ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Ι (ΜΑΘΗΜΑ 2ο) 1

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ γονίδιο πρωτεϊνη Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών 2

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών θέσεις για τα δείγµατα ζώνες πηχτή κατάλληλο διάλυµα ηλεκτρόδιο - + κατεύθυνση µετακίνησης συσκευή τροφοδοσίας ενέργειας κάθε πρωτεϊνη µε διαφορετικά αµινοξέα διαφορετικό µέγεθος και φορτίο διαφορετική ηλεκτροφορετική κινητικότητα 3

ΕΙΚΟΝΑ 16.14 Συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτώµατος αγαρόζης (δεξιά) και τροφοδοτικό (αριστερά). igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 4

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: πχ δρεπανοκυτταρική αναιµία: Η Α, Η S Γενότυπος Η Α Η Α - Η S Η S Η A Η S - + 5

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Γενετικές διαφορές µεταξύ γενοτύπων (πχ ποικιλιών) (ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών µιας γονιδιακής θέσης) - δείγµα 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ δείγµα 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + ΑΑ Αα αα ΑΑ Αα ΑΑ αα ΑΑ Αα αα 6

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Ενδονουκλεάσες Ι: ΤΕΜΑΧΙΣΜΟΣ DNA ΕΝΖΥΜΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ (βασικό εργαλείο) τρεις υποµονάδες, απαιτούν για τη δράση τους τρία συνένζυµα (ΑΤΡ, Mg++, SAM) και κόβουν το DNA σε τυχαίες και τουλάχιστο 100 βάσεις µακριά από τη θέση αναγνώρισης Ενδονουκλεάσες ΙΙ : µια υποµονάδα, απαιτούν για τη δράση τους ένα συνένζυµο ( Mg++) και κόβουν το DNA µέσα στη θέση αναγνώρισης η οποία είναι συµµετρική Ενδονουκλεάσες ΙΙΙ: δύο υποµονάδες, απαιτούν για τη δράση τους τρία συνένζυµα (ΑΤΡ, Mg++, SAM) και κόβουν το DNAσε 24-26 βάσεις από το άκρο 3 της θέσης αναγνώρισης Ενδονουκλεάσες ΙV: µια υποµονάδα, απαιτούν για τη δράση τους δύο συνένζυµα ( Mg++, SAM) και κόβουν το DNA µέχρι 20 βάσεις από της θέση αναγνώρισης που είναι ασύµµετρη 7

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Τεµαχισµός µε Ενδονουκλεάσες ΙΙ Αποτελούνται από µια υποµονάδα, και αναγνωρίζουν τετρα-ή έξα-ή οκτανουκλεοτίδια σε παλίνδροµη αλληλουχία 5 AG CT 3 3 TC GA 5 AluI (Arthrobacter luteus) 5.G AATTC 3 3.CTTAA G 5 EcoRI (Echerichia coli R) 5 G GATCC 3 3 C CTAG G 5 BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 5 TTAATT AA 3 3 AATT AATT 5 Pacl (Pseudomonas alcaligenes) 5 TCATCG AATTCGAGATGAAGAG CTCTTGCAATTG GATCCGGCCGAA 3 3 AGTAGCTTAA GCTCT ACTT CTC GAGAACGTTAACCTAG GCCGGCTT 5 TCATCG AATTCGAGATGAAGAG CTCTTGCAATTG GATCCGGCCGAA AGTAGCTTAA GCTCT ACTT CTC GAGAACGTTAACCTAG GCCGGCTT 8

ΕΙΚΟΝΑ 16.1 Θέση περιορισµού συµµετρική ως προς τον άξονα που περνά από το µέσο της. Στην εικόνα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της EcoRI. Η αλληλουχία είναι παλίνδρο- µη: είναι ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση (στο παράδειγµα αυτό είναι 5 GAATTC 3 ). igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 9

igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 10

igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 11

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Τεµαχισµός µε Ενδονουκλεάσες ΙΙ Τέλεια (ολική-πλήρης) πέψη: DNΑ Α Β Γ Α Β Β Γ Γ Μερική πέψη: DNΑ Α Β Γ Α Α Α Β Β Β Γ Γ Γ 12

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Τεµαχισµός µε Ενδονουκλεάσες ΙΙ Απαιτούν βέλτιστες συνθήκες για εξειδικευµένη δράση, διαφορετικά δραστικότητα «αστέρα» (δηλ. κόβουν σε παρόµοιες θέσεις) Μπορεί να αναγνωρίζουν περισσότερες θέσεις αλλά µε διαφορετική ταχύτητα κοπής Ισοσχιζοµερή:διαφορετικά ένζυµα που αναγνωρίζουν την ίδια θέση τυφλάάκρα προεξέχοντα άκρα 5 AG CT 3 3 TC GA 5 AluI (Arthrobacter luteus) 5 G GATCC 3 3 C CTAG G 5 BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 13

