7-1 Κεφάλαιο 7 Το δίπλωµα των πρωτεϊνών Μοριακοί ακόλουθοι Ανωµαλίες στο δίπλωµα Ασθένειες 7.1. Το δίπλωµα των πρωτεϊνών 7.1.1. Εισαγωγή Η πλειονότητα των πρωτεϊνών διπλώνει σε µία µοναδική τρισδιάστατη δοµή βιολογικά ενεργή παρ ότι οι πρωτείνες συντίθενται στο ριβόσωµα σαν γραµµικές αλυσίδες αµινοξέων. Έτσι κάθε νεοσυντιθέµενη αλυσίδα πρέπει να βρει το µονοπάτι του διπλώµατος που θα την οδηγήσει στην µοναδική ενεργή στερεοδοµή. Η κατανόηση αυτής της διεργασίας απασχολεί τους επιστήµονες επί δεκαετίες. Η επίλυση αυτού του προβλήµατος θα αποκαλύψει τον συνδετικό κρίκο στην ροή της πληροφορίας µεταξύ της νουκλεοτιδικής ακολουθίας και της τρισδιάστατης δοµής της πρωτεΐνης. Επίσης θα έχει σηµαντικές επιπτώσεις στην βελτίωση των αλγορίθµων πρόβλεψης δοµής και στον λογικό σχεδιασµό ακολουθιών που δεν µπορούν να προβλεφθούν εξελικτικά. Σε αντιδιαστολή, απλοί υπολογισµοί σε µία πρωτεΐνη 100 αµινοξέων θα χρειαστούν δισεκατοµµύρια χρόνια για να καταλήξουν στην ενεργή στερεοδοµή εάν ερευνηθούν όλες οι δυνατές στερεοδοµές. Αυτές οι παρατηρήσεις οδήγησαν στην άποψη ότι θα πρέπει να υπάρχει ένα συγκεκριµένο µονοπάτι για το δίπλωµα µιας πρωτεϊνικής αλυσίδας και είναι αναγκαίο να κατανοήσουµε πως η πρωτεΐνη βρίσκει το σωστό µονοπάτι και αποφεύγει τα άλλα. Επίσης πρέπει να κατανοήσουµε τις ενδιάµεσες καταστάσεις µερικού διπλώµατος, εάν µπορούν να εντοπιστούν και µελετηθούν, επειδή αυτές µπορούν να δώσουν σηµαντικές απαντήσεις για τα ενδιάµεσα στάδια προς την ενεργή κατάσταση. Έχουν προκύψει διαφορετικές µεθοδολογίες διπλώµατος που συνδυάζουν πειραµατικές και θεωρητικές προσεγγίσεις (εικ.7.1).
7-2 Εικόνα 7.1. Παλαιά µοντέλα µηχανισµού διπλώµατος. Τα αρχικά πειράµατα του Anfinsen απέδειξαν ότι οι πρωτείνες διπλώνουν στιγµιαία και αντιστρεπτά στην φυσική τους στερεοδοµή. Το µοντέλο της αύξησης του πυρήνα προτείνει ότι κατάλοιπα διαδοχικά στην ακολουθία φτιάχνουν ένα πυρήνα από όπου η φυσική στερεοδοµή αναπτύσσεται διαδοχικά. Αντίθετα το σκελετικό µοντέλο προτείνει ότι τοπικά στοιχεία δευτεροταγούς δοµής σχηµατίζονται πρώτα και αυτά πλησιάζουν και συνδυάζονται στην φυσική στερεοδοµή της πρωτεΐνης πιθανά µε ένα µηχανισµό διάχυσης-σύγκρουσης. Στο µοντέλο υδρόφοβης κατάρρευσης η πρωτεΐνη κρύβει τις υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες από τον διαλύτη, φτιάχνοντας µία ενδιάµεση κατάσταση ή εύπλαστη σφαίρα (molten globule) από όπου διαµορφώνεται η φυσική κατάσταση από αυτή την περιορισµένη στερεοδοµικά κατάσταση. Τέλος το παλλόµενο µοντέλο προτείνει ότι κάθε πρωτεϊνικό µόριο ακολουθεί διαφορετικό µονοπάτι διπλώµατος. Τώρα είναι πλέον φανερό ότι δεν υπάρχει ένας απόλυτα καθορισµένος τρόπος διπλώµατος όπως προτείνουν ορισµένα από τα αρχικά µοντέλα. 7.1.2. Νέες απόψεις για το δίπλωµα µε ή χωρίς ενδιάµεσες καταστάσεις. Σηµαντική πρόοδος έχει γίνει στην διερεύνηση των µηχανισµών διπλώµατος των πρωτεϊνών από τα αρχικά µοντέλα. Αυτή έχει προκύψει από πολλά νέα πειραµατικά δεδοµένα συνδυασµένα µε θεωρητική µεθοδολογία. Το κλειδί είναι ο συνδυασµός των αποτελεσµάτων διαφορετικών τεχνικών και την δηµιουργία µιας συνδυαστικής εικόνας της διεργασίας του διπλώµατος. Πειραµατικές µέθοδοι όπως ο φθορισµός και κυκλικός διχρωϊσµός προσφέρουν πληροφορίες για την έκταση σχηµατισµού δευτεροταγών και τριτοταγών δοµών αντίστοιχα. Συνδυαζόµενοι δε µε τεχνικές ελεγχόµενης ροής (stopped-flow) δίνουν την δυνατότητα µελέτης στην κλίµατα χιλιοστών του δευτερολέπτου.
