9. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ

9. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΣΩ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Ο Μεταβολισός εξαρτάται από την εταφορά θρεπτικών ουσιών από το εξωτερικό του κυττάρου έσο εβρανών στο εσωτερικό του κυττάρου. Συγκέντρωση εξωτερικά του κυττάρου ( ο ) Συγκέντρωση εσωτερικά του κυττάρου ( i ) Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί ηχανισοί συστατικών έσω εβρανών: 1. Παθητική Διάχυση (passive diffusion): Είναι η συνηθισένη διάχυση που προκαλείται από την διαφορά συγκεντρώσεων εκτός και εντός του κυττάρου. Εποένως έχουε εταφορά όνον όταν o > i. Η διαφορά ελεύθερης ενέργειας είναι αρνητική: ΔG RTln( i / o ) Ο ρυθός εταφοράς άζας δίνεται από τον σχέση: N k ( o - i ) (mol/cm 2 s) όπου k είναι ο συντελεστής διαπερατότητας (permeability coefficient, cm/s). Παθητική διάχυση χρησιοποιείται για την πρόσληψη ύδατος και οξυγόνου. Λιπίδια και άλλες υδρόφοβες ενώσεις έχουν σχετικά υψηλό συντελεστή διάχυσης διαέσου εβρανών (~10-8 cm 2 /sec) που συνεπάγεται ότι η παθητική διάχυση πορεί να επιτύχει σηαντική εταφορά θρεπτικών ουσιών. 2. Διάχυση ε Διευκόλυνση (facilitated diffusion): Όταν έχουε την εταφορά ηλεκτρικά φορτισένων ορίων και πολικών ουσιών που δεν είναι λιποδιαλυτές, τότε απαιτείται η χρήση ειδικών ενώσεων (εταφορείς) που βοηθούν στην εταφορά έσω της εβράνης ε την δηιουργία συπλόκου. Οι εταφορείς είναι ένζυα και ονοάζονται περιάσες. Η συσχέτιση του ρυθού εταφοράς και τις συγκεντρώσεις εντός και εκτός του κυττάρου είναι της ορφής: Καλογεράκης 2003 74

N o N, K T + o i K T + i Όταν είναι o > i έχουε εταφορά από το εξωτερικό του κυττάρου στο εσωτερικό και αντίστροφα. Η εταφορά των ουσιών γίνεται από την ψηλή συγκέντρωση προς την χαηλή και εποένως είναι θεροδυναικά ευνοούενη. Διάχυση ε διευκόλυνση παρατηρείται συχνά στην εταφορά σακχάρων και άλλων οργανικών ενώσεων χαηλού οριακού βάρους (κυρίως σε ευκαρυωτικά κύτταρα). Κλασσικό παράδειγα διάχυσης ε διευκόλυνση σε προκαρυωτικά κύτταρα είναι η εταφορά της γλυκερόλης (glycerol) σε εντερικά βακτήρια (E. coli). 3. Ενεργός Μεταφορά (active transport): Σε πολλές περιπτώσεις απαιτείται η πρόσληψη ουσιών από το κύτταρο ακόα και όταν η συγκέντρωση της ουσίας στο εσωτερικό του κυττάρου είναι πολλές φορές εγαλύτερη της εξωτερικής (> 100 φορές). Η εταφορά αυτή πορεί να γίνει εάν καταναλωθεί ενέργεια από το κύτταρο εγαλύτερη της θεροδυναικά απαιτούενης ΔG RTln( i / o ). Όταν τα όρια είναι φορτισένα, τότε απαιτείται επιπλέον ενέργεια (+zfδψ). Η ενεργός εταφορά είναι πού σηαντική για την εταφορά των ιόντων νατρίου και καλλίου (Na +, K + ). Η ενεργός εταφορά οιάζει ε την διάχυση ε διευκόλυνση ως προς την απαιτούενη παρουσία πρωτεϊνών που βρίσκονται στην κυτταρική εβράνη αλλά διαφέρει διότι γίνεται ενάντια στην ψηλή συγκέντρωση. Ο ρυθός δίνεται από την σχέση: N o N, K T + o 4. Μεταφορά ε Χηική Μετατροπή (group translocation): Ο τρόπος αυτός είναι σηαντικός για την εταφορά πολλών σακχάρων σε βακτήρια. Αντί να χρησιοποιείται πολύ ενέργεια για την εταφορά ανέπαφου του συστατικού, συνδυάζεται η εταφορά ε χηική ετατροπή (που θα γινόταν ούτως η άλλως εντός του κυττάρου για τον καταβολισό του εισερχόενου συστατικού). Κλασσικό παράδειγα είναι το σύστηα εταφοράς σακχάρων ε την σύγχρονη φωσφορυλίωση του σακχάρου (phosphotransferase system). Καλογεράκης 2003 75

10. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μοριακή Βιολογία η ελέτη του τρόπου διάδοσης και ρύθισης γενετικών πληροφοριών. Η γενετική πληροφορία του κυττάρου περιέχεται στο DNA ( ένας διπλός έλικας που αποτελείται από δύο κλώνους πολυ-δεσόξυ-ριβοζο-νουκλεοτιδίων). Το DNA χωρίζεται σε γονίδια (genes). Κάθε γονίδιο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή ιας συγκεκριένης πρωτεΐνης ή τήατος της. Το δόγα της οριακής βιολογίας Το DNA δρα ως εκαγείο (template) για την αναπαραγωγή του (replication) καθώς και για την εταγραφή πληροφοριών σε RNA για την παραγωγή RNA το οποίο εν συνεχεία χρησιοποιείται για την παραγωγή πρωτεϊνών. Η παραγωγή ιας πρωτεΐνης ( έκφραση της πληροφορίας του γονιδίου, gene epression) γίνεται σε δύο στάδια (ι) εταγραφή (transcription) και (ιι) ετάφραση (translation). DNA Transcription εταγραφή RNA Translation ετάφραση Πρωτεΐνη Replication αντιγραφή Reverse Transcription Ο Γενετικός Κώδικας: Για την εταφορά πληροφοριών χρειάζεται ία γλώσσα. Κάθε ζωντανός οργανισός (από βακτήρια έως ανθρώπους) χρησιοποιεί 4 γράατα που αντιστοιχούν στα 4 νουκλεοτίδια που απαρτίζουν το DNA (βάσεις: A, adenine G, guanine T, thymine C, cytosine) ή το RNA (βάσεις: A, adenine G, guanine U, uracil C, cytosine). Κάθε τριάδα από νουκλεοτίδια του mrna αποτελεί ία λέξη (κωδικόνιο) που αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριένο αινοξύ. Με τέσσερις βάσεις και τρεις θέσεις έχουε 4 3 64 πιθανές λέξεις (codons) που είναι υπεραρκετά δεδοένου ότι έχουε 20 αινοξέα που εφανίζονται στο DNA. Η αποκωδικοποίηση της αντιστοιχίας λέγεται γενετικός κώδικας και επιτεύχθηκε το 1961-1966. Προφανώς ο κώδικας αυτός είναι "εκφυλισένος" (degenerate) δεδοένου ότι πάνω από ένα κωδικόνιο αντιστοιχεί σε ένα αινοξύ. Τρία κωδικόνια UAA, UAG & UGA δεν αντιστοιχούν σε αινοξέα αλλά στο TOP (τέλος της εταγραφής). Ο γενετικός κώδικας ισχύει σχεδόν πάντοτε. Υπάρχουν όνο ελάχιστες εξαιρέσεις (ιδιαίτερα στα ιτοχόνδρια για την πρόσληψη σπανίων αινοξέων). Καλογεράκης 2003 76

