Μελέτες επί μεταλλαγμάτων της πρωτεΐνης La (Lupus antigen)

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Μελέτες επί μεταλλαγμάτων της πρωτεΐνης La (Lupus antigen) ΠΑΡΘΕΝΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΙΔΟΥ ΜΟΡΙΑΚH ΒΙΟΛΟΓΟΣ - ΓΕΝΕΤΙΣΤΡΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2015

Στη μητέρα μου

Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Ιατρικές Επιστήμες του Τμήματος Ιατρικής, του Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Καθηγητής Κωνσταντίνος Σταθόπουλος (Επιβλέπων Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής Διονύσιος Δραΐνας (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Καθηγητής Γεώργιος Σπυρούλιας (Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών)

Η ολοκλήρωση της παρούσας διπλωματικής εργασίας δεν θα ήταν δυνατή χωρίς τη συμβολή κάποιων ανθρώπων τους οποίους οφείλω να ευχαριστήσω προσωπικά. Πρώτον από όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή μου, κύριο Κωνσταντίνο Σταθόπουλο, για την άρτια επιστημονική καθοδήγηση καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης αυτής της εργασίας. Θα ήθελα επίσης να τον ευχαριστήσω που δέχθηκε να με εντάξει στην ερευνητική του ομάδα και μου έδωσε τη δυνατότητα να ασχοληθώ με ένα θέμα που από την πρώτη στιγμή μου κέντρισε το ενδιαφέρον και με έβαλε σε θέση να αντιμετωπίσω επιστημονικές προκλήσεις. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά και τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής: Τον καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής Γεώργιο Σπυρούλια, για την συνεργασία, την καθοδήγηση αλλά και την φιλόξενη υποστήριξη στο εργαστήριό του. Τον καθηγητή ιονύσιο ραΐνα για την προθυμία του να με συμβουλέψει κάθε φορά που αναζήτησα την επιστημονική του άποψη αλλά και για την φιλική αντιμετώπιση. Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές και συναδέλφους στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας για την εγκάρδια υποδοχή και για την οικειότητα που αποκτήσαμε. Πιο συγκεκριμένα όμως νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω τρεις ανθρώπους που τώρα πια είναι για μένα κάτι πολύ παραπάνω από απλοί συνάδελφοι, είναι φίλοι: Θα ήθελα να ευχαριστήσω πρώτη τη διδακτορική φοιτήτρια Μαρία Αποστολίδη. Χωρίς τη βοήθεια και την καθοδήγηση της Μαρίας σε κάθε μου βήμα, η εργασία αυτή φαντάζει ανέφικτη στο μυαλό μου. Ουσιαστικά, αυτή η διατριβή είναι τόσο δική της όσο και δική μου. Μαρία σε ευχαριστώ για την πολύτιμη βοήθεια σου αλλά και για την ηθική υποστήριξη που πολλές φορές χρειάστηκα και πάντα απλόχερα μου πρόσφερες. Μου είναι δύσκολο να εκφράσω με λόγια την ευγνωμοσύνη που νιώθω για τον διδακτορικό φοιτητή Δημήτρη Αναστασάκη. Παρόλα αυτά, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για την ανεκτίμητη φιλία και τη βοήθεια που μου παρείχε τόσο σε πειραματικό όσο και σε ανθρώπινό επίπεδο. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω με ένα πλατύ χαμόγελο, τον συνάδελφο και μεταπτυχιακό φοιτητή Ηλία Σκεπαρνιά, για την πιο ευχάριστη συνεργασία της ζωής μου. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για

τη βοήθειά του τις πρώτες μέρες μου στο εργαστήριο, την τίμια και αλτρουιστική αντιμετώπιση αλλά και το υπέροχο κλίμα που διατηρήσαμε μέχρι το τέλος. Ακόμα, οφείλω να ευχαριστήσω θερμά την ομάδα Βιομοριακής Προσομοίωσης & ΝΜR της Φαρμακευτικής σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών και συγκεκριμένα, τους υποψήφιους διδάκτορες Αικατερίνη Αργυρίου και Διονύσιο Βούρτση καθώς και τον μεταδιδακτορικό ερευνητή Χρήστο Χασάπη για την άριστη συνεργασία και τις δομικές μελέτες των μεταλλαγμάτων που συμπεριλαμβάνονται σε αυτήν την εργασία. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον François-Xavier Ogi από την NanoTemper για την εκπαίδευση και την υποστήριξη στα πειράματα MST. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την φίλη μου Άννα πρώτα για την ειλικρινή φιλία της και έπειτα για όλη την στήριξή της από την πρώτη στιγμή που μετακόμισα στην πάτρα. Τέλος, το πιο μεγάλο «ευχαριστώ», το οφείλω στους γονείς μου που με κόπο και θυσίες με στηρίζουν οικονομικά αλλά και ηθικά όλα αυτά τα χρόνια. Τους ευχαριστώ για την απεριόριστη αγάπη και την ασφάλεια που μου προσφέρουν. Τους ευχαριστώ που έχουν κάνει τα όνειρά μου προτεραιότητά τους και τους υπόσχομαι να δίνω πάντα τον καλύτερό μου εαυτό.

Περιεχόμενα Περίληψη-Abstract... 1 Εισαγωγή... 4 Η πρωτεΐνη La (Lupus antigen)... 6 1. Οργάνωση επικρατειών... 6 1.1 Η υπερ-οικογένεια των πρωτεϊνών που περιέχουν La motif... 8 1.2 Το RNA recognition motif (RRM)... 10 2. Μελέτες επί της δομής της πρωτεΐνης La... 10 3. Ανώτερες δομές διαμόρφωσης της πρωτεΐνης La... 16 4. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης La... 17 5. Μελέτες δέσμευσης μορίων RNA από την πρωτεΐνη La... 18 5.1 Χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης La που συμβάλλουν στην αναγνώριση του RNA... 18 5.2 Αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από την πρωτεΐνη La... 22 6. Ποσότητα και υποκυττάριος εντοπισμός... 24 7. Οι διαφορετικοί ρόλοι της πρωτεΐνης La στο κύτταρο... 24 7.1 H πρωτεΐνη La ως πιθανός μεταγραφικός παράγοντας της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ... 25 7.2 H πρωτεΐνη La απαιτείται για την ορθή πορεία ωρίμανσης των πρόδρομων trna... 26 7.3 Ο ρόλος της πρωτεΐνης La στην προστασία και τον υποκυττάριο εντοπισμό πρόδρομων μικρών μορίων RNA... 31 7.4 Πιθανοί ρόλοι της πρωτεΐνης La στη μετάφραση του mrna... 35 7.5 Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης La με τις UTR περιοχές των ιικών RNA... 37 7.6 Η πρωτεΐνη La ως RNA συνοδός πρωτεΐνη... 38 8. Η πρωτεΐνη La ως αυτοαντιγόνο... 40 Σκοπός της μελέτης... 44 Υλικά και Μέθοδοι... 46 Α. Υλικά... 47 1. Χημικά... 47 2. Ένζυμα... 48 3. Βακτηριακά Στελέχη... 49 4. Κιτ... 50 5. Θρεπτικά μέσα... 50 6. Ρυθμιστικά διαλύματα... 51

7. Πλασμιδιακοί φορείς... 53 8. Εκκινητές (primers)... 56 Β. Μέθοδοι... 56 Μοριακή κλωνοποίηση των επικρατειών La motif, RRM1 και La motif-rrm1... 56 Έκφραση των ανασυνδυασμένων τμημάτων... 61 Απομόνωση των πρωτεϊνικών επικρατειών... 62 Παραγωγή των πρόδρομων trna του D. discoideum με in vitro μεταγραφή... 66 5 Ραδιενεργή σήμανση των πρόδρομων trna με [γ- 32 P] ATP... 68 Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)... 70 MicroScale Thermophoresis (MST)... 71 Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting analysis)... 72 Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR)... 74 Αποτελέσματα... 77 Μοριακή κλωνοποίηση των τμημάτων που κωδικοποιούν τις επικράτειες La motif, RRM1 και La motif-rrm1... 78 Έκφραση και απομόνωση των επικρατειών της πρωτεΐνης La... 80 Παραγωγή των πρόδρομων trna με in vitro transcription... 82 Δοκιμασίες αλληλεπίδρασης των ανασυνδυασμένων τμημάτων με τα πρόδρομα trna... 83 Electrophoresis mobility shift assay (EMSA)... 83 MicroScale Thermoforesis (MST)... 89 Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting Analysis)... 91 Δομικός χαρακτηρισμός των ανασυνδυασμένων επικρατειών... 94 Συζήτηση... 97 Βιβλιογραφία... 106

Περίληψη-Abstract 1

Περίληψη-Abstract Η πρωτεΐνη La περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1974 ως αυτοαντιγόνο στον ορό των ασθενών που έπασχαν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και σύνδρομο Sjögren. Απαντάται σε μεγάλες ποσότητες μέσα στα κύτταρα, όπου υπό φυσιολογικές συνθήκες δεσμεύει τα πρόδρομα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ προστατεύοντάς τα από την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι μπορεί να δεσμεύεται σε μία πληθώρα κυτταρικών και ιικών mrna ρυθμίζοντας τη μετάφρασή τους. Πρόσφατες έρευνες έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο της ανθρώπινης πρωτεΐνης ως RNA συνοδό (RNA chaperone) που συμβάλλει στην ορθή αναδίπλωση των μορίων RNA που δεσμεύει. Παρά το γεγονός ότι η La περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ομόλογες πρωτεΐνες έχουν βρεθεί σε μία ποικιλία ευκαρυωτικών οργανισμών. Σε όλους αυτούς τους οργανισμούς η πρωτεΐνη παρουσιάζει μία κοινή οργάνωση επικρατειών. Στο Ν-τελικό άκρο υπάρχει το εξαιρετικά συντηρημένο μοτίβο La motif, το οποίο ακολουθείται από ένα τουλάχιστον μοτίβο RNA αναγνώρισης (RRM) και ένα αρκετά μεταβλητό C-τελικό άκρο. Παρότι ο λειτουργικός ρόλος της πρωτεΐνης έχει μελετηθεί επαρκώς, ελάχιστα είναι γνωστά για τη δομή της και τον τρόπο με τον οποίο δεσμεύεται στα φυσικά της υποστρώματα, όπως είναι τα πρόδρομα trna. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη μελέτη τριών επιμέρους επικρατειών της πρωτεΐνης La του οργανισμού Dictyostelium discoideum, η οποία παρουσιάζει πολύ μεγάλη ομολογία και παρόμοια δομική οργάνωση με την ανθρώπινη πρωτεΐνη. Κάθε επικράτεια μελετάται ως προς τη δυνατότητα και τον τρόπο αλληλεπίδρασης με ομόλογα πρόδρομα trna του D. discoideum. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μοριακή κλωνοποίηση των επικρατειών La motif, RRM1 και La motif-rrm1 και υπερέκφρασή τους σε βακτηριακά κύτταρα. Οι ανασυνδυασμένες επικράτειες απομονώθηκαν σε δύο στάδια καθαρισμού και εξετάστηκαν ως προς την ικανότητα δέσμευσης στα πρόδρομα trna, με Electrophoresis Mobility Shift Assay και Micro Scale Thermophoresis. Επιπλέον, με ανάλυση αποτυπώματος (footprinting) αποκαλύφθηκαν τα σημεία της αλληλεπίδρασης του κάθε τομέα επάνω στο μόριο του pre-trna Arg. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η La χρησιμοποιεί τις διαφορετικές επικρατειές της για να αναγνωρίζει ξεχωριστά σημεία επάνω στο μόριο του pre-trna. Τέλος, με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR σε διάλυμα, επιβεβαιώθηκε ότι τόσο το La motif όσο και το RRM1 μπορούν να αναδιπλώνονται ανεξάρτητα σε μία διαμόρφωση που πιθανότατα διατηρούν και μέσα σε ολόκληρο το μόριο in vivo. 2

Περίληψη-Abstract La is a highly abundant nuclear phosphoprotein. It was first described as an autoantigen found in the sera of patients suffering from systemic lupus erythematosus and Sjögren s syndrome. Under normal conditions, La protein associates with the newly synthesized RNA polymerase III transcripts and protects them from exonucleases. It has also been reported that La associates with a variety of cellular and viral mrnas and regulates their translation. Recent research has established the role of human La as an RNA chaperone that contributes to the proper folding of the associated RNA molecules. Although La was first described in human, homologs have been identified in a wide variety of eukaryotes. All these proteins share a common domain organization. The N-terminus of all known La proteins contains the highly conserved La motif. La motif is followed by a less conserved RNA Recognition motif (RRM) and a notably variable C-terminus. While the functional properties of La have been adequately investigated, information regarding the exact mode of binding and the structure remains elusive. This study focusses on the interaction between distinct domains of Dictyostelium discoideum La and homologous pre-trnas. La motif, RRM1 and La motif-rrm1 were cloned and overexpressed in E. coli. The recombinant domains were purified by affinity chromatography and subsequent FPLC. Each domain was assayed regarding its capacity to bind the pre-trna using Electrophoresis Mobility Shift Assay and Micro Scale Thermophoresis. Foot-printing analysis revealed the specific pre-trna recognition patterns for each domain. The results suggest that La uses its distinct domains to bind different sites of the pre-trna molecule. Finally, structural analysis based on solution NMR spectroscopy, confirmed the independent folding of the domains. Probably each domain preserves its tertiary structure in the wild type protein. 3

Εισαγωγή 4

Συντομογραφίες: SS: Sjögren s syndrome SLE: Systemic Lupus Erythematosus NTD: N terminal domain CTD: C terminal domain RRM: RNA recognition motif LARPs: La related proteins RNP: Ribonucleoprotein complex NLS: Nuclear localization signal IRES: Internal ribosome entry site EMSA: Electrophoresis mobility shift assay MST: Micro-scale thermophoresis NMR: Nuclear magnetic resonance HSQC: Heteronuclear single quantum coherence (spectrum) TROSY: Transverse relaxation optimized spectroscopy aa: amino acids bp: base pairs K d : Dissociation constant 5

Εισαγωγή Η πρωτεΐνη La (Lupus antigen) Η La είναι μία σημαντική πρωτεΐνη που υπάρχει σε αφθονία μέσα στον πυρήνα των κυττάρων. Περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1974 ως αυτοαντιγόνο στον ορό ασθενών που έπασχαν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus) [1] και σύνδρομο Sjögren [2]. Το όνομά της προέρχεται από τον ασθενή στον οποίο ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά όμως συναντάται και ως SS-B (Sjögren Syndrome s antigen B). Παρά το γεγονός ότι η La χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ομόλογες πρωτεΐνες έχουν εντοπιστεί σε μία ποικιλία ανώτερων και κατώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών συμπεριλαμβανομένων των Μ. musculus [3], X. laevis [4], D. melanogaster [5], S. pombe [6], S. cerevisiae [7] και T. brucei [8]. Σήμερα, είναι γνωστό ότι η La δεσμεύεται σε μία πληθώρα μορίων RNA και λειτουργεί ως ικρίωμα για την ορθή αναδίπλωση των μορίων αυτών προστατεύοντάς τα παράλληλα από την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση. Αυτή η μεσολαβούμενη από τη La σταθεροποίηση των μορίων RNA έχει ως αποτέλεσμα: α) την προώθηση του μεταβολισμού των πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ (όπως είναι τα trna), μέσω δέσμευσης της La στην χαρακτηριστική αλληλουχία UUU OH που υπάρχει στο 3 άκρο τους και β) τη ρύθμιση της μετάφρασης συγκεκριμένων κυτταρικών και ιικών mrna. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει την παρέμβαση της πρωτεΐνης La στις διαδικασίες της επιτήρησης των trna (trna surveillance) [9] και της έκφρασης των mirna [10]. 1. Οργάνωση επικρατειών Από τον άνθρωπο ως το T. brucei, όλες οι γνωστές πρωτεΐνες La διαθέτουν τουλάχιστον τρεις ξεχωριστές επικράτειες. Στο Ν-τελικό άκρο των πρωτεϊνών αυτών εντοπίζεται το μοτίβο La motif. Μία εξαιρετικά συντηρημένη αλληλουχία περίπου 60 αμινοξέων, η οποία φαίνεται να είναι παρούσα σε μία σειρά άλλων μη σχετικών πρωτεϊνών [11, 12]. Το La motif ακολουθεί ένα λιγότερο συντηρημένο μοτίβο RNA αναγνώρισης (RNA Recognition Motif, RRM) [13, 14] και 6

Εισαγωγή ένα φορτισμένο και ελάχιστα συντηρημένο C- τελικό άκρο (Εικόνα 1). Στις πρωτεΐνες των σπονδυλωτών μεταξύ του πρώτου RRM και του C- τελικού άκρου, μεσολαβεί ένα επιπλέον άτυπο RRM μοτίβο. Συχνά στη βιβλιογραφία, η πρωτεΐνη χωρίζεται σε δύο μεγάλες περιοχές: την Ν-τελική (NTD) που περιλαμβάνει το La motif και το πρώτο RRM, και στη C- τελική (CTD) που περιλαμβάνει το δεύτερο άτυπο RRM (στα σπονδυλωτά) και το C-τελικό άκρο. Το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης κυμαίνεται από 50 kda στα σπονδυλωτά έως 32 kda στη ζύμη S. cerevisiae. Εικόνα 1. Οργάνωση επικρατειών των La πρωτεϊνών. Κάτω από την ανθρώπινη La στοιχίζονται οι ομόλογες πρωτεΐνες από τους οργανισμούς D. melanogaster, C. elegans, S. pombe, S. cerevisiae και T. brucei. Όλες αυτές οι πρωτεΐνες, με εξαίρεση την C44E4.4 του C. elegans, δεσμεύουν τα νεοσυντιθέμενα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ in vivo [5, 6, 15]. Ένα σύντομο βασικό μοτίβο (SBM) και μία πιθανή περιοχή διμερισμού έχουν εντοπιστεί στη C- τελική περιοχή της ανθρώπινης πρωτεΐνης [16, 17]. Σημειώνεται επίσης το σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) [18-20]. Η C- τελική περιοχή είναι η λιγότερο συντηρημένη μεταξύ των ευκαρυωτών. Αυτό το τμήμα της πρωτεΐνης είναι πιο μεγάλο και πολύπλοκο στα θηλαστικά. Συχνά αναφέρεται ως στοιχείο ρύθμισης που αποκτήθηκε από τα μετάζωα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Το αυξημένο μέγεθος της πρωτεΐνης στα σπονδυλωτά οφείλεται κατά ένα μέρος, στην ύπαρξη ενός δεύτερου άτυπου RRM μέσα σε αυτό το τμήμα [21]. Ένα πιθανό μοτίβο Walker A (GXXXXXGKX), που δεσμεύει ATP [22], έχει εντοπιστεί μέσα στο σύντομο βασικό μοτίβο της 7

Εισαγωγή C- τελικής περιοχής της πρωτεΐνης των σπονδυλωτών [3] (Εικόνα 1). Άλλες λειτουργίες που αποδίδονται στο C- τελικό άκρο της ανθρώπινης πρωτεΐνης La, περιλαμβάνουν ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) [19], ένα σήμα πυρηνικής παρακράτησης (Nuclear Retention Signal, NRE) [19], μία πιθανή περιοχή διμερισμού [17] και ένα πιθανό σημείο διάσπασης από κασπάση [23]. Πρόσφατα, εντοπίστηκε ένα πιθανό σήμα εξόδου από τον πυρήνα (NES) στην ανθρώπινη La και την ομόλογη πρωτεΐνη του S. pombe [24]. Το σήμα αυτό χαρτογραφήθηκε εντός της επικράτειας RRM1. Η λειτουργία του φαίνεται να επισκιάζεται από το σήμα πυρηνικής παρακράτησης, είναι όμως λειτουργικό απουσία του τελευταίου. Ενδεχομένως η αλληλεπίδραση μεταξύ των συντηρημένων στοιχείων που μεσολαβούν στις διαδικασίες της πυρηνικής παρακράτησης, της εξόδου από τον πυρήνα και της RNA δέσμευσης, να συμβάλλει στη δυνατότητα που διαθέτει η πρωτεΐνη να δεσμεύει τους διάφορους τύπους RNA μορίων στα διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα [24]. 1.1 Η υπερ-οικογένεια των πρωτεϊνών που περιέχουν La motif Όπως αναφέρθηκε, το La motif είναι η πιο συντηρημένη επικράτεια της πρωτεΐνης La από την οποία πήρε και το όνομά του. Ωστόσο, το μοτίβο αυτό δεν συναντάται μόνο στην πρωτεΐνη La και στις ομόλογές αυτής, αλλά και σε άλλες πρωτεΐνες με ανεξάρτητες λειτουργίες (La-related proteins LARPs). Οι πρωτεΐνες αυτές (LARPs) είναι ευρέως διαδεδομένες μεταξύ των ευκαρυωτικών οργανισμών και παρότι δεν έχουν χαρακτηριστεί επαρκώς, φέρονται να έχουν ιδιότητες πρόσδεσης σε RNA και να εμπλέκονται σε καθοριστικής σημασίας κυτταρικές λειτουργίες. Μελέτη που βασίστηκε στις αλληλουχίες 83 ευκαρυωτικών ειδών διάσπαρτων στο δέντρο της ζωής και αφορούσε την ύπαρξη πρωτεϊνών που περιέχουν το La motif, έδειξε πως οι πρωτεΐνες αυτές υπάρχουν σε όλους τους ευκαρυώτες (με εξαίρεση τα πρώτιστα από το γένος Plasmodium) αλλά απουσιάζουν από τα αρχαία [12]. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι το LaM είναι ένα προγονικό μοτίβο το οποίο εμφανίστηκε αμέσως μετά τον διαχωρισμό αρχαίων ευκαρυωτών. Στην ίδια μελέτη μετά από εξελικτική και δομική ανάλυση των πρωτεϊνών αυτών, προτείνεται η ταξινόμησή τους σε 5 οικογένειες: τις ομόλογες της γνήσιας La πρωτεΐνης και 4 άλλες LARP οικογένειες. Σε κάθε οικογένεια, ένα κλασικό RRM ή ένα RRM-like motif ακολουθεί το La 8

Εισαγωγή motif των περισσότερων πρωτεϊνών (Εικόνα 2). Εξελικτική ανάλυση των La motif RRM/RRM-L περιοχών έδειξε ότι τα μοτίβα αυτά εξελίχθηκαν μαζί και οι συγγραφείς της μελέτης συνιστούν να αντιμετωπίζονται ως μία οντότητα στις μελέτες που αφορούν τη λειτουργική περιοχή αλληλεπίδρασης των LARPs με τα υποψήφια μόρια συνδέτες. Εικόνα 2. Προτεινόμενη ταξινόμηση των πρωτεϊνών που περιέχουν το μοτίβο LaΜ [12]. Η ονοματολογία ακολουθεί τους εξής κανόνες: όπου Χy τοποθετείται η συντομογραφία του είδους, La για ομόλογες της γνήσιας La πρωτεΐνης και LARP για τις La-related πρωτεΐνες, 1,4,6 ή 7 ο αριθμός της οικογένειας και τέλος, όπου z πεζό γράμμα (a,b,c, ) που προστίθεται στις περιπτώσεις που υπάρχουν περισσότερα μέλη της ίδιας ομάδας σε ένα είδος. 9

Εισαγωγή 1.2 Το RNA recognition motif (RRM) Το μοτίβο αναγνώρισης RNA (RRM), είναι μία από τις πιο κοινές πρωτεϊνικές επικράτειες μέσα στα κύτταρα των ευκαρυωτών. Είναι παρόν σε μία πληθώρα πρωτεϊνών που προσδένουν μονόκλωνο RNA και επιτελούν ποικίλες λειτουργίες. Αποτελείται από περίπου 90 αμινοξέα ανάμεσα στα οποία υπάρχουν δύο συντηρημένες αλληλουχίες 8 και 6 αμινοξέων που είναι στην πλειοψηφία τους αρωματικά και θετικά φορτισμένα. Οι αλληλουχίες αυτές που αντιστοιχούν σε δύο β κλώνους, θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στη δέσμευση του RNA και για αυτό ονομάζονται RNP1 και RNP2 (Ribonucleoprotein domains). Στις ευκαρυωτικές πρωτεΐνες, τα RRM απαντώνται συχνά σε πολλαπλά αντίγραφα μέσα στην πρωτεΐνη και/ή μαζί με άλλες επικράτειες όπως οι δακτύλιοι ψευδαργύρου τύπου CCCH και CCHC, η C τελική περιοχή της πρωτεΐνης PABP (Poly-adenylate binding protein) και η επικράτεια WW [25]. Μέσω της αλληλεπίδρασής του με διαφορετικές πρωτεϊνικές επικράτειες, το RRM μπορεί να ρυθμίζει τη συγγένεια και την εξειδίκευσή του για τα διάφορα μόρια RNA, και να διαφοροποιεί τις βιολογικές του λειτουργίες. Ευκαρυωτικές πρωτεΐνες που περιέχουν RRM εμπλέκονται σχεδόν σε όλες τις μεταμεταγραφικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των τροποποιήσεων του πρόδρομου mrna, του ματισώματος, της σταθερότητας του mrna, της εξαγωγής του mrna από τον πυρήνα, της συναρμολόγησης των συμπλόκων των πρόδρομων rrna, της ρύθμισης της μετάφρασης και της αποικοδόμησης [25]. 2. Μελέτες επί της δομής της πρωτεΐνης La Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες μελέτες πραγματοποιούνται για την αποκάλυψη της τριτοταγούς διαμόρφωσης της La. Μπορεί ο δομικός χαρακτηρισμός ολόκληρης της πρωτεΐνης να μην είναι ακόμη εφικτός, ωστόσο τμηματική μελέτη έχει αποκαλύψει σημαντικά δομικά χαρακτηριστικά τόσο της πρωτεΐνης όσο και του συμπλόκου αυτής με το RNA. Η Ν- τελική περιοχή (N-terminal Domain, NTD) της πρωτεΐνης, η οποία περιλαμβάνει το La motif και το παρακείμενο RRM μοτίβο, έχει μελετηθεί καλύτερα από την υπόλοιπη 10

Εισαγωγή πρωτεΐνη. Οι δομές τόσο του La motif όσο και του RRM1 ξεχωριστά, αποκαλύφθηκαν πρόσφατα. Ανθρώπινη πρωτεΐνη La Η δομές του La motif και του RRM1 της ανθρώπινης πρωτεΐνης La σε διάλυμα, καθορίστηκαν με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR [26]. Το La motif υιοθετεί μία αναδίπλωση παρόμοια με τη δομή winged-helix που έχει παρατηρηθεί και σε άλλες πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεϊκά οξέα. Οι κλασικές δομές winged-helix συνήθως περιέχουν μία δέσμη από τρεις α έλικες και ένα β πτυχωτό φύλλο από τρεις αντιπαράλληλους β κλώνους σε μία τοπολογία α-β-α-α-β-β. Οι δομές winged-helix σχετίζονται με διάφορες λειτουργίες. Στις πρωτεΐνες FokI και RPA (replication protein A), για παράδειγμα, η δομή winged-helix μεσολαβεί στις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης με πρωτεΐνη, ενώ σε πολλούς παράγοντες της μεταγραφής, εμπλέκεται στη δέσμευση δίκλωνου DNA. Το La motif της ανθρώπινης πρωτεΐνης La, φαίνεται να κυριαρχείται από μία μακριά αμφιπαθή α έλικα (α1: κατάλοιπα 8-25). Η πολική πλευρά της α1 έλικας, εκτίθεται στο υδατικό περιβάλλον ενώ η αντίθετη, μη πολική πλευρά συμμετέχει σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τα υπόλοιπα δευτεροταγή στοιχεία της δομής του La motif, σχηματίζοντας τον υδρόφοβο πυρήνα της επικράτειας. Το στριμμένο β πτυχωτό φύλλο, συνεισφέρει με μη πολικά κατάλοιπα στον πυρήνα της επικράτειας La motif, αλλά περιέχει και μία εκτεθειμένη επιφάνεια στην αντίθετη πλευρά από αυτή της α1 έλικας (Εικόνα 3). Η επικράτεια RRM1 που έχει μελετηθεί στην ανθρώπινη πρωτεΐνη La, αναδιπλώνεται σε μία κλασική για τα RRM μοτίβα δομή [26]. Παρά το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες που περιέχουν RRM εκδηλώνουν μεγάλη ποικιλία όσον αφορά τον ρόλο τους στον μεταβολισμό του RNA, τα RRM μοτίβα τους δεσμεύουν το RNA με έναν κοινό μηχανισμό. Το μονόκλωνο RNA απλώνεται επάνω σε μία β πτυχωτή επιφάνεια που σχηματίζεται από τέσσερις β κλώνους. Αρωματικές πλευρικές αλυσίδες που εξέχουν από την μία πλευρά της β πτυχωτής επιφάνειας αλληλεπιδρούν με το RNA [25]. Η άλλη πλευρά της επιφάνειας αυτής, ακουμπάει σε δύο α-έλικες και αποτελεί το υδρόφοβο τμήμα του συγκεκριμένου μοτίβου. Στο RRM1 της ανθρώπινης πρωτεΐνης La, η C- τελική έλικα (α3: κατάλοιπα 185-194), συνδέεται με τον κλώνο β4 μέσω ενός μοναδικού καταλοίπου (Phe 184) και εντοπίζεται στην πλευρά του β πτυχωτού φύλλου που αλληλεπιδρά με το RNA. 11