7-3 Εικόνα 7.2. Σχηµατικό διάγραµµα της ενεργειακής επιφάνειας διπλώµατος. Αποδοµηµένα µόρια βρίσκονται στο χείλος του ενεργειακού κώνου και µπορούν να διπλώσουν στην φυσική κατάσταση µε πολλούς διαφορετικούς τρόπους µερικούς από τους οποίους περιέχουν ενδιάµεσες καταστάσεις (τοπικά ενεργειακά ελάχιστα) ενώ άλλοι περιέχουν µη αντιστρέψιµες καταστάσεις (καταστάσεις µη σωστού διπλώµατος). Για πρωτείνες που διπλώνουν χωρίς ενδιάµεσες καταστάσεις η επιφάνεια του ενεργειακού κώνου θα είναι λεία. Ίσως η µεγαλύτερη ανακάλυψη στην κατανόηση του διπλώµατος σήµερα είναι ότι δεν υπάρχει ένα µοναδικό διπλώµατος όπως υποστηρίζονταν από τα παλαιά µοντέλα. Μία πολυδιάστατη ενεργειακή επιφάνεια περιγράφει καλλίτερα την διαδικασία διπλώµατος (Εικ.7.2). Έτσι υπάρχει µία πληθώρα µονοπατιών προς την φυσική κατάσταση και το ποια από αυτά θα προτιµούνται εξαρτάται από τις λεπτοµέρειες του συστήµατος που µελετάται (π.χ. αµινοξική ακολουθία, τοπολογία, πειραµατικές συνθήκες). ιαφορετικά µονοπάτια θα προτιµώνται σαν αποτέλεσµα µικρών τροποποιήσεων στο κοινό ενεργειακό σχήµα. Ένα καλό σηµείο αφετηρίας για την µελέτη του διπλώµατος είναι η επιλογή µικρών πρωτεϊνών µε λιγότερο από 100 αµινοξέα. Η πρώτη πρωτείνη που µελετήθηκε διεξοδικά ήταν ο αναστολέας της χυµοτρυψίνης 2 (CI2). Αυτή η απλή πρωτείνη µε 64 αµινοξέα διπλώνει χωρίς ενδιάµεσες καταστάσεις σε µία µετάπτωση δύο φάσεων. Αυτό συµβαίνει και µε τις περισσότερες µικρές πρωτείνες. Αντίθετα µεγαλύτερες πρωτείνες διπλώνουν µε µεταπτώσεις τριών φάσεων µε ενδιάµεσες καταστάσεις. Αυτές οι ενδιάµεσες καταστάσεις µπορεί να περιέχουν δοµηµένες ενότητες ή υποενότητες που αντιστοιχούν στην φυσική κατάσταση. Σε αυτές τις περιπτώσεις ο βασικός περιορισµός είναι η επανοργάνωση των δοµικών στοιχείων στην κατάσταση κατάρρευσης ή το δίπλωµα αδόµητων περιοχών σε πρωτείνες πολλών ενοτήτων (Εικ.7.3).
7-4 Εικόνα 7.3. Οι µικρές πρωτείνες διπλώνουν σε δύο φάσεις. (α) που ενσωµατώνουν την συνδηµιουργία όλων των αλληλεπιδράσεων της φυσικής κατάστασης.(β) Την κατάρρευση σε µία εύπλαστη σφαίρα και κατόπιν την αναδιάταξη των διπλωµένων περιοχών. (γ) Την δηµιουργία της πρώτης διπλωµένης ενότητας και κατόπιν της υπόλοιπης δοµής. Στο δίπλωµα δύο φάσεων σταθερές ενδιάµεσες καταστάσεις δεν είναι προαπαιτούµενες για το δίπλωµα αλλά καταστάσεις υψηλής ενέργειας δεν µπορούν να αποκλειστούν. Ο ρόλος των ενδιάµεσων καταστάσεων στο δίπλωµα των πρωτεϊνών είναι ένα σηµείο αντίρρησης. Σε µερικές περιπτώσεις εµφανίζονται σαν σηµαντικές ενδιάµεσες καταστάσεις για την δηµιουργία του διπλώµατος ενώ σε άλλες περιπτώσεις προκύπτουν από µη εξειδικευµένες συσπειρώσεις της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στην τελευταία περίπτωση παρ ότι δεν µας υποδεικνύουν την διαφορά µεταξύ της αποδοµηµένης ή δοµηµένης κατάστασης είναι σηµαντικές για την διαµόρφωση της ενεργειακής επιφάνειας διπλώµατος και πιθανόν να είναι καταστάσεις υποστρωµάτων µοριακών ακολούθων ή προαγωγοί αποδόµησης. 7.1.3. Η σηµασία της τοπολογίας του µορίου. Πρόσφατα µεγάλο ενδιαφέρον δόθηκε στην παρατήρηση ότι οι ρυθµοί διπλώµατος και οι µηχανισµοί µικρών πρωτεϊνών δεν καθορίζονται από τις λεπτοµέρειες της αµινοξικής ακολουθίας αλλά από γενικότερα χαρακτηριστικά της πολυπεπτιδικής αλυσίδας την τοπολογία της. Αυτό προκύπτει από την παρατήρηση ότι ο ρυθµός διπλώµατος συσχετίζεται άµεσα µε µία παράµετρο τον βαθµό επαφής που αντικατοπτρίζει την απόσταση στην γραµµική ακολουθία αµινοξέων που βρίσκονται σε επαφή στην φυσική κατάσταση. Αυτή η συσχέτιση είναι βασική και σηµαίνει ότι απλά µοντέλα βασισµένα στη δοµή της φυσικής κατάστασης µπορούν να περιγράψουν την διεργασία διπλώµατος. Επίσης εξηγεί γιατί προσοµοιώσεις πλέγµατος µπορούν να προσφέρουν µια κατανόηση του διπλώµατος παρά την απλούστευση τους και την παρατήρηση ότι η δοµή του συνόλου των καταστάσεων µετάπτωσης συντηρείται σε πρωτείνες µιας δοµικής οικογένειας παρ ότι µπορούν να έχουν µη οµόλογες ακολουθίες.
