ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΆΤΩΝ ΚΑΙ ΧΡΩΣΕΩΝ

Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Τεχνολογίας Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Ανάλυσης Βιολογικών Υγρών Συμπληρωματικές σημειώσεις για το εργαστήριο του μαθήματος Ανάλυση Βιολογικών Υγρών ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΜΆΤΩΝ ΚΑΙ ΧΡΩΣΕΩΝ ΠΕΤΡΟΣ Λ. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ Βιολόγος Msc, PhD, EurClinChem Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΤΕΙ ΑΘΗΝΩΝ Έκδοση Τρίτη ΑΘΗΝΑ 2017

2

ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Διάλυμα καθαρισμού φακών μικροσκοπίου Αντιδραστήρια Απόλυτη αιθυλική αλκοόλη Ισοπροπανόλη Αποσταγμένο νερό Συνταγή A. Δημιουργούμε διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 90% B. Δημιουργούμε διάλυμα ισοπροπανόλης 90%: 10 ml ισοπροπανόλη και 90 ml νερό. C. Αναμιγνύουμε το δύο διαλύματα. Αντιδραστήρια Θειικός χαλκός (CuSO 4 ) Κιτρικό νάτριο (C 6 H 5 O 7 Na 3 ) Καυστικό νάτριο (ΝaOH) Αποσταγμένο νερό Διάλυμα Benedict Εκπαιδευτικό διάλυμα Συνταγή Αναμιγνύονται τα ακόλουθα δύο αντιδραστήρια A. 1,7 gr CuSO 4 + 10 ml Η 2 Ο Β. 17,3 gr Κιτρικό νάτριο + 10 ml ΝaΟΗ + 80 ml Η 2 Ο Αντιδραστήρια Διαγνωστικό διάλυμα Διάλυμα Ι: Άνυδρο ανθρακικό νάτριο (Na 2 CO 3 ) 100 gr Κιτρικό νάτριο (C 6 H 5 O 7 Na 3 ) 173 gr Αποσταγμένο νερό 700 ml 3

Διάλυμα ΙI: Θειικός χαλκός (CuSO 4 ) 17 gr Αποσταγμένο νερό 100 ml Συνταγή A. Παρασκευάζονται τα δύο διαλύματα χωριστά σε ξεχωριστές φιάλες με ζεστό αποσταγμένο νερό. Για την πλήρη διάλυση των παραπάνω ουσιών θέτουμε τα ποτήρια ζέσεως σε θερμαντική εστία, υπό συνεχή ανάδευση. B. Μετά την πλήρη διάλυση (δυσκολότερα διαλύεται το πρώτο διάλυμα), διηθούμε με χάρτινο ηθμό το διάλυμα Ι σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml, και στο διήθημα αυτό προσθέτουμε χωρίς διήθηση το διάλυμα II. C. Αναμιγνύονται τα δύο διαλύματα αυτά αναστρέφοντας αρκετές φορές τη φιάλη, και αφού κρυώσει το μείγμα συμπληρώνουμε τη φιάλη με αποσταγμένο νερό μέχρι την χαραγή. D. Μετά από νέα ανάμιξη το τελικό αντιδραστήριο που προκύπτει και ονομάζεται Benedict έχει χρώμα σκούρο γαλάζιο και πρέπει να είναι απολύτως διαυγές. Αν δεν είναι διαυγές ξαναφτιάχνεται από την αρχή. 4

