Εργαστήριο Βιοϊατρικής Απεικόνισης και Εφαρμοσμένης Οπτικής Τμήμα Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών Πανεπιστήμιο Κύπρου Μέθοδος Εξακρίβωσης Ευαισθησίας Βακτηρίων στα Αντιβιοτικά με Φασματοσκοπία RAMAN από την Κατερίνα Χ Γεωργίου Υποβάλλεται στο Πανεπιστήμιο Κύπρου ως μερική συμπλήρωση των απαιτήσεων για την απόκτηση Πτυχίου Ηλεκτρολόγου Μηχανικού Τμήμα Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών Μάιος 2008
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΞΑΚΡΙΒΩΣΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN Από την Κατερίνα Χ Γεωργίου Υποβάλλεται στο Πανεπιστήμιο Κύπρου ως μερική συμπλήρωση των απαιτήσεων για την απόκτηση Πτυχίου Ηλεκτρολόγου Μηχανικού Τμήμα Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών Μάιος 2008
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΞΑΚΡΙΒΩΣΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN Από την Κατερίνα Χ Γεωργίου Εξεταστική επιτροπή: Κωνσταντίνος Πίτρης Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα ΗΜΜΥ, Επιβλέπων Διπλωματικής Στυλιανού Πετρούδη Επισκέπτης Λέκτορας, Τμήμα ΗΜΜΥ, Μέλος Επιτροπής
Περίληψη Βασικός στόχος της βιοϊατρικής ως επιστήμης, μέσω των νέων τεχνολογικών μεθόδων που προωθεί, είναι η αρωγή της στην καλύτερη ποιότητα ζωής του ανθρώπου. Η έρευνα στη διπλωματική αυτή έχει ως στόχο να συμβάλει προς αυτό το στόχο με μια νέα μέθοδο που θα συμβάλλει στη μείωση του χρόνου που απαιτείται για την εξεύρεση αντιβιοτικού, το οποίο θα καταπολεμά πιθανές ουρολοιμώξεις. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκε μια μέθοδος, που θα επιτρέπει την εξακρίβωση της ευαισθησίας διαφόρων βακτηρίων σε αντιβιοτικά με χρήση φασματοσκοπία Ράμαν. Για την ανάπτυξη αυτής της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά είδη βακτηρίων, τα οποία εμφανίζονται πιο συχνά σε ουρολοιμώξεις. Τα βακτήρια αυτά είναι escherichia coli, proteus mirabilis και klebsiella pneumoniae. Από κάθε είδος βακτηρίου χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά στελέχη. Όλα τα βακτήρια λήφθηκαν από παγωμένο αποθέματα (-75 ο C έως-80 ο C) και φυλάγονταν σε στερεά καλλιέργεια που μετατρεπόταν σε υγρή όταν υπήρχε ανάγκη. Αρχικό στάδιο της έρευνας ήταν η εξακρίβωση των παραμέτρων, που θα χρησιμοποιούνταν για την φασματοσκοπία Ράμαν ώστε να λαμβάνεται το καλύτερο σήμα με όσο το δυνατό λιγότερο θόρυβο και εξωτερικές επιρροές. Στις παραμέτρους αυτές περιλαμβάνονταν ο χρόνος έκθεσης (integration time) και ο αριθμός των επαναλήψεων (averages). Επόμενο στάδιο ήταν η εξακρίβωση του αντιβιοτικού στο οποίο ήταν ευαίσθητα τα στελέχη των βακτηρίων. Η εξακρίβωση αυτή έγινε βάση του κλασσικού αντιβιογράμματος. Βρέθηκε ότι το αντιβιοτικό στο οποίο ήταν ευαίσθητα όλα τα βακτήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το ciprofloxacin. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που σταματά την ανάπτυξη των βακτηρίων. Στην επόμενη φάση των πειραμάτων έγινε έκθεση των βακτηρίων στο αντιβιοτικό ciprofloxacin για 0, 1, 2, 3, 4, έως 8 ώρες και ληφθήκαν τα ανάλογα φάσματα Ράμαν. Αυτά τα φάσματα αναλύθηκαν με αλγόριθμο, που γράφτηκε στο λογισμικό Matlab, ώστε να καθοριστεί κατά πόσο η φασματοσκοπία Ράμαν μπορούσε να διακρίνει ta βακτήρια που έχουν εκτεθεί σε αντιβιοτικά. iii
Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας έδειξαν ότι μέσα σε 2-4 ώρες η φασματοσκοπία Ραμαν μπορεί να καταδείξει την ευαισθησία των βακτηρίων στο αντιβιοτικό. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα των αποτελεσμάτων αυτής της διπλωματικής εργασίας είναι η σημαντική μείωση του χρονικού διαστήματος που απαιτείται για διάγνωση από 48 σε 4 ώρες. Με αυτό τον τρόπο τα βακτήρια θα μπορούν να καταπολεμούνται έγκαιρα με το καταλληλότερο αντιβιοτικό ώστε να μειώνεται ο κίνδυνος επιδείνωσης της μόλυνσης αλλά και να μειώνεται η πιθανότητα παρουσίας αντίστασης στο αντιβιοτικό. iv
ABSTRACT The main goal of biomedical research, through the development of new technological methods, is to improve of the quality of life of patients and the public. This project aims to contribute towards that gola with the development of a method wich will lead to the reduction of the time that it takes to recognize the right antibiotic for a urinary tract infection. To achieve this goal, a method was developed which will allow the quantification of a bacterium s sensitivity to an antibiotic using Raman spectroscopy. For the development of this method, three different types of bacteria were used (escherichia coli, proteus mirabilis και klebsiella pneumoniae.) These are the spieces more frequently causing urinary tract infections. Three different samples from each type of bacterium were used. All bacteria were taken from frozen stock (-75 ο C to - 80 ο C), were kept in solid culture and converted to liquid when needed. The first step in this research was the establishment of the parameters which would be used for the Raman spectroscopy in order to have the best signal with the least noise and external influences as possible. These parameters included the integration time and number of averages. The next stage was to determine the antibiotic to which the bacteria were most susceptible. This was achieved using standard antibiotograms. The result was that all bacteria were sensitive to ciprofloxacin. Then, the concentration of antibiotic which halts the growth of the bacteria was determined. In the next phase, the bacteria were exposed to the antibiotic (ciprofloxacin) for 0, 1, 2, 3, 4, up to 8 hours and Raman spectra were recorded at each