ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΥΞΗΜΕΝΩΝ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ SRPK1 ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΚΑΙ TO ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΝΟΣΟ ALZHEIMER

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΥΞΗΜΕΝΩΝ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ SRPK1 ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΚΑΙ TO ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΝΟΣΟ ALZHEIMER ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΒΑΜΒΑΛΗ ΜΑΡΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΥΞΗΜΕΝΩΝ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ SRPK1 ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΚΑΙ TO ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΝΟΣΟ ALZHEIMER ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΒΑΜΒΑΛΗ ΜΑΡΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 1 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 2 Α.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs)... 2 Α.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών χαρακτηριστικά της δοµής τους... 2 Α.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης... 6 Α.1.3. Εντοπισµός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς... 7 Α.1.4. Υποστρώµατα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης... 8 Α.1.4.1. Παράγοντες µατίσµατος του RNA (SR splicing factors)... 8 Α.1.4.2. Υποδοχέας της λαµίνης Β (LBR Lamin B Receptor)... 10 Α.1.4.3. Πρωταµίνη P1... 11 Α.1.5. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης... 12 Α.1.6. SRPKs και παθογένεια... 13 Α.2. Η νόσος Alzheimer... 15 Α.3. Αυτοαντισώµατα... 20 Α.3.1. Αυτοαντισώµατα στη νόσο Alzheimer... 23 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ...28 Β.1. Ανθρώπινο υλικό... 28 Β.2. Πλασµίδια... 28 Β.2.1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR)... 29 Β.2.2. Κλωνοποίηση DNA σε πλασµιδιακούς φορείς... 31 Β.3. Έκφραση και καθαρισµός πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST)... 32 Β.4. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου (PAGE)... 33

Β.5. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE)... 35 Β.6. Βαφή µε Coomassie Brilliant Blue R-250... 36 Β.7. Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε µεµβράνη (Western blot)... 37 Β.8. Ανοσοανίχνευση... 37 Β.9. ELISA... 39 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...41. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...51 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...57

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Αυτοαντισώµατα απέναντι σε συγκεκριµένα κυτταρικά αντιγόνα ανιχνεύονται συχνά στον ορό και εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών µε νόσο Alzheimer και πιθανά παίζουν σηµαντικό ρόλο στην εµφάνιση/εξέλιξη της νόσου. Στην παρούσα εργασία βρήκαµε ότι η πρωτεϊνική κινάση SRPK1 αποτελεί ένα καινούργιο αυτοαντιγόνο το οποίο είναι αυξηµένο στους ασθενείς µε νόσο Alzheimer. Χρησιµοποιώντας την µεθοδολογία της έµµεσης ELISA δείξαµε ότι υπάρχουν αυξηµένα αντισώµατα απέναντι στην SRPK1 που στοχεύουν κύρια την πρώτη καταλυτική περιοχή της κινάσης στον ορό ασθενών µε Alzheimer, σε σχέση µε τον ορό υγιών ηλικιωµένων. Παρόµοια αντισώµατα βρέθηκαν και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών, όπου όµως ο περιορισµένος αριθµός των δειγµάτων δεν µας επιτρέπει να εξάγουµε ένα σαφές συµπέρασµα αν η διαφορά στα επίπεδα των αυτοαντισωµάτων είναι στατιστικά σηµαντική σε σχέση µε τους υγιείς ηλικιωµένους. Τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης δείχνουν για πρώτη φορά την ύπαρξη αυτοαντισωµάτων απέναντι στην SRPK1 σε ανθρώπινο ορό και είναι ενδεικτικά της ύπαρξης συσχέτισης ανάµεσα στα επίπεδα αυτών των αυτοαντισωµάτων και την εµφάνιση της νόσου Alzheimer. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, κάτω από την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή Θωµά Γιαννακούρου, τον οποία ευχαριστώ θερµά για την υπόδειξη του θέµατος και για την πολύτιµη βοήθεια που µου προσέφερε κατά την διάρκεια της εργασίας. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Θ. Χολή- Παπαδοπούλου και την επίκουρο καθηγήτρια κ. Αναστασία Πανταζάκη, µέλη της τριµελούς εξεταστικής µου επιτροπής, για τις υποδείξεις και την εποικοδοµητική κριτική της εργασίας. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την επίκουρο καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη και την υποψήφια διδάκτορα Μακρίνα ανιηλίδου για τη στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συµπαράσταση, καθώς και για την πολύτιµη και ουσιαστική βοήθεια που µου προσέφεραν κατά την πειραµατική διαδικασία. Τέλος, ευχαριστίες οφείλω και σε όλο το προσωπικό και τους συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχηµείας για την συνεργασία τους και τη δηµιουργία του ευχάριστου συναδελφικού κλίµατος µέσα στο εργαστήριο. 1

A. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs) A.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών χαρακτηριστικά της δοµής τους Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν µια σχετικά νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώµατα τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες που αποτελούν µέρος µιας επαναλαµβανόµενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθµιση του µατίσµατος του mrna, η µεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταµίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερµιογένεσης, η µεταφορά πολυαµινών µέσα στα κύτταρα και η οµοιόσταση ιόντων (Nikolakaki et al., 2001). Το πρώτο µέλος της οικογένειας το οποίο κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ήταν η ανθρώπινη µορφή της SRPK1, µε βάση την ικανότητά της να φωσφορυλιώνει τους παράγοντες µατίσµατος που περιέχουν στο µόριο τους ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριµένων ακολουθιών παίζει καθοριστικό ρόλο στη συγκρότηση του σωµατιδίου µατίσµατος του RNA (Gui et al., 1994a; Gui et al., 1994b). Μέχρι σήµερα τουλάχιστον δέκα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αγρινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισµούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες µορφές των SRPK1 (accession No: U09564), SRPK1a (accession No: AJ318054) και SRPK2 (accession No: U88666A) και στο ποντίκι οι µορφές των SRPK1 (accession No: AJ224115), SRPK2 (accession No: AB006036) και SRPK3 (accession No: ΝΜ_019684). Στη ζύµη οι Sky1 (accession No: S55098) (S. cerevisiae) και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το οµόλογο της SRPK1 (accession No: AF01149), στο C. elegans η SPK-1 (accession No: AF241656) και στα φυτά το αντίστοιχο οµόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana) (NCBI, Entrez Nucleotide). 2

Σχήµα A.1. Σχηµατική αναπαράσταση των SRPKs ποντικού. Τα τρία µέλη της οικογένειας εµφανίζουν µεγάλη οµολογία στις περιοχές µε δράση κινάσης (kinase domain), αλλά διαφέρουν στο Ν- τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή (hinge region). Το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Τα ποσοστά δηλώνουν την οµολογία στην αµινοξική αλληλουχία, ενώ δίνονται και οι αριθµοί των αµινοξέων (Nakagawa et al., 2005). Οι SRPKs των θηλαστικών έχουν το χαρακτηριστικό ότι παρουσιάζουν πολύ µεγάλη οµολογία στην πρωτοταγή τους δοµή, στις περιοχές µε δράση κινάσης (kinase domain), καθώς επίσης και στην εξειδίκευση τους ως προς τα διάφορα υποστρώµατα. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των κινασών αυτών αποτελεί το γεγονός ότι οι περιοχές του µορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από µία ασυνήθιστα µεγάλη αλληλουχία αµινοξέων (Σχήµα Α.1), γεγονός πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισµένο σε κινάσες τυροσίνης (Wang et al., 1998). Η µεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αµινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο τόσο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, όσο και στην υποκυτταρική τους κατανοµή (Ding et al., 2006). Ακόµη ένα κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι περιέχουν στο µόριο τους δύο πιθανά σήµατα για την εντόπιση στον πυρήνα (NLS nuclear localization signal), ένα στην αµινο-τελική περιοχή ( 11 R-K-K-R-T-K-A-K-K-D-K 21 ) και ένα στο κέντρο του µορίου ( 267 Κ-Κ-Κ- Κ-L-K-K-K-Q-K-R 277 ) (Gui et al., 1994a). Οι διαφορές ανάµεσα στα µέλη της οικογένειας που απαντώνται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισµένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε µορίου στην πρωτοταγή του δοµή. Στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού µατίσµατος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η µόνη διαφορά έγκειται στην ύπαρξη µιας εµβόλιµης ακολουθίας από 171 αµινοξέα στο αµινο-τελικό άκρο του µορίου αµέσως µετά τα τέσσερα πρώτα αµινοξέα, όπως φαίνεται στο Σχήµα Α.2 (Nikolakaki et al., 2001). 3