Πρώτη βάση Δεύτερη βάση U C A G U UUU phe φαινυλαλανίνη UCU ser σερίνη UAU tyr τυροσίνη UGU cys Κυστείνη UUC phe UCC ser UAC tyr UGC cys UUA leu UCA ser UAA TOP UGA TOP λευκίνη UUG leu UCG ser UAG TOP UGG try C CUU leu CCU pro προλίνη CAU his ιστιδίνη CGU arg αργινίνη CUC leu CCC pro CAC his CGC arg CUA leu CCA pro CAA glu-n CGA arg γλουταίνη CUG leu CCG pro CAG glu-n CGG arg A AUU ileu ACU thr AAU asp-n AGU ser ισολευκίνη θρεονίνη ασπαρτίνη AUC ileu ACC thr AAC asp-n AGC ser AUA ileu ACA thr AAA lys AGA arg AUG met εθιονίνη ACG thr AAG lys λυσίνη AGG arg G GUU val βαλίνη GCU ala αλανίνη GAU asp Ασπαρικό οξύ GGU gly γλυκίνη GUC val GCC ala GAC asp GGC gly GUA val GCA ala GAA glu GGA gly γλουταινικό οξύ GUG val GCG ala GAG glu GGG gly ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ (Transcription): Μεταγραφή είναι η παραγωγή ενός ορίου, mrna (messanger RNA), χρησιοποιώντας σαν εκαγείο ένα κλώνο DNA. Η διαδικασία παραγωγής αρχίζει ε την προσκόλληση του ενζύου RNA polymerase σε συγκεκριένη θέση του DNA (εκεί που βρίσκεται ο υποκινητής γονιδίου, promoter και ενώνεται ε την πρωτείνη σ του ενζύου). Μια συγκεκριένη σειρά βάσεων στο DNA δίνει το ήνυα τερατισού της παραγωγής του mrna. Καλογεράκης 2003 77

Ενζυική ρύθιση της παραγωγής πρωτεϊνών Το κύτταρο χρησιοποιεί δύο διεργασίες για την ρύθιση της έκφρασης των γονιδίων. Διέγερση (Enzyme Induction): χρησιοποιείται κυρίως για την ρύθιση του καταβολισού (π.χ., ρύθιση σύνθεσης του ενζύου β-γαλακτοσιδάση). Υποκινητής Ρυθιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3 DNA RNA polymerase Repressor Transcription blocked.. Μεταγραφή δεν γίνεται Υποκινητής Ρυθιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3 DNA RNA polymerase Transcription permitted.. Μεταγραφή επιτρέπεται Inducer διεγέρτης Repressor Καταστολή (enzyme repression): χρησιοποιείται κυρίως για την ρύθιση της βιοσύνθεσης (π.χ. η ρύθιση του βασικού ενζύου που απαιτείται για την βιοσύνθεση της ιστιδίνης). Υποκινητής Ρυθιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3 DNA RNA polymerase Repressor Transcription blocked.. Μεταγραφή δεν γίνεται Co-repressor Συγκαταστολέας Υποκινητής Ρυθιστής γονίδιο-1 γονίδιο-2 γονίδιο-3 Promoter Operator gene-1 gene-2 gene-3 DNA RNA polymerase Transcription permitted.. Μεταγραφή επιτρέπεται Repressor Καλογεράκης 2003 78

ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ (Translation) To m-rna ενώνεται σε ένα ριβοσωάτιο (που αποτελείται από r-rna και πρωτεΐνη). Τα εταγωγά RNA (t-rna) εταφέρουν τα αντίστοιχα αινοξέα. Κάθε t-rna έχει ία τριάδα νουκλεοτιδίων (αντικωδικόνιο, anticodon) που είναι συπληρωατική του κωδικονίου που αντιστοιχεί στο αινοξύ που εταφέρει. Μόλις σχηατιστεί ο πεπτιδικός δεσός απελευθερώνεται το άδειο t-rna ενώ το m-rna προχωράει κατά ία θέση έσα στο ριβόσωα. t-rna ileu UA αινοξύ anticodon άδειο t-rna πρωτεΐνη AU m-rna ριβόσωα ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA (DNA replication) Η διεργασία αντιγραφής του DNA ξεκινά ε την προσκόλληση του ενζύου DNApolymerase που κινείται πάνω στον ένα κλώνο του DNA (ε κατεύθυνση 5' 3') παράγοντας ένα συπληρωατικό κλώνο. Απαιτείται η παρουσία ενός RNA primer (που φτιάχνεται από το ένζυο RNA polymerase) για να αρχίσει η αντιγραφή του DNA. Το ένζυο DNA-ligase (DNA-λιγκάση) ενώνει τα κοάτια του DNA που έχουν αντιγραφθεί. DNA replication fork κυκλικό DNA Καλογεράκης 2003 79