ΧΡΩΣΕΙΣ Χρώση Oil Red O Χρησιμοποιείται για το χρωματισμό του λίπους. 1. Προετοιμάζεται η χρωστική σύμφωνα με την προμηθεύτρια εταιρεία. 2. Πάνω στο μονιμοποιημένο επίχρισμα τοποθετείται διάλυμα φορμαλδεύδης 10% για 2-5 λεπτά. 3. Πάνω στο επίχρισμα τοποθετείται ισοπροπανόλη (60% ή 85% ανάλογα με την εταιρεία). Επώαση για 5 λεπτά. 4. Ξέπλυμα των επιχρισμάτων με αποσταγμένο νερό. 5. Προστίθεται πάνω στα επιχρίσματα η χρωστική Oil Red O. Επώαση για 5 λεπτά. 6. Ξέπλυμα των επιχρισμάτων με αποσταγμένο νερό. 7. Προσθήκη αιματοξυλίνης. Επώαση για 1 λεπτό. 8. Ξέπλυμα των επιχρισμάτων με αποσταγμένο νερό. 9. Μικροσκόπηση Sudan III Χρησιμοποιείται για το χρωματισμό του λίπους. 1. Τα ούρα συλλέγονται σε γυάλινο δοχείο. 2. Φυγοκεντρούνται για 15 min και αναζητούνται τα λιποσφαίρια στο υπερκείμενο. 3. Με πιπέττα Pasteur αναρροφάται μια μικρή ποσότητα από την επιφάνεια και τοποθετούνται δύο σταγόνες σε αντικειμενοφόρες πλάκες. 4. Χρωματίζεται η μια σταγόνα ούρων με μία σταγόνα χρωστικής Sudan III και αφήνεται σε ηρεμία για λίγα λεπτά. 5. Τοποθετούνται καλυπτρίδες και μικροσκοπούνται οι δύο σταγόνες ούρων. 6. Μικροσκοπείται αρχικά η άχρωμη σταγόνα και μετά τη χρωματισμένη. 7. Τα λιποσφαίρια αναγνωρίζονται από την έντονη διαθλαστικότητά τους (άχρωμο δείγμα) και κόκκινο σομόν χρώμα (έγχρωμο δείγμα). 5

Χρώση Steinheimer Malbin Χρησιμοποιείται στη ταυτοποίηση των κυτταρικών στοιχείων. Χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο για την χρώση των πυρήνων των πυοσφαιρίων και την διάκριση τους από άλλα έμμορφα στοιχεία, κυρίως τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Χρωματίζει με διαφορετική απόχρωση πρόσφατα και παλαιότερα πυοσφαίρια βοηθώντας έτσι στη κατανόηση της προέλευσής τους δηλαδή αν προέρχονται από το κατώτερο ή ανώτερο ουροποιητικό σύστημα. 1. Παρασκευάζεται η χρωστική Α που περιέχει: κρυσταλλικό ιώδες 3,0 g, οινόπνευμα 96% 20 ml, οξαλικό αμμώνιο 0,8 g, αποσταγμένο νερό 80 ml. 2. Παρασκευάζεται η χρωστική Β που περιέχει: σαφρανίνη Ο, οινόπνευμα 96% 10 ml, αποσταγμένο νερό 100 ml. 3. Τρία μέρη της χρωστικής Α αναμιγνύονται με 97 μέρη της χρωστικής Β. 4. Διήθηση. 5. Το μίγμα αυτό διατηρείται για 2-3 μήνες σε σκοτεινό φιαλίδιο αλλά γρήγορα τα χρώμα αλλάζει και από ιώδες γίνεται κοκκινωπό. 6. Πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα ρίχνουμε από μια σταγόνα από το μίγμα χρωστικής και μία σταγόνα ιζήματος. 7. Ανάδευση και επώαση 1 με 2 λεπτά. 8. Μικροσκόπηση σε οπτικό μικροσκόπιο για τα χαρακτηριστικά πυοσφαίρια ανώτερου και κατώτερου ουροποιητικού συστήματος. Τα τελευταία έχουν έντονα χρωματισμένα κυανό πρωτόπλασμα και πυρήνα. Χρώση Ηωσίνης - Μεθυλενίου Χρησιμοποιείται για τη χρώση ερυθρών και αιμορραγικών κυλίνδρων 1. Χρησιμοποιούνται δύο χρωστικές: H κόκκινη χρωστική: Υδατικό διάλυμα ηωσίνης 5% H γαλάζια χρωστική: Σε 10 ml κεκορεσμένου διαλύματος πικρικού οξέος προσθέτονται 1 ml διαλύματος κυανού του μεθυλενίου (1%) και 10 σταγόνες γλυκερίνη. 2. Στο ίζημα των ούρων προστίθεται 1 σταγόνα από την ηωσίνη, γίνεται ανάδευση για 1 λεπτό. 6

