ΑΣΚΗΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ ΚΑΙ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΣ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ

ΑΣΚΗΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ ΚΑΙ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΣ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών 1

1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Εξοικείωση με βασικές έννοιες της Μοριακής Βιολογίας, όπως τα πλασμίδια και οι πλασμιδιακοί φορείς γενετικού υλικού, ο μετασχηματισμός βακτηρίων, η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και η μοριακή κλωνοποίηση. Πειραματική προετοιμασία βακτηριακών κυττάρων Ε. coli ώστε να γίνουν δεκτικά για μετασχηματισμό από πλασμίδια. Μετασχηματισμός των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων Ε. coli που έχουν ετοιμαστεί με ανασυνδυασμένο και μη πλασμίδιο. Υπολογισμός της απόδοσης του μετασχηματισμού. 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1. Γενικά περί πλασμιδίων Τα πλασμίδια είναι μικρά, κυκλικά μόρια δίκλωνου DNA που απαντούν στην φύση ως επιπλέον εξωχρωμοσωματικό γενετικό υλικό διαφόρων προκαρυωτικών (βακτήρια) αλλά και κατώτερων ευκαρυωτικών (μύκητες) κυττάρων. Το μέγεθός τους ποικίλει από χίλια ως μερικές εκατοντάδες χιλιάδες ζεύγη βάσεων. Τα πλασμίδια, στην φύση, διαθέτουν γονίδια που κωδικοποιούν υδρολυτικά ένζυμα τα οποία εξουδετερώνουν ορισμένα αντιβιοτικά και για τον λόγο αυτό παρέχουν στα βακτηριακά κύτταρα που τα φέρουν, ανθεκτικότητα στα συγκεκριμένα αντιβιοτικά, επιτρέποντάς τους να αναπτύσσονται παρουσία των αντιβιοτικών αυτών. Κατά συνέπεια, τα βακτηριακά κύτταρα που φιλοξενούν πλασμίδια παρέχουν σε αυτά όλους τους απαραίτητους ρυθμιστικούς και ενζυμικούς μηχανισμούς για την αντιγραφή του πλασμιδιακού DNA, τη μεταγραφή των πλασμιδιακών γονιδίων αλλά και τη μετάφραση των αντίστοιχων αγγελιοφόρων RNA σε πρωτεΐνες, όπως για παράδειγμα τα ένζυμα που υδρολύουν τα αντιβιοτικά. Για τον παραπάνω λόγο, τα βακτηριακά κύτταρα που φιλοξενούν πλασμίδια ονομάζονται ξενιστές και εξαιτίας της παρουσίας των πλασμιδίων έχουν κάποιες επιπλέον ιδιότητες ως προς τα ίδια στελέχη βακτηρίων που δεν φιλοξενούν πλασμίδια και αυτές αφορούν κυρίως στην ανθεκτικότητά τους ως προς κάποια αντιβιοτικά. Επιπλέον, όλα τα πλασμίδια διαθέτουν ειδικές ακολουθίες βάσεων που συνθέτουν την περιοχή αντιγραφής (origin of replication ή απλώς ori), η οποία τους επιτρέπει την έναρξη της αντιγραφής τους και άρα τον αυτόνομο πολλαπλασιασμό τους, ανεξάρτητα από την αντιγραφή του βακτηριακού χρωμοσώματος. Με αυτό τον τρόπο, όταν το βακτήριο διαιρείται κάθε θυγατρικό κύτταρο που προκύπτει εξασφαλίζει την παρουσία τουλάχιστον ενός αντιγράφου από το εμπεριεχόμενο, στο μητρικό κύτταρο, πλασμίδιο και άρα όλη τη γενετική πληροφορία που 2