Τεχνολογία Ανασυνδυασένου DNA (Recombinant DNA technology) Η επανάσταση στην βιοτεχνολογία έχει επέλθει τα τελευταία χρόνια ε την ανάπτυξη της γενετικής ηχανικής. Η βασική ιδέα είναι η εταφορά και ενσωάτωση κάποιου γονιδίου από έναν οργανισό σε έναν άλλο ο οποίος πορεί να εκφράζει το γονίδιο αυτό. Κλασσικό παράδειγα είναι η παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης από βακτήρια. Η διαδικασία παραγωγής r-dna γίνεται σε δύο στάδια. 1) Αποονώνουε το γονίδιο (ξένο DNA) που ας ενδιαφέρει να εκφράσουε. Διαλέγουε ένα κατάλληλο φορέα (πλασίδιο) και του κάνουε ία τοή. Προσθέτουε το γονίδιο που ας ενδιαφέρει και το συνενώνουε (ανασυνδυάζουε) παράγοντας το ανασυνδυασένο DNA (r-dna). 2) Εισάγουε το r-dna σε κάποιο ξενιστή οργανισό (π.χ. E. coli). Αποονώνουε και καλλιεργούε εκφράζοντας το νέο γονίδιο. Καλογεράκης 2003 80

Τα βασικά εργαλεία που χρειαζόαστε είναι: Ι) Ενδονουκλεάσες υψηλής ειδίκευσης που κόβουν το DNA σε συγκεκριένα έρη. Π.χ. η ενδονουκλεάση ECORI του E.coli που κόβει την συγκεκριένη αλληλουχία: EcoRI G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G G- C-T-T-A-A- + -A-A-T-T-C -G EcoRI Σηείωση: τα δύο άκρα που έχουν κοπεί έτσι πορούν να επανασυνδεθούν ε άλλα κοάτια του DNA που έχουν κοπεί ε τον ίδιο τρόπο. II) DNA-ligase για την συγκόλληση κοατιών DNA. III) DNA-polymerase για την αντιγραφή του DNA. IV) Reverse transcriptase (αντιστροφη τρανσκριπτάση) που χρησιεύει για την παραγωγή DNA από m-rna. V) Τερατική τρανσφεράση (terminal transferase) που προσθέτει οοιοπολυερικές ουρές (-Α-Α-Α-Α-Α-Α ή -Τ-Τ-Τ-Τ-Τ-Τ). VI) Με την χρήση χλωραφενικόλης που αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση, πορούε να αυξήσουε σηαντικά τον αριθό των αντιγράφων του πλασιδίου που παράγονται εντός του κυττάρου (π.χ. από 30 σε 1000 αντίγραφα). VΙΙ) Πρέπει ο φορέας να περιέχει κάποιο σηατοδότη επιλογής (π.χ., αντίσταση σε συγκεκριένο αντιβιοτικό). Το πιο συνηθισένο πλασίδιο είναι το pbr322 (χαρακτηρίζεται από δύο θέσεις για ενδονουκλεάσες EcoRI & BamHI, έχει αντίσταση στα αντιβιοτικά απισιλίνη και τετρακυκλίνη, έχει σηείο έναρξης αντιγραφής DNA ανεξάρτητα από το κυτταρικό DNA). Σηείωση: Υπάρχει η δυνατότητα χρησιοποίησης ρυθιζόενου υποκινητή (που τίθεται εντός / εκτός λειτουργίας ε προσθήκη διεγέρτη ή αλλαγή θεροκρασίας κτλ.). Η παραγωγή της ξένης πρωτεΐνης επιβαρύνει το κύτταρο και εποένως ο ρυθός ανάπτυξης των κυττάρων είναι χαηλότερος. Καλογεράκης 2003 81

ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ: 1) Γενετική Αστάθεια (genetic instability): Η συνεχής καλλιέργεια οδηγεί στην δηιουργία απογόνων που περιέχουν ικρότερο αριθό πλασιδίων λόγω του εγαλύτερου ειδικού ρυθού ανάπτυξης των. Ln(X V ) - +2 +1 2) Οι πρωτεάσες (ένζυα Ln(X V0 ) που διασπούν πρωτεΐνες) t του ξενιστή πορεί να προσβάλλουν την παραγόενη πρωτεΐνη. 3) Μεταλλάξεις του ξενιστή (mutations of the host cells) που τον καθιστούν λιγότερο αποδοτικό για την παραγωγή της συγκεκριένης πρωτεΐνης. 4) Δοική αστάθεια του πλασιδίου: Μερικά κύτταρα διατηρούν τα πλασίδια αλλά τα ετατρέπουν έτσι ώστε να ειώσουν την επίδραση που έχει το πλασίδιο στο κύτταρο. 5) Παρόλο που το E.coli είναι ο ευκολότερος ξενιστής, αν απαιτείται η έκφραση ενός ευκαρυωτικού γονιδίου, πρέπει να χρησιοποιηθεί ευκαρυωτικός ξενιστής (π.χ.,. cerevisiae) για να πορέσει να απαλλείψει τα εσώνια (introns) κατά την παραγωγή του m-rna (η διεργασία καλείται RNA-splicing). Τα εσώνια αντιστοιχούν σε περιοχές του DNA που δεν πρέπει να εταφραστούν. ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ DNA ΠΥΡΗΝΑΣ Eon1 Intron1 Eon2 Intron2 Eon3 Primary RNA Eon1 Intron1 Eon2 Intron2 Eon3 RNA plicing (removal of Introns) Mature RNA Eon1 Eon2 Eon3 Μεταφορά στο κυτταρόπλασα Πρωτεΐνη Μετάφραση 6) Εάν απαιτείται η παραγωγή εξαιρετικά πιστής πρωτεΐνης, δηλ. απαιτείται η δηιουργία ετατροπών ετά την ετάφραση (posttranslational modifications), τότε είαστε αναγκασένοι να χρησιοποιήσουε ζωικά κύτταρα (mammalian cells) σαν ξενιστή. Καλογεράκης 2003 82

11. ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Κάθε ικροοργανισός πορεί να θεωρηθεί σαν ένα ανοικτό σύστηα όπου χηικές ενώσεις εισέρχονται και εξέρχονται από το κύτταρο συνοδευόενες από έκλυση θερότητας (+). Το κύτταρο πορεί να θεωρηθεί ότι αυξάνει στο έγεθος έχρι να διαχωριστούν τα θυγατρικά κύτταρα. Θερότητα Εισερχόενες χηικές ουσίες (υποστρώατα, j ) κύτταρο Εξερχόενες χηικές ουσίες (προϊόντα εταβολισού, P j ) Θυγατρικά κύτταρα Οι ικροοργανισοί ανάλογα ε την πηγή ενέργειας ή τα θρεπτικά συστατικά που χρησιοποιούν διαχωρίζονται ως εξής: Πηγή ενέργειας Φως Χηική ενέργεια (διάσπαση δεσών) Φωτότροφοι [Phototrophs] Χηειότροφοι [Chemotrophs] 1. organotrophs (οξείδωση οργανικών ενώσεων) 2. Lithotrophs (οξείδωση ανόργανων ουσιών) Πηγή άνθρακα Αυτότροφοι [Autotrophs] (χρήση CO 2 ) Ετερότροφοι [Heterotrophs] (από οργανικές ουσίες) Ισοζύγια C,O,H,N: Η στοιχειοετρία της ανάπτυξη ικροοργανισών πορεί να γραφτεί ως αcη n Ο m + βνη 3 + γο2 CΗ a Ο b Ν c + δcη p Ο q Ν r + εη 2 Ο + κcο 2 } } } } πηγή C πηγή Ν κύτταρο προϊόν Τα ατοικά ισοζύγια για τα βασικά στοιχεία έχουν ως εξής: Καλογεράκης 2003 83

