Ποικιλότητα χλωροπλαστικού DNA (cpdna) σε πληθυσμούς οξιάς στη Ροδόπη

Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 1 Ποικιλότητα χλωροπλαστικού DNA (cpdna) σε πληθυσμούς οξιάς στη Ροδόπη 1 Βιδάλη A., 1 Παπαγεωργίου A., 2 Finkeldey R. & 2 Gailing O. 1 Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Τμήμα Δασολογίας & Διαχείρισης Περιβάλλοντος & Φυσικών Πόρων, Πανταζίδου 193, 682 00 Ορεστιάδα, Ελλάς. 2 Abteilung Forstgenetik, Büsgenweg 2, D-37077 Göttingen, Γερμανία. Περίληψη Η οξιά (Fagus spp.) αποτελεί ένα από τα πιο αντιπροσωπευτικά και σημαντικά, από οικολογική και οικονομική άποψη, πλατύφυλλα για την περιοχή της Ευρώπης. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η γενετική ποικιλότητα της οξιάς στην ελληνική Ροδόπη. Συλλέχθηκαν δείγματα πληθυσμών από τις περιοχές Ελατιά, Χαϊντού, Εχίνος, Παπίκιο και Δαδιά και έγινε χρήση μικροδορυφόρων (SSR) για τη γενετική ανάλυση 25 ατόμων από καθέναν από τους τέσσερις πληθυσμούς. Για τις ανάγκες της εργασίας αυτής χρησιμοποιήθηκε ο εκκινητής χλωροπλαστικού DNA ccmp7, που παρουσίασε αποτελέσματα υψηλής ποιότητας και μεγάλο πολυμορφισμό. Συνολικά εντοπίστηκαν έντεκα διαφορετικοί απλότυποι με διαφορετικές συχνότητες για τον κάθε πληθυσμό. Η επεξεργασία των συχνοτήτων αυτών παρουσίασε υψηλά μεγέθη ποικιλότητας τόσο εντός όσο και μεταξύ των εν λόγω πληθυσμών, με τον δεύτερο παράγοντα να εμφανίζεται γενικά υψηλότερος. Επιπλέον παρατηρήθηκε η σταδιακή αύξηση του αριθμού των απλοτύπων από τα δυτικά προς τα ανατολικά. Η τάση αυτή ενισχύει την άποψη ότι οι πληθυσμοί οξιάς της Ροδόπης αποτελούν πιθανό σημείο συνάντησης των δύο ευρωπαϊκών (υπο-) ειδών της οξιάς: της δασικής Fagus sylvatica ssp.sylvatica και της ανατολικής F. sylvatica ssp. orientalis. Chloroplast DNA (cpdna) diversity in Fagus populations of Rodopi Mountains (Greece) 1 Vidalis A., 1 Papageorgiou A., 2 Finkeldey R. & 2 Gailing O. 1 Democritus University of Thrace, Department of Forestry and Management of the Environment and Natural Resources, Pandazidou 193, GR-682 00 Orestiada, Greece. 2 Abteilung Forstgenetik, Büsgenweg 2, D-37077 Göttingen, Germany. Abstract Fagus is one of the most typical tree genera in Europe and the Balkan countries and also one of the most important, ecologically and economically, broadleaved tree in the area of western Eurasia. Bud samples from five Fagus populations (25 individuals sampled from each population) were collected in the area of Rodopi Mountains,

2 Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 northeastern Greece, covering a geographical spread from the west to the east (Elatia, Chaidou, Echinos, Papikio, Dadia). Genetic diversity within and between these populations was estimated by the use of cpdna SSR markers. The primer of cpdna that was used to assess genetic diversity was ccmp7. The analysis of the results demonstrated eleven different haplotypes. The majority of these haplotypes occurred in the easternmost populations (Papikio and Dadia). The analysis of the results revealed high levels of diversity within and among the populations, with the last component generally higher. The results of this study indicate that a possible introgression between the two European (sub-) species Fagus sylvatica ssp. sylvatica and F. sylvatica ssp. orientalis may have occurred in Rodopi. Εισαγωγή Το γένος Fagus ανήκει στην οικογένεια Fagaceae. Στην περιοχή της Ευρώπης και της νοτιοδυτικής Ασίας εκπροσωπείται σύμφωνα με πολλούς ερευνητές από δύο είδη: Fagus sylvatica L. και Fagus orientalis Lipsky (π.