Εισαγωγή Σταθεροποιείται πάνω στο β πτυχωτό φύλλο κυρίως μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων των καταλοίπων της και των Tyr114, Leu183 και Phe184 της επιφάνειας του β φύλλου. Ωστόσο, η έλικα α3 είναι κατά κύριο λόγο υδρόφιλη και προεξέχει προς το υδατικό διάλυμα, μακριά από το σώμα της επικράτειας. Αυτή η είναι μία ασυνήθιστη χωρική διάταξη σε σχέση με το υπόλοιπο μόριο, που δεν έχει παρατηρηθεί σε άλλα RRM. Τα συντηρημένα RNP μοτίβα (113-VYIKGF-118 και 151-KGSIFVVF-158) του RRM1 που εντοπίζονται στο κεντρικό ζευγάρι β κλώνων, περιέχουν δύο από τα τρία αρωματικά κατάλοιπα (Tyr114 και Phe155) που εμφανίζουν μεγάλη συντήρηση στα RRM μοτίβα και μπορούν να αλληλεπιδρούν μη ομοιοπολικά με τις βάσεις του RNA (base stacking interactions). Υπενθυμίζεται όμως ότι η Tyr114 συμμετέχει σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με την α3 έλικα. Στην πιθανή περίπτωση που το κατάλοιπο αυτό συμμετέχει στην αλληλεπίδραση με το RNA, θα πρέπει να συμβαίνει μετατόπιση της α3 έλικας (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Δομή του La motif (αριστερά) και του RRM1 (δεξιά) της ανθρώπινης πρωτεΐνης La από φασματοσκοπία NMR [26]. Οι έλικες (μπλε) αποτελούν ενθέσεις στις κλασικές αναδιπλώσεις winged helix και RRM αντίστοιχα. Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου της ανθρώπινης La NTD με το 9μερές RNA UGCUGUUUU OH, κατέρριψε τη θεωρία που ήθελε το συντηρημένο RRM μοτίβο να ευθύνεται για την αναγνώριση της αλληλουχίας UUU OH. Αποκάλυψε πως η ανθρώπινη πρωτεΐνη δεν χρησιμοποιεί το RRM για την εξειδικευμένη αναγνώριση της αλληλουχίας 12

Εισαγωγή 3 UUU OH, παρά μόνο για να δημιουργήσει μία σχισμή μεταξύ της β πτυχωτής επιφάνειάς και της δομής winged helix, στην οποία θα εγκολπωθεί το συγκεκριμένο RNA [27]. Έχει ενδιαφέρον ότι αυτή η κατάσταση δέσμευσης, αφήνει τις επιφάνειες που τυπικά χρησιμοποιούνται από τα δύο αυτά μοτίβα για τη δέσμευση των νουκλεϊκών οξέων, ελεύθερες για άλλες πιθανές αλληλεπιδράσεις (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Κρυσταλλική δομή του συμπλόκου LaNTD:AUAAUUU. Το ολιγονουκλεοτίδιο (πράσινο χρώμα), εισάγεται στη σχισμή μεταξύ του La motif και του RRM1. Οι τυπικές θέσεις RNA δέσμευσης αυτών των μοτίβων υποδεικνύονται με κίτρινους σωλήνες που αντιπροσωπεύουν τα RNA που δεσμεύονται από την SelB και την PABP [28]. Κρυσταλλική ανάλυση του ίδιου τομέα (NTD) με μία σειρά από μονόκλωνα RNA, τα τρία εκ των οποίων προσομοιάζουν την 3 ακόλουθη αλληλουχία του trna Met, παρέχει πιο λεπτομερείς πληροφορίες [28]. Από τη σύγκριση των διάφορων συμπλόκων που μελετήθηκαν, αποκαλύφθηκε ότι οι δύο και όχι οι τρεις, τελευταίες ουριδίνες του 3 άκρου του RNA, αλληλεπιδρούν σταθερά με την πρωτεΐνη. Από αυτές τις δύο, μόνο η δεύτερη U -2, συμμετέχει σε ειδικές αλληλεπιδράσεις (base-specific contacts). Η U -1 φαίνεται να συνεισφέρει στη δέσμευση με τρόπο ανεξάρτητο από τη βάση. Η δέσμευσή της στην πρωτεΐνη στηρίζεται σε δεσμούς υδρογόνου μεταξύ του φωσφορικού σκελετού του RNA και 13

Εισαγωγή του La motif. Η ίδια μελέτη, έφερε για πρώτη φορά στο φως μία διαμορφωτική αλλαγή που πραγματοποιείται στην πρωτεΐνη όταν αυτή δεσμεύει RNA. Τα κατάλοιπα 102-110 που ενώνουν τις δύο επικράτειες (La motif και RRM1), είναι αποδιαταγμένα στην ελεύθερη μορφή της πρωτεΐνης, αλλά παρουσία δεσμευμένου RNA σχηματίζουν μία δομή α-έλικας. Πειράματα NMR, έδειξαν πως η C- τελική περιοχή (CTD) της ανθρώπινης πρωτεΐνης La, περιλαμβάνει μία σφαιρική δομή (κατάλοιπα 231-325) που γειτονεύει ανοδικά με μία σύντομη ευκίνητη περιοχή (κατάλοιπα 225-230) και καθοδικά με ένα μακρύ και ευκίνητο C- τελικό άκρο [29, 30]. Τα κατάλοιπα 225-334 περιλαμβάνουν το δεύτερο άτυπο RRM μοτίβο της ανθρώπινης πρωτεΐνης. Το άτυπο αυτό RRM, χαρακτηρίζεται από την απουσία αρωματικών καταλοίπων που εξέχουν από τη β πτυχωτή επιφάνεια σε ένα τυπικό RRM μοτίβο. Αντί αυτών, πλευρικές αλυσίδες όξινων αμινοξέων (D263, E270, E304) διακοσμούν την β πτυχωτή επιφάνεια του άτυπου μοτίβου [30]. Παρότι όξινα αμινοξέα μπορεί να υπάρχουν σε αντίστοιχες θέσεις και άλλων RRM μοτίβων, είναι ασυνήθιστο να υπάρχουν ταυτόχρονα και στις τρεις αυτές θέσεις [21]. Ένα ακόμα στοιχείο του άτυπου RRM μοτίβου που το διαφοροποιεί από τα συμβατικά RRM, είναι μία μακριά α-έλικα που υπάρχει στο C- τελικό άκρο του μοτίβου (κατάλοιπα 308-325). Αυτή η έλικα (α3), περιλαμβάνει τα συντηρημένα κατάλοιπα που σύμφωνα με άλλη μελέτη ευθύνονται για την πυρηνική παρακράτηση (NRE) [31]. Ενδεχομένως η παρουσία των συγκεκριμένων αμινοξέων σε αυτή την α-έλικα να είναι σημαντική για τη λειτουργία τους. Λαμβάνοντας υπόψη την εγγύτητα της α3 έλικας στην επιφάνεια δέσμευσης του RNA καθώς και το γεγονός ότι σε ένα παρόμοιο RRM μοτίβο της πρωτεΐνης U1A η θέση της αντίστοιχης έλικας αλλάζει μετά από δέσμευση του RNA, μπορεί κανείς να υποθέσει πως η λειτουργία του NRE που εδράζεται στην α3 έλικα, ρυθμίζεται από τη δέσμευση του RNA. 14

Εισαγωγή Εικόνα 5. Δομή της C-τελικής περιοχής της ανθρώπινης πρωτεΐνης (κατάλοιπα 225-334). (A) Υπέρθεση είκοσι δομών. Το N- τελικό και το C- τελικό άκρο της σφαιρικής δομής εμφανίζονται αποδιαταγμένα και ευκίνητα. (Β) Απεικόνιση κορδέλας της τελικής δομής [30]. Η πρωτεΐνη La του T. brucei Το La motif της ομόλογης πρωτεΐνης του T. brucei αναδιπλώνεται σε μία δομή παρόμοια με winged helix (Εικόνα 6) [32]. Η μελέτη για την κρυσταλλική δομή του La motif στο T. brucei, έδειξε ότι μέσα σε αυτό το μοτίβο υπάρχει μία συντηρημένη περιοχή αρωματικών αμινοξέων η οποία φαίνεται να ευθύνεται για την αλληλεπίδραση με το RNA [32]. Επιπλέον, αποκάλυψε ότι ένα συντηρημένο κατάλοιπο ασπαραγινικού οξέως (το D27 που αντιστοιχεί στο D33 της ανθρώπινης La), είναι καθοριστικό για την ιδιότητα της πρωτεΐνης να ξεχωρίζει τα RNA που φέρουν 3 -ΟΗ από αυτά που φέρουν 3 -PO 4. Χάρις σε αυτό το διαχωρισμό, η πρωτεΐνη La αναγνωρίζει τα νεοσυντιθέμενα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ και τα ξεχωρίζει από τα μόρια που έχουν υποστεί ενζυμική αποικοδόμηση και περιέχουν 3 - PO 4 άκρο. 15

Εισαγωγή Εικόνα 6. (Α) Κρυσταλλική δομή του La motif από την ομόλογη πρωτεΐνη La του οργανισμού T. brucei. (Β) Απεικόνιση κορδέλας του Winged HTH μοτίβου που παρατηρείται στην επικράτεια δέσμευσης Ζ-DNA της απαμινάσης της αδενοσίνης (ADAR1). To συγκεκριμένο μοτίβο, συνήθως αποτελείται από τρεις α-έλικες και μία β-πτυχωτή επιφάνεια τριών αντιπαράλληλων κλώνων. Δύο από τις τρεις Ν-τελικές έλικες καθώς και η Η4 του La motif μπορούν να θεωρηθούν ως παρεμβολές στην κλασική τοπολογία του Winged HTH [32]. Μέχρι σήμερα, η πλήρης δομή της πρωτεΐνης La παραμένει άγνωστη. Η τμηματική μελέτη των επικρατειών της πρωτεΐνης La από τον άνθρωπο και το T. brucei όμως έχει φέρει στο φως σημαντικά στοιχεία για τη δομή της πρωτεΐνης και τη δέσμευσή της με συνθετικά ολιγο(u) μονόκλωνα RNA. Νέα πειραματικά δεδομένα καταρρίπτουν τις κρατούσες θεωρίες για τον τρόπο αναγνώρισης και δέσμευσης του RNA, καταδεικνύοντας ταυτόχρονα την ανάγκη για περαιτέρω μελέτη. 3. Ανώτερες δομές διαμόρφωσης της πρωτεΐνης La Με τη χρήση χρωματογραφίας μοριακής διήθησης βρέθηκε ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη La μπορεί να σχηματίζει ομοδιμερή [17, 33]. Η περιοχή που ευθύνεται για τον διμερισμό της πρωτεΐνης τοποθετήθηκε μεταξύ των καταλοίπων 293 και 348 [17]. Ωστόσο, πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) έδειξαν ότι το τμήμα 225-408 της 16

Εισαγωγή ανθρώπινης πρωτεΐνης το οποίο περιείχε την παραπάνω περιοχή, δεν σχηματίζει διμερή σε διάλυμα [30]. Στην ίδια μελέτη, η πιθανότητα ολιγομερισμού εξετάστηκε και με αναλυτική υπερφυγοκέντρηση. Τόσο τμήματα του C- τελικού άκρου όσο και ολόκληρη η ανθρώπινη πρωτεΐνη εμφανίζονταν ως μονομερή. Τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να εξηγηθούν αν η πρωτεΐνη La ομοδιμερίζεται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από αυτές που χρησιμοποιήθηκαν στην τελευταία μελέτη. Ωστόσο, σημειώνεται ότι η ερμηνεία των αποτελεσμάτων από την χρωματογραφία μοριακής διήθησης λαμβάνει ως δεδομένο ότι η υπό μελέτη πρωτεΐνη είναι φύσει σφαιρική όπως οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται ως πρότυπα μοριακών βαρών. Είναι πιθανό λοιπόν, η εξαιρετικά ευκίνητη ουρά των 83 αμινοξέων [30], να οδήγησε σε υπερεκτίμηση του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης στη χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Επιπλέον, η δυνατότητα διμερισμού που αποδόθηκε στο τμήμα 293-348 υπό αποδιατακτικές συνθήκες σε μελέτες ανοσοαποτύπωσης [17], ενδεχομένως να οφείλεται στην πολύ βασική φύση του συγκεκριμένου πεπτιδίου που το κάνει επιρρεπές σε μη ειδικές αλληλεπιδράσεις με όξινες περιοχές της GST-La που χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής. Παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων ανθρώπινης πρωτεΐνης La σε Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA), συχνά εμφανίζονται μικρές ζώνες πάνω από το κυρίως σύμπλοκο που παρατηρείται [30]. Αυτές οι επιπλέον ζώνες μπορεί να υποδηλώνουν ότι o διμερισμός της La μεσολαβείται από τη δέσμευση του RNA ή ότι ένα δεύτερο μόριο RNA δεσμεύεται από το μονομερές της πρωτεΐνης. Σε κάθε περίπτωση, η φυσιολογική σημασία αυτών των αλληλεπιδράσεων δεν είναι ακόμα ξεκάθαρη και οι μέχρι τώρα ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη La αλληλεπιδρά κυρίως ως μονομερές με ένα μόνο μόριο RNA. 4. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης La Πειράματα μεταβολικής σήμανσης, έχουν δείξει ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη La και οι ομόλογες πρωτεΐνες των S. cerevisiae και S. pombe φωσφορυλιώνονται in vivo [6, 34, 35]. Στα πειράματα αυτά, ενεργές καλλιέργειες κυττάρων HeLa, S. cerevisiae και S. pombe αναπτύχθηκαν παρουσία ραδιενεργού ορθοφωσφορικού. Στη συνέχεια, τα κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα εναντίον της La. Η παρουσία ραδιοσημασμένης πρωτεΐνης στο ανοσοκατακρήμνισμα σημαίνει πως η La 17

Εισαγωγή φωσφορυλιώνεται in vivo. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη La φωσφορυλιώνεται σε πολλές θέσεις, οι οποίες φαίνεται να βρίσκονται εντός του C-τελικού άκρου [34]. Μέχρι σήμερα, τέσσερις θέσεις φωσφορυλίωσης έχουν χαρτογραφηθεί για την ανθρώπινη πρωτεΐνη. In vivo, περισσότερο από το 85% της πρωτεΐνης φαίνεται να είναι φωσφορυλιωμένο στη σερίνη 366 (θέση φωσφορυλίωσης από την Casein Kinase II, CKII) [36, 37]. Επιπλέον, η πρωτεΐνη μπορεί να φωσφορυλιωθεί στη θρεονίνη 302, στη σερίνη 325 και στη θρεονίνη 362 [37]. Σύμφωνα με την ομοπαράθεση των αλληλουχιών των La πρωτεϊνών των σπονδυλωτών καμία από τις θέσεις φωσφορυλίωσης δεν φαίνεται να είναι συντηρημένη. Πειράματα με χρήση ανάλυσης NMR που πραγματοποιήθηκαν σε τμήματα του C- τελικού άκρου της ανθρώπινης πρωτεΐνης, ανέδειξαν μία σφαιρική δομή που αποτελείται από τα κατάλοιπα 231-325 [29]. Η δομή αυτή φαίνεται να συνορεύει ανοδικά με ένα μικρό ευκίνητο κομμάτι (κατάλοιπα 225-230) και καθοδικά με ένα μακρύ ευκίνητο C- τελικό άκρο (κατάλοιπα 326-408). Αποκαλύφθηκε επίσης ότι η κύρια θέση φωσφορυλίωσης της ανθρώπινης πρωτεΐνης, η σερίνη 366, βρίσκεται μέσα σε μία αποδιαταγμένη και ευκίνητη περιοχή του C- τελικού άκρου. Αν και ο ρυθμιστικός μηχανισμός της συγκεκριμένης φωσφορυλίωσης δεν έχει ακόμα εξακριβωθεί, εικάζεται πως η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή επηρεάζει την επαφή με ορισμένα RNA ή τις αναδιπλώσεις της πρωτεΐνης που τίθενται διαθέσιμες παρουσία δεσμευμένου RNA. 5. Μελέτες δέσμευσης μορίων RNA από την πρωτεΐνη La 5.1 Χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης La που συμβάλλουν στην αναγνώριση του RNA Ανθρώπινη πρωτεΐνη La Μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι ένα Ν- τελικό τμήμα της ανθρώπινης πρωτεΐνης αποτελούμενο από το La motif, το RRM1 και περίπου 17 παρακείμενα αμινοξέα, μπορεί να δεσμεύει τόσο ολιγο(u) RNA [38], όσο και ανθρώπινα Y RNA [16, 39] με συγγένεια συγκρίσιμη με αυτήν της ολόκληρης πρωτεΐνης. Τόσο το La motif όσο και το πρώτο RRM μοτίβο της ανθρώπινης πρωτεΐνης φαίνεται να παίζουν καθοριστικό ρόλο για τη δέσμευση στο RNA. Αν και αναφέρεται ότι το απομονωμένο La motif δεν δεσμεύει RNA [40], μικρές 18

Εισαγωγή σημειακές μεταλλάξεις σε αυτό το μοτίβο μπορούν να μειώσουν σημαντικά τη συγγένεια της ανθρώπινης πρωτεΐνης για το RNA [16, 41]. Ωστόσο, σε υψηλές συγκεντρώσεις ανθρώπινης La από την οποία απουσιάζει το La motif, η La εξακολουθεί να δεσμεύει RNA [16], πράγμα που σημαίνει ότι ένα μέρος τουλάχιστον από τη δεσμευτική ικανότητα της πρωτεΐνης παρέχεται από το RRM1. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε πειράματα δομικού χαρακτηρισμού του συμπλόκου La motif-rrm1:rna φάνηκε πως οι επαφές με τις τερματικές ουριδίνες γίνονται μέσω του La motif, ενώ το RRM1 συμμετέχει στη δέσμευση με μία μη ειδική αλληλεπίδραση με τον φωσφορικό σκελετό του RNA [27]. Ενώ το La motif και το RRM1 παίζουν σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με τα νεοσυντιθέμενα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ που περιέχουν το χαρακτηριστικό 3 UUU OH, το RRM1 μαζί με το RRM2 είναι πιθανό να συνεργάζονται για την εσωτερική αναγνώριση αλληλουχιών που προέρχονται από τον ιό της ηπατίτιδας B [33] και όλα μαζί τα μοτίβα La motif, RRM1 και RRM2 να συνεργάζονται για την αλληλεπίδραση με το RNA του ιού της ηπατίτιδας C [42, 43] (Εικόνα 7). Φαίνεται λογική λοιπόν η υπόθεση ότι η La ρυθμίζει την μετάφραση κυτταρικών και ιικών mrna μέσω του RRM1 και RRM2. Παρότι το C- τελικό άκρο της ανθρώπινης La δεν είναι απαραίτητο για την ειδική δέσμευση του UUU OH, περιοχές μέσα σε αυτό μπορεί να συνεισφέρουν στην αναγνώριση του RNA. Προσθήκη του C- τελικού RRM ή ολόκληρου του C- τελικού άκρου στο Ν- τελικό τμήμα La motif RRM1, μειώνει τη δεσμευτική ικανότητα της ανθρώπινης La στο κατάλοιπα ουριδίνης [38], γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει ότι το δεύτερο RRM μοτίβο του C- τελικού άκρου ρυθμίζει τη δέσμευση στο RNA [38]. Το C- τελικό άκρο των La πρωτεϊνών στα σπονδυλωτά, περιλαμβάνει επίσης μία αλληλουχία Walker A (μοτίβο δέσμευσης ATP) [3]. Ωστόσο τόσο το ATP όσο και ανάλογα του ATP που δεν μπορούν να υποστούν υδρόλυση, δεν έχουν καμία επίδραση στη συγγένεια της ανθρώπινης πρωτεΐνης για τα κατάλοιπα ουριδίνης [38]. Αντιθέτως, έχει προταθεί πως η συγκεκριμένη αλληλουχία έρχεται σε επαφή με το 5 τριφωσφορικό άκρο που υπάρχει σε όλα τα νεοσυντιθέμενα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ [44-46]. Στα πειράματα αυτά, ολόκληρη η πρωτεΐνη La ή κομμάτια αυτής εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να προστατεύουν το 5 άκρο των πρόδρομων trna από την απομάκρυνσή του από την RNase P. Καθώς τα μεταλλάγματα από τα οποία έλλειπε το μοτίβο Walker A, δεν έδωσαν αποτέλεσμα σε αυτή τη δοκιμασία, προτάθηκε πως το μοτίβο αυτό παίζει ρόλο στη σύνδεση με το 5 τριφωσφορικό άκρο [44]. Ωστόσο, άμεση 19

Εισαγωγή αλληλεπίδραση μεταξύ του 5 τριφωσφορικού άκρου και του μοτίβου Walker A δεν έχει ακόμα αποδειχθεί. Ενδιαφέρον προκαλεί το ότι ακόμη και αν όλες οι ομόλογες La πρωτεΐνες από τη ζύμη μέχρι τον άνθρωπο δεσμεύουν τα πρόδρομα trnas, η χαρακτηριστική αλληλουχία GXXXXXGKX του μοτίβου Walker A βρίσκεται μόνο στις πρωτεΐνες των σπονδυλωτών. Εφόσον για τις υπόλοιπες La πρωτεΐνες δεν έχει αναφερθεί ότι προστατεύουν τα πρόδρομα trna από την RNase P, μία υπόθεση που μπορεί να γίνει είναι ότι μόνο οι πρωτεΐνες των σπονδυλωτών μπορούν να συνδεθούν με το 5 τριφωσφορικό άκρο. Εναλλακτικά, επειδή τα υπόλοιπα αμινοξικά κατάλοιπα της σύντομης βασικής περιοχής, εμφανίζουν συντήρηση στα ασπόνδυλα [5, 6], θα μπορούσαν αυτά να μεσολαβούν στη σύνδεση με το 5 τριφωσφορικό άκρο αντί του Walker A. Εικόνα 7. (Α) Οργάνωση επικρατειών της ανθρώπινης πρωτεΐνης La. (B) Κρυσταλλική δομή του La motif-rrm1 σε σύμπλοκο με ένα 3 oligou ssrna (PDB ID 2VOP) και δομή του απομονωμένου RRM2 σε διάλυμα (PDB ID 1OWX). Μία διακεκομμένη γραμμή αντικαθιστά το συνδετικό κομμάτι μεταξύ του RRM1 και του RRM2. Με κόκκινο αστέρι υποδεικνύονται οι επιφάνειες αλληλεπίδρασης με το RNA πάνω σε κάθε επικράτεια. (C) Σχηματική αναπαράσταση των επικρατειών και των δευτεροταγών δομών του HCV IRES. Η επικράτεια ΙV δεσμεύεται από την ανθρώπινη La [42]. 20

Εισαγωγή Επειδή το C- τελικό άκρο της ανθρώπινης πρωτεΐνης La περιέχει αρκετές θέσεις φωσφορυλίωσης, μελέτες επιχείρησαν να διευκρινίσουν αν η φωσφορυλίωση της ανθρώπινης πρωτεΐνης ρυθμίζει τη δέσμευση στο RNA. Σε μία από αυτές τις μελέτες, η φωσφορυλίωση της La είχε ελάχιστη επίδραση στη συγγένεια για το RNA [36], ενώ σε μία άλλη παρατηρήθηκε 2 φορές μικρότερη συγγένεια μετά από φωσφορυλίωση με την κινάση της καζεΐνης [38]. Έτσι η φωσφορυλίωση μπορεί να έχει μία μικρή επίδραση στη δεσμευτική συγγένεια της ανθρώπινης πρωτεΐνης για το RNA. Η πρωτεΐνη La του S. cerevisiae Σε συμφωνία με τα παραπάνω, η φωσφορυλιωμένη και μη φωσφορυλιωμένη μορφή της ομόλογης πρωτεΐνης του S. cerevisiae, παρουσιάζουν παρόμοια συγγένεια σύνδεσης για το RNA [47]. Παρόλα αυτά, η φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη του S. cerevisiae εκδηλώνει ελαφρώς μεγαλύτερη ειδικότητα όσον αφορά τη διάκριση μεταξύ των RNA που φέρουν UUU OH ή UU p στο 3 άκρο, υποδηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση μπορεί να έχει μία μικρή συμβολή στην εξειδικευμένη δέσμευση της La στο RNA [47]. Επιπλέον, το C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης του S. cerevisiae φαίνεται πως μπορεί να αλληλεπιδρά με το anticodon loop ενός πρόδρομου μορίου trna [48]. Η πρωτεΐνη La του T. brucei Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στην ομόλογη πρωτεΐνη του T. brucei, αποκάλυψαν μία χαρακτηριστική περιοχή αρωματικών αμινοξέων στο La motif, η οποία φαίνεται να έχει καθοριστική σημασία για τη δέσμευση του RNA [32]. Μεταλλάξεις στα συγκεκριμένα αμινοξέα είχαν σαν αποτέλεσμα τη μείωση της ειδικότητας που παρουσιάζει η πρωτεΐνη για το UUU OH [32]. 21

Εισαγωγή 5.2 Αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από την πρωτεΐνη La Παρότι τα κατάλοιπα ουριδίνης στο 3 άκρο των RNA υποστρωμάτων, αποτελούν καθοριστικό παράγοντα για τη δέσμευση από την πρωτεΐνη La, αυτή φαίνεται να αναγνωρίζει και άλλα χαρακτηριστικά της δομής του RNA. Παρατηρήθηκε ότι ένα ώριμο trna ζύμης, που περιέχει πρόσθετες ουριδίνες στο 3 άκρο του, δεσμευόταν λιγότερο σταθερά στην ανθρώπινη πρωτεΐνη από το αντίστοιχο αγρίου τύπου πρόδρομο trna [49]. Επίσης, αρκετά από τα RNA που δεσμεύονται από τη La μέσα στα κύτταρα δεν φέρουν τερματικά κατάλοιπα ουριδίνης. Αν και τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά που συνεισφέρουν στη δέσμευσή ενός RNA από τη La δεν έχουν διερευνηθεί συστηματικά, έχει αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη La των σπονδυλωτών δεσμεύει ορισμένες μακριές δομές στελέχους στις οποίες δεν υπάρχουν τερματικές ουριδίνες [41, 50]. Μεταλλάξεις στο TAR RNA του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) που διαταράσσουν τη δομή στελέχους, ανέστειλαν τη δέσμευση από την πρωτεΐνη La [41]. Ενδεχομένως το εκτεταμένο στέλεχος υποδοχής (acceptor stem) που υπάρχει σε όλα τα πρόδρομα trna, λόγω της συμπληρωματικότητας μεταξύ της πλούσιας σε πουρίνες 5 οδηγού αλληλουχίας και της πλούσιας σε πυριμιδίνες 3 ακόλουθης αλληλουχίας [51], να συμβάλλει στη σταθεροποίηση της δέσμευσης από τη La. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η ανθρώπινη La αναγνωρίζει τις θέσεις εσωτερικής εκκίνησης της μετάφρασης (IRES) που υπάρχουν στις 5 UTR πολλών κυτταρικών και ιικών RNA [52-56] και χαρακτηρίζονται από πολύπλοκες αναδιπλώσεις, πλούσιες σε δομές στελέχους-βρόχου (stem-loop). Επιπλέον, αναφέρεται πως η ανθρώπινη πρωτεΐνη La δεσμεύει πρόδρομα μόρια trna που περιέχουν ένα 5 τριφωσφορικό άκρο, δύο έως και τρεις φορές πιο αποτελεσματικά από τα αντίστοιχα αποφωσφορυλιωμένα [44]. Internal Ribosome Entry Sites (IRES) Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η μετάφραση ξεκινάει από το 5 άκρο ενός mrna καθώς η αναγνώριση της 5 καλύπτρας είναι απαραίτητη για την συναρμολόγηση του συμπλόκου εκκίνησης της μετάφρασης (cap-dependent translation) στην πλειοψηφία των περιπτώσεων. Ωστόσο, η ύπαρξη ενός σημείου δέσμευσης του ριβοσώματος καθοδικά του σημείου έναρξης της μετάφρασης (Internal Ribosome Entry Site, IRES) μπορεί να παρακάμψει τον κλασσικό τρόπο εκκίνησης της μετάφρασης (IRES mediated translation). Ο 22

Εισαγωγή όρος (IRES) χρησιμοποιείται για να περιγράψει μία νουκλεοτιδική αλληλουχία στην 5 αμετάφραστη περιοχή (5 UTR) ενός mrna, η οποία επιτρέπει την έναρξη της μετάφρασης από εσωτερικό σημείο. Τέτοιες αλληλουχίες ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά το 1988 στα RNA των ιών της πολιομυελίτιδας και της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας από τους Sonenberg N. και Wimmer E. αντίστοιχα [57, 58]. Περιγράφονται ως ξεχωριστές περιοχές στο mrna, πλούσιες σε αναδιπλώσεις, οι οποίες έχουν την ικανότητα να προσελκύουν το ευκαρυωτικό ριβόσωμα και να διευκολύνουν την έναρξη της μετάφρασης (Εικόνα 8). Η διαδικασία αυτή έγινε γνωστή ως εσωτερική εκκίνηση της μετάφρασης. Συνήθως τέτοιες περιοχές υπάρχουν στο γενετικό υλικό των RNA ιών. Μέχρι το 2009 όμως, είχαν ταυτοποιηθεί πάνω από 60 mrna θηλαστικών που περιείχαν IRES. Στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις, τα στοιχεία αυτά εντοπίζονται σε mrna που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σχετικές με την επιβίωση των κυττάρων κάτω από συνθήκες στρες. Εικόνα 8. Σχηματική απεικόνιση της 5 αμετάφραστης περιοχής (UTR) του RNA του ιού της πολιομυελίτιδας [59]. Με πράσινο οριοθετείται το στοιχείο IRES. Με κόκκινο βέλος υποδεικνύεται η θέση εισόδου για το ριβόσωμα. Στο 5 άκρο, στη δομή τριφυλλιού (clover-leaf) δεσμεύονται δύο σημαντικές πρωτεΐνες για τη μετάφραση, η κυτταρική Poly(rC) Binding Protein και η ιική 3CD. 23

