Τα επίπεδα του mrna πού είναι διαθέσιμα για την μετάφραση προσδιορίζονται Από την ταχύτητα σύνθεσης του μηνύματος κατά την πορεία της μεταγραφής Από την αποδοτικότητα της Μεταμεταγραφικής ωρίμανσης Από την ταχύτητα μεταφοράς του μηνύματος έξω από τον πυρήνα Από την ταχύτητα αποικοδόμησης στο κυτταρόπλασμα
Σήμερα πιστευεται ότι η παρουσία της αλυσίδας του Poly(A) στο mrna σχετίζεται αμεσα με την αποικοδόμηση του.μεταξύ των ενδείξεων που υποστηρίζουν την άποψη αυτή περιλαμβάνονται και οι παρακάτω Οι ακολουθίες του poly(a) του κυτταροπλασματικού mrna γίνονται προοδευτικά μικρότερες με τον χρόνο Το mrna το οποίο στερείται poly(a) έχει μικρότερη ημιζωή από ότι τα περισσότερα ευκαρυωτικά mrna Το αποαδενυλιωμένο mrna της γλοβίνης μεταφράζεται με μικρότερη ικανότητα από ότι το κανονικό mrna όταν γίνεται ένεση σε ωοκύτταρα του Xenopus αλλά όχι όταν προστίθεται σε συστήματα ελευθέρων κυττάρων σε μικρά χρονικά διαστήματα Έχει κατορθωθεί να αυξηθεί η σταθερότητα των διαφόρων μηνυμάτων όταν πολυαδενυλιώνονται In vitro Ελαττώνεται η σταθερότητα του μηνύματος του αδενοιού όταν παρεμποδίζεται η προσθήκη poly(a) με δεοξυαδενοσίνη
Το μέγεθος του poly(a) όμως φαίνεται ότι δεν είναι ο μοναδικός παράγων ο οποίος ελέγχει την σταθερότητα του RNA έτσι έχει βρεθεί ότι mrna τα οποία περιέχουν λίγο ή καθόλου poly(a) έχουν υψηλή σταθερότητα Η περιοχή του mrna που βρίσκεται κοντά στο σημείο σύνδεσης με το poly(a) φαίνεται να είναι μια περιοχή που είναι ευαίσθητη σε ριβονουκλεάση Οι πρωτεΐνες που συνδέονται στην περιοχή του poly (A) ή στην 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή και ιδιαίτερα οι διαμορφώσεις της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής εχουν καθοριστικό ρόλο στην σταθερότητα του μηνύματος RNA
Τα ευκαρυωτικά κυτταρικά mrna είναι καλυμμένα στο 5 άκρο από μία δομή πού έχει την μορφή m7g(5 )ppp(5 )ppp(5 )N)N (όπου( με Ν παριστάνεται τό κάθε νουκλεοτίδιο Ο ρόλος της δομής του καπέλου κατά την μετάφραση των μηνυμάτων σε In vitro συστήματα μετάφρασης υποστηρίχθηκε από δύο κύκλους πειραμάτων Καλυμμένα με καπέλο μηνύματα που απομονώνονται από ορισμένους ιούς ή από ορισμένα κύτταρα μεταφράζονται πολύ πιο αποδοτικά από τα μηνύματα εκείνα πού δεν φέρουν καπέλο Ανάλογα του καπέλου όπως m7gmp ή m7gdp αναστέλλουν ειδικά την μετάφραση των καλυμμένων μηνυμάτων ελαττώνοντας την δέσμευση της 40S ριβοσωμικής υπομονάδος στο mrna
Παρά την σημασία του καπέλου κατά την μετάφραση η αναγκαιότητα του φαίνεται να μην είναι ούτε απόλυτη ούτε για όλους τους οργανισμούς.γεγονός που δημιουργεί δύο ερωτήματα Ποιοι είναι οι παράγοντες εκείνοι οι οποίοι επηρεάζουν τον βαθμό στο οποίο ένα μήνυμα εξαρτάται από την δομή του καπέλου και πώς η αναγκαιότητα αυτή διαπλέκεται με την ρύθμιση της μετάφρασης Πώς ένα μήνυμα RNA πού στην φυσική του κατάσταση είναι μη καλυμμένο ξεπερνά την αναγκαιότητα της παρουσίας του καπέλου της μετάφρασης