7-5 Πολλά µοντέλα έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα που κάνουν επιτυχή πρόβλεψη των ρυθµών διπλώµατος και του µηχανισµού διπλώµατος πρωτεϊνών. Η επιτυχία τους αποδεικνύει ότι οι αλληλεπιδράσεις εκτός της φυσικής κατάστασης είναι σχετικά µη σηµαντικές στον καθορισµό του διπλώµατος, τουλάχιστον για µικρές πρωτείνες που διπλώνουν σε µεταπτώσεις δύο φάσεων. Ο στόχος είναι να βελτιωθεί η ακρίβεια αυτών των µοντέλων ώστε η διεργασία διπλώµατος να περιγραφεί καλλίτερα και περισσότερο πολύπλοκες πρωτείνες να προβλεφθούν. Στο µέλλον πιθανόν να υπάρχουν µοντέλα που θα προβλέπουν πρωτεϊνικές δοµές από την αρχή. 7.1.4. Το δίπλωµα στο κύτταρο. Το πεδίο του διπλώµατος των πρωτεϊνών άλλαξε δραµατικά τα τελευταία 25 χρόνια και περιλαµβάνει θεµατικές ενότητες που επεκτείνονται πέρα από τις αρχικές βιοφυσικές έρευνες του στιγµιαίου διπλώµατος in vitro. Από την δεκαετία του 1980 είναι ήδη γνωστό ότι µερικές πρωτείνες χρειάζονται βοήθεια για να διπλώσουν στο κύτταρο και αυτή δίνεται από άλλες πρωτείνες βοηθούς γνωστές ως µοριακοί ακόλουθοι. Αυτό βέβαια δεν σηµαίνει ότι η αρχική παρατήρηση του Anfinsen ότι το δίπλωµα των πρωτεϊνών είναι αυθόρµητο είναι λανθασµένη αλλά του ότι στο κυτταρικό περιβάλλον το αυθόρµητο δίπλωµα χρειάζεται βοήθεια. Γιατί όµως το δίπλωµα in vivo είναι τόσο δύσκολο;. Κατ αρχήν βιοσύνθεση και δίπλωµα είναι στενά συνδεδεµένα και η νεοπαραγόµενη πολυπεπτιδική αλυσίδα µπορεί να διπλώνει πριν να ολοκληρωθεί η βιοσύνθεση. Ο ρυθµός διπλώµατος µιας τυπικής πρωτείνης ( t 1/2 = 1 sec ) είναι πολύ µεγαλύτερος από τον ρυθµό βιοσύνθεσης (4-20 αµινοξέα/sec). Μόλις αρκετά αµινοξέα εξέχουν από το ριβόσωµα αυτά θα διπλώσουν στο χαµηλότερο διαθέσιµο ενεργειακό ελάχιστο για αυτό το µήκος της αλυσίδας. Για κοντές ακολουθίες αυτό να σηµαίνει στοιχεία δευτεροταγούς δοµής αλλά για µακρύτερες η απουσία της ολοκληρωµένης ακολουθίας θα οδηγούσε σε µη κανονικές στερεοδοµές. Σε µερικές περιπτώσεις ολόκληρη η δοµική ενότητα διπλώνει ταυτόχρονα µε την βιοσύνθεση της. Στην περίπτωση µιας πρωτείνης όµως µε πολλές δοµικές ενότητες η απουσία µιας γειτονικής δοµικής ενότητας θα µπορούσε να προβάλει στον διαλύτη µία υδρόφοβη επιφάνεια ειδικότερα στο πολύ πυκνό περιβάλλον του πολυσώµατος. Η µεταγραφή και η µετάφραση βασίζονται σε ενεργειακά εξαρτώµενους µηχανισµούς για την αποφυγή λαθών. Η χρήση των µοριακών ακολούθων ως µηχανισµοί διόρθωσης έχουν αναγνωριστεί πολύ πρόσφατα. Εκτός από µικρά πολυπεπτίδια οι περισσότερες πρωτείνες διπλώνουν δια µέσου συµπαγών σφαιρικών καταστάσεων γνωστές ως εύπλαστες σφαίρες (molten globules) που µπορεί να περιέχουν φυσιολογικά στοιχεία δευτεροταγούς δοµής αλλά δεν έχουν την στερεοδοµή που χαρακτηρίζει την φυσιολογική κατάσταση. Αυτά τα µη-φυσιολογικά πολυπεπτίδια εκθέτουν τα υδρόφοβα αµινοξικά κατάλοιπα (συνήθως στο εσωτερικό στη φυσιολογική κατάσταση) και έχουν την τάση να δηµιουργούν συσσωµατώµατα. Αυτή η κατάσταση θα είναι πιο έντονη in vivo µε τις υψηλές συγκεντρώσεις αδόµητων
7-6 πολυπεπτιδίων που προκύπτουν από την µετάφραση στα ριβοσώµατα και την υψηλή περιεκτικότητα µακροµορίων στο κυτόπλασµα που αυξάνει τις σταθερές σύνδεσης αδόµητων πολυπεπτιδίων σε σχέση µε αυτές στο διάλυµα in vitro. Η δυσκολία διπλώµατος µέσα στο κύτταρο δεν συνδέεται µόνον µε την βιοσυνθετική διεργασία. Σε συγκεντρώσεις της τάξης µεγέθους [~300 (g πρωτείνης) l -1 ] στο κυτταρόπλασµα η θερµοδυναµική σταθερότητα µερικώς διπλωµένων καταστάσεων αυξάνεται 10-100 φορές µε αποτέλεσµα την αύξηση της πιθανότητας δηµιουργίας συσσωµατωµάτων κατά την διάρκεια του διπλώµατος.
7-7 7.2. Μοριακοί ακόλουθοι 7.2.1. Εισαγωγή στις µοριακές ακολούθους. Οι σωτήρες του σωστού διπλώµατος στο κύτταρο είναι οι µοριακοί ακόλουθοι. Αυτές οι πρωτείνες βοηθούν την διαδικασία διπλώµατος in vivo παίρνοντας µέρος στην βιοσυνθετική διαδικασία και δεσµεύοντας µόρια σε καταστάσεις ανώµαλου διπλώµατος στο κυτταρόπλασµα µετά την µετάφραση και δίνοντας σε αυτές νέες ευκαιρίες διπλώµατος. Είναι επίσης σηµαντικές στην προστασία από την δηµιουργία συσσωµατωµάτων σε καταστάσεις ακραίων συνθηκών θερµότητας ή ψύχους και συµµετέχουν σε πολλές κυτταρικές διεργασίες όπως µετάδοση σήµατος, δηµιουργία στόχων και αποδόµηση πρωτεϊνών. Οι µοριακοί ακόλουθοι εµποδίζουν την δηµιουργία πρωτεϊνικών συσσωµατωµάτων δεσµευµένες σε έκθετα υδρόφοβα αµινοξέα µή φυσιολογικά ή τελείως µη διπλωµένων πολυπεπτιδίων. Με αυτό τον τρόπο τα πολυπεπτίδια µπορούν να συντηρηθούν σε µία κατάσταση ετοιµότητας για δίπλωµα. Αποτελεσµατικό δίπλωµα τότε επιτυγχάνεται µε κύκλους ελεγχόµενης πρόσδεσης και αποχωρισµού του πολυπεπτιδίου από µία άλλη µοριακή ακόλουθο. Έτσι οι µοριακοί ακόλουθοι προσφέρουν ένα ασφαλές περιβάλλον όπου η γραµµική ακολουθία αµινοξέων θα πάρει την φυσική στερεοδοµή της χωρίς όµως να προσφέρουν στερικές αλληλεπιδράσεις που θα επηρεάσουν ή κατευθύνουν το δίπλωµα. Επίσης οι µοριακοί ακόλουθοι εµποδίζουν την δηµιουργία συσσωµατωµάτων σε περιπτώσεις αποδιάταξης πρωτεϊνών εξ αιτίας της έκθεσης των κυττάρων σε ακραίες συνθήκες όπως υψηλή ή χαµηλή θερµοκρασία. Έχει επίσης προταθεί ότι ορισµένες µοριακοί ακόλουθοι να επαναδιατάσουν λάθος διπλωµένα πολυπεπτίδια επαναφέροντας τα στο µονοπάτι που οδηγεί στην φυσιολογική στερεοδοµή. Εικ. 7.4. Σχηµατικό διάγραµµα απ αρχής διπλώµατος στο κυτταρόπλασµα ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών κυττάρων. (α) ίπλωµα που δεν εξαρτάται από τις hsp70 ή hsp60. (β) ίπλωµα που υποβοηθείται από την hsp70 ή ενεργοποιείται από κάποιον άλλο παράγοντα (TF). (γ) ίπλωµα που υποβοηθείται και από την hsp70 ή TF και από την hsp60. Το διάγραµµα δίνει τα κοινά στοιχεία µεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων για το δίπλωµα µε την βοήθεια µοριακών ακολούθων παρότι σε αυτά υπάρχουν και διαφορές.