time. These spectra were analyzed by an algorithm, written in Matlab, in order to determine whether Raman spectroscopy could distinguish the bacteria which have been exposed to the antibiotic. The results of this research have shown that Raman spectroscopy can indicate sensitivity to an antibiotic within 2-4 hours. The main advantage of the results of this thesis is the reduction in the time required for diagnosis from 48 hours to 4 hours. In v
this way, bacterial infections can be treated in a more timely manner and with the best antibiotic so that the risk of the infection worsening and of developing antiobiotic resistant bacteria is minimized. vi
Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω από την καρδιά μου τον Δρ. Κωνσταντίνου Πίτρη και την Δρ. Ευδοκία Κάστανου για την εμπιστοσύνη και την βοήθεια τους. vii
Περιεχόμενα: ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΕΙΣΑΓΩΓΗ...1 1.1 Εισαγωγή...1 1.2 Φασματοσκοπία Ράμαν...2 1.2.1 Μελέτη θεωρίας φασματοσκοπίας Ράμαν...2 1.2.2 Λειτουργία φασματοσκοπίας Ράμαν....4 1.3 Μελέτη τρόπου δράσης των αντιβιοτικών...5 1.3.1 Ciprofloxacin...5 1.3.2 Amoxicillin...6 1.3.3 Cefuroxime...6 1.4 Βακτήρια που εξετάστηκαν...7 1.4.1 Escherichia coli...7 1.4.2 Klebsiella pneumoniae...8 1.4.3 Proteus mirabilis...8 1.5 Ανθεκτικότητα...9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ...10 2.1 Εισαγωγή...10 2.2 Δημιουργία στερεάς καλλιέργειας...10 2.3 Μετατροπή των βακτηρίων από στερεά καλλιέργεια σε υγρή καλλιέργεια...11 2.4 Επεξεργασία βακτηρίων ώστε να είναι έτοιμα για φασματοσκοπία Ράμαν...12 2.5 Αναγνώριση αντιβιοτικού στο οποίο είναι ευαίσθητα τα στελέχη βακτηρίων..13 2.6 Εξακρίβωση της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που σταματά την ανάπτυξη των βακτηρίων...14 2.7 Εξακρίβωση των παραμέτρων που θα χρησιμοποιηθούν για τη φασματοσκοπία Ράμαν...17 2.8 Έκθεση βακτηρίων στο αντιβιοτικό που είναι ευαίσθητα για διάφορα χρονικά διαστήματα...18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ...20 3.1 Εισαγωγή...20 3.2 Μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την υλοποίηση των αλγορίθμων...20 3.2.3 Principal Component Analysis (PCA)...20 3.2.2 Multivariate Analysis of Variance (MANOVA)...20 viii
3.2.1 T-TEST...21 3.3 Συναρτήσεις που βοήθησαν στη υλοποίηση των αλγορίθμων...22 3.3.1 ReadRamanDAT...22 3.3.2 RemoveCosmicSpikes...22 3.3.3 NormalizeRamanData...23 3.4 Επεξήγηση αλγορίθμων...24 3.4.1 Προετοιμασία δεδομένων για επεξεργασία...24 3.4.2 Πρώτη μέθοδος ανάλυσης αποτελεσμάτων...25 3.4.3 Δεύτερη μέθοδος ανάλυσης αποτελεσμάτων...25 3.4.4 Τρίτη μέθοδος ανάλυσης αποτελεσμάτων...26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ...28 4.1 Εισαγωγή...28 4.2 Ανάλυση αποτελεσμάτων αλγορίθμων...28 4.2.1 Ανάλυση αποτελεσμάτων