γύρω από τα κεντρομερή, ενώ μένουν ανεπηρέαστα τα επίπεδα της μονο- και διμεθυλιωμένης Κ9 (126, 127). Ωστόσο, σε άλλη έρευνα έχει βρεθεί ότι η ανασυνδυασμένη Su(var)3-9, σε in vitro συνθήκες, δεν μπορεί να προκαλέσει τριμεθυλίωση της Κ9 της ιστόνης Η3 και προτάθηκε ότι ίσως για να είναι δραστικές, in vivo, οι Suv39h1 και Suv39h2 και να μπορούν να προκαλέσουν τριμεθυλίωση, απαιτείται η προηγούμενη ενεργοποίηση τους από κάποιον άγνωστο μέχρι στιγμής παράγοντα (129). Επίσης, η μεθυλτρανσφεράση G9a βρέθηκε ότι είναι υπεύθυνη για την διμεθυλίωση και για το μεγαλύτερο μέρος της μονομεθυλίωσης της Κ9 σε εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού. Αντίθετα, τα επίπεδα της τριμεθυλίωσης της Κ9 παρέμειναν αμετάβλητα, στα κύτταρα από τα οποία αφαιρέθηκε το γονίδιο της G9a (126, 127). Α.6.3. Ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) 28

Η ΗΡ1 είναι ένα μη ιστονικό συστατικό της χρωματίνης, που βρίσκεται κατά προτίμηση σε ετεροχρωματινικές περιοχές και σχετίζεται με την μεταγραφική καταστολή. Είναι μια σχετικά μικρή πρωτεΐνη, 200 περίπου αμινοξέων και έχει μοριακό μέγεθος περίπου 25 kda. Αποτελείται από μια χρωμοπεριοχή (chromodomain, CD) στο αμινο-τελικό άκρο και περιοχή χρωμοσκιάς (chromoshadow, CSD) στο καρβοξυ-τελικό της άκρο. Οι δύο αυτές περιοχές διαχωρίζονται από ένα συνδετικό τμήμα το οποίο είναι εύκαμπτο και εκτεθειμένο. Οι CD και CDS περιοχές είναι εξαιρετικά συντηρημένες, ενώ η συνδετική περιοχή είναι το λιγότερο συντηρημένο τμήμα (130). Οι CD και CDS περιοχές έχουν κοινή δομή και έχει βρεθεί ότι έχουν σφαιρικό σχήμα με μέση διάμετρο 30 Α. Αποτελούνται από 3 β-ελάσματα τα οποία έρχονται κοντά σε μία α-έλικα (α2) στην περίπτωση της CD περιοχής ή δύο α-έλικες (α1, α2) στην περίπτωση της CDS περιοχής. Η CDS περιοχή έχει την ικανότητα να σχηματίζει διμερή σε αντίθεση με την CD. Υπεύθυνη για τον διμερισμό είναι η α2 έλικα της CDS περιοχής η οποία αλληλεπιδρά με την α2 έλικα μιας γειτονικής CDS περιοχής σχηματίζοντας γωνία 45º (131, 132). UΣχήμα Α.10.U Κρυσταλλική δομή της CD περιοχής της HP1β. Η CD περιοχή αποτελείται από τρία β- ελάσματα τα οποία έρχονται κοντά με μία α2 έλικα. Παρόμοια δομή εμφανίζει και η CDS περιοχή στο καρβοξυ-τελικό άκρο της HP1 με την διαφορά ότι η CDS περιοχή περιλαμβάνει δύο έλικες (α1 και α2) (131). Ομόλογες πρωτεΐνες της HP1 εμφανίζονται από την ζύμη έως τον άνθρωπο. Στα θηλαστικά έχουν αναγνωριστεί τρεις HP1 πρωτεΐνες, οι οποίες κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και στον άνθρωπο είναι οι HP1α, HP1β και HP1γ (133). Οι HP1 29

πρωτεΐνες δείχνουν κυρίως περικεντρομερική υποκυτταρική εντόπιση, αν και η HP1β και κυρίως η HP1γ εντοπίζονται και σε ευχρωματινικές περιοχές (134). Η ΗΡ1 έχει βρεθεί ότι μπορεί να καταστέλλει παροδικά την μεταγραφή ευχρωματινικών ενδογενών γονιδίων και ίσως έτσι δικαιολογείται η εντόπιση της ΗΡ1 σε περιοχές της ευχρωματίνης (135). Επίσης, μια πρόσφατη έρευνα αναφέρει μια απροσδόκητη εντόπιση των ΗΡ1 πρωτεϊνών σε γονίδια τα οποία ενεργοποιούνται μεταγραφικά στα πολυταινικά χρωμοσώματα της Drosophila (136). Α.6.4. Σύνδεση της ΗΡ1 στην μεθυλιωμένη λυσίνη 9 (Κ9) της ιστόνης Η3 Η ΗΡ1 ήταν από παλιά γνωστό ότι απαιτείται για τον σχηματισμό της ετεροχρωματίνης, αφού μεταλλάξεις της είχαν σαν αποτέλεσμα την μεταγραφική ενεργοποίηση ετεροχρωματινικών περιοχών (137). Πρόσφατα όμως άρχισε να διευκρινίζεται ο τρόπος με τον οποίο στρατολογείται στα σημεία σχηματισμού ετεροχρωματίνης. Συγκεκριμένα, από δύο διαφορετικές ερευνητικές ομάδες, βρέθηκε ότι η ΗΡ1 και η ομόλογή της πρωτεΐνη στην ζύμη Swi6, συνδέονται εκλεκτικά με την μεθυλιωμένη Κ9 της ιστόνης Η3. Στην αλληλεπίδραση αυτή καθοριστικό ρόλο παίζει η CD περιοχή της HP1. Σε κύτταρα ποντικού στα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της μεθυλτρανσφεράσης Suv39h1, η ΗΡ1 δεν εντοπίζεται σε ετεροχρωματινικές περιοχές. Επίσης, στην ζύμη S. pombe βρέθηκε ότι η μεθυλτρανσφεράση Clr4, που μεθυλιώνει την Κ9 της ιστόνης Η3, είναι απαραίτητη για την εντόπιση της Swi6 (ομόλογη της ΗΡ1) στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη και για την γονιδιακή καταστολή. Η αλληλεπίδραση, αν και δεν είναι ιδιαίτερα ισχυρή, φαίνεται εξειδικευμένη, αφού η CDS περιοχή δεν μπορεί να δεσμευτεί. Επιπλέον, η HP1 δεν συνδέεται σε μη μεταφραστικά τροποποιημένο πεπτίδιο της Η3, ούτε σε πεπτίδιο μεθυλιωμένο στην θέση K4 (138, 139). Πρόσφατα βρέθηκε η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου της ΗΡ1 με την μεθυλιωμένη Η3. Η μεθυλιωμένη Η3 με την μορφή β-ελάσματος δεσμεύεται σε μια αύλακα που σχηματίζεται στην μία πλευρά του β-ελάσματος της CD περιοχής της ΗΡ1. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, η μεθυλομάδα της Κ9 της ιστόνης Η3 περιτριγυρίζεται από τρεις αρωματικές πλευρικές αλυσίδες (140). Ωστόσο, μόνο η μεθυλίωση της Κ9 δεν είναι αρκετή ώστε να εντοπίζεται η ΗΡ1 στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη, δεδομένου ότι σε κύτταρα, τα οποία είχαν γίνει διαπερατά με κατάλληλη κατεργασία, η HP1α δεν ανιχνεύθηκε στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη, όταν είχε προηγηθεί επώαση των κυττάρων με RNase Α. Προτάθηκε ότι το RNA αποτελεί δομικό συστατικό της περικεντρομερικής ετεροχρωματίνης, το οποίο απαιτείται μαζί με την μεθυλίωση της Κ9 της ιστόνης Η3 για την δέσμευση της ΗΡ1 στην 30

ετεροχρωματίνη. Η περιοχή της ΗΡ1 η οποία δεσμεύει RNA φαίνεται ότι βρίσκεται στο καρβοξυ-τελικό άκρο της συνδετικής περιοχής το οποίο περιέχει βασικά αμινοξέα. Επίσης, φαίνεται ότι ρόλο στην σύνδεση της ΗΡ1 στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη διαδραματίζει και η υποακετυλίωση των ιστονών, αφού σε κύτταρα τα οποία έχουν εκτεθεί για πολλές γενιές σε αναστολέα των αποακετυλασών, η ΗΡ1 δεν εντοπίζεται πλέον στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη (141, 142). Α.6.5. Υποακετυλίωση των ιστονών Η μεταγραφικά ανενεργή χρωματίνη συνδέεται με χαμηλό ποσοστό ακετυλίωσης, ιδιαίτερα των ιστονών Η3 και Η4. Η απαίτηση σε υποακετυλίωση δικαιολογείται από το γεγονός ότι η θέση Κ9 της ιστόνης Η3 είναι δυνατόν να είναι ακετυλιωμένη ή μεθυλιωμένη. Προκειμένου να μεθυλιωθεί πρέπει προηγουμένως να αφαιρεθεί η προϋπάρχουσα ακετυλομάδα (143). Επίσης, η μεθυλίωση της θέσης Κ9 εξαρτάται από τις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις άλλων αμινοξέων. Για παράδειγμα, η μεθυλίωση της Κ9 παρεμποδίζεται όταν είναι ακετυλιωμένη η Κ14 (144). Έτσι προτού μεθυλιωθεί η Κ9, πρέπει προηγουμένως να δράσουν αποακετυλάσες και να αφαιρέσουν τις ακετυλομάδες που παρεμποδίζουν την μεθυλίωση της Κ9 (143). UΣχήμα Α.11.U Ρόλος της υποακετυλίωσης στο σχηματισμό ετεροχρωματινικών περιοχών στην ζύμη S. pombe. Αρχικά, οι θέσεις Κ9 και Κ14 της ιστόνης Η3 αποακετυλιώνονται από τις αποακετυλάσες clr3 και clr6, έτσι ώστε η θέση Κ9 να μπορεί στην συνέχεια να μεθυλιωθεί από την μεθυλτρανσφεράη clr4 και κατόπιν να ακολουθήσει η δέσμευση της πρωτεΐνης Swi6 στην μεθυλιωμένη Κ9. 31

Στην ζύμη S. pombe για τον σχηματισμό της ετεροχρωματίνης είναι απαραίτητες η clr4 (μεθυλτρανσφεράση της ιστόνης Η3 που μεθυλιώνει την Κ9), η Swi6 (ομόλογη πρωτεΐνη της ΗΡ1 στη ζύμη), αλλά και οι αποακετυλάσες clr3 και clr6. Η clr3 έχει βρεθεί ότι αποακετυλιώνει την Κ14 της ιστόνης Η3, ενώ η clr6 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την αποακετυλίωση της Κ9. Μεταλλάξεις στο γονίδιο της clr3 έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ετεροχρωματινικών περιοχών, με ταυτόχρονη μείωση της μεθυλίωσης της Κ9 της ιστόνης Η3, καθώς και της εντόπισης της Swi6 στις ετεροχρωματινικές περιοχές (144). Επίσης, πρόσφατα βρέθηκε ότι σε HeLa κύτταρα απώλεια του συμπλόκου p33ing1-sin3- HDAC, το οποίο εμφανίζει δράση αποακετυλάσης, έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ακετυλίωσης των ιστονών, με αντίστοιχη μείωση της μεθυλίωσης της Κ9 της ιστόνης Η3 και της εντόπισης της ΗΡ1 στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη (145). Α.6.6. Σχηματισμός και εξάπλωση της ετεροχρωματίνης Αφού στρατολογηθεί η ΗΡ1 στην ετεροχρωματινική περιοχή και συνδεθεί στην μεθυλιωμένη Κ9, μπορεί να σχηματίσει ομοδιμερή ή ετεροδιμερή. Στην διμερή κατάσταση έχει βρεθεί ότι η ΗΡ1α σχηματίζει σύμπλοκο με την μεθυλτρανσφεράση Suv39Η1, με την οποία αλληλεπιδρά άμεσα (146). Επίσης, διαπιστώθηκε ότι και η ομόλογη της Suv39Η1 στην Drosophila, η Su(var)3-9, σχηματίζει διμερή, ενώ η δράση της ενισχύεται όταν είναι στην διμερή μορφή (129). Έτσι, φαίνεται ότι η αρχική δέσμευση της ΗΡ1 έχει ως αποτέλεσμα την στρατολόγηση καινούργιων μορίων των Suv39 μεθυλτρανσφερασών στην περιοχή, οι οποίες με την σειρά τους μεθυλιώνουν τις γειτονικές Κ9 της ιστόνης Η3, στις οποίες στην συνέχεια συνδέονται νέα μόρια ΗΡ1. Με τον τρόπο αυτό η ετεροχρωματίνη ξεκινά από ένα σημείο και εξαπλώνεται στις γειτονικές περιοχές, με την συγχρονισμένη δράση ενζύμων που τροποποιούν τις ιστονικές ουρές, αλλά και την συμμετοχή δομικών πρωτεϊνών (120). Ωστόσο, το κύτταρο έχει αναπτύξει ανταγωνιστικούς μηχανισμούς οι οποίοι σταματούν την εξάπλωση της ετεροχρωματίνης. Συγκεκριμένα, έχουν βρεθεί διαχωριστικές περιοχές (boundaries) οι οποίες σταματούν την εξάπλωση της ετεροχρωματίνης στις γειτονικές ευχρωματινικές περιοχές. Αφαίρεση των περιοχών αυτών έχει ως αποτέλεσμα την εξάπλωση της ετεροχρωματίνης σε γειτονικά ευχρωματινικά γονίδια με αποτέλεσμα την μεταγραφική καταστολή τους (121, 122). 32

UΣχήμα Α.12.U Σχηματική αναπαράσταση των διαχωριστικών περιοχών που διαχωρίζουν ετεροχρωματινικές (αριστερά στην εικόνα) από ευχρωματινικές περιοχές (δεξιά). Στις ετεροχρωματινικές περιοχές είναι μεθυλιωμένη η Κ9 της ιστόνης Η3, γεγονός που πυροδοτεί την στρατολόγηση της Swi6, ενώ στις ευχρωματινικές περιοχές είναι ακετυλιωμένες οι Κ9 και Κ14 και μεθυλιωμένη η Κ4. Α.6.7. Μεθυλίωση του DNA Η μεθυλίωση του DNA πιστεύεται ότι συνεισφέρει στην σταθεροποίηση της μεταγραφικά ανενεργής ετεροχρωματίνης, κυρίως στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, αφού δεν είναι εξελικτικά συντηρημένος μηχανισμός. Συγκεκριμένα, απαντάται σε μεγάλη έκταση στα θηλαστικά και τα φυτά, εντοπίζεται λίγο στην Drosophila, ενώ δεν υπάρχει στην ζύμη. Η μεθυλίωση της κυτοσίνης συμβαίνει στο πέμπτο άτομο άνθρακα (C5) κυτοσινών που βρίσκονται σε CpG δινουκλεοτίδια στα θηλαστικά, αλλά στα φυτά παρατηρείται μεθυλίωση και σε κυτοσίνες που απαντώνται σε CpNpG νουκλεοτιδία. Η μεθυλίωση καταλύεται από εξειδικευμένα ένζυμα, τις DNA μεθυλτρανσφεράσες (Dnmts). Στα θηλαστικά έχουν αναγνωριστεί η Dnmt1, Dnmt2 και Dnmt3 DNA μεθυλτρανσφεράσες, αφαίρεση των οποίων οδηγεί σε θάνατο στα πρώτα εμβρυϊκά στάδια (147). Πρόσφατες έρευνες αναφέρουν ότι, τουλάχιστον σε ορισμένους οργανισμούς, η μεθυλίωση του DNA εξαρτάται από την μεθυλίωση της Κ9 της ιστόνης Η3. Συγκεκριμένα, στον μύκητα Neurospora έχει βρεθεί ότι η μεθυλίωση της Κ9 και η στρατολόγηση της ΗΡ1 είναι απαραίτητες για την μεθυλίωση του DNA (148, 149), ενώ και στο φυτό Arabidopsis βρέθηκε ότι η μεθυλίωση της Κ9 ενισχύει την μεθυλίωση του DNA (150). Σε εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού έχει βρεθεί ότι η DNA μεθυλίωση περιοχών της περικεντρομερικής ετεροχρωματίνης εξαρτάται από την ύπαρξη των Suv39h και της HΡ1 (151). Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν έρευνες στις οποίες έχει βρεθεί ότι, και αντίστροφα, η μεθυλίωση του 33

DNA επηρεάζει θετικά την μεθυλίωση των ιστονών και την αντίστοιχη στρατολόγηση της ΗΡ1 (152). Επιπλέον, στα θηλαστικά βρέθηκε ότι DNA μεθυλτρανσφεράσες βρίσκονται σε σύμπλοκο μαζί με μεθυλτρανσφεράσες ιστονών και την ΗΡ1β. Φαίνεται ότι η μεθυλίωση του DNA και η μεθυλίωση των ιστονών, τουλάχιστον σε ορισμένους οργανισμούς, αλληλοεπηρεάζονται και η μία τροποποίηση προωθεί την άλλη, έτσι ώστε να διασφαλίζεται η μεταγραφική καταστολή των ετεροχρωματινικών περιοχών (153). Α.6.8. RNA παρεμβολή (RNA interference, RNAi) Ο RNAi μηχανισμός ξεκινά με την μεταγραφή μιας ακολουθίας και προς τις δύο κατευθύνσεις με αποτέλεσμα τη δημιουργία δίκλωνου RNA. Τα μεγάλα μόρια δίκλωνου RNA υδρολύονται σε όλο τους το μήκος, με αποτέλεσμα να προκύπτουν μικρά δίκλωνα τμήματα RNA, μεγέθους περίπου 21-26 νουκλεοτιδίων, τα οποία ονομαστήκαν small interfering RNAs (sirnas). H υδρόλυση απαιτεί την κατανάλωση ATP και πραγματοποιείται από το ένζυμο Dicer, το οποίο έχει δράση RNase IIΙ ριβονουκλεάσης (154). Οι ριβονουκλεάσες Dicer είναι εξελικτικά συντηρημένες και έχουν αναγνωριστεί έως τώρα τέσσερις στην Arabidopsis thaliana, μία στα θηλαστικά και δύο στην Drosophila (155). Στο μόριο της Dicer αναγνωρίστηκε μια αμινο-τελική ακολουθία ελικάσης, μια PAZ ακολουθία, μια περιοχή δέσμευσης σε δίκλωνο RNA και δύο περιοχές RNase III ριβονουκλεάσης (156). Στο επόμενο βήμα, το δίκλωνο RNA ενσωματώνεται στο πρωτεϊνικό σύμπλοκο RISC (URUNA-UIUnduced USUilencing UCUomplex) όπου ξεδιπλώνεται από μία ελικάση, με ταυτόχρονη απομάκρυνση του νοηματικού κλώνου. Στην συνέχεια, το ενεργοποιημένο σύμπλοκο RISC το οποίο περιέχει το sirna, οδηγείται στο συμπληρωματικό RNA και το καταστρέφει ή το απενεργοποιεί, με έναν άγνωστο μέχρι στιγμής μηχανισμό (156). Βασικό συστατικό του συμπλόκου RISC είναι πρωτεΐνες της οικογένειας Argonaute, οι οποίες είναι ιδιαίτερα βασικές, με μοριακό μέγεθος περίπου 100 kd. Οι πρωτεΐνες αυτές περιέχουν μια PAZ ακολουθία 130 αμινοξέων η οποία πιστεύεται ότι επάγει τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και μία καρβοξυ-τελική PIWI περιοχή 300 αμινοξέων με άγνωστη λειτουργία. Πιθανολογείται ότι οι Argonaute πρωτεΐνες συνδέονται με τα μικρά RNAs (157). Επίσης, έχει βρεθεί ότι σε ορισμένες περιπτώσεις καταλύουν το κόψιμο του mrna, όπως η Ago2 στον άνθρωπο η οποία περιέχει ακολουθία RNaseH (158). Έχουν αναγνωριστεί 10 πρωτεΐνες της Argonaute οικογένειας στην A. thaliana, 8 στον άνθρωπο και 5 στην Drosophila (155). 34

Σχήμα Α.13. Διαγραμματική απεικόνιση του RNAi μηχανισμού. Με μπλε κύκλο αναπαρίστανται άγνωστοι παράγοντες που συμμετέχουν στο RISC σύμπλοκο. Σε ορισμένους οργανισμούς φαίνεται ότι απαιτείται ακόμα ένα στάδιο πολλαπλασιασμού του RNA. Σε φυτά, σε σκουλήκια και στην ζύμη έχει βρεθεί μια RNAεξαρτώμενη RNA πολυμεράση (URUNA UdUependent URUNA UPUolymerase, RdRP), η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο RNA και το μετατρέπει σε δίκλωνο. Τα καινούργια δίκλωνα μόρια πιθανότατα στην συνέχεια υδρολύονται και πάλι από την ριβονουκλεάση Dicer, έτσι ώστε να παραχθεί μια ικανοποιητική συγκέντρωση sirnas. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό αν αυτό το επιπλέον στάδιο πολλαπλασιασμού λειτουργεί στα θηλαστικά και στις μύγες, αφού στους οργανισμούς αυτούς δεν έχει εντοπιστεί ακόμα γονίδιο που να κωδικοποιεί την πολυμεράση RdRP (156). 35

Α.6.9. Συμμετοχή του RNAi μηχανισμού στον σχηματισμό ετεροχρωματίνης Πρόσφατες έρευνες αποκάλυψαν την συμμετοχή του RNAi μηχανισμού στον έλεγχο της γονιδιακής καταστολής και στον σχηματισμό ετεροχρωματίνης. Φαίνεται ότι τροποποιήσεις που είναι χαρακτηριστικές των ετεροχρωματινικών περιοχών, όπως η μεθυλίωση της Κ9 της ιστόνης Η3 και η μεθυλίωση του DNA, ελέγχονται σε πολλές περιπτώσεις από τον RNAi μηχανισμό. Συγκεκριμένα, μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν συστατικά του RNAi μηχανισμού έχουν ως αποτέλεσμα την μεταγραφική ενεργοποίηση κατεσταλμένων γονιδίων, ενώ επίσης έχουν βρεθεί και μικρά RNAs που αντιστοιχούν σε ακολουθίες της συστατικής ετεροχρωματίνης. Φαίνεται ότι η γονιδιακή καταστολή μέσω του RNAi μηχανισμού είναι εξαιρετικά συντηρημένη, αφού εμφανίζεται σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών από την ζύμη μέχρι τα θηλαστικά (159). Schizosaccharomyces pombe Στην ζύμη S. pombe τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες Dicer, RdRp και Argonaute είναι απαραίτητα για τον σχηματισμό της περικεντρομερικής ετεροχρωματίνης, αφού απάλειψη οποιουδήποτε από τα προηγούμενα γονίδια οδηγεί σε ενεργοποίηση της μεταγραφής ενός γονιδίου αναφοράς που έχει τοποθετηθεί στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη, σε απώλεια μεθυλίωσης της Κ9 της ιστόνης Η3, καθώς και της εντόπισης της Swi6/HP1 στα κεντρομερή (160). Μάλιστα έχει παρατηρηθεί στον ίδιο οργανισμό μεταγραφή των επαναλήψεων της περικεντρομερικής περιοχής και των δύο αλυσίδων του DNA, με αποτέλεσμα τα συμπληρωματικά μόρια RNA να σχηματίζουν δίκλωνα μόρια (160, 161). Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στην υπόθεση ότι στην ζύμη S. pombe το δίκλωνο RNA το οποίο προέρχεται από την μεταγραφή και των δύο κλώνων του περικεντρομερικού DNA, μετατρέπεται σε sirna, το οποίο στην συνέχεια μέσω ενός αγνώστου μηχανισμού, επάγει την μεθυλίωση της Κ9 της ιστόνης Η3 και την ακόλουθη στρατολόγηση της Swi6, με αποτέλεσμα την εδραίωση της ετεροχρωματινικής περιοχής. Μάλιστα, πιστεύεται ότι ο RNAi μηχανισμός απαιτείται για την έναρξη σχηματισμού μιας ετεροχρωματινικής περιοχής αλλά όχι για την διατήρησή της (162). Στην ζύμη S. pombe αναφέρθηκε επίσης και η μεταγραφική καταστολή ενός ευχρωματινικού γονιδίου με την παραγωγή συμπληρωματικού προς αυτό RNA το οποίο μεταγράφεται από γονίδιο που έχει προστεθεί εξωγενώς. Η καταστολή επιτυγχάνεται μέσω του RNAi μηχανισμού αφού απαιτούνται οι πρωτεΐνες Argonaute, Dicer και Rdp1. Επίσης, απαιτείται η μεθυλτρανσφεράση Clr4, ενώ η Swi6/ΗΡ1 δεν είναι απαραίτητη για την μεταγραφική καταστολή, αλλά για την εξάπλωση της ετεροχρωματίνης στις γειτονικές 36

περιοχές. Συγκρίνοντας τα επίπεδα μεθυλίωσης της Κ9 και της προσδεδεμένης Swi6 στο ενδογενές γονίδιο, διαπιστώθηκε ότι στα κύτταρα που έλειπαν συστατικά του RNAi μηχανισμού, τόσο η μεθυλίωση της Κ9 της ιστόνης Η3, όσο και τα επίπεδα της δεσμευμένης Swi6, δεν ήταν ανιχνεύσιμα (163). Αν και τα αποτελέσματα πληθώρας ερευνών κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο σχηματισμός ενός σημαντικού αριθμού ετεροχρωματινικών περιοχών ελέγχεται από τον RNAi μηχανισμό, δεν είναι γνωστός ο τρόπος με τον οποίο τα sirnas καθοδηγούν τον σχηματισμό της ετεροχρωματίνης. Πρόσφατα άρχισε να διαφωτίζεται η λειτουργία των sirnas με την ταυτοποίηση του συμπλόκου RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing) στην ζύμη S. pombe. Το σύμπλοκο RITS αποτελείται από την πρωτεΐνη Chp1 που έχει μία χρωμοπεριοχή (chromodomain), την πρωτεΐνη Ago1, που ανήκει στην οικογένεια των Argonaute και μια νέα πρωτεΐνη την Tas3 (Τargeting complex subunit 3). Kαι οι τρεις πρωτεΐνες που απαρτίζουν το σύμπλοκο είναι απαραίτητες για την μεταγραφική καταστολή ενός γονιδίου αναφοράς που έχει ενσωματωθεί στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη. Το RITS σύμπλοκο εκτός από το πρωτεϊνικό περιεχόμενό του, περιέχει μικρά RNAs τα οποία έχουν μέγεθος 22-25 νουκλεοτίδια και αντιστοιχούν σε επαναλαμβανόμενες ακολουθίες των κεντρομερών. Το σύμπλοκο RITS εντοπίζεται σε ετεροχρωματινικές περιοχές και η εντόπιση αυτή εξαρτάται από τα RNAs και τον RNAi μηχανισμό. Μετάλλαξη της Dicer έχει σαν αποτέλεσμα τον σχηματισμό μεν του συμπλόκου, αλλά χωρίς τα RNAs και έτσι το σύμπλοκο RITS αδυνατεί να συνδεθεί με την ετεροχρωματίνη (164). Drosophila Στην Drosophila η μετάλλαξη πρωτεϊνών που συμμετέχουν στον RNAi μηχανισμό, οδηγεί στην καταστολή σχηματισμού της ετεροχρωματίνης. Συγκεκριμένα, μεταλλάξεις στα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες PIWI και Aubergine οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια Argonaute καθώς και της Homeless, η οποία είναι μια RNA ελικάση, έχουν ως αποτέλεσμα την μείωση της μεθυλίωσης της Κ9 της ιστόνης Η3, την αλλαγή της κατανομής της ΗP1 και την απώλεια της μεταγραφικής καταστολής στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη (165). Επίσης, έχουν βρεθεί μικρά RNAs στην Drosophila τα οποία αντιστοιχούν σε δορυφορικό DNA και σε μεταθετά στοιχεία. Μάλιστα, είναι εξαιρετικά ενδιαφέρον το γεγονός ότι τα μικρά RNAs ρυθμίζονται αναπτυξιακά, με την μεγαλύτερη ποσότητα να ανιχνεύεται στους όρχεις και στα έμβρυα (166). 37

Φυτά Στα φυτά υπάρχουν αρκετές εργασίες που υποστηρίζουν την συμμετοχή του RNAi μηχανισμού στην μεθυλίωση των ιστονών, στην μεθυλίωση του DNA και γενικότερα στην γονιδιακή καταστολή (167). Αποτελέσματα γενετικών μελετών στο φυτό Arabidopsis thaliana για την ανίχνευση μεταλλάξεων που έχουν σαν αποτέλεσμα την άρση της μεταγραφικής καταστολής του γονιδίου SUPΕΡΜΑΝ (SUP), ανέδειξαν μεταξύ άλλων ως υπεύθυνο και το γονίδιο της πρωτεΐνης Ago4 (πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια των Argonaute). Μεταλλάξεις στο γονίδιο της Ago4 έχουν σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του SUP γονιδίου, την μείωση της μεθυλίωσης της θέσης Κ9 στην ιστόνη Η3 και την μείωση της μεθυλίωσης του DNA στις θέσεις CpNpGp, ενώ τα επίπεδα της CG μεθυλίωσης του γονιδίου μένουν ανεπηρέαστα. Είναι χαρακτηριστικό ότι η μετάλλαξη στην πρωτεΐνη Αgo4 επηρεάζει την μεθυλίωση του DNA κάποιων περιοχών, ενώ αφήνει ανεπηρέαστες κάποιες άλλες ετεροχρωματινικές περιοχές (168). Επίσης, στο φυτό Arabidopsis έχουν βρεθεί sirnas, το 90-95% των οποίων παρουσιάζει ομολογία με μεταθετά στοιχεία και επαναληπτικές ακολουθίες DΝΑ, οι οποίες χαρακτηρίζονται από έντονη μεθυλίωση του DNA και των ιστονών τους (169). Θηλαστικά Μία ένδειξη ότι ο μηχανισμός RNAi μπορεί να συμμετέχει στον σχηματισμό της ετεροχρωματίνης των θηλαστικών είναι ότι η εύρεση μεθυλιωμένης Κ9 στην ιστόνη Η3 καθώς και η εντόπιση της πρωτεΐνης ΗP1 στην περικεντρομερική ετεροχρωματίνη, χάνεται όταν καθηλωμένα κύτταρα τα οποία έχουν γίνει διαπερατά μετά από κατάλληλη κατεργασία, έχουν υποστεί κατεργασία με ριβονουκλεάση (142). Επίσης, σε κύτταρα ποντικού έχουν ανιχνευθεί RNA τα οποία αντιστοιχούν και στους δύο κλώνους του επαναληπτικού DNA των κεντρομερών (170), ενώ ποντίκια στα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της ριβονουκλεάσης Dicer δεν είναι βιώσιμα (171). Επιπλέον, πρόσφατα διαπιστώθηκε μείωση της καταστολής του επαναλαμβανόμενου DNA της περικεντρομερικής περιοχής, σε εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού από τα οποία έχει αφαιρεθεί η Dicer (172). Στα θηλυκά άτομα των θηλαστικών λειτουργεί, στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης, ένας μηχανισμός απενεργοποίησης του ενός X χρωμοσώματος όπου δεν φαίνεται να συμμετέχει ο RNAi μηχανισμός, αλλά και στην περίπτωση αυτή η απενεργοποίηση βασίζεται στην παρουσία ενός RNA, το οποίο ονομάζεται Xist RNA (Χ-inactivation-specific transcript). Το Xist RNA δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, έχει μέγεθος 17 kb και παράγεται μόνο από το χρωμόσωμα που πρόκειται να αδρανοποιηθεί. Μεταλλάξεις στο Xist γονίδιο έχουν 38

δείξει ότι η παρουσία του Xist RNA είναι απαραίτητη για την έναρξη της απενεργοποίησης του ενός Χ χρωμοσώματος. Η σύνδεση του Xist RNA στο Χ χρωμόσωμα ακολουθείται από μείωση των επιπέδων ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4, αυξημένη μεθυλίωση της Κ9 και τριμεθυλίωση της Κ27 της ιστόνης Η3, καθώς και μεθυλίωση του DNA (173, 174). Α.7. Σπερματογένεση Σπερματογένεση ονομάζεται η διαδικασία παραγωγής ώριμων σπερματοζωαρίων από τις πρόδρομες μορφές τους (διπλοειδή σπερματογόνια). Τα ώριμα σπερματοζωάρια παράγονται από πρόδρομα κύτταρα με αλληλοδιάδοχες μιτωτικές και μειωτικές διαιρέσεις, ενώ υπόκεινται και σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης. Το τελικό αποτέλεσμα της σπερματογένεσης είναι η παραγωγή μικρών απλοειδών σπερματοζωαρίων, με τέτοιες μορφολογικές και βιοχημικές ιδιαιτερότητες, που να εξυπηρετούν την λειτουργικότητα τους που είναι η μετακίνηση προς το ωάριο και η σύντηξή τους με αυτό (175). Α.7.1. Δομή όρχεων και σπερματοφόρων σωληναρίων Η σπερματογένεση λαμβάνει χώρα στις γονάδες των αρσενικών ατόμων (όρχεις). Οι όρχεις των θηλαστικών είναι σύνθετα όργανα αποτελούμενα από πολυάριθμα περιελιγμένα σπερματοφόρα σωληνάρια, τα οποία έχουν μήκος περίπου 1 m και διάμετρο 0.5 mm. Το κάθε σπερματοφόρο σωληνάριο περιβάλλεται από τη βασική μεμβράνη, ενώ στο κέντρο του φέρει τον αυλό του σωληναρίου. Ο χώρος στον οποίο βρίσκονται τα σπερματοφόρα σωληνάρια περιέχει μεσοκυττάριο υγρό, αγγεία, νεύρα καθώς και κύτταρα Leydig (176). Τα κύτταρα Leydig εκκρίνουν την ορμόνη τεστοστερόνη, η οποία διαχέεται στα σπερματοφόρα σωληνάρια και προωθεί την διαδικασία της σπερμιογένεσης (177). Τα σπερματοφόρα σωληνάρια αποτελούνται από δύο κατηγορίες κυττάρων, τα αρσενικά γεννητικά κύτταρα και τα κύτταρα Sertoli. Τα γεννητικά κύτταρα είναι ένας ανομοιογενής πληθυσμός κυττάρων τα οποία βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης. Μάλιστα, έχουν συγκεκριμένη διάταξη μέσα στο σπερματοφόρο σωληνάριο ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξής τους, με αποτέλεσμα σε μια εγκάρσια τομή οι πιο ανώριμες μορφές να βρίσκονται προς την βασική μεμβράνη και οι ωριμότερες τοποθετημένες προς τον αυλό. Όμως, όλα τα γεννητικά κύτταρα, ανεξάρτητα από το στάδιο διαφοροποίησής τους, βρίσκονται σε στενή επαφή με τα κύτταρα Sertoli, μέσω ειδικών συνδέσεων. Είναι χαρακτηριστικό ότι κάθε κύτταρο Sertoli συνδέεται με περίπου 30-50 γεννητικά κύτταρα (176). 39