Εισαγωγή 6. Ποσότητα και υποκυττάριος εντοπισμός Η ανθρώπινη La εκτιμάται ότι υπάρχει σε 2x10 7 αντίγραφα ανά κύτταρο [60]. Αυτό σημαίνει ότι είναι σχεδόν τόσο άφθονη όσο μία ριβοσωμική πρωτεΐνη. Πειράματα με ανοσοφθορισμό αποκάλυψαν ότι φαινομενικά σε όλους τους κυτταρικούς τύπους και σε όλα τα είδη, η La περιορίζεται κατά κύριο λόγο στον πυρήνα [40]. Μέσα στον πυρήνα, η La εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα όσο και στον πυρηνίσκο [61, 62]. Παρά το γεγονός ότι υπό φυσιολογικές για το κύτταρο συνθήκες, η La εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα, ένα ποσοστό αυτής εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα σε ορισμένες περιπτώσεις όπως είναι η μόλυνση από ιούς ή η ενεργοποίηση ενός αποπτωτικού μονοπατιού. Κατά την μόλυνση κυττάρων θηλαστικών από τον ιό της πολιομυελίτιδας για παράδειγμα, ένα τμήμα της πρωτεΐνης αναδιανέμεται στο κυτταρόπλασμα [63]. Αυτό συμβαίνει επειδή μία πρωτεάση του ιού (poliovirus-specific protease 3C, 3Cpro), αποκόπτει κομμάτι της C-τελικής περιοχής της La, απομακρύνοντας έτσι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού [64]. Με παρόμοιο τρόπο, η La εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της απόπτωσης σε κύτταρα θηλαστικών. Σε αυτή την περίπτωση, η απομάκρυνση του σήματος πυρηνικού εντοπισμού οφείλεται στην ενεργοποίηση του μονοπατιού των κασπασών [23, 65, 66], με πιθανότερη την εμπλοκή της κασπάσης 3 [23]. 7. Οι διαφορετικοί ρόλοι της πρωτεΐνης La στο κύτταρο Τόσο γενετικές όσο και βιοχημικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι ο σημαντικότερος ρόλος της La είναι να προστατεύει το 3 άκρο των πρόδρομων μικρών RNA από τη δράση εξωνουκλεασών [67, 68]. Αυτή η μεσολαβούμενη από τη La σταθεροποίηση του 3 άκρου, έχει διαφορετικές επιπτώσεις για τα διάφορα RNA που δεσμεύει. Δέσμευση της La στο 3 άκρο των πρόδρομων trna επηρεάζει την σειρά και τον μηχανισμό με τον οποίο απομακρύνεται η 3 ακόλουθη αλληλουχία [67] και μπορεί επίσης να ρυθμίζει την αφαίρεση της 5 οδηγού αλληλουχίας από την RNase P [44, 45]. Δέσμευση της La σε άλλα μικρά μόρια RNA μπορεί να συμβάλλει στη συναρμολόγηση ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων (RNP) [69, 70], στη διατήρηση των πρόδρομων RNA εντός του πυρήνα [50, 71, 72], ή να σταθεροποιεί την δομή των μορίων αυτών [67]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η La μπορεί 24

Εισαγωγή να ρυθμίζει την μετάφραση ορισμένων κυτταρικών και ιικών mrna [63, 73]. Ωστόσο έχει αναφερθεί ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη La μπορεί να δεσμεύεται in vivo και στα ίδια τα γονίδια που θα μεταγραφούν από την RNA πολυμεράση υποδηλώνοντας πως ίσως να ρυθμίζει τα μόρια αυτά και σε μεταγραφικό επίπεδο [74]. 7.1 H πρωτεΐνη La ως πιθανός μεταγραφικός παράγοντας της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ Ένας από τους πρώτους ρόλους που προτάθηκε για την πρωτεΐνη La ήταν αυτός του παράγοντα λήξης της μεταγραφής και ανακύκλωσης της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ. Έχει προταθεί ότι η πρωτεΐνη La επηρεάζει τόσο την ακρίβεια όσο και την αποτελεσματικότητα της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ [60]. Σε πειράματα όπου η La απομακρύνθηκε από εκχύλισμα HeLa κυττάρων, παρατηρήθηκε δραστική μείωση στην μεταγραφή των γονιδίων από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Τα ελάχιστα μετάγραφα που συντίθεντο απουσία της La, είχαν λιγότερα ουριδινικά κατάλοιπα στο 3 άκρο σε σχέση με τα μετάγραφα που συντίθεντο παρουσία της La. Αποκατάσταση των επιπέδων της La στο ίδιο εκχύλισμα, διέγειρε την μεταγραφή και επανέφερε το φυσιολογικό μέγεθος των μεταγράφων [60]. Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι προσθήκη καθαρισμένης ανθρώπινης La συνέβαλε στην απελευθέρωση των μεταγράφων και την επανεκκίνηση της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ [16, 75-77]. Ωστόσο, άλλες μελέτες αναφέρουν ότι η RNA πολυμεράση που είχε απομονωθεί από σπονδυλωτά, ήταν ικανή για ορθό τερματισμό και απελευθέρωση των μεταγράφων απουσία άλλων πρωτεϊνών [78-80]. Εκχυλίσματα από κύτταρα S. cerevisiae στα οποία είχε πραγματοποιηθεί γενετική αποσιώπηση της La, μπορούσαν να μεταγράφουν trna και U6 RNA γονίδια, όπως ακριβώς και τα εκχυλίσματα που προέρχονταν από αγρίου τύπου κύτταρα [67, 70]. Ομοίως, σε κυτταρικά εκχυλίσματα από Xenopus, η απουσία της La δεν φάνηκε να επηρεάζει την μεταγραφή των trna γονιδίων [81]. Και στον άνθρωπο όμως, η απουσία της La από ένα in vitro σύστημα μεταγραφής δεν επηρέασε τη μεταγραφή από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ [82]. Στην ίδια μελέτη, αναφέρεται πως έπειτα από προσθήκη της La, αυτή δεν φάνηκε να δεσμεύει μεταγραφικούς παράγοντες παρά μόνο τα νεοσυντιθέμενα RNA και δεν ενίσχυσε τον ρυθμό της μεταγραφής [82]. 25

Εισαγωγή Δεδομένου ότι η μεταγραφή σε εκχυλίσματα κυττάρων είναι αποτελεσματική ακόμα και απουσία ανιχνεύσιμης πρωτεΐνης La [81, 82], είναι σαφές ότι η La δεν απαιτείται για την μεταγραφή από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ in vitro. Επιπλέον, εφόσον η La δεν είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των S. cerevisiae και S. pombe [5-7], δεν μπορεί να απαιτείται για την μεταγραφή οποιουδήποτε βασικού μεταγράφου της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ σε αυτούς τους μύκητες. Ωστόσο, δεν αποκλείεται η πιθανή αλληλεπίδραση της La με συνιστώσες της μεταγραφικής μηχανής για τη ρύθμιση της μεταγραφής in vivo. 7.2 H πρωτεΐνη La απαιτείται για την ορθή πορεία ωρίμανσης των πρόδρομων trna Το μεταφορικό RNA (trna) Το trna διαδραματίζει έναν κεντρικό ρόλο στη βιολογία του κυττάρου. Λειτουργεί ως προσαρμοστής (adaptor), μεταξύ του mrna και της πρωτεΐνης κατά την ροή της γενετικής πληροφορίας από τα γονίδια στις πρωτεΐνες. Η αλληλεπίδρασή του με το mrna μέσα στο ριβόσωμα, έχει ως αποτέλεσμα την προσθήκη του αμινοξέος που μεταφέρει στην επεκτεινόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Μετά την αλληλούχιση του πλήρους γονιδιώματος του ανθρώπου ταυτοποιήθηκαν τουλάχιστον 497 γονίδια trna. Από τη μεταγραφή των γονιδίων αυτών προκύπτουν τα πρόδρομα μόρια trna (pre-trna). Τα πρόδρομα αυτά μόρια, φέρουν επιπρόσθετες αλληλουχίες στα 5 και 3 άκρα τους καθώς και εσωτερικά παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες, τα ιντρόνια. Για να προβιβαστούν σε λειτουργικά trna, υποβάλλονται σε μία πληθώρα μετά-μεταγραφικών τροποποιήσεων. Η ωρίμανση των πρόδρομων trna περιλαμβάνει πέντε κύρια στάδια: (1) την αφαίρεση της 5 οδηγού αλληλουχίας από το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο RNase P, (2) την αφαίρεση της 3 ακόλουθου αλληλουχίας από ένα συνδυασμό ενδονουκλεασών και εξωνουκλεασών, (3) την προσθήκη του CCA άκρου στους ευκαρυώτες και σε κάποια αρχαία, (4) το μάτισμα των ιντρονίων που διαθέτουν μερικά trna και (5) μία πλειάδα τροποποιήσεων σε πολλές διαφορετικές βάσεις [83, 84] (Εικόνα 9). 26

Εισαγωγή Το ώριμο μόριο trna αποτελείται κυρίως από διπλές έλικες, αλλά τα κύρια λειτουργικά του καθήκοντα εκτελούνται από βραχείες μονόκλωνες περιοχές. Στη μία άκρη του μορίου βρίσκεται ο βραχίονας του αντικωδικονίου ο οποίος αναγνωρίζει το αντίστοιχο κωδικόνιο του mrna στη 40S υπομονάδα του ριβοσώματος. Στην αντίθετη άκρη του μορίου, στο 3 άκρο, βρίσκεται η αλληλουχία CCA που συνδέεται με το αντίστοιχο αμινοξύ για να το μεταφέρει στην Α-θέση του ριβοσώματος. Το άκρο αυτό συνιστά τον βραχίονα υποδοχής του αμινοξέος (Εικόνα 10Εικόνα 10). Εικόνα 9. Στάδια ωρίμανσης πρόδρομου trna στον S. cerevisiae. Σε αντίθεση με τα σπονδυλωτά, το μάτισμα των ιντρονίων στη ζύμη πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα. Μετά το μάτισμα, ανάδρομη εισαγωγή του trna στον πυρήνα μπορεί να απαιτείται για περαιτέρω επεξεργασία. Ενδεχομένως η επανεξαγωγή του από τον πυρήνα να προϋποθέτει ότι το trna είναι κατάλληλα αναδιπλωμένο και αμινοακυλιωμένο [85]. 27

Εισαγωγή Εικόνα 10. Οι δίκλωνες και μονόκλωνες περιοχές του ώριμου trna σχηματίζουν μία δομή τριφυλλιού (Δεξιά). Αναδίπλωση αυτών των περιοχών στο χώρο, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μίας δομής που μοιάζει με ανάποδο L (αριστερά). Στην 3 περιοχή του Acceptor Stem δεσμεύεται το αμινοξύ, ενώ μέσω του Anticodon Loop το trna δεσμεύεται στο mrna (http://www.bio.miami.edu/). Στους μύκητες S. cerevisiae και S. pombe, η La δεν είναι απαραίτητη για την βιωσιμότητα [5-7]. Απουσία της La από κύτταρα S. cerevisiae οδηγεί σε μεταβολές τόσο στην σειρά όσο και στον μηχανισμό με τον οποίο θα απομακρυνθούν οι 5 και 3 επεκτάσεις από τα πρόδρομα μόρια trna [67] (Εικόνα 11). Σε αγρίου τύπου κύτταρα, το πρώτο βήμα της ωρίμανσης των πρόδρομων trna είναι η απομάκρυνση της 5 οδηγού αλληλουχίας από την ενδονουκλεάση RNase P. Έπειτα, η δεσμευμένη από την La 3 ακόλουθη αλληλουχία απομακρύνεται ενδονουκλεολυτικά από την RNase Z. Ωστόσο σε κύτταρα από τα οποία απουσιάζει η La, η 3 ακόλουθη αλληλουχία απομακρύνεται με εξωνουκλεολυτικό τρόπο (ενδεχομένως από την RNA εξωνουκλεάση Rex1) και ακολουθεί η αφαίρεση της 5 οδηγού αλληλουχίας από την RNase P [67]. Μετά την απομάκρυνση της 5 οδηγού αλληλουχίας από την RNase P, περαιτέρω εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση παράγει το ώριμο πλέον 3 άκρο [67]. Πειράματα σε εκχυλίσματα Xenopus [81] αλλά και σε εκχυλίσματα HeLa κυττάρων [44] επαληθεύουν την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση της 3 ακολούθου αλληλουχίας απουσία της La. Από τον μύκητα μέχρι τον άνθρωπο, φαίνεται πως η δέσμευση από τη La προστατεύει την 3 ακόλουθη αλληλουχία από την δράση εξωνουκλεασών και επηρεάζει το μονοπάτι της ωρίμανσης των πρόδρομων μορίων trna. 28

Εισαγωγή Εικόνα 11. Μοντέλο για την ωρίμανση του 3 άκρου των πρόδρομων μορίων trna. (Α) Σε κύτταρα αγρίου τύπου, η La προστατεύει το 3 άκρο από εξωνουκλεάσες. Το πρώτο συμβάν είναι η απομάκρυνση της 5 οδηγού αλληλουχίας από την RNase P ενώ η 3 ακόλουθη αλληλουχία απομακρύνεται από μία ενδονουκλεάση όπως η RNase Z. Σε κάποια άλλα πρόδρομα trna, η La είτε δεν δεσμεύεται καθόλου είτε αποδεσμεύεται επιτρέποντας την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση του 3 άκρου από την Rex1p. Μετά την προσθήκη του CCA, η Rex1p μπορεί να απομακρύνει την τερματική αδενοσίνη. (Β) Σε κύτταρα από τα οποία απουσιάζει η La, η Rex1p, η Rrp6p και άλλες εξωνουκλεάσες συμβάλλουν στην απομάκρυνση του 3 άκρου. Όπως και στα αγρίου τύπου, μία 3 ενδονουκλεάση μπορεί επίσης να συμμετέχει. Μετά την προσθήκη του CCA, η Rex1p συμμετέχει στη σήμανση του trna για καταστροφή από το εξώσωμα [9]. 29

Εισαγωγή Η επιλογή του μονοπατιού ωρίμανσης του 3 άκρου ενός πρόδρομου μορίου trna μπορεί να έχει συνέπειες στη μετέπειτα πορεία του μορίου. Απουσία της καταλυτικής υπομονάδας Trf4p του συμπλόκου TRAMP από κύτταρα S. cerevisiae, παρατηρείται συσσώρευση αμινοακυλιωμένων μορίων trna τα οποία έχουν ώριμα άκρα αλλά δεν έχουν υποστεί μάτισμα [9]. Φυσιολογικά, αυτά τα μη λειτουργικά μόρια trna, στοχοποιούνται από το σύμπλοκο TRAMP και οδηγούνται προς αποικοδόμηση μέσω του μονοπατιού της πυρηνικής επιτήρησης (nuclear surveillance). Η συσσώρευσή τους σε κύτταρα από τα οποία απουσιάζει η Trf4p όμως, απαιτεί επιπλέον την παρουσία της Rex1p, υποδηλώνοντας ότι τα συγκεκριμένα ελαττωματικά trna προκύπτουν ως συνέπεια της εξωνουκλεολυτικής αποικοδόμησης από την Rex1p. Καθώς η υπερέκφραση της ομόλογης πρωτεΐνης La του S. cerevisiae μειώνει τόσο την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση του pre-trna σε κύτταρα αγρίου τύπου, όσο και τη συσσώρευση των ελαττωματικών μορίων trna σε κύτταρα από τα οποία απουσιάζει η Trf4p [9], είναι πιθανό η La να ανταγωνίζεται την Rex1p για τη δέσμευση του 3 άκρου των πρόδρομων μορίων trna. Επομένως, μία συνέπεια της εξωνουκλεολυτικής αποικοδόμησης του 3 άκρου από την Rex1p είναι η παραγωγή ελαττωματικών RNA που πρέπει να στοχοποιηθούν από το σύμπλοκο TRAMP για να οδηγηθούν προς καταστροφή στο εξώσωμα. Ενώ στο μονοπάτι της επιτήρησης (trna surveillance), η αποικοδόμηση των trna είναι πλήρης και δεν αναμένεται να υπάρξουν παραπροϊόντα της αποικοδόμησης, εντούτοις σταθερά τμήματα διαφόρων μεγεθών που προέρχονται από τα μόρια trna (trna derived RNA fragments, trfs), έχουν εντοπιστεί τα τελευταία χρόνια. Τα τμήματα αυτά φαίνεται να προέρχονται από τη δράση ενδονουκλεασών τόσο στα ώριμα όσο και στα πρόδρομα μόρια trna. Παρότι οι μελέτες για την προέλευση και τη λειτουργία τους είναι ακόμα σε πρώιμα στάδια, έχει προταθεί ότι η δημιουργία τους μπορεί να οφείλεται σε μονοπάτια που ενεργοποιούνται κάτω από συνθήκες στρες [86]. Επίσης, υπάρχουν επαρκή στοιχεία που υποδηλώνουν ότι τα trf δεν αποτελούν απλά παραπροϊόντα της αποικοδόμησης των trna αλλά συμμετέχουν σε σημαντικές βιολογικές διαδικασίες [87]. Μερικοί από τους ρόλους που έχουν προταθεί για τα trf είναι η αναστολή της μετάφρασης, η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω RNA αποσιώπησης και η επαγωγή της απόπτωσης. Από τα μέχρι στιγμής στοιχεία, είναι δυνατή η κατηγοριοποίηση των trf σε 30

Εισαγωγή πέντε τάξεις ανάλογα με την περιοχή του trna από την οποία προέρχονται. Τα trna halves, προκύπτουν από ενδονουκλεολυτική πέψη στην θηλιά του αντικωδικονίου των ώριμων μορίων trna και περιλαμβάνουν το 3 μισό ή 5 μισό trna. Αυτές οι δύο τάξεις είναι τα μεγαλύτερα trfs που έχουν εντοπιστεί. Από ενδονουκλεολυτική πέψη στο D loop των ώριμων μορίων trna, προκύπτουν τα trf που περιέχουν το 5 άκρο ενώ από πέψη στο T loop προκύπτουν τα trf που περιέχουν το 3 άκρο συμπεριλαμβανομένου του CCA. Η τελευταία κατηγορία προκύπτει από την ενδονουκλεολυτική απομάκρυνση της 3 ακόλουθης αλληλουχίας των πρόδρομων μορίων trna. Συμπτωματικά, η περιοχή αυτή προστατεύεται μέσω δέσμευσης από την πρωτεΐνη La. Όπως ήδη αναφέρθηκε, απουσία της La, το συγκεκριμένο κομμάτι υπόκειται σε εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση. Το κομμάτι αυτό, έχει βρεθεί ότι παράγεται στο κυτταρόπλασμα μέσω πέψης από την 3 ενδονουκλεάση trnasez2 (ELAC2) και εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές αλλά όχι σε ιστούς. Επίσης έχει προταθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [88]. Ενδεχομένως λοιπόν, η ωρίμανση του 3 άκρου των πρόδρομων μορίων trna με ενδονουκλεολυτικό τρόπο μέσω δέσμευσης της La, να σχετίζεται με τη δημιουργία ορισμένων trfs. Παρότι η πρωτεΐνη La δεν είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό λειτουργικών ώριμων trna [6, 67], γίνεται απαραίτητη παρουσία μεταλλάξεων σε σημαντικά γονίδια trna ή σε άλλες βασικές συνιστώσες της βιογένεσης των trna. Για παράδειγμα, μεταλλάξεις στα βασικά γονίδια trna που κωδικοποιούν τα trna Ser CGA, trna Arg CCG και trna CGU Thr καθιστούν την ομόλογη πρωτεΐνη της La στον S. cerevisiae (την Lhp1p) απαραίτητη για την βιωσιμότητα των κυττάρων [67, 89]. Η La καθίσταται επίσης απαραίτητη σε κύτταρα S. cerevisiae που στερούνται του ενζύμου μεθυλοτρανσφεράση του trna, η οποία μεθυλιώνει την αδενοσίνη στη θέση 58 του ΤψC βρόχου πολλών ευκαρυωτικών trna [90-92]. 7.3 Ο ρόλος της πρωτεΐνης La στην προστασία και τον υποκυττάριο εντοπισμό πρόδρομων μικρών μορίων RNA Εκτός από τα πρόδρομα trna, δέσμευση από την La μπορεί να προστατεύσει και άλλα νεοσυντιθέμενα μικρά RNA από τη δράση 3 εξωνουκλεασών. Κύτταρα από τα οποία 31

Εισαγωγή απουσιάζει η πρωτεΐνη La, παρουσιάζουν αλλαγές τόσο στα επίπεδα όσο και στα μεγέθη ορισμένων πρόδρομων μικρών RNA. Στον S. cerevisiae, δέσμευση από την La σταθεροποιεί τα πρόδρομα μόρια τόσο των RNA του επανασυνδεοσώματος (spliceosome) U1, U2, U4, U5 όσο και των μικρών RNA που εντοπίζονται στον πυρηνίσκο (snorna) U3 [68, 69]. Αυτά τα RNA που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II, διαφέρουν από τα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ ως προς την σύνδεσή τους με τη La, καθώς αυτή δεν δεσμεύεται κατευθείαν στα νεοσυντιθέμενα μετάγραφα. Εν αντιθέσει, τα πρόδρομα αυτά μόρια υφίστανται πέψη από την RNase III και εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση του πολυουριδινικού άκρου τους προτού δεσμευτούν από την La [93-95]. Δέσμευση της La παρέχει προστασία στα πρόδρομα αυτά μετάγραφα, τα οποία είτε δεν ανιχνεύονται είτε ανιχνεύονται περικομμένα σε στελέχη από τα οποία απουσιάζει η πρωτεΐνη La [68, 69]. Παρότι η La δεν είναι απαραίτητη για την βιογένεση μικρών RNA στη ζύμη, ορισμένες μεταλλάξεις σε βασικές πρωτεΐνες των αντίστοιχων ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων (snrnps) καθιστούν την πρωτεΐνη La απαραίτητη για τα κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, μεταλλάξεις στην Sm και την Sm-like οικογένεια πρωτεϊνών καθιστούν την La απαραίτητη για τον S. cerevisiae [69, 70, 96]. Τα μέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών μοιράζονται έναν συντηρημένο τομέα γνωστό ως Sm motif. Στη ζύμη, δέσμευση των Sm πρωτεϊνών σε νεοσυντιθέμενα snrnas συμβάλλει στην επεξεργασία του 3 άκρου, την υπερμεθυλίωση της 5 καλύπτρας και προστατεύει τα RNAs από την αποικοδόμηση [95, 97-99]. Μετάλλαξη στο γονίδιο SMD1 που κωδικοποιεί την Sm D1 πρωτεΐνη, καθιστά την La απαραίτητη για τα κύτταρα του S. cerevisiae που καλλιεργούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες [69]. Στα κύτταρα αυτά, η La είναι απαραίτητη για τη συναρμολόγηση του U4 RNA στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο U4/U6 snrnp. Εφόσον το πρόδρομο U4 RNA και όχι το ώριμο, δεσμεύεται από την Smd1p in vitro, η La μπορεί να λειτουργεί σε αυτά τα κύτταρα σταθεροποιώντας το προτιμώμενο υπόστρωμα για την δέσμευση της Sm πρωτεΐνης [69]. Παρόμοια, επτά σχετιζόμενες πρωτεΐνες γνωστές ως Lsm (Like Sm) πρωτεΐνες, σχηματίζουν έναν επταμερή δακτύλιο ο οποίος δεσμεύει την πολυουριδινική περιοχή στο 3 άκρο του U6 snrna. Παρουσία μεταλλάξεων σε αυτές τις πρωτεΐνες, η La καθίσταται απαραίτητη για την σταθεροποίηση τα των νεοσυντιθέμενων U6 snrnas σε κύτταρα ζύμης [70, 96]. Σε κύτταρα σπονδυλωτών περίπου 10% του U6 snrna δεσμεύεται από την La πρωτεΐνη [100, 101]. Το δεσμευμένο από την La U6 RNA, ενδεχομένως να αντιπροσωπεύει 32

Εισαγωγή νεοσυντιθέμενο RNA καθώς περιλαμβάνει λιγότερα τροποποιημένα νουκλεοτίδια σε σχέση με το σύνολο των U6 RNA [100]. Επιπλέον, ενώ το δεσμευμένο από την La U6 snrna καταλήγει σε UUU OH, η πλειοψηφία των U6 RNAs στα σπονδυλωτά σχηματίζουν 2,3 φωσφορικό στο 3 άκρο τους [101, 102]. Έτσι, όπως και στη ζύμη, δέσμευση της La στα νεοσυντιθέμενα U6 snrnas μπορεί να σταθεροποιεί τα μόρια αυτά στα κύτταρα των ανώτερων ευκαρυωτών. Δεν είναι ακόμα σαφές όμως αν η La δεσμεύει τα πρόδρομα των U1, U2, U4 και U5 snrnas στα μετάζωα. Ένας πληθυσμός από U1 snrnas που είναι μεγαλύτερα από τo ώριμο U1 snrna, δεσμεύεται από την La στα κύτταρα σπονδυλωτών [103]. Επιπλέον, αναφέρεται πως αυτός ο πληθυσμός εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα [103]. Ωστόσο, κάτι τέτοιο δεν αποτελεί έκπληξη καθώς η μεγάλη πλειοψηφία των δεσμευμένων από την La RNAs, συμπεριλαμβανομένων των pre-trnas και των pre-5s rrna, μπορεί να διαρρεύσουν στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια αντίστοιχων διαδικασιών κλασμάτωσης [49, 104]. Ενδεχομένως δηλαδή, η La να δεσμεύει νεοσυντιθέμενα pre-u1 RNAs σε κύτταρα σπονδυλωτών αλλά κάτι τέτοιο δεν έχει επαληθευτεί ακόμα για τα νεοσυντιθέμενα U2, U4 και U5 snrnas στα μετάζωα. Τέλος, πρόσφατη μελέτη σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές αποκάλυψε πως η καθολική έκφραση των mirna προάγεται από την πρωτεΐνη La [10]. Σύμφωνα με την μελέτη αυτή, η ανθρώπινη πρωτεΐνη La δεσμεύεται στη δομή στελέχους-βρόχου των πρόδρομων μορίων mirna (pre-mirna) και τα προστατεύει από τη νουκλεολυτική αποικοδόμηση. Παρατηρήθηκε μάλιστα πως η La ανταγωνίζεται την Dicer για τη δέσμευση των συγκεκριμένων μορίων και πως οι δύο πρωτεΐνες παρουσιάζουν παρόμοια συγγένεια δέσμευσης στα pre-mirna. Γεγονός που υποδηλώνει ότι τα μόρια αυτά ανταλλάσσονται εύκολα μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Με αυτό τον τρόπο, η La εξασφαλίζει την ορθή ωρίμανση των pre-mirna από την Dicer. Επειδή τα νεοσυντιθέμενα μικρά RNAs που δεσμεύει η La είναι πυρηνικά ενώ τα ώριμα RNAs είναι συνήθως κυτταροπλασματικά, έχει από καιρό προταθεί ότι η δέσμευση από τη La, μπορεί να συμβάλλει στη διατήρηση των πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ στον πυρήνα [72]. Μελέτη που έγινε στον X. laevis έδειξε ότι όταν από το U6 snrna απουσιάζει η θέση δέσμευσης της La, δηλαδή η UUU OH -3, ένα ποσοστό 50% αυτού του RNA εξάγεται στο 33

Εισαγωγή κυτταρόπλασμα [71]. Ωστόσο, επειδή μόνο περίπου το 10% από το U6 snrna δεσμεύεται από την La στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους [70, 100, 101], προτάθηκε ότι είναι μάλλον απίθανο να ευθύνεται η La για την παραμονή της πλειοψηφίας των U6 snrnas μέσα στον πυρήνα. Αντιθέτως, είναι πιθανότερο να υπάρχουν και άλλοι παράγοντες, ανεξάρτητοι από τη La, που να αναγνωρίζουν το 3 άκρο του U6 snrna και να συμβάλλουν στην παραμονή του εντός του πυρήνα [71]. Αργότερα έγινε γνωστό ότι το Lsm πρωτεϊνικό σύμπλοκο δεσμεύει το 3 άκρο του ώριμου U6 snrna [105, 106]. Έτσι, αφαίρεση του 3 άκρου του U6 snrna, μπορεί να εμποδίζει την σταθερή δέσμευση του Lsm πρωτεϊνικού συμπλόκου. Πράγματι, πιο πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι σταθερή δέσμευση του επταμερούς συμπλόκου Lsm2-8 στο U6 snrna, είναι απαραίτητη για την συσσώρευση αυτού του RNA στον πυρήνα [107]. Η La, η οποία δεσμεύεται μόνο παροδικά στο πρόδρομο U6 snrna, έχει μία μικρότερη και από ότι φαίνεται έμμεση επίδραση στην διατήρηση του συγκεκριμένου RNA εντός του πυρήνα. Πιο ισχυρή ένδειξη για την συνεισφορά της La στην διατήρηση μικρών RNA εντός του πυρήνα, παρέχεται από μελέτες που αφορούν το ανθρώπινο Y1 RNA. Τα περισσότερα από αυτά τα μόρια βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα σε σύμπλοκο με την πρωτεΐνη Ro [108-111]. Ένας πληθυσμός hy1 RNA όμως, δεσμεύεται από την La πρωτεΐνη στον πυρήνα [110]. Όταν hy1 RNA που κατασκευάστηκε in vitro, εγχέεται σε ωοκύτταρα του οργανισμού Xenopus, το RNA εξάγεται αργά στο κυτταρόπλασμα απαιτώντας πάνω από οκτώ ώρες για την πλήρη εξαγωγή του [72, 112]. Ωστόσο, ένα μεταλλαγμένο hy1 RNA από το οποίο απουσιάζουν οι τερματικές ουριδίνες εξάγεται εξολοκλήρου στο κυτταρόπλασμα μέσα σε δύο ώρες [72]. Παρότι το συγκεκριμένο πείραμα δεν αποκλείει την πιθανότητα να παρεμποδίζεται η αλληλεπίδραση του hy1 RNA με άλλους πιθανούς παράγοντες πυρηνικής παρακράτησης λόγω της μετάλλαξης στο 3 άκρο, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η La μεσολαβεί για την παρακράτηση του συγκεκριμένου RNA εντός του πυρήνα. Μία άλλη μελέτη, στην οποία χρησιμοποιήθηκε μία τεχνική in vivo επιλογής των πυρηνικών RNA, υποστηρίζει το παραπάνω συμπέρασμα. Στην εν λόγω μελέτη, ένα από τα επιλεγμένα RNA γνωστό ως NL-15, βρέθηκε να δεσμεύεται από την πρωτεΐνη La στον πυρήνα του ωοκυττάρου Xenopus. Έγχυση μεγάλων συγκεντρώσεων NL-15 στο ωοκύτταρο, προκάλεσε αύξηση του εξαγόμενου στο κυτταρόπλασμα hy1 RNA [50]. Ενδεχομένως η περίσσεια του NL-15 στον πυρήνα, να ανταγωνίστηκε το hy1 RNA για την δέσμευση από την La. 34