C: α 1+δ+κ Η: nα + 3β a + pδ + 2ε Ο: mα + 2γ b + qδ + ε + 2κ N: β c + rδ Θεωρώντας τον επειρικό τύπο της κυτταρικής άζας γνωστό, θα θέλαε να προχωρήσουε στον υπολογισό των υπολοίπων παραέτρων. Οι έξη (6) στοιχειοετρικοί συντελεστές (α, β, γ, δ, ε & κ) δεν πορούν να υπολογιστούν ε τα τέσσερα (4) παραπάνω ισοζύγια. Για αερόβιους οργανισούς πορούε να χρησιοποιήσουε το αναπνευστικό κλάσα (respiratory quotient), RQ που ορίζεται ως RQ Ρυθος παραγωγης CO [mm/(l h)] 2 Ρυθος καταναλωσης O [mm/(l h)] 2 κ γ Επιπλέον εξισώσεις πορούν να γραφούν για την δηιουργία ΑΤΡ (το «ενεργειακό νόισα» του κυττάρου) και NADH (εταφορέας ηλεκτρονίων στο κύτταρο) βασισένοι στην οξείδωση της πηγής του άνθρακα CΗ n Ο m. Κατά την οξείδωση του υποστρώατος ηλεκτρόνια εταφέρονται στο NAD + ε την ορφή ατόων υδρογόνου. Βεβαίως αν θεωρούσαε περισσότερα εξερχόενα προϊόντα εταβολισού, η απροσδιοριστία θα ήταν πολύ εγαλύτερη. Επίσης επειδή η σύσταση του ικροοργανισού εταβάλλεται όταν εταβάλλεται η πηγή του άνθρακα, η προσέγγιση αυτή δεν είναι επαρκής. Έχει όως χρησιοποιηθεί ε επιτυχία για την αυτόατη ρύθιση ικροβιακών ζυώσεων (συνεχούς λειτουργίας ή ηιδιαλείποντος έργου) στην βιοηχανία τροφίων και την φαράκων. Συντελεστές απόδοσης (yield coefficients): Ο συνήθης τρόπος αντιετώπισης της στοιχειοετρίας στην κυτταρική ανάπτυξη είναι ε την χρησιοποίηση «συντελεστών απόδοσης» που είναι ο λόγος της ποσότητας του παραχθέντος προϊόντος ή βιοάζας ως προς την ποσότητα του υποστρώατος που καταναλώθηκε. O περισσότερο γνωστός συντελεστής απόδοσης είναι ο Υ X/ Υ X/ g δηιουργηθεισας βιοαζας g καταναλωθεντος υποστρωατος ΔX Δ ΔX/Δt Δ/Δt r r s ( r r s ) Y /s Ο συντελεστής αυτός δεν παραένει σταθερός αλλά αλλάζει όταν αλλάζουν οι συνθήκες ανάπτυξης. Ο κύριος λόγος είναι ότι έρος του υποστρώατος χρησιοποιείται για συντήρηση των ικροοργανισών, έρος για βιοσύνθεση νέων κυττάρων και εκλυόενων κυτταρικών προϊόντων και έρος για την παραγωγή ενέργειας (ΑΤΡ). Δηλαδή, το υπόστρωα καταναλίσκεται ως εξής: Δ Δ biomass + Δ biosynthesis + Δ growth_energy + Δ maintenace_energy Άλλοι συντελεστές απόδοσης που χρησιοποιούνται ευρέως είναι οι εξής: Καλογεράκης 2003 84

Υ Ρ/ g δηιουργηθεντος προιοντος g καταναλωθεντος υποστρωατος ΔP Δ ΔP/Δt Δ/Δt r p r s ( rp r Yp/s ) Υ Χ/Ο g δηιουργηθεισας βιοαζας g καταναλωθεντος O 2 ΔX ΔM O2 ΔX/Δt ΔM / Δt O2 r r O2 ( r r O2 ) Y /o Υ ΑΤΡ Υ Χ/ΑΤΡ g δηιουργηθεισας βιοαζας mol καταναλωθεντος ATP ΔX Δ[ATP] r r ATP Για αερόβιους ικροοργανισούς το έρος του άνθρακα που καταναλίσκεται για την παραγωγή ενέργειας πορεί να είναι αρκετά εγάλο. Το τυπικό διάστηα τιών του Υ ΑΤΡ για αερόβιους οργανισούς είναι 8,3 έως 12,6 [g-cells/mol-atp] ε έση τιή του Υ ΑΤΡ 10.7 [g-cells/mol-atp]. Άλλοι δύο συντελεστές απόδοσης που χρησιοποιούνται είναι: Y avg-e και Υ kcal. Y avg-e Y Χ/avg-e Y Y X / avg e / όπου Y avg-e/ είναι ο αριθός των ηλεκτρονίων διαθέσια στο υπόστρωα, υπολογιζόενα ως εξής: Y avg-e/ {moles O 2 για τέλεια καύση} 4 παραδείγατος χάρη, Y avg-e/γλυκόζη 6 4 24. Γενικά η έση τιή του Y avg-e 3,07 [g-cells/avg-e] Τελικά, ο συντελεστής απόδοσης Υ kcal συσχετίζει την παραγωγή βιοάζας ε την ποσότητα θερότητας που εκλύεται, Υ kcal g δηιουργηθεισας βιοαζας kcal εκλυοενης θεροτητας ΔX ΔQ όπου ΔQ ( Δ H i )( Δ massi ) i (-ΔH i ) θερότητα τέλειας καύσης (heat of combustion) της ουσίας i (υπολογίζεται από πίνακες). (-ΔH ) θερότητα τέλειας καύσης βιοάζας 5,41 kcal/g-cells. Καλογεράκης 2003 85