UΣχήμα Α.14.U Σχηματική αναπαράσταση τμήματος σπερματοφόρου σωληναρίου. Διακρίνονται προς την βασική μεμβράνη τα σπερματογόνια, ενώ τα σπερματοκύτταρα και οι σπερματίδες βρίσκονται τοποθετημένες πιο κοντά στον αυλό, ανάλογα με το επίπεδο διαφοροποίησης. Όλα τα γεννητικά κύτταρα βρίσκονται συνδεδεμένα με κύτταρα Sertoli (175). Τα κύτταρα Sertoli είναι κολωνοειδή, με φαρδιά βάση και στενή κορυφή και εκτείνονται από την βασική μεμβράνη μέχρι τον αυλό του σπερματοφόρου σωληναρίου. Συμβάλουν στη δομική οργάνωση του σπερματοφόρου σωληνίσκου, χωρίζοντας το επιθήλιο σε δύο κύριες περιοχές, τη βασική περιοχή η οποία περιέχει τα σπερματογόνια και τα πρώιμα σπερματοκύτταρα και τη γειτονική στον αυλό περιοχή, η οποία περιέχει τα ώριμα σπερματοκύτταρα και τις σπερματίδες (178). Ο ρόλος των κυττάρων Sertoli κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των σπερματογονικών κυττάρων είναι πολλαπλός. Οι κύριες λειτουργίες τους είναι η φυσική (δομική) υποστήριξη των γεννητικών κυττάρων, η διακίνηση στο σπερματοφόρο επιθήλιο ορμονών, μεταβολιτών και θρεπτικών συστατικών προς τα γεννητικά κύτταρα, η προστασία των σπερματοκυττάρων, σπερματίδων και σπερματοζωαρίων από αυτοάνοση αντίδραση του οργανισμού απέναντι τους (Blood-Testis 40

barrier), η απομάκρυνση των υπολειπόμενων σωματιδίων και εκφυλισμένων κυττάρων με φαγοκύτωση, η ρύθμιση της μετακίνησης των κυττάρων διαμέσου του επιθηλίου και η απελευθέρωση των ώριμων σπερματοζωαρίων στον αυλό (179). Α.7.2. Διαφοροποίηση κυττάρων κατά την διάρκεια της σπερματογένεσης Η σπερματογένεση μπορεί γενικά να διακριθεί σε τρεις περιόδους. Η πρώτη περίοδος περιλαμβάνει τον μιτωτικό πολλαπλασιασμό των προδρόμων κυττάρων (σπερματογόνια), η δεύτερη την μειωτική διαίρεση των σπερματοκυττάρων και η τρίτη την σπερμιογένεση. Η διαδικασία της σπερματογένεσης ξεκινά με συνεχείς μιτωτικές διαιρέσεις των διπλοειδών σπερματογονίων, τα οποία βρίσκονται στην βασική μεμβράνη συνδεδεμένα με κύτταρα Sertoli. Κάποια από τα θυγατρικά κύτταρα των μιτωτικών διαιρέσεων θα αποτελέσουν τους προγόνους των υπολοίπων γενιών σπερματοζωαρίων, ενώ τα υπόλοιπα θα μετατραπούν σε πρωτοταγή σπερματοκύτταρα και θα μετακινηθούν από την βασική μεμβράνη προς τον αυλό του σπερματοφόρου σωληναρίου. Στη συνέχεια, τα πρωτογενή σπερματοκύτταρα αρχίζουν να διαιρούνται μειωτικά με αποτέλεσμα, μετά την ολοκλήρωση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης, να προκύψουν δύο δευτεροταγή σπερματοκύτταρα. Από τα δευτεροταγή σπερματοκύτταρα, με το τέλος της δεύτερης μειωτικής διαίρεσης, θα δημιουργηθούν τέσσερις απλοειδείς κυκλικές σπερματίδες. Οι σπερματίδες, εάν και έχουν απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων, δεν μπορούν να γονιμοποιήσουν το ωάριο. Πρέπει πρώτα, με την διαδικασία της σπερμιογένεσης, να μετατραπούν σε σπερματοζωάρια τα οποία τοποθετούνται στην κορυφή των κυττάρων Sertoli με την ουρά τους μέσα στον αυλό (180). Η σπερμιογένεση για λόγους μελέτης διαιρείται σε διάφορα στάδια ο αριθμός των οποίων ποικίλει ανάλογα με τον οργανισμό. Για παράδειγμα, η σπερμιογένεση του ποντικού διακρίνεται σε 15 στάδια (181). Οι κύριες μορφολογικές αλλαγές που επιτελούνται κατά την διάρκειά της είναι ο σχηματισμός της κεφαλής και της ουράς του σπερματοζωαρίου. Στην κεφαλή βρίσκεται ο πυρήνας ο οποίος είναι μικρός και επιμηκυμένος και περιέχει εξαιρετικά συμπυκνωμένη χρωματίνη. Το μεγαλύτερο τμήμα του πυρήνα καλύπτεται από ένα κυστίδιο το οποίο ονομάζεται ακρόσωμα και το οποίο προέρχεται από το σύστημα Golgi. Από το ώριμο σπερματοζωάριο απουσιάζουν πολλά κυτταροπλασματικά οργανίδια, όπως ριβοσώματα, ενδοπλασματικό δίκτυο, σύστημα Golgi κ.α τα οποία είναι άχρηστα για την λειτουργικότητα του σπερματοζωαρίου, ενώ αντίθετα περιέχει πολυάριθμα μιτοχόνδρια, τα οποία δίνουν την απαραίτητη ενέργεια για την κίνηση (182). 41

UΣχήμα Α.15.U Σχηματική αναπαράσταση των διαφόρων φάσεων της σπερματογένεσης (175). Ένα ιδιαίτερο γνώρισμα της σπερματογένεσης είναι ότι όλα τα θυγατρικά κύτταρα μένουν συνδεδεμένα με σταθερές κυτταροπλασματικές γέφυρες. Οι κυτταροπλασματικές γέφυρες διευκολύνουν την επικοινωνία των αναπτυσσόμενων κυττάρων, καθώς και την σύγχρονη διαφοροποίησή τους. Επιπλέον, επιτρέπουν σε κάθε αναπτυσσόμενο απλοειδές σπερματοκύτταρο να προμηθεύεται όλα τα παράγωγα ενός διπλοειδούς γενώματος. Όταν τα σπερματοζωάρια είναι έτοιμα να απελευθερωθούν μέσα στον αυλό, οι γέφυρες αποκόπτονται μαζί με το υπολειπόμενο σωμάτιο, δηλαδή το άχρηστο κυτταρόπλασμά τους (183). Αφού τα σπερματοζωάρια απελευθερωθούν στον αυλό του σπερματοφόρου σωληναρίου, στην συνέχεια μεταφέρονται στην επιδιδυμίδα, την οποία για να την 42

διασχίσουν χρειάζονται περίπου 2 εβδομάδες. Στην διάρκεια αυτού του χρονικού διαστήματος ολοκληρώνονται όλες οι αλλαγές που απαιτούνται, έτσι ώστε τα ώριμα σπερματοζωάρια να έχουν την μέγιστη κινητικότητα και ικανότητα γονιμοποίησης (184). Α.7.3. Δημιουργία συμπυκνωμένης χρωματίνης σπερματοζωαρίων Η χρωματίνη των σπερματοζωαρίων είναι εξαιρετικά συμπυκνωμένη και μεταγραφικά ανενεργή. Η συμπύκνωση της χρωματίνης επιτυγχάνεται εξαιτίας της απομάκρυνσης των ιστονών και της σύνδεσης του DΝΑ με μικρά βασικά πεπτίδια, τις πρωταμίνες. Στα ψάρια και τα πουλιά φαίνεται ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες γίνεται άμεσα. Ωστόσο, στα θηλαστικά οι ιστόνες πρώτα αντικαθίστανται από τα μεταβατικά πεπτίδια και στην συνέχεια αυτά από τις πρωταμίνες (185). Ο μοριακός μηχανισμός απομάκρυνσης των ιστονών δεν είναι γνωστός, αλλά ίσως παίζουν ρόλο μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, όπως η ακετυλίωση. Έχει παρατηρηθεί ότι οι ιστόνες Η3 και Η4 είναι υποακετυλιωμένες κατά τη διάρκεια της μείωσης και στις κυκλικές σπερματίδες, ενώ με την έναρξη της σπερμιογένεσης παρατηρείται έντονη υπερακετυλίωση. Αυτή η ιδιαίτερη υπερακετυλίωση έχει προταθεί ότι λειτουργεί ως σήμα, ώστε να στρατολογηθούν παράγοντες, οι οποίοι θα μεσολαβήσουν για την απομάκρυνση των ιστονών (186). Η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες δεν είναι πλήρης. Στα ώριμα σπερματοζωάρια το 10-15% του DNA εξακολουθεί να βρίσκεται συνδεδεμένο με ιστόνες, ενώ το υπόλοιπο με πρωταμίνες. Πιστεύεται ότι οι ιστόνες συνδέονται εκλεκτικά με γονίδια τα οποία θα εκφραστούν γρήγορα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ζυγωτού. Πράγματι, σε μελέτες όπου εξετάστηκε η οργάνωση της χρωματίνης των γονιδίων της σφαιρίνης σε σπερματοζωάρια, βρέθηκε ότι κάποια τμήματα των γονιδίων της ε και γ σφαιρίνης τα οποία εκφράζονται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη συνδέονταν με ιστόνες. Αντίθετα, τα γονίδια που κωδικοποιούν την β και δ-σφαιρίνη συνδέονται μόνο με πρωταμίνες και είναι ανενεργά κατά την ανάπτυξη του εμβρύου (187). Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα της χρωματίνης των σπερματοζωαρίων και των πρόδρομων κυττάρων τους είναι η ύπαρξη μοναδικών ισομορφών των ιστονών. Συγκεκριμένα, έχουν ανιχνευθεί δύο ισομορφές της Η1 ιστόνης, οι Η1t και HILS1 (188). Η Η1t διαφέρει αρκετά στην δομή της από την Η1 και ανιχνεύεται έως το στάδιο των επιμηκυμένων σπερματίδων (elongated spermatids). Μάλιστα, στο στάδιο αυτό αποτελεί περίπου το 55% των συνδετικών ιστονών. Έχει βρεθεί ότι η Η1t προσδίδει μια πιο ανοιχτή διαμόρφωση της χρωματίνη πιθανότατα διευκολύνοντας την πρόσβαση των μεταβατικών πρωτεϊνών και των πρωταμινών. Η HILS1 (H1-like protein in spermatids) βρέθηκε 43

πρόσφατα στον άνθρωπο και ανιχνεύεται και στα τελευταία στάδια όπου παρατηρείται συμπύκνωση της χρωματίνης. Μια ισομορφή της Η3, η Η3t, η οποία διαφέρει από την Η3 μόνο σε τέσσερα αμινοξέα, ανιχνεύθηκε στον άνθρωπο, ενώ η ΗΤ2Β, μια ισομορφή της Η2Β, ανιχνεύθηκε τόσο στον άνθρωπο όσο και στα ποντίκια (188). Η ΗΤ2Β διαφέρει από την Η2Β κυρίως στο αμινο-τελικό άκρο της, ενώ μικρότερες διαφορές εντοπίζονται στο κεντρικό τμήμα του μορίου. Ανιχνεύεται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα στο στάδιο των σπερματογονίων, τα επίπεδά της είναι μέγιστα στο στάδιο των κυκλικών σπερματίδων, ενώ μετά αρχίζουν και μειώνονται. Αντίθετα, στον άνθρωπο ανιχνεύεται ακόμα και στα ώριμα σπερματοζωάρια. Τέλος, στους όρχεις απαντάται και μια ισομορφή της Η2Α, η οποία ονομάζεται ΤΗ2Α και υπάρχει μόνο στα σπερματοκύτταρα (188). Α.7.4. Μεταβατικές Πρωτεΐνες (Transition Proteins -TPs ) Οι μεταβατικές πρωτεΐνες διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τις τύπου 1 και 2. Η TP1 πρωτεΐνη έχει μοριακή μάζα 6.2 kda, είναι ιδιαίτερα βασική (περίπου 20% αργινίνη, 20% λυσίνη), με τα βασικά αμινοξέα να παρουσιάζουν ομοιόμορφη κατανομή και δεν περιέχει καθόλου κυστεΐνες (189). Η ακολουθία της TP1 είναι εξαιρετικά συντηρημένη παρουσιάζοντας περίπου 90% ομολογία ανάμεσα στα διάφορα θηλαστικά (190). Από την άλλη πλευρά, η TP2 είναι μια βασική πρωτεΐνη 13 kda, (περίπου 10% αργινίνη, 10% λυσίνη) η οποία περιέχει κυστεΐνες στο μόριό της (191). Το καρβοξυ-τελικό τμήμα της είναι πλούσιο σε βασικά αμινοξέα, ενώ το αμινο-τελικό άκρο περιέχει 2 δάκτυλα ψευδαργύρου (zinc-fingers) (192). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις μεταβατικές πρωτεΐνες στον άνθρωπο (Tnp1 και Tnp2) εντοπίζονται στα χρωμοσώματα 2 και 16, αντίστοιχα (193, 194). Η πρωτεΐνη TP2 αμέσως μετά τη σύνθεσή της στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος φωσφορυλιώνεται και στην συνέχεια μεταφέρεται στον πυρήνα. Έχει βρεθεί ότι τα κύρια αμινοξέα φωσφορυλίωσης είναι η θρεονίνη 101 και η σερίνη 109 και η υπεύθυνη κινάση είναι η πρωτεϊνική κινάση Α. Φαίνεται ότι η φωσφορυλίωση διευκολύνει την είσοδο της νεοσυντιθέμενης TP2 στον πυρήνα (195). Στον πυρήνα η TP2 ανιχνεύεται νωρίτερα από ότι η TP1, όπως έδειξαν μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια. Συγκεκριμένα, η TP2 ανιχνεύεται για πρώτη φορά στο στάδιο 10, ενώ η TP1 εντοπίζεται στο στάδιο 12, μετά από περίπου 24 ώρες. Στα στάδια 12-13 εμφανίζεται το μεγαλύτερο ποσοστό τους, όπου αποτελούν περίπου το 90% των βασικών πρωτεϊνών που συνδέονται με DNA, με τα επίπεδα της TP1 να είναι 2.5 φορές μεγαλύτερα από αυτά της TP2. Στα επόμενα στάδια αρχίζει η αντικατάστασή τους από τις πρωταμίνες, με αποτέλεσμα στην αρχή του σταδίου 15 καμία μεταβατική πρωτεΐνη να μην ανιχνεύεται στην χρωματίνη των σπερματίδων (196). 44

Πειράματα απενεργοποίησης των δύο γονιδίων που κωδικοποιούν τις TPs σε ποντίκια, έδειξαν ότι οι μεταβατικές πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό λειτουργικών σπερματοζωαρίων, αφού τα ποντίκια ήταν στείρα, με ανώμαλη συμπύκνωση της χρωματίνης και αυξημένες βλάβες στο DNA (196). Σε συμφωνία με τα προηγούμενα αποτελέσματα, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η TP1 ενεργοποιεί in vitro την επιδιόρθωση κοψιμάτων, όταν αυτά γίνονται μόνο σε έναν από τους δύο κλώνους του DNA (DNA-USUingle USUtrands UBUreaks, SSB) και ακόμα ότι σε κύτταρα τα οποία εκφράζουν την TP1 ενισχύεται η επιδιόρθωση βλαβών του DNA που έχουν προκληθεί με έκθεση σε UV ακτινοβολία (197). UΣχήμα Α.16.U Πιθανό μοντέλο δράσης της TP1 στην επιδιόρθωση των βλαβών του DNA. 1. Δημιουργία κοψιμάτων σε κάθε έναν από τους δύο κλώνους στο μόριο του DNA (single strand breaks) μετά την απομάκρυνση των ιστονών. 2. Η TP1 συνδέεται με τα μονόκλωνα τμήματα του DNA, τα φέρνει κοντά και τα προσανατολίζει το ένα προς το άλλο 3. Μια DNA λιγάση συνδέει τα μονόκλωνα τμήματα 4. Ακολουθεί η αντικατάσταση των μεταβατικών πρωτεϊνών από τις πρωταμίνες (198). 45

Εικάζεται ότι η TP1 συμμετέχει στην αποκατάσταση των βλαβών που δημιουργούνται στο DNA κατά την απομάκρυνση των ιστονών (198). Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από έρευνες στις οποίες έχει βρεθεί ότι η εμφάνιση των μεταβατικών πρωτεϊνών συμπίπτει με την εξαφάνιση των SSB (199). Όσον αφορά στον ρόλο που διαδραματίζουν στην συμπύκνωση της χρωματίνης, πολλές in vitro έρευνες έδειξαν ότι και οι δύο μεταβατικές πρωτεΐνες έχουν την ικανότητα να δεσμεύονται στο DNA και να προκαλούν συμπύκνωση της χρωματίνης, με την TP2 να είναι αποτελεσματικότερη. Μάλιστα, η TP2 συνδέεται κυρίως με περιοχές του γενώματος πλούσιες σε GC, μέσω των δακτύλων ψευδαργύρου που περιέχει. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός της συμπύκνωσης του DNA δεν έχει ακόμα διασαφηνιστεί (200). Α.7.6. Πρωταμίνες 1 και 2 Στα θηλαστικά απαντώνται δύο τύποι πρωταμινών, οι τύπου 1 και 2, οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια που έχουν χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 16p13.3 (194). Οι πρωταμίνες τύπου 1 απαντώνται σε όλα τα θηλαστικά, ενώ οι τύπου 2 περιορίζονται μόνο σε ορισμένα είδη, όπως ο άνθρωπος, το ποντίκι και το άλογο. Οι πρωταμίνες τύπου 1 συντίθενται με την ώριμή τους μορφή και αποτελούν μικρά βασικά πεπτίδια πλούσια σε αργινίνες. Οι αργινίνες αποτελούν περίπου το 50% του μορίου και διατάσσονται σε τρεις ή τέσσερις ομάδες. Οι πρωταμίνες τύπου 1 διαιρούνται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τον αν περιέχουν ή όχι κυστεΐνες στο μόριό τους. Συγκεκριμένα, αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα μαρσιποφόρα, ενώ αυτές των θηλαστικών με πλακούντα περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς που σταθεροποιούν τη δομή τους (201). Η πρωταμίνη 2 συντίθεται ως πρόδρομο μόριο και η ώριμη μορφή της προκύπτει με σταδιακή πρωτεόλυση της πρόδρομης μορφής (202). Οι πρωταμίνες, αμέσως μετά την σύνθεσή τους, φωσφορυλιώνονται στοιχειομετρικά. Οι πρωταμίνες τύπου 1 περιέχουν συντηρημένα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια RS στο μόριό τους, τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από τις SRPKs (203). Επίσης, έχει βρεθεί ότι η πρωταμίνη τύπου 2 υπόκειται σε φωσφορυλίωση από την κινάση Camk4 (Calmodulindependent protein kinase). Μάλιστα απενεργοποίηση του γονιδίου της κινάσης, παρεμποδίζει την αντικατάσταση της TP2 από την πρωταμίνη 2 και οδηγεί σε στειρότητα (204). Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση επιτρέπει στο μόριο των πρωταμινών να αποκτήσει σφαιρική δομή και έτσι διευκολύνεται η σύνδεση με το DNA ( 205). 46

UΣχήμα Α.17. UΑμινοξική ακολουθία και ομολογία μεταξύ των πρωταμινών διαφόρων θηλαστικών. Αφού συνδεθούν με το DNA, οι πρωταμίνες αποφωσφορυλιώνονται, διατηρώντας όμως την σφαιρική διαμόρφωση τους, εξαιτίας της γειτνίασης τους με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA. Η αποφωσφορυλίωσή τους πιστεύεται ότι οδηγεί πιθανότατα σε μία περαιτέρω συμπύκνωση της χρωματίνης. Έχει προταθεί ότι στην συμπυκνωμένη χρωματίνη των σπερματοζωαρίων ένα μόριο πρωταμίνης συνδέεται με τρία μόρια DNA, ενώ δεν είναι γνωστό αν οι πρωταμίνες συνδέονται στην μικρή ή την μεγάλη αύλακα του DNA, αφού υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα που υποστηρίζουν και τις δύο πιθανότητες (205). Ο τρόπος με τον οποίο οι πρωταμίνες αντικαθιστούν τις μεταβατικές πρωτεΐνες και στην συνέχεια εναποτίθενται στο DNA δεν έχει διευκρινιστεί. Αυτό που είναι γνωστό, με δομικές μελέτες, είναι ότι η εμφάνιση των πρωταμινών και η συμπύκνωση της χρωματίνης ξεκινά από την περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου κάτω από το ακροσωμικό κυστίδιο και στην συνέχεια προχωρά προς το πίσω μέρος του πυρήνα (206). 47

ΣΚΟΠΟΣ Από φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου ήταν από παλιά γνωστό ότι η εσωτερική μεμβράνη του πυρηνικού φακέλου βρίσκεται σε στενή επαφή με την ετεροχρωματίνη. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο επιτυγχάνεται η σύνδεση αυτή, ο μηχανισμός ρύθμισής της στη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, καθώς και η μοριακή ταυτότητα των παραγόντων που συμμετέχουν δεν ήταν διευκρινισμένοι. Καθώς έρευνες έφερναν στο φως πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, άρχισε να μελετάται εκτενέστερα ο ρόλος των πρωτεϊνών αυτών και γρήγορα διαπιστώθηκε ότι εμπλέκονται στη σύνδεση της πυρηνικής μεμβράνης με την ετεροχρωματίνη. Κυρίαρχος ρόλος αποδόθηκε στον υποδοχέα της λαμίνης Β, που όπως προαναφέρθηκε, είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Ορμόμενοι από τις παραπάνω παρατηρήσεις κεντρικό σημείο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αποτέλεσε η αλληλεπίδραση του LBR με συστατικά της χρωματίνης, τόσο των σωματικών όσο και των γεννητικών κυττάρων, καθώς και ο τρόπος ρύθμισης της αλληλεπίδρασης αυτής. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες συγκατακρήμνισης ώστε να μελετηθεί η αλληλεπίδραση των ιστονών με τον LBR. Τα πειράματα έδειξαν ότι ο LBR αλληλεπιδρά με δύο από τις ιστόνες του κεντρικού πυρήνα του νουκλεοσώματος, τις Η3 και Η4. Προκειμένου να εξακριβωθεί η περιοχή του LBR που είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση αυτή, δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένες μορφές του υποδοχέα της Β λαμίνης από τις οποίες είχαν αφαιρεθεί συγκεκριμένα τμήματά του (truncated proteins) και οι οποίες ακολούθως δοκιμάστηκαν στα πειράματα συγκατακρήμνισης. Στην πορεία της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε επίσης η ικανότητα του LBR να αλληλεπιδρά με νουκλεϊκά οξέα, τόσο με πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας νουκλεϊκών οξέων όσο και με δοκιμασίες συγκατακρήμνισης. Διαπιστώθηκε ότι ο LBR αλληλεπιδρά με DNA, αλλά κυρίως με RNA και ακολούθησε προσπάθεια εύρεσης του φυσιολογικού ρόλου της δέσμευσης RNΑ στον LBR. Η τελευταία φάση των πειραμάτων εστιάστηκε στην μελέτη της αλληλεπίδρασης του LBR με συστατικά της χρωματίνης των γεννητικών κυττάρων. Πειράματα συγκατακρήμνισης έδειξαν ότι ο LBR αλληλεπιδρά με την πρωταμίνη 1, μια μικρή, πολύ βασική πρωτεΐνη που αντικαθιστά τις ιστόνες κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Η αλληλεπίδραση αυτή είναι παροδική, λαμβάνει χώρα στην αρχή της σπερμιογένεσης και επιβεβαιώθηκε και με δοκιμασίες ανοσοφθορισμού. Επιπλέον, μελετήθηκε ο ρόλος της φωσφορυλίωσης του LBR και της πρωταμίνης 1 στην αλληλεπίδραση αυτή, καθώς και η 48

επίδραση της κυτταρικής πρωτεΐνης p32 που είχε βρεθεί σε παλιότερες εργασίες ότι επίσης αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα. Τέλος, για να διαπιστωθεί ποια είναι η περιοχή της πρωταμίνης 1 που ευθύνεται για την δέσμευση της στον LBR, ακολούθησαν πειράματα δημιουργίας μιας σειράς μεταλλαγμένων μορφών της πρωταμίνης 1. Έγινε προσπάθεια έκφρασης των μεταλλαγμένων αυτών πρωτεϊνών σε προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα και ακολούθησαν δοκιμασίες συγκατακρήμνισης. 49

Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά B.1. Βιολογικό υλικό Οι όρχεις που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή πυρηνικού RNA και πυρηνικού εκχυλίσματος προέρχονται από ποντίκια C57BL/6. B.2. Χημικά αντιδραστήρια Η προμήθεια των χημικών αντιδραστηρίων, αναλυτικής καθαρότητας έγινε από τους εξής οίκους: Merck (Darmstadt, Germany), Sigma (St. Louis, USA) και Serva (Heidelberg, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, TM Germany) και οι μεμβράνες νάιλον GeneScreen PlusP P της εταιρείας Strategene. 32 Το γ-p PΡ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol είναι του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Τα ακτινογραφικά φιλμ που χρησιμοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες είναι του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ ήταν αντίστοιχα: X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρίας. B.3. Πρωτεΐνες, ένζυμα, αντισώματα και υλικά μοριακής βιολογίας Το μίγμα ιστονών καθώς και οι καθαρές ιστόνες Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 είναι της εταιρείας Roche (Mannheim, Germany). Το trna μας παραχωρήθηκε ευγενικά από το εργαστήριο του Dr. Jeremy Brockes (Ludwig Institute for Cancer Research, London). Καθαρή μη φωσφορυλιωμένη ανθρώπινη πρωταμίνη 1 μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Philippe Chevaillier (Laboratoire de Biologie Cellulaire, Université Paris-Val de Marne, France). Ο κλώνος του LBR παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Howard Worman (Department of Anatomy and Cell Biology, Columbia University, NY, USA) και ο κλώνος της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 από τον Dr. Paolo Sassone-Corsi (IGBMC, Strasbourg, France). Το 50

κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pet-15b γονίδιο της ανθρώπινης p32 παραχωρήθηκε από τον Göran Akusjärvi (Department of Medical Biology and Microbiology, BMC, Uppsala University, Sweden). Το αντίσωμα έναντι της GST-SRPK1 αναπτύχθηκε από την ερευνητική μας ομάδα, κατά την διάρκεια της διπλωματικής εργασίας του Ι. Σανίδα. Τα αντισώματα απέναντι σε πεπτίδια του LBR από ερυθροκύτταρα γαλοπούλας και την πρωτεΐνη p32 αναπτύχθηκαν από τον Δρ. Σπύρο Γεωργάτο (Ιατρικό Τμήμα, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων), ενώ τα αντισώματα απέναντι στον ανθρώπινο LBR και το επίτοπο FLAG μας παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Dr. Prim Singh (Division of Gene Expression and Development, The Roslin Institute, Edinburgh, UK) και τον Δρ. Γιώργο Μόσιαλο (Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών Αλ. Φλέμινγκ, Βάρη, Αττικής), αντίστοιχα. Το αντίσωμα απέναντι στην πρωταμίνη 1 από ποντίκι, αναπτύχθηκε από την ομάδα του Dr. Paolo Sassone-Corsi (IGBMC, Strasbourg, France). Το αντίσωμα απέναντι στην Green Fluorescent Protein (GFP) ήταν της εταιρείας Roche. Τα δεύτερα αντισώματα απέναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού και ποντικού αντίστοιχα αγοράστηκαν από την εταιρία Chemicon (Temecula, USA). Τα ένζυμα μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας Takara (Gennevilliers, France). Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρίας Amersham Pharmacia Biotech. Η εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας έγινε χρησιμοποιώντας το P Τ7 PSequencing Kit της εταιρίας Amersham Pharmacia Biotech. Β.4. Θρεπτικά υλικά Όλα τα συστατικά των θρεπτικών υλικών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρείας GIBCO BRL (Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Μέθοδοι Β.5. Μέθοδος προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών με την μέθοδο Bradford (207) Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στο σχηματισμό συμπλόκου των πρωτεϊνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue (CBB) G-250, σε αραιό όξινο διάλυμα. Ενώ η ελεύθερη χρωστική απορροφά στα 465 nm, η δημιουργία του συμπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση της απορρόφησης στα 595 nm. 51

Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεϊνών στα διάφορα εκχυλίσματα γίνεται με ανάμιξη ποσότητας δείγματος, αραιωμένης στα 2 ml με απιονισμένο νερό, με 2 ml αντιδραστηρίου Bradford, ανάδευση και μέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm. Στη συνέχεια με την χρήση πρότυπης καμπύλης αναφοράς με αλβουμίνη (BSA), η απορρόφηση ανάγεται σε συγκέντρωση πρωτεΐνης στο δείγμα. Το αντιδραστήριο Bradford αποτελείται από τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue G-250 που προστίθεται σε συγκέντρωση 1 mg/ml, σε 200 ml διαλύματος φωσφορικού οξέος 85%, υπό ανάδευση, και στη συνέχεια γίνεται αραίωση του διαλύματος στο 1 lt με απιονισμένο νερό. Β.6. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) (208) Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός δείγματος πραγματοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύμφωνα με την εξίσωση: v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CHB2B=CH-CO-NHB2B) και του Ν,Ν μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bisακρυλαμιδίου (CHB2B=CH-CO-NH-CHB2B-NH-CO-CH-CHB2B) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα που διαθέτει πόρους που το μέγεθος τους εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού ανάλογα και με τη συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη του υπερθειϊκού αμμωνίου (NHB4B)B2BSB2BOB8B για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για τη διάδοσή του. Το σχήμα των πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα με τη συσκευή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στη συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, το πήκτωμα 52

επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για τη συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωμα διαχωρισμού που είναι υπεύθυνο για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώματα είναι διαφορετικά ως προς το ph και τη σύσταση τους. Επίσης, το ρυθμιστικό διάλυμα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούμενα. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων, όπως το απορρυπαντικό SDS (μετά νατρίου άλας του θειϊκού δωδεκυλίου). Απουσία τέτοιων παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Β.6.1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (209) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το μετά νατρίου άλας του θειϊκού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες δεσμεύεται πάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων κατά τη διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωμα διαχωρισμού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωμα επιστοίβαξης, όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωμα διαχωρισμού και οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιμέρους στοιχείων του συστήματος είναι η εξής: Διάλυμα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris 53

0.19 M γλυκίνη 0.1% SDS ph 8.9 Πήκτωμα επιστοίβαξης: 5% ακρυλαμίδιο 0.25% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS 0.125 Μ Tris-Cl ph 6.8 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED Πήκτωμα διαχωρισμού: 12% ακρυλαμίδιο 0.62% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS 0.375 Μ Tris-Cl ph 8.9 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων το οποίο αποτελείται από: 0.0625 Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανού της βρωμοφαινόλης Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 μl του διαλύματος αυτού σε 25 μl του μίγματος επώασης. Τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDS-πρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη που χρησιμοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υπομονάδες τους. 54

Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος 25 ma έως τη στιγμή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. Β.7. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250 Προκειμένου να βαφούν οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, εμβαπτίζεται σε διάλυμα χρώσης όπου ανακινείται για διάστημα περίπου 1 ώρας. Στο διάλυμα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωματισμός της πηκτής επιτυγχάνεται υπό ανακίνηση σε διάλυμα αποχρωματισμού. UΔιάλυμα χρώσηςu UΔιάλυμα αποχρωματισμού U 0.1% w/v Coomasie Brilliant Blue R-250 10% v/v οξικό οξύ 10% v/v οξικό οξύ 10% v/v μεθανόλη 50% v/v μεθανόλη Β.8. Αυτοραδιογραφία (210) Με την τεχνική της αυτοραδιογραφίας ανιχνεύονται ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες ή νουκλεϊκά οξέα. Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεμπόμενη β-ακτινοβολία είτε του ισοτόπου P χρησιμοποιείται για την επισήμανση διάφορων πρωτεϊνικών μορίων, είτε του ισοτόπου P που χρησιμοποιείται στην εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων μορίων DNA. 32 PΡ που Στην περίπτωση των πηκτωμάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωμα ανακινείται για 30 λεπτά σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3MM για 1 ώρα υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους. Μία πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται, μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger. Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer, αντίστοιχα. 35 PS Β.9. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (211, 212) 55

(P P)P Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF, βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, από την πηκτή προς τη μεμβράνη κατά την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού και στον εγκλωβισμό τους στο πλέγμα της μεμβράνης. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η μεμβράνη και η πηκτή μεταφέρονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) το οποίο αποτελείται από: 12.5 mm Tris-Βορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT (στην περίπτωση της PVDF μεμβράνης προηγείται ένα στάδιο εμβαπτίσεως της μεμβράνης σε 100% μεθανόλη πριν βυθιστεί στο διάλυμα μεταφοράς). Η τοποθέτηση τους στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε δύο χαρτιά Whatman 3MM με τη μεμβράνη προσανατολισμένη στο θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter της εταιρίας Hoeffer. Η μεταφορά γίνεται για 1 ώρα κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος (45-65 ma ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής και των πρωτεϊνών που πρόκειται να μεταφερθούν). Β.10. Ανοσοανίχνευση (213) Η ανοσοανίχνευση είναι μια τεχνική που μας επιτρέπει τον εντοπισμό μιας καθηλωμένης σε μεμβράνη πρωτεΐνης με τη βοήθεια αντισώματος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσμευθεί με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα, δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου. Κατά την διάρκεια της παρούσας εργασίας, η τεχνική της μεταφοράς σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευσης χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των πρωτεϊνών του πίνακα Β.1. Τα αντισώματα ar1 και ar4 έχουν αναπτυχθεί έναντι των πεπτιδίων R1 61 80 182 197 PKQRKSQSSSSSPSRRSRSRSP P) και R4 (P PKIFEAIKTPEKPS SKTP Pτου αμινο-τελικού τμήματος του LBR από ερυθροκύτταρα γαλοπούλας. Το αντίσωμα της πρωτεΐνης p32 αναπτύχθηκε απέναντι σε πεπτίδιο της καρβοξυ-τελικής περιοχής της πρωτεΐνης 141 157 (CGGP PTGESEWKDTNYTLNTDSP P), με το τρι-νουκλεοτίδιο CGG να χρησιμοποιείται 56