7-8 Η πρώτη µοριακή ακόλουθος που αναγνωρίστηκε ήταν η νουκλεοπλασµίνη, πρωτείνη που συµµετέχει στην συγκρότηση του νουκλεοσώµατος. Σήµερα στις µοριακές ακολούθους συµπεριλαµβάνονται περίπου 20 οικογένειες διαφορετικών µοριακών βαρών, δοµών, βιολογικών ρόλων και κυτταρικού εντοπισµού. Την τελευταία δεκαετία ένας τεράστιος όγκος πληροφοριών έχει προκύψει για τις µοριακές ακολούθους. Η περισσότερη όµως γνώση υπάρχει για τις οικογένειες hsp70 και hsp60. 7.2.2. Μοριακοί ακόλουθοι Hsp70 και Hsp60. Μέχρι σήµερα µια διεξοδική ανάλυση των δοµικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών για τα δύο συστήµατα µοριακών ακολούθων. Η hsp70 έχει ένα ευρύ φάσµα βιολογικών δράσεων µία εκ των οποίων είναι να προσδένεται σε κοντές υδρόφοβες ακολουθίες (περίπου επτά αµινοξέα) όπως αναδύονται από το ριβόσωµα ενώ αγνοεί διπλωµένα πολυπεπτίδια. Έτσι αυτές οι πρωτείνες εµποδίζουν την συσσωµάτωση νεοσυντιθεµένων αλυσίδων κατά την διάρκεια πρωτεϊνικής βιοσύνθεσης (εικ.7.4). Η δέσµευση και η απελευθέρωση των ξεδιπλωµένων πεπτιδίων είναι εξαρτηµένη από ATP και ρυθµίζεται από διάφορες µοριακές ακολούθους συντρόφους όπως τα µέλη της οικογένειας Hsp40 (DnaJ) (εικ.7.5 α, εικ7.7). Εικόνα 7.5. Μοντέλα που αναπαριστούν τους βασικούς µηχανισµούς των Hsp70 και Hsp60 µοριακών ακολούθων στο δίπλωµα των πρωτείνών. (α) Ο µηχανισµός του συστήµατος Hsp70 της Escherichia coli µε την DnaK (Hsp70), DnaJ and GrpE. (β) Ο µηχανισµός του συστήµατος της Escherichia coli GroEL GroES. Αντίθετα οι Ηsp60 συµµετέχουν αργότερα στο δίπλωµα, όταν η βιοσύνθεση έχει ολοκληρωθεί. Αυτές οι µοριακοί ακόλουθοι αποτελούνται από δύο υποµονάδες σχήµατος δακτυλίου σχηµατίζοντας µία κεντρική κοιλότητα, τον κλωβό του διπλώµατος. Στην περίπτωση της Escherichia coli µοριακής ακολούθου GroEL η κεντρική κοιλότητα καλύπτεται µε την πρόσδεση µιας δεύτερης µοριακής ακολούθου που λέγεται GroES (εικ 5 β, εικ.6). Εικόνα 7.6
7-9 Οι µοριακοί ακόλουθοι προσφέρουν µία κεντρική κοιλότητα όπου µία πολυπεπτιδική αλυσίδα διπλώνει αποφεύγοντας την συσσωµάτωση µε άλλες ξεδιπλωµένες πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Αυτός ο µηχανισµός έχει προσδιοριστεί για την GroEL, την µοριακή ακόλουθο της E. coli, και το συνένζυµο GroES. Το ξεδιπλωµένο πολυπεπτίδιο δεσµεύεται σε συµπαγή µορφή σε υδρόφοβες επιφάνειες στο εσωτερικό κυλινδρικό τοίχωµα της GroEL (εικ.7.5β). Η GroES, ένας επταµερής δακτύλιος µεγέθους ~10 kda προσδένεται µε ΑΤΡ στην GroEL κλείνοντας το άνοιγµα του κυλίνδρου και δηµιουργώντας ένα υδρόφιλο κλωβό όπου το ξεδιπλωµένο πολυπεπτίδιο απελευθερώνεται (εικ7.6, εικ7.8). Η δέσµευση του ΑΤΡ στον άλλο δακτύλιο της GroEL προκαλεί την απελευθέρωση της GroES ανοίγοντας τον κλωβό. Το διπλωµένο πολυπεπτίδιο διαφεύγει στο διάλυµα ενώ πολυπεπτίδια που δεν έχουν πλήρως διπλώσει µπορούν να επαναπροσδεθούν για άλλη µια προσπάθεια διπλώµατος. Ανώµαλα διπλωµένα πολυπεπτίδια µπορούν επίσης να προσδεθούν µε αποτέλεσµα την αναδίπλωση τους. Οι µοριακοί ακόλουθοι hsp70 και hsp60 συνεργάζονται in vivo σχηµατίζοντας ένα σύστηµα που αποµακρύνει την νεοσυντεθείσα αλυσίδα µέχρι το σηµείο που η δηµιουργία συσσωµατώµατος να µην είναι πλέον δυνατή. Εικόνα 7.7. Το µοντέλο του κύκλου αντίδρασης των DnaK, DnaJ και GrpE στο δίπλωµα των πρωτεϊνών. (α) Το αποδιαταγµένο πολυπεπτίδιο αλληλεπιδρά µε την DnaJ. (β) H DnaK αναλαµβάνει από την DnaJ και υδρολύει το δεσµευµένο ΑΤΠ σε ADP. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την δηµιουργία ενός συµπαγούς συµπλόκου. (γ) Η GrpE προκαλεί την αποδέσµευση του ADP από την DnaK. Αυτό κάνει την αλληλεπίδραση µεταξύ DnaK και πολυπεπτιδίου ασθενέστερη επιτρέποντας την µεταφορά του στη µοριακή ακόλουθο GroEL. (δ) Με την δέσµευση ΑΤΡ στην DnaK το σύµπλοκο διαχωρίζεται. Το πολυπεπτίδιο µπορεί να διπλώσει στην φυσιολογική στερεοδοµή, να επαναπροσδεθεί στις DnaK-DnaJ ή να µεταφερθεί στη GroEL ανάλογα µε τις ιδιότητες επαναδιάταξης της πρωτείνης.