χ. Tutin 1964). Άλλοι θεωρούν το δεύτερο είδος ως υποείδος του πρώτου (Greuter et al. 1984). Επιπλέον, η Fagus moesiaca (Maly) Domin θεωρείται φυλογενετικός σύνδεσμος μεταξύ των δύο άλλων ειδών (Mišic 1957) ή ακόμα και υβρίδιο της Fagus sylvatica και της Fagus orientalis (Stoyanoff 1932) και σπανιότερα ξεχωριστό είδος της περιοχής (Czeczott 1933). Είναι γενικά αποδεκτό ότι οι σημερινοί πληθυσμοί της οξιάς στην Ευρώπη έχουν κοινή προέλευσή από κάποιους πληθυσμούς που επέζησαν σε περιοχές καταφύγια (refugia) κατά τη διάρκεια των τελευταίων παγετώνων (Taberlet et al. 1998). Σε ό,τι αφορά τη Fagus sylvatica η περιοχή της Βαλκανικής χερσονήσου φαίνεται να αποτελεί το βασικότερο καταφύγιο (Demesure et al. 1996, Vettori et al. 2004). Οι γενετικές αναλύσεις με χλωροπλαστικό DNA (cpdna) είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για τη μελέτη της μετακίνησης των πληθυσμών των φυτών μετά τους παγετώνες. Για την οξιά, οι Demesure et al. (1996) αναφέρουν ασυνήθιστη ομοιομορφία στο cpdna σε πληθυσμούς από την κεντρική Ευρώπη και τα Βαλκάνια. Αντίθετα, μεγάλη ποικιλότητα μεταξύ και εντός πληθυσμών βρέθηκε στην Ιταλία, ιδιαίτερα στο νότο (Vettori et al. 2004) και στην Τουρκία (Gailing & von Wühlisch 2004). Στην περιοχή της ελληνική Ροδόπης βρέθηκε διακριτή γεωγραφική ποικιλότητα για την οξιά σε μορφολογικούς χαρακτήρες. Η ποικιλότητα στους ανατολικούς πληθυσμούς εμφανίζεται να είναι μεγαλύτερη αυτής των δυτικών (Tsiripidis & Athanasiadis 2003, Μπούτσιος et al. 2004). Οι ίδιοι αναφέρουν ότι η περιοχή της Ροδόπης αποτελεί πιθανό σημείο συνάντησης της F. sylvatica και F. orientalis αφού οι χαρακτήρες των δέντρων μεταβάλλονται κλιμακωτά από τα δυτικά προς τα ανατολικά. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της γενετικής ποικιλότητας στους πληθυσμούς οξιάς της ελληνικής Ροδόπης και η εξαγωγή περισσότερων συμπερασμάτων σχετικά με τα είδη οξιάς που υπάρχουν στην περιοχή και τη μεταναστευτική τους διαδρομή μετά τους παγετώνες. Υλικά και μέθοδοι Τα δείγματα συλλέχθηκαν από πέντε αντιπροσωπευτικούς πληθυσμούς οξιάς της οροσειράς της Ροδόπης (Πίνακας 1). Οι πληθυσμοί ήταν προεπιλεγμένοι με βάση τη

Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 3 γεωγραφική κατανομή που σχημάτιζαν. Από κάθε πληθυσμό συλλέχθηκε δείγμα (οφθαλμοί) 25 ατόμων. Η εκχύλιση DNA από τους οφθαλμούς έγινε με βάση το πρωτόκολλο Dneasy TM 96 plant protocol for isolation of DNA from plant tissue ενώ η εξέταση της ποιότητας και της ποσότητας του DNA πραγματοποιήθηκε σε 0,8% gel αγαρόζης χρωματισμένο με βρωμιούχο αιθίδιο. Πίνακας 1. Γεωγραφική θέση και υψόμετρο των πληθυσμών Fagus που