εμπεριέχεται στο πλασμίδιο. Με αυτό τον τρόπο, εξασφαλίζεται η κάθετη μεταφορά του γενετικού υλικού που εμπεριέχεται στα πλασμίδια, στα θυγατρικά βακτηριακά κύτταρα. Ειδικά στα βακτήρια, τα φυσικά πλασμίδια έχουν επιπλέον την ικανότητα να μεταφέρονται από κύτταρο σε κύτταρο με την διαδικασία της βακτηριακής σύζευξης λειτουργώντας έτσι ως φορείς γενετικού υλικού, οι οποίοι, με αυτό τον τρόπο, δύναται να μεταφέρουν και οριζοντίως νέα γενετική πληροφορία και έτσι, να προσδίδουν στα βακτηριακά κύτταρα που τα προσλαμβάνουν νέα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά όπως για παράδειγμα η ανθεκτικότητα σε κάποιο αντιβιοτικό. 2.2. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA αφορά σε όλες τις μεθόδους και τα εργαλεία που μπορούν να χρησιμοποιηθούν προκειμένου 1) να παραχθεί ένα υβριδικό (χιμαιρικό) μόριο DNA το οποίο προέρχεται από τουλάχιστον δύο διαφορετικά είδη οργανισμών καθώς και 2) να εξασφαλιστεί η είσοδός του σε ένα κύτταρο-ξενιστή προκειμένου να αναπαραχθεί η ανασυνδυασμένη γενετική πληροφορία σε αυτόν. Αν και η απομόνωση του συνόλου του DNA ενός κυττάρου ή οργανισμού είναι σχετικά εύκολη διαδικασία, η απομόνωση ενός γονιδίου ή μιας συγκεκριμένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας στο σύνολο του γενετικού υλικού ενός οργανισμού ή κυττάρου είναι σχετικά πιο πολύπλοκη διαδικασία. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA ωστόσο, έδωσε στους επιστήμονες την δυνατότητα να απομονώνουν οποιαδήποτε τμήμα DNA, να καθορίζουν την νουκλεοτιδική του αλληλουχία, να την τροποποιούν, για παράδειγμα με κατευθυνόμενες μεταλλάξεις και τέλος, να την επαναεισάγουν σε έναν οργανισμό ή κύτταρο-ξενιστή προκειμένου είτε να την πολλαπλασιάσουν σε πολλά πανομοιότυπα αντίγραφα είτε για να την εκφράσουν σε πρωτεϊνικό προϊόν όταν πρόκειται για νουκλεοτιδική αλληλουχία που αντιστοιχεί σε γονίδιο. Η διαδικασία δημιουργίας πολλαπλών πανομοιότυπων αντιγράφων είτε DNA είτε πρωτεΐνης ονομάζεται μοριακή κλωνοποίηση. Η προεπισκόπηση της μοριακής κλωνοποίησης αλλά και μερικά παραδείγματα χρήσης των κλωνοποιημένων γονιδίων δίνονται συνοπτικά στην Εικόνα 1. 3

Εικόνα 1. Προεπισκόπηση της μοριακής κλωνοποίησης και μερικών εφαρμογών της. Στην εικόνα παρουσιάζονται διαγραμματικά και απλουστευμένα τα στάδια κλωνοποίησης ενός γονιδίου. Η διαδικασία ξεκινά με την εισαγωγή του προς μελέτη γονιδίου σε ένα πλασμίδιο. Ακολούθως το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο εισέρχεται σε ένα βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή, το οποίο καλλιεργείται προκειμένου να σχηματιστεί ένας κλώνος βακτηρίων που φέρει το υπό μελέτη γονίδιο. Με αυτό τρόπο εξασφαλίζεται ο πολλαπλασιασμός του υπό μελέτη γονιδίου σε πολλά αντίγραφα προκείμενου να ακολουθήσει βασική έρευνα ή εφαρμογές. [Προέλευση: Βιολογία, Τόμος Ι, Η χημεία της ζωής, το κύτταρο γενετική, Κεφ. 20, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2015, Campbell, NA, Reece JB, Urry, LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Jackson RB] Όπως γίνεται εύκολα αντιληπτό, η αξία της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA είναι 4

τεράστια αν αναλογιστεί κανείς τις εφαρμογές της στην Ιατρική (γονιδιακή θεραπεία κ.α.), την γεωργία και την κτηνοτροφία (δημιουργία φυτικών και ζωικών προϊόντων με επιθυμητά χαρακτηριστικά) αλλά και την βιομηχανία παραγωγής φαρμάκων με έμφαση την παραγωγή ανθρώπινων πρωτεϊνών ή μικρών πεπτιδίων των οποίων η έλλειψη σχετίζεται με δριμείς νόσους (π.χ. παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης για την διαχείριση του σακχαρώδους διαβήτη). Πέραν των μοριακών και γενετικών τεχνικών για την απομόνωση και διαχείριση οποιουδήποτε τμήματος DNA, ιδιαίτερη αξία έχει η μεθοδολογία που απαιτείται για την είσοδο του υλικού αυτού σε ένα κύτταρο-ξενιστή. Για τον σκοπό αυτό είναι απαραίτητη η ύπαρξη ειδικών οχημάτων μεταφοράς του υπό μελέτη τμήματος DNA, τα οποία ονομάζονται φορείς κλωνοποίησης. Ως φορέας κλωνοποίησης ορίζεται οποιοδήποτε εν δυνάμει λειτουργικά αυτόνομο DNA (π.χ. πλασμίδιο, ιός κλπ) το οποίο μπορεί να ενσωματώσει ένα ξένο DNA, είτε από άλλο οργανισμό είτε τεχνητά κατασκευασμένο στο εργαστήριο και να το εισάγει σε ένα κύτταρο-ξενιστή. Στο κύτταρο ξενιστή το ξένο DNA είτε μπορεί να μείνει έως έχει, είτε να πολλαπλασιαστεί, είτε να εκφραστεί σε πρωτεϊνικό προϊόν ή και τέλος στην περίπτωση των Εικόνα 2. Ο μοριακός χάρτης του πλασμιδιακού φορέα κλωνοποίησης puc19. Στο χάρτη διακρίνεται με πράσινο χρώμα το γονίδιο που κωδικοποιεί ένζυμο, το οποίο υδρολύει το αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (Amp) προσφέροντας ανθεκτικότητα στο εν λόγω αντιβιοτικό καθώς και η περιοχή αντιγραφής (ori). Επιπλέον, διακρίνεται η περιοχή του πολυσυνδέτη (MSC: multiple cloning site), η οποία εμπεριέχει θέσεις αναγνώρισης από πολλές ενδονουκλεάσες περιορισμού και η οποία βρίσκεται εντός του αναγνωστικού πλαισίου του γονιδίου lacz. Η εισαγωγή ξένου DNA μέσα στην περιοχή του πολυσυνδέτη προκαλεί διακοπή του αναγνωστικού πλαισίου του γονιδίου lacz άρα και απώλεια σύνθεσης του ενζύμου που αυτό κωδικοποιεί. ιικών φορέων, να ενσωματωθεί στο γενετικό υλικό του ξενιστή και να προσδώσει σε αυτό νέα χαρακτηριστικά που θα κληρονομούνται στα απόγονα κύτταρα από γενεά σε γενεά. Ανάλογα με την επιθυμητή χρήση του ανασυνδυασμένου DNA που κατασκευάζεται κάθε φορά επιλέγεται και ο κατάλληλος φορέας κλωνοποίησης σε κάποιο κύτταρο-ξενιστή. Στην παρούσα άσκηση, ως 5