P 1P P αντίσωμα για λόγους σύζευξης. Το αντίσωμα της πρωταμίνης 1 αναπτύχθηκε απέναντι στο πεπτίδιο 1 PMARYRCCRSKSRSRCRP 16 P, που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1-16 της πρωταμίνης 1 από ποντίκι. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε απέναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού είναι συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση. Επίσης, στις περιπτώσεις ανοσοανίχνευσης σε εκχυλίσματα παροδικά επιμολυσμένων κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα απέναντι στην GFP πρωτεΐνη και απέναντι στο επίτοπο FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), ανάλογα αν οι πρωτεΐνες που υπερεκφράστηκαν ήταν συζευγμένες με την πρωτεΐνη GFP ή το επίτοπο FLAG, αντίστοιχα. Και στις δύο περιπτώσεις η ανίχνευση έγινε με χρωμοαντίδραση αλκαλικής φωσφατάσης του δευτέρου αντισώματος το οποίο δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες IgG ποντικού. UΠίνακας Β.1.U Πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν με την τεχνική της ανοσοανίχνευσης. Αναφέρεται το είδος του πρώτου αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε καθώς και η αντίστοιχη αραίωσή του. Πρωτεΐνη ο Αραίωση GST-wtNt, GST-ΔRS, Αντιορός κουνελιού που ανοσοποιήθηκε με 1:200 GST-(62-92) το πεπτίδιο R1 (ar1) GST-(92-205), GST-(62-205) αprm1 Flag-Prm1 Prm1-GFP και οι Αντιορός κουνελιού που ανοσοποιήθηκε με το πεπτίδιο R4 (ar4) Αντιορός κουνελιού που ανοσοποιήθηκε με το πεπτίδιο MARYRCCRSKSRSRCR Μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του επίτοπου FLAG Μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της GFP 1:200 1:200 1:2000 1:2000 μεταλλαγμένες της μορφές πρωτεΐνης 6xHis-p32 SRPK1 Αντιορός κουνελιού που ανοσοποιήθηκε με το πεπτίδιο της καρβοξυτελικής περιοχής της πρωτεΐνης p32 (ap32) Αντιορός κουνελιού που ανοσοποιήθηκε με την GST-SRPK1 (asrpk1) 1:200 1:200 57

Η διαδικασία που εφαρμόζεται, είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Αρχικά, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς εμβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 ώρα σε διάλυμα κορεσμού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l NaB2BHPOB4B, 0.2 gr/l KHB2BPOB4B), ώστε να κορεστεί η μεμβράνη από τη ζελατίνη και να αποφύγουμε τις μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις της μεμβράνης με το αντίσωμα. Κατόπιν, η μεμβράνη επωάζεται με το αντίστοιχο αντίσωμα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 λεπτών στη μεμβράνη με διάλυμα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της μεμβράνης για 1 ώρα υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1 : 2000) σε διάλυμα κορεσμού. Αφού η μεμβράνη υποστεί 2 πλύσεις των 10 λεπτών με PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromochloroindolyl phosphate) και 30 μl NBT (Nitro Blue Tetrazolium) σε 10 ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-Cl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgClB2B) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddhb2bo φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddhb2bo που περιέχει και NaNB3B. Β.11. Πειράματα συγκατακρήμνισης (Pulldown assays) Τα πειράματα συγκατακρήμνισης συνιστούν μία μέθοδο, η οποία επιτρέπει τη διερεύνηση της δυνατότητας των διαφόρων πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Μας δίνει επίσης και μία πρώτη εκτίμηση για το πόσο ισχυρή είναι η αλληλεπίδραση αυτή. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στη δυνατότητα καθήλωσης διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης (π.χ με GST ή 6xHis) στα σφαιρίδια των αντίστοιχων στηλών χρωματογραφίας 2+ (γλουταθειόνη-σεφαρόζη, NiP P-αγαρόζη) με τις οποίες παρουσιάζουν αγχιστεία. Οι καθηλωμένες αυτές πρωτεΐνες μπορούν να δεσμεύσουν άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες είτε βρίσκονται σε καθαρή μορφή, είτε περιέχονται σε συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και με τις οποίες παρουσιάζουν αγχιστεία. Η διαδικασία γίνεται παρουσία σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων ή/και απορρυπαντικών, ώστε να αποφεύγονται τυχαίες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα εκχυλίσματα και οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε εσφαλμένα συμπεράσματα. Στην παρούσα εργασία ως μέσο καθήλωσης χρησιμοποιήθηκε, κατά κύριο λόγο, η στήλη σεφαρόζης-γλουταθειόνης για τη δέσμευση πρωτεϊνών που είχαν εκφραστεί ως 58

πρωτεΐνες σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης. Στα πειράματα αναφοράς έγινε δέσμευση σκέτης GST στα σφαιρίδια. Τα γενικά στάδια της διαδικασίας που ακολουθούνται σε κάθε περίπτωση είναι τα παρακάτω: Αρχικά τα σφαιρίδια της στήλης εξισορροπούνται με τρεις διαδοχικές πλύσεις των 10 λεπτών η κάθε μία, στους 4 C, σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l NaB2BHPOB4B, 0.2 gr/l KHB2BPOB4B, 1% Triton X-100), είτε σε ρυθμιστικό διάλυμα πού αποτελείται από 1 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2 mm MgClB2B, 1% Triton X-100. Η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης με την GST (ή της σκέτης GST) στα σφαιρίδια της στήλης γίνεται παρουσία του ίδιου ρυθμιστικού, υπό ανακίνηση, στους 4 C για 1 ώρα. Το υπερκείμενο της στήλης απομακρύνεται μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g και τα σφαιρίδια της στήλης πλένονται 2 φορές με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για 10 λεπτά στους 4 C. Στη συνέχεια, μία συγκεκριμένη ποσότητα από τις πρωτεΐνες των οποίων η αλληλεπίδραση πρόκειται να ελεγχθεί (είτε πρόκειται για κυτταρικά εκχυλίσματα, είτε για ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που για την υπερέκφραση τους χρησιμοποιήθηκε κάποιο διαφορετικό σύστημα από αυτό της GST, π.χ με 6xHis, είτε για καθαρές κυτταρικές πρωτεΐνες) αραιώνεται στο ρυθμιστικό διάλυμα της διαδικασίας και επωάζεται με τα σφαιρίδια της στήλης, όπου είναι καθηλωμένη η GST-πρωτεΐνη, υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g και απομάκρυνση του υπερκειμένου, ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων των 10 λεπτών η κάθε μία, στους 4 C, στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολούθως, απομακρύνεται όλο το υγρό από τα σφαιρίδια της στήλης και τα σφαιρίδια επαναιωρούνται σε 25 μl νερού. Αφού προστεθεί 1.5 μl DTT 1 M και 5 μl από το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων, τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 90 C και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών γίνεται με δύο τρόπους. Όταν πρόκειται για καθαρές κυτταρικές πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες σύντηξης, μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή βάφεται με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύονται με τη χρώση. Όταν πρόκειται για πρωτεΐνες από εκχυλίσματα ευκαρυωτικών κυττάρων, που είτε είναι συζευγμένες με την πρωτεΐνη GFP είτε περιέχουν την αλληλουχία FLAG στο μόριο τους, ή πρωτεΐνες από εκχυλίσματα ιστών (π.χ. όρχεις) μετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικά αντισώματα απέναντι στην GFP πρωτεΐνη και το επίτοπο FLAG ή με το αντίστοιχο πολυκλωνικό αντίσωμα της πρωτεΐνης στόχου. Σε κάποια πειράματα είχε προηγηθεί φωσφορυλίωση των καθηλωμένων πρωτεϊνών, καθώς και των καθαρών κυτταρικών πρωτεϊνών που προστίθενται πριν από τη διαδικασία 59

συγκατακρήμνισης. Επίσης, σε άλλα πειράματα είχε προηγηθεί επώαση των καθηλωμένων πρωτεϊνών με RNase. Β.12. Φωσφορυλίωση πρωτεϊνών Η φωσφορυλίωση πρωτεϊνικών μορίων πραγματοποιήθηκε με δότη φωσφορικών είτε 32 μόνο ψυχρό ATP είτε μίγμα ψυχρού και ραδιενεργού [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Ως πηγή ενζύμου χρησιμοποιήθηκαν καθαρή ανασυνδυασμένη GST-SRPK1 και μεσοφασικά ή μιτωτικά εκχυλίσματα από HeLa κύτταρα. Ως υποστρώματα χρησιμοποιήθηκαν το αμινο-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (GST-wtNt), η πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά τους. Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιείται σε τελικό όγκο 25 μl και λαμβάνει χώρα στους 30 C για 2 ώρες όταν δότης φωσφορικών είναι το ψυχρό ATP και για 30 min 32 όταν δότης φωσφορικών είναι μίγμα ψυχρού και [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Το μίγμα επώασης περιλαμβάνει εκτός από τη πηγή του ενζύμου (0.5 μg καθαρή ανασυνδυασμένη GST- SRPK1, ή ~10 μg μεσοφασικού ή μιτωτικού εκχυλίσματος), το υπόστρωμα (2-3 μg πρωτεΐνης) και διάλυμα του οποίου η σύσταση αποτελείται από 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 32 mm MgClB2B, 80 mμ NaCl, 25 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Στα πειράματα που χρησιμοποιήθηκε ως δότης φωσφορικών αποκλειστικά το ψυχρό ΑΤΡ, προκειμένου να πετύχουμε όσο το δυνατόν πιο στοιχειομετρική φωσφορυλίωση, προστέθηκαν 600 μμ ψυχρού ATP. Στην περίπτωση χρήσης ραδιενεργού ATP, μετά το τέλος της επώασης, προστίθενται 50 mμ DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων που χρησιμοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Ακολουθεί βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R- 250, αποχρωματισμός, ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. Στην περίπτωση χρήσης ψυχρού ATP ακολουθεί η δοκιμασία συγκατακρήμνισης των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών. Β.13. Παρασκευή μεσοφασικών και μιτωτικών εκχυλισμάτων από HeLa κύτταρα Για τον συγχρονισμό HeLa κυττάρων χρησιμοποιούνται τρυβλία στα οποίο τα κύτταρα είναι σε σχετικά μεγάλη συγκέντρωση (70-80% πληρότητα των τρυβλίων). Έγινε απλός συγχρονισμός με νοκοδαζόλη, η οποία τοποθετείται μαζί με το θρεπτικό υλικό στα τρυβλία σε τελική συγκέντρωση 50 ng/ml για 14-18 ώρες πριν τη συλλογή των μιτωτικών κυττάρων. Τα κύτταρα που είχαν συγχρονιστεί με αυτόν τον τρόπο ήταν σταματημένα στη μετάφαση. 60

Μετά τη συλλογή τους, τα μιτωτικά κύτταρα επωάζονται για 45 min με μέσο ο καλλιέργειας που περιέχει νοκοδαζόλη και 20 μμ κυτοχαλασίνης Β στους 37P P C. Στη συνέχεια, πλένονται 2 φορές με κρύο PBS καθώς και μια φορά με κρύο διάλυμα ΚΗΜ (78 mm KCl, 50 mm Hepes-KOH ph 7.0, 4 mm MgClB2B, 8 mm CaClB2B, 10 mm EGTA, 1mM DTT, 20 μμ κυτοχαλασίνη Β και 1 mm PMSF). Η ομογενοποίηση των κυττάρων γίνεται σε διάλυμα ΚΗΜ (σε αναλογία όγκου κυττάρων : διάλυμα ΚΗΜ 1:1) 100 φορές, σε γυάλινο ομογενοποιητή Dounce. Το ομογενοποίημα των κυττάρων φυγοκεντρείται τέλος για 1 ώρα σε 100000 x g. Για την παρασκευή του αντίστοιχου εκχυλίσματος από μεσοφασικά κύτταρα, τα κύτταρα δεν υποβάλλονται σε διαδικασία συγχρονισμού αλλά χρησιμοποιούνται όπως είναι. Τα κύτταρα αυτά αποκολλώνται από τα τρυβλία καλλιέργειας με χρήση τρυψίνης, πλένονται 2 φορές με μέσο καλλιέργειας, για να απενεργοποιηθεί η τρυψίνη και ακολουθεί η διαδικασία ομογενοποίησης και φυγοκέντρησης που αναφέρθηκε παραπάνω. Τα ο εκχυλίσματα διατηρούνται σε μικρά κλάσματα στους 70P P C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης, όπως αυτή προσδιορίστηκε με την μέθοδο Bradford, κυμαίνονταν από 1-2 mg/ml. Β.14. Επώαση του ανασυνδυασμένου αμινο-τελικού άκρου του LBR με πολυνουκλεοσώματα (214) Στα πειράματα αυτά απομονωμένα πολυνουκλεοσώματα (40 μg πρωτεΐνης) από πυρήνες ερυθροκυττάρων γαλοπούλας επωάστηκαν με καθαρές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες. Τα πολυνουκλεοσώματα μας παραχωρήθηκαν από την ομάδα του Σ. Γεωργάτου (Ιατρικό Τμήμα Πανεπιστημίου Ιωαννίνων). Η ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των πολυνουκλεοσωμάτων και των πρωτεϊνών, είχε ως αποτέλεσμα οι τελευταίες να ανιχνεύονται στο ίζημα μαζί με τα πολυνουκλεοσώματα. Οι πρωτεΐνες οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν ήταν το αμινο-τελικό τμήμα του LBR (GST-wtNt), το αμινο-τελικό τμήμα του LBR από το οποίο απουσιάζει η RS ακολουθία (GST-ΔRS) και το αμινο-τελικό τμήμα του LBR το οποίο είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί στην RS ακολουθία του από καθαρή ανασυνδυασμένη GST-SRPK1. Η επώαση πραγματοποιήθηκε σε συνολικό όγκο 200 μl για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου, σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 150 mμ NaCl, 0.5 mm MgClB2B, 1% Triton X-100, 0.5 mm PMSF και 1 mg/ml αλβουμίνη. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν σε 13000 x g για 30 min και συλλέχθηκε το ίζημα και το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης, τα οποία ακολούθως αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση. Ακολούθησε ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας το ar1 πεπτιδικό αντίσωμα. Στην περίπτωση που η επώαση των πολυνουκλεοσωμάτων έγινε με 61

φωσφορυλιωμένο GST-wtNt, το ίζημα και το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Β.15. Απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος όρχεων ποντικού Σε πρώτο στάδιο, οι όρχεις από ποντίκια C57BL/6 ζυγίζονται ώστε να γίνει γνωστή η αρχική τους μάζα. Στην συνέχεια, καθαρίζονται από το λιπώδη ιστό και το εξωτερικό υμένιο που καλύπτει τους σωληνίσκους και ακολουθεί η αιώρηση τους σε διπλάσιο όγκο από το διάλυμα ομογενοποίησης. Το μίγμα ομογενοποιείται σε συσκευή ομογενοποίησης ιστών Potter-Elvehjem. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 2500 x g για 10 λεπτά, όπου παραλαμβάνεται το ακατέργαστο πυρηνικό κλάσμα με την μορφή ιζήματος. Το πυρηνικό κλάσμα επαναιωρείται στο διάλυμα ομογενοποίησης και το αιώρημα των πυρήνων επιστοιβάζεται πάνω σε διάλυμα επιστοίβαξης (cushion) σουκρόζης και φυγοκεντρείται σε 100000 x g για 90 λεπτά. Το λευκό ίζημα που καθιζάνει στον πυθμένα του σωλήνα φυγοκέντρησης αποτελεί τους πυρήνες. Το ίζημα αιωρείται σε διάλυμα 10 mm NaB2BHPOB4B/NaHB2BPOB4B, 2 mm MgClB2B, 1 mm PMSF ph 7.5 και ακολουθεί πέψη με 100 µg/ml DNase I για 45 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στο αιώρημα προστίθεται NaCl σε τελική συγκέντρωση 1 Μ και αναδεύεται για 2 ώρες στους 4 C. Το πυρηνικό εκχύλισμα συλλέγεται μετά από φυγοκέντρηση σε 10000 x g για 30 λεπτά, ογκομετρείται και προσδιορίζεται η περιεκτικότητα του σε πρωτεΐνες σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford. Η φύλαξη του πυρηνικού εκχυλίσματος γίνεται στους 20 C. UΔιάλυμα ομογενοποίησης U UΔιάλυμα επιστοίβαξης (cushion) σουκρόζηςu 0.25 Μ σουκρόζη 2.3 Μ σουκρόζη 25 mm KCl 25 mm KCl 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5 50 mm Tris-HCl ph 7.5 5 mm MgClB2B 5 mm MgClB2B B 5 mm DTT B5mM DTT 3 mm PMSF 3 mm PMSF Β.16. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) (215) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA, καθώς και για την εισαγωγή θέσεων πέψης με ενδονουκλεάσες περιορισμού, ώστε να είναι δυνατή η κλωνοποίηση του τμήματος DNA σε πλασμιδιακούς φορείς. Στην PCR χρησιμοποιούνται 62

U1UPU U2UPU U3UPU UPU Στάδιο: UPU Στάδιο: UPU Στάδιο: P μόρια 3 τμήματα DNA: το πρώτο είναι το DNA, τμήμα του οποίου πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, ενώ τα δύο άλλα είναι μικρά συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές-primers) τα οποία είναι συμπληρωματικά με τα άκρα της ακολουθίας που θα πολλαπλασιαστεί. Το ένζυμο που χρησιμοποιείται είναι μια θερμοάντοχη DNA πολυμεράση η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου ξεκινώντας τον πολυμερισμό από το 3 υδροξύλιο του εκκινητή και πολυμερίζοντας πάντα προς 5 3 κατεύθυνση. Τα ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάζονται έτσι ώστε στα άκρα τους να περιέχουν θέσεις αναγνώρισης από ενδονουκλεάσες περιορισμού, με σκοπό την κλωνοποίηση του συντιθέμενου τμήματος του DNA σε ένα πλασμίδιο. Η τεχνική της PCR λαμβάνει χώρα σε τρία στάδια. Ο κύκλος των τριών σταδίων επαναλαμβάνεται 20-30 φορές με αποτέλεσμα τελικά να παράγονται 2P είναι ο αριθμός των κύκλων που γίνονται. ο n DNA, όπου n αποδιάταξη DNA Το δίκλωνο DNA μετατρέπεται σε μονόκλωνο με θέρμανση στους 94 C. Κατά τη διάρκεια του σταδίου αυτού σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες των προηγούμενων σταδίων όπως, για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. ο υβριδισμός Οι εκκινητές δεσμεύονται με δεσμούς υδρογόνου στην συμπληρωματική τους ακολουθία στο εκμαγείο. Η θερμοκρασία υβριδισμού εξαρτάται από την σύσταση σε βάσεις του εκκινητή και του εκμαγείου και από το μήκος του εκκινητή. ο πολυμερισμός Στο στάδιο αυτό η DNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα, συνθέτει την συμπληρωματική της προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3 άκρο του εκκινητή. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων. Στην παρούσα εργασία με την τεχνική της PCR πολλαπλασιάστηκαν τα τμήματα του γονιδίου του LBR που κωδικοποιούν τις ακολουθίες μεταξύ των αμινοξέων 62 έως 205, 92 έως 205, 62 έως 92, καθώς και το γονίδιο της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της. Ως εκμαγεία χρησιμοποιήθηκαν το γονίδιο του αμινο-τελικού τμήματος του LBR κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2tp Pκαι το γονίδιο της πρωταμίνης 1 κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα psg5. Οι εκκινητήρες που χρησιμοποιήθηκαν στην κάθε περίπτωση φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. 63

UΠίνακας Β.2U.U Ακολουθία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό των τμημάτων DNA της πρώτης στήλης. Με έντονα γράμματα είναι η θέση για πέψη από ενδονουκλεάση περιορισμού που περιείχε ο κάθε εκκινητής. Ως (s) αναφέρεται ο νοηματικός και ως (a) ο αντινοηματικός εκκινητής. Γονίδιο Εκκινητής Ενδονουκλεάση περιορισμού Γονίδιο prm1 (s) 5-cgcggatccatggccagatacccgatgctgc-3 BamHI (a) 5-ccggattcctagtattttttacaccttatggt-3 EcoRI Τμήμα 62 έως 205 του (s) 5-cgcggatcccagaggaaaagccagtct-3 BamHI LBR (a) 5- gcgaattctcatcttccaccaaattctag-3 EcoRI Τμήμα 92 έως 205 του (s) 5-gcgggatccagacgtcgctcttcttcccatag-3 BamHI LBR (a) 5-gcgaattctcatcttccaccaaattctag-3 EcoRI Τμήμα 62 έως 92 του (s) 5-cgcggatcccagaggaaaagccagtct-3 BamHI LBR (a) 5-gcggaattctctgccttttgctggccgacc-3 EcoRI Γονίδιο prm1 και (s) 5-cgacaagcttatggccaagataccgatgctg-3 HindIII μεταλλάγματα (a) 5-gcgtggatcccggtattttttacaccttatggtg-3 BamHI UΑντίδραση PCR συνολικού όγκου συνολικού όγκου 50 μlu Μίγμα των τεσσάρων τριφωσφορικών νουκλεοζιτών (dntps) (1,25 mm) Εκκινητήρας νοηματικός (0,13 μgr/μl) Εκκινητήρας αντινοηματικός (0,13 μgr/μl) 10x Ρυθμιστικό διάλυμα της Taq DNA πολυμεράσης Taq DNA πολυμεράση (5 U/μl) DNA υπόστρωμα ddh2o 8 μl 3 μl 3 μl 5 μl 1 μl 0.1 μg Μέχρι τελικού όγκου 50 μl Το 10x ρυθμιστικό διάλυμα της Taq DNA πολυμεράσης αποτελείται από 20 mm Tris- Cl, 10 mm (NHB4B)B2BSOB4B, 10 mm KCl, 2 mm MgSOB4B και 0.1% Triton-X-100. 64

UΠρόγραμμα PCR U Αποδιάταξη Υβριδισμός Πολυμερισμός Χρόνος Θερμοκρασία Χρόνος Θερμοκρασία Θερμοκρασία Χρόνος 30 sec 94 C 30 sec 59-65 C 72 C 30 sec Οι συνολικοί κύκλοι πολλαπλασιασμού ήταν 30. Στο τέλος των κύκλων το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 C για 5 min ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Το τέλος της αντίδρασης πραγματοποιείται με την παραμονή του μίγματος της PCR στους 4 C. Β.17. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης και απομόνωση των τμημάτων του DNA (216, 217) Η ηλεκτροφόρηση συγκεκριμένων τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης και η απομόνωση τους απ αυτές αποτελεί έναν απλό και αποδοτικό τρόπο διαχωρισμού και καθαρισμού τους. Η μέθοδος βασίζεται στην παρασκευή πηκτών αγαρόζης με τήξη της αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα έως ότου σχηματιστεί ένα διαυγές διάλυμα. Με τη ψύξη του διαλύματος σχηματίζεται ένα πλέγμα που η πυκνότητα του εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τα τμήματα του DNA, που είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο ph, μετακινούνται προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από ορισμένους παράγοντες: (1) Το μέγεθος των τμημάτων του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. (2) Η συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. (3) Η διαμόρφωση των τμημάτων DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA, ίδιου μοριακού βάρους, κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. (4) Το δυναμικό που εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. (5) Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται πηκτές με συγκέντρωση 1% αγαρόζης, σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE (0.04 M Tris-οξικό, 0.001 M EDTA ph 8.0), παρουσία και 65

βρωμιούχου αιθιδίου σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA. Η ιδιότητα του να απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία και να την επανεκπέμπει στο κόκκινο ορατό φάσμα χρησιμοποιείται για να ανιχνευθούν τα τμήματα του DNA πάνω στην πηκτή. Το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων αποτελείται από 5% γλυκερόλη, 0.42% μπλε της βρωμοφαινόλης και 0.42% κυανούν του ξυλενίου, ενώ η χρησιμοποιούμενη συσκευή ηλεκτροφόρησης είναι της εταιρείας International Biotechnologies, Inc. Για την απομόνωση των διαχωρισθέντων τμημάτων του DNA από την αγαρόζη χρησιμοποιούνται τα αντιδραστήρια και το πρωτόκολλο που παρέχονται από το Qiaquick Gel Extraction Kit της εταιρίας Qiagen. Η απομόνωση τμημάτων DNA σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή βασίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται από ειδικά σφαιρίδια στήλης, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων, ενώ οι προσμίξεις διέρχονται από τη στήλη. Το τμήμα του DNA που μας ενδιαφέρει αποκόπτεται από την πηκτή αγαρόζης και τοποθετείται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης (eppendorff). Εκεί προστίθεται το διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης (3 Μ NaI, 4 M NaClOB4B, 19 mm Tris-ΗCl, 0.1% NaB2BSOB3B ph 7.0) σε αναλογία 300 μl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση για 10 λεπτά στους 50 C με περιοδική ανάδευση, ώστε να διαλυτοποιηθεί η πηκτή. Η παραλαβή του DNA γίνεται με προσθήκη κατάλληλου όγκου σφαιριδίων στήλης Qiaquick και θέρμανση στους 50 C για 10 λεπτά αναδεύοντας περιοδικά, ώστε τα σφαιρίδια να καλύπτουν όλο τον όγκο του διαλύματος. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του διαλύματος για 30 δευτερόλεπτα σε 12000 x g και απόχυση του υπερκειμένου. Στα σφαιρίδια προστίθεται δύο φορές διάλυμα πλύσης QX2 (8 M NaClOB4B, 10 mm Tris-ΗCl ph 7.0) και δύο φορές αιθανολικό διάλυμα QX3 (100 mm NaCl, 10 mm Tris-ΗCl, 1mM EDTA ph 7.5), ώστε να απομακρυνθούν οι τυχόν προσμίξεις. Τα σφαιρίδια αφήνονται να ξηραθούν για 2 λεπτά και στη συνέχεια το DNA εκλούεται με προσθήκη 20 μl ΗB2BΟ ή ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 1mM EDTA ph 8.0). Μικρή ποσότητα από το έκλουσμα (2-4 μl) ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης για να διαπιστωθεί κατ εκτίμηση η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε. Β.18. Κλωνοποίηση DNA (216) Η κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς βασίζεται στην ικανότητα του πλασμιδιακού DNA να διασπάται σε συγκεκριμένες θέσεις μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού και να συνδέεται με το ξένο τμήμα DNA που έχει υποστεί την 66

P ίδια κατεργασία. Τα πλασμίδια είναι μικρά, κυκλικά, δίκλωνα μόρια DNA που μπορούν να αναπτύσσονται ημι-αυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε αντιβιοτικά. Το πλασμιδιακό DNA καθώς και το ξένο τμήμα DNA που έχουν κατεργαστεί με τα ίδια ένζυμα περιορισμού μπορούν να επανακυκλοποιηθούν συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού που καταλύει μία λιγάση. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μπορεί να μεταφερθεί σε κύτταρα και να αναπτυχθεί παρουσία αντιβιοτικών επιτρέποντας την επιλογή τους σε σχέση με τα κύτταρα που δεν περιέχουν το πλασμίδιο. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι pgex- 2T, palter-1, pflag-cmv-2 και palter-1. Ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t έχει μέγεθος 4948 bp και περιέχει έναν tac προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου, το γονίδιο laq IP που κωδικοποιεί τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST). Η περιοχή κλωνοποίησης του πλασμιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει θέσεις για τη πέψη του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού BamHΙ και EcoRΙ που χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή των ξένων γονιδίων. Ο πλασμιδιακός φορέας palter-1 της εταιρίας Promega χρησιμοποιείται για την εισαγωγή επιθυμητών σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της πρωταμίνης 1 (prm1) και είναι κατάλληλος για την εύκολη παρασκευή και επιλογή μεταλλαγμάτων σύμφωνα με την ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Προσφέρει αντίσταση στην τετρακυκλίνη και αμπικιλλίνη (στην περίπτωση της αμπικιλλίνης η ανθεκτικότητα επανέρχεται με τη χρήση κατάλληλου ολιγονουκλεοτιδίου) για την επιλογή των μεταλλαγμένων κλώνων. Διαθέτει δύο προαγωγείς για την Τ7 και SP6 RNA πολυμεράση προκειμένου να γίνει η σύνθεση του μεταλλαγμένου κλώνου. Περιέχει χαρακτηριστικές περιοχές (phage f1 region) που βοηθούν την παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων. Επιτρέπει την κλωνοποίηση τμημάτων DNA με μέγεθος έως 6 kb, καθώς και επιλογή των κυττάρων που φέρουν το κλωνοποιημένο τμήμα DNA με τη δράση β-γαλακτοσιδάσης, δεδομένου ότι ο πλασμιδιακός φορέας περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί το lacz α-πεπτίδιο. Η περιοχή κλωνοποίησης περιέχει θέσεις για την πέψη του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoR I και BamH I όπου και βρίσκεται κλωνοποιημένο το γονίδιο της prm1. Ο φορέας κλωνοποίησης pflag-cmv-2 επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεϊνών σύντηξης στο αμινο-τελικό q 67

1P 2P P ενδονουκλεάση P ενδονουκλεάση τους άκρο με την ακολουθία Met-FLAG (Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για την παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με το κλωνοποιημένο τμήμα DNA. Η μεταγραφή των τμημάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus. Είναι ανθεκτικός στην αμπικιλλίνη και περιέχει θέσεις για την πέψη του από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού Hind III και EcoR I όπου και κλωνοποιήθηκε το γονίδιο της prm1. Ο φορέας κλωνοποίησης pegfp-n1 επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο με την Green Fluorescent Protein (GFP). Η μεταγραφή των τμημάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus. Περιέχει γονίδιο που του προσδίδει ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη και θέσεις για πέψη από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού Hind III και BamH I όπου και κλωνοποιήθηκαν το γονίδιο της prm1 και οι μεταλλαγμένες μορφές του. Β.19. Πέψη με ένζυμα περιορισμού Αντίδραση λιγάσης Το μίγμα της αντίδρασης περιέχει το DNA (πλασμιδιακός φορέας, ή το κομμάτι του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, όπου τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση τους και τα ένζυμα περιορισμού. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως στους 37 C για 2 ώρες και σε τελικό όγκο 30 μl. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε για την πέψη με τα ένζυμα EcoR I, BamH I και Hind III είναι η εξής : 500 mm NaCl, 1 M Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgClB2B, 0,25% Triton X-100. UΑντίδραση πέψης με ενδονουκλεάσες περιορισμού η η περιορισμού (10 U/μl) περιορισμού (10 U/μl) Πλασμίδιο / τμήμα DNA 10x Ρυθμιστικού διαλύματος ενδονουκλεασών 1 μl 1 μl 4 μg 2 μl Η αντίδραση λιγάσης πραγματοποιείται με την προσθήκη στο μίγμα αντίδρασης του τμήματος DNA και του φορέα σε αναλογία 7:1, 1.5 μl Τ4 DNA λιγάσης (350000 U/ml, Takara), 2 μl 10x ρυθμιστικού διαλύματος Τ4 DNA λιγάσης (500 mm Tris-Cl, 100 mm MgClB2B, 100 mm DTT, 10 mm ATP, 25 μg/ml BSA ph 7.5) και απιονισμένο νερό μέχρι 68

P C τελικού όγκου 20 μl. Το μίγμα επωάζεται για 12-16 ώρες σε θερμοκρασία 15 C και ακολουθεί μετασχηματισμός των κατάλληλων σε κάθε περίπτωση κυττάρων E. coli. Β.20. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων ώστε να γίνουν επιδεκτικά για μετασχηματισμό (Competent Cells) (216) Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων, ώστε να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασμένα με διαλύματα CaClB2B στους 4P ο και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές. Πολλές παραλλαγές της βασικής τεχνικής έχουν περιγραφεί και μία από αυτές χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Σύμφωνα μ αυτή, 2 ml θρεπτικού υλικού LB (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1%) εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα XL1/B (παρουσία 15 μg/ml τετρακυκλίνης), Top10 (20 μg/ml στρεπτομυκίνη), JM109 ή ΜutS (απουσία αντιβιοτικού). Η καλλιέργεια αναπτύσσεται για 12-16 ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml LB, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. Ένα ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού LB και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, μέχρις ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm φτάσει την τιμή 0.35-0.4. Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 10 λεπτά στους 4 C και στη συνέχεια αιωρούνται σε 25 ml (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος, που αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaClB2B, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικού καλίου ph 7.5. Τα κύτταρα παραμένουν στον πάγο για 10 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 3000 x g. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 2 ml διαλύματος που αποτελείται από 10 mm MOPS, 75 mm CaClB2,B 10 mm KCl και 20% γλυκερόλη (1/25 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρημα που προκύπτει μοιράζεται σε κλάσματα των 200 μl και εμβαπτίζεται σε λουτρό που αποτελείται από ξηρό πάγο/αιθανόλη για μικρό χρονικό διάστημα. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετό χρονικό διάστημα. 69