ΕΙΚΟΝΑ 16.2 Παραδείγµατα του τρόπου µε τον οποίο τα ένζυµα περιορισµού κόβουν το DNA. (α) Η SmaI δηµιουργεί λεία άκρα. (β) Η BamHI δηµιουργεί προεξέχοντα 5 µονόκλωνα (κολλώδη) άκρα. (γ) Η PstI δηµιουργεί προεξέχοντα 3 µονόκλωνα (κολλώδη) άκρα. igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 14

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΕΝΩΣΗ ΤΜΗΜΑΤΩΝ DNA Ένζυµο: Τ4 DNAλιγάση ενώνει ανεξάρτητα µε το µέγεθος και την προέλευση άκρα από την περιοχή αναγνώρισης ή τεχνητά 15

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Ένωση µε Τ4 DNA λιγάση Τυφλά (λεία) άκρα: 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 xίµαιρα DNA Προεξέχοντα συµβατά άκρα: 5 3 3 CTAG 5 5 GATC 3 3 5 5 3 GATC CTAG 3 5 xίµαιρα DNA 16

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ πλασµίδια βακτηρίων ΦΟΡΕΙΣ βακτηριοφάγοι ιοί συνδυασµός πλασµιδίου βακτηριοφάγου (κοσµίδια) 17

Πλασµίδια ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΦΟΡΕΙΣ DNA R πλασµίδιο βακτήριο 18

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΦΟΡΕΙΣ Πλασµίδια Θέση αναγνώρισης περιοριστικού ενζύµου CTGCAG GACGTC αρχή αντιγραφής γονίδιο µάρτυρας 19

ΕΙΚΟΝΑ 16.4 Ο πλασµιδιακός φορέας κλωνοποίησης puc19. Το πλασµίδιο αυτό φέρει µια θέση έναρξης της αντιγραφής (ori), το δείκτη επιλογής amp R και έναν πολυσυνδέτη που εδράζεται στο τµήµα άλφα του γονιδίου της β-γαλακτοζιδάσης, lacz +. igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 20

Πλασµίδια ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΦΟΡΕΙΣ G A T A A T T C T A C G TA A G T A A T T C G C πλασµίδιο ανοιχτό πλασµίδιο A A T T C G T T A A T T A A C G T T A A ξένο γονίδιο ανασυνδυασµένο DNA 21

ΕΙΚΟΝΑ 16.5 Ένθεση ενός τµήµατος DNA στον πλασµιδιακό φορέα κλωνοποίησης puc19 και δηµιουργία ενός ανασυνδυασµένου µορίου DNA. igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 22

Πλασµίδια ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΦΟΡΕΙΣ Μεταµόρφωση βακτηρίων: DNA R πλασµίδιο βακτήριο 23

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΦΟΡΕΙΣ Πλασµίδια Θέση αναγνώρισης περιοριστικού ενζύµου CTGCAG GACGTC αρχή αντιγραφής γονίδιο µάρτυρας Μέγεθος εισαγόµενου «ξένου» DNA µερικών δεκάδων έως χιλιάδων βάσεων Όσο µικρότερο τόσο ευκολότερο να µετασχηµατίσει ένα βακτήριο (10-100 φορές µεγαλύτερη πιθανότητα για το µικρότερο) Σε ετερογενή πληθυσµό τα µικρά ανασυνδυασµένα εισέρχονται ευκολότερα 24

Πλασµίδια ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΦΟΡΕΙΣ 25

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Γονιδιωµατική: Το σύνολο του γονιδιώµατος κλωνοποιηµένο σε φορέα cdna : Το σύνολο των εκφραζόµενων γονιδίων κλωνοποιηµένο σε φορέα 26

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Στόχος: Τεµαχισµός του γονιδιώµατος σε τµήµατα µε κατάλληλο µέγεθος και άκρα Μειονεκτήµατα: Ένα τµήµα που µας ενδιαφέρει ή ένα γονίδιο µπορεί να κόβεται Μεγάλες περιοχές χωρίς θέσεις αναγνώρισης από το ένζυµο Θέσεις αναγνώρισης πολύ κοντά 27