φορέας κλωνοποίησης θα χρησιμοποιηθεί το πλασμίδιο PUC19, ο μοριακός χάρτης του οποίου απεικονίζεται στην Εικόνα 2. Το πλασμίδιο αυτό είναι κατάλληλα τροποποιημένο και κυκλοφορεί στο εμπόριο. Προκειμένου ένα τμήμα DNA να εισαχθεί σε ένα φορέα κλωνοποίησης απαιτείται αρχικά η πέψη του φορέα σε συγκεκριμένη θέση μέσω ρήξης των φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ δύο διαδοχικών νουκλεοτιδίων και στις δύο αλυσίδες του φορέα. Τον ρόλο αυτό αναλαμβάνουν ειδικά υδρολυτικά ένζυμα που ονομάζονται ενδονουκλεάσες περιορισμού. Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και πέπτουν συγκεκριμένους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και στις δύο αλυσίδες του δίκλωνου DNA με αποτέλεσμα, στην περίπτωση των φορέων κλωνοποίησης που είναι δίκλωνα κυκλικά μόρια DNA, να προκύπτει γραμμικό μόριο DNA, είτε με τυφλά άκρα είτε με συμπληρωματικά άκρα. Η ενσωμάτωση του επιθυμητού DNA στο γραμμικό πλέον φορέα κλωνοποίησης πραγματοποιείται με ειδικά ένζυμα, που ονομάζονται λιγάσες και τα οποία καταλύουν τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών μεταξύ του ξένου DNA και του φορέα κλωνοποίησης. Σε αυτό το πλαίσιο, φυσικά πλασμίδια που απαντούν στην φύση έχουν επιλεγεί από τους επιστήμονες για τις εφαρμογές της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA μετά από κατάλληλη τροποποίηση. Η αξία τους στην εν λόγω τεχνολογία συνίσταται: 1) στην δυνατότητα που παρέχουν στον ερευνητή να τα τροποποιεί in vitro, με την εισαγωγή ενός τμήματος ξένου DNA, οπότε και ονομάζονται ανασυνδυασμένα πλασμίδια. 2) στη δυνατότητα που παρέχουν στον ερευνητή να τα επαναεισάγει σε βακτηριακά κύτταρα με εργαστηριακές μεθόδους, οι οποίες αφορούν α) στην εργαστηριακή προετοιμασία των βακτηριακών κυττάρων στο να γίνουν δεκτικά για την εισαγωγή πλασμιδίων και β) στην διαδικασίας εισαγωγής του φορέα κλωνοποίησης στα δεκτικά πλέον κύτταρα και η οποία ονομάζεται μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων. 3) στη δυνατότητα που παρέχουν στον ερευνητή, λόγω των γονιδίων που φέρουν και τα οποία προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά, να διακρίνει τα μετασχηματισμένα από τα μη μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Αυτό πραγματοποιείται με ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων, μετά την πειραματική διαδικασία επαγωγής μετασχηματισμού τους, παρουσία αντιβιοτικού στο θρεπτικό υλικό, για το οποίο αντιβιοτικό, μέσω του πλασμιδίου που φέρουν αν έχουν μετασχηματιστεί, διαθέτουν ανθεκτικότητα. Σε αυτή την περίπτωση μόνο τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα θα επιβιώσουν στην καλλιέργεια. Η ενδογενής αυτή ικανότητα των φυσικών πλασμιδίων αποτελεί στην ουσία και το πρώτο σύστημα επιλογής των μετασχηματισμένων από τα μη μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα στην διαδικασία της μοριακής κλωνοποίησης. 6