3. Μετά προσθέτονται 2 σταγόνες από την γαλάζια χρωστική, γίνεται ανάδευση και ελέγχεται ο χρωματισμός του ιζήματος. Αν όχι προστίθεται και άλλη γαλάζια χρωστική μέχρι να εμφανιστεί γαλάζιο χρώμα. Μετά από δύο λεπτά γίνεται μικροσκόπηση. 4. Τα ερυθρά και οι αιμορραγικοί κύλινδροι παίρνουν το χρώμα της ηωσίνης (κόκκινο). Χρώση Wright Η χρώση Wright που χρησιμοποιείται κυρίως για τον χρωματισμό των αιμοσφαιρίων του αίματος στα ούρα, κόπρανα και άλλα βιολογικά υγρά. Διατίθεται έτοιμη στο εμπόριο (π.χ. Sigma). H χρώση μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: 1. Πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα. A. Πάνω στο επίχρισμα τοποθετείται με σιφώνιο παστέρ 1-2 ml χρώσης Wright. B. Μετά από 30 δευτερόλεπτα και χωρίς να ξεπλυθεί η χρώση Wright τοποθετείται με σιφώνιο παστέρ ίση ποσότητα αποσταγμένου νερού. Γ. Το επίχρισμα ξεπλένεται στη βρύση με άφθονο νερό. Ξεραίνεται στον αέρα και μικροσκοπείται. 2. Μέσα σε μπανάκια χρώσης. Σε δύο μπανάκια χρώσης τοποθετούνται από 50 ml χρώσης Wright και αποσταγμένου νερού. Α. Το επίχρισμα βυθίζεται μέσα στη χρώση Wright επί 15 δευτερόλεπτα περίπου. Β. Στη συνέχεια το επίχρισμα βυθίζεται στο αποσταγμένο νερό επί 30 δευτερόλεπτα. Το επίχρισμα δεν ανακινείται σε κανένα από τα δύο μπανάκια. Γ. Το επίχρισμα ξεπλένεται στη βρύση με άφθονο νερό. Ξεραίνεται στον αέρα και μικροσκοπείται. 7

Χρώση Hansel 1. Διαλύονται 0,3 g ηωσίνης και 0,6 g κυανού του μεθυλενίου σε 60 ml μεθυλικής αλκοόλης. 2. Ετοιμάζεται ένα παρασκεύασμα από το ίζημα των ούρων το οποίο αφήνεται να στεγνώσει στον αέρα. 3. Το παρασκεύασμα μονιμοποιείται με 95% μεθυλική αλκοόλη. Εναλλακτικά μπορεί να γίνει ξέκασμα με ειδικό μονιμοποιητικό υλικό όπως το biofix όσο το παρασκεύασμα είναι νωπό. 4. Προσθέτονται 20 σταγόνες χρωστικής και αφήνονται να δράσουν επί 45. 5. Προσθέτονται 20 σταγόνες αποσταγμένο νερό και αφήνονται για 30. 6. Απορρίπτεται η χρωστική από το παρασκεύασμα και πλένεται με αποσταγμένο νερό. 7. Αποχρωματίζεται το παρασκεύασμα με μεθυλική αλκοόλη για 1 2 λεπτά. 8. Πλένεται το παρασκεύασμα με αποσταγμένο νερό και στεγνώνεται στον αέρα. Διάλυμα Turk (χρώση 1) Χρησιμοποιείται για τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και της κυτταρικής μεμβράνης των (οξεικό οξύ) και τη χρώση των πυρήνων των λευκών αιμοσφαιρίων (κυανό του μεθυλενίου). Σε κωνική φιάλη προστίθενται 1. 97 ml αποσταγμένου νερού 2. 3 ml οξεικό οξύ. 8