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Μέγεθος τµηµάτων DNA : εξαρτάται από τον αριθµό βάσεων της θέσης περιορισµού 5 AG CT 3 3 TC GA 5 AluI (Arthrobacter luteus) µια θέση ανά 256 βάσεις (1/4 4 ) Κατά µ.ο. τεµάχια των 256 βάσεων 5 G GATCC 3 3 C CTAG G 5 BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) µια θέση ανά 4096 βάσεις (1/4 6 ) Κατά µ.ο. τεµάχια των 4096 βάσεων 28

igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 29

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Μέγεθος τµηµάτων DNA : εξαρτάται από τον αριθµό βάσεων της θέσης περιορισµού περιοριστική θέση 6 βάσεων περιοριστική θέση 4 βάσεων Χρησιµοποιούνται ένζυµα 4 βάσεων µε µερική πέψη για να εξασφαλιστεί αντιπροσώπευση των ενδιαφερόµενων τµηµάτων 30

ΕΙΚΟΝΑ 16.7 Παραγωγή τµηµάτων DNA κατάλληλου µεγέθους για την κατασκευή µιας γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης, µέσω µερικής πέψης µε ένζυµο περιορισµού. igenetics Ακαδηµαϊκές Εδόσεις 2009 31

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Απαιτούµενος αριθµός κλώνων: Arabidopsis thaliana Μέγεθος γονιδιώµατος: 1,2 x 10 8 βάσεις Μέσο µέγεθος κλώνου: 15.000 βάσεις Ελάχιστος αριθµός κλώνων: n=1,2 x 10 8 / 15.000 = 8 x 10 3 Απαιτούµενος αριθµός: Ν= ln(1-p) ln(1-1/n) = ln(1-0,99) ln(1-1/8x10 3 ) = 36.840 x 5 32

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Μέγεθος γονιδιώµατος και απαιτούµενος αριθµός κλώνων Οργανισµός Μέγεθος γονιδιώµατος (αρ. βάσεων) Μέσο µέγεθος κλώνου (αρ. βάσεων) Αντιπροσώπευση (τουλάχιστο) Αριθµός κλώνων που αντιπροσωπεύουν τη βιβλιοθήκη Ζύµη 1,35 x 10 7 4.500 Arabidopsis thaliana 1,2 x 10 8 40.000 Drosophila 1,8 x 10 8 60.000 Καπνός 1,6 x 10 9 500.000 Ποντικός 2,3 x 10 9 15.000 x 5 750.000 Άνθρωπος 2,8 x 10 9 950.000 Xenopus 3,0 x 10 9 1.000.000 Σιτάρι 5,5 x 10 9 1.800.000 Καλαµπόκι 1,5 x 10 10 5.000.000 33

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ γονίδιο intron exon pre-mrna µεταγραφή mrna αποκοπή introns cdna αντίστροφη µεταγραφή 34

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ mrna ΑΑΑΑΑΑ υβριδισµός µε ολιγοθυµίνη ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ αντίστροφη µεταγραφάση ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ αποµάκρυνση του mrna ΤΤΤΤΤΤΤ cdna DNA πολυµεράση ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ 35

ΕΙΚΟΝΑ 16.8 Σύνθεση δίκλωνου cdna από πολυαδενυλιωµένο mrna µε τη χρήση της αντίστροφης µεταγρα- φάσης, της RNάσης Η, της DNA πολυµεράσης Ι και της DNA λιγάσης. igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 36

ΕΙΚΟΝΑ 16.9 Κλωνοποίηση cdna µε τη χρήση συνδετών BamHI. igenetics Ακαδηµαϊκές Εκδόσεις 2009 37

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Σε δεδοµένη φάση και συγκεκριµένο ιστό από το σύνολο των γονιδίων εκφράζονται περίπου το 30%. Από το σύνολο των µηνυµάτων στο κύτταρο (αριθµό mrna): το 40% µε µικρή συχνότητα (15 αντίγραφα mrna/κύτταρο) το 25% µε µέση συχνότητα (300-3.000 αντίγραφα mrna/κύτταρο) το 35% µε µεγάλη συχνότητα περίπου (10.000-100.000 αντίγραφα mrna/κύτταρο) 38

ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Απαιτούµενος αριθµός κλώνων: Arabidopsis thaliana cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Από το σύνολο των 20.000 γονιδίων εκφράζονται περίπου 6.000: 5.000 µε µικρή συχνότητα 50-1000 µε µέση συχνότητα 1-20 µε υψηλή συχνότητα Ελάχιστος αριθµός: n=5.000 / 0,40 = 12.500 Απαιτούµενος αριθµός: n= ln(1-p) ln(1-1/n) ln(1-0,99) = = 57.500 ln(1-1/12.500) Αναλογική cdna βιβλιοθήκη (περιέχει όλα τα cdna στην ίδια αναλογία): cdna υβριδίζεται µε γονιδιωµατικό µονόκλωνο DNA cdna που υβριδίζονται γίνονται δίκλωνα κλωνοποίηση σε φορέα Απαιτούµενος αριθµός: n= ln(1-p) ln(1-1/n) ln(1-0,99) = = 27.630 ln(1-1/6.000) 39