Εισαγωγή Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν αρκετά στοιχεία για να υποστηρίξουν ότι η δέσμευση από τη La συμβάλλει στην πυρηνική διατήρηση των hy1 και NL-15 RNA σε ωοκύτταρα του Xenopus, δεν είναι ακόμα σαφές κατά πόσον αυτό αποτελεί έναν γενικότερο ρόλο της πρωτεΐνης. Εφόσον η La δεν καθίσταται απαραίτητη για τη βιωσιμότητα στους S. cerevisiae και S. pombe [5-7], δεν μπορεί να ευθύνεται για την διατήρηση οποιουδήποτε βασικού RNA εντός του πυρήνα στα κύτταρα ζύμης. Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχουν ομόλογα του hy1 RNA στις ζύμες. Ενδεχομένως λοιπόν, η πρωτεΐνη La των σπονδυλωτών να έχει αποκτήσει κατά την εξέλιξη, την ικανότητα να διατηρεί ορισμένα νεοσυντιθέμενα μετάγραφα, όπως το hy1 RNA, εντός του πυρήνα. Διαφορετικά, οι ζύμες μπορεί να διαθέτουν εναλλακτικούς μηχανισμούς για την διατήρηση των πρόδρομων trna εντός του πυρήνα. 7.4 Πιθανοί ρόλοι της πρωτεΐνης La στη μετάφραση του mrna Η La μπορεί να αλληλεπιδρά με ενδογενή mrna ενισχύοντας την μετάφρασή τους. Τα περισσότερα mrna που προσδένει η La περιέχουν Internal Ribosome Entry Site (IRES) και κωδικοποιούν πρωτεΐνες απαραίτητες για την επιβίωση των κυττάρων σε συνθήκες στρες. Παρά το γεγονός ότι η La εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα, έχει βρεθεί ότι μπορεί να ανακατανέμεται και να συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε συνθήκες στρες όπως είναι η έκθεση σε UV ακτινοβολία [113], η χορήγηση οξειδωτικών [52], η μόλυνση από ιούς [64, 114], η απόπτωση [23] και η καταστολή της RNA σύνθεσης [115]. Επιπλέον, η μεταγραφή του ανθρώπινου γονιδίου της La, έχει σαν αποτέλεσμα δύο μετάγραφα που διαφέρουν μόνο στις 5 -UTR [116]. Το ένα από αυτά τα δύο μετάγραφα περιέχει ένα στοιχείο IRES στην 5 -UTR [117]. Για τους λόγους αυτούς έχει προταθεί ότι η La μπορεί να αποτελεί μέρος της στρατηγικής επιβίωσης των κυττάρων σε συνθήκες όπου η φυσιολογική εκκίνηση της μετάφρασης (Cap-dependent translation) παρεμποδίζεται. Ακόμα και υπό αυτές τις συνθήκες, η πρωτεΐνη La συνεχίζει να παράγεται μέσω των IRES στοιχείων στο mrna της. Με τη σειρά της η La μπορεί να συμβάλλει στην μετάφραση ορισμένων σημαντικών για την περίσταση mrna. Για παράδειγμα, σε κύτταρα στα οποία χορηγήθηκε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ), παρατηρήθηκε συσσώρευση της La στο κυτταρόπλασμα και πρόσδεσή της στην 5 -UTR περιοχή του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2. Ο Nrf2 είναι 35

Εισαγωγή ένας σημαντικός μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση αντιοξειδωτικών και αποτοξινωτικών γονιδίων. Στην 5 -UTR περιοχή του mrna του υπάρχει μία θέση για εσωτερική εκκίνηση της μετάφρασης (IRES) η οποία ενεργοποιείται με τη συμβολή της La [52]. Στην ίδια μελέτη παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση της La με πρωτεΐνες του ριβοσώματος παρουσία του H 2 O 2. Επιπλέον, δέσμευση της La στην αλληλουχία IRES του mrna της πρωτεΐνης BiP, βρέθηκε ότι ενισχύει τη μετάφραση του συγκεκριμένου mrna τόσο in vitro όσο και in vivo [53]. Η Binding immunoglobulin protein (BiP), είναι μία σημαντική πρωτεΐνη συνοδός που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και δεσμεύει νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες μέχρι αυτές να αποκτήσουν την ορθή αναδίπλωση και να δεσμευτούν από άλλες συνιστώσες όταν πρόκειται για σύμπλοκα ή ολιγομερή. Έχει επίσης προταθεί πως η πρωτεΐνη La μπορεί να ρυθμίζει τη μετάφραση των mrna που διαθέτουν 5 - τερματική ολιγοπυριμιδινική αλληλουχία (TOP mrnas) [118]. Αυτή η ενδιαφέρουσα κατηγορία των mrna, που κωδικοποιούν ριβοσωμικές και άλλες πρωτεΐνες που δεν σχετίζονται απαραίτητα με τη μεταφραστική συσκευή [119], ρυθμίζονται στο μεταφραστικό επίπεδο με τρόπο εξαρτώμενο από την κυτταρική ανάπτυξη [120]. Όταν αναστέλλεται η κυτταρική ανάπτυξη, η μετάφραση των εν λόγω mrna καταστέλλεται όπως αποδεικνύεται από την μειωμένη πολυριβοσωμική σύνδεση σε αυτά [120]. In vitro πειράματα έδειξαν ότι η La δεσμεύεται στην 5 αμετάφραστη περιοχή του mrna ενός φυλοσύνδετου αναστολέα της απόπτωσης (του X-linked inhibitor of apoptosis XIAP) [121]. Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε εκχυλίσματα δικτυοερυθροκυττάρων, έδειξαν ότι ένα τμήμα της C- τελικής περιοχής της ανθρώπινης πρωτεΐνης, που μπορεί να καταστείλει τη μετάφραση του mrna του ιού της πολυομυελίτιδας [17], μπορεί επίσης να αναστείλει τη μετάφραση ενός γονιδίου αναφοράς όταν ανοδικά από αυτό προστίθεται η 5 αμετάφραστη περιοχή του XIAP [121]. Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, μία κασπάση απομακρύνει τη C τελική περιοχή της La μαζί με το σήμα πυρηνικού εντοπισμού [23, 66]. Έτσι, προκύπτει η υπόθεση ότι κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, η μεταφορά της La στο κυτταρόπλασμα συμβάλλει στη ρύθμιση της έκφρασης του εν λόγω αναστολέα. 36

Εισαγωγή 7.5 Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης La με τις UTR περιοχές των ιικών RNA Η αλληλεπίδραση της La με ιικά RNA σε συστήματα που περιλαμβάνουν ιούς όπως ο parainfluenza [122], ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας [123], της πολιομυελίτιδας [64, 124], της πανώλης των βοοειδών [125], της λύσσας [126], του Δάγκειου πυρετού (DENV) [114], της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) [41], της ηπατίτιδας Β (HBV) [33] και της ηπατίτιδας C (HCV) [54, 127] έχει καταγραφεί. Σε αυτά τα συστήματα, έχει παρατηρηθεί μετατόπιση της La από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα και έχει προταθεί ότι η La μπορεί να σταθεροποιεί τα RNA των ιών αυτών αλλά και να ρυθμίζει τη μετάφραση ή/και την αντιγραφή τους. Στις περισσότερες περιπτώσεις η ανθρώπινη La δεσμεύεται στις αλληλουχίες IRES που υπάρχουν στις 5 UTR των ιικών RNA. Για παράδειγμα, δέσμευση της La στο στοιχείο IRES του HCV, διευκολύνει την σύνδεση μεταξύ της 5 και της 3 αμετάφραστης περιοχής και ενισχύει την αντιγραφή του RNA του ιού [54]. Αλληλεπίδραση της La με το στοιχείο IRES του ιού της ηπατίτιδας Α (HAV), έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της μετάφρασης του συγκεκριμένου RNA [55]. Η La δεσμεύεται επίσης στο IRES του ιού της πολυομυελίτιδας και ενισχύει την εσωτερική εκκίνηση της μετάφρασης (Internal initiation of translation) του RNA του ιού [56]. Η χαρτογράφηση της δέσμευσης της La κοντά στο εναρκτήριο κωδικόνιο του HCV IRES [127] και η δέσμευση της La στα εναρκτήρια κωδικόνια εντός της αλληλουχίας Kozak (ACCAUGG), υποδηλώνουν ότι η La μπορεί να διευκολύνει την εύρεση του σωστού εναρκτήριου κωδικονίου από την μεταφραστική συσκευή [124]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι δέσμευση της La στο RNA του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού (RSV) λειτουργεί ως ασπίδα προστασίας αποτρέποντας την αναγνώριση του ιικού RNA από τον ενδογενή υποδοχέα RIG-I. Η αναγνώριση του ιικού RNA από τον RIG- I πυροδοτεί ένα μονοπάτι που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι. Έτσι, η αλληλεπίδραση της La με το ιικό RNA εμποδίζει την αντιική απόκριση του ξενιστή [128]. Ενώ για το γένος των φλαβοϊών έχει αναφερθεί ότι η La προσδένεται στην 3 αμετάφραστη περιοχή (3 -UTR) και συμμετέχει στην αντιγραφή του ιού της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας [129]. 37

Εισαγωγή 7.6 Η πρωτεΐνη La ως RNA συνοδός πρωτεΐνη Το RNA έχει τη δυνατότητα να αναδιπλώνεται σε αμέτρητες διαφορετικές διαμορφώσεις πέραν της εκάστοτε λειτουργικής. Μέσα στο κύτταρο όμως, υπάρχουν πρωτεΐνες που δεσμεύονται παροδικά στα διάφορα μόρια RNA και τα βοηθούν να πάρουν την κατάλληλη διαμόρφωση. Οι πρωτεΐνες αυτές, γνωστές ως RNA συνοδοί (RNA chaperones), μπορούν να διευκολύνουν την αποδιάταξη και την επαναδιάταξη των δίκλωνων περιοχών του RNA χωρίς την κατανάλωση ATP. Η ιδιότητα RNA συνοδού οφείλει να αποδειχθεί τόσο in vitro όσο και in vivo προτού μία πρωτεΐνη χαρακτηριστεί ως RNA συνοδός. Μελέτη που πραγματοποιήθηκε το 2005, ανέδειξε τη ιδιότητα RNA συνοδού της ανθρώπινης πρωτεΐνης La in vitro με τη δοκιμασία cis splicing assay και in vivo με τη δοκιμασία folding trap assay [130]. Για τη δοκιμασία cis splicing, χρησιμοποιήθηκε ένα μεταλλαγμένο γονίδιο που κωδικοποιεί το mrna της θυμιδιλικής συνθετάσης (td) και περιέχει ένα αυτοκαταλυόμενο ιντρόνιο της ομάδας Ι ανάμεσα σε δύο μειωμένα σε μήκος εξώνια. Έχει αποδειχθεί ότι το συγκεκριμένο μετάλλαγμα δεν υπόκειται σε αποτελεσματικό μάτισμα απουσία συνοδού πρωτεΐνης [131]. Απουσία της πρωτεΐνης La, περίπου 30% από το παραγόμενο pre-mrna υπέστη ικανοποιητικό μάτισμα ενώ το υπόλοιπο 70% παρουσίαζε 50 φορές μείωση στον ρυθμό ματίσματος. Αυτό υποδηλώνει ότι η πλειοψηφία των μορίων RNA έχουν υιοθετήσει μία τριτοταγή διαμόρφωση που επιτρέπει μόνο αργούς ρυθμούς αντίδρασης. Ενδεχομένως τα μόρια αυτά να είναι μερικώς αποδιαταγμένα ή να έχουν μη φυσιολογική αναδίπλωση. Μετά από προσθήκη της πρωτεΐνης La, το κλάσμα των μορίων που αντιδρούσαν ταχέως αυξήθηκε στο 70% - 75% [130]. Για τη δοκιμασία folding trap, χρησιμοποιήθηκε ένα ξεχωριστό μετάλλαγμα της θυμιδιλικής συνθετάσης, το tdsh1. Το mrna της θυμιδιλικής συνθετάσης παγιδεύεται in vivo σε μία ενδιάμεση αναδίπλωση που εμποδίζει την αυτοκατάλυση του ιντρονίου ομάδας Ι. Έχει βρεθεί ότι κατά τη διάρκεια της μετάφρασης, το ριβόσωμα ξεδιπλώνει την ελαττωματική δομή και επιτρέπει στο ιντρόνιο να υιοθετήσει τη φυσιολογική διαμόρφωση. Αυτό σημαίνει ότι η μετάφραση του mrna της θυμιδιλικής συνθετάσης είναι άμεσα συνδεδεμένη με τη διαδικασία του ματίσματος [132]. Η ύπαρξη ενός πρόωρου κωδικονίου λήξης στο μεταλλαγμένο tdsh1, απομακρύνει το ριβόσωμα και καθιστά απαραίτητη την 38

Εισαγωγή παρουσία μιας RNA συνοδού που θα βοηθήσει το ιντρόνιο να αναδιπλωθεί σωστά και να αυτοκαταλύσει την εκτομή του από το εν λόγω mrna [133] (Εικόνα 12). Έκφραση της ανθρώπινης πρωτεΐνης La σε μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα, επανέφερε την αυτοκαταλυτική ικανότητα του μεταλλαγμένου tdsh1 επαληθεύοντας την ιδιότητα RNA συνοδού in vivo [130]. Εικόνα 12. Folding trap assay. Απουσία μετάφρασης λόγω πρόωρου τερματισμού, το ιντρόνιο ομάδας Ι παγιδεύεται σε μία μη λειτουργική διαμόρφωση (αριστερά). Υπερέκφραση RNA σαπερονών μέσα στο κύτταρο, μπορεί να ανατρέψει την κατάσταση αποδιατάσσοντας την ελαττωματική δομή. Το αποδιαταγμένο μόριο μπορεί να αναδιπλωθεί εκ νέου σε λειτουργικό ριβοένζυμο (δεξιά) και να υποστεί εκτομή [134]. Η ιδιότητα της La ως RNA συνοδού επιβεβαιώθηκε και από πρόσφατη μελέτη. Πιο συγκεκριμένα, η ανθρώπινη La και η ομόλογη πρωτεΐνη του S. pombe, εξετάστηκαν με τη μεθοδολογία FRET (fluorescence resonance energy transfer) για την δυνατότητα να ενισχύουν την αποδιάταξη και την επαναδιάταξη ποικίλων μορίων RNA. Και οι δύο πρωτεΐνες εκδήλωσαν ιδιότητα RNA συνοδού ανεξάρτητα από την παρουσία αλληλουχίας UUU OH στα υποστρώματα που εξετάστηκαν. Στην ίδια μελέτη, η ιδιότητα RNA συνοδού 39

Εισαγωγή χαρτογραφήθηκε εντός του RRM1 μοτίβου της πρωτεΐνης και συνδέθηκε με την ύπαρξη μίας «μη κανονικής» α3- έλικας μέσα σε αυτό [135]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα περισσότερα mrna που ρυθμίζονται σε μεταφραστικό επίπεδο από τη La, περιέχουν στοιχεία IRES που είναι γνωστά για την τάση τους να αναδιπλώνονται σε πολύπλοκες δευτεροταγείς δομές. Αυτή η παρατήρηση ενισχύει την υπόθεση ότι η La, η οποία ήταν ο πρώτος γνωστός ITAF (IRES-transacting factor), χρησιμοποιεί την ιδιότητα RNA συνοδού ώστε να προάγει τις αναδιπλώσεις εκείνες που ευνοούν την εκκίνηση της μετάφρασης. Πράγματι, σε πρόσφατη μελέτη, αποδείχθηκε ότι η ιδιότητα RNA συνοδού είναι απαραίτητη για την προώθηση της εσωτερικής εκκίνησης της μετάφρασης από τη La [136]. Επιπλέον σε αντίθεση με την προηγούμενη, η μελέτη αυτή χαρτογράφησε την ιδιότητα συνοδού στο C- τελικό άκρο της πρωτεΐνης και αποκάλυψε πως η ιδιότητα αυτή ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης στη θρεονίνη 389 από την Protein Kinase B (AKT) [136]. 8. Η πρωτεΐνη La ως αυτοαντιγόνο Ανάμεσα στους κύριους στόχους των αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με συστηματικές ρευματοειδείς παθήσεις, όπως ο συστηματικός ευθηματώδης λύκος (systemic lupus erythematosus, SLE) και το σύνδρομο Sjogren (Sjiogren s syndrome, SS), περιλαμβάνονται τα συστατικά του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου Ro/La RNP. Το σύμπλοκο αυτό, αποτελείται από ένα από τα τέσσερα μικρά, πλούσια σε ουριδίνες hy RNA και τρεις τουλάχιστον μη ομοιοπολικά συνδεόμενες πρωτεΐνες, την Ro52, την La και την Ro60. Αντισώματα εναντίον της Ro (anti-ro) και αντισώματα εναντίον της La (anti-la) εντοπίζονται σε περίπου 60-90% και 30-60% των ασθενών με πρώιμο SS, καθώς και σε 30-40% και 10-15% των ασθενών με SLE, αντίστοιχα [137]. Παρότι οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες εντοπίζονται αυτόνομα στον πυρήνα, το σύμπλοκο Ro/La RNP εντοπίζεται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, κάτω από ορισμένες συνθήκες που περιλαμβάνουν το στρες [138], τη UV ακτινοβολία [113, 139], την απόπτωση [140] ή τη μόλυνση από ιούς [141], οι πρωτεϊνικές συνιστώσες του Ro/La RNP εμφανίζονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Μετά την αναγνώριση της La ως αυτοαντιγόνο στο SS και τον SLE, αρκετές μελέτες επικεντρώθηκαν στην εύρεση του ακριβούς αντιγονικού καθοριστή επίτοπου της 40

Εισαγωγή πρωτεΐνης. Σύντομα όμως έγινε αντιληπτό ότι δεν πρόκειται μόνο για έναν. Και στις δύο παθήσεις (ίσως λίγο περισσότερο στον SLE), παρατηρείται έντονα το φαινόμενο της εξάπλωσης επιτόπων. Ο όρος «εξάπλωση επιτόπων» χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη διαφοροποίηση της ανοσολογικής απόκρισης των Β και Τ κυττάρων στο επίπεδο της εξειδίκευσης, από έναν επίτοπο, σε πολλούς ξεχωριστούς [142]. Η εξάπλωση επιτόπων μπορεί να περιλαμβάνει τόσο ξεχωριστές περιοχές της ίδιας πρωτεΐνης (ενδομοριακή εξάπλωση επιτόπων) όσο και περιοχές άλλων πρωτεϊνών που όμως αλληλεπιδρούν με την αρχική πρωτεΐνη (διαμοριακή εξάπλωση επιτόπων). Αναλυτική χαρτογράφηση των Β κυτταρικών επιτόπων της La/SSB χρησιμοποιώντας συνθετικά πεπτίδια αποκάλυψε τους 4 επίτοπους που παρουσιάζουν την υψηλότερη αντιγονικότητα. Οι επίτοποι αυτοί καλύπτουν τις αλληλουχίες HKAFKGSA (aa147-154, η οποία εντοπίζεται μέσα στο μοτίβο RRM), NGNLQLRNKEVT (aa291-302), VTWEVLEGEVEKEALKKI (aa301-318) και GSGKGKVQFQGKKTKF (aa349-364) [143]. Ο πιο σημαντικός ίσως Β κυτταρικός επίτοπος, είναι αυτός που καλύπτει την αμινοξική αλληλουχία 349-364 και αναγνωρίζεται πιο συχνά από τον ορό των ασθενών με SS. Aποτελεί τον πιο ευαίσθητο αλλά και εξειδικευμένο επίτοπο για τον εντοπισμό anti-la αντισωμάτων σε δοκιμασίες ELISA και dot blot [144]. Η ύπαρξη αντισωμάτων εναντίον αυτού του επίτοπου σχετίζεται με μεγαλύτερη διάρκεια νόσου, επαναλαμβανόμενη ή εμμένουσα διόγκωση παρωτίδων και υψηλότερη συχνότητα εξω-αδενικών εκδηλώσεων στους ασθενείς με SS [145]. Και άλλοι επίτοποι έχουν εντοπισθεί σε διαφορετικά σημεία του μορίου χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένα τμήματα της πρωτεΐνης La ή συνθετικά πεπτίδια [146]. Η ύπαρξή τους ενδεχομένως να οφείλεται στην εκτεταμένη ενδομοριακή εξάπλωση επιτόπων σε ολόκληρη την πρωτεΐνη. Θεωρητικά, μία μοναδική περιοχή αποτέλεσε τον αρχικό επίτοπο. Έπειτα, με διάφορους μηχανισμούς, αλληλεπίδραση με τον επίτοπο αυτό, πυροδότησε την εξάπλωση της ανοσολογικής απόκρισης σε ένα ευρύ φάσμα περιοχών του ίδιου αλλά και άλλων μορίων (Εικόνα 13). Η αποκάλυψη του αρχικού επιτόπου έχει μεγάλη σημασία για την κατανόηση του μηχανισμού έναρξης και εξέλιξης της αυτοάνοσης απόκρισης τόσο στο SS όσο και στον SLE. Το αν αυτός ο επίτοπος αποτελεί περιοχή της πρωτεΐνης La ή όχι δεν έχει ακόμα αποδειχθεί. 41

Εισαγωγή Εικόνα 13. Μοντέλο πιθανού μηχανισμού εξάπλωσης Β κυτταρικών επιτόπων [147]. Αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (μακροφάγα, δενδριτικά ή Β κύτταρα) ενδοκυτταρώνουν σύμπλοκα Ro/La RNP (προερχόμενα από αποπτωτικό ή νεκρωτικό υλικό) και μετά από πέψη, παρουσιάζουν πεπτίδια της La σε Τ βοηθητικά κύτταρα. Τα Τ βοηθητικά κύτταρα, μπορούν να αλληλεπιδράσουν με Β κύτταρα που έχουν αντι-la δραστικότητα και εμφανίζουν στην επιφάνειά τους πεπτίδια της La συνδεδεμένα με MHC II. Από την αλληλεπίδραση αυτή ενεργοποιούνται τα Β κύτταρα και παράγουν αντισώματα εναντίον της La. Ωστόσο, τα ίδια Τ βοηθητικά κύτταρα, μπορούν να ενεργοποιήσουν άλλα Β κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν τη Ro μέσω του BCR, ενδοκυτταρώνουν ολόκληρο το σύμπλοκο Ro/La RNP και παρόλα αυτά, επιλέγουν να παρουσιάσουν πεπτίδια της La μέσω των επιφανειακών MHC II. Πρόσφατα επιχειρήθηκε in silico κατασκευή της δομής του πλήρους ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου Ro/La (μαζί με το hy1 RNA) [148]. Στην προσομοίωση του συμπλόκου φάνηκε ότι το hy1 RNA κάλυπτε πλήρως τους επιτόπους 169-190aa του Ro60 και 145-164aa της La, οι οποίοι είχαν συσχετισθεί με τον συστηματικό ερυθηματώδη λύκο αλλά όχι τους επίτοπους 211-232aa του Ro60 και 349-364aa της La που έχουν συσχετισθεί με το σύνδρομο Sjogren. Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώθηκε με πειράματα ELISA στα οποία αντισώματα που στόχευαν τα συγκεκριμένα αμινοξέα ανταγωνίζονταν τη δέσμευση του hy1 RNA στη Ro60 και στη La αντίστοιχα. Προτείνεται λοιπόν, ότι οι επίτοποι της Ro και της La που σχετίζονται με τον συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, είναι κρυφοί επίτοποι που καλύπτονται από το hy1 RNA στην τρισδιάστατη διαμόρφωση του συμπλόκου 42

Εισαγωγή Ro/La RNP. Αντιθέτως, οι επίτοποι των δύο πρωτεϊνών που σχετίζονται με το σύνδρομο Sjogren φαίνεται πως είναι προσβάσιμοι στο σύμπλοκο Ro/La RNP. Ωστόσο, η προσομοίωση του συμπλόκου Ro/La RNP, στηρίχθηκε στις κρυσταλλικές δομές τριών επιμέρους τομέων της πρωτεΐνης La και όχι στη δομή ολόκληρου του μορίου καθώς αυτή δεν είναι ακόμα διαθέσιμη. Επιπλέον, για την τοποθέτηση του hy1 RNA, στηρίχθηκε στη μελέτη του συμπλόκου της περιοχής LaM-RRM με ένα μονόκλωνο πολύ-u ολιγονουκλεοτίδιο, αγνοώντας τη συμμετοχή των υπολοίπων τομέων της πρωτεΐνης και την κατάσταση δέσμευσης με τα φυσιολογικά RNA στόχους της La, εφόσον αυτά δεν έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Η αλληλεπίδραση των αυτοαντισωμάτων με τους παραπάνω γραμμικούς επίτοπους δεν αποκλείει την πιθανότητα τα αντισώματα να στοχεύουν ασυνεχείς επίτοπους που δημιουργούνται από την τριτοταγή αναδίπλωση της πρωτεΐνης και ενδεχομένως επηρεάζονται από τη δέσμευση του RNA. Εκτενείς μελέτες για την ολοκλήρωση της δομής της πρωτεΐνης αλλά και τον τρόπο που αυτή δεσμεύει τους εγγενείς στόχους της, όπως είναι τα πρόδρομα μόρια trna, θα συμβάλλουν στο σαφή καθορισμό των επιτόπων. Καθορισμός ο οποίος είναι απαραίτητος για την αποσαφήνιση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην παραγωγή των αυτοαντισωμάτων εναντίον της La. 43

Εισαγωγή Σκοπός της μελέτης Από την ανακάλυψή της ως αυτοαντιγόνο σε ασθενείς με σύνδρομο SS και SLE μέχρι σήμερα, έχει γίνει αντιληπτό ότι η πρωτεΐνη La αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα στη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων. Η συμβολή της είναι καθοριστική για την τύχη πολλών μορίων RNA. Η προστασία και η ορθή ωρίμανση λειτουργικών μορίων όπως είναι τα trna αλλά και ρυθμιστικών όπως είναι τα mirnas, καθώς και η μετάφραση συγκεκριμένων mrna που περιέχουν στοιχεία IRES, είναι μόνο λίγες από τις διαδικασίες που εξαρτώνται από τη συμμετοχή της πρωτεΐνης La. Η συντήρηση της La από τους μύκητες μέχρι τον άνθρωπο αλλά και η εμφάνιση cis ρυθμιστικών στοιχείων στις ομόλογες πρωτεΐνες των ανώτερων ευκαρυωτών, υποδηλώνει πως η πρωτεΐνη αυτή διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των οργανισμών. Ανοσολογικές μελέτες έχουν επιχειρήσει να αποκαλύψουν τα χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης που ευθύνονται για την αναγνώρισή της ως αυτοαντιγόνο, στο SS και στον SLE. Πιθανοί γραμμικοί επίτοποι έχουν βρεθεί με τη χρήση μικρών συνθετικών πεπτιδίων [143]. Κάποιοι από αυτούς εδράζονται εντός των λειτουργικών περιοχών της πρωτεΐνης όπως είναι το μοτίβο RRM1 και η περιοχή πιθανής δέσμευσης ATP που έχει εντοπισθεί μέσα στο SBΜ. Ωστόσο, το αν αυτοί οι επίτοποι είναι συνεχείς ή τμήματα ασυνεχών επιτόπων στην τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης, καθώς και το αν αυτοί οι επίτοποι είναι προσβάσιμοι παρουσία ή απουσία δεσμευμένου μορίου RNA, στην αναδιπλωμένη ή αποδιαταγμένη μορφή της πρωτεΐνης, είναι ερωτήματα τα οποία δεν μπορούν ακόμη να απαντηθούν. Η τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης αποτελεί πρόσφατο αντικείμενο μελετών και δεν έχει ολοκληρωθεί μέχρι σήμερα. Στα πλαίσια της συνολικότερης μελέτης που αφορά το δομικό χαρακτηρισμό του πλήρους μορίου της πρωτεΐνης La σε διάλυμα και την αλληλεπίδραση του με ένα από τα φυσικά του υποστρώματα, δημιουργήθηκε μία βιβλιοθήκη των ξεχωριστών επικρατειών της ομόλογης πρωτεΐνης του Dictyostelium discoideum. Οι επικράτειες La motif, RRM1 και La motif-rrm1, αποτελούν το αντικείμενο της παρούσας διατριβής (Εικόνα 14). 44