Β.21. Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (Transformation) (216) Στην παρούσα εργασία μετασχηματίστηκαν με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pgex-2t κύτταρα XL1/B, με το πλασμίδιο palter-1 κύτταρα ΜutS και JM 109, ενώ με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pegfp-ν1 κύτταρα TOP10. Αναλυτικότερα, ο μετασχηματισμός επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων (200 μl), λίγων μl από το DNA που θέλουμε να εισαγάγουμε και παραμονή των κυττάρων για 60 λεπτά στον πάγο. Στο τέλος του χρονικού διαστήματος ακολουθεί επώαση για 2 λεπτά στους 37 C. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη, καναμυκίνη ή τετρακυκλίνη. Τα τρυβλία επωάζονται στους 37 C για 12-16 ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έναντι των βακτηρίων που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο, γίνεται παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, διότι οι ανασυνδυασμένοι πλασμιδιακοί φορείς περιέχουν γονίδιο αντίστασης στο αντιβιοτικό αυτό. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τρυβλίων, συλλέγονται η καθεμία χωριστά και αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αντιβιοτικού, ώστε είτε να απομονωθεί το πλασμιδιακό DNA είτε να γίνει έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Β.22. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση (216) Μία αποικία των μετασχηματισμένων βακτηρίων χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3 ml θρεπτικού υλικού παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού (100 μg/ml) και ο αναπτύσσεται για περίπου 12 ώρες στους 37P PC. Στη συνέχεια, 1.5 ml της καλλιέργειας μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 1 λεπτό. Στο ίζημα αρχικά προστίθενται 50 μl διαλύματος GTE (50 mm Tris-Cl ph 8, 10 mm EDTA, 20% γλυκόζη) και τα κύτταρα αναδεύονται έντονα ώστε να αιωρηθεί πλήρως το ίζημα. Στην συνέχεια, προστίθεται διπλάσιος όγκος διαλύματος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 80 μl ψυχρού διαλύματος 3 Μ οξικού καλίου και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε 12000 x g. Στο υπερκείμενο που παραλαμβάνεται γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 0.7 όγκου ισοπροπανόλης και παραμονή στους -20 C για 30 λεπτά. Το ίζημα που προκύπτει μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g για 5 λεπτά, αιωρείται σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) 70

UPU : UPU : UPU : παρουσία RNase A (20 μg/ml) και το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 20 λεπτά. Το DNA εκχυλίζεται με την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορμίου. Στην υδατική στοιβάδα που απομονώνεται μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε 12000 x g, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 2.5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αμμωνίου. Το DNA διαλύεται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου ddhb2bo. Ποσότητα του DNA υπόκειται σε πέψη με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού και στην συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται σε πηκτή αγαρόζης, ώστε να ταυτοποιηθούν οι θετικές αποικίες, δηλαδή οι αποικίες οι οποίες περιέχουν το κομμάτι του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Κατόπιν, 750 μl κυττάρων από τις θετικές αποικίες αναμιγνύονται με 250 μl γλυκερόλης 50% και διατηρούνται στους -20 C (stock). Β.23. Εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του DNA (10) Η χρησιμοποιούμενη τεχνική για την εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του DNA είναι η μέθοδος των διδεοξυνουκλεοτιδίων ή ενζυμική μέθοδος κατά Sanger. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της DNA πολυμεράσης να ενσωματώνει στην νεοσυντιθέμενη αλυσίδα τριφωσφορικούς διδεοξυριβονουκλεοζίτες (ddntp s) με αποτέλεσμα τον τερματισμό της επιμήκυνσης της αλυσίδας. Αυτό συμβαίνει γιατί η έλλειψη του 3 υδροξυλίου στη διδεοξυριβόζη εμποδίζει τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού με επόμενα dntp s σταματώντας ουσιαστικά τον πολυμερισμό του DNA. Κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε στηρίζεται στο T7 sequencing kit της εταιρίας Pharmacia Biotech, τα στάδια του οποίου αναφέρονται αναλυτικά παρακάτω: UΣτάδιο 1UPU ο Αποδιάταξη DNA Η αποδιάταξη των κλώνων DNA σε μονόκλωνα μόρια επιτυγχάνεται με την προσθήκη 8 μl ΝaΟΗ 2 Μ σε 32 μl διαλύματος DNA το οποίο έχει ρυθμιστεί ώστε να περιέχει 2 μg DNA. Στη συνέχεια τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 10 λεπτά. UΣτάδιο 2UPU ο Κατακρήμνιση μονόκλωνου DNA Η κατακρήμνιση των μορίων του DNA γίνεται με την προσθήκη στο διάλυμα 7 μl οξικού νατρίου 3 Μ (ph 4.8), 4 μl ddhb2bo, 120 μl απόλυτης αιθανόλης και παραμονή στους -20 C για 15 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση 15 λεπτών σε 12000 x g γίνεται μια σύντομη πλύση του ιζήματος με 70% αιθανόλη και επαναφυγοκέντρηση. Το τελικό ίζημα που προκύπτει διαλύεται σε 10 μl ddhb2bo. UΣτάδιο 3UPU ο Υβριδισμός εκκινητή στο μονόκλωνο DNΑ 71

UPU : UPU : Στα 10 μl του δείγματος γίνεται προσθήκη 2 μl εκκινητή 0.13 μg/μl και 2 μl διαλύματος υβριδισμού 10x (1 M Tris-Cl ph 7.6, 100 mm MgClB2, B160 mm DTT). Το διάλυμα ανακινείται απαλά και επωάζεται στους 65 C για 5 λεπτά, στους 37 C για 10 λεπτά και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 5 λεπτά. UΣτάδιο 4UPU ο Αντιδράσεις σήμανσης Η σήμανση των νεοσυντιθέμενων κλώνων γίνεται με προσθήκη στο διάλυμα υβριδισμού 3 μl μίγματος επισήμανσης (1.375 μμ από dctp, dgtp, dttp και 333.5 mm 35 NaCl), 2 μl [α-p PS] datp, και 2 μl Τ7 DNA πολυμεράσης (1.8 u/μl) αραιωμένης σε διάλυμα που περιέχει 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 5 mm DTT, 100 μg/ml BSA και 5% γλυκερόλη. Το μίγμα αφήνεται να επωαστεί για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, ενώ συγχρόνως προεπωάζονται στους 37 C τα τέσσερα διαφορετικά σωληνάκια που περιέχουν το μίγμα των τεσσάρων δεοξυνουκλεοτιδίων και ένα διαφορετικό διδεοξυνουκλεοτίδιο το καθένα. UΣτάδιο 5UPU ο Αντίδραση τερματισμού Μεταφέροντας από 4.5 μl του αρχικού δείγματος όπου έγινε η επισήμανση, σε κάθε σωληνάκι που περιέχει το αντίστοιχο διδεοξυνουκλεοτίδιο και με επώαση στους 37 C για 5 λεπτά γίνεται ο τερματισμός της επιμήκυνσης των διαφορετικών τμημάτων DNA. Έτσι προκύπτουν τμήματα DNA διαφορετικού μήκους, τα οποία έχουν το ίδιο 5 άκρο (εκκινητή) αλλά διαφορετικό 3 άκρο, το οποίο καθορίζεται από το διδεοξυνουκλεοτίδιο που ενσωματώθηκε. Τέλος, στην κάθε αντίδραση προστίθενται 5 μl διαλύματος τερματισμού (0.3% Bromophenol Blue και Xylene Cyanol FF, 10 mm EDTA ph 7.5, 97.5% απιονισμένο φορμαμίδιο). Μετά από θέρμανση στους 100 C των τεσσάρων αντιδράσεων, ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (6% ακρυλαμίδιο, 0.3% bis-ακρυλαμίδιο, 8 Μ ουρία), σε τέσσερις παράλληλες διαδρομές, υπό σταθερή τάση 1300 V, για 4-6 ώρες. Τόσο το ρυθμιστικό διάλυμα της πηκτής όσο και το διάλυμα της ηλεκτροφόρησης είναι το TBE (0.089 Tris-βορικό, 0.089 βορικό οξύ, 0.002 Μ EDTA). Η στερέωση του πηκτώματος γίνεται σε 5% οξικό οξύ, 5% ισοπροπανόλη και ακολουθεί αυτοραδιογραφία για 16 ώρες. Με ανάγνωση των ζωνών (διαβάζοντας από κάτω προς τα πάνω) που αποτυπώνονται στο film αυτοραδιογραφίας αποκαλύπτεται η ακολουθία του τμήματος DNA που εξετάζεται. Β.24. Παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων (216) 72

Η ύπαρξη πλασμιδιακών φορέων που περιλαμβάνουν στο μόριο τους χαρακτηριστικά βακτηριοφάγων, επιτρέπει την παραγωγή αντιγράφων μονόκλωνου DNA (ssdna) του τμήματος που έχει κλωνοποιηθεί στους φορείς αυτούς, με τη βοήθεια κατάλληλων φάγων. Τέτοιου είδους πλασμιδιακοί φορείς φέρουν στο μόριο τους όλες τις αλληλουχίες των γονιδίων που απαιτούνται για την έναρξη και τον τερματισμό της σύνθεσης ιϊκού DNA, τη μορφογένεση σωματιδίων βακτηριοφάγων, καθώς και γονίδιο που τους προσδίδει αντίσταση σε αντιβιοτικό. Με βάση τα παραπάνω, όταν τα βακτηριακά κύτταρα-ξενιστές που έχουν μεταμορφωθεί με τα πλασμιδία αυτά, επιμολυνθούν με κατάλληλο φάγο, θα παραχθούν αντίγραφα μονόκλωνου DNA τα οποία θα πακεταριστούν στους βακτηριοφάγους. Το παραγόμενο ssdna μπορεί να υποστεί καθαρισμό και να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο για διάφορες διεργασίες, όπως η in vitro ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Με τη μέθοδο αυτή παραγωγής μονόκλωνου DNA, μόνο ο ένας κλώνος του ενσωματωμένου στο πλασμίδιο DNA, θα πακεταριστεί στο φάγο. Εάν είναι επιθυμητή η ύπαρξη και των δύο κλώνων ως ssdna, θα πρέπει το τμήμα του ξένου DNA να κλωνοποιηθεί και προς στις δύο κατευθύνσεις, ώστε να σχηματιστούν βακτηριοφάγοι που θα περιέχουν είτε τον έναν είτε τον άλλο κλώνο. Στην παρούσα εργασία, η μέθοδος παρασκευής μονόκλωνου DNA ακολουθεί τα εξής στάδια. Επιλέγονται από τρυβλίο βακτηριακές αποικίες που έχουν μεταμορφωθεί με τον πλασμιδιακό φορέα (p-alter1) που φέρει κλωνοποιημένο το ξένο DNA (prm1). Στη συνέχεια 2 ml θρεπτικού υλικού TYP (1.6% w/v Bacto-tryptone, 1.6% w/v yeast extract, 0.5% w/v NaCl, 0.25% w/v KB2BHPOB4B) που περιέχουν και το αντιβιοτικό επιλογής (12.5 μg/ml τετρακυκλίνη) εμβολιάζονται με τις αντίστοιχες αποικίες και επωάζονται υπό ανακίνηση στους 37 C για 16 ώρες. Με 100 μl από την καλλιέργεια αυτή εμβολιάζονται 5 ml θρεπτικού υλικού TYP (12.5 μg/ml τετρακυκλίνη) και η επώαση που ακολουθεί γίνεται υπό έντονη ανάδευση σε κωνική φιάλη των 250 ml για 30 λεπτά στους 37 C. Η βακτηριακή καλλιέργεια επιμολύνεται με 40 μl αιωρήματος του φάγου R408 (Promega) και συνεχίζεται η επώαση για 6-16 ώρες στους 37 C. Η ύπαρξη KB2BHPOB4B στο θρεπτικό υγρό της καλλιέργειας, καθώς και η επώαση για όσο το δυνατόν περισσότερες ώρες βελτιώνουν την απόδοση σε μονόκλωνο DNA. Η συλλογή των βακτηριοφάγων γίνεται στο υπερκείμενο που προκύπτει από δύο συνεχόμενες φυγοκεντρήσεις των 15 λεπτών η κάθε μία σε 12000 x g. Για να αυξηθεί η καθαρότητα του ssdna γίνεται επώαση του υπερκειμένου για 15 λεπτά στους 37 C παρουσία DNase I και RNase A. Οι φάγοι παραλαμβάνονται από το υπερκείμενο με προσθήκη 0.25 όγκων διαλύματος κατακρημνίσεως φάγων (3.75 Μ οξικό 73

αμμώνιο, 20% πολυαιθύλενογλυκόλη, ph 7.5), παραμονή για 30 λεπτά στους 4 C και φυγοκέντρηση για 15 λεπτά σε 12000 x g. Μετά την προσεκτική απομάκρυνση όλου του υπερκειμένου, το ίζημα αιωρείται σε 400 μl ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8.0) και το αιώρημα μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου. Η λύση των φάγων επιτυγχάνεται με την προσθήκη 400 μl χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (24:1), έντονη ανακίνηση για 1 λεπτό και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε 12000 x g. Η υδατική στοιβάδα που περιέχει το DNA του φάγου μεταφέρεται σε νέο σωλήνα όπου το DNA εκχυλίζεται με φαινόλη:χλωροφόρμιο:ισοαμυλική αλκοόλη (25:24:1) σε ΤΕ και μετά από έντονη ανακίνηση 1 λεπτού φυγοκεντρείται σε 12000 x g για 5 λεπτά. Η διαδικασία της εκχύλισης επαναλαμβάνεται ώστε να παραληφθεί όσο το δυνατόν καθαρότερο ssdna. Στην υδατική στοιβάδα γίνεται προσθήκη 0.5 όγκων από οξικό αμμώνιο 7.5 Μ, 2 όγκων απόλυτης αιθανόλης και αφήνεται στους -20 C για 30 λεπτά ώστε να κατακρημνιστεί το DNA. Μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε 12000 x g, το ίζημα πλένεται με 70% αιθανόλη και επαναφυγοκεντρείται. Το DNA διαλύεται σε 20 μl ddhb2bo και η απόδοση σε ssdna εκτιμάται με ηλεκτροφόρηση 2 μl από το διάλυμα σε πηκτή αγαρόζης 1%. Οι κύριες ζώνες που εμφανίζονται είναι δύο, μία για το μονόκλωνο DNA και μία για το DNA του φάγου. Επίσης, μερικές φορές μπορεί να εμφανιστούν και υπολείμματα από το χρωμοσωμικό DNA και RNA των βακτηρίων. Β.25. Σημειακή in vitro ολιγονουκλεοτιδίου-κατευθυνόμενη μετάλλαξη (216, 218) Η μέθοδος στηρίζεται στον υβριδισμό ενός συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου συμπληρωματικού ως προς το μονόκλωνο εκμαγείο στο οποίο γίνεται η σημειακή μετάλλαξη. Το ολιγονουκλεοτίδιο φέρει τη μετάλλαξη στο κέντρο του μορίου, ενώ τα άκρα του παραμένουν συμπληρωματικά ως προς το εκμαγείο. Οι συνθήκες πραγματοποίησης της αντίδρασης είναι τέτοιες, ώστε να ευνοούν τον εξειδικευμένο υβριδισμό του ολιγονουκλεοτιδίου στην επιθυμητή περιοχή του γονιδίου. Η επιμήκυνση της αλυσίδας του DNA γίνεται με εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο από μία DNA πολυμεράση, ενώ η δημιουργία του φωσφοδιεστερικού δεσμού στο χάσμα μεταξύ εκκινητή και κλώνου γίνεται από μία λιγάση. Η επιλογή των μεταλλαγμάτων γίνεται με τη χρήση αντιβιοτικού, στο οποίο ο πλασμιδιακός φορέας προσδίδει ανθεκτικότητα. Για να παραχθούν δίκλωνα μεταλλαγμένα μόρια DNA στα βακτηριακά κύτταρα, τα οποία μεταμορφώνονται με το DNA που φέρει τη μετάλλαξη μόνο στον ένα κλώνο, πρέπει να λείπουν τα γονιδιακά στοιχεία που προκαλούν την in vivo επιδιόρθωση των μεταλλάξεων (κύτταρα ES 1301 muts). Οι δίκλωνοι 74

P 5 μεταλλαγμένοι κλώνοι που παραλαμβάνονται από αυτά, μεταμορφώνουν βακτηριακά κύτταρα JM 109 τα οποία επιτρέπουν τη δημιουργία πολλών αντιγράφων πλασμιδιακού DNA. Ο έλεγχος για την ύπαρξη της μετάλλαξης στο γονίδιο γίνεται με την ενζυμική μέθοδο Sanger. R Συγκεκριμένα στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το Altered SitesP P II, in vitro mutagenesis system της εταιρίας Promega. Με βάση αυτό, το κλωνοποιημένο σε πλασμιδιακό φορέα p-alter1 γονίδιο της prm1, αφού έχει γίνει μονόκλωνο με τη βοήθεια φάγων, υφίσταται τη διαδικασία υβριδισμού με τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (βλ. Πίνακα B.3.). UΠίνακας Β.3.U Ακολουθία των μεταλλαγμένων ολιγουνεοκλεοτιδίων SerP 9 Μετάλλαξη 9 P AlaP P Ακολουθία μεταλλαγμένου ολιγονουκλεοτιδίου 5 P-CTCCTGCTTTTGGCGCGGCAGCATCG-3 SerP SerP 11 13 11 P AlaP P 13 P AlaP P Απαλοιφή P 11 PSRSRP 13 5 P-CATCTGCTCCTGGCTTTGCTGCGGCA-3 5 P-CGGCGGCATCTGGCCCTGCTTTTGCT-3 P GCGACGGCGGCATCTGCTCCTGCAGCATCGGTATCTGGCCAT -3 Η αντίδραση υβριδισμού εκτελείται με την προσθήκη 2 μl ssdna (0.1 μg) ως εκμαγείο, 1 μl ολιγονουκλεοτιδίου μετάλλαξης (30 ng/μl), 1 μl Ampicillin Repair Oligo (2.2 ng/μl) το οποίο επαναφέρει την ανθεκτικότητα του πλασμιδίου στην αμπικιλλίνη, και 2 μl 10x διαλύματος υβριδισμού (200 mm Tris-Cl, 100 mm MgClB2B, 500 mm NaCl ph 7.5) σε 14 μl ddhb2bo. Το μίγμα της αντίδρασης αφήνεται για 5 λεπτά στους 75 C σε υδατόλουτρο και με απομάκρυνση του σκεύους της επώασης από την πηγή θερμότητας γίνεται αργή ψύξη του μίγματος σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο τρόπος αυτός επιτρέπει τον εξειδικευμένο υβριδισμό του ολιγονουκλεοτιδίου στο εκμαγείο. Ακολουθεί η σύνθεση του μεταλλαγμένου κλώνου, προσθέτοντας στο μίγμα της αντίδρασης υβριδισμού 3 μl 10x διαλύματος σύνθεσης (100 mm Tris-Cl, 5 mm dntps, 10 mm ATP, 20 mm DTT ph 7.5), 1.2 μl T4 DNA polymerase (BioLabs), 1 μl T4 DNA ligase (BioLabs) και 4.8 μl ddhb2bo. Το διάλυμα επωάζεται για 90 λεπτά στους 37 C. 75

Σχήμα Β.1. Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας εισαγωγής σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της SRPK1 με το in vitro σύστημα Altered Sites II της εταιρίας Promega. Από το διάλυμα σύνθεσης του μεταλλαγμένου κλώνου αφαιρούνται 15 μl με τα οποία μεταμορφώνονται βακτηριακά κύτταρα ES 1301 muts. Αυτά αναπτύσσονται σε τρυβλία LB/άγαρ με 100 μg/ml αμπικιλλίνη και μετά από επιλογή και ανάπτυξη των αποικιών σε υγρό θρεπτικό υλικό LB με αμπικιλλίνη (100 μg/ml), γίνεται απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση. Χρησιμοποιώντας 1 μl του DNA αυτού, μεταμορφώνονται κύτταρα JM 109 και αφού αναπτυχθούν σε τρυβλία LB/άγαρ (100 μg/ml αμπικιλλίνη) γίνεται επιλογή 76

μερικών αποικιών και απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Με εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων διαπιστώνεται η ύπαρξη θετικού μεταλλαγμένου κλώνου σε κάποια αποικία. Ο μεταλλαγμένος κλώνος της prm1 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t, καθώς και στους pflag-cmv-2 και pegfp-n1 για την έκφραση των κλώνων ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτήρια και για την παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων, αντίστοιχα. Β.26. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) (216) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα με υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους, αφ ενός κατάλληλους προαγωγείς που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και αφ ετέρου το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί προϊόν σύντηξης με την GST. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με στήλη αγχιστείας που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το εκχύλισμα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST με τη γλουταθειόνη, με αποτέλεσμα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται με την προσθήκη διαλύματος γλουταθειόνης σε περίσσεια και εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτημα να γίνεται σε πολύ ήπιες συνθήκες χωρίς να υπάρχει κίνδυνος αλλαγών στη δομή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν με τον τρόπο αυτό είναι το αμινο-τελικό άκρο του LBR (GST-wtNt), η μεταλλαγμένη μορφή του χωρίς την αλληλουχία αργινίνης/σερίνης (GST-ΔRS), το αμινο-τελικό άκρο από το οποίο έχουν αφαιρεθεί τα αμινοξέα 1 έως 61 (GST-(62-205)), το αμινο-τελικό άκρο από το οποίο έχουν αφαιρεθεί τα αμινοξέα 1 έως 91 (GST-(92-205)) και το τμήμα εκείνο του αμινο-τελικού άκρου που περιέχει τα αμινοξέα 62 έως 92 (GST-(62-92)) Εκφράστηκαν επίσης η πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της (GST-prm1, GST-prm1(9SA),P PGST-prm1(11SA), GST-prm1(13SA),P PGST-prm1Del), καθώς και η SRPK1 (GST-SRPK1). Ο πλασμιδιακός φορέας, στον οποίο είναι κλωνοποιημένα τα παραπάνω γονίδια είναι ο pgex-2t (Pharmacia) που φέρει το γονίδιο της GST. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Τα 77

βακτηριακά κύτταρα (XL1/B) που έχουν μεταμορφωθεί με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τρυβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Από την καλλιέργεια που προκύπτει αφαιρούνται 10 ml με τα οποία εμβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού LB που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C, μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων γίνει ίση με ΑB590B=0.6-0.7. Τη δεδομένη χρονική στιγμή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG που ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες κυτταρικές πρωτεΐνες, καθώς και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις πρωτεολυτικών ενζύμων. Η επώαση συνεχίζεται για 1.5-2.5 ώρες και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση 15 λεπτών σε 4000 x g. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου, το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 8 ml διαλύματος PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l NaB2BHPOB4B, 0.2 gr/l KHB2BPOB4B, 1% Triton X-100, 0.1% β-μερκαπταιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρημα σε υπέρηχους για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά σε 8500 x g και λαμβάνεται το υπερκείμενο εκχύλισμα των πρωτεϊνών. Το υπερκείμενο αναμιγνύεται με το αιώρημα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C, ώστε να δεσμευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 λεπτά σε 3000 x g και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 λεπτά στους 4 C υπό ανάδευση. Στους κόκκους της στήλης που λαμβάνονται μετά από φυγοκέντρηση 2 λεπτών σε 3000 x g, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 λεπτών η κάθε μία, με διάλυμα που περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris-Cl ph 8.0. Τα εκλούσματα λαμβάνονται με φυγοκέντρηση 2 λεπτών σε 3000 x g και το ληφθέν υπερκείμενο που περιέχει την πρωτεΐνη σύντηξης φυλάσσεται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης μετά από κάθε χρήση αναγεννάται με διαδοχικές πλύσεις σε όξινο (0.1 M CHB3BCOONa, 0.5 M NaCl, ph 4.5) και βασικό (0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-Cl, ph 8.5) διάλυμα, τρεις φορές στους 4 C για 30 λεπτά στο κάθε διάλυμα. Η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυμα PBST. Κατά τη διαδικασία της απομόνωσης του τμήματος εκείνου του αμινο-τελικού άκρου του LBR που περιέχει τα αμινοξέα 62 έως 92 (GST-(62-92)), καθώς και της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της, χρησιμοποιήθηκε διάλυμα PBST στο οποίο η τελική ιονική 78

ισχύς είχε ρυθμιστεί ώστε να είναι 1 Μ. Αυτό οφείλεται στη διαπίστωση ότι δεν είναι δυνατή η απομόνωση πολύ βασικών πολυπεπτιδίων από τα βακτήρια παρά μόνο σε συνθήκες υψηλής ιονικής ισχύος. Β.27. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με 6 ιστιδίνες (216) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται εναλλακτικά για την έκφραση πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα και τον εύκολο καθαρισμό τους. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, την έκφραση της οποίας επιθυμούμε, κλωνοποιείται σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα ο οποίος φέρει εκτός των χαρακτηριστικών εκείνων που εξυπηρετούν την παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγάλες ποσότητες και μια αλληλουχία η οποία κωδικοποιεί έξι συνεχόμενες ιστιδίνες. Έτσι η πρωτεΐνη θα εκφραστεί με μια «ουρά» έξι ιστιδινών στο ένα της άκρο. Η μικρή αυτή αλληλουχία εξυπηρετεί τον εύκολο καθαρισμό +2 της πρωτεΐνης με μια στήλη NiP P-αγαρόζης. Η ακολουθία των 6 ιστιδινών έχει τη δυνατότητα να δεσμεύεται στη στήλη δημιουργώντας, μέσω των ιμιδαζολίων, δεσμούς συναρμογής με το δισθενές κατιόν του νικελίου. Παράλληλα στο ρυθμιστικό διάλυμα συνυπάρχει και μια μικρή συγκέντρωση ιμιδαζολίου, ώστε να αποφεύγονται μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις με τα συστατικά του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται με την προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης +2 ιμιδαζολίου το οποίο συναγωνίζεται με τις έξι ιστιδίνες για τις θέσεις δέσμευσης στο NiP P. Η πρωτεΐνη που παρασκευάστηκε με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι η p32/p34, το γονίδιο της οποίας ήταν κλωνοποιημένο στο φορέα κλωνοποίησης pet-15b και ήταν προσφορά του Dr. Göran Akusjärvi (Department of Medical Biology and Microbiology, BMC, Uppsala Univ., Sweden). Κύτταρα BL21 μεταμορφωμένα με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τρυβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Με 10 ml από την παραπάνω καλλιέργεια εμβολιάζονται 500 ml LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και επωάζονται υπό ανακίνηση στους 37 C έως ότου παρουσιάσει απορρόφηση ΑB590B=0.6-0.7. Στην καλλιέργεια προστίθενται 5 mm IPTG και η θερμοκρασία επώασης μειώνεται στους 28 C. Μετά την πάροδο 2 ωρών επώασης της καλλιέργειας υπό ανακίνηση, γίνεται φυγοκέντρηση των κυττάρων για 20 λεπτά σε 4500 x g και μετά την απόχυση του υπερκειμένου, τα κύτταρα αιωρούνται σε 8 ml ρυθμιστικού διαλύματος 50 mm NaB2BHPOB4B ph 8.0, 300 mm NaCl και 5 79

mm ιμιδαζολίου. Το αιώρημα ψύχεται σε λουτρό ξηρού πάγου/αλκοόλης και αφήνεται να ξεπαγώσει σε θερμοκρασία 4 C ώστε να υποβοηθηθεί η ρήξη των μεμβρανών, η οποία γίνεται με υπερήχηση του αιωρήματος 5 φορές, για 20 δευτερόλεπτα η καθεμία, μεσολαβώντας διαστήματα των 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να μην υπερθερμανθεί το δείγμα. Το δείγμα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά σε 8500 x g και +2 παραλαμβάνεται το υπερκείμενο. Η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης στη στήλη NiP P- αγαρόζης γίνεται υπό ανακίνηση στους 4 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί μία πλύση της στήλης για 10 λεπτά στους 4 C με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που έγινε η αιώρηση των κυττάρων και 2 πλύσεις των 10 λεπτών στην ίδια θερμοκρασία έχοντας αυξήσει τη συγκέντρωση του ιμιδαζολίου στα 50 mm. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με την ανακίνηση της στήλης για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 1 ml διαλύματος 50 mm NaB2BHPOB4B ph 8.0, 300 mm NaCl και 300 mm ιμιδαζολίου, δύο συνεχόμενες φορές. Από τα υπερκείμενα, προτού τα φυλάξουμε στους 20 C, παραλαμβάνονται δείγματα των 10 μl, ώστε μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250, να αποφανθούμε για την απόδοση της έκφρασης της πρωτεΐνης. B.28. Μέθοδος παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων (219) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων ως πρωτεΐνες σύντηξης με χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιμες. Η παροδική επιμόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή μίξη του πλασμιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυμα CaClB2B με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσμα της ανάμιξης είναι η δημιουργία κατακρημνισμάτων DNA με φωσφορικό ασβέστιο. Το κατακρημνίσματα αυτά διαπερνούν την κυτταροπλασματική μεμβράνη πιθανώς με ενδοκύττωση. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις μεταβολές του ph (βέλτιστο ph 6.9-7.2) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εμπορικά kit καθαρισμού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρμογή της μεθόδου). Τα χαρακτηριστικά της μεθόδου είναι η εντόπιση του κλωνοποιημένου πλασμιδιακού φορέα εκτός του γενώματος των κυττάρων, καθώς και η ανίχνευση και παραμονή του προϊόντος του κλωνοποιημένου γονιδίου για χρονικό διάστημα 1-4 ημερών. Επίσης, σε κάθε κυτταρική διαίρεση μόνο τα μισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασμιδιακού DNA που εισάχθηκε κατά την επιμόλυνση. 80

Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα ανθρώπινα 293Τ κύτταρα, τα οποία επιμολύνθηκαν παροδικά με τα γονίδια της prm1 και των μεταλλαγμάτων της κλωνοποιημένα στους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2 και pegfp-n1. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιμόλυνση πρέπει να καταλαμβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τρυβλίου. Το διάλυμα του DNA με το CaClB2B (250 mm CaClB2B, 20 μg/ml πλασμιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 μg/ml περιλαμβάνουν το δραστικό κλάσμα του DNA που φέρει το κλωνοποιημένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος HEPES-φωσφορικών (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm NaB2BHPOB4B ph 7.1), το μίγμα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για 20-30 λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως απομακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1 ml του αιωρήματος DNA-φωσφορικού ασβεστίου, στάγδην, στο τρυβλίο της καλλιέργειας. Τα τρυβλία αφήνονται για 20 λεπτά με παροδική ανακίνηση κάθε 10 λεπτά. Στο τρυβλίο προστίθενται 4 ml DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)/10% v/v FCS (Fetal Calf Serum-Εμβρυϊκός ορός βοδιού) με 5 μl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυμα που διασπούν το DNA, καθώς και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Στη συνέχεια, τα τρυβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία COB2B. Μετά το πέρας τεσσάρων ωρών, τα 5 ml του υγρού που έγινε η επιμόλυνση αφαιρούνται και προστίθενται εκ νέου 10 ml από το θρεπτικό υγρό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί με επώαση στους 37 C σε ατμόσφαιρα COB2B για 24 ώρες και ακολουθεί ακόμη ένας κύκλος αφαίρεσης-προσθήκης θρεπτικού μέσου και επώασης για άλλες 24 ώρες. Με τη συμπλήρωση συνολικά 48 ωρών από τη στιγμή της επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέγονται, αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης. Ακολούθως προσθέτουμε 200 μl στο τρυβλίο των 100 mm από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 μg/ml απροτινίνη και 1 mm PMSF) και τα κύτταρα αφαιρούνται από την επιφάνεια του τρυβλίου με τη βοήθεια σπάτουλας. Τα κύτταρα αφήνονται σε αιώρηση στο διάλυμα λύσης για 30 λεπτά στους 4 C και κατόπιν διαβιβάζονται συνεχόμενα μέσα από σύριγγα πολύ στενής διαμέτρου, ώστε να διαρρηχθούν εντελώς οι κυτταρικές μεμβράνες και να σπάσει το χρωμοσωμικό DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 12000 x g για 15 λεπτά στους 4 C και συλλογή του υπερκειμένου. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυλάσσεται στους 70 C και η ανίχνευση της παραγόμενης πρωτεΐνης γίνεται με ηλεκτροφόρηση 10 μl από το εκχύλισμα, 81

κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ανοσοανίχνευση με το μονοκλωνικά αντισώματα απέναντι στην FLAG αλληλουχία ή απέναντι στην πρωτεΐνη GFP. Σχήμα Β.2. Σχηματική αναπαράσταση της παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων Β.29. Απομόνωση πυρηνικού και συνολικού RNA Για την παρασκευή πυρηνικού RNA χρησιμοποιήθηκαν πυρήνες απομονωμένοι από όρχεις ποντικού, ενώ για την απομόνωση συνολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα HeLa κύτταρα. Αρχικά, οι πυρήνες ή τα κύτταρα διαλυτοποιούνται σε ένα διάλυμα που περιέχει 4 Μ θειοκυανική γουανιδίνη, 25 mm κιτρικού νατρίου ph 7.0, 0.5 % N-lauroylsarcosine και 0.1 M 2-μερκαπτοαιθανόλη σε αναλογία όγκου 1:1. Στη συνέχεια, σε 1.8 ml του εκχυλίσματος προστίθενται 0.2 ml 2 Μ οξικού νατρίου ph 4, 2 ml φαινόλης και 0.4 ml χλωροφόρμιο. Ακολουθεί έντονη ανάδευση και παραμονή στον πάγο για 15 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση σε 8500 x g για 10 λεπτά, το RNA κατακρημνίζεται με προσθήκη στην υδατική φάση ίσου όγκου ισοπροπανόλης, ανάδευση και παραμονή στους -20 C για 1 ώρα. Το ίζημα που προκύπτει μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g, ξεπλένεται με 70% αιθανόλη και επαναιωρείται σε 50 μl HB2BO-ελεύθερου από RNases. Τα δείγματα, αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωση του RNA που περιέχουν, φυλάσσονται στους -20 C. 82