1. Τι είναι τα ένζυµα περιορισµού, από τι οργανισµούς αποµονώνονται, σε ποιες κατηγορίες διακρίνονται; 2. Ποια κατηγορία ενζύµων περιορισµού κυρίως αξιοποιείται στη Γενετική Μηχανική (ενδονουκλεάσες ΙΙ), ποια είναι τα χαρακτηριστικά τους, πως ονοµατίζονται, τι περιοχές αναγνωρίζουν (παραδείγµατα) 3. Πότε τα τεµαχισµένα DNA από ενδονουκλεάσες ΙΙ δίνουν τυφλά και πότε προεξέχοντα άκρα (παραδείγµατα), πότε έχουµε ολική και πότε µερική πέψη (από τι εξαρτάται;) 4. Ποιο είναι το ένζυµο ένωσης τµηµάτων DNA, τι είναι η χίµαιρα DNA (παραδείγµατα επανένωσης µε τυφλά και προεξέχοντα άκρα). 5. Ποια είναι η αναγκαιότητα των φορέων και τι είδους φορείς χρησιµοποιούνται για γενετική τροποποίηση; 6. Τι είναι τα πλασµίδια, ποιες είναι οι βασικές τους δοµές; ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 7. Σε τι αξιοποιούνται τα πλασµίδια για το γονιδιακό χειρισµό (τι είναι το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο, τι είναι το µεταµορφωµένο βακτήριο), από τι εξαρτάται η πιθανότητα ένα ανασυνδυασµένο πλασµίδιο να µεταµορφώσει βακτήριο; 8. Να δοθούν οι έννοιες γονιδιωµατική και cdna βιβλιοθήκη. Γιατί και στις δύο περιπτώσεις απαιτείται µεγάλος αριθµός κλώνων (µεταµορφωµένων βακτηρίων); 9. Αν δηµιουργηθούν 2 cdna βιβλιοθήκες από το ίδιο φυτό, αλλά από διαφορετικό όργανο (πχ άνθος και ρίζα), ή από το ίδιο όργανο αλλά σε διαφορετική χρονική στιγµή, οι δύο βιβλιοθήκες θα είναι ίδιες ή θα διαφέρουν και γιατί; 10. Στη γονιδιωµατική βιβλιοθήκη ποιο είναι το µέσο µέγεθος των κλώνων (µέγεθος του γονιδιωµατικού DNA σε κάθε µεταµορφωµένο βακτήριο) αν χρησιµοποιηθεί ένζυµο περιορισµού 4 βάσεων ή 6 βάσεων; Συνήθως τι από τα δύο χρησιµοποιείται και πως εξασφαλίζεται ότι το µέγεθος των κλώνων δεν είναι υπερβολικά µεγάλο ή µικρό; 11. Το µέγεθος του γονιδιώµατος στο καλαµπόκι είναι 1,5 x 10 10 βάσεις και απαιτούνται 5.000.000 κλώνοι για να έχουµε πλήρη γονιδιωµατική βιβλιοθήκη. Στην περίπτωση του καπνού οι αντίστοιχοι αριθµοί είναι 1,6 x 10 9 βάσεις και 500.000 κλώνοι. Να σχολιαστεί η διαφορά στο αριθµό των απαιτούµενων κλώνων. 12. Το cdna αντιπροσωπεύει ένα συγκεκριµένο γονίδιο, παρόλα αυτά διαφέρει δοµικά από το αντίστοιχο πυρηνικό γονίδιο, γιατί; Να εξηγηθεί πως αποκτάται ένα cdna τµήµα για τη δόµηση της cdna βιβλιοθήκης (αντίστροφη µεταγραφή) 40

2. ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΖΥΜΑ ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΕΣ 2 Οι πρώτες «άµεσες» προσεγγίσεις του γενετικού υλικού έγιναν µέσω της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών. Είναι γνωστό από τη Γενετική ότι η γενετική πληροφορία που είναι κωδικοποιηµένη σε ένα γονίδιο εκφράζεται µε τη σύνθεση µιας πεπτιδικής αλυσίδας (το γονίδιο µεταγράφεται σε mrna το οποίο στη συνέχεια µεταφράζεται σε πεπτιδική αλυσίδα) η οποία στη συνέχεια συµµετέχει στη δοµή κάποιας πρωτεϊνης. Συνεπώς η ταυτότητα των πρωτεϊνών αντιστοιχεί στην ταυτότητα των αντίστοιχων γονιδίων από τα οποία προέρχεται. (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής) 3 Η αρχή της ηλεκτροφόρησης βασίζεται στο γεγονός ότι S αµινοξέα (αργινίνη, λυσίνη, ιστιδίνη) που χαρακτηρίζονται ως βασικά και ασπαρτικό, γλουταµινικό οξύ (όξινα) έχουν πλευρικές αλυσίδες που ιονίζονται ανάλογα µε το pη του περιβάλλοντος προσδίδοντας στις πρωτείνες ένα χαρακτηριστικό φορτίο. Η ηλεκτροφορετική κινητικόητα του ενζύµου εξαρτάται από το φορτίο και το µέγεθός τους. Σε δυσδιάστατη µάλιστα ηλεκτροφόρηση οι πρωτείνες διαχωρίζονται σε µια διάσταση µε βάση το φορτίο και σε άλλη µε βάση το µέγεθος. (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής) 5 Με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης διερευνήθηκε το 1950 η γενετική βάση της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής) 6 Στην 1η περίπτωση όλα τα δείγµατα έδωσαν µόνο µια ζώνη γιατί σε όλα υπήρχε µόνο µια µορφή της πρωτεϊνης, ως αποτέλεσµα ότι όλα προέρχονται από οµοζύγωτους γενότυπους για το ίδιο αλληλόµορφο γονίδιο (Α) Στη 2η περίπτωση τα δείγµατα 1, 4, 6, και 8 προέρχονται από οµοζύγωτους γενότυπους ΑΑ και έδωσαν µια συγκεκριµένη ζώνη. Τα δείγµατα 3, 7 και 10 επίσης προέρχονται από οµοζύγωτους γενότυπους για το δεύτερο όµως αλληλόµορφο α, και έδωσαν µια συγκεκριµένη αλλά διαφορετική από τα προηγούµενα ζώνη. Τέλος τα δείγµατα 2, 5, και 9 προέρχονται από ετεροζύγωτους γενότυπους και έδωσαν δύο ζώνες γιατί παράγουν δύο µορφές της πρωτεϊνης, µια για το αλληλόµορφο Α και µια για το αλληλόµορφο α. (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής)

7 Τα ένζυµα περιορισµού αποµονώνονται από βακτήρια* και έχουν την ιδιότητα να κόβουν το DNA σε σηµεία στα οποία αναγνωρίζουν συγκεκριµένες αλληλουχίες βάσεων (σηµεία περιορισµού). Έτσι το DNA τεµαχίζεται σε επιµέρους τµήµατα, τα τµήµατα περιορισµού Οµαδοποίηση ανάλογα µε την αλληλουχία αναγνώρισης και τοµής, τον αριθµό υποµονάδων (πεπτιδικές αλυσίδες), αναγκαιότητα συνενζύµων κλπ: Οµ. Ι: τρεις υποµονάδες, απαιτούν για τη δράση τους τρία συνένζυµα ΑΤΡ, Mg++, SAM (S-αδενοσυλο-µεθειονίνη) και κόβουν το DNA σε τυχαίες και τουλάχιστο 100 βάσεις µακριά από τη θέση αναγνώρισης Οµ. ΙΙ: µια υποµονάδα, απαιτούν για τη δράση τους ένα συνένζυµο ( Mg++) και κόβουν το DNA σε µέσα στη θέση αναγνώρισης η οποία είναι συµµετρική (παλίνδροµο) Οµ.ΙΙΙ: σπάνιες, δύο υποµονάδες, απαιτούν για τη δράση τους τρία συνένζυµα (ΑΤΡ, Mg++, SAM) και κόβουν το DNA σε 24-26 βάσεις από το άκρο 3 της θέσης αναγνώρισης Οµ. ΙV: µια υποµονάδα, απαιτούν για τη δράση τους δύο συνένζυµα ( Mg++, SAM) και κόβουν το DNA µέχρι 20 βάσεις από της θέση αναγνώρισης που είναι ασύµµετρη Από τις 4 οµάδες τελικά χρησιµοποιείται η δεύτερη (ενδονουκλεάσες ΙΙ) που λόγω των ιδιοτήτων της εµφανίζει πρακτικά πλεονεκτήµατα *Τα ένζυµα περιορισµού προστατεύουν τα βακτήρια από ιούς, κατακερµατίζοντας το ιικό DNA (περιορισµός ξενιστή). Το βακτήριο τροποποιεί το δικό τους DNA µέσω µεθυλίωσης στις θέσεις αναγνώρισης. 8 Η ονοµατολογία τους βασίζεται στο βακτήριο από το οποίο προέρχονται µε το πρώτο γράµµα του γένους και τα δύο πρώτα του είδους. Για κάθε νέο περιοριστικό ένζυµο δίνεται µετά τα γράµµατα ένας αριθµός µε λατινική µορφή. πχ το ένζυµο AluI, είναι το πρώτο που αποµονώθηκε από το βακτήριο Arthrobacter luteus. Αν προέρχεται από συγκεκριµένο στέλεχος τότε παρεµβάλλεται µεταξύ των τριών γραµµάτων και του λατινικού αριθµού ένα γράµµα ή ένας αραβικός αριθµός που υποδηλώνει το συγκεκριµένο βακτηριακό στέλεχος, πχ το ένζυµο EcoRI, είναι το πρώτο που αποµονώθηκε από το στέλεχος R του βακτηρίου Echerichia coli. 13 Στην τέλεια πέψη το DNA κόβεται σε όλες τις θέσεις αναγνώρισης Στη µερική πέψη το DNA κόβεται σε ορισµένες από τις θέσεις αναγνώρισης και προκύπτει µε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκερόλης. Με κατάλληλες συνθήκες συγκέντρωσης του περιοριστικού ενζύµου, συγκέντρωσης γλυκερόλης, ph, και θερµοκρασίας χειριζόµενοι πολλά κοµµάτια DNA, προκύπτουν όλα τα δυνατά επιµέρους τµήµατα.