Εισαγωγή Εικόνα 14. Επάνω: Οργάνωση επικρατειών της πρωτεΐνης La του D. discoideum. Κάτω: Μεταλλάγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Οι επικράτειες La motif και RRM1 (N-RRM) μελετήθηκαν ξεχωριστά αλλά και μαζί, ως N- τελική περιοχή της πρωτεΐνης (NTD). Κάθε επικράτεια μελετήθηκε ως προς τη δυνατότητα και τον τρόπο δέσμευσης σε ομόλογα πρόδρομα trna του D. discoideum. Επιπλέον, η τρισδιάστατη δομή του κάθε τομέα σε διάλυμα, μελετήθηκε με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR. Ο κυτταρομυξομύκητας D. discoideum αποτελεί ένα εύχρηστο εργαστηριακό κυτταρικό σύστημα για τη μελέτη των πρωτεϊνών που δεσμεύουν ακτίνη (actin-binding proteins) αλλά και για τη μελέτη της κινητικότητας των κυττάρων γενικότερα. Έχει μικρό και απλό γονιδίωμα και ακολουθεί έναν καλά καθορισμένο κύκλο ανάπτυξης και διαφοροποίησης, γεγονός που τον έχει καθιερώσει ως ένα πρότυπο οργανισμό μοντέλο για μελέτες που αφορούν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση [149]. Παρότι ο διαχωρισμός του D. discoideum από τους υπόλοιπους ευκαρυώτες συνέβη νωρίς στην φυλογενετική ιστορία των ευκαρυωτικών οργανισμών, πολλές από τις πρωτεΐνες του παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα με τις ορθόλογες του ανθρώπου παρά με αυτές του S. cerevisiae [150]. Η ομόλογη πρωτεΐνη La του D. discoideum για παράδειγμα, παρουσιάζει πολύ μεγαλύτερη ομολογία με την ανθρώπινη πρωτεΐνη από ότι με τις ομόλογες πρωτεΐνες των υπόλοιπων μονοκύτταρων ευκαρυωτών. Επιπλέον, εκτός από το La motif και το RRM1, η πρωτεΐνη του D. discoideum διαθέτει και το C-τελικό RRM μοτίβο (RRM2) το οποίο χαρακτηρίζει τις πρωτεΐνες των ανώτερων ευκαρυωτών. 45

Υλικά και Μέθοδοι 46

Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και μέθοδοι Α. Υλικά 1. Χημικά [γ- 32 P] ΑΤΡ (6000 Ci/mmol, SBP-501) από IZOTOP Acetic Acid (glacial) (MERCK) Acrylamide 2X (SERVA) Agar (SERVA) Agarose (BIORAD) Ammonium acetate (MERCK) Ammonium chloride (MERCK) Ammonium persulfate (APS) (SERVA) Ampicillin (Na+ Salt) (SERVA) Boric acid (MERCK) Bovine Serum Albumin (BSA) (SIGMA) Bradford reagent (SIGMA) 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside (Χ-Gal) (SIGMA) Bromophenol blue (SIGMA) Coomassie brilliant blue R250 (MERCK) Deoxynucleotides (dntps) (SIGMA, DNTP100A) Diethylpyrocarbinol (DEPC) (SIGMA) Ethanol (MERCK) Ethylendiaminetetra-acetic acid (EDTA) (SERVA) Gel Red Nucleic Acid Gel Stain (BIOTIUM) Glycerol (SERVA) Glycine (SERVA) Hydrochloride 37% (MERCK) HyperLadder I & II (BIOLINE) Imidazole (ALDRICH) 47

Υλικά και Μέθοδοι Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (SERVA) Magnesium chloride, hexahydrate (MERCK) Magnesium sulfate, heptahydrate (MERCK) β Mercaptoethanol (SERVA) Methanol (MERCK) N-N methylen bis acrylamide (SERVA) Nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) Agarose (QIAGEN) Peptone, tryptic (SERVA) Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) (SERVA) Polyethylene glycol (MW 4000) (MERCK) Potassium chloride (MERCK, 104933) Protein Ladder 10-250 kda (NEB) Ribonucleotides triphosphates (PROMEGA) Sodium chloride (MERCK) Sodium dodecyl sulfate (SDS) (ICN) N, N, N, N Tetramethylethylendiamine (TEMED) (SERVA) Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethane (APPLICHEM) Urea (SERVA) Xylene cyanol (SERVA) Yeast extract (SERVA) 2. Ένζυμα Antarctic Phosphatase (NEB) DNase I (NEB) DraI (NEB) EcoRI (TAKARA) Lysozyme (FLUKA) 48

Υλικά και Μέθοδοι NdeI (TAKARA) PPase (NEB) RNase A (ΑΜΒΙΟΝ) RNase T1 (AMBION) RNase V1 (AMBION) RNasin (TAKARA) SspI (NEB) T4 DNA Ligase (FERMENTAS) T4 PNK (TAKARA) T7 RNA polymerase (TAKARA) XhoI (TAKARA) 3. Βακτηριακά Στελέχη *DH5a : Στέλεχος E. coli που χρησιμοποιείται για την εισαγωγή και κλωνοποίηση πλασμιδιακού DNA. *StratacloneTM Solopack Competent Cells : Tα συγκεκριμένα κύτταρα παρέχονται από το Strataclone PCR Cloning Kit της Stratagene και διαθέτουν την ικανότητα έκφρασης της ρεκομπινάσης Cre, η οποία απαιτείται για την κυκλοποίηση των γραμμικών μορίων DNA που παράγονται κατά τη διάρκεια του καταλυόμενου από την τοποϊσομεράση Ι ligation. Επίσης, τα κύτταρα αυτά υποστηρίζουν την επιλογή βάσει των μπλε και άσπρων αποικιών (blue/white screening) όταν μετασχηματισθούν με το πλασμίδιο psc-a, το οποίο παρέχεται από το ίδιο kit και εξασφαλίζουν μετασχηματισμό υψηλής απόδοσης. *BL21 (DE3)Rosetta: Tα επιδεκτικά κύτταρα BL21, είναι σχεδιασμένα για την πραγματοποίηση πρωτεϊνικής έκφρασης υψηλού επιπέδου. Χρησιμοποιούν συστήματα έκφρασης που βασίζονται στην Τ7 RNA πολυμεράση. Όλα τα στελέχη BL21 δεν έχουν τις πρωτεάσες OmpT και Lon, οι οποίες μπορούν να παρεμποδίσουν την απομόνωση των εκάστοτε ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Επιπλέον τα στελέχη Rosetta, ενισχύουν την έκφραση των ευκαρυωτικών πρωτεϊνών που περιέχουν κωδικόνια που χρησιμοποιούνται σπάνια στο Ε.coli. 49

Υλικά και Μέθοδοι 4. Κιτ Kapa 2G Fast PCR Kit (KAPA BIOSYSTEMS) Kapa HiFi PCR Kit (KAPA BIOSYSTEMS) Mini Quick Spin Columns (ROCHE) NucleoSpin Plasmid DNA Mini Prep (MACHEREY NAGEL) PCR clean-up, Gel extraction (MACHEREY NAGEL) StrataClone PCR Cloning Kit (STRATAGENE) 5. Θρεπτικά μέσα Υγρό θρεπτικό μέσο (LB Broth) ph 7,2 Αντιδραστήριο Τυπική αναλογία (g/l) Tryptone 10.0 Yeast extract 5.0 NaCl 10.0 Πίνακας 1: Σύσταση υγρού θρεπτικού μέσου (LB Broth) ph 7,2. Στερεό θρεπτικό μέσο (LB Agar) ph 7,2 Αντιδραστήριο Τυπική αναλογία (g/l) Tryptone 10.0 Yeast extract 5.0 Άγαρ 15.0 NaCl 10.0 Πίνακας 2: Σύσταση στερεού θρεπτικού μέσου (LB Agar) ph 7,2. SOC medium (υγρό θρεπτικό μέσο) ph 7 για τελικό όγκο 100ml Αντιδραστήριο Ποσότητα Tryptone 2g Yeast extract 0.5g NaCl 1M KCl 1M Δ/μα Mg2 + 2M Γλυκόζη 2Μ Πίνακας 3: Σύσταση SOC medium ph 7 για τελικό όγκο 100ml. 1ml 0.25ml 1ml 1ml 50

Υλικά και Μέθοδοι 6. Ρυθμιστικά διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (50x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης για τελικό όγκο 1L. Αντιδραστήριο Tris base Οξικό οξύ EDTA 0,5M ph 8 Πίνακας 4: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος ΤΑΕ (50x). *Ακολουθεί ρύθμιση του ph στο 8,6. Ποσότητα 242g 57.1ml 100ml Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (10 %), για τελικό όγκο 1L.(Running buffer 10x) Αντιδραστήριο Ποσότητα Tris base (ph 8,3) 30.3g Γλυκίνη 144g SDS Πίνακας 5: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών. Ρυθμιστικό διάλυμα Loading dye (2x) για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Αντιδραστήριο 10g Περιεκτικότητα / Συγκέντρωση Bromophenol Blue 0.1% SDS 4% Glycerol 20% Tris-HCl ph 6,8 β-mercaptoethanol Πίνακας 6: Σύσταση loading dye 120 mm 100 mm Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒ (3.5x) για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και RNA σε μη αποδιατακτικές συνθήκες, για τελικό όγκο 200 ml.(running buffer) Αντιδραστήριο Ποσότητα Tris base (ph 8,3) 7.56g H 3 BO 3 3.85g Πίνακας 7: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος TB (3.5x). 51

Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα BB (1x) για τις δοκιμασίες δέσμευσης. (Binding buffer 1x) Αντιδραστήριο Tris-HCl (ph 7,5) MgCl 2 NH 4 Cl Πίνακας 8: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος BB (1x). Συγκέντρωση 50mM 5mM 10mM Ρυθμιστικό διάλυμα TBE (10x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, για τελικό όγκο 1L.(Running buffer) Αντιδραστήριο Ποσότητα Tris base (ph 8,3) 121.14g H 3 BO 3 30.5g Na 2 EDTA 7.45g Πίνακας 9: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος TBE (10x). Ρυθμιστικό διάλυμα Loading buffer for IVT (2x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. (Loading buffer) Αντιδραστήριο Περιεκτικότητα Formamide 90% Bromophenol Blue 0.05% Xylene Cyanol 0.05% Πίνακας 10: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος Loading buffer for IVT (2x). Ρυθμιστικό διάλυμα Elution buffer for IVT (1x) Αντιδραστήριο Συγκέντρωση Tris-HCl (ph 7,5) 0.01Μ KCl 0.3M Xylene Cyanol 1mM Πίνακας 11: Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος Elution buffer for IVT (1x). 52

Υλικά και Μέθοδοι 7. Πλασμιδιακοί φορείς *psc-a: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 3.5 kb που χρησιμοποιείται για τη κλωνοποίηση γονιδίων. H διαδικασία της κλωνοποίησης με το συγκεκριμένο φορέα εκμεταλλεύεται τις συνδυασμένες δράσεις της τοποϊσομεράσης Ι από το ιό Vaccinia και της ρεκομπινάσης Cre από τον βακτηριοφάγο P1. In vivo, η τοποϊσομεράση Ι συμμετέχει στην αντιγραφή του DNA χαλαρώνοντας και επανασυνδέοντας τις έλικες του DNA. Ειδικότερα, η τοποϊσομεράση Ι κόβει τη φωσφοδιεστερική ραχοκοκαλιά μιας αλυσίδας DNA ακριβώς μετά την αλληλουχία 5-CCCTT δημιουργώντας μια ενδιάμεση ένωση DNA-ενζύμου, η οποία συντηρεί την ενέργεια δεσμού που πρόκειται να χρειαστεί για την επανελίκωση του κομμένου DNA πίσω στη σωστή έλικα. Από τη στιγμή που δημιουργηθεί το ενδιάμεσο αυτό, η αντίδραση επανελίκωσης μπορεί επίσης να συμβεί με ένα ετερόλογο τμήμα DNA. Η ρεκομπινάση Cre καταλύει τον ανασυνδιασμό μεταξύ δύο loxp αλληλουχιών αναγνώρισης. Το μείγμα φορέων που παρέχεται με το PCR cloning kit της Stratagene περιέχει βραχίονες DNA δύο ειδών, καθένας από τους οποίους στο ένα άκρο του φέρει μια τοποϊσομεράση Ι και στο άλλο μια περιοχή αναγνώρισης loxp. Τα φορτισμένα με την τοποϊσομεράση άκρα διαθέτουν μια προεξοχή τροποποιημένης ουριδίνης ( U*). Με αυτόν τον τρόπο τα ενισχυμένα με Taq πολυμεράση προϊόντα της PCR, τα οποία φέρουν 3-Α προεξοχές μπορούν να ενωθούν αποτελεσματικά με τους παραπάνω βραχίονες μέσω του σχηματισμού δεσμών Α- U*, ακολουθούμενου από την σύνδεση των αλυσίδων DNA με τη βοήθεια της τοποϊσομεράσης Ι (Εικόνα 15). Το γραμμικό μόριο DNA που προκύπτει στη συνέχεια, μετασχηματίζει επιδεκτικά κύτταρα που έχουν την ικανότητα σύνθεσης της ρεκομπινάσης Cre, η οποία με τη σειρά της ανασυνδιάζει τις περιοχές loxp στα άκρα του γραμμικού μορίου. Έτσι, σχηματίζεται ο κυκλικός φορέας psc-a που έχει την ικανότητα ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο παρουσία αμπικιλλίνης και περιέχει το οπερόνιο της λακτόζης (lacz). Το συγκεκριμένο οπερόνιο παίζει ρόλο στον έλεγχο της επιτυχίας της κλωνοποίησης με βάση την εμφάνιση μπλε ή/και άσπρων αποικιών (blue/white screening). Ο φορέας έχει επεξεργαστεί κατάλληλα έτσι ώστε να είναι κομμένος εντός του γονιδίου της β- γαλακτοσιδάσης. Oι αποικίες που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο ή το πλασμίδιο δεν έχει ενσωματώσει το επιθυμητό γονίδιο, παρουσιάζουν μπλε χρώμα, καθώς ο φορέας επανακυκλοποιείται, εκφράζεται το lacz και επομένως διασπάται η λακτόζη. Ο μηχανισμός 53

Υλικά και Μέθοδοι αυτός, λοιπόν, είναι ιδιαίτερα χρήσιμος για την κλωνοποίηση γονιδίων σε βακτηριακούς φορείς και μάλιστα σε συνδυασμό με την ανάπτυξη των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με το κατάλληλο αντιβιοτικό, καθιστά αρκετά αξιόπιστη και ακριβή την διαδικασία επιλογής των αποικιών που έχουν προσλάβει τον φορέα με το επιθυμητό ένθετο. Εικόνα 15. Σύνοψη της μεθόδου στην οποία στηρίζεται ο μετασχηματισμός με τη βοήθεια του Strataclone PCR cloning kit. *pet-20b: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 3716 bp (Novagen), ο οποίος διαθέτει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (Εικόνα 16). Χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων μέσω της Τ7 RNA πολυμεράσης. Στο πλασμίδιο pet- 20b μετά τον προαγωγέα της Τ7 RNA πολυμεράσης υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυμα περιορισμού (Εικόνα 17). 54

Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 16. Ο πλασμιδιακός φορέας pet-20b. Εικόνα 17. Ο προαγωγέας της Τ7 RNA πολυμεράσης και ο πολυσυνδέτης (polylinkler) του φορέα pet-20b. Στο εσωτερικό του πολυσυνδέτη διακρίνονται οι θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενζύμων NdeI και XhoI, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή της παρούσας εργασίας. Μετά τον πολυσυνδέτη διακρίνεται το His-Tag. Έτσι, με τη χρήση των κατάλληλων ενζύμων είναι δυνατή η εισαγωγή του επιθυμητού γονιδίου, όπως είναι στη συγκεκριμένη περίπτωση το γονίδιο La στο εσωτερικό του polylinker και στη συνέχεια, η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου αυτού μετά από την πρόσδεση της Τ7 RNA πολυμεράσης στον προαγωγέα της. Το κωδικόνιο λήξης της μεταγραφής του La έχει απαλειφθεί, με αποτέλεσμα να προστίθενται έξι τριάδες νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν έξι ιστιδίνες στο τέλος της αμινοξικής αλληλουχίας της La. Η μεταγραφή σταματά από ένα κωδικόνιο λήξης αμέσως μετά τα νουκλεοτίδια που κωδικοποιούν τις έξι ιστιδίνες. Παρ όλα αυτά, ο pet-20b δε 55

Υλικά και Μέθοδοι διαθέτει το οπερόνιο της λακτόζης (lacz), με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η επιλογή των αποικιών που έχουν προσλάβει το επιθυμητό πλασμίδιο με blue/white screening. 8. Εκκινητές (primers) Για την ενίσχυση των La motif, RRM1 και Lamotif-RRM1 από το γονίδιο της πρωτεΐνης La του οργανισμού D.discoideum, χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές (primers). Εκκινητές για το La motif Αλληλουχία 5-3 Tm Dicty La Protein NdeI Forward (3F) 5 - GCATATGTCAGAAGAAACATCAACTC - 3 53 ο C Dicty La Protein XhoI Reverse (3R1) 5 - CTCGAGATCAATATTCTCTGGTAATGG- 3 56 ο C Εκκινητές για το RRM1 Αλληλουχία 5-3 Tm Dicty La Protein NdeI Forward (3F1) 5 -GCATATGGGTAAAACATTATATAGCAA- 3 53 ο C Dicty La Protein XhoI Reverse (3R2) 5 - CTCGAGTTTATCGCCATTTGTTGA - 3 57 ο C Εκκινητές για το La motif-rrm1 Αλληλουχία 5-3 Tm Dicty La Protein NdeI Forward (3F) 5 - GCATATGTCAGAAGAAACATCAACTC - 3 53 ο C Dicty La Protein XhoI Reverse (3R2) 5 - CTCGAGTTTATCGCCATTTGTTGA - 3 57 ο C Β. Μέθοδοι Μοριακή κλωνοποίηση των επικρατειών La motif, RRM1 και La motif-rrm1 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Τα τμήματα La motif, RRM1 και La motif-rrm1 ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας ως μήτρα το γονίδιο La από cdna κλώνο από βιβλιοθήκη του οργανισμού D. discoideum. Η αντίδραση PCR περιλαμβάνει τον cdna κλώνο, το ρυθμιστικό διάλυμα της DNA πολυμεράσης, 56

Υλικά και Μέθοδοι μείγμα τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (dntps), το εκάστοτε ζευγάρι εκκινητών, Η 2 Ο και το ένζυμο DNA πολυμεράση. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του La motif είναι οι Dicty La protein Forward Primer NdeI (3F) και La Dicty Construct 1 Reverse Primer XhoI (3R1). Για το RRM1 χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές La Dicty Construct 2 Forward Primer NdeI (3F1) και La Dicty Construct 2 Reverse Primer XhoI (3R2) ενώ για το La motif-rrm1 χρησιμοποιήθηκαν οι Dicty La protein Forward Primer NdeI (3F) και La Dicty Construct 2 Reverse Primer XhoI (3R2). Έτσι, μετά το πέρας της αντίδρασης ενίσχυσης των επιθυμητών τμημάτων, προκύπτουν προϊόντα που στα άκρα τους φέρουν θέσεις κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και XhoI. Η αντίδραση PCR ξεκινάει με ένα στάδιο μετουσίωσης σε θερμοκρασία 95 ο C για 5 λεπτά. Ακολουθούν 30 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από ένα βήμα μετουσίωσης στους 95 ο C για 20 δευτερόλεπτα, ένα στάδιο υβριδισμού για την σύνδεση των εκκινητών στους 55 ο C για 15 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο πολυμερισμού κατά το οποίο δρα η πολυμεράση στους 72 ο C για 15 δευτερόλεπτα. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με ένα στάδιο σε θερμοκρασία υβριδισμού 72 ο C για 5 λεπτά. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την Παρασκευή μειγμάτων τελικού όγκου 25μl φαίνονται στον Πίνακας 12. Πίνακας 12: Μείγμα για την αντίδραση PCR Αντιδραστήρια Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης (5x) Premixed dntps (10mM each) Forward primer(10μμ) Reverse primer (10μΜ) cdna (1:100) DNA πολυμεράση (HiFi, Kapa Biosystems) (1U/μl) Sterile ddη 2 Ο Συνολικός όγκος Όγκος 5 μl 0.75 μl 0.75 μl 0.75 μl 1 μl 0.5 μl 16.25 μl 25 μl Απομόνωση τμημάτων DNA Για το διαχωρισμό των τμημάτων DNA και τον προσδιορισμό του μεγέθους του καθενός, τα δείγματα ηλεκτροφορούνται σε πηκτή αγαρόζης 1%, η οποία παρασκευάζεται με την προσθήκη 0.3g αγαρόζης σε 30ml ΤΑΕ buffer 1x. Στη συνέχεια, το διάλυμα θερμαίνεται μέχρι να 57

Υλικά και Μέθοδοι διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης και να γίνει διαυγές. Αφού κρυώσει ακολουθεί προσθήκη 1μl Gel Red, ήπια ανάδευση και στη συνέχεια το διάλυμα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης όπου και αφήνεται να πήξει. Τα δείγματα που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν, προετοιμάζονται με την προσθήκη loading buffer 5x. Ως μάρτυρας μοριακού βάρους χρησιμοποιήθηκε ο Hyperladder II (Bioline). Η απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (DNA extraction from agarose gels) έγινε με βάση το πρωτόκολλο του kit NucleoSpin PCR clean-up, Gel extraction της MACHEREY-NAGEL. 1. Εξαγωγή του τμήματος DNA- Διάλυση της πηκτής: Αρχικά εξάγεται από την πηκτή αγαρόζης η ζώνη με το τμήμα του DNA που επιθυμούμε να απομονώσουμε με τη χρήση ενός αποστειρωμένου νυστεριού. Η εξαγωγή πραγματοποιείται με προσοχή ώστε να ελαχιστοποιηθεί όσο το δυνατόν ο περιττός όγκος της πηκτής. Το κομμάτι αυτό διαλύεται σε buffer NTΙ σε αναλογία 200μl buffer για κάθε 100mg πηκτής αγαρόζης (για πηκτή αγαρόζης μέχρι και 2%). Η διάλυση επιτυγχάνεται με θέρμανση στους 50 C για 5-10 λεπτά με ανάδευση κάθε 2-3 λεπτά. 2. Δέσμευση του DNA- Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Το δείγμα φορτώνεται σε στήλη, η οποία τοποθετείται σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2mL. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g, το έκλουσμα απομακρύνεται και η στήλη επανατοποθετείται στο συλλεκτικό σωλήνα. Προστίθενται 700μl NT3 buffer, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. 3. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης- Έκλουση του DNA Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις 11000 x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer NT3. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Ακολούθως, η στήλη μεταφέρεται σε νέο σωλήνα (Recovery Tube) και προστίθενται 15-30μl Elution Buffer NE. Ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό με σκοπό την αύξηση της απόδοσης της έκλουσης του DNA. Τέλος, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g. Το εκλουόμενο DNA φυλάσσεται στους -20 ο C. Σύνδεση τμημάτων DNA 58

Υλικά και Μέθοδοι Επωάζεται γραμμικός φορέας παρουσία των τμημάτων, που επιθυμούμε να συνδέσουμε, σε αναλογία φορέα προς τμήμα DNA 1:3, με την προσθήκη 1 Unit Τ4 DNA λιγάσης (1u/μl). Επιπλέον, είναι απαραίτητη η προσθήκη στο διάλυμα του ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος της λιγάσης το οποίο κατασκευάζεται από την ίδια εταιρεία. Το διάλυμα επωάζεται για 12-14h στους 16 ο C στην περίπτωση που χρησιμοποιείται ο φορέας pet-20b. Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθεί ο πλασμιδιακός φορέας psc-a, προστίθενται με την ακόλουθη σειρά τα εξής συστατικά: 3 μl Strataclone Cloning Buffer 2 μl PCR product (5-50ng) 1 μl Strataclone Vector Mix Ακολούθως, πραγματοποιείται επώαση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφορά πλασμιδιακού υλικού σε κύτταρα E. coli με ηλεκτροδιάτρηση (Electroporation) Σε 50μl επιδεκτικών κυττάρων κατάλληλων για ηλεκτροδιάτρηση γίνεται προσθήκη 1-2μl του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA και επώαση στον πάγο για 1 λεπτό. Στη συνέχεια τα κύτταρα μεταφέρονται σε κυβέττα 0.2cm (Biorad Gene Pulser ) και πραγματοποιείται ηλεκτρικό shock των κυττάρων ( pulse ) στο micropulser στο πρόγραμμα Ec2 (Biorad MicroPulser TM ). Έπειτα το μίγμα DNA-κύτταρων αφαιρείται από την κυβέττα και μεταφέρεται σε 1ml SOC medium. Ακολουθεί επώαση για 1,5 ώρες στους 37 ο C υπό ανάδευση (160 rpm). Τέλος,100-200μl της μετασχηματισμένης καλλιέργειας, επιστρώνονται σε τριβλία με στερεό θρεπτικό μέσο LB agar το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, ανάλογα με τα γονίδια ανθεκτικότητας που διαθέτει το εκάστοτε πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για το μετασχηματισμό (π.χ. για pet-20b αμπικιλλίνη). Επίσης, σε περίπτωση που το πλασμίδιο που χρησιμοποιείται διαθέτει το οπερόνιο της λακτόζης (π.χ. psc-a), είναι απαραίτητη η προσθήκη 20μl X-gal (2%) πριν την επίστρωση των κυττάρων, για να είναι δυνατή, στη συνέχεια, η επιλογή των λευκών αποικιών που θα περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο (blue/white screening). Τέλος, τα τριβλία επωάζονται στους 37 ο C για 12-14 ώρες. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα Οι θετικές αποικίες ενοφθαλμίζονται σε 3mL LB broth που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό. Ακολουθεί επώαση των καλλιεργειών για 12-14h στους 37 o C υπό ανάδευση (210 rpm). Η 59

Υλικά και Μέθοδοι ακόλουθη διαδικασία πραγματοποιείται με βάση το πρωτόκολλο απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από κύτταρα E. coli του kit NucleoSpin Plasmid της MACHEREY-NAGEL. 1. Συλλογή των βακτηριακών κυττάρων: Μεταφέρονται 1,5mL από την καλλιέργεια E. coli που αναπτύχθηκε σε ένα σωλήνα και φυγοκεντρούνται για 30s στις 11000 x g. Απομακρύνεται το υπερκείμενο και επαναλαμβάνεται αυτό το βήμα. 2. Λύση των κυττάρων: Προστίθενται 250μl buffer A1 και επαναδιαλύεται το ίζημα με τη βοήθεια πιπέτας και έντονη ανάδευση στο vortex. Ακολουθεί προσθήκη 250μl buffer A2 και ανάμειξη αναποδογυρίζοντας ήπια μερικές φορές χωρίς τη χρήση του vortex. Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 2-3 λεπτά. Ακολούθως προστίθενται 300μl buffer A3 και πραγματοποιείται ήπια ανάδευση αναποδογυρίζοντας μερικές φορές (6-8) αποφεύγοντας τη χρήση του vortex. Φυγοκέντρηση για 5-10 λεπτά στις 11000 x g σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Δέσμευση του DNA: Τοποθετείται η στήλη σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2ml στην οποία φορτώνεται το υπερκείμενο που έχει προκύψει από τη φυγοκέντρηση του προηγούμενου βήματος. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g και απομάκρυνση του εκλούσματος. 4. Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης: Επανατοποθετείται η στήλη στο συλλεκτικό σωλήνα και προστίθενται 600μl buffer A4 (με αιθανόλη). Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. 5. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης - Έκλουση του DNA: Επανατοποθετείτε η στήλη στο συλλεκτικό σωλήνα και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στις 11000 x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer Α4. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Τοποθετείται η στήλη σε νέο σωλήνα και προστίθενται 50μl buffer AE. Στη συνέχεια, επωάζεται το δείγμα για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g. Το εκλουόμενο πλασμιδικό DNA φυλάσσεται στους -20 ο C. 60

Υλικά και Μέθοδοι Ανάλυση των πλασμιδίων μετά από πέψη με ένζυμα περιορισμού Η πέψη με τη χρήση ενζύμων περιορισμού έχει σκοπό την υδρόλυση των φωσφοδιεστερικών δεσμών του DNA. Πλασμιδιακό DNA επωάζεται με το ένζυμο σε αναλογία 2 Units (ενζυμικές μονάδες)/μg DNA, παρουσία του κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο προτείνεται από την κατασκευαστική εταιρεία. Η ενζυμική μονάδα (Unit) ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που υδρολύει 1 μg DNA από βακτηριοφάγο σε μια ώρα, στους 37 ο C. Η αντίδραση διαρκεί περίπου 2-3 ώρες στους 37 ο C. Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική διαδικασία είναι τα NdeI (10u/μl) και XhoI (10u/μl). Εικόνα 18. Οι αλληλουχίες του DNA που αναγνωρίζουν τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και XhoI και οι θέσεις κοπής τους. Έκφραση των ανασυνδυασμένων τμημάτων Σε 5ml LB Broth με αμπικιλλίνη σε τελική συγκέντρωση 0.1mg/ml, ενοφθαλμίζονται κύτταρα BL21 (DE3) Rosetta που περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο (pet-20b με το εκάστοτε ανασυνδυασμένο τμήμα) και επωάζονται για 12-14 ώρες στους 37 ο C υπό ανάδευση (210 rpm). Ακολουθεί μεταφορά 2,5ml της Ο/Ν καλλιέργειας σε 500ml από φρέσκο θρεπτικό μέσο LB broth με αμπικιλλίνη. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 600nm (OD 600 ) και επώαση της καλλιέργειας στους 37 ο C υπό ανάδευση έως ότου το OD 600 φτάσει περίπου το 0,6 που αντιστοιχεί στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Προσθέτουμε IPTG (Isopropyl Thio Galactosyl) σε τελική συγκέντρωση 0,5mM. Το IPTG δρα ως επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης της οποίας ο προαγωγέας στο πλασμίδιο pet-20b, βρίσκεται μπροστά από τον polylinker. Η έκφραση του γονιδίου αυτού στα κύτταρα του E. coli αναστέλλεται από τον καταστολέα LacIQ. Το IPTG δεσμεύει και απομακρύνει τον καταστολέα από το DNA επιτρέποντας έτσι την έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης, η οποία με τη σειρά της θα 61