Σχήµα A.2. Σχηµατική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου µατίσµατος της SRPK1a. (Α) Αναπαράσταση της δοµής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξώνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξώνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τµήµα των 513 bp το οποίο δεν περιλαµβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αµινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξώνιο 1 της SRPK1a µε την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξώνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τµήµα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις µατίσµατος που βρίσκονται στα όρια µεταξύ των εξωνίων 1a και 1b και του τµήµατος των 513 bp (Nikolakaki et al., 2001). Η εµβόλιµη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σηµαντικό αριθµό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες µε το µοτίβο L-X-X-L-L ( 148 L-A-P-L-L 152 και 158 L-G-R- L-L 162 ), το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών µε πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης µε διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσµευσης της µε την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγµατος SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1) (Nikolakaki et al., 2001). 4

Στην περίπτωση του µορίου της SRPK2, η οποία αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε µικρές αλλαγές στην αµινοξική ακολουθία στη κεντρική και καρβοξυ-τελική τους περιοχή. Οι διαφορές αυτές δεν παίζουν σηµαντικό ρόλο στη δραστικότητα και την εξειδίκευση των δύο ενζύµων (πάνω από 90% οµολογία στις περιοχές κινάσης). Επιπλέον, το αµινο-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες και περιέχει την αµινοξική αλληλουχία P-P-L-P, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισµα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε SH 3 - και WW- περιοχές άλλων πρωτεϊνών (Wang et al., 1998). Κατ αναλογία µε την πρόσθετη αλληλουχία της SRPK1a, η διαφορετική αυτή περιοχή της SRPK2 µπορεί να παίζει το ρόλο ενός σήµατος για την αλληλεπίδραση της µε διαφορετικά υποστρώµατα ή άλλα ρυθµιστικά µόρια, σε σύγκριση µε την SRPK1. Το µοντέλο, σύµφωνα µε το οποίο οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωµάτων τους, δεν εξηγεί τη φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώµατος. Είναι πιθανό in vivo το υπόστρωµα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από µία άλλη κινάση πρωτεϊνών και ακολούθως οι SRPKs να το αναγνωρίζουν και να φωσφορυλιώνουν τις υπόλοιπες σερίνες, ακολουθώντας µία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωµάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPKs, αλλά µε πολύ µικρότερη αποτελεσµατικότητα. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η SRPK1 συνδέεται αρχικά µε τα υποστρώµατά της µέσω µίας αύλακας του µορίου της (docking groove), η οποία αναγνωρίζει το µοτίβο R-X-R/K-X-X-X-R (Ngo et al., 2005). Όταν η αρχική φωσφορυλίωση του υποστρώµατος επιτευχθεί, η SRPK συνεχίζει τη φωσφορυλίωση του υποστρώµατος επιδεικνύοντας υψηλότερη δραστικότητα (Nolen et al., 2001). Σε πειράµατα φωσφορυλίωσης του παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2 από την SRPK1 βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση των σερινών της RS ακολουθίας γίνεται διαδοχικά. Όσο διαρκεί η διαδικασία αυτή, το υπόστρωµα παραµένει δεσµευµένο πάνω στο µόριο της κινάσης. Αποδείχτηκε ακόµη ότι από τις 20 σερίνες της RS ακολουθίας, µόνο οι µισές φωσφορυλιώνονται in vitro. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης µάλιστα είναι ανεξάρτητες της ποσότητας του ATP ή της ποσότητας της κινάσης (Aubol et al., 2003). 5

A.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Η εξειδίκευση των SRPKs εντοπίζεται στην ύπαρξη µιας επαναλαµβανόµενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα µόρια των υποστρωµάτων τους. Η µεταφορά της γ-φωσφορικής οµάδας του ΑΤΡ γίνεται στις σερίνες των ακολουθιών αυτών. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι SRPKs είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (-R-S-R-S-R-S-). Σε πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης χρησιµοποιώντας ως κινάση την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και υποστρώµατα που περιείχαν µόνο δύο επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόµη έχει δειχτεί ότι η αντικατάσταση της σερίνης από θρεονίνη ή της αργινίνης από λυσίνη στις RS ακολουθίες, έχει ως αποτέλεσµα τη µη φωσφορυλίωση των υποστρωµάτων από την SRPK1 (Wang et al., 1998). Το Ν-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαµίνης Β (LBR Lamin B Receptor) περιέχει κατάλληλη περιοχή διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την SRPK1. Μεταλλάγµατα της περιοχής αυτής, στα οποία είχαν εισαχθεί µε σηµειακές µεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών, έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν την δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίµηση από την πλευρά της κινάσης (Nikolakaki et al., 1996; Papoutsopoulou et al., 1999b). Ακόµη σε in vitro πειράµατα που έγιναν χρησιµοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 µε διάφορους παράγοντες µατίσµατος του mrna που προέρχονται από διαφορετικούς οργανισµούς, έδειξαν ότι οι κινάσες αυτές προτιµούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που είναι τοποθετηµένες ανάµεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αµινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al., 1998). Όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των SRPKs, οι µελέτες που έγιναν χρησιµοποιώντας ως πηγή δράσης την SRPK1 και ως υπόστρωµα τον παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2 έδωσαν µια τιµή Κm 10 µμ για το ΑΤΡ, και µία πολύ µικρή τιµή Κm 0,07 µμ για το υπόστρωµα. Το γεγονός αυτό δείχνει την πολύ µεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώµατά τους (Gui et al., 1994b). 6

A.1.3. Εντοπισµός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς Φθορισµοµετρικός in situ υβριδισµός (FISH) σε ανθρώπινα σωµατικά κύτταρα έδειξε ότι το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται τοποθετηµένο στο χρωµόσωµα 6 (θέση 6p21.2-p21.3), ενώ αντίστοιχα το γονίδιο της SRPK2 στο χρωµόσωµα 7 (θέση 7q22-q31.1). Στο ποντίκι, η χαρτογράφηση των χρωµοσωµάτων έδειξε ότι τα γονίδια των SRPK1 και SRPK2 βρίσκονται στα χρωµοσώµατα 17 (θέση 17 A3.3) και 5 (θέση 5 9.0 cm) αντίστοιχα (NCBI, Entrez Gene; Wang et al., 1999). Στο ποντίκι ακόµη, όπου δεν εκφράζεται η ανθρώπινη ισοµορφή SRPK1a, εκφράζεται η Stk23/SRPK3 (Nakagawa et al., 2005), το γονίδιο της οποίας βρίσκεται στο χρωµόσωµα Χ (θέση X A7.3). Οµόλογη της συγκεκριµένης χρωµοσωµικής περιοχής έχει βρεθεί και στον άνθρωπο, στο χρωµόσωµα Χ (θέση Xq28) (NCBI, Entrez Gene), δεν έχει όµως βρεθεί ακόµη η αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η κατανοµή των µελών της οικογένειας των SRPKs στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σηµαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασης τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των SRPKs, χρησιµοποιώντας υβριδισµό κατά Northern µε ιχνηλάτες ραδιενεργά επισηµασµένα τµήµατα των γονιδίων τους, έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται σε µεγαλύτερο βαθµό στους όρχεις, έχοντας µικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύµος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός µυς (Papoutsopoulou et al., 1999a). Παρόµοια εικόνα έδειξε και η µελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όµως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασής της στους διάφορους ιστούς ήταν σηµαντικά µικρότερα (Nikolakaki et al., 2001). Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα, αφού εκφράζεται σε µεγάλο βαθµό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, µέτρια στην καρδιά και το σκελετικό µυ, ενώ παρουσιάζει χαµηλά επίπεδα έκφρασης στον πνεύµονα, το ήπαρ και το νεφρό (Wang et al., 1998). Τέλος, η SRPK3 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό µυ του ποντικού (Nakagawa et al., 2005). Τα παραπάνω αποτελέσµατα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών στους ιστούς των οργανισµών, συµβάλλουν στη ρύθµιση των λειτουργιών τους κατά ένα εξειδικευµένο τρόπο στο επίπεδο του κάθε ιστού ξεχωριστά (tissue specific regulation). 7