Β.30. Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA μια μικρή ποσότητα του προς ανάλυση δείγματος (3 μl) αραιώνεται (600 μl) και στην συνέχεια μετρείται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Με βάση το γεγονός ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm αντιστοιχεί με 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίστηκε η ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊκού οξέος στο άγνωστο δείγμα. Ο βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων εκτιμήθηκε από τον λόγο των οπτικών τους πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm, αφού τα δείγματα υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων έχουν λόγο ODB260B/ODB280B περίπου 2. Β.31. Ηλεκτροφόρηση RNA σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση φορμαλδεΰδης Η κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης προστίθεται σε νερό και ακολουθεί θέρμανση του διαλύματος στους 100 C περίπου, ώστε να διαλυτοποιηθεί η αγαρόζη. Αφού ψυχθεί το διάλυμα και η θερμοκρασία προσεγγίσει περίπου τους 60 C, προστίθεται το 1/10 του όγκου από ένα διάλυμα που περιέχει 0.2 M MOPS, 10 mm EDTA, 50 mm οξικό νάτριο, φορμαλδεΰδη σε τελική συγκέντρωση 1% και το βρωμιούχο αιθίδιο. Μετά τον πολυμερισμό η πηκτή τοποθετείται στην συσκευή ηλεκτροφόρησης η οποία περιέχει το διάλυμα των ηλεκτροδίων (20 mm MOPS, 1 mm EDTA και 5 mm οξικό νάτριο). Στα δείγματα RNA που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν προστίθενται 2.5 μl ενός διαλύματος που περιέχει 0.2 M MOPS, 10 mm EDTA, 50 mm οξικό νάτριο, 3.5 μl φορμαλδεΰδη 37%, 10 μl φορμαμίδιο, 3 μl γλυκερόλη 50% και HB2BO-ελεύθερο από RNases μέχρι τελικού όγκου 25 μl. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται οριζόντια στα 100 ma μέχρι τα δείγματα να εισέλθουν στις θέσεις υποδοχείς και έπειτα η ένταση αυξάνει στα 150 ma μέχρι την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης. Β.32. Μεταφορά RNA από πηκτή αγαρόζης σε μεμβράνη (Northern) και χρώση της μεμβράνης (216) Η μεταφορά του RNA από την πηκτή αγαρόζης σε νάιλον μεμβράνη βασίζεται σε τριχοειδή φαινόμενα. Η πηκτή τοποθετείται πάνω σε ένα πλαστικό κουτί το οποίο εμβαπτίζεται σε ένα μικρό πλαστικό δοχείο που περιέχει το ρυθμιστικό διάλυμα της μεταφοράς (10x SSC: 1.5 M NaCl και 0.15 M κιτρικό νάτριο). Η τοποθέτηση της πηκτής 83

γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε να μην έρχεται σε απ ευθείας επαφή με το ρυθμιστικό διάλυμα αλλά να διαβρέχεται μόνο μέσω χαρτιών Whatmann, τα οποία παρεμβάλλονται ανάμεσα στην πηκτή και το πλαστικό κουτί και τα οποία έχουν προηγουμένως διαβραχεί με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Η μεμβράνη κόβεται στις διαστάσεις της πηκτής, διαβρέχεται για 15 λεπτά στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και τοποθετείται πάνω στη πηκτή. Ακολούθως προστίθενται στεγνά χαρτιά Whatmann, χαρτοπετσέτες και τέλος ένα μικρό βάρος για να γίνεται καλά η επαφή της μεμβράνης με τη πηκτή. Η μεταφορά διαρκεί περίπου 14-18 ώρες και αφού ολοκληρωθεί, ακολουθεί χρώση της μεμβράνης. Συγκεκριμένα, η μεμβράνη ξεπλένεται δύο φορές με 2x SSC για 20 λεπτά, στη συνέχεια, εμβαπτίζεται για 5 λεπτά σε 5% διάλυμα οξικού οξέος και μετά στο διάλυμα χρώσης (0.5 Μ οξικό οξύ ph 5.2 και 0.04% w/v κυανού του μεθυλενίου) για 10 λεπτά. Τέλος, ξεπλένεται 3-4 φορές με ddηb2bο για να απομακρυνθεί από την μεμβράνη η περίσσεια της χρωστικής. Β.33. Πειράματα επώασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με RNA Στα πειράματα αυτής της κατηγορίας αρχικά η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST αλληλεπιδρά με RNA και στην συνέχεια καθηλώνεται σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Αναλυτικότερα, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη επωάζεται με συγκεκριμένη ποσότητα RNA σε 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος, το οποίο περιέχει 100-750 mm KCl, 2 mm EDTA και 20 mm Hepes ph 7.5 για μία ώρα, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στη συνέχεια, ακολουθεί η δέσμευση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στα σφαιρίδια της γλουταθειόνηςσεφαρόζης, η οποία πραγματοποιείται σε 1 ml του προηγούμενου ρυθμιστικού διαλύματος για 1 ώρα στους 4 C υπό συνεχή ανάδευση. Στο στάδιο αυτό είναι δυνατόν να ακολουθηθούν δύο διαφορετικές πορείες. Στη πρώτη, το υπερκείμενο της στήλης απομακρύνεται μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g και τα σφαιρίδια ξεπλένονται τρεις φορές από 10 λεπτά στους 4 C, ώστε να απομακρυνθεί τυχόν RNA που δεν έχει δεσμευθεί στην πρωτεΐνη. Στη συνέχεια, απομακρύνεται όλο το υγρό από τα σφαιρίδια της στήλης και αυτά επαναιωρούνται σε 25 μl νερού. Αφού προστεθεί το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεΰδης, τα δείγματα φυγοκεντρούνται. Τελικά, πραγματοποιείται TM μεταφορά του δεσμευμένου RNA σε νάιλον μεμβράνη GeneScreen PlusP P και χρώση της μεμβράνης με την χρωστική μπλε του μεθυλενίου. 84

Η δεύτερη πορεία ακολουθείται προκειμένου να διερευνηθεί αν η δέσμευση νουκλεϊκών οξέων στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μεσολαβεί ώστε να δεσμευτεί μια δεύτερη πρωτεΐνη. Συγκεκριμένα, μετά την καθήλωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με το δεσμευμένο RNA στη στήλη, ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2 mm MgClB2B, 1% Triton X-100 για 10 λεπτά στους 4 C. Στη συνέχεια, σε 250 μl του προηγούμενου διαλύματος προστίθεται η πρωτεΐνη της οποίας την αλληλεπίδραση θέλουμε να μελετήσουμε. Η επώαση γίνεται για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος υπό συνεχή ανακίνηση. Τα σφαιρίδια ξεπλένονται τρεις φορές για 10 λεπτά στους 4 C και απομακρύνεται όλο το υγρό. Επαναιωρούνται σε διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων που χρησιμοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Οι πρωτεϊνικές ζώνες εμφανίζονται μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R- 250. Β.34. Πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας νουκλεϊκών οξέων (Electrophoretic shift mobility assays) Τα πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας νουκλεϊκών οξέων στηρίζονται στην ιδιότητα των συμπλόκων νουκλεϊκών οξέων-πρωτεϊνών να μετακινούνται πιο αργά μέσα από τους πόρους μιας πηκτής αγαρόζης από ότι το νουκλεϊκό οξύ μόνο του. Τα νουκλεϊκά οξέα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν trna, συνολικό RNA, πυρηνικό RNA και ένα τμήμα DNA του γονιδίου της SRPK1a που περιλάμβανε τα νουκλεοτίδια 1-513. Οι πρωτεΐνες με τις οποίες επωάστηκαν τα παραπάνω νουκλεϊκά οξέα ήταν η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92) και η GST-(62-92) η οποία προηγουμένως είχε φωσφορυλιωθεί είτε από την GST-SRPK1 είτε από μεσοφασικό ή μιτωτικό εκχύλισμα από HeLa κύτταρα. Συγκεκριμένα, η επώαση νουκλεϊκών οξέων με πρωτεΐνες πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα επώασης που περιέχει 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 50-500 mμ KCl, 2.5 mm EDTA, 5% γλυκερόλη και 0.5 mg/ml αλβουμίνη. Η επώαση γίνεται σε συνολικό όγκο 20 μl για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στη συνέχεια, στα δείγματα προστίθενται 5 μl του διαλύματος διαλυτοποίησης των δειγμάτων, ηλεκτροφορούνται σε 1% πηκτή αγαρόζης και παρατηρείται η αλλαγή της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του δεσμευμένου νουκλεϊκού οξέος, σε σύγκριση με το αντίστοιχο νουκλεϊκό οξύ το οποίο δεν έχει επωαστεί με πρωτεΐνη. 85

Β.35. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού (220) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πρωτεϊνών σε γεννητικά κύτταρα τα οποία έχουν απομονωθεί από το σπερματοφόρο σωληνίσκο ποντικού. Η απομόνωση των κυττάρων γίνεται σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφουν οι Parvinen και Vanha-Perttula (220). Η τεχνική έχει ως βάση το γεγονός ότι τα στάδια της σπερματογένεσης μπορούν να αναγνωριστούν σε πρόσφατα απομονωμένους σωληνίσκους με τη βοήθεια στερεομικροσκοπίου. Ο σωληνίσκος παρουσιάζει διαφορετικά επίπεδα απορρόφησης του διερχόμενου φωτός ανάλογα με το στάδιο της διαφοροποίησης των κυττάρων που βρίσκονται σ αυτόν. Έτσι σύμφωνα με το μέγεθος του πυρήνα, του βαθμού συμπύκνωσης της χρωματίνης και της μορφολογικής ανάπτυξης του ακροσώματος των κυττάρων, ο σωληνίσκος παρουσιάζει περιοχές διαφορετικής φωτεινότητας. Σύμφωνα με τα παραπάνω, στα στάδια I-VI παρουσιάζονται σκοτεινές κηλίδες πάνω στο φωτεινό υπόβαθρο του σωληνίσκου, το τμήμα των σταδίων VII-VIII απορροφά σχεδόν πλήρως το φως και εμφανίζεται ως μια σκούρα συνεχής σκοτεινή περιοχή, ενώ στα στάδια IX-XII η απορρόφηση είναι πολύ ασθενής και ο σωληνίσκος παρουσιάζεται διαπερατός από το φως. Μεγαλύτερη ακρίβεια στην απομόνωση συγκεκριμένων σταδίων είναι δυνατή με τη χρήση μικροσκοπίας phase-contrast, όπου το κάθε στάδιο αναγνωρίζεται χωριστά ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων που περιέχονται στο επιθήλιο. Ο ανοσοφθορισμός βασίζεται στην αλληλεπίδραση των κατάλληλων αντισωμάτων με τα αντίστοιχα αντιγόνα τους που βρίσκονται στις διάφορες υποκυτταρικές περιοχές των απομονωμένων γεννητικών κυττάρων. Περαιτέρω επεξεργασία με δεύτερα αντισώματα, τα οποία φέρουν συζευγμένες φθορίζουσες ομάδες επιτρέπει τον εντοπισμό των πρωτεϊνών στα κύτταρα. Ο φθορισμός επιτυγχάνεται με την επίδραση φωτός κατάλληλου μήκους κύματος, το οποίο προσπίπτει κάθετα στο επίπεδο των δειγμάτων. Η παρατήρηση γίνεται με τη χρήση μικροσκοπίου το οποίο φέρει κατάλληλους φακούς και φίλτρα απορρόφησης του φωτός. Σχήμα Β.3. Σχηματική αναπαράσταση των σταδίων της σπερματογένεσης σε σωληνίσκο όρχεως ποντικού όπως αυτός εμφανίζεται σε στερεομικροσκόπιο. 86

Αναλυτικότερα η διαδικασία που ακολουθείται στην παρούσα εργασία είναι η εξής. Όρχεις ενηλίκου ποντικού αφού τους αφαιρεθεί το εξωτερικό υμένιο εμβαπτίζονται σε τρυβλίο που περιέχει διάλυμα PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l NaB2BHPOB4B, 0.2 gr/l KHB2BPOB4B). Αυτό τοποθετείται κάτω από το φακό στερεομικροσκοπίου και με τη βοήθεια λαβίδας ευθυγραμμίζονται οι σωληνίσκοι. Μετά την αναγνώριση των σταδίων VII και VIII αποκόπτονται και τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρο πλάκα η οποία είχε επεξεργαστεί προηγουμένως με διάλυμα πολύ-λυσίνης 100 μl/ml για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Με τη βοήθεια phase contrast μικροσκοπίας βρίσκεται το ακριβές στάδιο της σπερματογένεσης και σημειώνεται στο πλακίδιο. Τα κύτταρα απλώνονται προσεκτικά στην αντικειμενοφόρο πλάκα και αφήνονται να προσκολληθούν σ αυτή για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα υφίστανται δύο πλύσεις των 10 λεπτών με PBS, 2 mm MgClB2B και στερεώνονται σε διάλυμα PBS, 4% παραφορμαλδεΰδη (PAF) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 15 λεπτά. Ακολουθούν δύο πλύσεις με διάλυμα PBS, 50 mm NHB4BCl για 5 λεπτά και τα κύτταρα γίνονται διαπερατά με διάλυμα PBS, 0.2% Triton X-100 για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Τα κύτταρα πλένονται δύο φορές με διάλυμα PBS και επωάζονται με το πρώτο αντίσωμα (α-prm1 ή α-lbr) για 45 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και αραίωση 1:100. Μετά από τρεις πλύσεις των 5 λεπτών με PBS ακολουθεί επώαση με το δεύτερο αντίσωμα Cy3 που φέρει τη φθορίζουσα ομάδα, για 30 λεπτά και αραίωση 1:500. Τα κύτταρα πλένονται τρεις φορές με διάλυμα PBS για 5 λεπτά και ακολουθεί επώαση με τη χρωστική ουσία DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) για τη χρώση του πυρήνα των κυττάρων, τέλος τα κύτταρα επικαλύπτονται με πλακίδια. Η λήψη των φωτογραφιών γίνεται σε μικροσκόπιο DMLB Leica με λάμπα HBO 100-W. 87

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΡΟΣ Α Γ.1. UΜελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινο-τελικού τμήματος του LBR μεu Uσυστατικά της χρωματίνης των σωματικών κυττάρων Γ.1.1. Έκφραση του αμινο-τελικού τμήματος του υποδοχέα της Β λαμίνης ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt), καθώς και του μεταλλάγματος από το οποίο έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία (GST-ΔRS) Από προηγούμενες εργασίες ήταν γνωστό ότι ο LBR που έχει απομονωθεί από τον πυρηνικό φάκελο ερυθροκυττάρων γαλοπούλας, αλληλεπιδρά τόσο με πολυνουκλεοσώματα όσο και με μιτωτικά χρωμοσώματα (102). Προκειμένου να προσδιοριστεί το τμήμα του LBR μέσω του οποίου πραγματοποιείται η αλληλεπίδραση αυτή, εκφράστηκε αρχικά το υδρόφιλο αμινο-τελικό άκρο του, το οποίο προεξέχει στο πυρηνόπλασμα, ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt). Για την έκφραση της πρωτεΐνης σε βακτήρια χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί το τμήμα του γονιδίου του LBR, το οποίο κωδικοποιεί την αμινο-τελική περιοχή του, που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1-205. Στη συνέχεια, βακτηριακά κύτταρα XL-1/Β τα οποία μετασχηματίστηκαν με τον παραπάνω ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα, αναπτύχθηκαν στους 37 C, με έντονη ανάδευση, μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει 0.6-0.7. H επαγωγή της σύνθεσης των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 5 mm IPTG, για χρονικό διάστημα 1.5 ωρών στους 27 C, γιατί επαγωγή μεγαλύτερης διάρκειας είχε σαν αποτέλεσμα την εκτεταμένη πρωτεόλυση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Ακολούθησε καθαρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-wtNt και έκλουση της από την στήλη γλουταθειόνηςσεφαρόζης με βάση την μεθοδολογία που περιγράφεται στην παράγραφο Β.26. Από τα εκλούσματα της στήλης παρελήφθησαν 10 μl τα οποία ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες. Η επιτυχής έκφραση της πρωτεΐνης ταυτοποιήθηκε μετά από βαφή της πηκτής με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, καθώς και με ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του R1 πεπτιδίου του αμινο-τελικού άκρου του LBR, που βρίσκεται ακριβώς πριν από την RS ακολουθία (βλ. σχήμα Γ.1.Α, περισσότερες πληροφορίες στην παράγραφο Β.10). Η 88

πρωτεΐνη σύντηξης εμφανίζεται στην πηκτή ως μία ζώνη που αντιστοιχεί σε μοριακή μάζα ~51 kda, ενώ εμφανίζονται και ζώνες μικρότερης μοριακής μάζας που αντιστοιχούν σε προϊόντα πρωτεόλυσης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-wtNt. UΣχήμα Γ.1.U Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα του αμινο-τελικού άκρου του LBR ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt) και της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης από την οποία έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία (GST-ΔRS). (A) Σχηματική αναπαράσταση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GSTwtNt και GST-ΔRS. Στο σχήμα απεικονίζεται το R1 πεπτίδιο που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη πολυκλωνικού αντισώματος, καθώς και η RS ακολουθία του LBR που απουσιάζει από την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη GST-ΔRS. (B) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 των πρωτεϊνών GST, GST-wtNt και GST-ΔRS. (Γ) Ανοσοανίχνευση των εκφρασμένων πρωτεϊνών με πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο R1 του αμινο-τελικού τμήματος του LBR. 89

Παράλληλα, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης, εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST και η μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης από την οποία έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία. Η διαδικασία που ακολουθείται για την έκφραση και τον καθαρισμό της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης (GST-ΔRS) είναι ακριβώς η ίδια με αυτή της GST-wtNt, ενώ στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου εμφανίζεται ως μία ζώνη με ελαφρώς μικρότερη μοριακή μάζα από το μη μεταλλαγμένο τμήμα. Γ.1.2. Αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού τμήματος του LBR και του αμινοτελικού τμήματος από το οποίο απουσιάζει η RS ακολουθία με πολυνουκλεοσώματα Στη συνέχεια, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST-wtNt και GST-ΔRS χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα αλληλεπίδρασης με πολυνουκλεοσώματα που απομονώθηκαν από πυρήνες ερυθροκυττάρων γαλοπούλας, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.14. Συγκεκριμένα, αφού οι πρωτεΐνες GST-wtNt και GST-ΔRS επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ή χωρίς πολυνουκλεοσώματα (40 μg πρωτεΐνης), τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο και το ίζημα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Ακολούθησε μεταφορά των πρωτεϊνικών ζωνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο R1 πεπτίδιο. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.2.B, απουσία των νουκλεοσωμάτων η GST-wtNt εντοπίζεται αποκλειστικά στο υπερκείμενο. Αντίθετα, παρουσία νουκλεοσωμάτων ένα μεγάλο μέρος της ανιχνεύεται στο ίζημα, αφού αλληλεπιδρά με τα νουκλεοσώματα με αποτέλεσμα να καθιζάνει μαζί με αυτά. Την ίδια περίπου συμπεριφορά παρουσιάζει και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GTS-ΔRS, δηλαδή η αμινο-τελική περιοχή του LBR από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία (σχήμα Γ.2.Γ), γεγονός που υποδηλώνει ότι η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία των διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης δεν φαίνεται να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην δέσμευση του αμινο-τελικού άκρου του LBR στα πολυνουκλεοσώματα. 90

UΣχήμα Γ.2.U Αλληλεπίδραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-wtNt και GST-ΔRS με πολυνουκλεοσώματα ερυθροκυττάρων γαλοπούλας. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDSπηκτή πολυακρυλαμιδίου των πρωτεϊνών GST-wtNt και GST-ΔRS μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (B) Διαδρομές 1 και 2: Ανοσοανίχνευση της πρωτεΐνης GST-wtNt στο ίζημα και στο υπερκείμενο, αντίστοιχα μετά από κατακρήμνιση της απουσία νουκλεοσωμάτων. Διαδρομές 3 και 4: Ανοσοανίχνευση της πρωτεΐνης GST-wtNt στο ίζημα και στο υπερκείμενο, αντίστοιχα μετά από επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με πολυνουκεοσώματα (40 μg πρωτεΐνης) και φυγοκέντρηση για 20 min σε 13.000 x g. (Γ) Διαδρομές 1 και 2: Ανοσοανίχνευση της πρωτεΐνης GST-ΔRS στο ίζημα και στο υπερκείμενο, αντίστοιχα μετά από κατακρήμνιση της απουσία πολυνουκλεοσωμάτων. Διαδρομές 3 και 4: Ανοσοανίχνευση της πρωτεΐνης GST-ΔRS στο ίζημα και στο υπερκείμενο, αντίστοιχα μετά από επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με πολυνουκλεοσώματα (40 μg πρωτεΐνης) και φυγοκέντρηση για 20 min σε 13.000 x g. Και στο (Β) και στο (Γ) από τα υπερκείμενα ηλεκτροφορήθηκαν 50 μl (το 1/4 του συνολικού όγκου, η δοκιμασία αλληλεπίδρασης γίνεται σε συνολικό όγκο 200 μl, βλ. και παράγραφο Β.14). Γ.1.3. Έκφραση της κινάσης SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST και φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του αμινο-τελικού τμήματος του LBR Προκειμένου να μελετηθεί αν η αλληλεπίδραση του LBR με τα πολυνουκλεοσώματα ρυθμίζεται με φωσφορυλίωση των RS διπεπτιδίων του από την SRPK1 κινάση με την οποία εντοπίζεται στο ίδιο σύμπλοκο (28, 39, 60), η SRPK1 εκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST. Για την έκφραση της πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε και σε αυτή τη περίπτωση ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί το γονίδιo της ανθρώπινης SRPK1. Ακολούθησε καθαρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 91

GST-SRPK1 και έκλουση της από την στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης με βάση την μεθοδολογία που περιγράφεται στην παράγραφο Β.26. Ο χρόνος της επαγωγής της σύνθεσης στα βακτήρια ήταν 2 ώρες στους 27 C, παρουσία 5 mm IPTG. Μετά την έκλουση από την στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης, 10 μl από το έκλουσμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Η ανασυνδυασμένη κινάση εμφανίζεται στην πηκτή ως μία ζώνη που αντιστοιχεί σε μοριακή μάζα ~120 kda, ενώ εμφανίζεται και μία ζώνη περίπου στα 28 kda που αντιστοιχεί στην GST. Το γεγονός ότι η πρωτεϊνική ζώνη των ~120 kda αντιστοιχεί στην SRPK1 επιβεβαιώθηκε και με ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα που είχε αναπτυχθεί στο εργαστήριο μας απέναντι στην ανασυνδυασμένη SRPK1. Σχήμα Γ.3. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της SRPK1 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST- SRPK1). (A) Ηλεκτροφορητική εικόνα της GST-SRPK1 σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. Η GST-SRPK1 αντιστοιχεί στη ζώνη με μοριακή μάζα ~120 kda, ενώ η ζώνη με μοριακή μάζα ~28 kda αντιστοιχεί στην GST. (Β) Ανοσοανίχνευση της GST-SRPK1 με χρήση κατάλληλου πολυκλωνικού αντισώματος. Διακρίνεται η πλήρους μήκους ανασυνδυασμένη κινάση, καθώς και κάποιο ποσό GST στο ύψος του μάρτυρα των 29 kda. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε αν η ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 είναι δραστική και φωσφορυλιώνει RS ακολουθίες. Ως υποστρώματα χρησιμοποιήθηκαν ολόκληρος ο LBR που είχε απομονωθεί από ερυθροκύτταρα γαλοπούλας, καθώς και οι ανασυνδυασμένες 92

πρωτεΐνες GST-wtNt και GST-ΔRS. Το μίγμα επώασης περιείχε 0.5 μg καθαρής ανασυνδυασμένης GST-SRPK1, 2-3 μg υποστρώματος και 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm 32 MgClB2B, 80 mμ NaCl, 25 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 30 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Από το σχήμα Γ.4 προκύπτει ότι η κινάση GST-SRPK1 φωσφορυλιώνει αποτελεσματικά τον LBR και την πρωτεΐνη GST-wtNt, αφού στις δύο αυτές πρωτεΐνες υπάρχει άθικτη η RS ακολουθία. Αντίθετα, αδυνατεί να φωσφορυλιώσει την GST-ΔRS από την οποία έχουν αφαιρεθεί τα RS διπεπτίδια. Σχήμα Γ.4. Έλεγχος δραστικότητας της ανασυνδυασμένης κινάσης GST-SRPK1. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου των πρωτεϊνών LBR, GST-wtNt και GST-ΔRS μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) Φωσφορυλίωση των παραπάνω πρωτεϊνών από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1. Στη φωτογραφία παρουσιάζονται οι ραδιενεργές ζώνες των LBR και GST-wtNt, όπως εμφανίζονται στο φιλμ μετά από αυτοραδιογραφία της αντίστοιχης πηκτής. Γ.1.4. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης του φωσφορυλιωμένου αμινο-τελικού τμήματος του LBR με πολυνουκλεοσώματα Η φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη GST-wtNt επωάστηκε εκ νέου με ή χωρίς πολυνουκλεοσώματα (βλ. και παράγραφο Γ.1.2). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και οι ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες του ιζήματος και του υπερκειμένου αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Η φωσφορυλίωση της GST-wtNt 93

από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 πραγματοποιήθηκε, όπως ακριβώς αναφέρθηκε στην προηγούμενη παράγραφο. Όπως αναμένεται η φωσφορυλιωμένη μορφή του αμινο-τελικού τμήματος του LBR απουσία νουκλεοσωμάτων εντοπίζεται εξ ολοκλήρου στο υπερκείμενο (βλ. σχήμα Γ.5). Αντίθετα, η προσθήκη νουκλεοσωμάτων έχει ως αποτέλεσμα τη συγκαθίζηση της πρωτεΐνης σύντηξης, με αποτέλεσμα το μεγαλύτερο μέρος της να ανιχνεύεται στο ίζημα, ενώ στο υπερκείμενο ανιχνεύεται ένα μικρό ποσοστό. Τα αποτελέσματα του παραπάνω πειράματος είναι παρόμοια με εκείνα που πήραμε στις δοκιμασίες αλληλεπίδρασης της μη φωσφορυλιωμένης GST-wtNt με τα πολυνουκλεοσώματα (βλ. σχήμα Γ.2), γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση των RS διπεπτιδίων από την πρωτεϊνική κινάση SRPK1 δεν παίζει ουσιαστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση αυτή. Το ίδιο αποτέλεσμα προέκυψε και όταν η δοκιμασία αλληλεπίδρασης έγινε, όχι με επισημασμένη πρωτεΐνη, αλλά με την GST-wtNt η οποία είχε φωσφορυλιωθεί εξαντλητικά από την SRPK1 παρουσία μεγάλης περίσσειας ψυχρού ATP. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση της πρωτεΐνης GST-wtNt στο υπερκείμενο και στο ίζημα μετά την φυγοκέντρηση, έγινε με ανοσοανίχνευση, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Γ.1.2 (αποτέλεσμα που δεν δείχνεται). Σχήμα Γ.5. Αλληλεπίδραση της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης GST-wtNt με πολυνουκλεοσώματα ερυθροκυττάρων γαλοπούλας. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου της πρωτεΐνης GST-wtNt μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (B) Διαδρομές 1 και 2: Φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη GST-wtNt στο ίζημα και στο υπερκείμενο, αντίστοιχα μετά από κατακρήμνιση της απουσία νουκλεοσωμάτων. Διαδρομές 3 και 4: Φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη GST-wtNt στο ίζημα και στο υπερκείμενο, αντίστοιχα μετά από επώαση 94

για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με πολυνουκλεοσώματα (40 μg πρωτεΐνης) και φυγοκέντρηση για 20 min σε 13.000 x g. Στη φωτογραφία παρουσιάζονται οι ραδιενεργές ζώνες της GST-wtNt όπως εμφανίζονται στο φιλμ μετά από αυτοραδιογραφία της αντίστοιχης πηκτής. Και στο (Β) και στο (Γ) από τα υπερκείμενα ηλεκτροφορήθηκαν 50 μl (το 1/4 του συνολικού όγκου, η δοκιμασία αλληλεπίδρασης γίνεται σε συνολικό όγκο 200 μl, βλ. και παράγραφο Β.14). Γ.1.5. Μελέτη της αλληλεπίδρασης ιστονών με το αμινο-τελικό τμήμα του υποδοχέα της λαμίνης Β Προκειμένου να βρεθεί ποιο από τα συστατικά των νουκλεοσωμάτων είναι υπεύθυνο για την αλληλεπίδραση με το αμινο-τελικό άκρο του LBR, αρχικά πραγματοποιήθηκαν πειράματα συγκατακρήμνισης μίγματος ιστονών (που προμηθευτήκαμε από το εμπόριο) με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.11. Το μίγμα ιστονών περιέχει τις ιστόνες Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4. Συγκεκριμένα, σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης καθηλώθηκαν οι πρωτεΐνες GST και GST-wtNt. Ακολούθησε επώαση των πρωτεϊνών GST και GST-wtNt με μίγμα ιστονών για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 2 mm MgClB2B και 1% Triton X-100. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και θέρμανση για 5 λεπτά στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. Όπως προκύπτει από το σχήμα Γ.6, το αμινοτελικό άκρο του LBR έχει την ικανότητα να συγκατακρημνίζει δύο ιστόνες από το μίγμα των ιστονών, ενώ αντίθετα κάτι ανάλογο δεν παρατηρείται με την GST. Η επώαση των ιστονών με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt πραγματοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ αλάτι και 1% Triton X-100, ώστε αφ ενός να διασφαλιστεί ότι οι ιστόνες θα παραμείνουν διαλυτές και αφ ετέρου να περιοριστούν οι τυχαίες αλληλεπιδράσεις, ώστε η παρατηρούμενη δέσμευση να είναι εξειδικευμένη. 95

Σχήμα Γ.6. Έλεγχος της δέσμευσης μίγματος ιστονών στις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST και GST-wtNt. Διαδρομή 1: Μίγμα ιστονών. Διαδρομή 2: Ιστόνες που συγκατακρημνίστηκαν με την GST. Διαδρομή 3: Ιστόνες που συγκατακρημνίστηκαν με την GST-wtNt. Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. Για να διαπιστωθεί ποιες από τις ιστόνες του μίγματος δεσμεύονται στον LBR επαναλήφθηκε το προηγούμενο πείραμα με την διαφορά ότι στην περίπτωση αυτή έγινε επώαση καθαρών ιστονών (που προμηθευτήκαμε από το εμπόριο) με το αμινο-τελικό άκρο του LBR. Αναλυτικότερα, οι ιστόνες Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 επωάστηκαν με την πρωτεΐνη GST-wtNt, που είχε προηγουμένως δεσμευτεί σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες που δεσμεύθηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.7, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt συγκατακρημνίζει εκλεκτικά τις ιστόνες Η3 και Η4, ενώ αντίθετα κάτι τέτοιο δεν παρατηρείται για τις Η1, Η2Α και Η2Β. 96

Σχήμα Γ.7. Έλεγχος της δέσμευσης καθαρών ιστονών στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Αφού οι ιστόνες Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 (2-3 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με την ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST-wtNt (~2 μg), οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η1. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η1 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 3: Καθαρή ιστόνη Η2A. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η2Α που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Διαδρομή 5: Καθαρή ιστόνη Η2Β. Διαδρομή 6: Ιστόνη Η2Β που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 7: Καθαρή ιστόνη Η3. Διαδρομή 8: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 9: Καθαρή ιστόνη Η4. Διαδρομή 10: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Το επόμενο βήμα ήταν η πραγματοποίηση πειραμάτων συγκατακρήμνισης χρησιμοποιώντας την φωσφορυλιωμένη μορφή της GST-wtNt, έτσι ώστε να διαπιστωθεί αν η φωσφορυλίωση των RS διπεπτιδίων του αμινο-τελικού τμήματος του LBR επηρεάζει την δέσμευση των ιστονών Η3 και Η4. Για το σκοπό αυτό οι πρωτεΐνες GST, GST-wtNt και GST-wtNt που είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από την ανασυνδυασμένη κινάση GST- SRPK1, καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και στη συνέχεια επωάστηκαν με τις ιστόνες Η3 και Η4 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ αλάτι και 1% Triton X-100. Μετά το τέλος της επώασης, τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Η φωσφορυλίωση της GST-wtNt από την GST-SRPK1 πραγματοποιήθηκε στους 30º C για 2 ώρες σε διάλυμα που αποτελείται από 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 mm MgClB2, B100 mμ NaCl παρουσία 0.6 mm ΑΤΡ. Χρησιμοποιήθηκε μεγάλος χρόνος επώασης και μεγάλη 97

περίσσεια ψυχρού ΑΤΡ για να πετύχουμε όσο το δυνατόν πιο στοιχειομετρική φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης GST-wtNt. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.8, η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας δεν μετέβαλε ουσιαστικά το ποσό των ιστονών Η3 και Η4 που δεσμεύονται στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Σχήμα Γ.8. Έλεγχος της δέσμευσης των ιστονών Η3 και Η4 στο φωσφορυλιωμένο από την GST- SRPK1 αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Οι ιστόνες Η3 και Η4 (2-3 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST-wtNt (~2 μg), ή με GST-wtNt η οποία είχε προγουμένως φωσφορυλιωθεί εξαντλητικά από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 για 2 ώρες στους 30º C παρουσία 0.6 mm ΑΤΡ. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η3. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 3: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την φωσφορυλιωμένη GST-wtNt. Διαδρομή 5: Καθαρή ιστόνη Η4. Διαδρομή 6: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 7: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Διαδρομή 8: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την φωσφορυλιωμένη GST-wtNt. Γ.1.6. Μελέτη του ρόλου της RS ακολουθίας στην αλληλεπίδραση του αμινοτελικού τμήματος του LBR με τις ιστόνες Η3 και Η4 Προκειμένου να διαπιστωθεί αν στην αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού τμήματος με τις ιστόνες παίζει ρόλο η επαναλαμβανόμενη ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης του 98

LBR, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST, GST-wtNt και GST-ΔRS καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και στη συνέχεια επωάστηκαν με τις ιστόνες Η3 και Η4 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ αλάτι και 1% Triton X-100. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες και ακολούθησε χρώση της πηκτής. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.9.Α, η ποσότητα της Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST- ΔRS είναι μικρότερη σε σχέση με εκείνη που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Αντίθετα, κάτι τέτοιο δεν παρατηρείται για την Η4, αφού η ποσότητα της Η4 που συγκατακρημνίζεται με τις δύο πρωτεΐνες είναι περίπου η ίδια (σχήμα Γ.9.Β). Το γεγονός ότι η RS ακολουθία συμμετέχει στην αλληλεπίδραση της ιστόνης Η3 με το αμινο-τελικό άκρο του LBR, ενώ κάτι τέτοιο δεν φαίνεται να ισχύει στην περίπτωση της ιστόνης Η4, πιθανά υποδηλώνει ότι οι δύο αυτές ιστόνες δεσμεύονται σε διαφορετικά σημεία του αμινο-τελικού άκρου. Σχήμα Γ.9. Έλεγχος του ρόλου της RS ακολουθίας στην αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Αφού οι ιστόνες Η3 και Η4 (2-3 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST, GST-wtNt και GST-ΔRS (2-4 μg από κάθε πρωτεΐνη), οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R- 250. (Α) Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η3. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 3: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST- ΔRS. (Β) Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η4. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 3: Ιστόνη Η4 που 99

συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST- ΔRS. Γ.2. Προσδιορισμός του τμήματος του αμινο-τελικού άκρου του LBR στο οποίο δεσμεύονται οι ιστόνες Η3 και Η4 Γ.2.1. Κατασκευή κατάλληλων ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που έχουν τη δυνατότητα να εκφράζουν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST τμήματα του αμινο-τελικού άκρου του LBR Είναι γνωστό ότι το αμινο-τελικό άκρο του LBR αποτελείται από δύο σφαιρικές περιοχές. Η πρώτη περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1 έως 62 και η δεύτερη τα αμινοξέα 92 έως 205 (40). Οι δύο αυτές σφαιρικές περιοχές διαχωρίζονται από μια συνδετική περιοχή που περικλείεται μεταξύ των αμινοξέων 62 έως 92. Για να διαπιστωθεί ποια από τις παραπάνω περιοχές είναι υπεύθυνη για την δέσμευση των ιστονών, κατασκευάστηκαν ανασυνδυασμένα πλασμίδια που έχουν τη δυνατότητα να εκφράζουν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST μικρότερα τμήματα του αμινο-τελικού άκρου του LBR, προκειμένου οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα συγκατακρήμνισης με τις ιστόνες Η3 και Η4. Η σχηματική αναπαράσταση των πρωτεϊνών αυτών δίνεται στο σχήμα Γ.10 και είναι οι ακόλουθες: o η πρωτεΐνη GST-(62-205) από την οποία απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 61 τα οποία αντιστοιχούν στην πρώτη σφαιρική περιοχή και o η πρωτεΐνη GST-(92-205) από την οποία απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 91 τα οποία αντιστοιχούν στην πρώτη σφαιρική και την συνδετική περιοχή. Αρχικά, σχεδιάστηκαν οι κατάλληλοι εκκινητές για την απάλειψη των περιοχών 1 έως 61 και 1 έως 91, ώστε να δημιουργηθούν οι πρωτεΐνες GST-(62-205) και GST-(92-205), αντίστοιχα (βλ. παράγραφο Β.16). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε να περιέχουν τις ακολουθίες αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού EcoRI και BamHI. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης όπου ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t το οποίο περιείχε το DNA που κωδικοποιεί το αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Τα προϊόντα της PCR εκχυλίστηκαν από την πηκτή αγαρόζης και επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και BamHI (βλ. παράγραφο Β.19). Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t. Ακολούθησε η αντίδραση της λιγάσης και τα προϊόντα της αντίδρασης 100

αυτής χρησιμοποιήθηκαν για τον μετασχηματισμό «επιδεκτικών» κυττάρων XL-1/Β με βάση την μεθοδολογία της παραγράφου Β.21. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη. Από τις αποικίες που προέκυψαν έγινε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με την μέθοδο της αλκαλικής λύσης και ταυτοποιήθηκαν οι θετικές αποικίες. Σχήμα Γ.10. Σχηματική αναπαράσταση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205). Από την πρωτεΐνη GST-(62-205) έχουν αφαιρεθεί τα αμινοξέα 1 έως 61, ενώ από την πρωτεΐνη GST-(92-205) τα αμινοξέα 1 έως 91. Στη συνδετική περιοχή φαίνεται σχηματικά η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Γ.2.2. Έκφραση των μεταλλαγμένων μορφών του αμινο-τελικού τμήματος του LBR και έλεγχος της φωσφορυλίωσης τους από την κινάση SRPK1 Για να εκφραστούν οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST-(62-205) και GST-(92-205), βακτηριακά κύτταρα XL-1/Β που περιείχαν τα αντίστοιχα ανασυνδυασμένα πλασμίδια, αναπτύχθηκαν στους 37 C με έντονη ανάδευση, μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει 0.6-0.7. Η επαγωγή της σύνθεσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών έγινε με την προσθήκη 5 mm IPTG για 1 ½ ώρες στους 27 C. Ακολούθησε η απομόνωση των πρωτεϊνών GST-(62-205) και GST-(92-205) με βάση την μεθοδολογία της παραγράφου Β.26. Μετά την έκλουση των πρωτεϊνών από τα σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης, 10 μl από το κάθε έκλουσμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η βαφή της πηκτής με χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και η ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα που αναπτύχθηκε απέναντι στο R4 πεπτίδιο, επιβεβαίωσαν τη σωστή έκφραση των πρωτεϊνών GST-(62-205) και GST-(92-205) (σχήμα Γ.11) 101

Σχήμα Γ.11. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα τμημάτων του αμινο-τελικού άκρου του LBR ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST. (A) Διαγραμματική απεικόνιση του αμινο-τελικού τμήματος του LBR όπου φαίνεται η ακολουθία του πεπτιδίου R4 στη δεύτερη σφαιρική περιοχή. (Β) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, των πρωτεϊνών GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205). Οι πρωτεΐνες GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205) αντιστοιχούν στις ζώνες με μοριακή μάζα ~51, ~44 και ~41 kda, αντίστοιχα ενώ οι ζώνες μικρότερης μοριακής μάζας αντιστοιχούν σε προϊόντα πρωτεόλυσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. (Γ) Ανοσοανίχνευση των εκφρασμένων πρωτεϊνών με πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο R4 του αμινο-τελικού τμήματος του LBR. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST-(62-205) και GST-(92-205) φωσφορυλιώθηκαν από την κινάση GST-SRPK1 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 32 mm MgClB2B, 80 mm NaCl, 25 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Η αντίδραση φωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 30 C και στην συνέχεια οι 102

ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Το αποτέλεσμα της αυτοραδιογραφίας έδειξε ότι η πρωτεΐνη GST-(62-205) φωσφορυλιώνεται αποτελεσματικά από την GST-SRPK1. Αντίθετα, όπως και αναμενόταν, η πρωτεΐνη GST-(92-205), η οποία δεν περιέχει τα επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια στο μόριο της δεν φωσφορυλιώνεται. Σχήμα Γ.12. Φωφσφορυλίωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-(62-205) και GST-(92-205) από την κινάση GST-SRPK1. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου των πρωτεϊνών GST-(62-205) και GST-(92-205) μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) In vitro φωσφορυλίωση των παραπάνω πρωτεϊνών από την GST-SRPK1. Στη φωτογραφία παρουσιάζονται οι ραδιενεργές ζώνες, όπως εμφανίζονται στο φιλμ μετά από αυτοραδιογραφία της αντίστοιχης πηκτής. Γ.2.3. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης των ιστονών Η3 και Η4 με τις μεταλλαγμένες μορφές του αμινο-τελικού άκρου του LBR Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες GST-(62-205) και GST-(92-205) συμμετείχαν σε πειράματα συγκατακρήμνισης με τις ιστόνες Η3 και Η4. Για το σκοπό αυτό οι πρωτεΐνες GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205) αρχικά καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και στη συνέχεια επωάστηκαν με τις ιστόνες Η3 και Η4. Αφού απομακρύνθηκε η περίσσεια των μη δεσμευμένων ιστονών, ακολούθησε έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη, ηλεκτροφόρηση και χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.13, οι ιστόνες Η3 και Η4 δεσμεύονται στην πρωτεΐνη GST-(62-205), δηλαδή στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR από το οποίο απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 61, ενώ αντίθετα αδυνατούν να δεσμευθούν στην πρωτεΐνη GST-(92-205), δηλαδή στο τμήμα 103

εκείνο από το οποίο απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 91. Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού μας οδήγησαν στη σκέψη ότι πιθανότατα η αλληλεπίδραση των ιστονών με το αμινοτελικό τμήμα του LBR πραγματοποιείται μέσω του τμήματος που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92. Σχήμα Γ.13. Αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με τμήματα του αμινο-τελικού άκρου του LBR. Οι ιστόνες Η3 και Η4 (2-3 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με ακινητοποιημένες σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST, GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205) (2-4 μg από κάθε πρωτεΐνη). Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (Α) Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η3. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 3: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-205). Διαδρομή 5: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(92-205). Διαδρομή 6: Καθαρή ιστόνη Η4. Διαδρομή 7: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 8: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GSTwtNt. Διαδρομή 9: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-205). Διαδρομή 10: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(92-205). Γ.2.4. Κατασκευή ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που έχει τη δυνατότητα να εκφράζει ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST το τμήμα που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 του αμινο-τελικού άκρου του LBR 104

Για να διαπιστωθεί εάν η περιοχή που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για την δέσμευση των ιστονών Η3 και Η4 ή αντίθετα η περιοχή αυτή συμμετέχει σε μια συγκεκριμένη διαμόρφωση του αμινο-τελικού άκρου του LBR που ευθύνεται για την δέσμευση των Η3 και Η4, κατασκευάστηκε ανασυνδυασμένο πλασμίδιο που έχει την δυνατότητα να εκφράζει ως πρωτεΐνη σύντηξη με την GST την συγκεκριμένη περιοχή του αμινο-τελικού άκρου του LBR. Η σχηματική αναπαράσταση της ανασυνδυασμένης αυτής πρωτεΐνης δίνεται στο σχήμα Γ.14. Σχήμα Γ.14. Σχηματική απεικόνιση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-wtNt και GST-(62-92). Στο τμήμα που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 φαίνεται σχηματικά και η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Αρχικά, σχεδιάστηκαν οι κατάλληλοι εκκινητές για τη σύνθεση του τμήματος που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 (βλ. παράγραφο Β.16). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε να περιέχουν τις ακολουθίες αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού EcoRI και BamHI. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης όπου ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t, το οποίο περιείχε ολόκληρο το DNA που κωδικοποιεί το αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Το προϊόν της PCR εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και επωάστηκε με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και BamHI (βλ. παράγραφο Β.19). Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t. Ακολούθησε η αντίδραση της λιγάσης και το προϊόν της αντίδρασης αυτής χρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό «επιδεκτικών» κυττάρων XL-1/Β με βάση την μεθοδολογία της παραγράφου Β.21. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη. Από τις αποικίες που προέκυψαν έγινε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με την μέθοδο της αλκαλικής λύσης και ταυτοποιήθηκαν οι θετικές αποικίες. 105

Γ.2.5. Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) και έλεγχος της φωσφορυλίωσής της από την κινάση SRPK1 Βακτηριακά XL-1/Β τα οποία μετασχηματίστηκαν με το παραπάνω ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, αναπτύχθηκαν στους 37 C με έντονη ανάδευση μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει 0.6-0.7. Η επαγωγή της σύνθεσης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης έγινε με την προσθήκη 5 mm IPTG για 1 ώρα στους 27 C. Ακολούθησε η απομόνωση της πρωτεΐνης GST-(62-92) με βάση την μεθοδολογία της παραγράφου Β.26. Μετά την έκλουση από τα σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης, 10 μl από το έκλουσμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η βαφή της πηκτής με χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 έδειξε ότι το επίπεδο της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης δεν ήταν ανιχνεύσιμο, ενώ αντίθετα φάνηκε να υπάρχει περίσσεια GSΤ (βλ. σχήμα Γ.15.Α). Το γεγονός αυτό οφείλεται είτε σε έντονη πρωτεόλυση στα βακτήρια του τμήματος που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 είτε σε κατακρήμνιση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης -λόγω του πολύ έντονου βασικού χαρακτήρα της (pi>10.5)- πιθανόν με κομμάτια χρωμοσωμικού DNA των βακτηρίων. Στα πλαίσια της επίλυσης αυτού του προβλήματος, αυξήσαμε τη συγκέντρωση NaCl στο 1 Μ, από 150 mm που είναι η φυσιολογική συγκέντρωση αλατιού στο ρυθμιστικό διάλυμα PBST. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.15.Β, η χρήση 1 Μ NaCl οδήγησε σε απομόνωση ικανοποιητικών ποσοτήτων της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, αν και αυτή ήταν μερικά υδρολυμένη. Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη GST-(62-92) εμφανίζεται στην πηκτή ως μία ζώνη που αντιστοιχεί σε μοριακή μάζα ~32 kda, ενώ εμφανίζονται και δύο ζώνες μικρότερης μοριακής μάζας που αντιστοιχούν σε προϊόντα πρωτεόλυσης. Η ταυτοποίηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) πραγματοποιήθηκε με ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει το πεπτίδιο R1 του αμινο-τελικού τμήματος του LBR. 106

Σχήμα Γ.15. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92). (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, των πρωτεϊνών GST και GST-(62-92) μετά από καθαρισμό με ρυθμιστικό διάλυμα PBST. (Β) Αντίστοιχη ηλεκτροφορητική εικόνα των πρωτεϊνών GST και GST- (62-92) μετά από καθαρισμό με ρυθμιστικό διάλυμα PBST με 1 Μ NaCl. (Γ) Ανοσοανίχνευση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο R1 του αμινο-τελικού τμήματος του LBR. Στη συνέχεια, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92) φωσφορυλιώθηκε από την GST-SRPK1 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 mm MgClB2B, 80 32 mm NaCl, 25 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Η αντίδραση φωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 30 C και στην συνέχεια οι ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.16, η πρωτεΐνη GST-(62-92) φωσφορυλιώνεται αποτελεσματικά από την GST-SRPK1. Χαρακτηριστικό είναι ότι φωσφορυλιώνεται μόνο η πλήρους μήκους ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. Σχήμα Γ.16. Φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) από την κινάση GST- SRPK1. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου των πρωτεϊνών GST και GST-(62-92) μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) In vitro φωσφορυλίωση της GST-(62-92) από την GST-SRPK1. Στη φωτογραφία παρουσιάζονται οι ραδιενεργές ζώνες όπως εμφανίζονται στο φιλμ μετά από αυτοραδιογραφία της αντίστοιχης πηκτής. 107

Γ.2.6. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GST-(62-92) με τις ιστόνες Η3 και Η4 Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη GST-(62-92) χρησιμοποιήθηκε σε δοκιμασίες συγκατακρήμνισης με τις ιστόνες Η3 και Η4. Για το σκοπό αυτό η GST-(62-92) αρχικά καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και στη συνέχεια επωάστηκε με τις ιστόνες Η3 και Η4. Αφού απομακρύνθηκε η περίσσεια των μη δεσμευμένων ιστονών, ακολούθησε έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη, ηλεκτροφόρηση και χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.17, οι ιστόνες Η3 και Η4, αντίθετα από ότι αναμενόταν, δεν δεσμεύονται στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. Αυτό αποδόθηκε είτε στον τρόπο παρασκευής της GST-(62-92) και συγκεκριμένα στην χρήση 1 Μ NaCl, είτε εναλλακτικά θεωρήθηκε ότι απαιτείται για την δέσμευση των ιστονών μια ευρύτερη περιοχή του αμινο-τελικού άκρου του LBR η οποία και έχει μια συγκεκριμένη διαμόρφωση. Σχήμα Γ.17. Αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με την πρωτεΐνη GST-(62-92). Οι ιστόνες Η3 και Η4 (2 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης GST-(62-92) (3 μg πρωτεΐνης). Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDSπηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (Α) Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η3. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92). (Β) Διαδρομή 1: Καθαρή ιστόνη Η4. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92). 108

Γ.2.7. Αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR το οποίο προηγουμένως είχε επωαστεί με 1 Μ NaCl Προκειμένου να διαπιστωθεί αν το προηγούμενο αποτέλεσμα οφείλεται στην παρουσία του 1 Μ NaCl κατά τη διάρκεια του καθαρισμού της πρωτεΐνης GST-(62-92), πραγματοποιήθηκε κατεργασία με την ίδια συγκέντρωση αλατιού της πρωτεΐνης GST-wtNt. Για το σκοπό αυτό, η πρωτεΐνη GST-wtNt καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST ή σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST στο οποίο η συγκέντρωση του NaCl είχε ρυθμιστεί ώστε να είναι 1 Μ. Η επώαση έγινε για μία ώρα στους 4 C. Αφού τα σφαιρίδια της στήλης πλύθηκαν αρκετές φορές με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 2 mm MgClB2B και 1% Triton X-100, πραγματοποιήθηκε επώαση με τις ιστόνες Η3 και Η4. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε η περίσσεια των μη δεσμευμένων ιστονών, ακολούθησε έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη, ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.18, η επώαση του αμινοτελικού τμήματος του LBR με 1 Μ NaCl οδήγησε σε απώλεια της ικανότητάς του να αλληλεπιδρά με τις ιστόνες Η3 και Η4, ενώ κάτι τέτοιο δεν παρατηρείται όταν χρησιμοποιήθηκε PBST με την φυσιολογική συγκέντρωση NaCl. Σχήμα Γ.18. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GST-wtNt που έχει προηγουμένως επωαστεί με 1Μ αλάτι με τις ιστόνες Η3 και Η4 σε 12 % SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. (Α) Διαδρομή 1: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίστηκε με την GST-wtNt. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίστηκε με την GST-wtNt που είχε 109

προηγουμένως επωαστεί με 1 Μ αλάτι. (Β) Διαδρομή 1: Ιστόνη Η4 Διαδρομή 2: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίστηκε με την GST-wtNt. Διαδρομή 3: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίστηκε με την GST-wtNt που είχε προηγουμένως επωαστεί με 1 Μ αλάτι. Γ.3. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινο-τελικού τμήματος του LBR με νουκλεϊκά οξέα Γ.3.1. Ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR που έχει εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα Προκειμένου να ερμηνευτούν τα προηγούμενα αποτελέσματα έγινε η υπόθεση ότι πιθανότατα η αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού τμήματος του LBR με τις ιστόνες Η3 και Η4, επιτυγχάνεται με την μεσολάβηση ενός αγνώστου παράγοντα, ο οποίος συγκαθαρίζεται με τον LBR από τα βακτηριακά κύτταρα και ο οποίος απομακρύνεται με την χρήση 1 Μ NaCl, με αποτέλεσμα να παρατηρείται απώλεια της δέσμευσης των ιστονών Η3 και Η4. Λαμβάνοντας υπ όψη το πολύ υψηλό ισοηλεκτρικό σημείο του αμινο-τελικού άκρου, υποθέσαμε ότι πιθανόν το τμήμα αυτό του LBR να έχει πάνω του δεσμευμένα βακτηριακά νουκλεϊνικά οξέα. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι τουλάχιστον in vitro στον LBR δεσμεύεται DNA σε συνθήκες χαμηλής ιονικής ισχύος (40, 31). Σε ένα πρώτο στάδιο λοιπόν ελέγχθηκε αν το αμινο-τελικό τμήμα του LBR, το οποίο εκφράζεται σε βακτηριακά κύτταρα, διατηρεί δεσμευμένο πάνω του βακτηριακό DNA. Για το σκοπό αυτό οι πρωτεΐνες GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205) ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης και διαπιστώθηκε, όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.19, ότι οι δύο πρώτες πράγματι δεσμεύουν νουκλεϊκά οξέα, κυρίως μικρού μοριακού βάρους. Αντίθετα, βακτηριακά νουκλεϊκά οξέα αδυνατούν να δεσμευτούν στην πρωτεΐνη GST-(92-205), δηλαδή στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR από το οποίο απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 91. Προκειμένου να διαπιστωθεί το είδος του νουκλεϊκού οξέος, οι παραπάνω πρωτεΐνες επωάστηκαν με 10 μg RNase A ή με DNase (~50 units) για 30 λεπτά στους 30 C και έπειτα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης. Παρατηρήθηκε ότι μετά από επώαση με την DNase τα νουκλεϊκά οξέα εξακολουθούν να παραμένουν δεσμευμένα στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR και να ανιχνεύονται μετά τη χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, ενώ αντίθετα μετά από επώαση με την RNase A εξαφανίζονται. Διαπιστώθηκε επομένως, αντίθετα από ότι αναμενόταν, ότι το είδος του νουκλεϊκού οξέος που δεσμεύεται στο αμινο-τελικό τμήμα του 110

LBR, κατά την έκφρασή του σε βακτηριακά κύτταρα, είναι βακτηριακό RNA. Μάλιστα φαίνεται ότι η πιθανή θέση δέσμευσης του RNA είναι τα αμινοξέα 62 έως 92, δεδομένου ότι το RNA δεσμεύεται στην πρωτεΐνη GST-(62-205) και όχι στην GST-(92-205). Σχήμα Γ.19. Έλεγχος της ύπαρξης νουκλεϊκών οξέων δεσμευμένων στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR που συντίθεται σε βακτηριακά κύτταρα. (Α) Ηλεκτροφόρηση σε 1% πηκτή αγαρόζης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-wtNt, GST-(62-205) και GST-(92-205). (Β) Ηλεκτροφόρηση σε 1% πηκτή αγαρόζης των προηγούμενων πρωτεϊνών μετά από επώαση με DNase (~50 units) για 30 λεπτά στους 30 C. (Γ) Ηλεκτροφόρηση σε 1% πηκτή αγαρόζης των προηγούμενων πρωτεϊνών μετά από επώαση με RNase A (10 μg) για 30 λεπτά στους 30 C. Όταν όμως η πρωτεΐνη GST-(62-92) ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης διαπιστώθηκε, όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.20, ότι στην ανασυνδυασμένη αυτή πρωτεΐνη δεν ανιχνεύονται βακτηριακά νουκλεϊκά οξέα. Αυτό φαινομενικά έρχεται σε σύγκρουση με το προηγούμενο αποτέλεσμα, αλλά αποδόθηκε στην χρήση 1 Μ NaCl κατά την παρασκευή της GST-(62-92) στα βακτηριακά κύτταρα, που απομακρύνει το δεσμευμένο RNA. Πράγματι κατεργασία του ανασυνδυασμένου αμινο-τελικού άκρου με 1 Μ NaCl για 1 ώρα στους 4 C έχει ως αποτέλεσμα την αποδέσμευση του βακτηριακού RNA από την GST- 111

wtnt, ούτως ώστε αυτό να μην είναι ανιχνεύσιμο σε πηκτή αγαρόζης (αποτέλεσμα που δεν δείχνεται, βλ. επίσης και σχήμα Γ.22). Σχήμα Γ.20. Προσπάθεια ανίχνευσης βακτηριακού RNA στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92). Οι πρωτεΐνες GST-wtNt και GST-(62-92) ηλεκτροφορήθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζης. Γ.3.2. Αλληλεπίδραση διαφόρων τύπων ευκαρυωτικού RNA με το αμινο-τελικό άκρο του LBR Το επόμενο βήμα ήταν η επώαση της πρωτεΐνης GST-(62-92) με διάφορα είδη ευκαρυωτικού RNA, με βάση την μεθοδολογία που περιγράφεται στην παράγραφο Β.33, προκειμένου να διαπιστωθεί αρχικά αν ο LBR έχει την δυνατότητα να αλληλεπιδρά με ευκαρυωτικά RNA και σε ένα δεύτερο επίπεδο αν υπάρχει εξειδίκευση στο είδος του RNA με το οποίο αλληλεπιδρά. Χρησιμοποιήθηκε η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92) για δύο λόγους: πρώτον δεν έχει δεσμευμένο πάνω της βακτηριακό RNA αφού αυτό έχει απομακρυνθεί με την χρήση 1 Μ NaCl κατά τη διάρκεια του καθαρισμού της και δεύτερον η περιοχή που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 αρκεί για την δέσμευση βακτηριακού RNA. Στα πειράματα αυτά χρησιμοποιήθηκε συνολικό RNA που απομονώθηκε από HeLa κύτταρα, πυρηνικό RNA που απομονώθηκε από όρχεις ποντικού, καθώς και μεταφορικό RNA. Το συνολικό και το πυρηνικό RNA απομονώθηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.29, ενώ το trna μας παραχωρήθηκε ευγενικά από το εργαστήριο του Dr. Jeremy Brockes (Ludwig Institute for Cancer Research, London). Συγκεκριμένα, η GST-(62-92) επωάστηκε με 50 μg συνολικού κυτταρικού RNA ή πυρηνικού RNA ή μεταφορικού RNA σε ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο περιείχε 150 mm KCl, 2 mm EDTA και 20 mm Hepes ph 7.5 για μία ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 112

Στη συνέχεια, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης, ακολούθησαν τρεις πλύσεις της στήλης και αιώρηση των σφαιριδίων σε διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων. Η ανάλυση του δεσμευμένου RNA πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, που επιτυγχάνονται με την χρήση φορμαλδεΰδης, ενώ για την ταυτοποίηση του ακολούθησε μεταφορά σε νάιλον μεμβράνη TM GeneScreen PlusP P και χρώση της μεμβράνης με την χρωστική μπλε του μεθυλενίου. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.21, στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR και μάλιστα στην περιοχή που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92- δεσμεύονται πράγματι ευκαρυωτικά RNA. Στις συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιήθηκε το παραπάνω πείραμα δεσμεύθηκαν εξίσου καλά και τα τρία είδη RNA που δοκιμάστηκαν. Σχήμα Γ.21. Αλληλεπίδραση διαφόρων τύπων ευκαρυωτικού RNA με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92). Η πρωτεΐνη GST-(62-92) (~2 μg) επωάστηκε με 50 μg trna, συνολικού κυτταρικού RNA και πυρηνικού RNA και στην συνέχεια ακινητοποιήθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Τα δεσμευμένα μόρια RNA αναλύθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζηςφορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκαν σε νάιλον μεμβράνη GeneScreen PlusP Pκαι ακολούθησε χρώση της TM μεμβράνης με την χρωστική μπλε του μεθυλενίου (διαδρομές 4, 5 και 6). Στις διαδρομές 1, 2 και 3 ηλεκτροφορήθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεΰδης, 20 μg trna, συνολικού κυτταρικού RNA και πυρηνικού RNΑ, αντίστοιχα. Γ.3.3. Έλεγχος της ισχύος της αλληλεπίδρασης του ευκαρυωτικού RNA με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR 113

Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη GST-(62-92) επωάστηκε με πυρηνικό RNA που απομονώθηκε από όρχεις ποντικού, σε αυξανόμενες τιμές ιονικής ισχύος, με βάση την μεθοδολογία που περιγράφεται στην παράγραφο Β.33. Από τα τρία είδη ευκαρυωτικού RNA που δοκιμάστηκαν στο προηγούμενο πείραμα χρησιμοποιήθηκε πυρηνικό RNA, γιατί φυσιολογικά έχει την ίδια υποκυτταρική κατανομή με τον υποδοχέα της λαμίνης Β και κατά συνέπεια έχει μεγαλύτερη πιθανότητα να βρίσκεται συνδεδεμένο με αυτόν και in vivo. Συγκεκριμένα, η GST-(62-92) επωάστηκε με 50 μg πυρηνικού RNA στα παρακάτω ρυθμιστικά διαλύματα : α. 100 mm KCl, 2 mm EDTA, 20 mm Hepes ph 7.5 β. 250 mm KCl, 2 mm EDTA, 20 mm Hepes ph 7.5 γ. 500 mm KCl, 2 mm EDTA, 20 mm Hepes ph 7.5 δ. 750 mm KCl, 2 mm EDTA, 20 mm Hepes ph 7.5 Aκολούθησε καθήλωση της GST-(62-92) με το τυχόν δεσμευμένο πυρηνικό RNA σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης, τρεις πλύσεις των σφαιριδίων με το αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα και στη συνέχεια αιώρηση των σφαιριδίων σε διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων. Tο δεσμευμένο RNA αναλύθηκε σε πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεΰδης και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκε με μεταφορά σε νάιλον μεμβράνη και χρώση της μεμβράνης με την χρωστική μπλε του μεθυλενίου. Από την χρώση της μεμβράνης προέκυψε ότι ακόμα και σε υψηλή συγκέντρωση αλατιού (750 mm KCl), η αλληλεπίδραση με το πυρηνικό RNA εξακολουθεί να υπάρχει και φαίνεται ότι στην υψηλή αυτή τιμή ιονικής ισχύος δεσμεύεται μόνο ένας μικρός συγκεκριμένος πληθυσμός μορίων πυρηνικού RNA (βλ. σχήμα Γ.22). Σχήμα Γ.22. Αλληλεπίδραση πυρηνικού RNA με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92) σε διάφορες τιμές ιονικής ισχύος. Η πρωτεΐνη GST-(62-92) (~2 μg) επωάστηκε με 50 μg πυρηνικού RNA και στην συνέχεια ακινητοποιήθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Τα δεσμευμένα 114

μόρια RNA αναλύθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζης-φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκαν σε νάιλον μεμβράνη TM GeneScreen PlusP Pκαι ακολούθησε χρώση της μεμβράνης με την χρωστική μπλε του μεθυλενίου. Διαδρομή 1: 20 μg πυρηνικού RNA. Διαδρομή 2: Πυρηνικό RNA που δεσμεύτηκε στην πρωτεΐνη GST-(62-92) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 100 mm KCl. Διαδρομή 3: Πυρηνικό RNA που δεσμεύτηκε στην πρωτεΐνη GST-(62-92) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 250 mm KCl. Διαδρομή 3: Πυρηνικό RNA που δεσμεύτηκε στην πρωτεΐνη GST-(62-92) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 500 mm KCl. Διαδρομή 4: Πυρηνικό RNA που δεσμεύτηκε στην πρωτεΐνη GST-(62-92) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 750 mm KCl. Το ίδιο, στην ουσία, πείραμα επαναλήφθηκε και πάλι, μόνο που αυτή τη φορά η ανάλυση του δεσμευμένου RNA έγινε σε 1% πηκτή αγαρόζης και παρατηρήθηκε η αλλαγή της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του δεσμευμένου RNA, σε σύγκριση με το αντίστοιχο RNA το οποίο δεν έχει επωαστεί με την πρωτεΐνη (για μεθοδολογία βλ. παράγραφο Β.34). Συγκεκριμένα, 50 μg πυρηνικού RNA επωάστηκαν με περίπου 2 μg ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92), για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2.5 mm EDTA, 5% γλυκερόλη και 0.5 mg/ml αλβουμίνη, σε συνθήκες αυξανόμενης ιονικής ισχύος (50-500 mμ ΚCl). Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.23.Α, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του RNA καθυστερεί ακόμα και όταν η ιονική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος είναι 500 mm, γεγονός που επιβεβαιώνει την ισχυρή δέσμευση του πυρηνικού RNA στο ανασυνδυασμένο τμήμα του αμινο-τελικού άκρου του LBR που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92. Δεδομένου ότι έχει ήδη δημοσιευτεί η δέσμευση DNA στο αμινο-τελικό άκρο του LBR in vitro, σε συνθήκες χαμηλής ιονικής ισχύος (40), πραγματοποιήσαμε ένα ανάλογο πείραμα όπου 1 μg από ένα τμήμα DNA του γονιδίου της SRPK1a που περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια 1-513, επωάστηκε με 2 μg ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και πάλι σε συνθήκες αυξανόμενης ιονικής ισχύος (50-500 mμ ΚCl). Στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε καθυστέρηση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του DNA, μόνο όταν η ιονική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος είναι μικρότερη από 300 mm (σχήμα Γ.23.Β). 115

Σχήμα Γ.23. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης πυρηνικού RNA και DNA με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92) σε διάφορες τιμές ιονικής ισχύος. Η πρωτεΐνη GST-(62-92) (~2 μg) επωάστηκε με 50 μg πυρηνικού RNA (Α) ή με 1 μg ενός τμήματος DNA 513 bp (Β), σε αυξανόμενες τιμές ιονικής ισχύς (50-500 mm ΚCl) και στην συνέχεια καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης. H ανάλυση του δεσμευμένου RNA ή DNA έγινε σε 1% πηκτή αγαρόζης. Στο σχήμα φαίνεται η αλλαγή της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του δεσμευμένου RNA (Α) ή DNA (Β) όταν η επώαση έγινε σε 50 (διαδρομή 2), 150 (διαδρομή 3), 300 (διαδρομή 4) και 500 mm ΚCl (διαδρομή 5) σε σύγκριση με το αντίστοιχο RNA ή DNA αντίστοιχα (διαδρομή 1), το οποίο δεν είχε επωαστεί με την πρωτεΐνη. Μ:μάρτυρες. Γ.3.4. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας του αμινο-τελικού τμήματος του LBR στην αλληλεπίδραση του με πυρηνικό RNA Προκειμένου να μελετηθεί διεξοδικότερα η αλληλεπίδραση του RNA με το αμινοτελικό τμήμα του LBR, ελέγχθηκε η επίδραση της φωσφορυλίωσης των RS διπεπτιδίων του LBR από την SRPK1 στην δέσμευση του RNA. Για το σκοπό αυτό, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92), αλλά και η GST-(62-92) που έχει προηγουμένως φωσφορυλιωθεί εξαντλητικά από την κινάση GST-SRPK1 (για 2 ώρες στους 30 C) παρουσία 0.6 mm ψυχρού ΑΤΡ (βλ. και παράγραφο Β.12), επωάστηκαν με πυρηνικό RNA σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 100 mm KCl, 2 mm EDTA και 20 mm Hepes. Στη συνέχεια, τόσο η φωσφορυλιωμένη όσο και η μη φωσφορυλιωμένη GST-(62-92) δεσμεύτηκαν σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης. Το δεσμευμένο RNA σε κάθε περίπτωση αναλύθηκε σε πηκτή αγαρόζης παρουσία φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκε σε νάιλον μεμβράνη και ακολούθησε χρώση της μεμβράνης. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.24, η φωσφορυλίωση της RS περιοχής του αμινο-τελικό τμήματος του LBR παρεμποδίζει την δέσμευση του πυρηνικού RNA. 116

Σχήμα Γ.24. Επίδραση της φωσφορυλίωσης στην αλληλεπίδραση πυρηνικού RNA με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92). 50 μg πυρηνικού RNA επωάστηκαν με ~2 μg GST-(62-92) ή 2 μg φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης, οι οποίες στην συνέχεια καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Τα δεσμευμένα μόρια RNA αναλύθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζηςφορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκαν σε νάιλον μεμβράνη GeneScreen PlusP Pκαι βάφτηκαν με την TM χρωστική μπλε του μεθυλενίου. Διαδρομή 1: 20 μg πυρηνικού RNA. Διαδρομή 2: πυρηνικό RNA που δεσμεύτηκε στην πρωτεΐνη GST-(62-92). Διαδρομή 3: πυρηνικό RNA που δεσμεύτηκε στην φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη. Γ.3.5. Επίδραση της φωσφορυλίωσης των RS διπεπτιδίων του αμινο-τελικού τμήματος του LBR στην αλληλεπίδραση του με DNA Αφού εξακριβώθηκαν οι συνέπειες της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας του αμινοτελικού τμήματος του LBR στην αλληλεπίδρασή του με το RNA, ανάλογο πείραμα πραγματοποιήθηκε και για τη δέσμευση του DNA. Στην περίπτωση αυτή ελέγχθηκε η αλλαγή της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του τμήματος DNA. Συγκεκριμένα, το τμήμα DNA του γονιδίου της SRPK1a, μοριακού μεγέθους 513 bp, επωάστηκε με την GST-(62-92) και GST-(62-92) που είχε φωσφορυλιωθεί από ανασυνδυασμένη GST-SRPK1, αλλά και μεσοφασικό και μιτωτικό εκχύλισμα από HeLa κύτταρα (βλ. παραγράφο Β.13). Ο λόγος που χρησιμοποιήθηκε μεσοφασικό και μιτωτικό εκχύλισμα είναι γιατί στη βιβλιογραφία έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού άκρου του LBR από μεσοφασικό εκχύλισμα επάγει τη πρόσδεση της χρωματίνης, ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση 117