Υλικά και Μέθοδοι αναγνωρίσει τον προαγωγέα της στο πλασμίδιο και θα μεταγράψει τα γονίδια που βρίσκονται μετά από αυτόν, που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι το εκάστοτε ανασυνδυασμένο τμήμα. Μετά την προσθήκη του IPTG συνεχίζεται η επώαση της καλλιέργειας σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι καλλιέργειες φυγοκεντρούνται στις 6000 rpm για 20 min στους 4 ο C, το υπερκείμενο αφαιρείται και το ίζημα αποθηκεύεται στους -80 ο C. Απομόνωση των πρωτεϊνικών επικρατειών Α. Ομογενοποίηση των κυττάρων Πριν την ομογενοποίηση το ίζημα των κυττάρων επωάζεται στον πάγο μέχρι να ξεπαγώσει. Στη συνέχεια αναδιαλύεται σε 3-5 ml διαλύματος λύσης / gr νωπού βάρους κυττάρων. Το διάλυμα λύσης περιέχει από 2 έως 10 mm ιμιδαζόλιο, το οποίο ανταγωνίζεται τα κατάλοιπα ιστιδινών για την πρόσδεση στη στήλη νικελίου, μειώνοντας έτσι τη μη ειδική πρόσδεση πρωτεϊνών με ιστιδίνες στη χρωματογραφία. Στο κυτταρικό διάλυμα προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 1 mg/ml, ώστε να διευκολυνθεί η λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων και ακολουθεί επώαση στο πάγο για 30 λεπτά και ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Η ομογενοποίηση των κυττάρων γίνεται σε συσκευή υπερήχων με 5 χτυπήματα (bursts) σε ισχύ 25-50 W, διάρκειας 10 δευτερολέπτων το καθένα, στον πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 7000 rpm, για 15 λεπτά στους 4 ο C. Διαχωρίζεται το υπερκείμενο από το ίζημα και ακολουθεί υπερφυγοκέντρηση του υπερκειμένου στα 100000 x g για 30-45 λεπτά στους 4 C. Διάλυμα λύσης κυττάρων: Αντιδραστήριο Συγκέντρωση Νa 2 HPO 4 2Η 2 Ο 20mM NaCl 500mM Imidazole 5mM Πίνακας 13: Διάλυμα λύσης κυττάρων. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται στο 8. B. Απομόνωση των ανασυνδυασμένων επικρατειών Καθαρισμός διαλυτής πρωτεΐνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου Το υπερκείμενο το οποίο συλλέγεται μετά την υπερφυγοκέντρηση περνάει από στήλη νικελίου (Ni-NTA Agarose Qiagen), η οποία κατακρατά την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μέσω 62

Υλικά και Μέθοδοι σύνδεσης των ιστιδινών που περιέχει με τα άτομα του νικελίου και αφήνει τις υπόλοιπες πρωτεΐνες να τη διαπεράσουν. Με τη διαδικασία αυτή ωστόσο, είναι δυνατόν να κατακρατηθούν μερικές πρωτεΐνες διαφορετικές της επιθυμητής ανασυνδυασμένης που επίσης αλληλεπιδρούν με το νικέλιο. Για το λόγο αυτό, η στήλη ξεπλένεται με διαδοχικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις ιμιδαζολίου (διαλύματα 1-3) το οποίο ανταγωνίζεται τη δέσμευση των πρωτεϊνών στο νικέλιο. Έτσι, οι πρωτεΐνες που κατακρατούνται ασθενώς εκλούονται. Για την ανάκτηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, η στήλη ξεπλένεται με μεγάλη συγκέντρωση ιμιδαζολίου (100-250 mm) (Διάλυμα 4). Το ιμιδαζόλιο δεσμεύεται στα ακινητοποιημένα ιόντα νικελίου και ανταγωνίζεται τα κατάλοιπα ιστιδίνης των ανασυνδυασμένων πρωτεΐνών στη δέσμευση. Κυρίως στα κλάσματα που συλλέχθηκαν μετά τα την εφαρμογή του διαλύματος 4 θα αναζητηθεί στη συνέχεια η ύπαρξη της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Εικόνα 19. Αλληλεπίδραση μεταξύ γειτονικών καταλοίπων ιστιδίνης σε ουρά ιστιδινών με άτομο νικελίου του υλικού Ni-NTA. Με μπλε χρώμα αναπαρίσταται η πεπτιδική αλυσίδα όπου διακρίνονται οι δακτύλιοι ιμιδαζολίου των ιστιδινών, οι οποίοι δεσμεύονται από τον χηλικό προσροφητή του νικελίου, το νιτριλοοξικό οξύ. *Διάλυμα 1: Νa 2 HPO 4 2Η 2 Ο 20mΜ, NaCl 500mM, Ιmidazole 10mM *Διάλυμα 2: Νa 2 HPO 4 2Η 2 Ο 20mΜ, NaCl 500mM, Imidazole 20mM *Διάλυμα 3: Νa 2 HPO 4 2Η 2 Ο 20mΜ, NaCl 500mM, Imidazole 40mM *Διάλυμα 4: Νa 2 HPO 4 2Η 2 Ο 20μΜ, Nacl 500mM, Imidazole 100mM *Διάλυμα 5: Νa 2 HPO 4 2Η 2 Ο 20μΜ, Nacl 500mM, Imidazole 400mM 63

Υλικά και Μέθοδοι Ανίχνευση των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/ πολυακρυλαμιδίου Για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, η οποία αποτελείται από δύο επιμέρους πηκτές, τη πηκτή διαχωρισμού (separating gel) και τη πηκτή συγκέντρωσης (stacking gel). Η πηκτή συγκέντρωσης έχει περιεκτικότητα 4% σε ακρυλαμίδιο και ph 6.8. Η περιεκτικότητα της πηκτής διαχωρισμού εξαρτάται από το εύρος των μοριακών βαρών των πρωτεϊνών για το οποίο επιθυμούμε τη μέγιστη διαχωριστική ικανότητα, ενώ το ph είναι 8.8. Για τον βέλτιστο διαχωρισμό πρωτεϊνών με μοριακά βάρη από 20 έως 90 kda η περιεκτικότητα της πηκτής διαχωρισμού πρέπει να είναι 10%, ενώ για εύρος 10 έως 20 kda η περιεκτικότητα πρέπει να είναι 16%. Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν φορτωθούν στην πηκτή περιλαμβάνει την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος Loading Dye (2x) και την θέρμανση των δειγμάτων στους 98 ο C, για 5 λεπτά. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 7cm x 9cm x 1mm και η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 120V για 2 ώρες. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η πηκτή διαχωρισμού μεταφέρεται σε διάλυμα χρωματισμού (staining solution) Coomassie Brilliant Blue (Πίνακας ). Το διάλυμα θερμαίνεται ελαφρώς για 10 20 λεπτά και στη συνέχεια πραγματοποιείται αποχρωματισμός της πηκτής με 10% οξικό οξύ, διάλυμα αποχρωματισμού (destaining solution). Αντιδραστήρια Coomasie Brilliant Blue Methanol Acetic Acid Πίνακας 14: Σύσταση διαλύματος χρωματισμού. Ποσότητα 0.2% w/v 20% v/v 0.5% v/v Η διαδικασία αποχρωματισμού διαρκεί για περίπου 1-2 ώρες, αλλά κάθε μισή με μια ώρα είναι απαραίτητη η ανανέωση του διαλύματος. Στο τέλος της διαδικασίας είναι ευδιάκριτες οι ζώνες των πρωτεϊνών, εξαιτίας της μπλε χρωστικής Coomasie Brilliant Blue, ενώ είναι δυνατός και ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους των πρωτεϊνικών τμημάτων μέσω της σύγκρισης των ζωνών με τους μάρτυρες μοριακού βάρους. Τα κλάσματα που περιέχουν σε μεγαλύτερη καθαρότητα το εκάστοτε ανασυνδυασμένο πολυπεπτίδιο, διαπιδύονται στο διάλυμα 6 (dialysis buffer) και φυλάσσονται στους 4 ο C. Η συγκέντρωση της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίζεται με την μέθοδο Bradford. *Διάλυμα 6 (dialysis buffer): Tris-HCl ph:7.5 50mM, MgCl 2 5mM, NH 4 Cl 10mM, Glycerol 10% 64

Υλικά και Μέθοδοι Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Μετά τη διαπίδυση, τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη καθαρότητα από τη χρωματογραφία συγγένειας, χρησιμοποιήθηκαν για το δεύτερο στάδιο καθαρισμού. Το στάδιο αυτό περιλαμβάνει τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης (size exclusion chromatography) σε στήλη Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Στη χρωματογραφία μοριακής διήθησης οι πρωτεΐνες μετακινούνται διαμέσου ενός πορώδους υλικού και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους. Τα μικρότερα μόρια παγιδεύονται στους πόρους του υλικού της στήλης και διανύουν μεγαλύτερη απόσταση μέχρι την έξοδο από αυτήν. Έτσι οι πρωτεΐνες μεγαλύτερου μεγέθους που δεν εισέρχονται στους πόρους του υλικού, εκλούονται πρώτες από τη στήλη της μοριακής διήθησης και ακολουθούν οι μικρότερες. Η έξοδος της στήλης συνδέεται με ένα φασματοφωτόμετρο UV. Για κάθε κλάσμα που εξέρχεται από τη στήλη δίδεται η απορρόφηση στα 280 nm. Έτσι τα διάφορα κλάσματα που περνούν από τη στήλη αναπαριστώνται σε ένα γράφημα χρόνου-απορρόφησης. Εικόνα 20. Βασική αρχή λειτουργίας της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης. Τα μικρότερα μόρια παγιδεύονται στο πορώδες υλικό της στήλης (γκρι σφαίρες) και διανύουν μεγαλύτερη απόσταση μέχρι την έξοδο της στήλης. Τα μετρίου μεγέθους μόρια εισέρχονται στους πόρους του υλικού αλλά δεν διανύουν όλες τις δυνατές διαδρομές λόγω περιορισμού από το μέγεθός τους. Τα πολύ μεγάλα μόρια δεν εισέρχονται καθόλου στους πόρους του υλικού και εκλούονται πρώτα. 65

Υλικά και Μέθοδοι Τα κλάσματα που συλλέγονται από τη διαδικασία της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/ πολυακρυλαμιδίου για την ανίχνευση του εκάστοτε επιθυμητού πολυπεπτιδίου και τον έλεγχο της καθαρότητας. Τα δείγματα καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης διατηρούνται στους 4 C. Παραγωγή των πρόδρομων trna του D. discoideum με in vitro μεταγραφή Για τις μελέτες αλληλεπίδρασης χρησιμοποιήθηκαν τρία πρόδρομα trna του D. discoideum: τo pre-trna Arg CCU με τις ενδογενείς 5 οδηγό και 3 ακόλουθη αλληλουχίες, το pretrna GCU χωρίς 5 οδηγό αλληλουχία και με μεταλλαγμένη 3 ακόλουθη, και το pre-trna Ser GCU - Ser 5 flank με μία εξαιρετικά κοντή, μεταλλαγμένη 3 ακόλουθη αλληλουχία και μία μακριά, μεταλλαγμένη 5 οδηγό αλληλουχία (5 flank) (Εικόνα 21). Εικόνα 21. Δευτεροταγής δομή των πρόδρομων trna CCU Arg (αριστερά), trna GCU Ser (στη μέση) και trna GCU Ser - 5 flank (δεξιά). Για την παραγωγή των πρόδρομων trna, χρησιμοποιήθηκαν οι ανασυνδυασμένοι Arg πλασμιδιακοί φορείς puc57 (για το trna CCU και για το trna Ser GCU ) και pibi31 (για το trna Ser GCU - 5 flank) που περιέχουν το εκάστοτε γονίδιο καθοδικά του υποκινητή της RNA πολυμεράσης Τ7. Επιπλέον, για την εξασφάλιση μεταγράφων με το επιθυμητό 3 άκρο, τα γονίδια σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να φέρουν στο τέλος μία θέση αναγνώρισης από συγκεκριμένο περιοριστικό ένζυμο. 66

Υλικά και Μέθοδοι Οι ανασυνδυασμένοι φορείς αποκτήθηκαν μετά από σύνθεσή τους στην GenScript κατόπιν σχεδιασμού σε ειδικό λογισμικό ανάλυσης αλληλουχιών (ApE). Αρχικά, κύτταρα E. coli (DH5a) μετασχηματίζονται με τον εκάστοτε φορέα για τον πολλαπλασιασμό του πλασμιδιακού DNA. Ποσότητα πλασμιδιακού DNA από καλλιέργεια DH5a απομονώνεται και στη συνέχεια γραμμοποιείται με το κατάλληλο ένζυμο περιορισμού (πίνακας 15). Πλασμίδιο Ένζυμο περιορισμού Ρυθμιστικό δ/μα Arg Ser trna CCU trna GCU DraI 7 U/μg πλασμιδίου SspI 7 U/μg πλασμιδίου 1x FastDigest TM 1x SspI buffer Greenbuffer (Thermo) (NEB) trna Ser GCU -5 flank EcoRI 7 U/μg πλασμιδίου 1x Buffer H (Takara) dd H 2 O Μέχρι τελικό όγκο 50μl Μέχρι τελικό όγκο 50μl Μέχρι τελικό όγκο 50μl Πίνακας 15. Αντιδράσεις γραμμοποίησης για το εκάστοτε ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Το μίγμα επωάζεται στους 37 o C για 2 ώρες. Τα προϊόντα της αντίδρασης ελέγχονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% και παρατήρηση σε λάμπα υπεριώδους. Για την απομάκρυνση του ενζύμου η αντίδραση γραμμοποίησης υφίσταται εκχύλιση με προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης (25: 24: 1), ενώ το γραμμοποιημένο πλασμίδιο παραλαμβάνεται καθαρό μετά από κατακρήμνιση με 2.5 όγκους απόλυτης αιθανόλης και επώαση στους -80 ο C για 30 λεπτά. Το ίζημα του πλασμιδίου αναδιαλύεται σε 25-30 μl αποστειρωμένου dd H 2 O, επεξεργασμένο με DEPC. Για την μεταγραφή των γονιδίων των trna του D. discoideum, ποσότητα γραμμοποιημένου πλασμιδίου προστίθεται σε αντίδραση μεταγραφής: Arg Μεταγραφή γονιδίου trna CCU Ρυθμιστικό διάλυμα Τ7 (10x) 1x DTT 50 mm 5 mm Μίγμα ATP,CTP,UTP (100 mm το καθένα) 2 mμ Γραμμοποιημένο πλασμίδιο 8 μg RNase Inhibitor 80 Units Thermostable Inorganic Ppase 0.2 Units T7 RNA πολυμεράση 100 Units DEPC treated H 2 O Μέχρι τελικό όγκο 300 μl 67

Υλικά και Μέθοδοι Το μίγμα επωάζεται 12-16 ώρες στους 37 o C. Η μεταγραφή του γονιδίου του εκάστοτε trna χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα γραμμοποιημένο πλασμίδιο, τερματίζεται καθώς η Τ7 RNA πολυμεράση συναντά το φυσικό τέλος του γονιδίου (run-off transcription). Μετά το πέρας της μεταγραφής προστίθενται 4 μl DNase I (5U/μl) και 10 μl CaCl 2 (11mM) και το μίγμα επωάζεται για άλλη μισή ώρα στους 37 o C. Η αντίδραση υφίσταται εκχύλιση με προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης (25: 24: 1). Μετά την εκχύλιση, ακολουθεί κατακρήμνιση του RNA με 2.5 όγκους απόλυτης αιθανόλης και επώαση στους -80 ο C για 30 λεπτά. Το ίζημα του RNA αναδιαλύεται σε 30 μl αποστειρωμένου dd H 2 O, επεξεργασμένο με DEPC και 30 μl (2x) loading buffer for IVT. Στη συνέχεια, το RNA ηλεκτροφορείται σε αποδιατακτικό πήκτωμα ακρυλαμιδίου (PAGE) 10% με 8 Μ ουρίας. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα TBE. Η ζώνη που αντιστοιχεί στο πρόδρομο μόριο trna γίνεται ορατή με UV shadowing, εκτέμνεται και εκλούεται σε 300-400 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (Elution buffer for IVT) για 16 h (o/n) στους 4 o C. Ακολουθεί κατακρήμνιση του RNA με 2.5 όγκους απόλυτης αιθανόλης παρουσία 1/10 του όγκου 3Μ οξικού νατρίου ph 5.2 για 30 min στους -80 C. Το ίζημα παραλαμβάνεται με φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο στα 12000 x g για 30 min στους 4 o C και αφαίρεση του υπερκειμένου. Το ίζημα ξεπλένεται με 70% αιθανόλη και παραλαμβάνεται με φυγοκέντρηση, όπως πριν. Τέλος, αναδιαλύεται με 50-100 μl αποστειρωμένο dd H 2 O επεξεργασμένο με DEPC και φυλάσσεται στους -20 C. 5 Ραδιενεργή σήμανση των πρόδρομων trna με [γ- 32 P] ATP Για τη σήμανση των πρόδρομων trna στο 5 άκρο, προηγείται μια αντίδραση αποφωσφορυλίωσης και ακολουθεί η αντίδραση της σήμανσης. Για την αντίδραση της αποφωσφορυλίωσης αναμιγνύουμε τα εξής συστατικά: Αντίδραση Αποφωσφορυλίωσης 10x ρυθμιστικό διάλυμα Antarctic Phosphatase Antarctic Phosphatase (5 U/μl) pre-trna (10pmol/μl) DEPC treated ddη 2 Ο Όγκος 5 μl 1 μl 1 μl 43 μl 68

Υλικά και Μέθοδοι Η αντίδραση επωάζεται για 30 λεπτά στους 37 o C και τερματίζεται με προσθήκη 1μl EDTA (200 mm) και επώαση για 5 λεπτά στους 65 o C. Έπειτα, πραγματοποιείται εκχύλιση με φαινόλη και κατακρήμνιση με αιθανόλη. Το ίζημα αναδιαλύεται σε 10 μl DEPC treated H 2 O. Ακολουθεί η αντίδραση σήμανσης : Αντίδραση σήμανσης Pre-tRNA (5pmol/μl) 10x διάλυμα Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης T4 PNK (10 U/μl) RNasin (10 U/μl) [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ (6000 Ci/mmol) DEPC treated ddh 2 O Όγκος 1 μl 2 μl 1 μl 1 μl 3 μl 12 μl Το μίγμα επωάζεται για 1 ώρα στους 37 ο C και η αντίδραση σταματά με προσθήκη 1 μl EDTA (200 mm). Ύστερα από εκχύλιση με φαινόλη και κατακρήμνιση με αιθανόλη, το ίζημα αναδιαλύεται σε 25 μl DEPC treated ddη 2 Ο και απαλλάσσεται από νουκλεοτίδια με στήλη μοριακής διήθησης Sephadex (Mini Quick Spin Columns, ROCHE). Αρχικά η στήλη πακετάρεται με φυγοκέντρηση στα 1000 x g για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Το έκλουσμα απομακρύνεται και προστίθενται 300 μl DEPC treated ddh 2 O στη στήλη, η οποία φυγοκεντρείται υπό τις ίδιες συνθήκες. Στη συνέχεια φορτώνεται το δείγμα και εκλούεται με φυγοκέντρηση στα 1000 x g για 4 λεπτά. *10x ρυθμιστικό διάλυμα Antarctic Phosphatase : 500 mm Bis-Tris-Propane-HCl, 10 mm MgCl 2, 1mM ZnCl 2, ph 6.0. *10x ρυθμιστικό διάλυμα T4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης : 500 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm MgCl 2, 50 mm DTT. 69

Υλικά και Μέθοδοι Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) Η τεχνική EMSA βασίζεται στην παρατήρηση, ότι σύμπλοκα πρωτεΐνης-dna ή πρωτεΐνης- RNA παρουσιάζουν μειωμένη ηλεκτροφορητική κινητικότητα σε ένα μη αποδιατακτικό πήκτωμα από ότι τα ελεύθερα μόρια DNA ή RNA, αντίστοιχα. Σταθερή συγκέντρωση σημασμένου με [γ- 32 P] ATP προδρόμου trna, επωάζεται με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του εκάστοτε ανασυνδυασμένου τμήματος σε 1x διάλυμα πρόσδεσης ΒΒ παρουσία 1 U RNasin και 1 mm EGTA για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπόστρωμα (pre- trna) αποδιατάσσεται με επώαση στους 65 o C για 3 λεπτά, και αφήνεται να αναδιαταχτεί παρουσία της La, εφόσον αυτή προστεθεί κοντά στους 37 o C. Μετά την επώαση προστίθενται 3 μl γλυκερόλης 50% και τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύονται ηλεκτροφορητικά σε μη αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (Native PAGE) πυκνότητας 6% σε 3.5xTB στα 7 ma και 4 C. Το πήκτωμα ηλεκτροφορείται πριν το φόρτωμα των δειγμάτων (pre-run), στα 10 ma για 30 λεπτά στους 4 C. Οι ζώνες που αντιστοιχούν στα προϊόντα της αντίδρασης γίνονται ορατές με αυτοραδιογραφία. Για την σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης του RRM1 και του La motif-rrm1 με το pretrna Arg CCU, εφαρμόστηκε η διαδικασία UV cross-linking. Τα δείγματα των αυξανόμενων συγκεντρώσεων της πρωτεΐνης με το pre- trna Arg CCU, εκτέθηκαν για 1 λεπτό σε UV ακτινοβολία, τοποθετημένα 8 εκατοστά κάτω από μία λάμπα UV (254 nm). Το UV cross-linking λειτουργεί προάγοντας τη δημιουργία ομοιοπολικών δεσμών στα σημεία μεγάλης εγγύτητας μεταξύ της πρωτεΐνης και του νουκλεϊκού οξέος, ώστε να σταθεροποιήσει την αλληλεπίδραση και να διευκολύνει την ανίχνευσή της από την εκάστοτε μέθοδο. *Διάλυμα δέσμευσης 1xΒΒ: 50mM Tris-Cl ph 7.5, 10mM NH 4 Cl, 5mM MgCl 2. *Διάλυμα δέσμευσης 1xBB (UV cross-linking): 10mM Tris-Cl ph 7, 100mM KCl, 3mM MgCl 2 *Διάλυμα 3.5xΤΒ: 312mM Tris-base, 311mM borate 70

Υλικά και Μέθοδοι MicroScale Thermophoresis (MST) Το MST είναι μία μέθοδος ανίχνευσης αλληλεπιδράσεων μεταξύ βιομορίων όπως είναι οι πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα. Καταγράφει την κίνηση των μορίων κατά μήκος μίας μικροσκοπικής βαθμίδωσης θερμοκρασίας (thermophoresis) και ανιχνεύει αλλαγές στη σφαίρα ενυδάτωσης, το φορτίο και το μέγεθός τους. Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε από την εταιρία NanoTemper Technologies GmbH. Πειραματική διαδικασία: Το πρώτο βήμα είναι η σήμανση της πρωτεΐνης με τη φθορίζουσα χρωστική ΝΤ-647 που παρέχεται από την εταιρία. Έπειτα, δημιουργούνται 16 δείγματα τα οποία περιέχουν σταθερή συγκέντρωση σημασμένης πρωτεΐνης σε 1xΒΒ με 1mg/ml BSA και αυξανόμενες συγκεντρώσεις πρόδρομου trna. Κάθε δείγμα εισάγεται σε τριχοειδή σωληνάρια τα οποία τοποθετούνται στο Monolith NT.115. Αρχικά, τα σημασμένα μόρια διαχέονται ελεύθερα και είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα κατά μήκος του τριχοειδούς. Το Monolith NT.115 χρησιμοποιεί λέιζερ υπέρυθρου φωτός (IR-Laser) για να δημιουργήσει μία εντοπισμένη αύξηση θερμοκρασίας στο κέντρο κάθε τριχοειδούς. Αυτή η εντοπισμένη αύξηση της θερμοκρασίας ευνοεί την κίνηση των μορίων από το κέντρο του τριχοειδούς προς τα ψυχρότερα άκρα ή το αντίθετο (ανάλογα με το μόριο), κατά μήκος της βαθμίδωσης θερμοκρασίας (Φαινόμενο του Soret, θερμοδιάχυση). Η κινητικότητα ενός σημασμένου μορίου κατά μήκος της βαθμίδωσης θερμοκρασίας, διαφέρει σημαντικά από την κινητικότητα του συμπλόκου του σημασμένου μορίου με ένα μόριο στόχο εξαιτίας αλλαγών στο μέγεθος, το φορτίο και την επιδιαλύτωση. Μετά το κλείσιμο του λέιζερ, τα μόρια διαχέονται προς τα πίσω με την τάση να αποκαταστήσουν την ομοιόμορφη κατανομή. Το MST χρησιμοποιεί τον φθορισμό για να παρακολουθεί την κίνηση των μορίων και να καταγράφει τις αλλαγές σε αυτήν, παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του συνδέτη (πρόδρομο trna). Μετά το τέλος των μετρήσεων, το λογισμικό του Monolith NT.115 παράγει μία καμπύλη δέσμευσης από την οποία προκύπτει η σταθερά διάστασης του εκάστοτε συμπλόκου που μελετάται (Εικόνα 22). 71

Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 22. Αρχή λειτουργίας της μεθόδου MST. A: Δείγματα με σταθερή συγκέντρωση σημασμένου μορίου και διαδοχικές αραιώσεις του προσδέτη τοποθετούνται σε τριχοειδή. Η δημιουργία μιας μικροσκοπικής βαθμίδωσης θερμοκρασίας μέσα σε κάθε τριχοειδές επάγεται από ένα λέιζερ υπέρυθρου φωτός. Β: Η κατευθυνόμενη κίνηση του σημασμένου μορίου καταγράφεται από έναν ανιχνευτή φθορισμού πριν, κατά τη διάρκεια και μετά την εφαρμογή του λέιζερ. Γ: Η μείωση του φθορισμού μετά την εφαρμογή του λέιζερ είναι λιγότερο έντονη στα δεσμευμένα μόρια, καθώς αυτά κινούνται πιο αργά από ότι τα ελεύθερα μόρια. Δ: Διάγραμμα του φθορισμού σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του μορίου προσδέτη. ("MST Technology" by SciMarie - Own work. Licensed under CC BY-SA 4.0 via Wikimedia Commons) Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting analysis) Η ανάλυση αποτυπώματος χρησιμοποιήθηκε για την αποκάλυψη των θέσεων πρόσδεσης του εκάστοτε τμήματος της πρωτεΐνης επάνω στο μόριο του πρόδρομου trna Arg CCU. Η τεχνική αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι τα νουκλεοτίδια του RNA, στα οποία δεσμεύεται μία πρωτεΐνη, προστατεύονται από χημική τροποποίηση. Ως χημικοί τροποποιητές χρησιμοποιήθηκαν ριβονουκλεάσες (Τ1,V1, RNase A) οι οποίες διασπούν σε συγκεκριμένα σημεία το ριβοσωματικό κορμό, πλην της περιοχής που προστατεύεται από την δεσμευμένη πρωτεΐνη. 72

Υλικά και Μέθοδοι Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιλαμβάνει μία αντίδραση αλκαλικής υδρόλυσης, τρεις αντιδράσεις αλληλούχισης του trna Arg CCU (με Τ1,V1 και RNase A) και μία αντίδραση προστασίας από την RNase A παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του εκάστοτε πολυνουκλεοτιδικού τμήματος. Αντίδραση αλκαλικής υδρόλυσης Για την αλκαλική υδρόλυση, ραδιενεργά σημασμένο trna Arg CCU, αναμιγνύεται με μη σημασμένο trna Arg CCU και διάλυμα αλκαλικής υδρόλυσης. Το δείγμα θερμαίνεται στους 95 C για 8 λεπτά. Μετά το πέρας της επώασης, προστίθεται στο δείγμα loading buffer for IVT και φυλάσσεται στον πάγο. Αντιδράσεις αλληλούχισης Για την αλληλούχιση του trna Arg CCU, πραγματοποιήθηκε πέψη με Τ1 και πέψη με RNase A σε αποδιατακτικές συνθήκες: Arg Ραδιενεργά σημασμένο trna CCU Arg Μη σημασμένο trna CCU RNA sequencing buffer (1x) DEPC treated H 2 O 1 μl 1 μl 6 μl 1 μl Τα παραπάνω συστατικά επωάζονται στους 50 C για 5 λεπτά και μετά από άλλα 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, προστίθεται 1μl Τ1(1:10) ή RNase A (1:2000). Τα δείγματα επωάζονται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα τοποθετούνται στον πάγο. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε πέψη με V1 σε μη αποδιατακτικές συνθήκες: Arg Ραδιενεργά σημασμένο trna CCU Arg Μη σημασμένο trna CCU RNA structure buffer (10x) RNase V1 (1:10) DEPC treated H 2 O 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 6 μl Το μείγμα επωάζεται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα τοποθετείται στον πάγο. Όλες οι αντιδράσεις αλληλούχισης υφίστανται κατακρήμνιση με αιθανόλη και το ίζημα αναδιαλύεται σε 10 μl loading buffer for IVT. 73