7-10 Πρόσφατες ανακαλύψεις εισηγούνται ότι ένας συνδυασµός υποβοηθούµενων και µη υποβοηθούµενων από µοριακές ακολούθους µηχανισµών δρα στο δίπλωµα των πρωτεϊνών στο κυτόπλασµα. Ενώ µοριακοί ακόλουθοι που δεσµεύονται σε νέα πολυπεπτίδια, όπως οι Hsp70, έχουν ένα κύριο ρόλο στην διατήρηση της ικανότητας των πολυπεπτιδίων να διπλώνουν, η συµµετοχή των κυλινδρικών µοριακών ακολούθων στο ολικό δίπλωµα είναι περιορισµένο σε ένα υποσύνολο των ευαίσθητων σε συσσωµάτωση πολυπεπτιδίων. Η πλειονότητα των βακτηριακών πρωτεϊνών είναι σχετικά µικρές και συντίθενται γρήγορα και ανεξάρτητα από την GroEL µεταβιοσυνθετικά. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν ένα µεγαλύτερο αριθµό πρωτεϊνών µε πολλές δοµικές ενότητες. Ένας αριθµός των ανεξαρτήτων δοµικών ενοτήτων µιας πρωτείνης µπορεί να διπλώσει συνµεταφραστικά και σειριακά. Έτσι εξηγείται πως µεγάλες πρωτείνες διπλώνουν χωρίς την βοήθεια µοριακών ακολούθων. Οµόλογα του συστήµατος GroEL GroES υπάρχουν και στα µιτοχόνδρια (Hsp60 Hsp10) και στους χλωροπλάστες (cpn60 cpn10). Το ευκαρυωτικό κυτόπλασµα περιέχει µία µακριά συγγενή µοριακή ακόλουθο γνωστή ως TRiC ή CCT. εν είναι πολλά γνωστά για τον τρόπο µε τον οποίο η TriC λειτουργεί χωρίς GroES συνένζυµο αλλά µε ενσωµατωµένη την λειτουργία της GroES στην δοµή της. Εικόνα 7.8. Ο κύκλος αντίδρασης GroEL GroES στο δίπλωµα των πρωτεϊνών. Με D* αναπαρίσταται η υψηλής συνάφειας για την δέσµευση ADP κατάσταση του επταµερούς δακτυλίου της GroEL. Με D αναπαρίσταται η χαµηλής συνάφειας για την δέσµευση ADP κατάσταση του επταµερούς δακτυλίου της GroEL. Με Τ η κατάσταση δέσµευσης ΑΤΡ. U και Ν είναι η αποδιαταγµένη και η φυσιολογική κατάσταση της πρωτείνης. (α) Η µορφή του συµπλόκου GroEL GroES είναι η φυσιολογική κατάσταση. (β) Με την δέσµευση της αποδιαταγµένης πολυπεπτιδικής αλυσίδας στην GroEL το ADP και η GroES αποχωρίζονται. (γ) εσµεύεται ΑΤΡ κάνοντας την αλληλεπίδραση GroEL και πρωτείνης ασθενέστερη και προκαλεί την δέσµευση πάλι της GroES. (δ) Η υδρόλυση της ΑΤΡ προκαλεί την απελευθέρωση της πρωτείνης από την GroEL και το φυσιολογικό δίπλωµα της. (ε) Η ηµιουργία της ADP κατάστασης αυξάνει την συγγένεια της GroEL για την GroES. Έτσι η πρωτείνη αν έχει διπλώσει αποχωρίζεται (Ν) ή επαναπροσδένεται για άλλο ένα κύκλο. Το µοντέλο της GroEL στο κάτω µέρος του σχήµατος δέιχνει την δοµή του επταµερούς µε και χωρίς ΑΤΡ µε το σηµείο δέσµευσης του ΑΤΡ σε σκούρο χρώµα.
7-11 Τουλάχιστον το 50% των πρωτεϊνών αλληλεπιδρούν µε µία ή περισσότερες hsp70 µοριακές ακολούθους κατά την διάρκεια της βιοσύνθεσης ένώ το 10% των νεοσυντιθεµένων πρωτεϊνών στην E. Coli και 15% των πρωτεϊνών σε ευκαρωτικά κύτταρα αλληλεπιδρούν µε hsp60 µοριακές ακολούθους για το δίπλωµα (εικ.7.9). Έτσι µοριακοί ακόλουθοι είναι αναγκαίες για ένα περιορισµένο υποσύνολο πρωτεϊνών. Είναι αξιόλογο ότι συχνά αυτές οι πρωτείνες περιέχουν ενότητες µε τοπολογία α/β. Μεγάλες πρωτείνες µε σύνθετη τοπολογία αναµένεται να διπλώνουν αργά και να σχηµατίζουν ενδιάµεσες καταστάσεις. Είναι επίσης αξιόλογο ότι η GroEL µπορεί να δεσµεύει πολλούς τύπους ενδιάµεσων καταστάσεων, από την τελείως αποδιπλωµένη αλυσίδα µέχρι αρχικές ή τελικές καταστάσεις διπλώµατος ακόµη και σχεδόν φυσικές καταστάσεις. Αυτό αποδεικνύει ότι η GroEL δεσµεύει το πολυπεπτίδιο χωρίς εξειδικευµένη αλληλεπίδραση αναγνωρίζοντας εκτιθέµενες υδρόφοβες επιφάνειες τυπικές σε µη φυσιολογικές καταστάσεις. Εικόνα 7.9. Το δίπλωµα των πρωτεϊνών στο κυτόπλασµα της Escherichia coli cytoplasm. (α) ιπλωµα ανεξάρτητο των µοριακών ακολούθων. (β) ίπλωµα µε την βοήθεια µοριακών ακολούθων τύπου hsp70. (γ) ίπλωµα µε την βοήθεια µοριακών ακολούθων τύπου hsp70 και της µοριακής ακολούθου GroEL. Η πλειονότητα των πολυπεπτιδίων διπλώνουν χωρίς την βοήθεια ή µε αρχική παρέµβαση µοριακών ακολούθων. Πολλές µελέτες προτείνουν ότι η GroEL υποβοηθά το δίπλωµα µε την δράση της ως ένζυµο αναδίπλωσης όπου ανώµαλα διπλωµένες καταστάσεις αποδιπλώνονται δεσµευµένες στην κεντρική κοιλότητα της GroEL και πάλι αναδιπλώνονται. Για µεγαλύτερες πρωτείνες έχει δειχθεί ότι το δίπλωµα µπορεί να προκύψει είτε ελεύθερα είτε µε την συµµετοχή της GroEL αλλά η µοριακή ακόλουθος υποβοηθά το ταίριασµα των δοµικών ενοτήτων που την αποτελούν. Συνολικά οι µοριακοί ακόλουθοι λειαίνουν την ενεργειακή επιφάνεια αφαιρώντας ή ελαττώνοντας το µέγεθος πιθανών ενεργειακών καταστάσεων παγίδων.