A.1.4. Υποστρώµατα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης A.1.4.1. Παράγοντες µατίσµατος του RNA (SR splicing factors) Τα πιο καλά µελετηµένα υποστρώµατα της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης αποτελούν οι παράγοντες µατίσµατος, οι οποίοι περιέχουν στο µόριο τους επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (SR splicing factors), µε πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγµα τον ASF/SF2. Άλλα µέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ο SC35, ο 9G8 και πέντε ακόµη πολυπεπτίδια µε µοριακές µάζες 20, 35, 40, 55 και 75 kda, όπως φαίνονται στο Σχήµα Α.3. Άλλες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στη διαδικασία µατίσµατος του RNA και περιέχουν το χαρακτηριστικό µοτίβο των επαναλαµβανόµενων διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιµοποιείται για τις επτά προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται µε τις µικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεϊνες (snrnps small nuclear RiboNucleoProteins) όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο αµινο-τελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης και δέσµευσης του RNA, RBDs (RNA Binding Domains), ενώ το καρβοξυ-τελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (Manley and Tacke, 1996). Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εµπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις µε άλλους παράγοντες µατίσµατος και εκτός από την συγκρότηση του σωµατιδίου µατίσµατος, θεωρούνται σηµαντικές και στην περίπτωση του εναλλακτικού τρόπου µατίσµατος των mrnas ρυθµίζοντας την επιλογή της θέσης όπου θα γίνει το µάτισµα (Manley and Tacke, 1996; Valcarcel and Green, 1996). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης των παραγόντων µατίσµατος είναι η αποσύνδεσή τους από τις θέσεις αποθήκευσης στον πυρήνα (IGCs - Interchromatin Granule Clusters), όπου βρίσκονται συγκεντρωµένοι σε µεγάλα ανενεργά σύµπλοκα. Έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική µορφή τους, είναι δυνατή η µεταφορά τους σε ενεργές περιοχές µεταγραφής στο πυρηνόπλασµα (PFs - Perichromatin Fibrils), όπου και συµµετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριµου mrna (Gui et al., 1994a; Kuroyanagi et al., 1998; Yeakley et al., 1999). Επίσης, η φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος από την οικογένεια των SR πρωτεϊνικών κινασών, επάγει τις µεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να 8

Σχήµα A.3. Σχηµατική αναπαράσταση των δοµικών περιοχών των SR παραγόντων µατίσµατος. ιακρίνονται στο αµινο-τελικό άκρο τους µία ή δύο περιοχές δέσµευσης µε το RNA (RBD - κόκκινο ή µπλε) και στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο οι περιοχές των επαναλαµβανόµενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS - πράσινο). Μία συνδετική αλληλουχία πλούσια σε γλυκίνη και σε ορισµένους παράγοντες εκτός της γλυκίνης πλούσια και σε προλίνη ή αργινίνη, φαίνεται µε πορτοκαλί. Ακόµη ο παράγοντας 9G8 µε µοριακή µάζα 35 kda περιέχει µία θέση δέσµευσης ψευδαργύρου (γκρι) (Manley and Tacke, 1996). συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύµπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας µατίσµατος του mrna (Gui et al., 1994a; Yue et al., 2000). Στην ικανότητα των SR πρωτεϊνικών κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συµπλόκου, συνηγορούν και δεδοµένα τα οποία δείχνουν ότι µε µη φωσφορυλιωµένους παράγοντες µατίσµατος ή µε την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύµπλοκο δεν συγκροτείται και το µάτισµα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (Cao et al., 1997). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιµη µε προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων µατίσµατος. Αφού όµως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συµπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος ώστε το σωµατίδιο µατίσµατος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία. Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι η 9

παρουσία µεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, µετά την συγκρότηση του συµπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του µατίσµατος του mrna (Cao et al., 1997). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει την λειτουργικότητα του συµπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι ένα ακόµη σηµείο που καταδεικνύει την σηµασία της ρυθµιζόµενης δραστικότητας των SR πρωτεϊνικών κινασών. Η δράση τους είναι απαραίτητη µόνο κατά τα αρχικά της στάδια του µατίσµατος, αφού παρατεταµένη φωσφορυλίωση οδηγεί σε αναστολή της καταλυτικής διαδικασίας (Cao et al., 1997; Valcarcel et al., 1996; Wang et al., 1998; Xiao and Manley, 1997). Άλλο ένα αποτέλεσµα που συνηγορεί στην παραπάνω θεώρηση, είναι η ανώµαλη φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος και η ανικανότητα δηµιουργίας λειτουργικού συµπλόκου µατίσµατος κατά την αλληλεπίδραση της SRPK1 µε την πρωτεΐνη ICP27 του HSV-1 (Herpes Simplex Virus) (Sciabica et al., 2003). Τέλος, η φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος από το κυτταροπλασµατικό κλάσµα των SR πρωτεϊνικών κινασών επάγει τη µεταφορά τους από το κυτταρόπλασµα, όπου συντίθενται, στον πυρήνα. Ταυτόχρονα ρυθµίζεται και η ενδοπυρηνική τους εντόπιση στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές του πυρήνα (Yeakley et al., 1999). Στο σηµείο αυτό πρέπει να σηµειωθεί ότι στη ζύµη S. cerevisiae, η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εµπλέκεται στη δέσµευση και µεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθµίζεται η είσοδος της συγκεκριµένης πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p µε τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (Gilbert et al., 2001). A.1.4.2. Υποδοχέας της λαµίνης Β (LBR Lamin B Receptor) Ο υποδοχέας της λαµίνης Β (LBR, p58), είναι µία πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής µεµβράνης του πυρηνικού φακέλου. Ανάλυση της πρωτοταγούς δοµής του έδειξε ότι αποτελείται από 8 υδρόφοβες διαµεµβρανικές περιοχές που διαπερνούν την εσωτερική πυρηνική µεµβράνη, καθώς και δύο υδρόφιλες περιοχές στο αµινο-τελικό και καρβοξυ-τελικό του άκρο αντίστοιχα, τα οποία εκτείνονται προς το πυρηνόπλασµα (Worman et al., 1990; Ye and Worman, 1994). Αν και δεν έχει γίνει συστηµατική µελέτη των διαµεµβρανικών τµηµάτων της πρωτεΐνης και του καρβοξυτελικού της άκρου, οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά του αµινο-τελικού της άκρου έχουν µελετηθεί διεξοδικά. 10

Το αµινο-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαµίνης Β αποτελείται από µία ακολουθία 208 αµινοξέων και έχει σφαιρικό (globular) σχήµα. Στο τµήµα αυτό περιέχονται το σήµα πυρηνικού εντοπισµού της πρωτεΐνης (NLS), ακολουθίες αµινοξέων οι οποίες είναι ικανές να φωσφορυλιωθούν από την πρωτεϊνική κινάση Α και την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, µία περιοχή επαναλαµβανόµενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS domain), καθώς και πιθανές περιοχές δέσµευσης του DNA (Appelbaum et al., 1990; Nikolakaki et al., 1997; Nikolakaki et al., 1996; Simos and Georgatos, 1992; Soullam and Worman, 1993). Ακόµη το αµινο-τελικό άκρο του LBR είναι ικανό να δεσµεύσει την λαµίνη τύπου Β, γεγονός που εξηγεί και την ονοµασία της πρωτεΐνης (Simos and Georgatos, 1992; Worman et al., 1988; Ye and Worman, 1994). Η RS ακολουθία του αµινο-τελικού άκρου του LBR περιλαµβάνει πέντε επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης ( 75 RSRSRSRSRS 84 ) και όλες οι σερίνες της φωσφορυλιώνονται από την SRPK1 (Mylonis et al., 2004; Nikolakaki et al., 1996). Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση του LBR µε άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα όπως η πρωτεΐνη p32/p34, οι ιστόνες Η3 και Η4 (Polioudaki et al., 2001) και η πρωταµίνη 1 (Mylonis et al., 2004). Ακόµη έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του LBR από την SRPK1 επάγει τη δέσµευση χρωµατίνης στον LBR (Takano et al., 2004). A.1.4.3. Πρωταµίνη P1 Ένα άλλο υπόστρωµα των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελεί η πρωταµίνη P1. Οι πρωταµίνες Ρ1 είναι πολύ βασικά, χαµηλού µοριακού βάρους πολυπεπτίδια µε ισοηλεκτρικό σηµείο µεγαλύτερο του 11 (τα µισά τους αµινοξέα αποτελούνται από αργινίνες). Είναι πρωτεΐνες πολύ συντηρηµένες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και διαιρούνται σε δύο κατηγορίες αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες και συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα µαρσιποφόρα, και αυτές των θηλαστικών µε πλακούντα που περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηµατίζουν ενδοµοριακούς δισουλφιδικούς δεσµούς που σταθεροποιούν τη δοµή τους (Oliva and Dixon, 1991; Retief et al., 1993). Και οι δύο κατηγορίες των Ρ1 πρωταµινών περιλαµβάνουν στο µόριο τους επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από τις SRPKs (Papoutsopoulou et al., 1999a). 11