4) στη δυνατότητα που παρέχουν στον ερευνητή πριν τον ανασυνδυασμό τους με το ξένο DNA, να τα τροποποιήσει ώστε να ενσωματώσει σε αυτά χρήσιμες ιδιότητες που επιτρέπουν την περαιτέρω επιλογή των ακριβώς επιθυμητών βακτηριακών κυττάρων, δηλαδή όχι απλώς όλων των μετασχηματισμένων κυττάρων αλλά ειδικά εκείνων που έχουν μετασχηματιστεί με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και μόνο. Εικόνα 3. Κλωνοποίηση γονιδίων με τη χρήση πλασμιδιακών φορέων κλωνοποίησης. Στην εικόνα παρουσιάζονται αναλυτικά όλα τα στάδια της μοριακής κλωνοποίησης ενός γονίδιου (στην συγκεκριμένη περίπτωση, από το πτηνό κολιμπρί) όπου διακρίνονται και τα δύο συστήματα επιλογής για την διάκριση των βακτηρίων που έχουν μετασχηματιστεί από το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. [Προέλευση: Βιολογία, Τόμος Ι, Η χημεία της ζωής, το κύτταρο γενετική, Κεφ. 20, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2015, Campbell, NA, Reece JB, Urry, LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Jackson RB] Η αξία αυτής της δυνατότητας γίνεται αντιληπτή από το γεγονός ότι η πειραματική διαδικασία του ανασυνδυασμού του πλασμιδίου, δηλαδή της ενσωμάτωσης σε αυτό ενός ξένου DNA, δεν είναι ποτέ 100% επιτυχής και ένα μέρος των γραμμικών πλασμιδίων ξαναγίνεται κυκλικό με την δράση των λιγασών χωρίς να ενσωματώσει ξένο DNA. Ωστόσο, τα μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια δεν μπορούν να διακριθούν από τα ανασυνδυασμένα στον πειραματικό σωλήνα. Αν όμως στο πλασμίδιο και ειδικά στην περιοχή που θα εισαχθεί το ξένο DNA (περιοχή πολυσυνδέτη, η οποία είναι αλληλουχία του πλασμιδίου που φέρει πολλές θέσεις αναγνώρισης από διάφορες περιοριστικές ενδονουκλέασες) έχει προηγουμένως εισαχθεί το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης (lacz) η διάκριση ακολούθως των μετασχηματισμένων 7

βακτηρίων με ανασυνδυασμένο ή όχι πλασμίδιο είναι εφικτή. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η β- γαλακτοσιδάση είναι ένα ένζυμο που με υπόστρωμα την ουσία X-gal παράγει μπλέ χρώμα. Η X- gal είναι ένα συνθετικό μόριο παραπλήσιας δομής με την λακτόζη ενώ και τα δύο είναι υποστρώματα της β-γαλακτοσιδάσης. Εάν το βακτήριο που έχει μετασχηματιστεί από μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και άρα το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης είναι ακέραιο, αναπτυχθεί σε στερεό θρεπτικό υλικό παρουσία της ουσίας X-gal, η προκύπτουσα αποικία θα έχει μπλε χρώμα διότι θα παράγεται λειτουργική β-γαλακτοσιδάση. Εάν όμως το βακτήριο έχει μετασχηματιστεί από ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και άρα το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης δεν είναι ακέραιο, καθώς μέσα στο αναγνωστικό του πλαίσιο έχει εισαχθεί το ξένο DNA, η προκύπτουσα αποικία θα έχει λευκό χρώμα καθώς δεν παράγεται λειτουργική β-γαλακτοσιδάση για να αντιδράσει με την X-gal και να δώσει μπλε χρώμα. Με αυτό τον τρόπο ο ερευνητής κατασκευάζει, χρησιμοποιώντας την ιδιότητα του πλασμιδίου να ενσωματώνει ξένο DNA, ένα δεύτερο σύστημα επιλογής των πλέον επιθυμητών μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων, δηλαδή εκείνων που μετασχηματίστηκαν μόνο με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Ο βακτηριακός μετασχηματισμός πραγματοποιείται εργαστηριακά με δύο κυρίως τρόπους: α) χημική κατεργασία των βακτηριακών κυττάρων και β) επίδραση ηλεκτρικού πεδίου στα βακτηριακά κύτταρα. Και στις δύο περιπτώσεις, στόχος είναι η διάνοιξη πόρων στο εξωτερικό περίβλημα των βακτηρίων προκειμένου να εισέλθει έστω και ένα αντίγραφο του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου. Στην παρούσα άσκηση θα χρησιμοποιηθεί η μέθοδος της χημικής κατεργασίας βακτηριακών κυττάρων E. coli προκειμένου να εισαχθεί σε αυτά πλασμίδιο puc19 το οποίο έχει ήδη υποστεί την διαδικασία ανασυνδυασμού με γνωστού μεγέθους τμήμα DNA. Στην άσκηση αυτή θα κληθείτε να υπολογίσετε την συχνότητα μετασχηματισμού των βακτηριακών κυττάρων. 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 3.1. Υλικά και Όργανα 3.1.1. Όργανα Ψυχόμενη φυγόκεντρο Υδατόλουτρο Επωαστήρες (ανάδευσης και σταθερός) Φασματοφωτόμετρο Λύχνος Bunsen 8