από μιτωτικό εκχύλισμα την παρεμποδίζει (62). Δεδομένου ότι η πρόσδεση της χρωματίνης έχει αποδοθεί μόνο στην αλληλεπίδραση του DNA με τον LBR, θελήσαμε να εξακριβώσουμε εάν πράγματι η φωσφορυλίωση από τα δύο εκχυλίσματα έχει τέτοια αντιδιαμετρικά αντίθετη συμπεριφορά στη δέσμευση του DNA. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης και παρατηρήθηκε η αλλαγή της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του DNA. Η αντίδραση φωσφορυλίωσης της GST-(62-92) πραγματοποιήθηκε στους 30 C για 2 ώρες, σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 mm MgClB2B, 100 mm NaCl παρουσία 0.6 mm ATP. Διαπιστώθηκε ότι η φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού τμήματος του LBR σε όλες τις περιπτώσεις παρεμποδίζει την δέσμευση του DNA (βλ. σχήμα Γ.25). Σχήμα Γ.25. Επίδραση της φωσφορυλίωσης στην αλληλεπίδραση του DNA με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-(62-92). Η πρωτεΐνη GST-(62-92) επωάστηκε με τμήμα DNA 513 bp και στην συνέχεια η ανάλυση του δεσμευμένου DNA έγινε σε 1% πηκτή αγαρόζης. Στο σχήμα φαίνεται η αλλαγή της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του δεσμευμένου DNA. Διαδρομή 1: 1 μg DNA. Στις διαδρομές 2 και 3, το DNA επωάστηκε με 1 και 2 μg της GST-(62-92), αντίστοιχα. Στις διαδρομές 4 και 5, το DNA επωάστηκε με 2 μg GST-(62-92) που είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από ~10 μg μεσοφασικού και μιτωτικού εκχυλίσματος, αντίστοιχα παρουσία 0.6 mm ψυχρού ATP. Σχεδόν μηδαμινή δέσμευση DNA (καμία μεταβολή στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα) παρατηρήθηκε και όταν η GST-(62-92) είχε φωσφορυλιωθεί από 0.5 μg καθαρής GST-SRPK1 (δεν δείχνεται στην φωτογραφία). Γ.3.6. Επίδραση της προσθήκης πυρηνικού RNA στην αλληλεπίδραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) με τις ιστόνες Η3 και Η4 Στη συνέχεια, ελέγχθηκε εάν η δέσμευση RNA σχετίζεται με την αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με τον LBR. Για το σκοπό αυτό, η πρωτεΐνη GST-(62-92) (η οποία όπως ήδη δείξαμε δεν περιέχει δεσμευμένο RNA, βλ. σχήμα Γ.20) επωάστηκε με ή χωρίς 50 μg 118

πυρηνικού RNA, σε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm ΚCl, 2 mm EDTA και 20 mm Hepes ph 7.5. Στη συνέχεια, καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και ακολούθησε επώαση με τις ιστόνες Η3 και Η4 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ αλάτι και 1% Triton X-100. Τα σφαιρίδια της στήλης ξεπλύθηκαν τρεις φορές με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R- 250. Παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη GST-(62-92) απουσία RNA δεν αλληλεπιδρά με τις ιστόνες Η3 και Η4. Αντίθετα, με την δέσμευση πυρηνικού RNA επιτυγχάνεται αλληλεπίδραση της GST-(62-92) με την Η3 (σχήμα Γ.26, διαδρομή 3), αλλά όχι και με την H4 (σχήμα Γ.26, διαδρομή 6). Σχήμα Γ.26. Αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με την πρωτεΐνη GST-(62-92) στην οποία προηγουμένως είχε δεσμευτεί πυρηνικό RNA. Οι ιστόνες Η3 και Η4 (2 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST-(62-92) (~3 μg πρωτεΐνης), η οποία είχε προεπωασθεί με ή χωρίς 50 μg πυρηνικού RNA για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Διαδρομή 1: Ιστόνη Η3. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92). Διαδρομή 3: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92) που είχε προεπωαστεί με πυρηνικό RNA. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η4. Διαδρομή 5: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92). Διαδρομή 6: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92) που είχε προηγουμένως επωαστεί με πυρηνικό RNA. 119

Γ.3.7. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt δεν αλληλεπιδρά με τις ιστόνες Η3 και Η4, όταν έχει προηγουμένως επωαστεί με RNase A Προκειμένου να επιβεβαιωθεί το προηγούμενο αποτέλεσμα με μια συμπληρωματική προσέγγιση, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αλληλεπίδρασης των ιστονών Η3 και Η4 με την πρωτεΐνη GST-wtNt η οποία είχε όμως προηγουμένως επωαστεί με RNase A, ώστε να απομακρυνθεί το βακτηριακό RNA που βρίσκεται δεσμευμένο πάνω της. Συγκεκριμένα, αφού η πρωτεΐνη GST-wtNt επωάστηκε με ή χωρίς 10 μg RNase A για 30 min στους 30 C, καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκε με τις ιστόνες Η3 και Η4 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ αλάτι και 1% Triton X-100. Αφού απομακρύνθηκε η περίσσεια των μη δεσμευμένων ιστονών, τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Σχήμα Γ.27. Αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με την πρωτεΐνη GST-wtNt, η οποία προηγουμένως είχε επωαστεί με RNase A. Οι ιστόνες Η3 και Η4 (2 μg από κάθε ιστόνη) επωάστηκαν με ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST-wtNt (~2 μg πρωτεΐνης), η οποία είχε προεπωασθεί με ή χωρίς 10 μg RNase A για 30 min, στους 30 C. (Α) Διαδρομή 1: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η3 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt που είχε προεπωαστεί με RNase A. (Β) Διαδρομή 1: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η4 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt που είχε προεπωαστεί με RNase A. 120

Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.27, ενώ η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt αλληλεπιδρά με τις ιστόνες Η3 και Η4 (διαδρομή 1), παρατηρείται απώλεια της αλληλεπίδρασης όταν η GST-wtNt έχει προηγουμένως επωαστεί με RNase A (διαδρομή 2). Χαρακτηριστικό είναι ότι η κατεργασία με RNase A οδηγεί σε πλήρη απώλεια δέσμευσης και της ιστόνης Η4, την οποία δεν είχαμε καταφέρει να δεσμεύσουμε στο τμήμα του αμινοτελικού άκρου που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 και στο οποίο είχαμε προηγουμένως δεσμεύσει πυρηνικό RNA (βλ. σχήμα Γ.26). Γ.3.8. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης GST-(62-92) από μεσοφασικό και μιτωτικό εκχύλισμα στην αλληλεπίδραση της με ιστόνες Όπως αναφέρθηκε και προηγούμενα έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η δέσμευση του LBR με την χρωματίνη ρυθμίζεται με την φωσφορυλίωσή του από μεσοφασικό και μιτωτικό εκχύλισμα (62). Δεδομένου λοιπόν ότι και η φωσφορυλίωση αυξάνει τον όξινο χαρακτήρα του αμινο-τελικού άκρου του LBR, όπως ακριβώς και η δέσμευση RNA, θελήσαμε στη συνέχεια να ελέγξουμε την σύνδεση των ιστονών Η3 και Η4 σε φωσφορυλιωμένο αμινοτελικό άκρο. Για τον λόγο αυτό οι πρωτεΐνες GST-(62-92), GST-(62-92) που είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από μεσοφασικό εκχύλισμα και GST-(62-92) που είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από μιτωτικό εκχύλισμα HeLa κυττάρων, καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκαν με τις ιστόνες Η3 και Η4. Για την αντίδραση της φωσφορυλίωσης χρησιμοποιήθηκαν ~10 μg μεσοφασικού ή μιτωτικού εκχυλίσματος, ενώ η επώαση πραγματοποιήθηκε στους 30 C, για 2 ώρες, παρουσία 0.6 mm ψυχρού ΑΤΡ. Ως control ελέγξαμε και την αλληλεπίδραση των ιστονών Η1, Η2Α, Η2Β. Οι δεσμευμένες ιστόνες αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coοmasie Brilliant Blue R-250. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.28, δεν καταφέραμε να επιτύχουμε σύνδεση καμίας ιστόνης στο τμήμα που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92, είτε αυτό είχε φωσφορυλιωθεί από μεσοφασικό, είτε από μιτωτικό εκχύλισμα HeLa κυττάρων. Παρόμοιο αρνητικό αποτέλεσμα προέκυψε και όταν για την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης GST-(62-92) χρησιμοποιήθηκε 0.5 μg καθαρής ανασυνδυασμένης GST-SRPK1 (αποτέλεσμα που δεν δείχνεται). 121

Σχήμα Γ.28. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης GST-(62-92) στην αλληλεπίδραση της με ιστόνες. Η αντίδραση της φωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε στους 30 C για 2 ώρες παρουσία 0.6 mm ψυχρού ΑΤΡ, ενώ χρησιμοποιήθηκαν ~10 μg μεσοφασικού ή μιτωτικού εκχυλίσματος. (Α) Διαδρομή 1: Ιστόνη Η1. Διαδρομή 2: Ιστόνη Η1 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92). Διαδρομή 3: Ιστόνη Η1 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92) που έχει φωσφορυλιωθεί από μεσοφασικό εκχύλισμα. Διαδρομή 4: Ιστόνη Η1 που συγκατακρημνίζεται με την GST-(62-92) που έχει φωσφορυλιωθεί από μιτωτικό εκχύλισμα. (Β) Διαδρομές 1 και 5: Ιστόνες Η2Α και Η2Β, αντίστοιχα. Διαδρομές 2 και 6: Ιστόνες Η2Α και Η2Β που συγκατακρημνίζονται με την GST-(62-92), αντίστοιχα. Διαδρομές 3 και 7: Ιστόνες Η2Α και Η2Β που συγκατακρημνίζονται με GST-(62-92) που έχει φωσφορυλιωθεί από μεσοφασικό εκχύλισμα, αντίστοιχα. Διαδρομές 4 και 8: Ιστόνες Η2Α και Η2Β που συγκατακρημνίζονται με GST-(62-92) που έχει φωσφορυλιωθεί από μιτωτικό εκχύλισμα, αντίστοιχα. (Γ) Διαδρομές 1 και 5: Ιστόνες Η3 και Η4, αντίστοιχα. Διαδρομές 2 και 6: Ιστόνες Η3 και Η4 που συγκατακρημνίζονται με την GST-(62-92), αντίστοιχα. Διαδρομές 3 και 7: Ιστόνες Η3 και Η4 που συγκατακρημνίζονται με GST-(62-92) που έχει φωσφορυλιωθεί από μεσοφασικό εκχύλισμα, αντίστοιχα. Διαδρομές 4 και 8: Ιστόνες Η3 και Η4 που συγκατακρημνίζονται με GST- (62-92) που έχει φωσφορυλιωθεί από μιτωτικό εκχύλισμα, αντίστοιχα. 122

ΜΕΡΟΣ Β Γ.4. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινο-τελικού τμήματος του LBR με συστατικά της χρωματίνης των σπερματοζωαρίων Γ.4.1. Φωσφορυλίωση της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 από την κινάση SRPK1 Είναι γνωστό ότι η πρωτεϊνική κινάση SRPK1 εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους όρχεις (221). Προκειμένου να ερμηνευτεί η κατανομή της και να διευκρινιστεί ο ρόλος της, αναζητήθηκαν υποστρώματά της στους όρχεις, δηλαδή πρωτεΐνες οι οποίες να περιέχουν στο μόριο τους RS διπεπτίδια. Στην προσπάθεια αυτή ελέγχθηκε, εάν η πρωταμίνη 1 η οποία περιέχει τρία RS διπεπτίδια στο μόριό της (βλ. και σχήμα Γ.35), φωσφορυλιώνεται από την κινάση SRPK1. Συγκεκριμένα, ανθρώπινη πρωταμίνη 1 (που μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Philippe Chevaillier (Laboratoire de Biologie Cellulaire, Université Paris-Val de Marne, France) φωσφορυλιώθηκε από 0.5 μg καθαρή ανασυνδυασμένη GST-SRPK1 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgClB2B, 80 mμ NaCl, 25 32 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Η αντίδραση φωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 30 C και στην συνέχεια οι ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.29, η πρωταμίνη 1 αποτελεί υπόστρωμα για την κινάση SRPK1. Σχήμα Γ.29. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 σε 12% πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) In vitro φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την κινάση GST-SRPK1. 123

Γ.4.2. Αλληλεπίδραση της RS ακολουθίας του LBR με την φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 Κατά την αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες στην διαδικασία της σπερμιογένεσης, οι πρωταμίνες ανιχνεύονται αρχικά στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου (206). Δεδομένου ότι οι RS ακολουθίες θεωρούνται υπεύθυνες για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών, ιδίως όταν η μία RS ακολουθία είναι φωσφορυλιωμένη (222), ελέγχθηκε αν η περιφερειακή εντόπιση της πρωταμίνης 1 οφείλεται στην αλληλεπίδρασή της με τον LBR, δια μέσου των RS ακολουθιών τους. Για το σκοπό αυτό διεξήχθησαν πειράματα συγκατακρήμνισης της πρωταμίνης 1 με τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST-wtNt και GST-ΔRS. Αρχικά, οι πρωτεΐνες GST-wtNt, GST-wtNt που είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από την GST-SRPK1 και GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία, καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης. Ακολούθησε επώαση των καθηλωμένων πρωτεϊνών με πρωταμίνη 1 και πρωταμίνη 1 η οποία προηγουμένως είχε φωσφορυλιωθεί από την κινάση GST-SRPK1. Η δοκιμασία αλληλεπίδρασης έγινε για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 2 mm MgClB2B και 1% Triton X-100. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και θέρμανση για 5 λεπτά στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. Η φωσφορυλίωση της GST-wtNt και της πρωταμίνης 1 από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα που αποτελείται από 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 mm MgClB2, B80 mμ NaCl παρουσία 0.6 mm ΑΤΡ για 2 ώρες στους 30 C. Για να έχουμε ακριβώς τις ίδιες συνθήκες αλληλεπίδρασης και οι μη φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες επωάστηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, αλλά απουσία της GST-SRPK1. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.30, μόνο όταν η πρωταμίνη 1 είναι φωσφορυλιωμένη αλληλεπιδρά με το αμινο-τελικό άκρο του LBR (διαδρομή 5). Η αλληλεπίδραση αυτή προϋποθέτει την ύπαρξη της RS ακολουθίας του LBR, αφού η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 δεν συνδέεται με την πρωτεΐνη GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία (διαδρομή 8). Η μη αλληλεπίδραση της πρωταμίνης με το φωσφορυλιωμένο αμινο-τελικό άκρο αποτελεί σαφή ένδειξη ότι οι RS ακολουθίες των δύο πρωτεϊνών δεν είναι ισοδύναμες. 124

Σχήμα Γ.30. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωταμίνης 1 με το αμινο-τελικό άκρο του LBR. Η πρωταμίνη 1 και η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 (~2 μg πρωτεΐνης σε κάθε περίπτωση) επωάστηκαν με ακινητοποιημένες σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST, GST-wtNt (~2 μg), GST-wtNt η οποία είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί και GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία. Η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 και της πρωτεΐνης GST-wtNt από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 πραγματοποιήθηκε για 2 ώρες στους 30º C παρουσία 0.6 mm ΑΤΡ. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Διαδρομή 1: Καθαρή πρωταμίνη 1. Διαδρομή 2: Πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 3: Φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την GST. Διαδρομή 4: Πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Διαδρομή 5: Φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την GST-wtNt. Διαδρομή 6: Πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την φωσφορυλιωμένη GST-wtNt. Διαδρομή 7: Φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την φωσφορυλιωμένη GST-wtNt. Διαδρομή 8: Φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 που συγκατακρημνίζεται με την GST-ΔRS. Γ.4.3. Συγκατακρήμνιση της πρωταμίνης 1 από πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων ποντικού με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt Προκειμένου να επιβεβαιωθεί το παραπάνω αποτέλεσμα απομονώθηκαν πυρηνικά εκχυλίσματα από όρχεις ποντικού και έγινε δοκιμασία συγκατακρήμνισης της πρωταμίνης 1 που υπάρχει σε αυτά με το ανασυνδυασμένο αμινο-τελικό άκρο του LBR. Αφού 125

καθηλώθηκαν οι πρωτεΐνες GST και GST-wtNt σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης, επωάστηκαν με πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων ποντικού (~300 μg συνολικής πρωτεΐνης) σε συνολικό όγκο 250 μl, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η επώαση έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 2 mm MgClB2B και 1% Triton X-100. Μετά από τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και έγινε ανοσοανίχνευση της δεσμευμένης πρωταμίνης 1 χρησιμοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωμα (βλ. παράγραφο Β.10). Όπως προκύπτει από την ανοσοαποτύπωση (σχήμα Γ.31), το αμινο-τελικό άκρο του LBR μπορεί να συγκατακρημνίσει την πρωταμίνη 1 από πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων ποντικού, σε αντίθεση με την GST. Σχήμα Γ.31. Συγκατακρήμνιση της πρωταμίνης 1 από πυρηνικά εκχυλίσματα όρχεων ποντικού με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt. Γ.4.4. Υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και πρωταμίνης 1 σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρων σωληνίσκων ποντικού Η υποκυτταρική εντόπιση του υποδοχέα της Β λαμίνης και της πρωταμίνης 1 έγινε με ανοσοφθορισμό σε απομονωμένα κύτταρα του σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.35. Για την απομόνωση των κυττάρων επιλέχθηκαν τμήματα του σωληνίσκου των σταδίων VII και VIII, ώστε να 126

περιλαμβάνονται οι σπερματίδες που βρίσκονται στην έναρξη της φάσης επιμήκυνσης. Χρησιμοποιήθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στον LBR και την πρωταμίνη 1 (βλ. παράγραφο Β.10). Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι το Cy3 το οποίο κατά το φθορισμό του στο μικροσκόπιο δίνει κόκκινη χροιά. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με τη χρωστική ουσία DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) που δεσμεύεται στην χρωματίνη και κατά το φθορισμό δίνει γαλάζια χροιά στον πυρήνα των κυττάρων. Σύμφωνα με το αποτέλεσμα του ανοσοφθορισμού (σχήμα Γ.32), ο LBR εντοπίζεται στο αρχικό στάδιο της σπερμιογένεσης στην περιφέρεια του πυρήνα και καταλαμβάνει σχεδόν όλο το σύνολο της πυρηνικής μεμβράνης. Σε αυτό το στάδιο η πρωταμίνη 1 δεν έχει εμφανιστεί ακόμα, ενώ το DNA στην χρωματίνη είναι συνδεδεμένο με ιστόνες. Σε επόμενο στάδιο, εντοπίζεται και η πρωταμίνη 1 στην περιφέρεια του πυρήνα και έχει την ίδια ακριβώς κατανομή με τον LBR του σταδίου αυτού. Συγκεκριμένα, τόσο ο LBR όσο και η πρωταμίνη 1 δεν καταλαμβάνουν όλη την πυρηνική μεμβράνη, αλλά αντίθετα έχουν περιοριστεί μόνο σε ένα τμήμα της. Σχήμα Γ.32. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού. Οι σπερματίδες προέρχονται από αρχικά στάδια επιμήκυνσης. Γ.4.5. Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 6xHis-p32 Το κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pet-15b γονίδιο της ανθρώπινης p32 μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Göran Akusjärvi (Department of Medical Biology and Microbiology, BMC, Uppsala University, Sweden). O πλασμιδιακός αυτός φορέας είναι κατάλληλος για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με 6 ιστιδίνες. Βακτηριακά κύτταρα BL21 μετασχηματίστηκαν με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα και αναπτύχθηκαν 127

στους 37 C με έντονη ανάδευση μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει 0.6-0.7. Η επαγωγή της σύνθεσης της πρωτεΐνης 6xHis-p32 έγινε με την προσθήκη IPTG σε συγκέντρωση 5 mm για 1 ½ ώρες στους 27 C. Η διαδικασία καθαρισμού πρωτεϊνών με ουρά 6 ιστιδινών περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.27. Η έκλουση από την 2+ στήλης αγαρόζης-nip P έγινε με διάλυμα 50 mm NaB2BHPOB4B ph 8.0, 300 mm NaCl και 300 mm ιμιδαζολίου. Από το έκλουσμα της στήλης ελήφθησαν 10 μl δείγματος και ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η βαφή της πηκτής με χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και η ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην p32 επιβεβαίωσαν τη σωστή έκφραση της πρωτεΐνης 6xHis-p32 (σχήμα Γ.33). Σχήμα Γ.33. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της πρωτεΐνης p32 ως πρωτεΐνη σύντηξης με 6 ιστιδίνες. (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 6xHis-p32 σε 12% SDSπηκτή πολυακρυλαμιδίου. (Β) Ανοσοανίχνευση της 6xHis-p32 με την χρήση κατάλληλου πολυκλωνικού αντισώματος. Γ.4.6. Η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 και η πρωτεΐνη p32 συναγωνίζονται για την δέσμευσή τους στην RS ακολουθία του LBR Είναι γνωστό από βιβλιογραφικές αναφορές ότι η πρωτεΐνη p32 δεσμεύεται στην RS ακολουθία του LBR (28, 60). Προκειμένου να επαληθευτεί ότι η θέση δέσμευσης της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 είναι η RS ακολουθία του LBR, ακολούθησε πείραμα συναγωνισμού της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με την πρωτεΐνη p32 για την δέσμευση 128

στην RS ακολουθία. Για το σκοπό αυτό οι πρωτεΐνες GST και GST-wtNt καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης και η GST-wtNt επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης 6xHis-p32 σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST. Στη συνέχεια, ακολούθησε πλύση των σφαιριδίων με ρυθμιστικό διάλυμα 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 2 mm MgClB2B και 1% Triton X-100 και επώαση με την φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Οι πρωτεΐνες που δεσμεύθηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες και στην συνέχεια ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του παραπάνω πειράματος προέκυψε ότι η πρωτεΐνη p32 και η φωσφορυλιωμένη στα RS διπεπτίδιά της πρωταμίνη 1 συναγωνίζονται για την RS περιοχή του LBR. Η δέσμευση της p32 στο αμινο-τελικό άκρο του LBR παρεμποδίζει τη δέσμευση της πρωταμίνης 1, επιβεβαιώνοντας ότι η θέση δέσμευσης της πρωταμίνης 1 είναι η RS ακολουθία του LBR. Σχήμα Γ.34. Αλληλεπίδραση της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR που έχει προηγουμένως επωαστεί με την 6xHis-p32. Η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 (~2 μg πρωτεΐνης σε κάθε περίπτωση) επωάστηκε με ακινητοποιημένες σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης GST, GST-wtNt (~2 μg) και GST-wtNt που είχε προηγουμένως επωαστεί με αυξανόμενες ποσότητες 6xHis-p32 (2, 4 και 6 μg). Η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 πραγματοποιήθηκε για 2 ώρες στους 30º C παρουσία 0.6 mm ΑΤΡ. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Διαδρομή 1: 6xHis-p32. Διαδρομή 2: Φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 από την GST-SRPK1. Διαδρομή 3: Συγκατακρήμνιση της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με την GST. Διαδρομή 4: Συγκατακρήμνιση της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με την GST-wtNt. Διαδρομές 5, 6, 7: Συγκατακρήμνιση της 129

φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με την GST-wtNt που έχει επωαστεί προηγουμένως με 2, 4 και 6 μg 6xHis-p32, αντίστοιχα. Γ.4.7. Δημιουργία μεταλλάξεων στο μόριο της πρωταμίνης 1 Η ακολουθία της πρωταμίνης 1 περιλαμβάνει τρία επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης-σερίνης τα οποία πιθανότατα να αποτελούν θέσεις φωσφορυλίωσης για την κινάση SRPK1. Για να διαπιστωθεί αφ ενός αν η SRPK1 φωσφορυλιώνει κατά προτίμηση τη σερίνη κάποιου συγκεκριμένου διπεπτιδίου, και για να μελετηθεί αφ ετέρου η συνεισφορά κάθε συγκεκριμένου διπεπτιδίου στην αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινο-τελικό άκρο του LBR, πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις στο μόριο της πρωταμίνης 1. Συγκεκριμένα, οι σερίνες στις θέσεις 9, 11 και 13 μετατράπηκαν σε αλανίνες, ενώ δημιουργήθηκε και μία απαλοιφή τεσσάρων αμινοξέων (P PRSKSP 8 11 P) ώστε να απομείνει μόνο ένα RS διπεπτίδιο. Οι μεταλλάξεις που δημιουργήθηκαν απεικονίζονται στο σχήμα Γ.35. Η τεχνική η οποία χρησιμοποιήθηκε για την δημιουργία των παραπάνω μεταλλάξεων ήταν η ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Τα ολιγονουκλεοτίδια που σχεδιάστηκαν για το σκοπό αυτό καθώς και η διαδικασία της μετάλλαξης περιγράφονται στην παράγραφο Β.25. Η επιτυχής μετάλλαξη των αμινοξέων στις θέσεις αυτές επιβεβαιώθηκε με την εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στις αντίστοιχες περιοχές της πρωταμίνης 1 σύμφωνα με τη μέθοδο της παραγράφου B.23. Οι επιτυχώς μεταλλαγμένοι κλώνοι, καθώς και το γονίδιο της πρωταμίνης 1 μετά από πέψη με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoRI και BamHI, κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t, έτσι ώστε η πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της να εκφραστούν αρχικά σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B. 130

Σχήμα Γ.35. Αμινοξική ακολουθία της RS ακολουθίας της πρωταμίνης 1 όπου φαίνονται τα αμινοξέα τα οποία μεταλλάχθηκαν ή απαλείφθηκαν. Σχήμα Γ.36. Εύρεση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων της πρωταμίνης 1, μετά τις σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο της και την απάλειψη των τεσσάρων αμινοξέων. Οι μεταλλάξεις παρουσιάζονται με βάση το νοηματικό κλώνο του γονιδίου. Γ.4.8. Έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα Η πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B μετά από τον μετασχηματισμό τους με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pgex-2t. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την έκφραση και τον καθαρισμό των πρωτεϊνών περιγράφεται στην παράγραφο Β.26. Η επαγωγή της σύνθεσης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης έγινε με την προσθήκη 5 mm IPTG για 1 ώρα στους 27 C. Λόγω του πολύ έντονου βασικού χαρακτήρα της πρωταμίνης χρησιμοποιήθηκε 1 Μ NaCl κατά την εκχύλιση των βακτηριακών κυττάρων, αλλά και κατά 131

τη διάρκεια του καθαρισμού. Μετά την έκλουση από τα σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης, οι πρωτεΐνες σύντηξης ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Σχήμα Γ.37. Ηλεκτροφορητική εικόνα σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, της ανασυνδυασμένης πρωταμίνης (GST-prm1) και των μεταλλαγμάτων της. Η GST-πρωταμίνη αντιστοιχεί στη ζώνη με μοριακή μάζα ~35 kda, ενώ εμφανίζονται και πρωτεολύματα στο ύψος της GST. Γ.4.9. Φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωταμίνης και των μεταλλαγμάτων της από την GST-SRPK1 Η πρωταμίνη 1, καθώς και η ανασυνδυασμένη πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της (ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST), φωσφορυλιώθηκαν από την κινάση GST-SRPK1 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 10 mm MgClB2B, 80 mm NaCl, 25 32 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ-p PΡ] ΑΤΡ. Η αντίδραση φωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε για 30 λεπτά στους 30 C και στην συνέχεια οι ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Το αποτέλεσμα της αυτοραδιογραφίας έδειξε ότι ενώ η GST-SRPK1 φωσφορυλιώνει την πρωταμίνη 1, αδυνατεί να φωσφορυλιώσει την πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της όταν έχουν εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST (σχήμα Γ.38). Λόγω του πολύ 132

μικρού μεγέθους της πρωταμίνης είναι πιθανόν η συνεκφραζόμενη GST να καλύπτει τα RS διπεπτίδια με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η φωσφορυλίωση τους. Στο γεγονός αυτό είναι πιθανόν να συντείνει και κάποιος διμερισμός της GST. Σχήμα Γ.38. In vitro φωσφορυλίωση καθαρής πρωταμίνης 1 (διαδρομή 1), ανασυνδυασμένης πρωταμίνης 1 (διαδρομή 2) και των μεταλλαγμάτων της (διαδρομές 3-6) από την GST-SRPK1. Σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν ~2 μg πρωταμίνης ως υπόστρωμα. Στη φωτογραφία παρουσιάζονται οι ραδιενεργές ζώνες, όπως εμφανίζονται στο φιλμ, μετά από αυτοραδιογραφία της αντίστοιχης πηκτής. Γ.4.10. Έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεΐνες σύντηξης με την ακολουθία FLAG σε ευκαρυωτικά κύτταρα Προκειμένου να ξεπεραστούν οι προηγούμενες δυσκολίες ακολούθησε προσπάθεια κλωνοποίησης του γονιδίου της πρωταμίνης 1 στον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2, ώστε να εκφραστεί σε ευκαρυωτικά κύτταρα 293Τ ως πρωτεΐνη σύντηξης με την ακολουθία FLAG. Η εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA στα 293Τ κύτταρα επιτεύχθηκε με παροδική επιμόλυνση σύμφωνα με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου που περιγράφεται στην παράγραφο Β.28. Μετά από την συμπλήρωση 24 ή 48 ωρών από την στιγμή της επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν και ακολούθησε προσπάθεια ανίχνευσης της παραγόμενης πρωταμίνης 1. Συγκεκριμένα, 10 μl από το κυτταρικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία. Ωστόσο στάθηκε αδύνατον να ανοσοανιχνευθεί η υπερεκφρασμένη πρωταμίνη με το επίτοπο FLAG (αποτέλεσμα που δεν δείχνεται). Το αποτέλεσμα αυτό πιθανότατα οφείλεται στο 133

γεγονός ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την πρωταμίνη δεν καταφέρνουν να επιβιώσουν λόγω υπερβολικής συμπύκνωσης της χρωματίνης τους. Γ.4.11. Έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP σε ευκαρυωτικά κύτταρα Σε μια προσπάθεια να ελαχιστοποιήσουμε την επίδραση της πρωταμίνης στην χρωματίνη των κυττάρων που υφίστανται την παροδική επιμόλυνση, κλωνοποιήθηκαν τα γονίδια της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-n1, ώστε να εκφραστούν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP πρωτεΐνη, η οποία έχει περίπου τριπλάσια μοριακή μάζα από την πρωταμίνη 1 και κατά συνέπεια μειώνει σημαντικά το πολύ θετικό φορτίο της πρωταμίνης. Η έκφραση σε ευκαρυωτικά κύτταρα επιτεύχθηκε με παροδική επιμόλυνση 293Τ κυττάρων σύμφωνα με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου που περιγράφεται στην παράγραφο Β.28. Με τη πάροδο 48 ωρών από τη στιγμή της επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν και ακολούθησε προσπάθεια ανίχνευσης των υπερεκφρασμένων πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, 10 μl από το κυτταρικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. Στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε σημαντική έκφραση τόσο της αγρίου τύπου πρωταμίνης 1 όσο και των μεταλλαγμάτων της (σχήμα Γ.39). Σχήμα Γ.39. Ανοσοανίχνευση εκχυλισμάτων από κύτταρα 293Τ που έχουν επιμολυνθεί παροδικά με GFP (σκέτος πλασμιδιακός φορέας, διαδρομή 1), prm1-gfp (διαδρομή 2), prm1(9sa)-gfp (διαδρομή 3), prm1(11sa)-gfp (διαδρομή 4), prm1(13sa)-gfp (διαδρομή 5) και prm1(del)-gfp (διαδρομή 6) με την χρήση μονοκλωνικού αντισώματος απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. 134

P Δεν είναι όμως γνωστό πρός το παρόν αν οι πρωταμίνες-gfp ενσωματώνονται (και σε ποιά έκταση) στην χρωματίνη των 293Τ κυττάρων, προκαλώντας μικρότερη συμπύκνωση απ ότι η κανονική πρωταμίνη ή αντίθετα παραμένουν σε διαλυτή μορφή. Επίσης, δεν είναι γνωστό αν η παρουσία της GFP πρωτεΐνης επιτρέπει την φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας της πρωταμίνης ή την παρεμποδίζει, όπως συμβαίνει στην περίπτωση υπερέκφρασης στα βακτήρια της GST-πρωταμίνης. Για να απαντήσουμε στα ερωτήματα αυτά, αφ ενός ξεκινήσαμε μία προσπάθεια να ελέγξουμε με δοκιμασίες ανοσοφθορισμού που κατανέμονται σε 293Τ κύτταρα τόσο η πρωταμίνη-gfp όσο και τα μεταλλάγματα της, και αφ ετέρου να παράγουμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι σε φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη. Το αντίσωμα αυτό αναπτύσσεται σε συνεργασία με την ομάδα του Dr. Paolo Sassone-Corsi (IGBMC, Illkirch, Strasbourg, France) απέναντι στο πεπτίδιο P PMARYRCCRSKSRSRCRP (το ίδιο πεπτίδιο είχε χρησιμοποιηθεί και για την ανάπτυξη αντισώματος απέναντι στη μη τροποποιημένη πρωταμίνη 1), στο οποίο όμως οι σερίνες στις θέσεις 9, 11 και 13 είναι φωσφορυλιωμένες. 1 16 Γ.4.12. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεϊνών σύντηξης με την GFP με το αμινο-τελικό άκρο του LBR (GST-wtNt) Παρά το γεγονός ότι δεν είναι γνωστά τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της υπερεκφρασμένης πρωταμίνης-gfp και των μεταλλαγμάτων της, κυτταρικά εκχυλίσματα από 293Τ κύτταρα, που είχαν επιμολυνθεί με GFP (σκέτος πλασμιδιακός φορέας), prm1- GFP, prm1(9sa)-gfp, prm1(11sa)-gfp, prm1(13sa)-gfp και prm1(del)-gfp χρησιμοποιήθηκαν σε αρχικά πειράματα συγκατακρήμνισης με την πρωτεΐνη GST-wtNt. Συγκεκριμένα, η GST-wtΝt καθηλώθηκε σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκε με 200 μl των κυτταρικών εκχυλισμάτων, για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 μg/ml απροτινίνη και 1 mm PMSF). Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και θέρμανση για 5 λεπτά στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε ανοσοανίχνευση των δεσμευμένων πρωταμινών με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.40, η πρωταμίνη 1-GFP και το μετάλλαγμα prm1(9sa)-gfp δεσμεύονται ισχυρότερα στην πρωτεΐνη GST-wtNt, ενώ το μετάλλαγμα prm1(11sa)-gfp δείχνει την μικρότερη αλληλεπίδραση με το αμινο-τελικό άκρο του LBR. Δεν μπορούμε να 135