Κινητική ικροβιακής ανάπτυξης (growth kinetics): Προφανώς έχουε να κάνουε ε ένα εξαιρετικά πολύπλοκο σύστηα βιοχηικών αντιδράσεων όπου είαστε αναγκασένοι να κάνουε σηαντικές απλοποιήσεις για να πορέσουε να καταλήξουε σε απλοποιηένα οντέλα που συσχετίζουν εταβλητές που πορούν να ετρηθούν. Ένα κινητικό οντέλο που αποβλέπει σε λεπτοερή περιγραφή των αναπτυσσόενων κυττάρων (ικροοργανισών) θα πρέπει να είναι: 1. Δοηένο (structured model) λαβάνοντας υπόψη την δοηένη δοή του κυττάρου (π.χ., ένα χηικά δοηένο οντέλο χωρίζει την κυτταρική άζα σε διαφορετικές ουσίες, οι οποίες πορούν να αλλάζουν σχετική συγκέντρωση σαν απόκριση του οντέλου σε αλλαγές στις περιβαλλοντικές συνθήκες). 2. Διαχωρητικό (segregated model) λαβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι τα κύτταρα δεν είναι ίδια εταξύ τους (π.χ., διαφορετική ηλικία των κυττάρων έχει ιδιαίτερη σηασία στην ανάπτυξη κυττάρων που περιέχουν πλασίδια). Ένα η δοηένο οντέλο (unstructured model) θεωρεί ότι η χηική σύσταση του κυττάρου παραένει σταθερή. Η παραδοχή αυτή οδηγεί στην παραδοχή της «εξισορροπηένης ανάπτυξης» (balanced growth), όπου τα συστατικά του κυττάρου αλλάζουν ε ανάλογους ρυθούς. Η παραδοχή αυτή πορεί να γίνει όταν οι αλλαγές στις περιβαλλοντικές συνθήκες είναι ικρές και αργές (σε σχέση ε την δυναική απόκριση του κυττάρου). Στις περισσότερες περιβαλλοντικές εφαρογές η χρήση «η δοηένων και η διαχωρητικών» οντέλων είναι ικανοποιητική. Τα οντέλα αυτά είναι τα πιο απλά και εποένως τα πιο εύκολα στην χρήση τους. Σε αυτές τις περιπτώσεις ιλάε για το «έσο κύτταρο» και η ποσοτικοποίηση της βιοάζας γίνεται από ία εταβλητή () που αντιπροσωπεύει είτε το ξηρό βάρος (dryweight) ή τον αριθό των κυττάρων (cell number). On-line έτρηση πορεί να γίνει ε φασατο-φωτόετρο ορατού φωτός (όπου έχει ήδη συσχετίσει την οπτική πυκνότητα ε την συγκέντρωση βιοάζας, g-dry weight/l) ή ε νεφελόετρο (turbidity meter). 1. Φάσεις ικροβιακής ανάπτυξης σε κλειστό σύστηα (growth patterns in batch culture): Κατά την διάρκεια καλλιέργειας ικροοργανισών σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου πορούε να παρατηρήσουε τις εξής πέντε φάσεις: i Φάση καθυστέρησης (lag phase) όπου οι ικροοργανισοί «εγκλιατίζονται» στις υπάρχουσες συνθήκες ανάπτυξης. Συνήθως η φάση της καθυστέρησης εφανίζεται όταν οι ικροοργανισοί εταφέρονται σε εγαλύτερο αντιδραστήρα όπου υπάρχουν «φρέσκα» θρεπτικά είγατα ανάπτυξης. Οι εσω-κυτταρικές συγκεντρώσεις διαφόρων συπαραγόντων (cofactors, π.χ., βιταίνες), αινοξέων και κατιόντων (π.χ., Mg 2+, Ca 2+, κτλ) πορούν να ειωθούν σηαντικά λόγω της εταφοράς των στο διάλυα διαέσου της κυτταρικής εβράνης. Εάν αυτά δεν είναι στις απαιτούενες συγκεντρώσεις Καλογεράκης 2003 86

πορεί να έχουε σηαντική είωση ενζυατικών αντιδράσεων και τα κύτταρα είναι υποχρεωένα να αποικοδοήσουν την πηγή του άνθρακα για να αναπληρώσουν τις ελλείψεις τους προτού συνεχίσουν ε την παραγωγή νέων κυττάρων. ii iii Φάση εκθετικής ανάπτυξης (eponential phase) όπου η ανάπτυξη γίνεται στο έγιστο δυνατό ρυθό και η παραδοχή της «ισορροπηένης ανάπτυξης» ισχύει. Φάση της επιβράδυνσης (declining growth phase / deceleration phase) όπου το υπόστρωα λιγοστεύει σηαντικά ή έχουε την παρουσία υψηλής συγκέντρωσης κάποιου αναστολέα / παρεποδιστή (συνήθως κάποιο «τοξικό» παραπροϊόν της αντίδρασης). Σε ία τυπική καλλιέργεια βακτηρίων, η φάση αυτή είναι πολύ ικρής διάρκειας. Οι γρήγορα εταβαλλόενες περιβαλλοντικές συνθήκες οδηγούν σε «η ισορροπηένη ανάπτυξη» (unbalanced growth). iv Φάση στασιότητας (stationary phase) όπου δεν έχουε ανάπτυξη ή ακριβέστερα ο ρυθός ανάπτυξης είναι ίσος ε τον ρυθό νέκρωσης. Σε αυτή την φάση τα κύτταρα είναι ακόα εταβολικά ενεργά και παράγουν δευτερογενή προϊόντα (που δεν είναι συνδεδεένα ε τον ρυθό ανάπτυξης των κυττάρων). Η σύνθεση ορισένων αντιβιοτικών έχει τον έγιστο ρυθό παραγωγής σε αυτή την φάση. v Φάση θανάτου (death phase) όπου έχουε λύση των ικροοργανισών που οδηγεί στην είωση της βιοάζας και ακολουθεί συνήθως κινητική πρώτης τάξης (r d -k d ). Log () Φάση επιβράδυνσης Φάση στασιότητας Φάση θανάτου Log ( 0 ) Φάση εκθετικής ανάπτυξης Φάση καθυστέρησης t lag Χρόνος (h) 2. Ειδικός ρυθός ανάπτυξης (specific growth rate): Η παραγωγή θυγατρικών κυττάρων γίνεται κυρίως κατά την φάση της εκθετικής ανάπτυξης όπου η παραδοχή της «ισορροπηένης ανάπτυξης» ισχύει. Γενικά τα κύτταρα αναπτύσσονται σαν ία γεωετρική πρόοδο: 2 0, 2 1, 2 2, 2 3, 2 4,, 2 m, ετά από m διχοτοήσεις. Δηλαδή, αν ξεκινώντας είχαε Ν 0 κύτταρα, ετά από m γενεές θα έχουε 2 m Ν 0 κύτταρα. Καλογεράκης 2003 87