Παγοθήκη και πάγο Αποστειρωμένους σωλήνες φυγοκέντρου των 15 και 50 ml (μιας χρήσης) Aποστειρωμένες κωνικές φιάλες των 250 ml Αποστειρωμένες ορολογικές πιπέτες και πουάρ Αποστειρωμένα σωληνάκια φυγοκέντρου του 1,5 ml 3.1.2. Χημικά Αντιδραστήρια CaCl 2 MgCl 2 PIPES γλυκερόλη yeast extract tryptone NaCl αμπικιλλίνη IPTG (isopropyl thiogalactosidase) με ΜΒ 283,3 X-gal δις απεσταγμένο νερό 3.2 Διαλύματα και Θρεπτικά Υλικά MgCl 2 0,1 M CaCl 2 0,1 M CaCl 2 60 mm, 15% γλυκερόλη, 10 mm PIPES CaCl 2 60 mm, 15% γλυκερόλη soc medium Θρεπτικό υλικό LB (Luria-Bertani): για 1 Lt διαλύετε 10 g tryptone, 5 g yeast extract και 10 g NaCl σε 900 ml δις απεσταγμένου νερού. Συμπληρώνετε τον όγκο ως το 1 Lt και αποστειρώνετε το θρεπτικό υλικό για 20 λεπτά σε 15 psi. Αφήνετε το θρεπτικό υλικό να έλθει σε θερμοκρασία δωματίου και το αποθηκεύετε στους 4 o C. Τρυβλία LB άγαρ με αμπικιλλίνη: Προετοιμάστε το LB όπως περιγράφετε παραπάνω μόνο που θα προσθέσετε και 15 g άγαρ/lt πριν την αποστείρωση. Μετά την αποστείρωση, αφήνετε το θρεπτικό υλικό να έλθει σε θερμοκρασία περίπου 55 o C και προσθέτετε το αντιβιοτικό (500 μl από διάλυμα αμπικιλλίνη συγκέντρωσης 100 mg/ml σε νερό) ώστε η τελική συγκέντρωση του αντιβιοτικού να είναι 50 μg/ml LB. Μοιράζετε από 9

25 ml του LB/άγαρ με αμπικιλλίνη σε τρυβλία petri και περιμένετε ώσπου να στερεοποιηθεί το θρεπτικό υλικό. Τα αποθηκεύετε ανεστραμμένα στους 4 o C. Αμπικιλλίνη 100 mg/ml σε νερό: ζυγίζετε την ποσότητα του αντιβιοτικού. Διαλύετε στον σωστό όγκο δις απεσταγμένου νερού και αποστειρώνετε με ηθμό. IPTG 0,1 M: Ζυγίζετε 0,238 g IPTG και τα διαλύετε σε 10 ml δις απεσταγμένου νερού. Αποστειρώνετε με ηθμό και αποθηκεύετε στους 4 o C. X-gal 20 mg/ml DMSO: 20 mg X-gal και τα διαλύετε σε 1 ml DMSO. Τυλίγετε το σωληνάκι με αλουμινόχαρτο διότι το διάλυμα είναι φωτόφοβο και το αποθηκεύετε στους 4 o C. Το διάλυμα X-gal δεν χρειάζεται αποστείρωση. 3.3. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων E. coli ώστε να γίνουν δεκτικά για μετασχηματισμό 1. 10 ml θρεπτικού υλικού LB σε κωνική φιάλη καλλιέργειας επιμολύνονται με μια αποικία E. coli και επωάζονται όλη νύχτα στους 37 C με ανάδευση. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται από τους ΣΕΠ των εργαστηρίων Βιολογίας την προηγούμενη ημέρα από το πείραμα. 2. 100 ml θρεπτικού υλικού LB σε κωνική φιάλη των 250 ml επιμολύνονται, εκ νέου, με 3 ml από την παραπάνω κορεσμένη καλλιέργεια E. coli και επωάζονται στους 37 C με σχετικά ήπια ανάδευση (250 rpm), έως ότου η οπτική πυκνότητα του θρεπτικού υλικού στα 600nm (OD600) φτάσει την τιμή 0,4. Η χρήση της σχετικά μεγάλης κωνικής φιάλης εξασφαλίζει τον αποτελεσματικότερο αερισμό των κυττάρων κατά την ανάδευση. Ας σημειωθεί επίσης ότι αυτή η καλλιέργεια, η οποία θα χρησιμοποιηθεί στο πείραμα μετασχηματισμού, πρέπει να βρίσκεται στην πρώιμη περιοχή της εκθετικής φάσης της καμπύλης ανάπτυξης. Σε αυτό το σημείο τα κύτταρα έχουν επάρκεια θρεπτικών υλικών και οξυγόνου. Εάν η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας (OD600) ξεπεράσει την τιμή 0,4 η αποτελεσματικότητα του μετασχηματισμού μειώνεται δραστικά. Στο χρονικό διάστημα που η καλλιέργεια επωάζεται (περισσότερο από 1 ώρα) είναι χρήσιμο ο φοιτητής να μελετά, να συζητά και να προετοιμάζει τα επόμενα στάδια του πειράματος. Οφείλει, για παράδειγμα, να σιγουρευτεί ότι η θερμοκρασία της φυγοκέντρου έχει ρυθμιστεί στους 4 C, η θερμοκρασία του υδατόλουτρου στους 42 C και ότι τα διαλύματα του MgCl 2 και του CaCl2 βρίσκονται στον πάγο. 10