Ο ρόλος των πρωταµινών είναι η αντικατάσταση των ιστονών κατά τη διάρκεια της σπερµατογένεσης µε αποτέλεσµα να προκύπτει χρωµατίνη µε πολύ υψηλό βαθµό συµπύκνωσης (Oliva and Dixon, 1991). Κατά τα αρχικά στάδια της σπερµατογένεσης οι πρωταµίνες φωσφορυλιώνονται στοιχειοµετρικά ενώ, αργότερα, στα ώριµα σπερµατοζωάρια αποφωσφορυλιώνονται στο µεγαλύτερο µέρος τους (Chirat et al., 1993; Oliva and Dixon, 1991). Παλαιότερα είχε προταθεί ότι ο ρόλος της φωσφορυλίωσης διευκολύνει τη σωστή σύνδεση των πρωταµινών µε το DNA, ενώ η αποφωσφορυλίωση τους κατά τα τελικά στάδια της σπερµατογένεσης οδηγεί πιθανότατα σε µία περαιτέρω συµπύκνωση της χρωµατίνης (Chirat et al., 1993). Στη συνέχεια διατυπώθηκε η άποψη ότι επειδή υπάρχει µεγάλη συγκέντρωση πρωταµινών και άλλων βασικών πρωτεϊνών γύρω από το DNA, η φωσφορυλίωση σε συγκεκριµένες θέσεις στο µόριο των P1 πρωταµινών µειώνει τις δυνάµεις απώθησης µεταξύ γειτονικών θετικών φορτίων (Papoutsopoulou et al., 1999a). Πρόσφατα όµως αποτελέσµατα µας οδηγούν στο συµπέρασµα ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταµίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της µε τον πυρηνικό φάκελο (Mylonis et al., 2004). εδοµένου δε ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταµίνες γίνεται στην πυρηνική περιφέρεια, η φωσφορυλίωση της P1 πρωταµίνης και η συνεπακόλουθη εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, µάλλον συνεισφέρουν στη διαδικασία αντικατάστασης. A.1.5. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Η οµόλογη της SRPK1 στη ζύµη S. cerevisiae, η Sky1p, εµπλέκεται στη ρύθµιση της µεταφοράς πολυαµινών στο κύτταρο καθώς και στην οµοιόσταση ιόντων (Erez and Kahana, 2001). Μεταλλαγµένα κύτταρα ζύµης, όπου έγινε απενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν µεγάλη ανθεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερµίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε µετά από επιµόλυνση των κυττάρων µε το γονίδιο που κωδικοποιεί την Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο µε επιµόλυνσή τους µε ένα µεταλλαγµένο γονίδιο που εκφράζει µια µη λειτουργική µορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξηµένη ευαισθησία στην σπερµίνη. Η απενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύµης προκάλεσε ακόµη µειωµένη πρόσληψη σπερµιδίνης και πουτρεσκίνης. Η ίδια µεταλλαγµένη µορφή των 12

κυττάρων έδειξε και µία µεγάλη ανεκτικότητα στα ιόντα λιθίου και νατρίου (Erez and Kahana, 2001). Ένα άλλο µέλος της οικογένειας αυτής των κινασών, η SPK-1 στο C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων. Η SPK-1 δεσµεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνη CeSF2 in vitro. Η κινάση αυτή και το υπόστρωµα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηµατοειδούς και παίζουν σηµαντικό ρόλο κατά την διάρκεια του εµβρυϊκού σταδίου του C. elegans (Kuroyanagi et al., 2000). Τέλος, η SRPK1 έχει αποµονωθεί ως σύµπλοκο µε την τοποϊσοµεράση ΙΙa, δύο ATPάσες/ελικάσες (RNA helicase A και RHII/Gu), δύο παράγοντες µατίσµατος του RNA (PRP8 και hnrnp C) και µια HMG πρωτεΐνη (SSRP1) (Lee et al., 2004). Το σύµπλοκο αυτό, το οποίο ονοµάστηκε τοποσωµάτιο (toposome), φαίνεται να συγκροτείται κυρίως κατά τη G2/M φάση ενώ κατά τη G1/S φάση, οι συστατικές του πρωτεΐνες εµφανίζουν πολύ χαµηλή αλληλεπίδραση µεταξύ τους. Το τοποσωµάτιο θεωρείται µερικώς υπεύθυνο για το διαχωρισµό των αδελφών χρωµατίδων. Τα παραπάνω δεδοµένα δείχνουν ότι το συγκεκριµένο σύµπλοκο είναι δυναµικό και ότι ο σχηµατισµός ή/και η ενεργοποίησή του εξαρτώνται άµεσα από τον κυτταρικό κύκλο (Lee et al., 2004). A.1.6. SRPKs και παθογένεια Αύξηση των επιπέδων της SRPK1 έχει δειχτεί σε διάφορες λευχαιµίες, όπως η οξεία ATL (Adult T-cell leukemia) (Hishizawa et al., 2005) και η χρόνια CML (Salesse et al., 2004) αλλά και σε καρκίνους του στήθους, του εντέρου και του παγκρέατος (Hayes et al., 2006; Hayes et al., 2007). Μείωση της έκφρασης της SRPK1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του στήθους και του εντέρου, µε χρήση sirna (small interference RNA), προκάλεσε αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που οδηγούνται σε απόπτωση και αύξηση του κυτταρικού θανάτου µετά από έκθεση σε χηµειοθεραπευτικά αντιδραστήρια. Ενδελεχής µελέτη της επίδρασης της SRPK1 στην ενεργοποίηση των µονοπατιών µεταφοράς σήµατος των κινασών MAPK και Akt, έδειξε ότι µετά από µείωση των επιπέδων της SRPK1, δεν παρατηρούνται αλλαγές σε επίπεδο πρωτεΐνης στις MAPK3, MAPK2 και Akt κινάσες. Εντούτοις υπάρχει µείωση στη φωσφορυλίωσή τους και αλλαγή στην αναλογία έκφρασης των 13

ισοµορφών της MAPK2, ίσως λόγω επίδρασης στο µηχανισµό µατίσµατος του RNA (Hayes et al., 2007). Η επίδραση της SRPK1 στη δραστικότητα διαφόρων χηµειοθεραπευτικών φαρµάκων, αποτελεί πεδίο αντιπαράθεσης, αφού η αύξηση των επιπέδων του συγκεκριµένου ενζύµου έχει συνδυαστεί τόσο µε την αντίσταση, όσο και µε την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων απέναντι σε παράγωγα πλατίνης. Σε καρκίνους των όρχεων και των ωοθηκών, η ελάττωση της έκφρασης της SRPK1 προκαλεί αντίσταση των καρκινικών κυττάρων απέναντι στη cis-πλατίνη (Schenk et al., 2001; Schenk et al., 2004). Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση της SRPK1 προκαλεί αντίσταση των ΗΤ29 (Human colon adenocarcinoma grade II cell line) κυττάρων στην οξαλιπλατίνη (Plasencia et al., 2006), ενώ η µείωση της έκφρασής της αυξάνει την ευαισθησία καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος στην cis-πλατίνη και τη γεµσιταµπίνη (Hayes et al., 2006). Οι αντίθετες αυτές δράσεις της SRPK1 απέναντι στα διάφορα κυτταροτοξικά αντιδραστήρια έχουν αποδοθεί ότι οφείλονται στην έκφραση διαφορετκών πρωτεϊνών σε κάθε κυτταρική σειρά (Hayes et al., 2007). Αύξηση της έκφρασης της SRPK1 παρατηρείται και κατά τη χρωµοσωµική µετατόπιση t(6;17)(p21.31;q11.2), η οποία είναι υπεύθυνη για µια πληθώρα ανωµαλιών (Mansouri et al., 2006). Ακόµα, η εγκεφαλική ισχαιµία σε ποντίκι έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση των επιπέδων της SRPK1 στα βασικά γάγγλια και µετατόπισή της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα (Erdo et al., 2004). Η διαφοροποίηση των λευχαιµικών κυττάρων HL-60 από το ρετινοϊκό οξύ, τη βρωµοδεοξυουριδίνη και το µεσαίο Τ αντιγόνο του µεταλλαγµένου ιού του πολυόµατος (Delta 205 mutant polyoma middle T antigen), προκαλούν αύξηση των επιπέδων έκφρασης της SRPK2 (Yen et al., 2004). Ακόµα, τόσο η SRPK2 όσο και η SRPK1 έχουν την ικανότητα να δεσµεύουν την κεντρική πρωτεΐνη του ιού της ηπατίτιδας Β και να αναστέλλουν την αντιγραφή του ιού, µέσω µιας οδού η οποία φαίνεται να είναι ανεξάρτητη της φωσφορυλίωσης (Zheng et al., 2005). Η SRPK3 βρίσκεται υπό τον έλεγχο του µεταγραφικού παράγοντα MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), ο οποίος παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη των µυών. Ποντίκια, από τα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της SRPK3, παρουσιάζουν µία καινούργια µορφή µυοπάθειας, ενώ διαγονιδιακά ποντίκια που την υπερεκφράζουν, εµφανίζουν σοβαρό εκφυλισµό των µυϊκών ινών και πεθαίνουν στην F0 ή F1 γενιά (Nakagawa et al., 2005). 14