14 Οι βέλτιστες συνθήκες συνιστούν τη συγκέντρωση του ενζύµου, τη συγκέντρωση γλυκερόλης, το ρη, τη θερµοκρασία κλπ 16 Επειδή οι ενδονουκλεάσες ΙΙ δίνουν επιµέρους τµήµατα DNA µε προεξέχοντα άκρα, πρακτικά αυτό είναι χρήσιµο για να διευκολύνεται η ένωση διαφορετικών DNA (από διαφορετικές πηγές, ακόµη και είδη) 17 Για τη γενετική τροποποίηση των φυτών είναι απαραίτητος ένας φορέας που λειτουργεί ως «δούρειος ίππος» και µεταφέρει τα «ξένα» γονίδια στα φυτά. Τέτοιοι φορείς µπορεί να είναι τα πλασµίδια των βακτηρίων ή ιοί που προσβάλλουν βακτήρια (βακτηριοβάγοι ιοί) ή τα κοσµίδια που προκύπτουν τεχνητά από το συνδυασµό πλασµιδίου και βακτηριοφάγου ιού. 18 Τα πλασµίδια, που αποτελούν επιπλέον χρωµόσωµα των βακτηρίων, χρησιµοποιούνται ως φορείς είτε για δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών είτε ως «δούρειος ίππος» για τη γενετική τροποποίηση (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA) 19 Σε ένα πλασµίδιο εντοπίζονται τα εξής σηµεία 1. αρχή αντιγραφής, είναι το σηµείο από το οποίο ξεκινά ο διπλασιασµός του µε τη διαδικασία της αντιγραφής του DNA 2. ένα γονίδιο µάρτυρας, που συνήθως είναι γονίδιο αντοχής σε κάποιο αντιβιοτικό. Αυτό αξιοποιείται για την αναγνώριση των βακτηρίων που έχουν το πλασµίδιο, όσα επιβιώνουν παρουσία του αντιβιοτικού σηµαίνει ότι έχουν το πλασµίδιο 3. η θέση αναγνώρισης στο περιοριστικό ένζυµο, και είναι το σηµείο που κόβεται όταν το χειριστούµε µε το ανάλογο περιοριστικό ένζυµο. 21 Ο ανασυνδυασµός του πλασµιδίου αναφέρεται στην ενσωµάτωση σ αυτό ενός «ξένου» γονιδίου (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA) 23 Η µεταµόρφωση του βακτηρίου αναφέρεται στην εισαγωγή σ αυτό του ανασυνδυασµένου µε το «ξένο» γονίδιο. (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA)