Υλικά και Μέθοδοι Αντιδράσεις προστασίας Για τις αντιδράσεις προστασίας, πραγματοποιήθηκε πέψη του πρόδρομου trna Arg CCU με το ένζυμο RNase A σε μη αποδιατακτικές συνθήκες, παρουσία της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Αρχικά δημιουργήθηκε ένα μίγμα σημασμένου και μη σημασμένου πρόδρομου trna Arg CCU : Arg * trna CCU mix: μη σημασμένο trna Arg CCU (0.25μg/μl), ραδιενεργά σημασμένο trna Arg CCU (~ 110 CPS / μl) και RNA structure buffer (1x) To trna Arg CCU mix υφίσταται αποδιάταξη για 3 λεπτά στους 65 C και αφήνεται να επαναδιαταχθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επαναδιάταξη, 2 μl από το trna Arg CCU mix, αναμειγνύονται με 60x και 100x ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σε 1x RNA structure buffer και αφήνονται να αλληλεπιδράσουν 15 λεπτά στους 37 C και άλλα 15 λεπτά στον πάγο. Ως δείγμα Arg ελέγχου (control), 2 μl trna CCU mix αναμιγνύονται με structure buffer απουσία ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Έπειτα, σε κάθε αντίδραση προστίθεται 1 μl RNase A (1:2000) και ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Όλες οι αντιδράσεις προστασίας υφίστανται εκχύλιση με φαινόλη και κατακρήμνιση με αιθανόλη. Το ίζημα, αναδιαλύεται σε 10 μl loading buffer for IVT. Τελικά, όλες οι αντιδράσεις φορτώνονται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 10% με 8Μ ουρία. Τα προϊόντα των αντιδράσεων οπτικοποιούνται με αυτοραδιογραφία στο Phosphorimager Fujifilm FLA 3000. Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) Πολλά είδη ατομικών πυρήνων συμπεριφέρονται σαν να περιστρέφονται γύρω από έναν άξονα. Δεδομένου ότι είναι θετικά φορτισμένοι (λόγω των πρωτονίων), οι περιστρεφόμενοι πυρήνες λειτουργούν ως μικροσκοπικοί μαγνήτες και κατά συνέπεια μπορούν να αλληλεπιδρούν με ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Η ιδιότητα αυτή των πυρήνων ονομάζεται πυρηνικό σπιν. Τα πυρηνικά σπιν των μαγνητικών πυρήνων προσανατολίζονται κατά τυχαίο τρόπο απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Με την εφαρμογή όμως ενός ισχυρού μαγνητικού πεδίου, τα σπιν των πυρήνων αποκτούν συγκεκριμένο προσανατολισμό και διατάσσονται είτε παράλληλα 74

Υλικά και Μέθοδοι είτε αντιπαράλληλα προς το εξωτερικό πεδίο (Εικόνα 23). Ωστόσο, είναι πιο πιθανό να συμβεί ο παράλληλος προσανατολισμός καθώς αυτός ευνοείται ενεργειακά. Εικόνα 23. (α) Απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τα σπιν των μαγνητικών πυρήνων έχουν τυχαίο προσανατολισμό. (β) Υπό την επίδραση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τα σπιν των πυρήνων προσανατολίζονται είτε παράλληλα είτε αντιπαράλληλα με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Ωστόσο, η παράλληλη διάταξη (κόκκινη) έχει λιγότερη ενέργεια και συναντάται πιο συχνά. Όταν αυτοί οι προσανατολισμένοι πυρήνες ακτινοβοληθούν με κατάλληλης συχνότητας ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία, απορροφούν ενέργεια και μεταβαίνουν στην κατάσταση υψηλότερης ενέργειας (αναστροφή του σπιν σε φορά αντιπαράλληλη προς το εξωτερικά εφαρμοζόμενο πεδίο). Όταν συμβαίνει αυτή η αναστροφή, λέγεται ότι οι πυρήνες έχουν συντονιστεί με την εφαρμοζόμενη ακτινοβολία. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (NMR). Οι πυρήνες 1 Η και 13 C χρησιμοποιούνται πιο συχνά στη φασματοσκοπία NMR για τη μελέτη οργανικών μορίων. Ωστόσο, όλοι οι πυρήνες με περιττό αριθμό πρωτονίων και όλοι οι πυρήνες με περιττό αριθμό νετρονίων μπορούν να εκδηλώσουν το φαινόμενο του NMR. Η ενέργεια που απαιτείται για την αναστροφή του σπιν ενός πυρήνα μέσα σε ένα δεδομένο μαγνητικό πεδίο (συχνότητα συντονισμού), επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από το χημικό περιβάλλον, το οποίο τροποποιεί το μαγνητικό πεδίο που αισθάνονται οι πυρήνες ακόμα και του ίδιου τύπου (π.χ. πυρήνες 1 Η). Διαφορετικά περιβάλλοντα προστατεύουν σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό τους διαφορετικούς πυρήνες ενός μορίου από την επίδραση του εξωτερικού 75

Υλικά και Μέθοδοι μαγνητικού πεδίου. Την ιδιότητα αυτή αξιοποιεί η φασματοσκοπία NMR για να εξάγει πληροφορίες σχετικά με τη δομή πολύπλοκων βιομορίων. Αρχικά το δείγμα τοποθετείται σε έναν ισχυρό μαγνήτη, έπειτα ακτινοβολείται με ενέργεια ραδιοσυχνότητας και τέλος καταγράφεται η απορρόφηση αυτής της ακτινοβολίας. Ιδανικά, ο πυρήνας κάθε ξεχωριστού ατόμου μέσα στο υπό εξέταση μόριο, θα απορροφά διαφορετικές συχνότητες ραδιοσημάτων. Δεδομένου του ότι η συχνότητα συντονισμού κάθε πυρήνα, μπορεί να διαταράσσεται από γειτονικούς πυρήνες, είναι δυνατή η δημιουργία ενός χάρτη το διάβασμα του οποίου θα συμβάλλει στην αποκάλυψη της σχετικής θέσης των ατόμων μέσα σε ένα μόριο. Κατόπιν, η θέση κάθε ατόμου σε σχέση με τα υπόλοιπα, χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της συνολικής δομής του μορίου. Σήμερα, η χρήση της φασματοσκοπίας NMR για τη μελέτη της δομής των βιομορίων, μπορεί να προσφέρει πληροφορίες με μεγάλη λεπτομέρεια σε ατομικό επίπεδο όπως είναι η απόσταση μεταξύ δύο πυρήνων, η γωνία μεταξύ δύο δεσμών και ο προσανατολισμός. Επιπλέον, παρέχει τη δυνατότητα παρατήρησης δυναμικών φαινομένων όπως η χημική ανταλλαγή, η ευλυγισία των μορίων αλλά και η αλληλεπίδρασή τους με άλλα βιομόρια. Τέλος, επιτρέπει τη μελέτη των μορίων και των φαινομένων που προαναφέρθηκαν σε ένα περιβάλλον πολύ κοντά στο φυσικό τους, στο υδατικό διάλυμα. Προετοιμασία των δειγμάτων: Η προετοιμασία των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε από την ομάδα Βιομοριακής Προσομοίωσης και NMR της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών και συγκεκριμένα από τους Διονύση Βούρτση, Χρήστο Χασάπη και Αικατερίνη Αργυρίου. Για τη μελέτη των επικρατειών της πρωτεΐνης La, η έκφραση του κάθε τομέα πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3) με τη χρήση IPTG (0.5 mm). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο Μ9 minimal, εμπλουτισμένο με 1 g/l 15 NH 4 (SO 4 ) 2 ή/και 4 g/l ομοιόμορφα σημασμένη με 13 C γλυκόζη, ώστε να επιτευχθεί η σήμανση των πρωτεϊνών με 13 C και 15 Ν. Ο καθαρισμός των ανασυνδυασμένων τμημάτων έγινε με χρωματογραφία συγγένειας (His- Trap) και χρωματογραφία μοριακής διήθησης με τη χρήση Superdex 200 10/300 GL στήλης σε συνδυασμό με το σύστημα AKTA purifier 10 FPLC (GE Healthcare). Τα δείγματα για τα πειράματα φασματοσκοπίας NMR, προετοιμάστηκαν σε διάλυμα με 90% H 2 O (50 mm KPi, ph 6.9) και 10% 2 Η 2 Ο. Τα πειράματα διεξήχθησαν στο Bruker Avance III High-Definition four-channel 700MHz NMR spectrometer εξοπλισμένο με cryogenically cooled 5 mm 1 H- 13 C/ 15 N/D Z-gradient probe. 76

Αποτελέσματα 77

Αποτελέσματα Μοριακή κλωνοποίηση των τμημάτων που κωδικοποιούν τις επικράτειες La motif, RRM1 και La motif-rrm1 Τα τμήματα La motif, RRM1 και La motif-rrm1, ενισχύθηκαν με ξεχωριστές αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας ως μήτρα το γονίδιο La από cdna κλώνο της βιβλιοθήκης του D. discoideum. Τα αποτελέσματα της PCR φαίνονται στην (Εικόνα 24). Εικόνα 24. (α) Προϊόντα αντίδρασης PCR για το La motif (273 bp) (στήλη 2) και το RRM1 (297 bp)(στήλη 3) σε πηκτή αγαρόζης 1,5%. Η στήλη 1 αντιστοιχεί στο HyperLadder II (Bioline). (β) Προϊόν αντίδρασης PCR για το La motif-rrm1 (573 bp)(στήλη 5) σε πηκτή αγαρόζης 1%. Η στήλη 4 αντιστοιχεί στο HyperLadder I (Bioline). Τα ενισχυμένα με PCR τμήματα DNA απομονώθηκαν από το πήκτωμα αγαρόζης με τη χρήση του PCR clean-up, Gel extraction κιτ (MACHEREY NAGEL) σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή και ενσωματώθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα psc-a με τη μέθοδο του ΤΑ cloning. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για τον μετασχηματισμό βακτηριακών κυττάρων DH5a στα οποία πραγματοποιήθηκε πολλαπλασιασμός των πλασμιδιακών φορέων. Ακολούθησε απομόνωση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων τα οποία ελέχθησαν για τα ενθέματα (inserts) με τη χρήση των περιοριστικών ενζύμων NdeI και XhoI. 78

Αποτελέσματα Έπειτα, τα ανασυνδυασμένα τμήματα υποκλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακό φορέα pet20(b). Στον φορέα pet20(b), ο πολυσυνδέτης (polylinker) βρίσκεται καθοδικά του προαγωγέα της T7 RNA πολυμεράσης και ανοδικά της αλληλουχίας των ιστιδινών (His-Tag). Για τους λόγους αυτούς, χρησιμοποιήθηκε για την υπερέκφραση των ανασυνδυασμένων τμημάτων της πρωτεΐνης La σε κύτταρα E. coli (BL21) που θα απομονωθούν με χρωματογραφία συγγένειας. Μετά την υποκλωνοποίηση, τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pet20(b) απομονώθηκαν από τις βακτηριακές καλλιέργειες και υποβλήθηκαν σε πέψεις με τη χρήση των περιοριστικών ενζύμων NdeI και XhoI, για τον έλεγχο των ενθεμάτων (Εικόνα 25). Εικόνα 25. (α) Διαγνωστικές πέψεις σε ανασυνδυασμένους πλασμιδιακούς φορείς pet20(b) για την επιβεβαίωση της ενσωμάτωσης του La motif (στήλη 4) και του RRM1 (στήλη 3) σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 %. Οι στήλες 1 και 2 αντιστοιχούν στο HyperLadder II (Bioline) και στο δείγμα ελέγχου (άκοπο πλασμίδιο) αντίστοιχα. (β) Διαγνωστικές πέψεις σε ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pet20(b) για την επιβεβαίωση της ενσωμάτωσης του La motif-rrm1 (στήλη 6) σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Οι στήλες 5 και 7 αντιστοιχούν στο HyperLadder I (Bioline) και στο δείγμα ελέγχου αντίστοιχα. Επιπλέον, τα ενθέματα των φορέων των μετασχηματισμένων κυττάρων στάλθηκαν για αλληλούχιση. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης αναλύθηκαν με ομοπαράθεση χρησιμοποιώντας ειδικό λογισμικό (αλγόριθμος clustal W) και επιβεβαιώθηκε ότι τα ενθέματα που ενισχύθηκαν δε φέρουν καμία τυχαία μετάλλαξη. 79

Αποτελέσματα Έκφραση και απομόνωση των επικρατειών της πρωτεΐνης La Η επαγωγή της έκφρασης των ανασυνδυασμένων τμημάτων La motif, RRM1 και La motif- RRM1 σε κύτταρα E. coli (BL21), έγινε με 0.5 mm IPTG και επώαση των καλλιεργειών για 12-14 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση. Οι επικράτειες απομονώθηκαν από τα κυτταρικά εκχυλίσματα με χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας στήλη ακινητοποιημένου νικελίου (Ni-NTA Agarose Qiagen). Τα αποτελέσματα της απομόνωσης εξετάστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτική πηκτή πολυακριλαμιδίου (SDS PAGE) (Εικόνα 26). Εικόνα 26. Απομόνωση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με χρωματογραφία συγγένειας. (α) Απομόνωση του La motif (10,5 kd). 1: ColorPlus Prestained Protein Ladder, Broad Range (NEB). 2: Kυτταρικό εκχύλισμα πριν τη φόρτωση στη στήλη νικελίου (Input). 3: Έκλουσμα αμέσως μετά τη φόρτωση του κυτταρικού εκχυλίσματος στη στήλη νικελίου(flow-through). Ακολουθούν τα εκλούσματα μετά το ξέπλυμα της στήλης με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ιμιδαζολίου (4-9). (β) και (γ) Απομόνωση του RRM1 (11,4 kd) και του La motif-rrm1 (22 kd) αντίστοιχα. 1: Input. 2: Flow-through. 3-9 : Aυξανόμενες συγκεντρώσεις ιμιδαζολίου. 10: Protein Ladder (NEB). Όλες οι επικράτειες που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη υπερεκφράζονται πολύ ικανοποιητικά στο ετερόλογο σύστημα βακτηρίων και εμφανίζονται στο διαλυτό κλάσμα κατά τις διαδικασίες καθαρισμού. Τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση και τη μεγαλύτερη 80

Αποτελέσματα καθαρότητα ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε περαιτέρω καθαρισμό με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε σε στήλη Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Αυτός ο περαιτέρω καθαρισμός κρίθηκε σημαντικός για την απομάκρυνση βακτηριακών ενζύμων που διασπούν το RNA (RNases) και πιθανόν παρέμειναν μετά την απομόνωση με χρωματογραφία συγγένειας. Τα κλάσματα που αποκτήθηκαν με τη διαδικασία της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης αναλύθηκαν σε αποδιατακτική πηκτή πολυακριλαμιδίου (SDS PAGE) (Εικόνα 27). Εικόνα 27. Καθαρισμός των ανασυνδυασμένων τμημάτων La motif (α), RRM1 (β) και La motif-rrm1 (γ). Η στήλη L αντιστοιχεί στον Protein Ladder (NEB). Τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη καθαρότητα χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμασίες αλληλεπίδρασης με τα πρόδρομα trna που ακολούθησαν. 81

Αποτελέσματα Παραγωγή των πρόδρομων trna με in vitro transcription Για την κατασκευή των πρόδρομων trna, χρησιμοποιήθηκαν οι ανασυνδυασμένοι πλασμιδιακοί φορείς που περιέχουν το εκάστοτε γονίδιο καθοδικά του υποκινητή της RNA πολυμεράσης Τ7 και ανοδικά μιας θέσης αναγνώρισης από κατάλληλο περιοριστικό ένζυμο. Αρχικά, κάθε ανασυνδυασμένος φορέας γραμμοποιήθηκε με το κατάλληλο περιοριστικό ένζυμο, ώστε το προϊόν της in vitro μεταγραφής να διαθέτει το επιθυμητό 3 άκρο. Τα αποτελέσματα της γραμμοποίησης αναλύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 1% (Εικόνα 28). Εικόνα 28. Γραμμοποίηση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. 1: Άκοπο πλασμίδιο (control). 2: προϊόντα γραμμοποίησης. α) Γραμμοποίηση του puc57- trna Arg CCU με DraI. Σημειώνεται πως ο ανασυνδυασμένος φορέας περιέχει τρεις θέσεις αναγνώρισης από το DraI, η μία εκ των οποίων βρίσκεται στο τέλος του γονιδίου του trna Arg Ser CCU. β) Γραμμοποίηση puc57- trna GCU με SSPI. O ανασυνδυασμένος φορέας περιέχει δύο θέσεις αναγνώρισης από το SSPI. γ) Γραμμοποίηση pιβι31- (trna Ser GCU -5 flank) με EcoRI σε μία μοναδική θέση στο τέλος του γονιδίου. Τα προϊόντα της γραμμοποίησης χρησιμοποιήθηκαν για τη διαδικασία της in vitro μεταγραφής με την RNA πολυμεράση Τ7. Ο προαγωγέας της πολυμεράσης T7 βρίσκεται ανοδικά του εκάστοτε γονιδίου, εντός της κλωνοποιημένης περιοχής. Ο τερματισμός της μεταγραφής επιτυγχάνεται μέσω της διαδικασίας run-off transcription κατά την οποία, η μεταγραφή σταματάει όταν η πολυμεράση συναντά το τέλος της αλυσίδας DNA που χρησιμοποιεί ως εκμαγείο και αποδεσμεύεται από αυτήν. Τα προϊόντα της in vitro μεταγραφής αναλύθηκαν σε αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμιδίου (UREA PAGE) και οπτικοποιήθηκαν με UV shadowing (Εικόνα 29). 82

Αποτελέσματα Εικόνα 29. In vitro μεταγραφή των γονιδίων trna CCU Arg (2 & 3), trna GCU Ser (4 & 5) και trna GCU Ser 5 flank (6 & 7), από γραμμοποιημένο φορέα. 1: Πρόδρομο trna σερίνης για τον έλεγχο του μεγέθους. Κατά τη διαδικασία της in vitro μεταγραφής με την RNA πολυμεράση T7, παρατηρήθηκε ότι η μεταγραφή των trna Ser GCU και trna Ser GCU 5 flank είχε καλύτερη απόδοση από τη μεταγραφή του trna Arg Arg CCU. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο παραπροϊόν που παράγεται μαζί με το trna CCU και διακρίνεται στις στήλες 2 και 3 ως ζώνη μεγαλύτερου μοριακού μεγέθους. Ενδεχομένως το παραπροϊόν μεγαλύτερου μοριακού μεγέθους να προκύπτει από ελαττωματική αποδέσμευση της πολυμεράσης από τη μη κωδική αλυσίδα του DNA και συνέχιση της μεταγραφής χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την κωδική. Δοκιμασίες αλληλεπίδρασης των ανασυνδυασμένων τμημάτων με τα πρόδρομα trna Electrophoresis mobility shift assay (EMSA) Το πρόδρομα trna που παρασκευάστηκαν με τη διαδικασία της in vitro μεταγραφής, σημάνθηκαν με γ- 32 P ATP στο 5 άκρο και χρησιμοποιήθηκαν για τις μελέτες αλληλεπίδρασης με τις επιμέρους επικράτειες της πρωτεΐνης La. Σε ένα πρώτο στάδιο, η επικράτεια La motif εξετάστηκε με EMSA ως προς την δυνατότητά αλληλεπίδρασης με κάθε ένα από τα τρία πρόδρομα trna. Σταθερή συγκέντρωση σημασμένου πρόδρομου trna επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του πρωτεϊνικής επικράτειας. Στη συνέχεια, τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε μη αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πυκνότητας 8% σε 3.5xTB, στα 7 ma και 4 C. Τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν με αυτοραδιογραφία στο Phosphorimager Fujifilm FLA 3000 (Εικόνα 30 και Εικόνα 31). 83

Αποτελέσματα Εικόνα 30. α) Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρόδρομου trna Ser (χωρίς 5 -οδηγό αλληλουχία και με μεταλλαγμένη 3 -ακόλουθη αλληλουχία), παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων La motif. β) Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρόδρομου trna Ser -5 flank (με μακριά μεταλλαγμένη 5 -οδηγό αλληλουχία και μειωμένη 3 -ακόλουθη αλληλουχία), παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων La motif. Δεν ανιχνεύεται αλληλεπίδραση σε καμία από τις δύο περιπτώσεις. Εικόνα 31. Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρόδρομου trna Arg (με τις ενδογενείς 5 οδηγό και 3 ακόλουθη αλληλουχίες), παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων La motif. Η δεύτερη ζώνη που αρχίζει να φαίνεται από τα 40 μμ πρωτεΐνης, είναι ενδεικτική της αλληλεπίδρασης της επικράτειας La motif με το πρόδρομο trna. 84

Αποτελέσματα Από τα προκαταρκτικά πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, προέκυψε ότι το La motif αλληλεπιδρά μόνο με το πρόδρομο trna Arg. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η πρωτεΐνη La παρουσιάζει προτίμηση στις τερματικές ουριδίνες που υπάρχουν στο 3 άκρο των πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ και το πρόδρομο trna Arg είναι το μόνο από τα τρία υποστρώματα που διαθέτει τα ενδογενή 5 και 3 άκρα. Υπενθυμίζεται ότι τα trna Ser και trna Ser -5 flank που χρησιμοποιήθηκαν διαθέτουν μεταλλαγμένη 3 ακόλουθη αλληλουχία, από την οποία απουσιάζουν οι τερματικές ουριδίνες. Αξίζει να σημειωθεί, ότι είναι η πρώτη φορά που ανιχνεύεται η δυνατότητα δέσμευσης της απομονωμένης επικράτειας La motif στο RNA. Στη διαθέσιμη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι η επικράτεια La motif αδυνατεί να δεσμεύσει RNA στόχους απουσία της γειτονικής επικράτειας RRM1 [151]. Ωστόσο, μελέτες επί της δομής του La motif έδειξαν ότι τόσο στην ανθρώπινη [26], όσο και στην ομόλογη πρωτεΐνη του T. brucei [32], η επικράτεια αυτή υιοθετεί μία αναδίπλωση που συναντάται συχνά σε πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεϊκά οξέα (winged helix). Επιπλέον, η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου της ανθρώπινης La NTD με ένα συνθετικό πολύ (U) RNA, κατέρριψε τη θεωρία που ήθελε το συντηρημένο RRM μοτίβο να ευθύνεται για την αναγνώριση της αλληλουχίας UUU OH. Αποκάλυψε πως η ανθρώπινη πρωτεΐνη δεν χρησιμοποιεί το RRM για την εξειδικευμένη αναγνώριση της αλληλουχίας 3 UUU OH, παρά μόνο για να δημιουργήσει μία σχισμή μεταξύ της β πτυχωτής επιφάνειάς και της δομής winged helix, στην οποία θα σφηνώσει το συγκεκριμένο RNA [27]. Περαιτέρω κρυσταλλική ανάλυση της NTD περιοχής της ανθρώπινης πρωτεΐνης La με μία σειρά από μονόκλωνα RNA αποκάλυψε πως μόνο το La motif συμμετείχε σε δεσμούς με τις ουριδίνες του 3 -άκρου των μορίων αυτών [28]. Ενδεχομένως αυτή να είναι η αιτία που η απομονωμένη επικράτεια La motif φάνηκε να διακρίνει το πρόδρομο trna Arg από τα άλλα δύο υποστρώματα που δεν διέθεταν τις τερματικές ουριδίνες στο 3 άκρο. Μετά την ανίχνευση της εξειδικευμένης δέσμευσης του La motif στο πρόδρομο trna Arg με τα ενδογενή άκρα, τα πειράματα αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, τα MST αλλά και η ανάλυση αποτυπώματος που ακολούθησε με τις υπόλοιπες επικράτειες της πρωτεΐνης, εστιάστηκαν σε αυτό το υπόστρωμα. 85

Αποτελέσματα Αρχικά, η αλληλεπίδραση των επικρατειών RRM1 και La motif-rrm1 με το πρόδρομο trna Arg εξετάστηκε με δοκιμασία αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, κάτω από τις ίδιες (με το La motif) συνθήκες (Εικόνα 32). Εικόνα 32. Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρόδρομου trna Arg παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων RRM1 (α) και La motif-rrm1 (β). Το σχηματιζόμενο σύμπλοκο με την εκάστοτε επικράτεια (RNP), φαίνεται να εγκλωβίζεται στα πηγάδια του πηκτώματος. Κατά τη δοκιμασία αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρόδρομου trna Arg με τις επικράτειες RRM1 και La motif-rrm1, παρατηρήθηκε ότι σχηματιζόταν ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (RNP), το οποίο εγκλωβιζόταν στα πηγάδια του πηκτώματος. Αυτό μάλλον οφείλεται στις φυσικοχημικές ιδιότητες του μοτίβου RRM1 (pi: 8,05), που εμποδίζουν τη μετακίνησή του κατά μήκος της διαφοράς τάσης που εφαρμόζεται στην πηκτή. Επιπλέον, φαίνεται ότι οι εν λόγω επικράτειες δεσμεύονται πολύ ισχυρά στο υπόστρωμα, με αποτέλεσμα τη δημιουργία αδιάλυτου συμπλόκου που παρατηρήθηκε ως ίζημα κατά την προετοιμασία των δειγμάτων. Για τους λόγους αυτούς, η διαδικασία UV crosslinking προηγήθηκε 86

Αποτελέσματα της επανάληψης των εν λόγω πειραμάτων και επέτρεψε την οπτικοποίηση του συμπλόκου στο μη αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (Εικόνα 33). Εικόνα 33. Δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρόδρομου trna Arg παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων RRM1 (α) και La motif-rrm1 (β), μετά από UV crosslinking. Με βέλη υποδηλώνονται το ελεύθερο RNA και το σχηματιζόμενο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. Όλες οι επικράτειες της πρωτεΐνης La που εξετάστηκαν με τη δοκιμασία αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (La motif, RRM1 και La motif-rrm1), παρουσιάζουν δυνατότητα δέσμευσης στο πρόδρομο trna Arg CCU. Η ένταση των ζωνών ποσοτικοποιήθηκε με ειδικό λογισμικό ανάλυσης εικόνας (AIDA/1D Evaluation). Πρέπει να σημειωθεί, ότι η ποσοτικοποίηση των ζωνών στα συγκεκριμένα πειράματα δεν μπορεί να θεωρηθεί ακριβής λόγω του εγκλωβισμού ενός ποσοστού του συμπλόκου στα πηγάδια και της άνισης κατανομής της ραδιενέργειας. Παρόλα αυτά, χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία καμπύλης δέσμευσης και τον υπολογισμό της σταθεράς διάστασης ως μία πρώτη εκτίμηση της συγγένειας της εκάστοτε επικράτειας για το πρόδρομο trna (Εικόνα 34). 87

Αποτελέσματα Εικόνα 34. Ανάλυση αποτελεσμάτων των δοκιμών αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας για τον προσδιορισμό της σταθεράς διάστασης K d. α-γ) Καμπύλες δέσμευσης για το σύμπλοκο της εκάστοτε επικράτειας με το pre-trna Arg. Σε κάθε γράφημα ενσωματώνεται το αντίστοιχο scatchard plot. δ) Σύγκριση των ξεχωριστών scatchard plots στο ίδιο γράφημα. Τα δεδομένα της ποσοτικοποίησης αναλύθηκαν με το λογισμικό GraphPad Prism. Σε κάθε καμπύλη δέσμευσης, στον άξονα Y τοποθετήθηκε το κλάσμα του δεσμευμένου πρόδρομου trna και στον άξονα Χ οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης που χρησιμοποιήθηκαν. Η μέγιστη δεσμευτική ικανότητα Bmax και η σταθερά διάστασης συμπλόκου υπολογίστηκαν από το λογισμικό με βάση την καμπύλη δέσμευσης. Η κλίση της γραμμής στα scatchard plots είναι αντιπροσωπευτική της σταθεράς διάστασης του εκάστοτε συμπλόκου. Από την ανάλυση των πειραμάτων αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, προέκυψε ότι η επικράτεια La motif- RRM1 παρουσιάζει τη μεγαλύτερη συγγένεια για το πρόδρομο trna Arg με σταθερά διάστασης 9.2 88

Αποτελέσματα μμ, ενώ οι επικράτειες La motif και RRM1 παρουσιάζουν παρόμοια συγγένεια για το υπόστρωμα με σταθερές διάστασης 17.3 μμ και 19.7 μμ αντίστοιχα. MicroScale Thermoforesis (MST) Για τον ακριβή προσδιορισμό της συγγένειας δέσμευσης, η αλληλεπίδραση της κάθε επικράτειας με το πρόδρομο trna Arg εξετάστηκε και με τη δοκιμασία MST. Σταθερή συγκέντρωση σημασμένης πρωτεΐνης επωάστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις πρόδρομου trna Arg. Για την αξιολόγηση των δεδομένων από το MST και τον υπολογισμό της σταθεράς διάστασης του συμπλόκου (K d ) από το λογισμικό NT Analysis Software, χρησιμοποιήθηκε η διαφορά του φθορισμού μεταξύ δύο χρονικών σημείων του πειράματος: πριν την ενεργοποίηση του υπέρυθρου λέιζερ και αμέσως μετά το σβήσιμό του (Thermophoresis + T-Jump) (Εικόνα 35, Εικόνα 36 και Εικόνα 37). Εικόνα 35. Καμπύλη υπολογισμού της σταθεράς διάστασης για το σύμπλοκο La motif : pre-trna Arg από τα δεδομένα της δοκιμασίας MST. Στον X άξονα τοποθετείται η συγκέντρωση του πρόδρομου trna και στον Y άξονα η διαφορά της έντασης φθορισμού ανάμεσα σε δύο χρονικά σημεία. 89

Αποτελέσματα Εικόνα 36. Καμπύλη υπολογισμού της σταθεράς διάστασης για το σύμπλοκο RRM1 : pre-trna Arg από τα δεδομένα της δοκιμασίας MST. Εικόνα 37. Καμπύλη υπολογισμού της σταθεράς διάστασης για το σύμπλοκο La motif-rrm1 : pre-trna Arg από τα δεδομένα της δοκιμασίας MST. 90