A.2. Η νόσος Alzheimer Η νόσος Alzheimer είναι µία σταδιακή νευροεκφυλιστική ασθένεια του κεντρικού νευρικού συστήµατος, η οποία σχετίζεται µε προοδευτική απώλεια µνήµης οδηγώντας σε άνοια. Περιγράφηκε αρχικά από τον Alois Alzheimer το 1907 και αποτελεί µία ασθένεια µε πολύπλοκο αιτιοπαθογενετικό υπόβαθρο που προσβάλει περίπου το 10% του πληθυσµού ηλικίας άνω των 65 ετών. Οι ασθενείς µε Alzheimer αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 50% του συνόλου των περιπτώσεων άνοιας και έχει υπολογισθεί ότι η νόσος αφορά περισσότερους από 24 εκατοµµύρια ασθενείς παγκοσµίως. Επιπλέον, πάνω από 5 εκατοµµύρια νέα περιστατικά καταγράφονται κάθε χρόνο αυξάνοντας τους ασθενείς της νόσου από 1% στις ηλικίες 60 µε 70 στο 6% και στο 8% στις ηλικίες 85 και άνω (Mayeux, 2003). Η ασθένεια, µπορεί να κατηγοριοποιηθεί µε βάση την ηλικία έναρξης των συµπτωµάτων σε πρώιµη (Early-Onset Alzheimer Disease EOAD) και όψιµη (Late- Onset Alzheimer Disease LOAD). Η πρώιµη νόσος Alzheimer αντιπροσωπεύει το 1% µε 6% όλων των περιπτώσεων και αφορά ασθενείς ηλικίας από 40 έως 60 µε 65 ετών. Η όψιµη νόσος Alzheimer αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 90% του συνόλου των ασθενών και αφορά ηλικίες µεγαλύτερες των 60 µε 65 ετών, αποτελώντας την πιο κοινή µορφή της νόσου, και ορίζεται πλέον ως νόσος Alzheimer σε αντίθεση µε την πρώιµη για την οποία χρησιµοποιείται περισσότερο ο όρος προάνοια (reviewed in Lynn et al., 2010). Τα κλινικά συµπτώµατα της νόσου δεν διαφέρουν µεταξύ της πρώιµης και της όψιµης µορφής, ιδιαίτερα στα αρχικά στάδια. Τα πρώτα συµπτώµατα της ασθένειας συχνά δεν συνδέονται µε τη νόσο Alzheimer αλλά, συνήθως, µε ψυχολογικές διαταραχές και καταστάσεις stress (Waldemar et al., 2007). Στα πρώτα στάδια, το συνηθέστερο αναγνωρίσιµο σύµπτωµα είναι η απώλεια µνήµης που εκδηλώνεται µε ανικανότητα συγκράτησης πρόσφατων πληροφοριών, καθώς και δυσκολία επαναφοράς στην µνήµη πρόσφατων γεγονότων. Η λεπτοµερής νευροψυχολογική µελέτη µπορεί να αποκαλύψει ήπιες γνωστικές δυσκολίες µέχρι και οκτώ έτη προτού να εκπληρώσει ένα άτοµο τα κλινικά κριτήρια για τη διάγνωση της νόσου (Tabert et al., 2005; Waldemar et al., 2007). Η νόσος Alzheimer δεν έχει τις ίδιες επιπτώσεις σε όλες τις ικανότητες µνήµης, τουλάχιστο στα αρχικά στάδια. Παλαιότερες µνήµες της ζωής του ασθενή (επεισοδιακή µνήµη) και γεγονότα που µαθαίνονται (σηµαντική µνήµη) επηρεάζονται 15

σε µικρότερο βαθµό, σε σχέση µε νέα γεγονότα και αναµνήσεις (Förstl and Kurz, 1999). Τα γλωσσικά προβλήµατα, που στην αρχή χαρακτηρίζονται κυρίως µε µειωµένη ικανότητα έκφρασης, σταδιακά εντείνονται και οδηγούν σε γενικευµένη αδυναµία χρήσης της γλώσσας. Με την πρόοδο της ασθένειας, τα συµπτώµατα περιλαµβάνουν σύγχυση, οξυθυµία, επιθετικότητα, προβλήµατα οµιλίας, απώλεια της µακροπρόθεσµης µνήµης, και γενική κοινωνική αποµόνωση του πάσχοντος. Σε αυτό το στάδιο είναι δυνατό, επίσης, να παρατηρηθεί απάθεια, η οποία θα παραµείνει ως το πιο επίµονο νευροψυχιατρικό σύµπτωµα καθ όλη τη διάρκεια της ασθένειας (reviewed in Lynn et al., 2010). Ο θάνατος τελικά επέρχεται συνήθως από ασιτία, έλκη και πνευµονία (Bird, 2008). Υπάρχουν διάφορες υποθέσεις όσον αφορά τα αίτια της νόσου Alzheimer. Η παλαιότερη, στην οποία είναι βασισµένη και η πλειονότητα των υπαρχόντων φαρµακευτικών σκευασµάτων, είναι η χολινεργική υπόθεση (Francis et al., 1999) η οποία προτείνει ότι η νόσος προκαλείται λόγω της µειωµένης σύνθεσης του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη. Η χολινεργική υπόθεση δεν είναι ευρέως αποδεκτή, κυρίως λόγω του γεγονότος ότι η φαρµακευτική αγωγή που χρησιµοποιείται προκειµένου να αντιµετωπιστεί η ανεπάρκεια της ακετυλοχολίνης δεν είναι ιδιαίτερα αποτελεσµατική (reviewed in Lynn et al., 2010). Το 1991, προτάθηκε η υπόθεση του αµυλοειδούς σύµφωνα µε την οποία η εναπόθεση του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (amyloid beta Aβ) στο λιµπικό σύστηµα και στις σχετιζόµενες δοµές, όπου σχηµατίζει άµορφες και αδιάλυτες εξωκυττάριες πλάκες είναι η κύρια αιτία της ασθένειας (Glenner et al., 1984; Hardy and Allsop, 1991; Iwatsubo et al., 1994; Mudher and Lovestone 2002). Σύµφωνα µε τη συγκεκριµένη υπόθεση, οι β-αµυλοειδείς πλάκες σχετίζονται µε δυστροφικούς νευρίτες, ενεργοποιηµένα αστροκύτταρα και µικρογλοία προκαλώντας µια σειρά από φλεγµονώδεις καταστάσεις όπως µικρογλοίωση, αστροκύττωση, ενεργοποίηση των συστατικών του συµπληρώµατος, αυξηµένη παραγωγή κυτοκινών και πρωτεϊνών οξείας φάσης όπως, επίσης, και συσσώρευση ελευθέρων ριζών (Mudher and Lovestone 2002; Wenk, 2003; Su et al., 2008). Υποστηρικτικό στοιχείο της υπόθεσης του αµυλοειδούς αποτελεί η θέση του γονιδίου για την πρόδροµη µορφή του β- αµυλοειδούς πεπτιδίου (Amyloid beta Precursor Protein APP) στο χρωµόσωµα 21 (γενετική θέση 21q21.2) σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι άτοµα µε τρισωµία 21 (Σύνδροµο Down) τα οποία διαθέτουν ένα επιπλέον αντίγραφο του συγκεκριµένου 16