πρώτης μεθόδου...28 4.2.2 Ανάλυση αποτελεσμάτων δεύτερης μεθόδου...30 4.2.3 Ανάλυση αποτελεσμάτων τρίτης μεθόδου...30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...33 5.1 Εισαγωγή...33 5.2 Μελλοντικές Βελτιώσεις...33 5.3 Επίλογος...33 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...35 Παραρτήματα...36 Π.1 Επιπλέον χρήσιμες πληροφορίες...36 Π.2 Αλγόριθμοι...38 Π.2.1 Αλγόριθμος Εξακρίβωσης Παραμέτρων...38 Π.2.2 Αλγόριθμος Προεπεξεργασίας Δεδομένων...41 Π.2.3 Αλγόριθμος Πρώτης Μεθόδου Ανάλυσης Αποτελεσμάτων...41 Π.2.4 Αλγόριθμος Δεύτερης Μεθόδου Ανάλυσης Δεδομένων...43 Π.2.5 Αλγόριθμος Τρίτης Μεθόδου Ανάλυσης Δεδομένων...46 ix
x
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Εισαγωγή Η επιτακτική ανάγκη για ένα καλύτερο ποιοτικά βιοτικό επιπέδου ωθεί την έρευνα σήμερα στην εύρεση νέων μεθόδων, οι οποίες θα κάνουν πιο εύκολη την ζωή των ανθρώπων. Με αρωγό την αλματώδη ανάπτυξη της τεχνολογίας η διπλωματική ερευνητική αυτή εργασία θέτει ως στόχο της να συνεισφέρει στην όλη προσπάθεια. Σκοπός της έρευνας αυτής είναι η μείωση του χρόνου που απαιτείται για την εξεύρεση αντιβιοτικού το οποίο θα καταπολεμά πιθανές ουρολοιμώξεις. Μέχρι σήμερα ο χρόνος που χρειαζόταν ώστε να γίνει η κατάλληλη επεξεργασία των ούρων, να βρεθεί το βακτήριο, το οποίο ευθύνεται για την ουρολοίμωξη και να δοθεί από τον θεράποντα ιατρό το κατάλληλο αντιβιοτικό ήταν σαράντα οχτώ ώρες. Στόχος της έρευνας που διεξάγεται στο Εργαστήριο Βιοϊατρικής Απεικόνισης και Εφαρμπσμένης Οπτικής, μέρος της οποίας είναι και η εργασία αυτή, είναι η δημιουργία μιας συσκευής, η οποία σε λιγότερο από έξη ώρες, θα αναγνωρίζει το αντιβιοτικό, που πρέπει να χορηγηθεί στον ασθενή, ώστε να καταπολεμηθεί η ουρολοίμωξη. Στο πρώτο κεφάλαιο δίνεται το θεωρητικό υπόβαθρο αυτής της διπλωματικής εργασίας. Αρχικά θα μελετηθεί η φασματοσκοπία Ράμαν, ποιο είναι το φαινόμενο Ράμαν, πώς προκαλείται και ποιος ο τρόπος λειτουργίας της συσκευής Ράμαν. Στη συνέχεια θα εξεταστεί ο τρόπος, με τον οποίο τα αντιβιοτικά, που χρησιμοποιήθηκαν αναστέλλουν τη δράση των βακτηρίων. Τέλος θα παρατεθούν τα κύρια χαρακτηρίστηκα των βακτηρίων, escherichia coli, proteus mirabilis και klebsiella pneumoniae, που χρησιμοποιήθηκαν για την υλοποίηση των πειραματικών διεργασιών. -1-
1.2 Φασματοσκοπία Ράμαν 1.2.1 Μελέτη θεωρίας φασματοσκοπίας Ράμαν Η φασματοσκοπία είναι μια τεχνική η οποία προέρχεται από την αλληλεπίδραση διαφόρων στοιχείων-μορίων με ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Για την φασματοσκοπία Ράμαν χρησιμοποιείται μια μονοχρωματική πηγή ακτινοβολίας, όπως είναι το λέιζερ. Αυτή η δέσμη ακτινοβολίας αλληλεπιδρά με τα μόρια προκαλώντας αντανάκλαση, απορρόφηση ή σκέδαση φωτονίων. Τα φωτόνια που αποτελούν τη μονοχρωματική δέσμη ακτινοβολίας λέγονται