Μέθοδος για τον προσδιορισμό των πρωτεινών πού δεσμεύονται στο καπέλο όπως αναπτύχθηκε από τους Sonenberg και Shatkin Συντίθεται mrna in vivo παρουσία τριτιωμένης στο μεθύλιο S-αδενοσυλομεθειονίνη για να ραδιοσημανθεί ειδικά το m7g τμήμα του καπέλου Η 2,3 cis διόλη της ριβόζης του m7g οξειδώνεται για να δώσει μια δραστική διαλδευδη Οι βάσεις του schiff που σχηματίζονται μεταξύ οξειδωμένου καπέλου και ελευθέρων αμινομάδων σταθεροποιούνται με αναγωγή με NaBH3CN Το μήνυμα αποικοδομείται Το σύμπλεγμα των πρωτεινών που δεσμεύεται στο καπέλο αναλύεται με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και φλουρογραφία
Για τον προσδιορισμό των πρωτεινών που δεσμεύονται στο καπέλο με την μέθοδο της χρωματογραφίας συγγενείας ακολουθεί η παρακάτω πορεία Ανάλογα του καπέλου δεσμεύονται σε αδρανές υλικό Στο υλικό χρωματογραφούνται οι πρωτεϊνες οι οποίες ελαμβάνοντο από μη κλασματωμένο εκχύλισμα παραγόντων έναρξης Οι πρωτεϊνες πού προσδένονται στην στήλη εκλύονται καί αναλύονται με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων
Η άποψη οτι η μόνη από τις πρωτεϊνες πού αναγνωρίζει συγκεκριμένη θέση είναι η 24K ενώ οι άλλες eif-4a και eif-4b δεσμεύονται με ένα δευτερογενή τρόπο πού είναι συνέπεια της αρχικής αλληλεπίδρασης της 24Κ CBP υποστηρίζεται από διάφορες ενδείξεις Η μόνη από τις πρωτεΐνες πού δεσμεύονται απ ευθείας στο καπέλο και η οποία μπορεί να καθαρισθεί σε εξατομικευμένη οντότητα με χρωματογραφία συγγενείας eif-4b σε υπόστρωμα με m7gdp είναι η 24Κ Τα συμπλέγματα υψηλού μοριακού βάρους πού δεσμεύονται στο καπέλο σχεδόν όλα περιέχουν την 24Κ Οι eif-4a και eif-4b δεν μπορούν να διασυνδεθούν με το mrna μόνες τους ή σε συνδυασμό παρά μόνο όταν αναμιχθούν με την 24Κ Παράγωγο φωτοσυγγενείας ανάλογα του καπέλου δεν μπορούν να σημάνουν ούτε τον eif-4a ούτε eif-4b αλλά μπορούν και σημαίνουν τον 24Κ
Η 3-UTR συνιστά σήμερα καθοριστικό στοιχείο για την ρύθμιση της μεταφραστικής ικανότητος σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια.πλήθος πρωτεινικών μορίων που προσδενονται στην περιοχή επηρεάζουν ουσιαστικά την μετάφραση Φαίνεται οτι στην UTR υπάρχει η πληροφορία για το πότε θα παραχθεί η πρωτείνη που κωδικοποιείται στην κωδογόνο περιοχή σε πόση ποσότητα και σε ποιά περιοχή του κυτταροπλάσματος
Η 3-UTR φαίνεται να εηρεάζει την πρωτεινοσύνθεση με ενα η περισσότερους από τους παρακάτω τρόπους Την προσθήκη η αποικοδόμηση του Poly(A) στο 3- ακρο Την μετατροπή του μηνύματος σε RNP (μεταφραστικά ανενεργό σωμάτιο) Την μεταφορά καί μετάφραση πολλών mrna σε καθωρισμένες περιοχές του κυτταροπλάσματος Τον χρονο ημιζωής των μηνυμάτων στο κυτταρόπλασμα Την δευτεροταγή δομή του μηνύματος στο 5-ακρο και την συγγένεια του 5-ακρου του μηνύματος με τους ειδικούς παράγοντες εναρξης της μετάφρασης