Αποτελέσματα Η δοκιμασία MST επαλήθευσε τα αποτελέσματα των πειραμάτων αλλαγής ηλεκτροφορητικής ικανότητας. Φαίνεται πως και τα τρία ανασυνδυασμένα τμήματα διαθέτουν δυνατότητα δέσμευσης στο πρόδρομο trna Arg. Επιπλέον, λόγω της αυξημένης ευαισθησίας της μεθόδου MST σε σχέση με τη δοκιμασία αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, ήταν δυνατός ο υπολογισμός της σταθεράς διάστασης σε nm. Η σταθερά διάστασης του συμπλόκου που προέκυψε από τα πειράματα MST αντιστοιχεί στη συγκέντρωση του trna Arg στην οποία παρατηρείται η μισή της μέγιστης επίδρασης στην αλλαγή του φθορισμού (Πίνακας 16). Ανασυνδυασμένη Επικράτεια Σταθερά διάστασης Απόκλιση ( ± nm ) συμπλόκου (nm) La motif 56.7 2.6 RRM1 5.47 1.1 La motif-rrm1 206 9.3 Πίνακας 16. Σταθερές διάστασης του συμπλόκου της εκάστοτε επικράτειας με το πρόδρομο trna Arg Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting Analysis) Σε συνέχεια της επιβεβαίωσης της δεσμευτικής ικανότητας του κάθε τομέα για το πρόδρομο trna Arg CCU, τα νουκλεοτίδια που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση αποκαλύφθηκαν με ανάλυση αποτυπώματος. Αρχικά, προηγήθηκε μία αντίδραση αλκαλικής υδρόλυσης η οποία χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας μοριακών βαρών στο αποδιατακτικό πήκτωμα PAGE UREA. Έπειτα, το πρόδρομο trna επεξεργάστηκε σε μη αποδιατακτικές συνθήκες με την RNase V1 για τον εντοπισμό των δίκλωνων περιοχών και σε αποδιατακτικές συνθήκες με την RNase T1 για τον εντοπισμό μονόκλωνων G. Επίσης, επωάστηκε σε αποδιατακτικές συνθήκες με την RNase A για τον εντοπισμό μονόκλωνων C και U αλλά και σε μη αποδιατακτικές συνθήκες με το ίδιο ένζυμο για τη δημιουργία αντίδρασης ελέγχου (control). Οι αντιδράσεις προστασίας πραγματοποιήθηκαν με την RNase A παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της εκάστοτε ανασυνδυασμένης επικράτειας. Τα προϊόντα των αντιδράσεων αναλύθηκαν σε αποδιατακτικό πήκτωμα PAGE-UREA (10%, 8M). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αποτυπώματος οπτικοποιήθηκαν με αυτοραδιογραφία στο Phosphorimager Fujifilm FLA 3000 (Εικόνα 38). 91

Αποτελέσματα Εικόνα 38. (α) Αποτελέσματα ανάλυσης αποτυπώματος. 1: Πρόδρομο trna CCU Arg, 2: Αλκαλική υδρόλυση, 3: Επεξεργασία με V1. 4: Επεξεργασία με T1. 5: Επεξεργασία αποδιαταγμένου RNA με RNaseA. 6: Αντίδραση ελέγχου (control). 7-8: Επεξεργασία με RNaseA παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων La motif και 9-10: Επεξεργασία με RNaseA παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων RRM1. Η προστασία από τη δράση της RNaseA παρατηρείται ως ζώνη που εξαφανίζεται (κίτρινα τετράγωνα). 92

Αποτελέσματα Εικόνα 39. Δευτεροταγής δομή του πρόδρομου trna Arg CCU. Με κόκκινο αστερίσκο σημειώνονται τα νουκλεοτίδια που προστατεύονται από τη δράση της RNaseA στην ανάλυση αποτυπώματος. Τα νουκλεοτίδια U74 και U76 προστατεύονται μόνο παρουσία της επικράτειας La motif. Τα νουκλεοτίδια U33, C34 και U36 που βρίσκονται στο anticodon loop, προστατεύονται παρουσία της επικράτειας La motif αλλά και παρουσία του RRM1. Τα νουκλεοτίδια αυτά αποτελούν τα πιθανά σημεία αλληλεπίδρασης με τις ανασυνδυασμένες επικράτειες της πρωτεΐνης La. Τόσο το La motif όσο και το RRM1 έχουν τη δυνατότητα να προστατεύουν και άρα πιθανώς αλληλεπιδρούν με την περιοχή του αντικωδικονίου (U33, C34, U36), ενώ αλληλεπίδραση Arg με το La motif φαίνεται να εντοπίζεται και στο 3 -OH του πρόδρομου trna CCU (U74, U76). Η αλληλεπίδραση του La motif με το 3 -OH του πρόδρομου trna Arg CCU, ενδεχομένως εξηγεί την εξειδίκευση που εκδήλωσε αυτή η επικράτεια ως προς τα τρία υποστρώματα που μελετήθηκαν αρχικά. Επιπλέον, συμφωνεί με τα δεδομένα που προέκυψαν από την κρυσταλλική ανάλυση της ανθρώπινης πρωτεΐνης με μία σειρά από συνθετικά μόρια RNA, και υποδήλωναν πως μόνο το La motif δημιουργεί δεσμούς με τις τερματικές ουριδίνες [28]. Η αλληλεπίδραση με το anticodon loop έχει αναφερθεί και για την πρωτεΐνη La του S. cerevisiae, όταν αυτή επωάστηκε με το ενδογενές trna Arg του οργανισμού αυτού [48]. Ωστόσο, στην εν λόγω μελέτη, η προσέγγιση του anticodon loop αποδίδεται στο C- τελικό άκρο της πρωτεΐνης καθώς δεν ανιχνεύθηκε αλληλεπίδραση παρουσία της απομονωμένης TND περιοχής. Η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης των δύο επικρατειών με τα ξεχωριστά σημεία του πρόδρομου trna, θα πρέπει να εξετασθεί με άλλες μεθόδους. Η τρισδιάστατη δομή του συμπλόκου της εκάστοτε επικράτειας με το πρόδρομο trna, αλλά και η σύγκρισή της με τη δομή ολόκληρης της πρωτεΐνης σε σύμπλοκο με το εν λόγω υπόστρωμα, ενδεχομένως να μπορούσε να καθορίσει τη φύση των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης με το 3 άκρο και το anticodon loop. 93

Αποτελέσματα Δομικός χαρακτηρισμός των ανασυνδυασμένων επικρατειών Σε ένα πρώτο στάδιο, η τριτοταγής διαμόρφωση της κάθε επικράτειας στο διάλυμα μελετήθηκε με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού από την ομάδα Βιομοριακής Προσομοίωσης & ΝΜR της Φαρμακευτικής σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται τα προκαταρκτικά HSQC και TROSY φάσματα. Τα συγκεκριμένα φάσματα παρέχουν πληροφορίες για την σταθερή αναδίπλωση των μεταλλαγμάτων που δημιουργήθηκαν και επιτρέπουν την ταυτοποίηση των σημάτων του πολυπεπτιδικού σκελετού. Εικόνα 40. (α) [ 1 Η- 15 Ν] HSQC φάσματα ομοιόμορφα [ 1 Η/ 15 Ν]-επισημασμένου La motif και RRM1. Κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε ένα ξεχωριστό αμινοξικό κατάλοιπο. Οι διασταυρούμενες κορυφές στο φάσμα του RRM1 υποδηλώνουν πως ορισμένα αμινοξικά κατάλοιπα βρίσκονται σε δύο ξεχωριστές διαμορφώσεις. (β) Πρόβλεψη δευτεροταγούς δομής από το PECAN. Τα διαγράμματα απεικονίζουν την πιθανότητα του κάθε αμινοξέος να συμμετάσχει στο σχηματισμό μιας α-έλικας (>0) ή ενός β-φύλλου (<0) [152]. Κάθε κορυφή σε ένα [ 1 Η- 15 Ν] HSQC φάσμα αντιπροσωπεύει ένα ξεχωριστό αμινοξικό κατάλοιπο της πρωτεΐνης. Η καλή διασπορά και το μικρό εύρος των κορυφών, είναι ενδεικτικά 94

Αποτελέσματα σταθερής αναδίπλωσης των ανασυνδυασμένων τμημάτων και επέτρεψαν μία σχεδόν πλήρη ταυτοποίηση των σημάτων. Όσον αφορά την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής, φαίνεται ότι το La motif διαθέτει 4/5 α-έλικες και τρία μικρά β-πτυχωτά φύλλα. Αυτή η κατανομή των στοιχείων της δευτεροταγούς δομής είναι παρόμοια με εκείνη του ανθρώπινου La motif. Το RRM1 περιλαμβάνει 3-α έλικες και 4 β-φύλλα ακολουθώντας το ίδιο μοτίβο που συναντάται και στην ανθρώπινη πρωτεΐνη. Εικόνα 41. (α) [ 1 H 15 N] TROSY φάσμα ομοιόμορφα [ 15 N]-επισημασμένου La motif-rrm1. (β) Πρόβλεψη δευτεροταγούς δομής από το TALOS+ για το La motif-rrm1 (επάνω διάγραμμα) και σύγκριση με την πρόβλεψη για τις απομονωμένες επικράτειες (κάτω διαγράμματα) [153]. 95

Αποτελέσματα Το [ 1 H 15 N] TROSY φάσμα έδειξε ότι το ανασυνδυασμένο τμήμα La motif-rrm1 αποκτά αρκετά σταθερή αναδίπλωση στο διάλυμα και επέτρεψε μία σχεδόν πλήρη ταυτοποίηση των σημάτων συντονισμού [153]. Επιπλέον, η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής για το La motif- RRM1 επιβεβαιώνει τις προβλέψεις που προέρχονται από τη μελέτη του κάθε τομέα ξεχωριστά [152], υποδηλώνοντας πως αυτές οι δύο επικράτειες διατηρούν την ανεξάρτητη αναδίπλωσή τους μέσα στο ενωμένο La motif-rrm1 που συνιστά την Ν-τελική περιοχή της πρωτεΐνης του D. discoideum. Οι πληροφορίες αυτές θα αποτελέσουν τη βάση για τη συνέχεια του δομικού χαρακτηρισμού του εν λόγω τομέα μέσω NMR. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η περιοχή La motif- RRM1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης La με το RNA. Οι διαμορφωτικές και δυναμικές ιδιότητες της εν λόγω περιοχής παρουσία του RNA, αναμένεται να διαφωτίσουν το μηχανισμό της RNA δέσμευσης και ενδεχομένως να φανούν χρήσιμες στην αποσαφήνιση του ρόλου της πρωτεΐνης La στη βιογένεση των μορίων RNA. 96

Συζήτηση 97

Συζήτηση Η πρωτεΐνη La αποτελεί έναν πολύ σημαντικό παράγοντα στη ζωή των ευκαρυωτικών κυττάρων. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, εντοπίζεται σε αφθονία μέσα στον πυρήνα όπου συμμετέχει στη βιογένεση πολλών μικρών μη κωδικών RNA. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η La δεσμεύει ορισμένα κυτταρικά και ιικά mrna και προάγει τη μετάφρασή τους. Για λόγους που δεν είναι ακόμα σαφείς, η πρωτεΐνη La αναγνωρίζεται ως αυτοαντιγόνο σε ασθενείς που πάσχουν από ρευματοειδείς παθήσεις όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος [1] και το σύνδρομο Sjögren [2]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει πως η πρωτεΐνη La υπερεκφράζεται στον καρκίνο του πνεύμονα [154], του τραχήλου της μήτρας [155] και της στοματικής κοιλότητας [156]. Παρότι η La περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ομόλογές πρωτεΐνες έχουν εντοπιστεί σε μία ποικιλία ανώτερων και κατώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών (Εικόνα 42). Η συντήρησή της από τους μύκητες μέχρι τον άνθρωπο αλλά και η εμφάνιση cis ρυθμιστικών στοιχείων στις ομόλογες πρωτεΐνες των ανώτερων ευκαρυωτών, υποδηλώνει πως η πρωτεΐνη αυτή διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των οργανισμών. Μέχρι σήμερα, πιθανοί αντιγονικοί επίτοποι της πρωτεΐνης La έχουν εντοπισθεί με τη χρήση συνθετικών πεπτιδίων [143]. Ωστόσο, παραμένει ανεξακρίβωτο αν αυτοί οι επίτοποι είναι συνεχείς ή αν αποτελούν τμήματα ασυνεχών επιτόπων που απαντώνται στην τριτοταγή διαμόρφωση της πρωτεΐνης. Επίσης, παραμένει άγνωστο το αν αυτοί οι επίτοποι επικαλύπτονται ή αποκαλύπτονται παρουσία δεσμευμένου μορίου RNA καθώς και το αν αποκρίπτονται στο εσωτερικό της πρωτεΐνης και εμφανίζονται σε περιπτώσεις αποδιάταξης ή πέψης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Για την απάντηση των παραπάνω ερωτημάτων, θα πρέπει να ληφθεί υπόψην τόσο η δομή της πρωτεΐνης όσο και τα δυναμικά φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα παρουσία κάποιου συνδέτη. Η μελέτη της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης αλλά και του τρόπου δέσμευσής της στα RNA στόχους, μπορεί να αποκαλύψει τις συνθήκες κάτω από τις οποίες οι επίτοποι αυτοί γίνονται προσβάσιμοι και ίσως να εξηγήσει το μηχανισμό πυροδότησης της ανοσολογικής απόκρισης εναντίον της La στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και το σύνδρομο Sjögren. Επιπλέον, η μελέτη των συμπλόκων της La με τα φυσιολογικά της υποστρώματα αναμένεται να αποκαλύψει τα χαρακτηριστικά εκείνα που δίνουν στην πρωτεΐνη τη δυνατότητα να αλληλεπιδρά με μία μεγάλη ποικιλία ξεχωριστών μορίων RNA. 98

Συζήτηση Εικόνα 42. Ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών της πρωτεΐνης La από επιλεγμένους οργανισμούς στο λογισμικό BioEdit. Τα αμινοξέα 7-99 και 111-187 της ανθρώπινης πρωτεΐνης αντιστοιχούν στις επικράτειες La motif και RRM1. Αυτές οι επικράτειες συνιστούν το πιο συντηρημένο τμήμα της πρωτεΐνης από τους μονοκύτταρους ευκαρυώτες μέχρι τον άνθρωπο. 99

Συζήτηση Παρότι οι διάφοροι ρόλοι της πρωτεΐνης La μέσα στα κύτταρα έχουν μελετηθεί επαρκώς, οι πληροφορίες για τον ακριβή μηχανισμό λειτουργίας παραμένουν ελλιπείς. Η παρούσα διπλωματική αποτελεί μέρος μίας μελέτης που αφορά τον μηχανισμό λειτουργίας της ομόλογης πρωτεΐνης του οργανισμού D. discoideum. Ο κυτταρομυξομύκητας D. discoideum αποτελεί ένα εύχρηστο εργαστηριακό κυτταρικό σύστημα για τη μελέτη των πρωτεϊνών που δεσμεύουν ακτίνη (actin-binding proteins) αλλά και για τη μελέτη της κινητικότητας των κυττάρων γενικότερα. Έχει μικρό και απλό γονιδίωμα και ακολουθεί έναν καλά καθορισμένο κύκλο ανάπτυξης και διαφοροποίησης, γεγονός που τον έχει καθιερώσει ως ένα πρότυπο οργανισμό μοντέλο για μελέτες που αφορούν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση [149]. Ενώ ο διαχωρισμός του D. discoideum από τους υπόλοιπους ευκαρυώτες συνέβη νωρίς στην φυλογενετική ιστορία των ευκαρυωτικών οργανισμών, πολλές από τις πρωτεΐνες του παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομοιότητα με τις ορθόλογες του ανθρώπου παρά με αυτές του S. cerevisiae [150]. Η ομόλογη πρωτεΐνη La του D. discoideum για παράδειγμα, παρουσιάζει πολύ μεγαλύτερη ομολογία με την ανθρώπινη πρωτεΐνη από ότι με τις ομόλογες πρωτεΐνες των υπόλοιπων μονοκύτταρων ευκαρυωτών. Επιπλέον, εκτός από το La motif και το RRM1, η πρωτεΐνη του D. discoideum διαθέτει και το C- τελικό RRM μοτίβο (RRM2) το οποίο χαρακτηρίζει τις πρωτεΐνες La των ανώτερων ευκαρυωτών (Εικόνα 43). Εικόνα 43. Οργάνωση επικρατειών της πρωτεΐνης La από τον άνθρωπο, τον D. discoideum και S. cerevisiae. Σε αντίθεση με την ομόλογη πρωτεΐνη του S. cerevisiae, η πρωτεΐνη La του D. discoideum διαθέτει ένα εκτεταμένο C-τελικό άκρο που θυμίζει περισσότερο τις πρωτεΐνες των ανώτερων ευκαρυωτών. Μέσα σε αυτό διακρίνονται ένα δεύτερο, άτυπο μοτίβο RRM (RRM2) και μία σύντομη βασική περιοχή. Είναι πολύ ενδιαφέρον το γεγονός ότι μία πρωτεΐνη που ενίοτε αναγνωρίζεται από το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα ως αυτοαντιγόνο, παρουσιάζει τόσο μεγάλη ομολογία με μία πρωτεΐνη ενός μυξομύκητα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι συνέπειες της μόλυνσης από κάποιον μικροοργανισμό μπορεί να είναι πιο πολύπλοκες από τις αναμενόμενες. Η ανοσολογική απόκριση του οργανισμού που έχει ως στόχο την απομάκρυνση του εισβολέα, μπορεί μέσω μηχανισμών εξάπλωσης επιτόπων και μοριακού μιμιτισμού, να οδηγήσει στην ανάπτυξη βλαβερών για τον 100

Συζήτηση ξενιστή αυτοαντισωμάτων. Δεν αποκλείεται λοιπόν, η επαφή με κάποιον αντίστοιχο παθογόνο για τον άνθρωπο μικροοργανισμό, να σχετίζεται με την πυροδότηση της αυτοάνοσης απόκρισης εναντίον της πρωτεΐνης La. Το γεγονός αυτό, καθιστά τη μελέτη των ομόλογων πρωτεϊνών των κατώτερων ευκαρυωτών όπως ο D. discoideum μία ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα υπόθεση. Για το σκοπό της μελέτης, μεταλλάγματα που κωδικοποιούν τις ξεχωριστές επικράτειες της πρωτεΐνης La του D. discoideum εκφράστηκαν σε ετερόλογο σύστημα βακτηρίων για τον τμηματικό βιοχημικό και δομικό χαρακτηρισμό της πρωτεΐνης. Οι επικράτειες La motif, RRM1 και La motif-rrm1 (NTD) εξετάζονται στην παρούσα διπλωματική εργασία (Εικόνα 44). Εικόνα 44. Επάνω: Οργάνωση επικρατειών της πρωτεΐνης La του D. discoideum. Κάτω: Μεταλλάγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Οι επικράτειες La motif και RRM1 (N-RRM) μελετήθηκαν ξεχωριστά αλλά και μαζί, ως N- τελική περιοχή της πρωτεΐνης (NTD). Τα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της συμμετοχής των ξεχωριστών επικρατειών στην αναγνώριση και τη δέσμευση μορίων στόχων. Αρχικά, η επικράτεια La motif εξετάστηκε με EMSA ως προς την δυνατότητα αλληλεπίδρασης με τρία ξεχωριστά πρόδρομα trna του D. discoideum. Από αυτά, τo pre-trna Arg CCU διαθέτει τις ενδογενείς 5 οδηγό και Ser 3 ακόλουθη αλληλουχίες, ενώ τα pre-trna GCU και pre-trna Ser GCU -5 flank διαθέτουν μεταλλαγμένες 5 οδηγό και 3 ακόλουθη αλληλουχίες (παρουσιάζονται στην Εικόνα 21). Από τα προκαταρκτικά αυτά πειράματα αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, αποκαλύφθηκε ότι το La motif αλληλεπιδρά μόνο με το πρόδρομο trna Arg. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η πρωτεΐνη La παρουσιάζει προτίμηση στις τερματικές ουριδίνες που υπάρχουν στο 3 άκρο των πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ και το πρόδρομο trna Arg είναι 101

Συζήτηση Ser το μόνο από τα τρία υποστρώματα που διαθέτει τα ενδογενή 5 και 3 άκρα. Τα pre-trna GCU και pre-trna Ser GCU -5 flank διαθέτουν μεταλλαγμένη 3 ακόλουθη αλληλουχία, από την οποία απουσιάζουν οι τερματικές ουριδίνες. Αξίζει να σημειωθεί, ότι είναι η πρώτη φορά που ανιχνεύεται η δυνατότητα δέσμευσης της απομονωμένης επικράτειας La motif στο RNA. Στη διαθέσιμη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι η επικράτεια La motif αδυνατεί να δεσμεύσει RNA στόχους απουσία της γειτονικής επικράτειας RRM1 [151]. Ωστόσο, μελέτες επί της δομής του La motif έδειξαν ότι τόσο στην ανθρώπινη [26], όσο και στην ομόλογη πρωτεΐνη του T. brucei [32], η επικράτεια αυτή υιοθετεί μία αναδίπλωση που συναντάται συχνά σε πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεϊκά οξέα. Επιπλέον, η κρυσταλλική ανάλυση της περιοχής La motif-rrm1 (NTD) με μία σειρά από συνθετικά μονόκλωνα μόρια RNA, έδειξε πως από τις δύο επικράτειες, μόνο το La motif κάνει δεσμούς με τις ουριδίνες του 3 άκρου [28]. Ενδεχομένως αυτή να είναι η αιτία που η απομονωμένη επικράτεια La motif φάνηκε να διακρίνει το πρόδρομο trna Arg από τα άλλα δύο υποστρώματα που δεν διέθεταν τις τερματικές ουριδίνες στο 3 άκρο. Έπειτα από τα προκαταρκτικά πειράματα με τα τρία ξεχωριστά υποστρώματα, η αλληλεπίδραση των υπολοίπων επικρατειών με το ομόλογο pre-trna Arg του D. discoideum, εξετάστηκε με δοκιμή αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Επιπλέον, με MST κατέστη δυνατός ο προσδιορισμός της σταθεράς διάστασης του εκάστοτε συμπλόκου σε nm. Και τα τρία μεταλλάγματα εκδήλωσαν ιδιότητες δέσμευσης για το πρόδρομο trna με αρκετά καλή συγγένεια. Η συγγένεια του απομονωμένου RRM1 μάλιστα (5.47 ± 1.1 nm), είναι συγκρίσιμη με αυτήν που έχει καταγραφεί για το σύμπλοκο της ολόκληρης πρωτεΐνης του D. discoideum με το ομόλογο pre-trna Ser GCU (4 ± 1 nm) [157], της ανθρώπινης πρωτεΐνης με το pre-trna Val (7.3 nm) [151] και της ομόλογης πρωτεΐνης του S. cerevisiae με το pre-trna Arg CCG [48]. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την εξειδικευμένη αναγνώριση του υποστρώματος από το La motif ίσως να υποδηλώνει πως οι εν λόγω επικράτειες συνεργάζονται για την προσέγγιση και την αναγνώριση των υποστρωμάτων της πρωτεΐνης. Ενδεχομένως, η επικράτεια RRM να συμβάλλει στην προσέγγιση των διαφόρων μορίων RNA με μη ειδικό τρόπο, τα οποία θα αναγνωριστούν ειδικά από το La motif ή θα απορριφθούν. Ο διαχωρισμός των υποστρωμάτων της πρωτεΐνης La από τα υπόλοιπα RNA μέσα στο κύτταρο όμως, εξαρτάται από μία διαδικασία ταχείας δοκιμής και απόρριψης. Επιπλέον, η πρωτεΐνη La δεσμεύεται μόνο παροδικά στα RNA-στόχους και αποδεσμεύεται μετά την εκπλήρωση του σύντομου λειτουργικού της ρόλου. Στα δεδομένα αυτά 102

Συζήτηση μπορεί οφείλεται η μειωμένη -σε σχέση με το απομονωμένο RRM1- συγγένεια που εκδήλωσε η επικράτεια La motif-rrm1 για το πρόδρομο trna στα πειράματα MST. Arg Η αλληλεπίδραση του La motif με τις ουριδίνες του 3 -άκρου του πρόδρομου trna CCU στην ανάλυση αποτυπώματος, συμφωνεί με τα δεδομένα της κρυσταλλικής ανάλυσης της ανθρώπινης πρωτεΐνης [28] και εξηγεί την εξειδίκευση που εκδήλωσε αυτή η επικράτεια ως προς τα τρία υποστρώματα που μελετήθηκαν αρχικά. Επιπλέον, τόσο το La motif όσο και το RRM1 φάνηκε να αλληλεπιδρούν με το anticodon loop. Όπως αναφέρθηκε, το 3 άκρο του RNA εισάγεται στη σχισμή μεταξύ των δύο επικρατειών όπου κάνει δεσμούς με κατάλοιπα του La motif. Ωστόσο, σε αυτή την κατάσταση δέσμευσης, οι επιφάνειες που τυπικά χρησιμοποιούνται από τα δύο δομικά μοτίβα (το winged helix και το β-φύλλο του RRM) για τη δέσμευση των νουκλεϊκών οξέων, παραμένουν ελεύθερες για άλλες πιθανές αλληλεπιδράσεις [28]. Ενδεχομένως αυτός να είναι ο λόγος που και οι δύο επικράτειες φαίνεται να αλληλεπιδρούν με μία ξεχωριστή περιοχή του πρόδρομου trna, το anticodon loop. Αλληλεπίδραση της La με το anticodon loop έχει καταγραφεί άλλη μία φορά, με την ομόλογη πρωτεΐνη του S. cerevisiae και το πρόδρομο trna Arg [48]. Στην εν λόγω μελέτη, παρατηρήθηκε προστασία του πρόδρομου trna Arg από τροποποίηση με kethoxal στο anticodon loop και το D-loop. Ωστόσο, η προστασία αυτή ήταν ορατή μόνο παρουσία ολόκληρης της πρωτεΐνης. Τόσο το 3 άκρο όσο και το anticodon loop παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία των μορίων trna. Το 3 άκρο είναι υπεύθυνο για την ομοιοπολική δέσμευση του εκάστοτε αμινοξέος, ενώ το anticodon loop ευθύνεται για την αναγνώριση του κωδικονίου με το οποίο αλληλεπιδρά μέσω συμπληρωματικότητας. Υπό αυτό το πρίσμα, η προστασία των δύο αυτών περιοχών είναι όχι μόνο λογική αλλά και απαραίτητη κατά τη διάρκεια των διαδικασιών ωρίμανσης των μορίων trna. Παρόλα αυτά, η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης των δύο επικρατειών με τα ξεχωριστά σημεία του πρόδρομου trna, χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Η τρισδιάστατη δομή του συμπλόκου της εκάστοτε επικράτειας με το πρόδρομο trna, αλλά και η σύγκρισή της με τη δομή ολόκληρης της πρωτεΐνης σε σύμπλοκο με το εν λόγω υπόστρωμα, ενδεχομένως να διευκολύνει τον περαιτέρω χαρακτηρισμό της αλληλεπίδρασης με το anticodon loop. Στη συγκεκριμένη μελέτη, επιχειρήθηκε όσο το δυνατόν καλύτερη προσομοίωση των φυσιολογικών συνθηκών αλληλεπίδρασης. Μέσα στο κύτταρο η δέσμευση της πρωτεΐνης La στα πρόδρομα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ, συμβάλλει μεταξύ άλλων και στην ορθή αναδίπλωση των μορίων αυτών. Για το λόγο αυτό, στα πειράματα αλληλεπίδρασης 103

Συζήτηση ενσωματώθηκε ένα βήμα αποδιάταξης του υποστρώματος, το οποίο αφέθηκε στη συνέχεια να αναδιπλωθεί παρουσία των ανασυνδυασμένων επικρατειών. Έτσι η αλληλεπίδραση που ανιχνεύθηκε αφορά κατά κύριο λόγο το αποδιαταγμένο πρόδρομο trna. Δεν αποτελεί παράδοξο λοιπόν, το γεγονός ότι το La motif φαίνεται να αλληλεπιδρά με δύο κατά τα άλλα απομακρυσμένες περιοχές στο ώριμο μόριο του trna Arg (Εικόνα 45). Εικόνα 45. Πιθανός μηχανισμός δέσμευσης της NTD περιοχής στο πρόδρομο trna. Η πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με τα απομακρυσμένα σημεία του υποστρώματος στην αποδιαταγμένη του μορφή και καθοδηγεί την ορθή αναδίπλωσή του. Το 3 -ΟΗ τοποθετείται στη σχισμή μεταξύ του La motif και του RRM1 όπου δημιουργεί δεσμούς μόνο με το La motif, ενώ από την άλλη πλευρά, το anticodon loop αλληλεπιδρά με ξεχωριστές περιοχές των δύο επικρατειών. Τα προκαταρκτικά πειράματα NMR που παρουσιάστηκαν, επέτρεψαν μία σχεδόν πλήρη ταυτοποίηση των σημάτων και στα τρία μεταλλάγματα [152, 153]. Αποκάλυψαν την οργάνωση των στοιχείων της δευτεροταγούς δομής για τη κάθε επικράτεια αλλά και για ολόκληρη την NTD περιοχή. Επιπλέον, έδειξαν πως τόσο το La motif όσο και το RRM1 υιοθετούν μία ανεξάρτητη αναδίπλωση που μάλλον διατηρούν και μέσα στην πρωτεΐνη. Οι πληροφορίες αυτές θα αποτελέσουν τη βάση για τη συνέχεια του δομικού χαρακτηρισμού της πρωτεΐνης μέσω NMR. Όπως αναφέρθηκε, η NTD περιοχή της La διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με το RNA. Οι δυναμικές ιδιότητες της εν λόγω περιοχής παρουσία των ενδογενών RNA-στόχων της πρωτεΐνης, αναμένεται να διαφωτίσουν το μηχανισμό της RNA δέσμευσης και ενδεχομένως να φανούν χρήσιμες στην αποσαφήνιση του ακριβούς ρόλου της La στη βιογένεση των μορίων RNA. Έχει επανειλημμένα αναφερθεί ότι η συμβολή της πρωτεΐνης La είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη των ιών μέσα στα κύτταρα. Δέσμευση της La στις UTR περιοχές των ιικών RNA, 104