προσπίπτοντα φωτόνια (incident photons), ενώ τα φωτόνια που προκύπτουν λόγω της αλληλεπίδρασης με τα μόρια λέγονται σκεδαζόμενα φωτόνια (scattered photons)[1]. Τα περισσότερα φωτόνια σκεδάζομται ελαστικά (elastically scattered). Δηλαδή τα σκεδαζόμενα φωτόνια έχουν ίδια συχνότητα με τα προσπίπτοντα φωτόνια. Αυτό το φαινόμενο λέγεται Rayleigh scattering. Παρόλα αυτά ένα μικρό εύρος φωτός γύρω στο 1 φωτόνιο στα 10 7 σκεδάζεται σε διαφορετική και ως συνήθως πιο χαμηλή συχνότητα από την συχνότητα του προσπίπτοντος φωτονίου. Αυτή η διαφορά στη συχνότητα είναι που δίνει τις χημικές και δομικές πληροφορίες για τα μόρια. Η διαδικασία που οδηγεί σε αυτή την ανελαστική σκέδαση (inelastic scatter) ορίζεται ως φαινόμενο Ράμαν [1,2,3]. Υπάρχουν δύο περιπτώσεις του φαινόμενου Ράμαν: Α. Raman Stokes scattering όπου το σκεδαζόμενο φωτόνιο έχει λιγότερη ενέργεια από το προσπίπτον φωτόνιο. Αυτό το φαινόμενο είναι το πιο σύνηθες. Β. Raman Anti-Stokes scattering όπου το σκεδαζόμενο φωτόνιο έχει περισσότερη ενέργεια από το προσπίπτον φωτόνιο. Μπορεί να ειπωθεί ότι η σκέδαση Ράμαν είναι αποτέλεσμα της μεταφοράς του σκεδαζόμενου φωτονίου σε μια «εικονική ενεργειακή στοιβάδα» και η επιστροφή του σε μια χαμηλότερη ή ψηλότερη ενεργειακή στοιβάδα (σε σχέση με τη στοιβάδα που -2-
βρισκόταν πριν αλληλεπιδράσει φωτόνιο όπως φαίνεται στην Εικόνα 1 [1,2,3]. με το προσπίπτον φωτόνιο) εκπέμποντας ένα Εικόνα 1: Η σκέδαση Ράμαν είναι αποτέλεσμα της μεταφοράς του σκεδαζόμενου φωτονίου σε μια «εικονική ενεργειακή στοιβάδα» και η επιστροφή του σε μια χαμηλότερη ή ψηλότερη ενεργειακή στοιβάδα εκπέμποντας ένα φωτόνιο. Ένα φάσμα Ράμαν είναι μια συνάρτηση της έντασης του σκεδαζόμενου φωτός ως προς τη διαφορά της συχνότητας του προσπίπτοντος με το σκεδασμένο φωτόνιο. Αυτή η διαφορά στη συχνότητα είναι χαρακτηριστική του μορίου με το οποίο αλληλεπιδρά το προσπίπτον φωτόνιο. Το φάσμα, το οποίο λαμβάνουμε, χαρακτηρίζεται από μια σειρά ζωνών Ράμαν (bands), που αντιστοιχούν στη δονητική (vibrational), περιστροφική (rotational) ή και ηλεκτρονική ενέργεια ενός μορίου. Σε αυτά τα πειράματα θα μελετηθεί η σκέδαση Ράμαν που προέρχεται από αλλαγή της δονητικής ενέργειας ενός μορίου, η οποία είναι χαρακτηριστική για τους δεσμούς κάθε μορίου. H διαφορά στην ενέργεια μεταξύ του προσπίπτοντος φωτονίου και του σκεδαζόμενου φωτονίου είναι ίση με την ενεργεία ενός παλμού ενός σκεδαζόμενου φωτονίου. Αριθμητικά, η διαφορά ενέργειας μεταξύ του αρχικού και τελικού δονητικού επιπέδου, v, ή διαφορετικά η διαφορά στη συχνότητα βρίσκεται από την εξίσωση: 1 v = λ incident 1 λ scattered όπου λ incident το μήκος κύματος του προσπίπτοντος φωτονίου και λ scattered το μήκος κύματος ου σκεδασμένου φωτονίου. [2,3] -3-