Επιπλέον, αυτό το χρονικό διάστημα φροντίζει να επιστρώσει την ουσία X-gal σε ένα τρυβλίο petri με στερεό θρεπτικό υλικό LB/άγαρ/αμπικιλλίνη και το οποίο θα χρησιμοποιήσει στο τέλος της άσκησης για να αναπτυχθούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. 3. Σε ένα σωληνάκι τύπου Eppendorf αναμειγνύετε 40 μl IPTG 0,1 M και 40 μl X-gal 20 mg/ml και 40 μl θρεπτικό υλικό LB. Επιστρώνετε ομοιόμορφα το μείγμα σε τρυβλίο petri που περιέχει στερεό θρεπτικό υλικό LB/άγαρ/αμπικιλλίνη. Αφήνετε να απορροφηθεί το μείγμα για πάνω από δύο ώρες και τοποθετείτε το τρυβλίο petri ως έχει σε σταθερό επωαστικό θάλαμο στους 37 ο C. 4. Όταν η οπτική πυκνότητα της υγρής βακτηριακής καλλιέργειας στα 600nm (OD600) φτάσει την τιμή 0,4 τα κύτταρα μεταφέρονται από την κωνική φιάλη σε αποστειρωμένα σωληνάκια φυγοκέντρου και βυθίζονται στον πάγο, όπου και παραμένουν για 10 min. Από αυτό το σημείο και μετά τα κύτταρα πρέπει να παραμένουν στον πάγο. Αύξηση της θερμοκρασίας καθιστά τα κύτταρα ιδιαίτερα ευπαθή στη χημική κατεργασία που θα ακολουθήσει. 5. Φυγοκεντρείτε το δείγμα για 10 min στις 3500 rpm στους 4 C και αποχύνετε το διαυγές υπερκείμενο θρεπτικό υλικό. Στο τέλος της φυγοκέντρησης τα κύτταρα θα έχουν επιστοιβαχθεί στον πυθμένα του σωλήνα και θα παραμείνουν σε αυτή την κατάσταση εφόσον ο χειρισμός τους γίνεται με αργές και προσεκτικές κινήσεις. Κρίνεται σκόπιμο να παραμείνει ο σωλήνας φυγοκέντρου ανεστραμμένος για μερικά δευτερόλεπτα, ώστε να απομακρυνθεί η μέγιστη δυνατή ποσότητα θρεπτικού υλικού. 6. Επαναιωρείτε το ίζημα των κυττάρων σε 30 ml διαλύματος 0.1Μ MgCl 2 με ήπια ανάδευση. 7. Επωάζετε το αιώρημα στον πάγο για 10 min. 8. Φυγοκεντρείτε επί 10 min στις 3500 rpm στους 4 C και απορρίπτετε το υπερκείμενο. 9. Επαναιωρείτε το ίζημα των κυττάρων σε 30 ml διαλύματος 0.1Μ CaCl2 με ήπια ανάδευση. 10. Επωάζετε το αιώρημα των κυττάρων για 20 min στον πάγο. Η κατεργασία με Ca ++ καθιστά το κυτταρικό περίβλημα σχετικά διαπερατό στο DNA. Για πολλά στελέχη E. coli, η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού αυξάνεται με πιο εκτεταμένη χρονικά επώαση (10 20 ώρες) των κυττάρων στον πάγο. 11. Φυγοκεντρείτε για 10 min στις 3500 rpm στους 4 C και απορρίπτετε το υπερκείμενο. 12. Επαναιωρείτε το ίζημα των κυττάρων σε 30 ml 60mM CaCl 2, 15% glycerol, 10mM PIPES 13. Φυγοκεντρείτε για 10 min, στις 3500 rpm, στους 4 C και απορρίπτετε το υπερκείμενο. 11