Γι αυτό το λόγο σε βιολογικά συστήατα χρησιοποιούε πολύ συχνά τους ειδικούς ρυθούς ανάπτυξης κυττάρων ή παραγωγής προϊόντων κτλ. Εάν r είναι ο ρυθός ανάπτυξης βιοάζας [g-biomass/(l h)] και είναι η συγκέντρωση της βιοάζας στον αντιδραστήρα [g-biomass/l], τότε ορίζουε τον ειδικό ρυθό ανάπτυξης (specific growth rate),, ως r [h -1 ] Από το ισοζύγιο βιοάζας (σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου) έχουε: d dt r d dt Με αρχική συνθήκη: (t lag ) o Εάν υποθέσουε ότι ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης είναι σταθερός (const.), ολοκλήρωση της παραπάνω διαφορικής εξίσωσης ας δίνει, ή (t) (t o e (t) t o e t lag ) εάν ετράε τον χρόνο από το τέλος της φάσης της καθυστέρησης. Η εξίσωση προφανώς προβλέπει συνεχή αύξηση της βιοάζας δεδοένου ότι δεν λαβάνει υπόψη την κατανάλωση του υποστρώατος. Η εξίσωση αυτή πορεί να ας δώσει τον χρόνο διπλασιασού (doubling time) της καλλιέργειας, t d. (t d t ) 2 e d t o o 2 e d t d ln 2 3. Λογιστική καπύλη ανάπτυξης (logistic equation): Δεδοένου ότι η καπύλη ικροβιακής ανάπτυξης είναι σιγοειδής (sigmoidal growth curve) η ανάγκη δηιουργίας απλών οντέλων που παρουσιάζουν αυτήν την συπεριφορά οδήγησαν στην χρησιοποίηση της έννοιας της «φέρουσας ικανότητας» (carrying capacity). Με άλλα λόγια, ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης είναι ανάλογος του υπολειπόενης φέρουσας ικανότητας, δηλ., k 1 και εποένως το ισοζύγιο άζας σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου γίνεται, Καλογεράκης 2003 88

d k 1 dt Ολοκλήρωση της παραπάνω διαφορικής εξίσωσης ε αρχική συνθήκη (0) o, οδηγεί στην «λογιστική καπύλη», (t) 1 o o e kt (1 e kt ) ο χρόνος Η έγιστη χωρητικότητα,, πρέπει να προσδιοριστεί για τις συγκεκριένες περιβαλλοντικές συνθήκες που γίνεται η ανάπτυξη των κυττάρων. Συχνά, χρησιοποιείται η προσέγγιση της εγίστης χωρητικότητας σαν τρόπος περιγραφής της επίδρασης τοξικών παραπροϊόντων Είναι προφανές ότι η έγιστη ικανότητα,, πορεί να συσχετιστεί ε την έγιστη συγκέντρωση υποστρώατος (που είναι η αρχική, 0 ) ε βάση την σχέση Δ/Δ Y /s (- 0 ) Y /s ( 0 -) ( - 0 ) Y /s ( 0-0) 0 + Y /s 0 Η παραπάνω σχέση υποθέτει ότι η ικροβιακή αύξηση συνεχίζεται έχρι την εξάντληση του περιοριστικού υποστρώατος,. Μικροβιακή ανάπτυξη ε περιορισό υποστρώατος (substrate-limited growth) 1. Εξίσωση Monod: Με βάση πειραατικά δεδοένα έχει διαπιστωθεί ότι ο ρυθός ικροβιακής ανάπτυξης είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του υποστρώατος κατά παρόοιο τρόπο ε αυτό που είδαε στις ενζυατικές αντιδράσεις. Η λεγόενη κινητική έκφραση του Monod είναι: K [] + [] /2 K [] Καλογεράκης 2003 89

όπου η σταθερά κορεσού Κ αντιστοιχεί στην συγκέντρωση υποστρώατος που ο ρυθός ανάπτυξης είναι στο ισό του εγίστου. Η φυσική σηασία της κινητικής έκφρασης Monod γίνεται προφανής αν θεωρήσουε ότι οι επί έρους βιοχηικές αντιδράσεις που λαβάνουν έρος στην ανάπτυξη ενός κυττάρου είναι ενζυατικές και ία από αυτές θα είναι εκείνη που ελέγχει τον ρυθό ανάπτυξης. Για τον υπολογισό των παραέτρων (, K ) πορούε να χρησιοποιήσουε όλες τις εθόδους που αναφέραε σε προηγούενο κεφάλαιο για ενζυατικές αντιδράσεις. 2. Εξίσωση Tessier: 1 e 3. Εξίσωση Moser: [] K K [] n + [] n 4. Εξίσωση Contois: [] ουσιαστικά έχουε K c που είναι συνάρτηση του. K + [] s 5. Εξίσωση Blackman: [] B 2K s [] > 2K [] 2K B s B s B s 2K 6. Εξίσωση Konak: O Konak πρότεινε ια διαφορική εξίσωση που συνδέει τον ρυθό ανάπτυξης ε την συγκέντρωση του υποστρώατος, d d k ( ) p Καλογεράκης 2003 90

όπου k & p είναι παράετροι. Όταν p1 η λύση καταλήγει στην εξίσωση του Tessier. H λύση για p 1 είναι 1 p 1 p ( ) (1 p)k[] όπου για p2 καταλήγουε στην έκφραση του Monod. 7. Εξίσωση Dabes: [] λ1 + λ 2 Λογιστική καπύλη ανάπτυξης (logistic equation): Συσχέτιση ειδικού ρυθού ανάπτυξης ε την κατανάλωση υποστρώατος: Δ/Δ Y /s (- 0 ) Y /s ( 0 -) 0 + Y /s ( 0 -) Αντικαθιστώντας στην εξίσωση k 1 προκύπτει η σχέση 0 + Y /s ( 0 ) k 1 0 + Y /s 0 Y /s k + Y 0 /s 0 ky /s k 0 + Y /s 0 Άρα όταν δεχόαστε την λογιστική καπύλη ανάπτυξης ουσιαστικά υποθέτουε ότι έχουε κινητική πρώτης τάξης ως προς το υπόστρωα. Η παραδοχή αυτή είναι σωστή όνον όταν η συγκέντρωση του υποστρώατος είναι ικρή (π.χ., όταν < K /2, υποθέτοντας κινητική Monod). Καλογεράκης 2003 91

12. ΠΟΛΛΑΠΛΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ - ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ Μικροβιακή Ανάπτυξη ε Πολλαπλά Υποστρώατα: Το οντέλο του Monod και οι παραλλαγές που αναφέραε προηγούενα είναι σε θέση να περιγράψουν τα πειραατικά δεδοένα όταν έχουε όνο ένα υπόστρωα που ελέγχει την κινητική ικροβιακής ανάπτυξης "περιοριστικό υπόστρωα" (single limiting substrate). Υπάρχουν όως πολλές περιπτώσεις όπου διαφορετικά υποστρώατα ελέγχουν ταυτόχρονα τον ειδικό ρυθό ανάπτυξης. Αυτό συβαίνει όταν περισσότεροι του ενός εταβολίτες εισέρχονται ένα εταβολικό ονοπάτι (metabolic pathway) και κάθε εταβολίτης ελέγχεται από διαφορετικό ένζυο. Π.χ., γλυκόζη και οξυγόνο πορούν να ελέγχουν την κυτταρική ανάπτυξη. Σε κυτταροκαλλιέργειες (ζωικών κυττάρων), γλυκόζη και γλουταίνη (glutamine) είναι γενικά απαραίτητα. Τα οντέλα που έχουν προταθεί για να περιγράψουν την ανάπτυξη από δύο υποστρώατα είναι: (α) Ταυτόχρονης χρήσης (multiplicative): 1 2 K 1 + 1 K 2 + 2 ή γενικότερα για n υποστρώατα n i όταν για κάποιο υπόστρωα έχουε j > 10K j, τότε K + i 1 i i (β) Διαδοχικής χρήσης (additive kinetics): Μπορεί να περιγράψει την διαυξητική ανάπτυξη (diauic growth) δηλ. όταν καταναλίσκεται διαδοχικά η κάθε πηγή άνθρακα. K j j + j 1 K 1 1 1 + 1 + K 2 2 2 + 2 ή γενικότερα για n υποστρώατα n i 1 K i i i + i Καλογεράκης 2003 92

Μία περαιτέρω γενίκευση πορεί να γίνει όταν διαχωρίσουε τα υποστρώατα σε αναγκαία (essential substrates) και σε υποστρώατα πού απλά ενισχύουν την ανάπτυξη (growth enhancers). k j j + 0 K + j j j K i i i + i υποστρώατα ενίσχυσης αναγκαία υποστρώατα Η παράετρος 0 είναι ο έγιστος ειδικός ρυθός ανάπτυξης όταν δεν υπάρχουν υποστρώατα ενίσχυσης ικροβιακής ανάπτυξης. Υπάρχουν και οντέλα που περιγράφουν την παρατηρούενη «αδράνεια» στην ετάβαση από ία πηγή άνθρακα σε άλλη. ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Παρεπόδιση Υποστρώατος: Ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης ικροοργανισών πορεί να ειωθεί όταν η συγκέντρωση του υποστρώατος είναι υψηλή κατά τρόπο ανάλογο της παρεπόδισης υποστρώατος σε ενζυατικές αντιδράσεις. Ένας τρόπος οντελοποίησης της παρεπόδισης υποστρώατος είναι ο εξής: K k X + X νέα κύτταρα K I X + X όπου το αντιστρεπτό διπλό σύπλοκο X δεν πορεί να δηιουργήσει καινούργια κύτταρα. Ο ρυθός κυτταρικής ανάπτυξης είναι: και ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης : r k[x] k[x]/[x]. Χρησιοποιώντας τις εκφράσεις «ισορροπίας» [X][] K και [X] [X][] K I [X] Καλογεράκης 2003 93

καταλήγουε στην σχέση 1 + KI K + 1 + KI K 2 + + K I Ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης αυξάνει έχρι ία εγίστη τιή και ετά ειώνεται. Η συγκέντρωση του υποστρώατος (*) που αντιστοιχεί στο έγιστο ρυθό ανάπτυξης βρίσκεται από την σχέση: d d 0 * K K I Μέγιστη τιή : * K 2 + 1 K I Παρεπόδιση Αναστολέα: Ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης ικροοργανισών πορεί επίσης να ειωθεί όταν η αυξηθεί η συγκέντρωση ενός παραπροϊόντος («τοξίνης») που δρα ανασταλτικά ή έχουε προσθήκη κάποιου αναστολέα που βρίσκεται στην τροφοδοσία στον βιοαντιδραστήρα. Οι εκφράσεις που χρησιοποιούνται είναι της ορφής (είωση όνο του ): ή ή ( K [I]) 0 1 I 0 [I] 1 + KI KI[I] 0e Παρεπόδιση Προϊόντος: Ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης ικροοργανισών πορεί επίσης να ειωθεί όταν η Μία διαφορετική αντιετώπιση για την ποσοτικοποίηση της παρεπόδισης προϊόντων είναι Καλογεράκης 2003 94

βασισένη σε πειραατικές ετρήσεις της συγκέντρωσης του προϊόντος (P j, ) που αναστέλλει παντελώς τον ρυθό ικροβιακής ανάπτυξης (0). Τα αντίστοιχα οντέλα που έχουν προταθεί είναι: ή ή Pj 1 Pj, K + Pj 1 Pj, K + Pj 1 P j, β γ K + όπου οι παράετροι β και γ υπολογίζονται από πειραατικές ετρήσεις. Είναι αρκετά γενικές και πορούν να καλύψουν πολλές περιπτώσεις. ΡΥΘΜΟΙ ΑΝΑΛΩΣΗΣ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Ειδικός Ρυθός Κατανάλωσης Υποστρώατος (substrate uptake rate): Ο ειδικός ρυθός κατανάλωσης του υποστρώατος συβολίζεται ε το q και ισούται ε το άθροισα του ρυθού κατανάλωσης που χρησιοποιείται για (ι) κυτταρική ανάπτυξη ( X), (ιι) παραγωγή προϊόντων ( P j ), και (ιιι) συντήρηση ( ενέργεια συντήρησης): q ( r ) Y / X r + m + Y j Pj Pj / > και θεωρώντας rpj qpj έχουε q Y X / q + m + Y j Pj Pj/ Η εταβλητή q έχει ονάδες [g-/(h g-drycells)]. Εάν ο ρυθός παραγωγής εξωκυτταρικών προϊόντων είναι χαηλός, η παραπάνω σχέση απλοποιείται ως εξής (Pirt): q Y + X / m Καλογεράκης 2003 95