1.2.2 Λειτουργία φασματοσκοπίας Ράμαν. Μια μονοχρωματική δέσμη φωτός, ως συνήθως λέιζερ, ακτινοβολεί το δείγμα. Η σκεδασμένη δέσμη φωτός φεύγει από το δείγμα προς όλες τις κατευθύνσεις. Τα κανάλια, τα οποία οδηγούν τη σκεδασμένη δέσμη φωτός προς τον ανιχνευτή τοποθετούνται σε γωνιά 135 ο, 90 ο ή και 180 ο αναλόγως του προσπίπτοντος φωτός λέιζερ [4]. Εικόνα 2: Διάταξη συσκευής Φασματογραφίας Ράμαν. [5] Στη συνέχεια η σκεδασμένη ακτινοβολία στέλνεται σε ένα φασματογράφο (spectrograph) [4]. Πριν καταλήξει η ακτινοβολία στον ανιχνευτή περνά από ένα φίλτρο Rayleigh. Όπως ειπώθηκε η Rayleigh σκεδασμένη ακτινοβολία έχει το ίδιο μήκος κύματος με την προσπίπτουσα μονοχρωματική ακτινοβολία και η έντασή της είναι περίπου ένα εκατομμύριο φορές μεγαλύτερη από τη σκέδαση Ράμαν. Αν περάσουν και οι δύο αυτές ακτινοβολίες δεν θα μπορούσε να εμφανιστεί κανένα φάσμα Ράμαν [6]. Τέλος η δέσμη φωτός καταλήγει στον ανιχνευτή. Ο ανιχνευτής ως συνήθως είναι μια CCD camera (charge-coupled device), η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη καταγραφή του φάσματος [5]. Έτσι δημιουργείται η φασματογραφία, η οποία είναι μια γραφική παράσταση της έντασης της σκεδασμένης ακτινοβολίας συναρτήσει του μήκους κύματος. -4-
Στο δικό μας σύστημα η μονοχρωματική ακτινοβολία που χρησιμοποιείται για φασματοσκοπία Ράμαν προέρχεται συνήθως από διοδικό λέιζερ. Το διοδικό λέιζερ εκπέμπει σε μήκος κύματος γύρω στα 800 nm. Είναι αξιόπιστο, δεν είναι πολύ ακριβό (η τιμή του κυμαίνεται στα $5,000) και μπορεί να λειτουργήσει ακόμα και με μπαταρίες. Στη φασματογραφία Ράμαν μπορεί να επιλεχθεί το κατάλληλο λέιζερ, το οποίο θα έχει το κατάλληλο μήκος κύματος, το οποίο θα δίνει τις καλύτερες Ράμαν πληροφορίες. Επίσης μπορεί να επιλεχθεί το κατάλληλο μήκος κύματος, ώστε να αποτραπεί ο φθορισμός και ο θερμικός θόρυβος. Στις μέρες μας μπορεί ένα λέιζερ να συντονιστεί από ακτινοβολία UV (200nm), που δίνει το ισχυρότερο σήμα Ράμαν λόγω συντονισμού, σε υπέρυθρη ακτινοβολία (1.06μm), όπου εκπέμπεται ο λιγότερος φθορισμός 1.3 Μελέτη τρόπου δράσης των αντιβιοτικών 1.3.1 Ciprofloxacin Το αντιβιοτικό ciprofloxacin ανήκει στη κατηγορία των quinolones. Τα quinolones εμποδίζουν την δράση του ενζύμου DNA-γυράση (DNA gyrase - topoisomerase ΙΙ και topoisomerase IV). Το ένζυμο αυτό είναι υπεύθυνο για το διπλασιασμό του βακτηριακού DNA βοηθ ντας στην αναπαραγωγή, μετάφραση και επιδιόρθωση. Το βακτηριακό DNA αποτελείται μόνο από ένα μακρύ χρωματόσωμα. Κατά τη διάρκεια της αντιγραφής το χρωματόσωμα τυλίγεται (twisted) και μπορεί να τυλιχτεί τόσο, ώστε να καταστραφεί. Το ένζυμο DNA-γυράση είναι το ξετυλιχτικό ( untwisting ) ένζυμο, το ένζυμο δηλαδή, το οποίο εμποδίζει το χρωματόσωμα να τυλιχτεί τόσο ώστε να καταστραφεί. Εμποδίζοντας έτσι τη λειτουργία αυτού του ένζυμου με το αντιβιοτικό ciprofloxacin το βακτήριο δεν μπορεί να αναπαραχθεί. Ο μηχανισμός δράσης των quinolones είναι διαφορετικός από το τρόπο δράσης άλλων αντιβιοτικών. Αυτό είναι που τα καθιστά τόσο δραστικά έναντι των βακτηρίων.[7,8] -5-
