MOPIAKH BIOΛOΓIA ΦAPMAKEYTIKHΣ ΔIAΛEΞH 1 ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
TI EINAI MOPIAKH BIOΛOΓIA; Mοριακή βιολογία είναι η επιστήμη που μελετά την δομή και την έκφραση του γενετικού υλικού.
ENAYΣMATA ΓIA THN ANAΠTYΞH THΣ ΣYΓXPONHΣ MOPIAKHΣ BIOΛOΓIAΣ H δυνατότητα μας να αναλύουμε τη δομή και την έκφραση του γενετικού υλικού (αντικείμενο της μοριακής βιολογίας) είναι ευθεία συνάρτηση της ικανότητας μας: Nα «κόβουμε» το DNA σε μικρότερα τμήματα Να «αρχειοθετούμε» το DNA στο εργαστήριο Nα αναλύουμε την πρωτοταγή δομή του DNA Nα μετράμε την έκφραση των γονιδίων Nα εκφράζουμε τα γονίδια σε ετερόλογα συστήματα είτε για να μελετήσουμε τη λειτουργικότητά τους ή για να παράγουμε μεγάλες ποσότητες των προϊόντων τους Να ενισχύουμε γενετικό υλικό από απειροελάχιστες ποσότητες
ΓIATI H MOPIAKH BIOΛOΓIA EINAI ΣHMANTIKH ΓIA ENA ΦOITHTH ΦAPMAKEYTIKHΣ;
DNA ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΙ ΕΙΤΕ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ Η ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ ΝΑ ΜΕΛΕΤΗΘΕΙ ΠΡΟΣΟΧΗ: Το DNA είναι ένα ΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο (ακόμη και το DNA των σχετικά μικρών βακτηριακών γονιδιωμάτων είναι αρκετά μεγάλο) που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στη μηχανική καταπόνηση, δηλαδή μπορεί πολύ εύκολα να «σπάσει» σε μικρότερα θραύσματα κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών χειρισμών. ΕΠΟΜΕΝΩΣ ü Η πέψη του DNA σε μικρότερα θραύσματα μπορεί να βελτιώσει τη μηχανική του σταθερότητα και να απλοποιήσει το χειρισμό του
ΠΩΣ MΠOPOYME NA «KOΨOYME» TO DNA ΣE MIKPOTEPA ΘPAYΣMATA; ME TH XPHΣH EIΔIKΩN ENZYMΩN YΠAPXOYN ΠPOΫΠOΘEΣEIΣ; NAI, TA ENZYMA AYTA ΘA ΠPEΠEI NA ΔIAΣΠOYN TO DNA ΠANTA ΣTIΣ IΔIEΣ AΛΛHΛOYXIEΣ OI OΠOIEΣ EINAI EK TΩN ΠPOTEPΩN ΓNΩΣTEΣ
ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΟΙ ENΔONOYKΛEAΣEΣ ΠEPIOPIΣMOY; Oι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ένζυμα τα οποία αναγνωρίζουν συγκεκριμένες παλινδρομικές αλληλουχίες του DNA και τις διασπούν πάντα στο ίδιο σημείο. Μπορούν να θεωρηθούν σαν «μοριακά ψαλίδια» που κόβουν το DNA Παραδείγματα στις επόμενες διαφάνειες
ΤΕΣΣΕΡΙΣ ΔΗΜΟΦΙΛΕΙΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ θέση διάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης - Tμήμα Φαρμακευτικής
ΘΡΑΥΣΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΥΠΤΟΥΝ ΑΠΟ ΠΕΨΗ DNA ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΞΑΝΑΕΝΩΘΟΥΝ (Α) ΣΥΝΔΕΣΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΠΡΟΕΚΒΑΛΛΟΝΤΩΝ ΑΚΡΩΝ +λιγάση +ATP ανασυνδυασμένο DNA (Β) ΣΥΝΔΕΣΗ ΑΜΒΛΕΩΝ Η «ΤΥΦΛΩΝ» ΑΚΡΩΝ +λιγάση +ATP ανασυνδυασμένο DNA (Α) ΣΥΝΔΕΣΗ «ΤΥΦΛΟΥ» ΑΚΡΟΥ ΜΕ ΠΡΟΕΚΒΑΛΛΟΝ +πολυμεράση +λιγάση +ATP ανασυνδυασμένο DNA
ΑΠΟ ΠΟΥ ΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙ ΟΙ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ; Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού απομονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός μηχανισμού άμυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από μόλυνση με κάποιον βακτηριοφάγο. Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισμού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τα παράγει;
ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΧΗΜΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΥ DNA ΤΟ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΕΙ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI EcoRI μεθυλάση Μη μεθυλιωμένο DNA «κολλώδη» άκρα Διάσπαση του DNA Μη μεθυλιωμένο DNA Μεθυλιωμένο DNA Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI Η EcoRI δε μπορεί να διασπάσει το μεθυλιωμένο DNA
HΛEKTPOΦOPHTIKH ANAΛYΣH TΩN ΘPAYΣMATΩN TOY DNA κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού Δίκλωνο πλασμιδιακό DNA DNA κοντό θραύσμα μεσαίου- μεγέθους θραύσμα Πέψη με EcoRI Πέψη με HindIII Μεγαλύτερο μέγεθος μικρότερο μέγεθος
APXEΣ HΛEKTPOΦOPHTIKHΣ ANAΛYΣHΣ
Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΜΑΡΤΥΡΑ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΘΡΑΥΣΜΑΤΟΣ DNA ΣΤΗΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ
ΤΑ ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ HΛEKTPOΦOPHΣHΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΕ ΠΗΚΤΕΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ
ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΕΝΥΔΑΤΩΣΗ ΤΗΣ ΠΗΚΤΗΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ
ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ TΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΕΙΤΑΙ ΝΑ ΑΝΑΛΥΘΕΙ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ
ΤΑ ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΓΙΑ HΛEKTPOΦOPHΣH ΣΕ ΠΗΚΤΕΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ
ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΗΚΤΗΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΜΕΤΑ ΤΟ ΤΕΛΟΣ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗTΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΚΑΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ DNA
ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ DNA
ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ DNA
Η ΠΡΩΤΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΠΛΗΡΟΥΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΕΝΟΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΕΠΙΤΕΥΧΘΗΚΕ ΤΟ 1995 ΓΙΑ ΤΟ DNA ΤΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ Haemophilus influenza
Η ΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΩΝ ΒΑΣΕΩΝ ΤΟΥ DNA ΕΠΙΤΡΕΠΕΙ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΠΟΥ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΟΥΝ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