Εποένως η εξάρτηση του q από το είναι παρόοια (τύπου-monod) του από το. Επίσης παρατηρούε ότι ακόα και όταν ο ρυθός ικροβιακής ανάπτυξης είναι ηδενικός (0), υπάρχει κατανάλωση υποστρώατος για συντήρηση. Εάν ορίσουε τον φαινοενικό συντελεστή απόδοσης (apparent yield coefficient, Y ) ως q app YX / app 1/ Y X / m καταλήγουε στην σχέση app X / Y 1 app X / Y 1 X / + m 1/Υ Χ/ 1/ Ο φαινοενικός συντελεστής απόδοσης υπολογίζεται εύκολα όταν έχουε πειραατικά δεδοένα της συγκέντρωσης του υποστρώατος () και της βιοάζας συναρτήσει του χρόνου () εκ των οποίων υπολογίζουε το q και. Δηλ., 1 d dt 1 Δ Δt και q 1 d dt 1 Δ Δt Y app X/ q Δ Δ Εποένως από ία σειρά πειραάτων όπου ο ειδικός ρυθός ανάπτυξης κρατείται σε διαφορετικά επίπεδα ( 1, 2, ), πορούε να υπολογίσουε τον πραγατικό συντελεστή απόδοσης (Y X/ ) και τον συντελεστή συντήρησης (m) ε ία γραική app X / παλινδρόηση του 1/ Y ως προς 1/. Τέλος, όταν έχουε σηαντική έλλειψη υποστρώατος πρέπει να λάβουε υπόψη και τον ενδογενή εταβολισό. Η ενέργεια που απαιτείται για την διατήρηση των κυττάρων βρίσκεται από κύτταρα που «πεθαίνουν» (βλέπε και νέες θεωρίες για programmed cell death σε ονοκυτταρικούς οργανισούς). Σε αυτή την περίπτωση η κατανάλωση υποστρώατος είναι λιγότερη. Καλογεράκης 2003 96

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ I. Growth Associated: Για προϊόντα πρωτογενούς εταβολισού που συσχετίζονται ε την κυτταρική ανάπτυξη, ο ρυθός παραγωγής τους είναι ανάλογος του ρυθού ανάπτυξης (growth associated product formation), r p λ 1 r εκ του οποίου προκύπτει ότι ο ειδικός ρυθός παραγωγής προϊόντος είναι rp r q P λ1 qp λ1 Εάν θεωρήσουε ότι έχουε κινητική Monod λ qp, q p 1 K + K + q p q p, /2 q p, K II. Non-Growth Associated: Πολλά προϊόντα δευτερογενούς εταβολισού δεν συσχετίζονται ε την κυτταρική ανάπτυξη, ο ρυθός παραγωγής τους είναι ανάλογος της συγκέντρωσης βιοάζας όνον (non-growth associated product formation), r p λ 2 εκ του οποίου προκύπτει ότι ο ειδικός ρυθός παραγωγής προϊόντος είναι σταθερός q P rp λ 2 qp λ 2 III. Partially-Growth Associated: Τέλος πολλά προϊόντα δευτερογενούς εταβολισού έχουν βρεθεί ότι συσχετίζονται ε τον ρυθό κυτταρικής ανάπτυξης και ε την συγκέντρωση βιοάζας (partially-growth associated product formation), r p λ 1 r + λ 2 εκ του οποίου προκύπτει ότι ο ειδικός ρυθός παραγωγής προϊόντος είναι σταθερός Καλογεράκης 2003 97

q P rp r λ 1 + λ2 qp λ1 + λ 2 Βασικά σε αυτή την περίπτωση ταξινοούε όλες τις «δύσκολες» περιπτώσεις οντελοποίησης του ρυθού παραγωγής προϊόντος. Δοηένα οντέλα είναι η πιο σοβαρή λύση όπου λαβάνεται υπόψη το εταβολικό ονοπάτι. Ενδεικτικά αναφέρουε ένα άλλο απλό οντέλο που ανήκει σε αυτή την κατηγορία (ισχύει για την παραγωγή πενικιλίνης): q P q λ1 P crit crit q p q p q p, q p, crit crit Καλογεράκης 2003 98

13. ΕΙΔΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ Ανάπτυξη Μυκήτων (fungi growth) σε στερεά υποστρώατα: Όταν η ανάπτυξη των υκήτων γίνεται σε στερεά υποστρώατα, π.χ., σε δίσκους ε άγαρ (agar plate), έχει παρατηρηθεί ότι η ακτίνα του ικροβιακής αποικίας αυξάνεται ε σταθερό ρυθό. Δηλαδή, dr θ dt όπου η παράετρος θ είναι σταθερή. Εάν θεωρήσουε ία κυκλική αποικία h R σταθερού ύψους (h) και πυκνότητας ρ, η βιοάζα είναι: Χ πr 2 hρ R X πhρ Ο ρυθός αύξησης της βιοάζας βρίσκεται συναρτήσει του ρυθού αύξησης της ακτίνας, dx dt 2πhρR dr dt και εφόσον η ακτίνα αυξάνεται ε σταθερό ρυθό, dx dt 2πhρθR αντικαθιστώντας το R από την προηγούενη σχέση, καταλήγουε στην διαφορική εξίσωση για την αύξηση της βιοάζας: dx 2πhρθ dt X πhρ Χρησιοποιώντας την αρχική συνθήκη X(t0) X 0, επίλυση της διαφορικής δίνει ( t ) 2 X (t) λ + ~ t 2 όπου λ θ πhρ X 0 Συπερασατικά η ανάπτυξη βιοάζας σε υπόστρωα από άγαρ είναι τετραγωνική συναρτήσει του χρόνου (quadratic growth). Καλογεράκης 2003 99

Σωατιδιακή Ανάπτυξη Μυκήτων (fungal pellet growth): Σε αυτή την περίπτωση η ακτίνα του ικροβιακού σωατιδίου (σφαίρας) αυξάνεται ε σταθερό ρυθό, θ. Ξεκινώντας από την συνολική βιοάζα, Χ(4/3)πρR 3, καταλήγουε: R ( t 3 ) 3 X (t) γ + ~ t 3 όπου γ 3θ 3 36πρ X 0 Προβλήατα οξυγόνωσης των κυττάρων στο κέντρο του σωατιδίου. Για ευρωτούκητες η έγιστη ακτίνα (R crit ) είναι περίπου 0.7 mm όπου το κέντρο έχει D.O. ηδέν. Καλογεράκης 2003 100