3. 3 σταγόνες κυανού του μεθυλενίου. Σε κωνική φιάλη προστίθενται Διάλυμα Turk (χρώση 2 1. 2% παγόμορφο οξικό οξύ 2. Υδατικό διάλυμα ιώδους της γεντιανής 1% Χρώση Gram 1. To κολπικό και γενικά το μικροβιολογικό δείγμα τοποθετείται με τη βοήθεια στειλεού πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αναμιγνύεται με μία σταγόνα αποσταγμένου νερού. 2. Δείγμα και σταγόνα αναδεύονται για να σχηματιστεί ένα ομοιογενές γάλακτωμα. 3. Το παρασκεύασμα μονιμοποιείται με ένα ελαφρό πέρασμα πάνω από τη φλόγα ενός λύχνου Bunsen. 4. Πάνω στο παρασκεύασμα αφήνονται λίγες σταγόνες κρυσταλλικού ιώδους και αφήνονται να δράσουν επί 1 λεπτό. Το κρυσταλλικό ιώδες χρωματίζει με βαθύ κυανό χρώμα όλα ανεξαιρέτως τα βακτηριακά κύτταρα. 5. Το παρασκεύασμα πλένεται με νερό και απομακρύνεται η περίσσεια της χρωστικής. 6. Στο παρασκεύασμα προστίθεται διάλυμα Ι 2 /ΚΙ (lugol) και αφήνεται να δράσει για 1 λεπτό. 7. Το παρασκεύασμα ξεπλένεται με αιθυλική αλκοόλη σταγόνα σταγόνα για 1 3 λεπτά. 8. Το παρασκεύασμα ξεπλένεται με άφθονο νερό σταγόνα σταγόνα. Τα κύτταρα αποχρωματίζονται εκτός από τα θετικά κατά Gram βακτήρια που διατηρούν το κυανό τους χρώμα. 9. Το παρασκεύασμα καλύπτεται με σαφρανίνη (1 λεπτό). 10. Νέο ξέπλυμα της περίσσειας με νερό. 11. Η περίσσεια του νερού απομακρύνεται προσεκτικά με απορροφητικό χαρτί. 12. Το παρασκεύασμα είναι έτοιμο για μικροσκόπηση σε μεγέθυνση Χ40 και στη συνέχεια Χ100. 9

Παρασκευή διαλύματος lugol 1. Ζυγίζονται 4 g ιωδιούχου καλίου (ΚΙ) και το προσθέτονται σε 100 ml αποσταγμένου νερού. 2. Το διάλυμα αναδεύεται μέχρι να διαυγάσει πλήρως. 3. Ζυγίζεται 1 g μεταλλικού ιωδίου (I 2 ) και προσθέτεται επίσης στο διάλυμα του ιωδιούχου καλίου. 4. Το διάλυμα αναδεύεται υπό θέρμανση μέχρι να διαλυθεί τελείως το ιώδιο. Κυανό της τολουϊδίνης Διακρίνει τους πυρήνες των κυττάρων (πυοσφαίρια, επιθηλιακά κύτταρα). Υδατικό διάλυμα τολουιδίνης 0,5% τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα μαζί με λίγες σταγόνες ιζήματος, ακολουθεί ανάδευση και επώαση λίγων λεπτών. Έχει το μειονέκτημα ότι καθιζάνει και να δημιουργεί συστάδες σε ορισμένα δείγματα. Κυανό του μεθυλενίου Χρωματίζει πολύ καλά κύτταρα, ιδιαίτερα τους πυρήνες τους και τα μικρόβια. Υδατικό διάλυμα 0,3% κυανού του μεθυλενίου τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα μαζί με λίγες σταγόνες ιζήματος, ακολουθεί ανάδευση και επώαση λίγων λεπτών. 10