7-12 7.2.3. Οι µοριακοί ακόλουθοι συνεργάζονται. Οι Hsp70 και Hsp60 µοριακοί ακόλουθοι δρουν διαδοχικά στα µιτοχόνδρια όπου οι ξεδιπλωµένες πρωτείνες εισάγονται από το κυτόπλασµα. Πειράµατα ανασύστασης ιn vitro µε οµόλογες των µιτοχονδριακών µοριακές ακολούθους της E. coli όπως DnaK (Hsp70), DnaJ, GrpE, GroEL and GroES, ανέδειξαν την σηµαντικότητα της συνεργασίας αυτής στο δίπλωµα των πρωτείνών. Το σύστηµα Hsp70 διατηρεί την ικανότητα διπλώµατος του πολυπεπτιδίου στο κυτοπλασµατικό περιβάλλον ενώ η µοριακή ακόλουθος Hsp60 µεσολαβεί στο δίπλωµα. Εκτός από το δίπλωµα που προκύπτει µετά την µετάφραστική διαδικασία το σύστηµα των µοριακών ακολούθων δρα και στην αναδίπλωση πρωτεϊνών που έχουν αποδοµηθεί εξ αιτίας ακραίων συνθηκών (στρές). 7.2.4. Το µέγεθος των πρωτεϊνών που διπλώνουν. Η GroEL και GroES είναι απαραίτητες για την αύξηση της E. Coli κάτω από κάθε συνθήκες. Παρ οτι η διαφοροποίηση µεταξύ των νέων πολυπεπτιδίων που αλληλεπιδρούν µε την GroEL είναι µεγάλη, αυτές συνολικά είναι το 10-15% όλων των πρωτεϊνών του κυτοπλάσµατος σε φυσιολογικές συνθήκες. Μετά από ένα θερµικό σοκ στους 42 C, το ποσοστό των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την GroEL αυξάνει στο 30% του συνολικού αριθµού. Τα πολυπεπτίδια υποστρώµατα της GroEL ποικίλλουν σε µέγεθος από 10 and 55 kda. Ο χρόνος που απαιτείται για ένα κύκλο διπλώµατος από την GroEL (~15 s), είναι ίσος µε τον χρόνο σύνθεσης µιας µέσης πρωτείνης της E. Coli. Ένα µεγάλο ποσοστό από τις πρωτείνες που δηµιουργούνται είναι µικρότερο από 25 kda και διπλώνουν τάχιστα. Αντίθετα οι µεγαλύτερες, µεταξύ 25 και 55 kda παραµένουν συµπλοκοποιηµένες µε τη GroEL για περισσότερο (100-150s κατά µέσο όρο) που αντιστοιχεί σε πολλαπλούς κύκλους αναδίπλωσης από την µοριακή ακόλουθο. Πως όµως οι πρωτείνες που απαιτούν το σύστηµα GroEL για το δίπλωµα τους φτάνουν στην θέση της µοριακής ακολούθου δεδοµένης της µικρής συγκέντρωσης της GroEL στο κυτόπλασµα και την υψηλή συγκέντρωση ανταγωνιστικών πολυπεπτιδίων; Οι µη φυσιολογικές καταστάσεις πολυπεπτιδίων εκθέτουν περισσότερα υδρόφοβα αµινοξικά κατάλοιπα στο διαλύτη και έτσι έχουν µεγαλύτερη συγγένεια για την GroEL. Επιπλέον οι Hsp70 δρουν ως µεσολαβητές επιτρέποντας την µετα-µεταφραστική µεταφορά στην GroEL. Το άνω όριο µεγέθους των υποστρωµάτων της GroEL (~55 kda η ~500 αµινοξικά κατάλοιπα) είναι σύµφωνο µε την χωρητικότητα της κοιλότητας του συστήµατος GroEL GroES. 7.2.5. Συνµεταφραστικό δίπλωµα. Σε πρωτείνες µε πολλές δοµικές ενότητες αυτές συνήθως συνδέονται µε εύκαµπτες ολιγοπεπτιδικές συνδέσεις. Τέτοιες πρωτείνες µπορούν να διπλώνουν συνµεταφραστικά όπως οι δοµικές τους ενότητες αναδύονται από το ριβόσωµα. Υπάρχουν αποδείξεις για συνµεταφραστικό δίπλωµα όπως την δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών κατά την έκκριση πρωτεϊνών στην κοιλότητα του ενδοπλασµατικού δικτύου (ER lumen) (εικ.8). Επίσης η τεχνητή δηµιουργία συνεχούς συµπλόκου πρωτεϊνών ανθρώπινης H-ras µε διυδροφολικής αφυδρογονάσης από
7-13 ποντικό συνδεδεµένων µε µια εύκαµπτη πολυπεπτιδική σύνδεση απέδειξε ότι ενώ οι δύο ξεχωριστές πρωτείνες διπλώνουν φυσιολογικά το σύµπλοκο in vitro δεν διπλώνει εξ αιτίας των εσωτερικών µοριακών αλληλεπιδράσεων µεταξύ των ξεδιπλωµένων δοµικών ενοτήτων. Αντίθετα το σύµπλοκο διπλώνει κανονικά κατά την µετάφραση του από το ευκαρυωτικό ριβόσωµα όπου οι δοµικές ενότητες παράγονται και διπλώνουν διαδοχικά (εικ.9). Από τη µηχανιστική άποψη το δίπλωµα ενός σύνθετου πολυπεπτιδίου ανάγεται στο δίπλωµα των ανεξαρτήτων υποµονάδων ή δοµικών ενοτήτων που µπορούν και να διπλώσουν χωρίς βοήθεια. Έτσι το συνµεταφραστικό δίπλωµα να εξηγεί το γιατί η πλειονότητα των ευκαρυωτικών κυτοπλασµατικών πρωτεϊνών να µπορεί