24 - Το µέγεθος του εισαγόµενου «ξένου» DNA µπορεί να είναι µερικές δεκάδες έως χιλιάδες βάσεις - όσο µικρότερο είναι το µέγεθος του «ξένου» DNA τόσο ευκολότερα το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο εισέρχεται στο βακτήριο - αν τα βακτήρια βρίσκονται σε µέσο µε ανασυνδυασµένα πλασµίδια διαφορετικού µεγέθους, τα µικρότερα έχουν µεγαλύτερη πιθανότητα να εισέλθουν στα βακτήρια 26 Στη γονιδιωµατική βιβλιοθήκη το σύνολο του γενώµατος του φυτού, αφού τεµαχιστεί µε κατάλληλα περιοριστικά ένζυµα, µέσω ανασυνδυασµένων πλασµιδίων διατηρείται σε µεταµορφωµένα βακτήρια Στη cdna βιβλιοθήκη µόνο τα γονίδια που εκφράζονται µέσω ανασυνδυασµένων πλασµιδίων διατηρούνται σε µεταµορφωµένα βακτήρια 27 Αν κόβεται ένα γονίδιο που µας ενδιαφέρει, χάνεται η ακεραιότητά του, και ουσιαστικά χάνεται το γονίδιο Μεγάλες περιοχές που δεν έχουν σηµείο περιορισµού; Και έτσι προκύπτουν µεγάλα κοµµάτια ερώτηση: και ποιά η σηµασία των µεγάλων κοµµατιών; πολύ µεγάλα δεν µπαίνουν στο ανοιχτό πλασµίδιο, άρα υπάρχει κίνδυνος να µη συµπεριληφθούν στη βιβλιοθήκη Θέσεις πολύ κοντά, πολύ µικρά κοµµάτια ερώτηση: και ποιά η σηµασία των µικρών κοµµατιών; πολύ µικρά σηµαίνει ότι απαιτείται πολύ µεγάλος αριθµός κλώνων για να τα συµπεριλάβει όλα η βιβλιοθήκη, µεγάλη πιθανότητα να χαθεί η ακεραιότητα γονιδίων 28 Αν χρησιµοποιείται περιοριστικό ένζυµο που αναγνωρίζει µια θέση µε τέσσερις βάσεις, θεωρητικά η θέση αυτή πάνω στο DNA υπάρχει πιθανότητα να βρίσκεται σε αποστάσεις που απέχουν 256 βάσεις, άρα µε το ένζυµο αυτό προκύπτουν τεµάχια των 256 βάσεων Αν χρησιµοποιείται περιοριστικό ένζυµο που αναγνωρίζει µια θέση µε έξι βάσεις, θεωρητικά η θέση αυτή πάνω στο DNA υπάρχει πιθανότητα να βρίσκεται σε αποστάσεις που απέχουν 4096 βάσεις, άρα µε το ένζυµο αυτό προκύπτουν τεµάχια των 4096 βάσεων 30 ηλαδή µε ένζυµο 6 βάσεων προκύπτουν πολύ µεγαλύτερα τεµάχια σε σχέση µε αυτά που προκύπτουν µε ένζυµο 4 βάσεων. Στην 1η περίπτωση είναι πολύ µεγάλα και είναι δύσκολο να γίνει ανασυνδυασµός πλασµιδίων και µεταµόρφωση βακτηρίων, ενώ στη 2η είναι πολύ µικρά και υπάρχει ο κίνδυνος να χαθεί η ακεραιότητα κρίσιµων περιοχών του DNA που αντιπροσωπεύουν επιθυµητά γονίδια Για το λόγο αυτό χρησιµοποιούνται ένζυµα 4 βάσεων µε µερική πέψη για να εξασφαλιστεί αντιπροσώπευση των ενδιαφερόµενων τµηµάτων