γονιδίου έχουν ισχυρή προδιάθεση για τη νόσο Alzheimer και συνήθως εµφανίζουν την ασθένεια σε ηλικία περίπου 40 ετών (Lott and Head 2005; Nistor et al., 2007). Η πιο κοινή µορφή του β-αµυλοειδούς στον άνθρωπο είναι ένα πεπτίδιο 40 αµινοξέων, το οποίο ονοµάζεται Αβ40. Εκτός από τη µορφή Αβ40 έχει βρεθεί και ένα πεπτίδιο 42 αµινοξέων, το Αβ42, το οποίο έχει σχετισθεί επίσης µε τη νόσο Alzheimer. Η µόνη διαφορά µεταξύ των Αβ40 και Αβ42 είναι τα δύο επιπλέον αµινοξέα που διαθέτει το τελευταίο στο C-τελικό άκρο του (Bentahir et al., 2006). Το β-αµυλοειδές προκύπτει από την πρόδροµη µορφή του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (APP) ύστερα από την αποκοπή που υφίσταται από τις σεκρετάσες. Αρχικά, η α-σεκρετάση (µη νευροτοξική «κανονική» αποκοπή) ή η β-σεκρετάση (ενδεχόµενα νευροτοξική «µη κανονική» αποκοπή) αποκόπτουν την πρόδροµη µορφή του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (APP) και, στη συνέχεια, µία δεύτερη αποκοπή στο προϊόν της β-σεκρετάσης από την γ-σεκρετάση οδηγεί στην παραγωγή του β- αµυλοειδούς (Σχήµα Α.4) (Seubert et al., 1992; Shoji et al., 1995; Vassar et al., 1999; De Strooper, 2000; Cai et al., 2001; Schroeter et al., 2003). Ανάλογα µε το σηµείο που δρα η γ-σεκρετάση παράγονται δύο κύριες µορφές του β-αµυλοειδούς που αποτελούνται από 40 ή 42 αµινοξέα (µορφές Αβ40 και Αβ42, αντίστοιχα). Το ποσοστό του Αβ40 πεπτιδίου που παράγεται σε σχέση µε εκείνο του Αβ42 είναι ιδιαίτερα σηµαντικό για τη νόσο Alzheimer δεδοµένου ότι το πεπτίδιο Αβ42 έχει πολύ µεγαλύτερη τάση πολυµερισµού και σχηµατισµού ινιδίων από το περισσότερο άφθονο Αβ40 πεπτίδιο. Μάλιστα, αν και φαίνεται η παραγωγή των Αβ ισοµορφών να είναι µία κανονική διαδικασία, άγνωστης µέχρι στιγµής λειτουργικότητας, µία αύξηση του σχηµατισµού του Αβ42 πεπτιδίου, έστω και σε ένα µικρό ποσοστό, είναι ικανή να οδηγήσει στην πρώιµη µορφή της νόσου Alzheimer (Early-Onset Alzheimer Disease EOAD) (Goedert and Spillantini, 2006; Irvine et al., 2008). Μια άλλη υπόθεση αφορά το γονίδιο APOE, τον κύριο γενετικό παράγοντα κινδύνου για τη νόσο Alzheimer. Το συγκεκριµένο γονίδιο, το οποίο εδράζεται στο χρωµόσωµα 19 και συγκεκριµένα στη γενετική θέση 19q13.2, αποτελείται από 4 εξώνια και κωδικοποιεί την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Ε, µία γλυκοπρωτεΐνη 299 αµινοξέων και µοριακού βάρους 34.200 Da. Οι τρεις κοινές ισοµορφές της πρωτεΐνης, APOE2, APOE3 και APOE4, κωδικοποιούνται από τα τρία αλληλόµορφα 17

Σχήµα A.4. Επεξεργασία της πρόδροµης µορφής του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (APP) και σχηµατισµός του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου. Η APP είναι δυνατό να αποκοπεί από τρεις διαφορετικές σεκρετάσες: α, β και γ. Μετά την αποκοπή από τη β-σεκρετάση, η sappβ µορφή παράγεται και απελευθερώνεται στον εξωκυττάριο χώρο ενώ το πεπτίδιο 99 αµινοξέων του C-άκρου (C99) υφίσταται µη κανονική» αποκοπή από τη γ-σεκρετάση οδηγώντας στο σχηµατισµό του του β-αµυλοειδους πεπτιδίου (Αβ) και της διαµεµβρανικής περιοχής της πρόδροµης µορφής του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (APP intracellular domain AICD, TMD: transmembrane domain). Το µεγάλο βέλος παριστάνει τη απόθεση πλάκών β-αµυλοειδούς (Bekris et al., 2010). ενός γονιδίου, τα ε2, ε3 και ε4, αντίστοιχα. Από τους τρεις οµόζυγους (APOε2/2, APOε3/3 και APOε4/4) και τους τρεις ετερόζυγους (APOε3/2, APOε4/3 και APOε4/2) γονοτύπους που προκύπτουν στον άνθρωπο, ο γονότυπος APOε3/3 είναι ο πιο κοινός στον πληθυσµό - περίπου 50 µε 70% - και το ε3 αλληλόµορφο αποτελεί το 70 µε 80% του γενετικού συνόλου, ενώ τα ε4 και ε3 αλληλόµορφα της συγκεκριµένης γενετικής θέσης αποτελούν το 10 µε 15% και 5 µε 10%, αντίστοιχα (Mahley, 1988). Οι διαφορές στην αµινοξική ακολουθία των ισοµορφών της APOE έχουν σηµαντικές λειτουργικές επιπτώσεις. Η περισσότερο άφθονη ισοµορφή, η APOE3, περιέχει κυστεΐνη και αργινίνη στις αµινοξικές θέσεις 112 και 158, αντίστοιχα, σε αντίθεση µε την ισοµορφή APOE2 η οποία έχει µόνο κατάλοιπα κυστεΐνης και την ισοµορφή APOE4 που έχει µόνο κατάλοιπα αργινίνης στις αντίστοιχες αµινοξικές θέσεις (Σχήµα Α.5) (Weisgraber, 1994). Η αντικατάσταση κυστεΐνης - αργινίνης επηρεάζει την τριτοταγή διαµόρφωση των ισοµορφών της APOE, καθώς επίσης και την ικανότητα πρόσδεσης αυτών σε λιπίδια (Mahley et al., 2006). 18

Σχήµα A.5. οµή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης Ε (APOE) και αντίστοιχοι πολυµορφισµοί νουκλεοτιδίων (Single Nucleotide Polymorphisms SNP). Παρουσιάζονται οι δύο πολυµορφισµοί στο εξώνιο 4 και τα τρία αλληλόµορφα του γονιδίου APOE (ε2, ε3 και ε4) όπου στο ε2 υπάρχουν νουκλεοτίδια T T, στο ε3 νουκλεοτίδια T C και στο ε4 νουκλεοτίδια C C, αντίστοιχα (Bekris et al., 2010). Το αλληλόµορφο APOE4 αποτελεί τον κυριότερο γνωστό γενετικό παράγοντα προδιάθεσης για τη νόσο Alzheimer, ιδιαίτερα για την όψιµη (Late-Onset Alzheimer Disease LOAD), άποψη η οποία ενισχύεται από το γεγονός ότι το 65 µε 80% των ασθενών φέρουν το συγκεκριµένο γονίδιο (Corder et al., 1993; Saunders et al., 1993; Farrer et al., 1997). Η σηµασία του συγκεκριµένου αλληλόµορφου στην παθογένεια της νόσου Alzheimer σχετίζεται µε την υπόθεση του αµυλοειδούς δεδοµένου ότι έχει προταθεί ότι η APOE4 εντείνει την απόθεση του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (Αβ) ενισχύοντας έτσι το σχηµατισµό των εξωκυττάριων πλακών, οι οποίες αποτελούν χαρακτηριστικό της νόσου (Namba et al., 1991; Wisniewski and Frangione, 1992). Μια πιο πρόσφατη υπόθεση για την παθογένεια της νόσου Alzheimer, η οποία σχετίζεται µε λειτουργία του APOE4 αλληλοµόρφου είναι ότι το προϊόν αυτού του γονιδίου ενισχύει την υπερφωσφορυλίωση της τ-πρωτεΐνης (tau protein) (Huang, 2006). Οι τ-πρωτεΐνες είναι πρωτεΐνες οι οποίες συµµετέχουν στη σταθεροποίηση των µικροσωληνίσκων και είναι άφθονες στους νευρώνες του κεντρικού νευρικού συστήµατος (Fath et al., 2002) και αποτελούν προϊόν εναλλακτικού µατίσµατος ενός γονιδίου το οποίο στον άνθρωπο ορίζεται ως MAPT (Microtubule-Associated Protein Tau) (Lladó et al., 2007). Η υπερφωσφορυλίωσή τους, η οποία πραγµατοποιείται κυρίως από κινάσες που σχετίζονται µε τους µικροσωληνίσκους (Microtubule- 19