να διπλώνει χωρίς την παρουσία µοριακών ακολούθων. Είναι δυνατόν η σύνδεση και η αποδέσµευση ΑΤΡ και Hsp70 που ρυθµίζεται από τις οµόλογες των Hsp40 να είναι αρκετή µεσολάβηση για το συνµεταφραστικό δίπλωµα πολλών πρωτεϊνών µε πολλές ενότητες µε την προστασία που προσφέρουν σε µερικά διπλωµένες δοµικές ενότητες. Επειδή το συνµεταφραστικό δίπλωµα σηµαίνει την δηµιουργία στερεοδοµής πολύ κοντά ή ακριβώς στην φυσιολογική απαιτείται η πλήρης σύνθεση του πολυπεπτιδίου µιάς δοµικής ενότητας επιπλέον αρκετού αριθµού καταλοίπων µετά το καρβοξυλοτελικό άκρο για την αποφυγή τοπολογικών παρεµποδίσεων από το ριβόσωµα. Έτσι για πρωτείνες µε µία δοµική ενότητα το δίπλωµα είναι µετα- µεταφραστική διαδικασία γιατί η πλήρης σύνθεση του πολυπεπτιδίου είναι απαραίτητη για το δίπλωµα. (εικ.7.10) Εικόνα 7.10. Το δίπλωµα των πρωτεϊνών στο ευκαρυωτικό κυτόπλασµα. Αναπαριστώνται τα µονοπάτια διπλώµατος µε και χωρίς την παρέµβαση των συστηµάτων των µοριακών ακολούθων. (α) Συνµεταφραστικά και ανεξάρτητα από το σύστηµα των µοριακών ακολούθων. (β) Μεταµεταφραστικά µε την παρέµβαση των µοριακών ακολούθων σε ανεξάρτητες δοµικές ενότητες. Η TRiC (CCT) µπορεί να δρα και συνµεταφραστικά σε πολυπεπτίδια που έχουν ένα µήκος αλυσίδας 150 αµινοξέων. Η κατάσταση θα είναι διαφορετική για πρωτείνες πολλών δοµικών ενοτήτων που όµως συντίθενται από διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Εδώ µια συνεχής πολυπεπτιδική αλυσίδα συνθέτει ένα τµήµα της δοµικής ενότητας αφήνει κάποιο κοµµάτι χωρίς δοµή συνεχίζει να συνθέσει µια άλλη δοµική ενότητα και µετά επιστρέφει στο να ολοκληρώσει το προηγούµενο δίπλωµα. Μία τέτοια πρωτείνη δεν θα ήταν δυνατόν να ολοκληρώσει το δίπλωµα της συνµεταφραστικά ή τουλάχιστον χωρίς να έχει ολοκληρωθεί το µεγαλύτερο µέρος της σύνθεσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Θα µπορούσε εν τούτοις να καταρρέει σε µη φυσιολογικές δοµικές ενότητες. Τέτοιες δοµικές ενότητες προβάλουν υδρόφοβες επιφάνειες που αναγνωρίζονται απο την TRiC. Αντίστοιχα αυτό µπορεί να συµβεί και σε πρωτείνες που έχουν διαδοχικές ενότητες που όµως αλληλοσταθεροποιούνται µε υδρόφοβες επιφάνειες διεπαφής όπως η ακτίνη.
7-14 7.3. Ανώµαλο δίπλωµα Ασθένειες 7.3.1. Εισαγωγή. Πολλές δεκαετίες πίσω οι επιστήµονες παρατήρησαν ότι οι πρωτείνες δε διάλυµα έχουν την τάση να δηµιουργούν αδιάλυτα συσσωµατώµατα. Τα τελευταία όµως χρόνια οι ερευνητές µελετώντας το δίπλωµα των πρωτεϊνών παρατήρησαν ότι τα συσσωµατώµατα αυτά είναι πανοµοιότυπα µε τα αµυλοειδή κατάλοιπα (εικ.7.11), παθολογικά χαρακτηριστικά µερικών δεκάδων σοβαρών ασθενειών µε περισσότερο γνωστή την ασθένεια του Altzheimer και πιο πρόσφατα την BSE ή ασθένεια των τρελών αγελάδων. Και στις δύο περιπτώσεις ή µερικά διπλωµένη πρωτείνη αλληλεπιδρά µε άλλες και συγκροτεί µη διαλυτά ινίδια (εικ.7.12). Στο εργαστήριο αυτά είναι απλά µια ενόχληση αλλά σε ζωντανούς ιστούς η συγκέντρωση τους µπορεί να αποδειχθεί θανατηφόρα. Τα συσσωµατώµατα αυτά είναι η απαρχή της κατανόησης και πρόληψης αυτών των ασθενειών. Εικόνα 7.11. Ινίδια β-αµυλοειδούς από ασθενή µε Altzheimer. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι το χυµοτρυψινογόνο ( ο πρόδροµος του ενζύµου χυµοτρυψίνη). Αυτό όταν αποδοµηθεί τεχνητά συχνά σχηµατίζει συσσωµατώµατα. Μελέτες αποδεικνύουν ότι ενώ αρχίζει να διπλώνει κανονικά οι µερικά διπλωµένες ενδιάµεσες καταστάσεις κολλούν µεταξύ τους και σταµατούν το δίπλωµα. Με ελάττωση της συγκέντρωσης της πρωτείνης (δηλαδή µειώνοντας της πιθανότητα οι πρωτείνες να έρθουν σε επαφή) το ποσοστό φυσιολογικά αναδιπλωµένης πρωτείνης αυξάνει. Έτσι αποκαλύπτεται ότι η εξειδίκευση των συσσωµατωµάτων εξαρτάται από αλληλεπιδράσεις µεταξύ ορισµένων αµινοξέων στα πρωτεϊνικά µόρια.