συλλέχθηκαν στα πλαίσια της μελέτης. Γεωγρ. πλάτος Γεωγρ. μήκος Υψόμετρο (m) Ελατιά 41º 28 24º 18 1200 Χαϊντού 41º 19 24º 41 1300 Εχίνος 41º 17 24º 58 800 Παπίκιο 41º 14 25º 25 900 Δαδιά 41º 17 26º 01 700 Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ccmp4, ccmp7, ccmp10. Από αυτά μόνο ο ccmp7 παρουσίασε υψηλής ποιότητας αποτελέσματα και πολυμορφισμό στα δείγματά μας. Το υλικό ενισχύθηκε μέσω PCR με θερμοκρασία επαναδιάταξης (annealing temperature) Ta = 49,2ºC για τους εκκινητές ccmp7 και Ta = 50ºC για τους εκκινητές ccmp10. Ο έλεγχος μεγέθους των πολλαπλασιασμένων τμημάτων DNA πραγματοποιήθηκε στο ABI 3100 Genetic Analyser με Hi Di Formamid και δείκτη Gene Scan 500 ROX. Υπολογίστηκαν οι δείκτες ποικιλότητας Hs (ποικιλότητα εντός πληθυσμών), Ht (συνολική ποικιλότητα) και συνολικής διαφοροποίησης Gst (Pons & Petit 1995) καθώς και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ πληθυσμών (Nei 1972) από τις οποίες προέκυψε το δενδρόγραμμα UPGMA. Αποτελέσματα Το ζεύγος εκκινητών ccmp7 (SSR) αποδείχτηκε εξαιρετικά πολυμορφικό στα δείγματα. Συνολικά βρέθηκαν έντεκα απλότυποι για το μοναδικό γονιδιακό τόπο που όρισε το παραπάνω ζεύγος εκκινητών. Αναλυτικά βρέθηκαν οι εξής αριθμοί απλοτύπων: τρεις στην Ελατιά, πέντε στη Χαϊντού, τρεις στον Εχίνο και από οχτώ για καθέναν από τους πληθυσμούς του Παπίκιου και της Δαδιάς. Οι απόλυτες συχνότητες των απλοτύπων στον κάθε πληθυσμό φαίνονται στον Πίνακα 2, όπου οι απλότυποι που βρέθηκαν συμβολίζονται με τον αριθμό των ζευγών βάσεων που καθορίζει το μέγεθος των τμημάτων DNA που ενισχύθηκαν. Η επεξεργασία των συχνοτήτων εμφάνισε υψηλά μεγέθη ποικιλότητας. Συγκεκριμένα, η γενετική ποικιλότητα μέσα στους πληθυσμούς (Hs) ήταν 0.575, ενώ η συνολική γενετική ποικιλότητα Ht ήταν 0.841. Η συνολική διαφοροποίηση των πληθυσμών (Gst) βρέθηκε επίσης σε υψηλά επίπεδα φτάνοντας την τιμή 0,361 που αποτελεί σημαντικό μέρος της συνολικής ποικιλότητας.

4 Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 Πίνακας 2. Απόλυτες συχνότητες απλοτύπων σε πληθυσμούς Fagus της Ελληνικής Ροδόπης. Απλότυπος Ελατιά Χαϊντού Εχίνος Παπίκιο Δαδιά 145 1 1 146 1 5 19 8 4 147 2 1 8 148 23 6 1 3 149 1 1 150 9 5 10 151 1 1 1 152 5 153 1 1 154 1 156 1 Σύνολο Δείγματος 25 23 25 24 24 Ο αριθμός απλοτύπων (n) και ο λειτουργικός αριθμός απλοτύπων (ne) σε κάθε πληθυσμό φαίνoνται στην Εικ. 1. Στον ανατολικότερο πληθυσμό της Δαδιάς παρατηρείται ο μεγαλύτερος λειτουργικός αριθμός απλοτύπων, ενώ τις μικρότερες τιμές εμφανίζει ο δυτικότερος πληθυσμός της Ελατιάς. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ελατιά Χαϊντού Εχίνος Παπίκιο Δαδιά n ne Εικόνα 1. Ραβδόγραμμα αριθμού απλοτύπων (n) και λειτουργικού αριθμού απλοτύπων (ne) σε πληθυσμούς Fagus της Ελληνικής Ροδόπης. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών του δείγματός μας απεικονίζονται στο δενδρόγραμμα της Εικ. 2. Ο δυτικότερος πληθυσμός (Ελατιά) είναι πιο απομακρυσμένος από τους υπόλοιπους πληθυσμούς, ενώ οι πληθυσμοί του Παπίκιου και του Εχίνου ομαδοποιούνται σε μικρότερες γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους.

Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 5 Συζήτηση - Συμπεράσματα Από τη μελέτη των αποτελεσμάτων γίνεται εμφανές το γεγονός ότι οι υπό μελέτη πληθυσμοί παρουσιάζουν μεγάλη γενετική ποικιλότητα, τόσο μεταξύ των ατόμων τους όσο και μεταξύ τους, με την ποικιλότητα στο σύνολο των πληθυσμών να είναι ελαφρά μεγαλύτερη, γεγονός που αποδεικνύει πως το μεγαλύτερο μέρος της ποικιλότητας, δεν οφείλεται στη διαφοροποίηση, αλλά στην εντός πληθυσμών ποικιλότητα. Η μεγάλη αυτή ποικιλότητα συναινεί στην άποψη ότι η περιοχή των Βαλκανίων αποτέλεσε για την Fagus sylvatica το σημαντικότερο καταφύγιο (Hazler et al. 1997, Demesure et al. 1996, Vettori et al. 2004), αφού τόσο μεγάλος αριθμός απλοτύπων εντός και μεταξύ των πληθυσμών με τη μελέτη ενός μόνο γονιδιακού τόπου SSR βρίσκεται για πρώτη φορά. Μεγάλα ποσοστά ποικιλότητας σε απλότυπους οξιάς βρέθηκαν και στην Ιταλία αλλά στον έναν primer που εξετάσαμε στην εργασία αυτή βρέθηκαν μόνο τρεις απλότυποι. Επίσης, το μεγαλύτερο μέρος της συνολικής ποικιλότητας οφείλονταν σε διαφορές μεταξύ πληθυσμών και όχι στην ποικιλότητα εντός των πληθυσμών (Vettori et al. 2004) αντίθετα, δηλαδή, με τα αποτελέσματα για την ελληνική Ροδόπη. Εικόνα 2. Δενδρόγραμμα γενετικών αποστάσεων κατά Nei (1972) σε πληθυσμούς Fagus της Ελληνικής Ροδόπης. Επιπλέον, παρατηρείται η σταδιακή αύξηση του αριθμού των απλοτύπων από τους δυτικούς προς τους ανατολικούς πληθυσμούς με εξαίρεση τον πληθυσμό του Εχίνου, ο οποίος πιθανώς λόγω της έντονης εκμετάλλευσης που υφίσταται από τους παραδασόβιους πληθυσμούς και τον κατακερματισμό του πληθυσμού της οξιάς, επιδεικνύει χαμηλά επίπεδα ποικιλότητας. Η παρατήρηση αυτή συμφωνεί με αντίστοιχες παρατηρήσεις που έγιναν στην ίδια περιοχή ύστερα από εξέταση μορφολογικών χαρακτηριστικών (Gömöry et al. 1999, Denk et al. 2002, Μπούτσιος et al. 2004). Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις, οι ανατολικοί πληθυσμοί εμφάνισαν υψηλότερη ποικιλομορφία στο μέγεθος και στο σχήμα των φύλλων από τους δυτικούς.

6 Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 Επιπλέον οι Μπούτσιος et al. (2004) αναφέρουν ότι οι μορφολογικοί χαρακτήρες των φύλλων των δυτικότερων πληθυσμών μοιάζουν με αυτούς της F. sylvatica ενώ πιο ανατολικά τα χαρακτηριστικά έμοιαζαν με αυτά της F. orientalis. Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις ενισχύονται από τα αποτελέσματα της δικής μας έρευνας, η οποία υποδεικνύει ότι ο κύριος απλότυπος που βρέθηκε στην Ελατιά χαρακτηρίζει την ελληνική F. sylvatica, ενώ οι απλότυποι των ανατολικών πληθυσμών έχουν βρεθεί σε ανατολικότερους πληθυσμούς (Gailing & von Wühlisch 2004). Επίσης, η τάση αύξησης της ποικιλότητας στα ανατολικά ενισχύει την άποψη ότι η Ελληνική Ροδόπη αποτελεί πιθανό σημείο συνάντησης των (υπο-) ειδών F. sylvatica και F. orientalis, αφού η δεύτερη εμφανίζει γενικά υψηλά επίπεδα ποικιλότητας τόσο σε μορφολογικά χαρακτηριστικά (Denk 1999a,b, Μπούτσιος et al. 2004), όσο και σε γονιδιακούς δείκτες (Μπούτσιος et al. 2004, Gailing & von Wühlisch 2004). Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις, οι μορφολογικοί χαρακτήρες των φύλλων των δυτικότερων πληθυσμών μοιάζουν με αυτούς της F. sylvatica ενώ όσο περισσότερο ανατολικά είχαν συλλεχθεί δείγματα τόσο περισσότερο τα χαρακτηριστικά τους μοιάζουν με την F. orientalis. Για την καλύτερη διερεύνηση της μίξης των δύο ευρωπαϊκών (υπο-) ειδών οξιάς στη Ροδόπη απαιτείται περαιτέρω έρευνα σε περισσότερους πληθυσμούς και με περισσότερους δείκτες. Βιβλιογραφία Czeczott H. 1933. Studium nad zmiennoś cia liś ci buków: Fagus orientalis Lipsky, F. sylvatica L. i form poś rednich. Cz. 1. Rocznik Dendrologiczny 5: 45-121. Demesure B., Comps B. & Petit R. 1996. Chlroplast DNA phylogeography of the common beech (Fagus sylvatica L.) in Europe. Evolution 50: 2515-2520. Denk T. 1999a. The taxonomy of Fagus in western Eurasia, 1: Fagus sylvatica subsp. orientalis (= F. orientalis). Feddes Repertorium 110: 3-4, 117-200. Denk T. 1999b. The taxonomy of Fagus in western Eurasia, 2: Fagus sylvatica subsp. sylvatica. Feddes Repertorium 110: 5-6, 381-412. Denk T., Grimm G., Stögerer K., Langer M. & Hemleben V. 2002. The evolutionary history of Fagus in western Eurasia: Evidence from genes, morphology and the fossil record. Plant Syst. Evol. 232: 213-236. Gailing O. & von Wühlisch G. 2005. Nuclear markers (AFLPs) and chloroplast microsatellites differ between Fagus sylvatica and Fagus orientalis. Silvae Genetica 53: 105-110. Gömöry D., Paulie L., Brus R., Zhelev P., Tomović & Gračan J. 1999. Genetic differentiation and phylogeny of beech on the Balkan peninsula. J. Evol. Biol. 12: 746-754. Greuter W., Burdet H.M. & Long G. 1984. Med-Checklist 1. Genève & Berlin. Hazler K., Comps B., Šugar I., Melovsky L. Tashev A. & Gračan J. 1997. Genetic structure of Fagus sylvatica L. populations in Southeastern Europe. Silvae Genetica 46, 4. Mišic V. 1957. Ecological variability of European beech in Yugoslavia. Inst. N. R. Serbiji Beograd. Μπούτσιος Σ., Τσιριπίδης Ι., Παπαγεωργίου Α.Χ. & Γαλατσίδας Σ. 2004. Ποικιλότητα

Πρακτικά 10 ου Συνεδρίου Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας, 2005 7 μορφολογικών χαρακτήρων των φύλλων οξιάς της Ροδόπης. Πρακτικά 1ου Πανελλήνιου Περιβαλλοντικού Συνεδρίου, «Σύγχρονα Περιβαλλοντικά Προβλήματα», Ν. Ορεστιάδα, 7-9 Μαίου 2004, ΓΕΩΤΕΕ, Θεσσαλονίκη. Nei M. 1972. Genetic distance between populations. American Naturalist 106: 283-292. Pons O. & Petit R.J. 1995. Estimation, variance and optimal sampling of gene diversity. I. Haploid locus. Theoretical & Applied Genetics 90: 462-470. Stoyanoff N. 1932. The beech woods of the Balkan Peninsula. Die Buchenwälder Europas: 182-219. Berne. Taberlet P., Fumagalli L., Wust-Sausy A. & Cosson J. 1998. Comparative phylogeography and postglacial colonization routes in Europe. Molecular Ecology 7: 453-464. Tsiripidis I. & Athanasiadis N. 2003. Contribution to the knowledge of the vascular flora of NE Greece: floristic composition of the beech (Fagus sylvatica L.) forests in the Greek Rodopi. Willdenowia 33: 273-298. Tutin T.G. 1964. Fagus L. In: Tutin T.G., Heywood V.H., Burges N.A., Moore D.M., Valentine D.H., Walters S.M. & Webb D.A. (eds), Flora Europaea 1. Cambridge. Vettori C., Vendramin G.G., Anzidei M., Pastorelli R., Paffetti D. & Giannini R. 2004. Geographic distribution of chloroplast variation in Italian populations of beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical & Applied Genetics 109: 1-9.