Affinity Regulating Kinases - MARKs) αλλά και από άλλες κινάσες, όπως η κινάση 3 της συνθετάσης του γλυκογόνου (Glycogen Synthase Kinase 3 - GSK3) και η εξαρτώµενη από κυκλίνες κινάση 5 (Cyclin-Dependent Kinase 5 - Cdk5), οδηγεί στην αποµάκρυνση τους από ρτους µικροσωληνίσκους, µε αποτέλεσµα αυτοί να αποσταθεροποιούνται και να οδηγούνται στο σχηµατισµό νευροϊνιδιακών ελικοειδών νηµατίων (Neurofibrillary tangles - NTFs) τα οποία αποτελούν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της νόσου Alzheimer (Goedert et al., 1991; Goedert, 1993). Σχήµα A.6. Υποθετικό µοντέλο των παθολογικής µεταβολών που λαµβάνουν χώρα κατά την εκδήλωση της νόσου Alzheimer (Forleza et al., 2010). A.3. Αυτοαντισώµατα Από τους βασικότερους µηχανισµούς άµυνας του ανθρώπινου οργανισµού είναι η παραγωγή αντισωµάτων προκειµένου να αντιµετωπισθούν παθογόνοι µικροοργανισµοί (π.χ. ιοί και βακτήρια). Τα αντισώµατα είναι µόρια πρωτεϊνικής φύσης, των οποίων η στερεοδιάταξη επιτρέπει τη πρόσδεσή τους στο αντιγόνο του παθογόνου µικροοργανισµού που ενεργοποίησε τα ειδικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος προκειµένου να παραχθούν τα αντισώµατα. Η 20

εξειδικευµένη πρόσδεση των αντισωµάτων στα αντίστοιχα αντιγόνα προκαλεί στη συνέχεια σειρά αντιδράσεων που ως στόχο έχουν την καταστροφή του αντιγόνου. Πολλές φορές, όµως, ένα υπερδραστήριο ανοσοποιητικό σύστηµα δηµιουργεί µεγάλο αριθµό αντισωµάτων που στρέφονται εναντίον ιστών και οργάνων του ίδιου του οργανισµού, αναγνωρίζοντας ως αντιγόνα τµήµατα ιστών και οργάνων. Αυτοαντισώµατα (Natural antibodies - Nabs) είναι τα αντισώµατα που παράγει το ανοσοποιητικό σύστηµα απέναντι σε πρωτεΐνες του ίδιου του οργανισµού. Η παραγωγή των συγκεκριµένων αντισωµάτων αποτελεί ένα απλό αλλά συνάµα αυστηρά ελεγχόµενο σύστηµα για τη ρύθµιση της οµοιόστασης των ιστών που στοχεύει στην αναγνώριση και αποµάκρυνση πρωτεϊνών που απελευθερώνονται από νεκρά ή λυµένα - για οποιοδήποτε λόγο - κύτταρα, ανενεργών πρωτεϊνών του πλάσµατος, καθώς επίσης και νεκρών, µη ενεργών και αποπτωτικών κυττάρων (Avrameas et al., 2007, Lutz, 2007). Σειρές µελετών έχουν δείξει την παρουσία αυτοαντισωµάτων στον άνθρωπο και σε άλλα ανώτερα σπονδυλωτά αλλά και σε µη συγγενικά εξελικτικά είδη, όπως οι καρχαρίες. Τα αντισώµατα αυτά έχουν την ικανότητα αναγνώρισης µεγάλης ποικιλίας αντιγόνων, τα οποία είναι είτε ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, είτε πρωτεΐνες που βρίσκονται στην κυτταρική επιφάνεια, είτε πρωτεΐνες του ορού του αίµατος. Αν και τα αντιγόνα αυτά δεν έχουν πλήρως ταυτοποιηθεί (Avrameas and Ternynck, 1993), ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ο συγκεκριµένος τύπος αντισωµάτων παρουσιάζει εξειδίκευση όσον αφορά ορισµένα ενδοκυτταρικά αντιγόνα αναγνώρισης, στερείται όµως εξειδίκευσης για τα «κλασσικά» ενδοκυτταρικά αντίγονα, όπως DNA, πυρηνικές πρωτεΐνες και πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού (Avrameas et al., 2007). Στον άνθρωπο, όπως επίσης στον ποντικό και τον αρουραίο, τα αντισώµατα αυτά είναι κυρίως των ισοτύπων IgM, IgG και IgΑ και είναι παρόντα όχι µόνο στο αίµα, αλλά επίσης και σε άλλα βιολογικά υγρά, όπως το µητρικό γάλα, το σάλιο και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Bouvet and Dighiero, 1998; Avrameas, 1991; Avrameas and Ternynck, 1993; 1995). Στον ορό του αίµατος υπάρχουν, συνήθως, υψηλοί τίτλοι αυτοαντισωµάτων IgM, σε αντίθεση µε το πλάσµα, ενώ οι τίτλοι των αυτοαντισωµάτων IgG και IgΑ είναι συνήθως χαµηλοί (Sigounas et al., 1994). Η παραγωγή των αυτοαντισωµάτων εξηγείται από δύο υπάρχουσες υποθέσεις. Η πρώτη υπόθεση περιλαµβάνει αλληλεπιδράσεις Τ και Β λεµφοκυττάρων (Huetz et al., 1988; Lymberi et al., 1989) και έχει δειχθεί ότι η αυτοανοσοβιολογική απόκριση 21

ρυθµίζεται από βοηθητικά T λεµφοκύτταρα (CD4) (Powrie and Mason, 1990). Η δεύτερη υπόθεση περιλαµβάνει αυτοαντιδρώντα Β λεµφοκύτταρα τα οποία εκτίθενται συνεχώς στα αυτοαντιγόνα µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των προαναφερόµενων και την παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων αυτοαντισωµάτων (Cooke et al., 1994; Cyster et al., 1994; Shokat and Goodnow, 1995). Μελέτες σε διαγονιδιακές κυτταρικές σειρές ποντικών αποδεικνύουν ότι τα αυτοαντιδρώντα Β λεµφοκύτταρα τα οποία παράγουν τα αυτοαντισώµατα δεν καταστρέφονται στο µυελό των οστών αλλά εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος και ενεργοποιούνται από αυτοαντιγόνα (Julien et al., 2002). Τα αυτοαντισώµατα έχει δειχθεί ότι συµµετέχουν σε αρκετές βιολογικές λειτουργίες οι οποίες, αρκετές φορές είναι αντιφατικές. Συνεισφέρουν στην άµυνα του οργανισµού εναντίων βακτηρίων, ιών και άλλων παθογόνων µικροοργανισµών (Reid et al., 1997; Ochsenbein et al., 1999; Ochsenbein and Zinkernagel, 2000), συνδέονται τόσο µε γηρασµένα ή τροποποιηµένα ενδοκυττάρια µόρια και κύτταρα όσο και µε καρκινικούς όγκους και συµµετέχουν στην αποµάκρυνσή τους (Ando et al., 1994) και λαµβάνουν µέρος στην αποπτωτική διαδικασία (Peng et al., 2005). Επιπλέον, έχουν την ικανότητα να ρυθµίζουν τη δράση των Β και Τ λεµφοκυττάρων, να συµµετέχουν στην ενεργοποίηση των κυτοκινών, όπως επίσης και να παρουσιάζουν τα αντιγόνα στα βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα συµµετέχοντας στην έναρξη της αυτοανοσοβιολογικής απόκρισης (Baker and Ehrenstein, 2002; Bruley- Rosset et al., 2003; Marchalonis et al., 2005). Σε παθολογικές καταστάσεις, στις οποίες το ανοσοβιολογικό σύστηµα δεν έχει υποστεί βλάβη µπορούν να σηµειωθούν µικρές αλλαγές στα επίπεδα των αυτοαντισωµάτων. Όµως, οι τίτλοι των ισοτύπων των αυτοαντισωµάτων παρουσιάζονται αλλαγµένοι σε πολλές µη ανοσοπαθολογικές καταστάσεις, όπως τη χρόνια ηπατίτιδα, τον καρκίνο του µαστού, τη σχιζοφρένια, τη νόσο Alzheimer, τον αυτισµό, την κατάθλιψη και την επιληψία (Avrameas and Ternynck, 1993; Poletaev et al., 2000). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι υψηλοί τίτλοι των αυτοαντισωµάτων στους ασθενείς που πάσχουν από αυτοάνοσα νοσήµατα όπως η αυτοάνοση αιµολυτική αναιµία, οι αυτοάνοσες παθολογικές καταστάσεις του ενδοκρινικού συστήµατος και η ρευµατοειδής αρθρίτιδα καθώς και η σύνδεση αυτών µε τις παθολογικές καταστάσεις που προκύπτουν (Avrameas et al., 2007, Zelenay et al., 2007). 22