14. Προσθέτετε στο ίζημα των κυττάρων 500μl - 1000μl 60mM CaCl 2, 15% glycerol κι επαναιωρείτε το ίζημα. Σε αυτό το σημείο τα βακτήρια μπορούν πλέον να «δεχθούν» πλασμιδιακό DNA. 15. Το εναιώρημα των κυττάρων χωρίζεται ανά 100 μl σε σωληνάκια τύπου Eppendorf και κάθε φοιτητής παραλαμβάνει στον πάγο από ένα δείγμα, που περιέχει 100 μl κατεργασμένα κύτταρα. Σημαίνουμε το σωληνάκι με μαρκαδόρο μόνιμης γραφής. 3.4. Μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων E. coli από ανασυνδυασμένο πλασμίδιο 1. Κάθε ομάδα φοιτητών παραλαμβάνει σωληνάκι τύπου Eppendorf με 100 μl επιδεκτικά κύτταρα E.coli στον πάγο. 2. Προσθέτετε 2-3 μl (50 μg πλασμιδιακού DNA) διαλύματος πλασμιδίου κι αναδεύετε πολύ απαλά. Σημαίνετε το σωληνάκι eppendorf με μαρκαδόρο μόνιμης γραφής. Η διαδικασία πραγματοποιείται και για κύτταρα στα οποία δεν προσθέτουμε πλασμίδιο και τα οποία θα αποτελέσουν τον αρνητικό μάρτυρα του πειράματος. 3. Επωάζετε για 30 min στον πάγο προκειμένου τα πλασμίδια να προσκολληθούν στις μεμβράνες των κυττάρων. 4. Τοποθετείτε το soc medium σε υδατόλουτρο 37 ο C. 5. Απομακρύνετε το σωληνάκι με τα βακτηριακά κύτταρα από τον πάγο και το τοποθετείτε σε θερμομπλόκ στους 42 ο C για αυστηρά 30 sec. Το θερμικό σοκ των κυττάρων προκαλεί αποδιάταξη των κυτταρικών μεμβρανών κι έτσι τα πλασμίδια εισέρχονται στα κύτταρα. 6. Απομακρύνετε το σωληνάκι από το θερμομπλόκ και το τοποθετείτε για 5 min στον πάγο. 7. Προσθέτετε 950 μl soc medium στα βακτηριακά κύτταρα. 8. Επωάζετε τα κύτταρα για 60 min στους 37 ο C υπό ανάδευση στα 210 rpm. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται ανάνηψη των κυττάρων. Στην πραγματικότητα, κατά το στάδιο αυτό δίνεται η δυνατότητα στα βακτηριακά κύτταρα να εκφράσουν το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη εφόσον έχουν μετασχηματιστεί από πλασμίδιο και το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης εφόσον έχουν μετασχηματιστεί από μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. 12

9. Φυγοκεντρείτε το δείγμα των κυττάρων για 1 min στα 3.000 rpm. 10. Απορρίπτετε το υπερκείμενο μέχρι περίπου τα 300μl. 11. Επαναιωρείτε το ίζημα των κυττάρων με αναρροφήσεις-εκροφήσεις με την πιπέτα πολύ απαλά. 12. Επιστρώνετε τα τρυβλία με τα κύτταρα. Σημαίνετε τα τρυβλία με μαρκαδόρο μόνιμης γραφής. 13. Αφήνετε τα τρυβλία σε θερμοκρασία δωματίου προκειμένου να απορροφηθεί το θρεπτικό υλικό με τα κύτταρα. 14. Επωάζετε τα τρυβλία ανεστραμμένα σε σταθερό επωαστικό θάλαμο στους 37 ο C όλη νύχτα. 3.5. Ανάλυση αποτελεσμάτων: Υπολογισμός συχνότητας μετασχηματισμού από ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Την επόμενη ημέρα παρατηρείτε την ανάπτυξη αποικιών πάνω στα τρυβλία. Στην ουσία, παρατηρείτε ότι υπάρχουν δύο ειδών αποικίες σε κάθε τρυβλίο που επιστρώθηκε με μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα: άσπρες και μπλε (Βλέπε Εικόνα 4). Εικόνα 4. Φωτογραφία αποικιών μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων Ε.coli. Οι μπλέ αποικίες αντιστοιχούν σε βακτήρια που μετασχηματιστήκαν από απλό, μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο puc19, ενώ οι λευκές αποικίες έχουν προέλθει από βακτηριακά κύτταρα που μετασχηματίστηκαν με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο puc19, στο οποίο το DNA ένθεμα έχει ενσωματωθεί στην θέση του πολυσυνδέτη καταστρέφοντας, έτσι, το αναγνωστικό πλαίσιο του γονιδίου lacz. Αυτά τα βακτηριακά κύτταρα και οι προερχόμενες από αυτά αποικίες, δεν μπορούν να διασπάσουν το X-gal και για αυτό τον λόγο δεν έχουν μπλε χρώμα. 13

Αφού καταμετρήσετε όλες τις λευκές αποικίες (μετασχηματισμένες με το ανασυνδιασμένο πλασμίδιο) στο τρυβλίο petri υπολογίζετε την συχνότητα μετασχηματισμού ως εξής: Συχνότητα μετασχηματισμού = αριθμός λευκών αποικιών (ή colony forming units cfus)/μg πλασμιδιακού DNA που χρησιμοποιήθηκε 4. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΑΥΤΟΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ 1. Η εισαγωγή ανασυνδυασμένου DNA σε βακτηριακό κύτταρο ξενιστή ονομάζεται. 2. Μοριακή κλωνοποίηση ονομάζεται η δημιουργία.αντιγράφων μορίων.. ή... 3. Επιλέξτε εάν οι παρακάτω προτάσεις είναι σωστές ή λανθασμένες α. Η DNA λιγάση μπορεί να ενώσει τμήματα αλυσίδων DNA ενός οργανισμού αλλά και τμήματα DNA διαφορετικών οργανισμών. β. Το ανασυνδυασμένο DNA λέγεται και φορέας κλωνοποίησης γ. Τα πλασμίδια είναι ανθεκτικά στα αντιβιοτικά δ. Ως κύτταρα ξενιστής χρησιμοποιούνται συνήθως βακτήρια που περιέχουν πλασμίδιο. 4. Μετασχηματισμός ορίζεται α. η ενσωμάτωση ενός τμήματος DNA σε ένα πλασμίδιο β. η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων γ. η διαδικασία εισαγωγής ανασυνδυασμένων πλασμιδίων σε βακτήρια δ. η διαδικασία επιλογής των κλώνων κατά την τεχνική του ανασυνδυασμένου DNA 5. Συνήθως για παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιούμε βακτήρια χωρίς πλασμίδια, και εισάγουμε σε αυτά ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιέχουν γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα σε κάποιο αντιβιοτικό. Αυτό γίνεται γιατί διευκολύνεται α. ο μετασχηματισμός των βακτηρίων β. η επιλογή των βακτηρίων που έχουν ανασυνδυασμένο DNA από τα άλλα που δεν έχουν γ. η επιλογή κλώνου που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA. δ. ο ανασυνδυασμός του DNA 14