32 Το φυτό Arabidopsis thaliana έχει το µικρότερο µέγεθος γενώµατος και έχει συνολικά 1,2 χ 108 βάσεις. Το µέσο µέγεθος κλώνου (δηλ. το µέγεθος του «ξένου» DNA σε ένα κλώνο) είναι 15000 βάσεις, άρα θεωρητικά χρειάζονται 8000 κλώνοι, ώστε αν ο καθένας περιέχει διαφορετικό τµήµα του «ξένου» DNA να συµπεριληφθεί όλο το γένωµα του φυτού στη βιβλιοθήκη. Επειδή όµως πρακτικά θα υπάρχουν επικαλύψεις (δηλ. ένα τµήµα να το έχουν περισσότερα από ένα κλώνο βακτηρίου), στατιστικά µε πιθανότητα 99% ο τελικά απαιτούµενος αριθµός κλώνων ώστε να µη παραληφθεί κανένα τµήµα είναι πενταπλάσιος 33 Τα νούµερα της τελευταίας στήλης προκύπτουν αν το αντίστοιχο της πρώτης διαιρεθεί µε το 15000 και πολλαπλασιαστεί µε το 5 34 Στην πραγµατικότητα τα γονίδια στον πυρήνα αποτελούνται από περιοχές που ονοµάζονται εσοχές (introns) και εξοχές (exons). Οι εσοχές αντιπροσωπεύουν επιµέρους περιοχές του γονιδίου που τελικά δεν µεταφράζονται. Γιαυτό το πρωταρχικό mrna (pre- mrna) υφίσταται στο κύτταρο επεξεργασία µε την οποία αποµακρύνονται οι εσοχές πριν αυτό µεταφραστεί στα ριβοσώµατα. Εργαστηριακά για τη δηµιουργία της cdna βιβλιοθήκης αποµονώνονται τα premrna, αποµακρύνονται οι εσοχές και µε αντίστροφη µεταγραφή προκύπτει ένα cdna γονίδιο στο οποίο είναι κωδικοποιηµένο αυτό το mrna. Κάθε τέτοιο cdna γονίδιο ενσωµατώνεται σε ένα κλώνο για τη δηµιουργία της cdna βιβλιοθήκης 35 Ανοσοκατακρήµνιση πολυσωµάτων: Λίγο πριν τη λήξη της µετάφρασης του mrna στα ριβοσώµατα, το σύµπλοκο ριβόσωµα (αποτελείται από rrna και πρωτεϊνες) µε το mrna και τα trna που µεταφέρουν τα τελευταία αµινοξέα, λέγεται πολύσωµα. Με φυγοκέντρηση σε κυτταρικό χυµό αποµονώνονται τα πολυσώµατα. Το συγκεκριµένο πολύσωµα που µας ενδιαφέρει αποµονώνεται από τα υπόλοιπα µε ένα κατάλληλο αντίσωµα (τα αντισώµατα µπλοκάρουν τις πρωτεϊνες και το κατάλληλο αντίσωµα για µια πρωτεϊνη µπορούµε να το πάρουµε µε ένεση της πρωτεϊνης σε ζώα). Το πολύσωµα τώρα απαλλάσσεται από τις πρωτεϊνες µε διάλυση σε οργανικό διαλύτη, όπως αιθανόλη, χλωροφόρµιο ή φαινόλη. Στους οργανικούς διαλύτες οι πρωτεϊνες κατακρηµνίζονται, ενώ τα RNA παραµένουν ανέπαφα. Τέλος το mrna αποµονώνεται από τα rrna και trna µε ένα ολιγονουκλεοτίδιο θυµίνης (ΤΤΤΤΤΤ...). Το mrna έχει πάντοτε στο ένα άκρο του µια ουρά που αποτελείται από ολιγονουκλεοτίδιο αδενίνης (ΑΑΑΑΑΑ...), η οποία ζευγαρώνει µε την ολιγοθυµίνη. Στη συνέχεια το αποµοµωµένο πλέον mrna υφίσταται αντίστροφη µεταγραφή και δίνει την αλυσίδα του γονίδιου από την οποία προήλθε µε τη µεταγραφή. Στην αλυσίδα αυτή, αφού µε αλκαλική υδρόλυση (µεγάλο ΡΗ) αποµακρυνθεί το mrna, µε τη δράση της DNA πολυµεράσης σχηµατίζεται και η συµπληρωµατική της και ολοκληρώνεται η σύνθεση του DNA. Το DNA που προκύπτει µε τον τρόπο αυτό λέγεται συµπληρωµατικό DNA (cdna). (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής)

38 Στόχος είναι στη βιβλιοθήκη να συµπεριληφθούν όλα τα γονίδια µε µικρή συχνότητα, τότε το πιθανότερο είναι να συµπεριληφθούν και αυτά µε µέση ή µεγάλη συχνότητα έκφρασης 39 ιαιρούµε µε το 0,40 καθώς αυτά αντιπροσωπεύουν το 40% του συνόλου των γονιδίων και θέλουµε να συµπεριληφθούν και τα υπόλοιπα 60%. Στην περίπτωση αυτή στο σύνολο των κλώνων θα περιλαµβάνονται αυτά µε µεγάλη συχνότητα σε πολύ µεγαλύτερη αναλογία από τα υπόλοιπα, για το λόγο αυτό τελικά ο απαιτούµενος αριθµός κλώνων είναι µεγαλύτερος από αυτόν της αντίστοιχης γονιδιωµατικής (57.500 vs 36.840) οπότε µπορούµε να πάµε σε αναλογική βιβλιοθήκη. Στην αναλογική βιβλιοθήκη εξασφαλίζεται ίσος αριθµός για όλα τα εκφραζόµενα γονίδια οπότε µειώνεται ο τελικά απαιτούµενος αριθµός κλώνων.