εξηγήσουμε προς το παρόν γιατί το μετάλλαγμα prm1(del)-gfp στο οπoίο λείπουν οι σερίνες στις θέσεις 9 και 11 εμφανίζει αυτή την ενδιάμεση ικανότητα αλληλεπίδρασης. Σχήμα Γ.40. Αλληλεπίδραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-wtNt με κυτταρικά εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων τα οποία είχαν επιμολυνθεί παροδικά με GFP (σκέτος πλασμιδιακός φορέας, διαδρομή 1), prm1-gfp (διαδρομή 2), prm1(9sa)-gfp (διαδρομή 3), prm1(11sa)-gfp (διαδρομή 4), prm1(13sa)-gfp (διαδρομή 5) και prm1(del)-gfp (διαδρομή 6). Η ανίχνευση της δεσμευμένης πρωταμίνης σε κάθε περίπτωση έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. 136

Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισμών εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει ο τρόπος καθήλωσης της ετεροχρωματίνης στην περιφέρεια του πυρήνα. Έχει προταθεί ότι κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζουν οι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Η παρούσα εργασία εστιάστηκε στον ρόλο που διαδραματίζει στην σύνδεση της χρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο μια από τις πρωτεΐνες αυτές, ο υποδοχέας της λαμίνης Β (Lamin B Receptor, LBR). O LBR αποτελείται από ένα αμινο-τελικό άκρο το οποίο προεξέχει στο πυρηνόπλασμα, μια διαμεμβρανική περιοχή που καταλαμβάνει και το μεγαλύτερο τμήμα του μορίου του και ένα καρβοξυ-τελικό άκρο που επίσης εκτείνεται στο πυρηνόπλασμα (31). Αρχικά διαπιστώθηκε ότι το αμινο-τελικό άκρο του LBR που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1-205 είναι υπεύθυνο για την αλληλεπίδραση του LBR με πολυνουκλεοσώματα, τα οποία απομονώθηκαν από ερυθροκύτταρα γαλοπούλας. Επώαση πολυνουκλεοσωμάτων με το αμινο-τελικό άκρο του LBR που εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα (GST-wtNt) και το ανασυνδυασμένο αμινο-τελικό άκρο του LBR από το οποίο όμως είχε αφαιρεθεί η RS ακολουθία (GST-ΔRS) έδειξε ότι η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία των διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης δεν παίζει καθοριστικό ρόλο στην δέσμευση του αμινο-τελικού άκρου του LBR στα πολυνουκλεοσώματα. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από παρόμοια πειράματα συγκατακρήμνισης, όπου το αμινο-τελικό άκρο είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1. Στα πειράματα αυτά διαπιστώθηκε ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας από την κινάση SRPK1 δεν μεταβάλλει ουσιαστικά την αλληλεπίδραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-wtNt με τα πολυνουκλεοσώματα. Προκειμένου να βρεθεί ποιο συστατικό των νουκλεοσωμάτων είναι υπεύθυνο για την αλληλεπίδραση με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt συμμετείχε σε πειράματα συγκατακρήμνισης με μίγμα ιστονών, καθώς και με κάθε μία ιστόνη ξεχωριστά (Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4). Στα πειράματα αυτά διαπιστώθηκε ότι ο LBR αλληλεπιδρά εκλεκτικά μόνο με τις ιστόνες Η3 και Η4. Η σύνδεση είναι εξειδικευμένη αφού πραγματοποιείται με υψηλή συγκέντρωση αλατιού και απορρυπαντικού. Οι ιστόνες Η3 και Η4 έδειξαν διαφορετική ικανότητα σύνδεσης στο μετάλλαγμα GST-ΔRS. Συγκεκριμένα, η ιστόνη Η4 συνδέεται εξ ίσου καλά και στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-ΔRS (από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία), ενώ αντίθετα μειώνεται σημαντικά η ικανότητα δέσμευσης της Η3, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δύο ιστόνες πιθανά συνδέονται σε 137

διαφορετικές θέσεις στον LBR. Ωστόσο, φαίνεται ότι η αλληλεπίδραση και μόνο της μίας ιστόνης αρκεί για να συνδεθούν τα νουκλεοσώματα στον LBR, αφού σε προηγούμενο αποτέλεσμα έχει βρεθεί ότι η ικανότητα δέσμευσης των δύο ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-wtNt και GST-ΔRS στα πολυνουκλεοσώματα είναι παρόμοια. Επιπρόσθετα διαπιστώθηκε, όπως και στη περίπτωση των πολυνουκλεοσωμάτων, ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του LBR δεν επηρεάζει την δέσμευση των ιστονών Η3 και Η4. Προκειμένου να μελετηθεί πιο διεξοδικά η σύνδεση των ιστονών Η3 και Η4 στον LBR, ακολούθησε προσπάθεια εύρεσης του τμήματος του αμινο-τελικού άκρου του LBR στο οποίο πραγματοποιείται η σύνδεση των ιστονών. Έτσι εκφράστηκαν δύο επιμέρους τμήματα του αμινο-τελικού άκρου, ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST, οι πρωτεΐνες GST-(62-205) και GST-(92-205). Από την πρώτη πρωτεΐνη απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 61, ενώ από την δεύτερη τα αμινοξέα 1 έως 91. Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα συγκατακρήμνισης με τις ιστόνες Η3 και Η4 όπου διαπιστώθηκε ότι οι ιστόνες Η3 και Η4 αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη GST-(62-205), ενώ αντίθετα δεν δεσμεύονται στην GST-(92-205). Έτσι προέκυψε ότι η πιθανή θέση δέσμευσης των ιστονών Η3 και Η4 είναι η περιοχή η οποία περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92. Η περιοχή αυτή συμπεριέχει και την RS ακολουθία. Το επόμενο βήμα ήταν η έκφραση μιας πρωτεΐνης σύντηξης με την GST η οποία περιείχε μόνο το τμήμα που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92, της GST-(62-92). Η πρωτεΐνη αυτή εκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα και απομονώθηκε από το βακτηριακό εκχύλισμα μόνο με την χρήση υψηλής συγκέντρωσης αλατιού (1 Μ NaCl), αφού με την χρήση χαμηλότερης συγκέντρωσης NaCl τα επίπεδα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης δεν ήταν ανιχνεύσιμα. Το γεγονός αυτό πιστεύουμε ότι οφείλεται κυρίως σε έντονη πρωτεόλυση του τμήματος που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 στα βακτήρια, δεδομένου ότι σε χαμηλή συγκέντρωση NaCl εκφράζεται σκέτη GSΤ. Δεν αποκλείεται σε χαμηλή ιονική ισχύ και η κατακρήμνιση ενός σημαντικού μέρους της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης -λόγω του πολύ έντονου βασικού χαρακτήρα της (pi>10.5)- πιθανόν μαζί με κομμάτια χρωμοσωμικού DNA των βακτηρίων. Η GST-(62-92) επωάστηκε με τις ιστόνες Η3 και Η4, αλλά αντίθετα με ότι αναμενόταν δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση. Το γεγονός αυτό μας οδήγησε στην υπόθεση ότι η αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού άκρου του LBR με τις ιστόνες Η3 και Η4 επιτυγχάνεται με την μεσολάβηση ενός αγνώστου παράγοντα, ο οποίος συγκαθαρίζεται με τον LBR από τα βακτηριακά κύτταρα και ο οποίος απομακρύνεται με την χρήση 1 Μ NaCl. Πράγματι, όταν η πρωτεΐνη GST-wtNt προεπωάστηκε με 1 Μ αλάτι παρατηρήθηκε απώλεια 138

της ικανότητας συγκατακρήμνισης της με τις ιστόνες Η3 και Η4, όπως ακριβώς συμβαίνει και με την GST-(62-92). Στην συνέχεια, διαπιστώθηκε ότι ο άγνωστος αυτός παράγοντας, ο οποίος δεσμεύεται στο τμήμα του αμινο-τελικού άκρου που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 και ο οποίος απομακρύνεται μετά από κατεργασία με 1 Μ NaCl, είναι βακτηριακό RNA. Ακολούθησαν πειράματα ώστε να μελετηθεί διεξοδικότερα η αλληλεπίδραση του RNA με το αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Αρχικά, βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη GST-(62-92) έχει την ιδιότητα, εκτός από βακτηριακό RNA, να αλληλεπιδρά και με ευκαρυωτικά RNA. Συγκεκριμένα, δεσμεύει εξίσου καλά trna, συνολικό κυτταρικό RNA, καθώς και πυρηνικό RNA σε διάλυμα χαμηλής ιονικής ισχύς (150 mm ΚCl). Η δέσμευση του πυρηνικού RNA φαίνεται να είναι ισχυρότερη δεδομένου ότι αυτή διατηρείται, σε κάποια έκταση, ακόμη και όταν η ιονική ισχύς του διαλύματος είναι 750 mm. Επίσης, ιδιαίτερα αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι ενώ σε χαμηλές τιμές ιονικής ισχύος δεσμεύεται ένας σχετικά ευρύς πληθυσμός μορίων πυρηνικού RNA, αντίθετα σε υψηλές τιμές δεσμεύεται μόνο ένας συγκεκριμένος πληθυσμός μορίων πυρηνικού RNA. Δεδομένου ότι έχει ήδη δημοσιευτεί η ικανότητα δέσμευσης DNA, in vitro, στην ίδια περιοχή του αμινο-τελικού άκρου (31) διαπιστώσαμε ότι η δέσμευση αυτή είναι εφικτή μόνο σε συνθήκες σχετικά χαμηλής ιονικής ισχύος (<300 mm). Κατόπιν, με δύο διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση του LBR με τις ιστόνες Η3 και Η4, πραγματοποιείται με την μεσολάβηση μορίων RNA. Συγκεκριμένα, έγινε επώαση της πρωτεΐνης GST-(62-92) με την ιστόνη Η3 χωρίς ή μετά από προεπώαση με πυρηνικό RNA. Βρέθηκε ότι μόνο παρουσία RNA η ιστόνη Η3 αλληλεπιδρά με την GST-(62-92). Πραγματοποιώντας ανάλογο πείραμα δεν παρατηρήθηκε δέσμευση της ιστόνης Η4, γεγονός που πιθανά υποδηλώνει διαφορετικό τρόπο δέσμευσης της συγκεκριμένης ιστόνης. Πιθανά, στην περίπτωση της Η4 να μην είναι καθοριστική μόνο η παρουσία του RNA, αλλά να απαιτείται για την δέσμευση της μια ευρύτερη περιοχή του αμινο-τελικού άκρου που να περιλαμβάνει και το τμήμα που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92. Στην υπόθεση αυτή συνηγορεί και το γεγονός ότι ενώ η αφαίρεση της RS ακολουθίας επηρεάζει σημαντικά την πρόσδεση της ιστόνης Η3, αντίθετα αφήνει ανεπηρέαστη την πρόσδεση της Η4. Σε μια δεύτερη προσέγγιση, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-wtNt που είχε προηγουμένως επωαστεί ή όχι με RNase A, χρησιμοποιήθηκε σε πείραμα συγκατακρήμνισης με τις ιστόνες Η3 και Η4. Βρέθηκε ότι υδρόλυση του βακτηριακού RNA που μεταφέρει δεσμευμένο πάνω της η GST-wtNt, οδηγεί σε απώλεια της δέσμευσης και των δύο ιστονών. 139

Τέλος, η φωσφορυλιωμένη GST-(62-92) από μεσοφασικό, μιτωτικό εκχύλισμα ή από την ανασυνδυασμένη GST-SRPK1 επωάστηκε με τις ιστόνες Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 και σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε δέσμευση ιστονών. Η φωσφορυλίωση, αν και αυξάνει τον όξινο χαρακτήρα του αμινο-τελικού άκρου του LBR και προσομοιάζει από ηλεκτροστατικής άποψης με την πρόσδεση του RNA, δεν προκαλεί δέσμευση των βασικών ιστονών. Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε το γεγονός ότι με τις πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιούμε φωσφορυλιώνεται μικρό μόνο μέρος της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) (βρισκόμαστε δηλ. μακριά από την επίτευξη στοιχειομετρικής φωσφορυλίωσης) φαίνεται ότι η παρουσία μορίων RNA είναι καθοριστική και δεν συνεισφέρει μόνο από ηλεκτροστατικής άποψης στην πρόσδεση των ιστονών. Όσον αφορά την θέση δέσμευσης του RNA στον LBR αυτή έχει εντοπιστεί στην περιοχή που περιλαμβάνεται μεταξύ των αμινοξέων 62 έως 92. Δεδομένου ότι η απουσία της RS ακολουθίας επηρεάζει αρκετά την δέσμευση της ιστόνης Η3, ενώ δεν επηρεάζει την δέσμευση της Η4, προκύπτει ότι στην δέσμευση του RNA συμμετέχει μεν η RS ακολουθία αλλά συμμετέχουν και κάποια από τα αμινοξέα δεξιά και αριστερά των RS διπεπτιδίων. Οι περιοχές αυτές δεν περιέχουν κάποια συγκεκριμένη ακολουθία η οποία αναγνωρίζεται σε πρωτεΐνες που δεσμεύουν RNA. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι σε αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες, περιοχές οι οποίες είναι πλούσιες σε θετικά φορτισμένα αμινοξέα και ιδιαίτερα λυσίνες και αργινίνες, είναι υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση με μόρια RNA (222, 223). Επιπλέον, πρόσφατα αποτελέσματα από ερευνητικές ομάδες που μελετούν τον μηχανισμό συγκρότησης του σωματιδίου ματίσματος (spliceosome) δείχνουν ότι οι RS περιοχές (τα επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια και κάποια αμινοξέα εκατέρωθεν αυτών) των παραγόντων ματίσματος του RNA (splicing factors) αλληλεπιδρούν απ ευθείας με το pre-mrna (224, 225). Φαίνεται λοιπόν ότι οι RS περιοχές, που έως τώρα θεωρούνταν αποκλειστικά γέφυρες αλληλεπίδρασης μεταξύ πρωτεϊνών, αποτελούν και πλατφόρμες δέσμευσης RNA. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα των πειραμάτων της παρούσας εργασίας, προκύπτει το συμπέρασμα ότι ένας τρόπος σύνδεσης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης με την ετεροχρωματίνη, είναι η έμμεση σύνδεση του LBR με τις ιστόνες Η3 και Η4, με την μεσολάβηση μορίων RNA. Ίσως, αυτός είναι ένας από τους πολλούς τρόπους που πιθανότατα υπάρχουν για την σύνδεση των διαφορετικών ειδών της ετεροχρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο. Ένας άλλος πιθανός τρόπος είναι η σύνδεση των πρωτεϊνών που ανήκουν στην LEM οικογένεια με τον BAF παράγοντα (24). Εναλλακτικά είναι δυνατόν αυτός ο τρόπος σύνδεσης να λειτουργεί σε μια συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου και στην συνέχεια να αντικαθίσταται από κάποιο άλλο μηχανισμό. Επιπλέον, είναι δυνατόν οι 140

διαφορετικοί μηχανισμοί σύνδεσης της ετεροχρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο να χαρακτηρίζονται από διαφορετική σταθερότητα. Για παράδειγμα, η συστατική ετεροχρωματίνη ίσως συνδέεται σταθερότερα στον πυρηνικό φάκελο από ότι η περιστασιακή ετεροχρωματίνη. Η ιδέα της συμμετοχής μορίων RNA στον σχηματισμό των ετεροχρωματινικών δομών κερδίζει συνεχώς έδαφος τα τελευταία χρόνια. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι το RNA αποτελεί δομικό συστατικό της περικεντρικής ετεροχρωματίνης (142), ενώ μη κωδικά μόρια RNA συμμετέχουν και στην δομή του απενεργοποιημένου Χ χρωμοσώματος των θηλυκών ατόμων, το οποίο σχηματίζει το σωμάτιο Barr κατά τη μεσόφαση (226). Επιπλέον, είναι ενδεικτικό ότι η ΗΡ1, μια πρωτεΐνη που συνδέεται με τον LBR έμμεσα μέσω των ιστονών Η3 και Η4 (227), απαιτεί για την σύνδεσή της στην περικεντρική ετεροχρωματίνη, μεταξύ των άλλων, και την ύπαρξη μορίων RNA (142). Έτσι δεν αποκλείεται ότι ο LBR και η HP1 να σχηματίζουν σύμπλοκο στο οποίο συμμετέχουν οι ιστόνες Η3 και Η4, αλλά και μόρια RNA. Χαρακτηριστικό είναι επίσης ότι με συνδυασμένες δοκιμασίες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και αυτοραδιογραφίας, ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις μικρών πυρηνικών RNA (small nuclear RNA, snrna) στην περιφέρεια του πυρήνα και μάλιστα σε περιοχές όπου υπάρχει συμπυκνωμένη χρωματίνη (228). 141

Σχήμα Δ.1. Yποθετικό μοντέλο πιθανών τρόπων αλληλεπίδρασης της χρωματίνης με πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Οι πρωτεΐνες που ανήκουν στην LEM οικογένεια (εμερίνη, LAP2 πρωτεΐνες και το ΜΑΝ1 αντιγόνο) αλληλεπιδρούν με τον BAF παράγοντα (Barrier-to- Autointegration Factor), ο οποίος συνδέεται μη εκλεκτικά με δίκλωνο DNA (αριστερή πλευρά της εικόνας). Στην δεξιά πλευρά της εικόνας, παρουσιάζεται η πιθανή αλληλεπίδραση των ιστονών Η3 και Η4 με το αμινο-τελικό άκρο του LBR, με την μεσολάβηση μορίων RNA. Με τον ίδιο τρόπο γίνεται και η σύνδεση της πρωτεΐνης ΗΡ1 στην χρωματίνη για την παγίωση της ετεροχρωματινικής δομής. Όπως ήδη αναφέρθηκε έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η σύνδεση των νουκλεοσωμάτων στον LBR γίνεται μέσω του DNA, το οποίο μάλιστα συνδέεται στην περιοχή που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 (31). Πρόσφατα μάλιστα υποστηρίχτηκε ότι η φωσφορυλίωση του τμήματος αυτού του αμινο-τελικού άκρου του LBR επάγει την πρόσδεση του στην χρωματίνη (62). Σύμφωνα με τα ευρήματα της παρούσας εργασίας, η δέσμευση του DNA είναι πολύ πιο χαλαρή από την δέσμευση του RNA και παρατηρείται μόνο σε τιμές χαμηλής ιονικής ισχύος. Δεν αποκλείεται και τα δύο είδη νουκλεϊνικών οξέων να συμμετέχουν σε διαφορετική έκταση κάθε φορά, ανάλογα και με την σύσταση της χρωματίνης, στην πρόσδεση της στον πυρηνικό φάκελο. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ξεκάθαρα ότι η φωσφορυλίωση των RS διπεπτιδίων του LBR από την SRPK1 κινάση παρεμποδίζει την δέσμευση του πυρηνικού RNA, κάτι που παρατηρείται και με άλλες πρωτεΐνες που δεσμεύουν RNA (229). Η φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-(62-92) από μεσοφασικό, μιτωτικό εκχύλισμα ή από την SRPK1 παρεμποδίζει επίσης και την δέσμευση DNA. Η αντίφαση που δημιουργείται με τα αποτελέσματα των Takano et al. (62) πιθανότατα οφείλεται στο γεγονός ότι η συγκεκριμένη ερευνητική ομάδα χρησιμοποιεί για τα πειράματα δέσμευσης όχι σωματική αλλά σπερματική χρωματίνη, η οποία αποτελείται κατά κύριο λόγο όχι από ιστόνες αλλά από πρωταμίνες που περιέχουν RS ακολουθίες στο μόριο τους. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας διερευνήθηκε ο ρόλος του LBR στην διαδικασία της σπερμιογένεσης. Αρχικά διαπιστώθηκε ότι η πρωταμίνη 1 η οποία εντοπίζεται αποκλειστικά στα αρσενικά γεννητικά κύτταρα και περιέχει τρία RS διπεπτίδια στο μόριό της, αποτελεί υπόστρωμα της κινάσης SRPK1. Στην προσπάθεια να αναζητηθεί ο φυσιολογικός ρόλος της φωσφορυλίωσής της από την κινάση SRPK1, διαπιστώθηκε, με πειράματα συγκατακρήμνισης, ότι μόνο όταν η πρωταμίνη 1 είναι φωσφορυλιωμένη στην 142

RS ακολουθία της από την SRPK1 δεσμεύεται στο αμινο-τελικό τμήμα του LBR. Μάλιστα, η δέσμευση πραγματοποιείται στην αντίστοιχη RS ακολουθία του LBR, αφού η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 δεν δεσμεύεται στο μετάλλαγμα GST-ΔRS από το οποίο απουσιάζει η RS ακολουθία. Η μη αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το φωσφορυλιωμένο αμινο-τελικό άκρο του LBR αποτελεί σαφή ένδειξη ότι η αλληλεπίδραση αυτή είναι εξειδικευμένη και με συγκεκριμένο προσανατολισμό. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί το προηγούμενο αποτέλεσμα, το αμινο-τελικό τμήμα του LBR ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST, δεσμεύτηκε σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκε με πυρηνικό εκχύλισμα από όρχεις ποντικού. Με ανοσοανίχνευση διαπιστώθηκε ότι η πρωταμίνη 1 βρίσκεται σε σύμπλοκο με τον LBR, αφού συγκατακρημνίζεται μαζί του από πυρηνικό εκχύλισμα όρχεων. Προκειμένου να επαληθευτεί ότι η θέση δέσμευσης είναι η RS ακολουθία του LBR, πραγματοποιήθηκε πείραμα συναγωνισμού μεταξύ της πρωταμίνης 1 και της p32 για την δέσμευση στο αμινοτελικό τμήμα του LBR, γνωρίζοντας ότι η θέση δέσμευσης της p32 στον LBR είναι η RS ακολουθία. Παρατηρήθηκε ότι η προσθήκη αυξανομένων ποσοτήτων της p32 έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της δέσμευσης της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 στον LBR, επιβεβαιώνοντας ότι η θέση δέσμευσης της πρωταμίνης 1 είναι η RS ακολουθία του αμινο-τελικού τμήματος του LBR (60). Με δοκιμασίες ανοσοφθορισμού σε τμήματα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού διαπιστώθηκε ότι ο LBR και η πρωταμίνη 1, κατά την έναρξη της επιμήκυνσης των σπερματίδων, εντοπίζονται μαζί. Συγκεκριμένα, στην αρχή της σπερμιογένεσης, στο στάδιο των κυκλικών σπερματίδων, ο LBR ανιχνεύεται σε όλο τον πυρηνικό φάκελο. Στο στάδιο αυτό το DNA βρίσκεται συνδεδεμένο με ιστόνες, αφού οι πρωταμίνες δεν βρίσκονται ακόμα στον πυρήνα. Στη συνέχεια καθώς προχωρά η σπερμιογένεση, ο LBR περιορίζεται μόνο σε ένα τμήμα του πυρηνικού φακέλου. Στο ίδιο στάδιο εμφανίζεται και η πρωταμίνη 1 στον πυρήνα, η οποία εντοπίζεται στην περιφέρεια του πυρήνα κάτω από την πυρηνική μεμβράνη. Η εντόπισή της περιορίζεται μόνο σε ένα σημείο της πυρηνικής μεμβράνης και έχει την ίδια ακριβώς εικόνα με τον LBR. Ένα πιθανό μοντέλο το οποίο προτείνεται για την ερμηνεία της αλληλεπίδρασης της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με τον LBR κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης είναι το ακόλουθο: Οι πρωταμίνες συντίθενται στα ριβοσώματα του κυταροπλάσματος και αμέσως μετά τη σύνθεση τους φωσφορυλιώνονται έντονα (230). Για την φωσφορυλίωση των πρωταμινών τύπου 1 και 2 φαίνεται ότι είναι υπεύθυνες διαφορετικές κινάσες. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί 143

ότι η πρωταμίνη τύπου 2 υπόκειται σε φωσφορυλίωση από την κινάση Camk4 (204), ενώ κυρίαρχο ρόλο στην φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 φαίνεται ότι διαδραματίζει η κινάση SRPK1 (203). Μια σειρά από έρευνες τονίζουν τον ρόλο της SRPK1 κινάσης στην διαδικασία της σπερμιογένεσης. Συγκεκριμένα με northern blot ανάλυση έχει βρεθεί ότι η SRPK1 εκφράζεται κυρίως στους όρχεις, ενώ στους υπόλοιπους ιστούς που εξετάστηκαν ανιχνεύεται σε μικρά επίπεδα (221). Στους όρχεις ανοσοανιχνεύεται σε όλα τα αρσενικά γεννητικά κύτταρα, εκτός από τα ώριμα σπερματοζωάρια, γεγονός που υποδηλώνει ότι διαδραματίζει ρόλο πριν την συμπύκνωση της χρωματίνης (221). Ο ρόλος της στους όρχεις ενισχύεται και από το γεγονός ότι η SPK-1, η οποία αποτελεί την ομόλογή της SRPK1 στο είδος C. elegans, είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των σπερματοζωαρίων (231). Η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 εκτιμούμε ότι λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα, καθ οδόν προς τον πυρήνα, σύμφωνα και με τα ευρήματα των Oliva and Dixon (230), αλλά και στηριζόμενοι στην κυτταροπλασματική εντόπιση της SRPK1 (66). Στην συνέχεια, η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 αφού εισέλθει στον πυρήνα, οδηγείται στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου που οριοθετείται από το νεοσχηματιζόμενο ακροσωμικό κυστίδιο. Η αρχική εντόπιση των πρωταμινών στην πυρηνική περιφέρεια είχε διαπιστωθεί και περίπου μια δεκαετία νωρίτερα με δοκιμασίες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας από τους Biggiogera et al. (206). Ίσως η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 να λειτουργεί ως σήμα που διευκολύνει την κατεύθυνση της πρωταμίνης 1 στην συγκεκριμένη περιοχή της πυρηνικής μεμβράνης. Εκεί η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 συνδέεται με τον LBR του οποίου τα RS διπεπτίδια πρέπει να μην είναι φωσφορυλιωμένα. Τα RS διπεπτίδια του LBR μπορεί να προστατεύονται από φωσφορυλίωση, αν είναι συνδεδεμένα με κάποιο άλλο μόριο. Πράγματι, έχει βρεθεί ότι ο LBR έχει την ίδια υποκυτταρική κατανομή στην αρχή της σπερμιογένεσης με την πρωτεΐνη p32 η οποία είναι δεσμευμένη στην RS ακολουθία του (60). Η απομάκρυνση της p32 από την περιφέρεια και η εντόπισή της στο εσωτερικό του πυρήνα, συμπίπτει με την εμφάνιση της πρωταμίνης 1 και την συν-εντόπισή της με τον LBR. Με τον τρόπο αυτό ελευθερώνεται η RS ακολουθία του LBR, έτσι ώστε να δεσμευτεί η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1. Δεν είναι γνωστό ακόμη ποιο είναι το σήμα εκείνο που οδηγεί στην αποσύνδεση της πρωτεΐνης p32 από την RS ακολουθία του LBR Καθώς προχωρά η σπερμιογένεση, η πρωταμίνη 1 σταδιακά αποφωσφορυλιώνεται, απομακρύνεται από την πυρηνική περιφέρεια και εντοπίζεται στο εσωτερικό του πυρήνα όπου δεσμεύεται στο DNA. Με τον τρόπο αυτό γίνεται η απόθεση των πρωταμινών στην χρωματίνη. Πράγματι, όπως ήδη αναφέρθηκε, είναι γνωστό από την βιβλιογραφία ότι η πρωταμίνη 1 εμφανίζεται αρχικά στην περιφέρεια του πυρήνα κάτω από το 144

νεοσχηματιζόμενο ακροσωμικό κυστίδιο (206). Από το σημείο αυτό αρχίζει η συμπύκνωση της χρωματίνης και στη συνέχεια προχωρά προς το πίσω μέρος του πυρήνα, με αποτέλεσμα στα ώριμα σπερματοζωάρια η συμπυκνωμένη χρωματίνη να καταλαμβάνει όλο τον πυρήνα (206). Στην πορεία της σπερμιογένεσης παρατηρείται αλλαγή της εντόπισης του LBR με την σταδιακή μετακίνησή του προς το πίσω μέρος του πυρήνα (posterior pole). Έτσι, ενώ ο LBR κατά την έναρξη της επιμήκυνσης των σπερματίδων ανιχνεύεται στο μπροστά μέρος του πυρήνα, στην συνέχεια εντοπίζεται σε δύο αντιδιαμετρικά αντίθετες θέσεις στην μέση περίπου του πυρήνα, ενώ τελικά εντοπίζεται μόνο στο πίσω μέρος του (60). Με βάση βιβλιογραφικές αναφορές, παρόμοια συμπεριφορά με τον LBR εμφανίζει ακόμα μία πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, η LAP2β, της οποίας η ποσότητα όσο προχωρά η σπερμιογένεση μειώνεται και η κατανομή της περιορίζεται μόνο στο πίσω τμήμα του πυρήνα. Το ίδιο έχει παρατηρηθεί και για τους πυρηνικούς πόρους της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης (232). Ο μηχανισμός με τον οποίο αναδιατάσσονται οι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης δεν είναι γνωστός. Πιθανότατα η μετακίνηση του LBR και γενικότερα των πρωτεϊνών της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης να προηγείται της εξάπλωσης του ακροσωμικού κυστιδίου. Ο πυρηνικός φάκελος, ο οποίος περιβάλλεται από το ακροσωμικό κυστίδιο, δεν είναι λειτουργικός και περικλείει χρωματίνη στην οποία ήδη έχουν εναποθετηθεί οι πρωταμίνες. Πιστεύουμε ότι ο LBR αποτελεί ένα παροδικό σημείο αγκίστρωσης της πρωταμίνης 1 στην πυρηνική περιφέρεια. Η αγκίστρωση αυτή ενδεχομένως να διευκολύνει την ανταλλαγή στο DNA των μεταβατικών πεπτιδίων (transition proteins) από τις πρωταμίνες. Σύμφωνα με την άποψη αυτή, οι νουκλεοπρωτεϊνικές δομές στις οποίες έχει εναποθετηθεί η πρωταμίνη 1, οδηγούνται στο εσωτερικό του πυρήνα και νέα νουκλεοπρωτεϊνικά μόρια τα οποία περιέχουν μεταβατικά πεπτίδια οδηγούνται στην περιφέρεια. Καθώς ο LBR μετακινείται προς το πίσω μέρος του πυρήνα, ολοκληρώνεται η εναπόθεση των πρωταμινών τύπου 1 σε όλη την έκταση του πυρήνα με αποτέλεσμα την συμπύκνωση της χρωματίνης. Σε συμφωνία με την άποψη αυτή είναι γνωστό από την βιβλιογραφία ότι κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης παρατηρούνται μετακινήσεις των χρωμοσωμάτων (233). Κατά μία άλλη άποψη, όχι κατ ανάγκη αντικρουόμενη με την προηγούμενη, ο πυρηνικός φάκελος παίζει τον ρόλο λειτουργικής πλατφόρμας όπου λαμβάνουν χώρα επιπρόσθετες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωταμίνης 1, όπως π.χ. μεθυλίωση. Οι τροποποιήσεις αυτές, όχι μόνον αυξάνουν την αγχιστεία της πρωταμίνης για το DNA, αλλά βοηθούν και στην στρατολόγηση 145

ειδικών μορίων, όπως η HP1 (Heterochromatin Protein 1), η παρουσία της οποίας είναι γνωστό ότι συμπίπτει με συμπυκνωμένη και μεταγραφικά ανενεργή χρωματίνη (234). Σχήμα Δ.2. Υποθετικό μοντέλο των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του LBR, της πρωταμίνης 1 και της πρωτεΐνης p32 κατά την εξέλιξη της σπερμιογένεσης. Στα αρχικά, απλοειδή κύτταρα, η πρωτεΐνη p32 βρίσκεται δεσμευμένη με την RS ακολουθία του LBR. Καθώς η σπερμιογένεση προχωρά, ένα άγνωστο έως τώρα σήμα, οδηγεί στην αποσύνδεση της από τον LBR, αποκαλύπτοντας την RS ακολουθία του. Στην εκτεθειμένη αυτή RS ακολουθία δεσμεύεται στη συνέχεια η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1. Η αποσύνδεση της πρωταμίνης 1 από τον πυρηνικό φάκελο και η τοποθέτηση της στην χρωματίνη, όπου αντικαθιστά τις μεταβατικές πρωτεΐνες (TP, transition proteins) πιστεύεται ότι γίνεται με την αποφωσφορυλίωση της. Προκειμένου να διερευνηθεί διεξοδικότερα η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την SRPK1 και η δέσμευση της στην RS ακολουθία του LBR, δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένες μορφές της πρωταμίνης 1. Ειδικότερα, κάθε σερίνη των τριών RS διπεπτιδίων της πρωταμίνης 1, δηλαδή η σερίνη 9, 11 και 13, αντικαταστάθηκε από αλανίνη. Επίσης, πραγματοποιήθηκε απάλειψη τεσσάρων αμινοξέων (P PRSKSP 8 11 P) της RS ακολουθίας, ώστε τελικά να παραμείνει μόνο ένα RS διπεπτίδιο (μετάλλαγμα Del). Οι πρωτεΐνες εκφράστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST και διαπιστώθηκε με αντίδραση φωσφορυλίωσης ότι ενώ η πρωταμίνη 1 φωσφορυλιώνεται από την SRPK1, η 146