6. Η συλλογή βακτηριακών κυττάρων για κατεργασία τους ώστε να γίνουν δεκτικά για μετασχηματισμό πραγματοποιείται: α. οποιαδήποτε στιγμή στην λανθάνουσα φάση β. στην πρώιμη εκθετική φάση γ. οποιαδήποτε στιγμή στην εκθετική φάση δ. στην πρώιμη στατική φάση 7. Το γονίδιο lacz κωδικοποιεί το ένζυμο β-γαλακτοσιδάση το οποίο χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα: α. β-λακτόζη β. φρουκτόζη γ. X-gal δ. τα α και γ 8. Κατά την κατεργασία βακτηριακών κυττάρων με Ca ++ : α. καταστρέφεται το κυτταρικό τους τοίχωμα β. προσκολλάται το πλασμίδιο στα βακτηριακά κύτταρα γ. το κυτταρικό τοίχωμα των βακτηρίων γίνεται διαπερατό στο DNA δ. καταστρέφεται το χρωμοσωματικό τους DNA 9. Η είσοδος πλασμιδιακού DNA σε επιδεκτικά για μετασχηματισμό βακτηριακά κύτταρα επιτυγχάνεται: α. με κατεργασία τους με Mg ++ β. με κατεργασία τους με Ca ++ γ. με θερμική αποδιάταξη των μεμβρανών των βακτηριακών κυττάρων δ. με την χρήση γλυκερόλης 10. Η ανάνηψη των βακτηριακών κυττάρων μετά τον μετασχηματισμό είναι μια διαδικασία που εξασφαλίζει: α. την επιβίωση των βακτηριακών κυττάρων β. την επιβίωση του πλασμιδίου γ. την καταστροφή του χρωμοσωματικού DNA των βακτηριακών κυττάρων δ. την έκφραση του γονιδίου που εξασφαλίζει ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικό 11. Στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, η ανάπτυξη μπλε αποικιών σε τρυβλίο petri αντιστοιχεί σε βακτήρια που: α. δεν έχουν μετασχηματιστεί 15

β. έχουν μετασχηματιστεί με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο γ. έχουν μετασχηματιστεί μόνο με το ξένο DNA ένθεμα δ. έχουν μετασχηματιστεί με μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο 12. Στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, το άσπρο χρώμα που έχουν ορισμένες αποικίες έναντι του μπλε κάποιων άλλων αποικιών στο ίδιο τρυβλίο petri οφείλεται: α. στην καταστροφή του ξένου DNA ενθέματος β. στην καταστροφή του πλασμιδιακού DNA γ. στην καταστροφή του γονιδίου lacz δ. στην έλλειψη X-gal από το θρεπτικό υλικό 13. Η χρήση αντιβιοτικού στο στερεό θρεπτικό υλικό που θα αναπτυχθούν μετασχηματισμένα κύτταρα λειτουργεί ως φίλτρο επιλογής που διακρίνει: α. τα μετασχηματισμένα από τα μη μετασχηματισμένα βακτήρια β. τα ζωντανά από τα νεκρά βακτήρια γ. τα μετασχηματισμένα με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο βακτήρια από εκείνα που μετασχηματίστηκαν με μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο δ. τα μετασχηματισμένα με πλασμίδιο βακτήρια από εκείνα που μετασχηματίστηκαν με ιικό φορέα κλωνοποίησης 14. Τα φυσικά πλασμίδια έχουν την ικανότητα να... από κύτταρο σε κύτταρο με την διαδικασία της...... λειτουργώντας έτσι ως φορείς γενετικού υλικού, οι οποίοι, με αυτό τον τρόπο, μεταφέρουν... νέα γενετική πληροφορία και έτσι, προσδίδουν στα βακτηριακά κύτταρα που τα προσλαμβάνουν νέα...χαρακτηριστικά όπως για παράδειγμα η... σε κάποιο αντιβιοτικό. 15. Ο βακτηριακός... πραγματοποιείται εργαστηριακά με δύο κυρίως τρόπους: α)...... των βακτηριακών κυττάρων και β) επίδραση...... στα βακτηριακά κύτταρα. Και στις δύο περιπτώσεις, στόχος είναι η διάνοιξη... στο εξωτερικό περίβλημα των βακτηρίων προκειμένου να εισέλθει έστω και ένα... του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου. 16