A.3.1. Αυτοαντισώµατα στη νόσο Alzheimer Αυξανόµενες ενδείξεις στηρίζουν την άποψη ότι η αυτοάνοση αντίδραση συµµετέχει στην νευροπαθολογία της νόσου Alzheimer. Υψηλός τίτλος ειδικών αυτοαντισωµάτων για διακριτά αντιγόνα τόσο του εγκεφάλου και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού όσο και εναντίον µη εγκεφαλικών αντιγόνων - τα οποία ανιχνεύονται και σε υγιείς ηλικιωµένους - στους ασθενείς µε Alzheimer ενισχύουν την προαναφερόµενη άποψη (Kumar et al., 1988; Singh and Fudenberg, 1989; Loeffler et al., 1997; Singh, 1997). Οι διάφορες κατηγορίες αυτοαντισωµάτων που έχουν ταυτοποιηθεί µέχρι στιγµής είναι δυνατό να έχουν προστατευτικό ρόλο, όπως για παράδειγµα τα αυτοαντισώµατα για το β-αµυλοειδές, ή παθογενετικό, όπως εκείνα για το γαγγλιοσίδιο GM1 και τη συνθάση του ATP. Σε κάθε περίπτωση, όµως, τα αυτοαντισώµατα αποτελούν χρήσιµους δείκτες της νόσου, τόσο διαγνωστικούς όσο και προγνωστικούς (reviewed in Colasanti et al., 2010). Ιδιαίτερη σηµασία στη νευροπαθολογία της νόσου Alzheimer έχουν τα αυτοαντισώµατα που παράγονται εναντίον του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου. Γνωρίζουµε ότι το β-αµυλοειδές προκύπτει από την πρόδροµη µορφή του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου (APP) ύστερα από την αποκοπή που υφίσταται από τις σεκρετάσες. Όπως ήδη αναφέρθηκε, ανάλογα µε το σηµείο δρουν τα ένζυµα παράγονται δύο κύριες µορφές του β-αµυλοειδούς που αποτελούνται από 40 ή 42 αµινοξέα (µορφές Αβ40 και Αβ42, αντίστοιχα) οι οποίες πολυµερίζονται. Μεγάλες συγκεντρώσεις πολυµερών του β-αµυλοειδούς έχουν ανιχνευθεί στον εγκέφαλο ασθενών µε Alzheimer, όπου το µεγαλύτερο ποσοστό συµµετέχει στο σχηµατισµό ινιδίων β-αµυλοειδούς, τα οποία µε τη σειρά τους σχηµατίζουν τις πλάκες β-αµυλοειδούς. Έχουν επίσης ανιχνευθεί και µικρές συγκεντρώσεις διαλυτών µονοµερών και ολιγοµερών του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου. Από τις προαναφερόµενες µορφές του β-αµυλοειδούς, τα ολιγοµερή εµφανίζονται ως περισσότερο νευροτοξικά, οδηγώντας στην καταστροφή και κατ επέκταση στο θάνατο των νευρώνων στον εγκέφαλο των ασθενών (Selkoe, 2000; Hardy, 2006). Αντισώµατα, τα οποία προκύπτουν φυσιολογικά εναντίον του β-αµυλοειδούς είναι παρόντα στον ορό ασθενών µε Alzheimer όπως επίσης και σε υγιή άτοµα (Szabo et al., 2008). Παρά το γεγονός ότι η συγκεκριµένη κατηγορία αυτοαντισωµάτων έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τη συσσώρευση του β-αµυλοειδούς in 23

vitro, δεν είναι ακόµα σαφές εάν έχουν την ικανότητα να µειώσουν αποτελεσµατικά το σχηµατισµό πλακών β-αµυλοειδούς στον άνθρωπο (Kellner et al., 2009). Πιθανώς, τα αυτοαντισώµατα που προκύπτουν φυσιολογικά για το β-αµυλοειδές πεπτίδιο να σχετίζονται µε την οµοιόσταση του συγκεκριµένου πεπτιδίου στον οργανισµό. Η υδρόλυση αυτού, η οποία καταλύεται από τη σύνδεση του αυτοαντισώµατος στο β- αµυλοειδές, αποτελεί ένα νέο µηχανισµό που είναι δυνατό να επιτύχει την αποµάκρυνση µιας µεγάλης ποσότητας του β-αµυλοειδούς πεπτιδίου από τον οργανισµό (Taguchi et al., 2008). Ασθενείς µε Alzheimer παράγουν µεγάλες ποσότητες αυτοαντισωµάτων IgM που υδρολύουν το β-αµυλοειδές. Η συγκεκριµένη περιφερειακή αποµάκρυνση του β- αµυλοειδούς πεπτιδίου είναι δυνατό να ενισχύσει την απελευθέρωση β-αµυλοειδούς από το εγκεφαλικό απόθεµα. Μιας και το β-αµυλοειδές δεν εκπληρώνει καµία γνωστή λειτουργία στο περιφερειακό σύστηµα, τα προκύπτοντα αυτοαντισώµατα για το β-αµυλοειδές είναι πιθανό να αντιπροσωπεύουν έναν αµυντικό ανοσολογικό µηχανισµό. Λαµβάνοντας υπόψη τα πλεονεκτήµατα της καταλυτικής λειτουργίας, τα συγκεκριµένα αυτοαντισώµατα είναι κατάλληλα για περαιτέρω µελέτη στην ανάπτυξη ανοσοβιολογικών θεραπευτικών προσεγγίσεων την νόσου Alzheimer (Taguchi et al., 2008). Μία άλλη σηµαντική κατηγορία αυτοαντισωµάτων είναι εκείνα που παράγονται εναντίον της οξειδωµένης µορφής της λιποπρωτεΐνης χαµηλής πυκνότητας (Low Density Lipoprotein - LDL). Αυξανόµενες ενδείξεις συνηγορούν στο ότι ο λιπιδικός µεταβολισµός, το οξειδωτικό stress και οι φλεγµονώδεις αντιδράσεις συµµετέχουν στην παθογένεση της νόσου Alzheimer. Το β-αµυλοειδές πεπτίδιο σχετίζεται µε σωµατίδια λιποπρωτεϊνών τόσο στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό όσο και στο πλάσµα, εντείνοντας την οξείδωση πολλών βιοµορίων (Butterfield and Lauderback, 2002). Έχει δειχθεί ότι οι λιποπρωτεΐνες του εγκεφαλονωτιαίου υγρού σε ασθενείς µε Alzheimer είναι περισσότερο επιρρεπείς στην οξείδωση και κατ επέκταση στην πρόκληση νευροτοξικότητας (Bassett et al., 1999). Οι οξειδωµένες λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας (OxLDL) αποδείχθηκε ότι είναι ιδιαίτερα ανοσογενετικές προκαλώντας τη συστεµική παραγωγή αντισωµάτων µε σηµαντικές λειτουργικές συνέπειες (Binder et al., 2003). Η παρουσία αυτοαντισωµάτων που προσδένονται στις οξειδωµένες λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό των ασθενών µε νευροεκφυλιστική άνοια, όπως επίσης και σε άτοµα που πάσχουν από την ασθένεια 24