7-15 Εικόνα 7.12. Σχηµατική αναπαράσταση των δυνατών µηχανισµών δηµιουργίας αµυλοειδών ινιδίων. Μετά την σύνθεση στο ριβόσωµα, η πρωτείνη διπλ ωνει στο ενδοπλασµατικού δίκτυο (ER) µε την βοήθεια µοριακών ακολούθων που εµποδίζουν την δηµιουργία συσσωµατωµάτων από µερικά αναδιπλωµένες πρωτείνες. Η σωστά διπλωµένη πρωτείνη εκρίνεται από το κύτταρο και λειτουργεί κανονικά στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Κάτω από ορισµένες συνθήκες η πρωτείνη αποδιατάσσεται, τουλάχιστον µερικά, και µπορεί να δηµιουργήσει συσσωµατώµατα. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την δηµιουργία ινιδίων ή άλλων συσσωµατωµάτων (πλάκες, σφαιρίδια) στους ιστούς. Είναι πιθανόν η συγκέντρωση αυτών να προκαλεί τις παθολογικές καταστάσεις. Ν,Ι,U, αναφέρονται στην φυσιολογική, ενδιάµεση και αποδιπλωµένη κατάσταη της πρωτείνης. QC αναφέρεται στο µηχανισµό ελέγχου ποιότητας που γίνεται σε πρωτείνες που δεν έχουν διπλώσει φυσιολογικά στο ενδοπλασµατικό δίκτυο. Συχνά η παρουσία µοριακών ακολούθων βοηθά την αναδίπλωση όπως αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο. Τι συµβαίνει όµως όταν οι µοριακοί ακόλουθοι δεν µπορούν να βοηθήσουν στο δίπλωµα των πρωτεϊνών στο κύτταρο είτε κάτω από ακραίες συνθήκες ή σε περιπτώσεις µεταλλαγµένων πρωτεϊνών µε αστάθεια ή ανώµαλο δίπλωµα; Τέτοιες καταστάσεις οδηγούν σε θανατηφόρες ανωµαλίες ή ασθένειες. Για παράδειγµα µεταλλάξεις στην πρωτείνη p53 είναι υπεύθυνες για το 50% των καρκίνων. Οι περισσότερες από αυτές τις µεταλλάξεις δηµιουργούν αστάθεια στην πρωτείνη. Ένα δεύτερο παράδειγµα είναι η µετάλλαξη DF508 σε µία σηµαντική πρωτεΐνη κανάλι ιόντων χλωρίου που προκαλεί την κυστική ίνωση εξ αιτίας του ανώµαλου διπλώµατος του καναλιού. Ένα τρίτο είναι οι αµυλοειδείς ασθένειες, µια οικογένεια 20 γνωστών ανθρώπινων ανωµαλιών όπως η Alzheimer και η Creutzfeldt-Jakob (prions) (εικ.7.14). Σε αυτές τις περιπτώσεις µη σωστό δίπλωµα ή ανώµαλη επεξεργασία φυσιολογικά διαλυτών πρωτεϊνών οδηγεί στην δηµιουργία συσσωµατωµάτων και αδιάλυτων πλακών. Σε µερικές περιπτώσεις συµµετέχει η φυσιολογική πρωτείνη ενώ σε άλλες πρωτείνες µε σηµειακές µεταλλάξεις. Και στις δύο περιπτώσεις το πρώτο κρίσιµο βήµα προς την ασθένεια πιστεύεται ότι προκαλείται από την µερική αποδιάταξη της φυσιολογικής πρωτείνης. Επίσης έχουν εντοπιστεί µεταλλάξεις που επηρεάζουν το δίπλωµα ανάλογα µε την θερµοκρασία. Στην περίπτωση µιας πρωτείνης από το περίβληµα ιού η µεταλλαγµένη πρωτείνη (µε µία µόνο αµινοξική υποκατάσταση) σε χαµηλή θερµοκρασία διπλώνει κανονικά ενώ σε υψηλή η µεταλλαγµένη πρωτείνη ξεδιπλώνει αντίθετα µε την φυσιολογική. Σε άλλη περίπτωση η τεχνητή αντικατάσταση ενός
7-16 αµινοξέος στην βοδινή αυξητική ορµόνη σταµατά την δηµιουργία συσσωµατωµάτων χωρίς να επηρεάζει το δίπλωµα της. Εικόνα 7.13. Εάν η µερικώς αναδιπλωµένη πρωτείνη βρεθεί εκτός του κανονικού της µέσου ή έχει κάποια σηµειακή µετάλλαξη µπορεί αντί της φυσιολογικής στερεοδοµής να συσσωµατωθεί. Σε µερικές περιπτώσεις δηµιουργίας συσσωµατωµάτων εµπλέκεται η κανονική πρωτείνη ενώ σε άλλες σηµειακές µεταλλάξεις είναι η αιτία. Μέχρι σήµερα ελάχιστη είναι η πρόοδος στη θεραπεία τέτοιων ασθενειών. Η µεθοδολογία που αναφέρθηκε για την µελέτη του διπλώµατος των πρωτεϊνών και η µεγαλύτερη κατανόηση των µηχανισµών πρωτεϊνικού διπλώµατος στο µοριακό επίπεδο εφαρµόζονται ήδη και στην µελέτη αυτών των ασθενειών. Ένα παράδειγµα είναι ο σχεδιασµός αναλόγων υποστρώµατος της πρωτείνης τρανσθυρετίνης που δεσµεύονται από αυτή και σταθεροποιούν το τετραµερές της ανθρώπινης πρωτείνης αναστέλλοντας την αµυλοείδωση αυτής της πρωτείνης. Επίσης η αναγνώριση πρωτεϊνών που συµµετέχουν στην ανάπτυξη της ασθένειας Alzheimer και του µηχανισµού δηµιουργίας συσσωµατωµάτων των δηµιουργούµενων πεπτιδίων A βοηθά στην κατασκευή µικρών φαρµακευτικών ουσιών αναστολέων κατά αυτής της σηµαντικής ανθρώπινης ασθένειας. Εικόνα 7.14. Η δοµή των πρωτείνών prions. Α,Β. Η δοµή της rprp(90-231) από ινδικό χοιρίδιο. Και Γ η δοµή της µεταλλαγµένης ανθρώπινης πρωτείνης PrP Sc.
7-17 Εκτός από τις µοριακές ακολούθους υπάρχουν τουλάχιστον άλλα δύο ένζυµα που καταλύουν το δίπλωµα των πρωτεϊνών στο κύτταρο. Η ΡΡΙ καταλύει τον cis/trans ισοµερισµό της προλίνης και η PDI την δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών. Επειδή το δίπλωµα των πρωτεϊνών είναι τόσο πολύπλοκο οι πιθανότητες ατελειών στο δίπλωµα είναι σηµαντικές. Πιθανή θερµοδυναµική αστάθεια της φυσικής πρωτείνης ή των ενδιαµέσων καταστάσεων του διπλώµατος, τροποποίηση στη κινητική του διπλώµατος, δηµιουργία µη αντιστρεπτών τοξικών στερεοδιατάξεων µπορούν να αφαιρέσουν από την πρωτείνη την λειτουργικότητα της οδηγόντας σε παθολογικές καταστάσεις. εν είναι µόνον η λανθασµένη στερεοδιάταξη που προκαλεί τις ανωµαλίες. Και η υπερβολικά σταθερή στερεοδιάταξη, όπως στην περίπτωση των prions, µπορεί να είναι τοξική για τα κύτταρα. Στην περίπτωση της σπογγώδους εγκεφαλοπάθειας η prion πολυµερισµένη πρωτείνη έχει κυρίως β-πτυχωτές επιφάνειες που µπορουν να επάγουν στην στερεοδοµή και στην φυσιολογική πρωτείνη (εικ.14). Στην περίπτωση της Alzheimer η στερεοδιατακτική αλλαγή της αµινοτελικής περιοχής από α-έλικα σε β-πτυχωτή επιφάνεια είναι η δηµιουργία των αµυλοειδών.