Εικόνα 3: Χημική δομή (chemical structure) του αντιβιοτικού ciprofloxacin. 1.3.2 Amoxicillin Το αντιβιοτικό amoxicillin δεσμεύεται με τη πρωτεΐνη δέσμευσης πενικιλίνης 1A (penicillin-binding protein 1A (PBP-1A)), που βρίσκεται στο εσωτερικό του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος (bacterial cell wall). Αυτή η απενεργοποίηση του ένζυμου αποτρέπει τη δημιουργία ενός συνδέσμου μεταξύ δύο γραμμικών σκελών peptidoglycan παρεμποδίζοντας το τρίτο και τελευταίο στάδιο σύνθεσης των τοιχωμάτων του κυττάρου βακτηρίου. Έτσι εμποδίζεται η δημιουργία νέων βακτηρίων [7]. Εικόνα 4: Χημική δομή (chemical structure) του αντιβιοτικού amoxicillin. 1.3.3 Cefuroxime Το αντιβιοτικό Cefuroxime, όπως και η πενικιλίνη είναι ένα beta-lactam αντιβιοτικό. Συνδεόμενο με συγκεκριμένες πρωτεΐνες δέσμευσης πενικιλίνης (PBPs) που βρίσκονται στο εσωτερικό των τοιχωμάτων του βακτηριακού κυττάρου αναστέλλει την σύνθεση των τοιχωμάτων του βακτηρίου [7]. -6-
Εικόνα 5: Χημική δομή(chemical structure) του αντιβιοτικού Cefuroxime. 1.4 Βακτήρια που εξετάστηκαν 1.4.1 Escherichia coli Το Escherichia coli είναι ένα βακτήριο το οποίο βρίσκεται στο κάτω έντερο (ορθό) των θηλαστικών. Τα περισσότερα είδη E. coli δεν προκαλούν λοιμώξεις, αντιθέτως παράγουν βιταμίνη Κ και αποτρέπουν άλλα παθογόνα βακτήρια από το να προκαλέσουν λοιμώξεις στο έντερο. Κάποια είδη όμως όπως το serotype O157:H7 προκαλούν τροφικές δηλητηριάσεις, ενώ άλλα προκαλούν ουρολοιμώξεις. Το E. coli ευθύνεται για το 90% των ουρολοιμώξεων. Στις ακμάζουσες λοιμώξεις το E. coli δημιουργεί αποικίες στην ουρήθρα και εξαπλώνεται στην ουροδόχο κύστη και στον αγωγό. Οι ουρολοιμώξεις είναι πιο πιθανό να εμφανιστούν σε γυναίκες παρά σε άντρες. Τα παθογόνα E. coli συνδέονται με τα ενδοθηλιακά κύτταρα του ουρικού αγωγού και να δημιουργήσουν αποικίες στην ουροδόχο κύστη. Οι μολύνσεις που προκαλούνται από το βακτήριο E. coli μπορούν να θεραπευτούν με αντιβιοτικά. Όμως για διαφορετικό είδος E. coli χρειάζεται και διαφορετικό είδος αντιβιοτικού. Κάποια από τα αντιβιοτικά, τα οποία μπορούν να θεραπεύσουν αυτού του είδους την ουρολοίμωξη είναι το amoxicillin, το cephalosporins, το nitrofurantoin, το aminoglycosides και το ciprofloxacin που χρησιμοποιήθηκε για την υλοποίηση των πειραμάτων σε αυτή τη διπλωματική. Κάποια άλλα χαρακτηριστικά των βακτηρίων E. Coli είναι ότι δεν περιορίζονται μόνο στο έντερο. Έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν εκτός του σώματος για αρκετό -7-
καιρό. Επίσης μπορούν να αναπαραχθούν γρήγορα να επεξεργαστούν εύκολα και αυτό τα ορίζει σαν ένα από τα καλύτερα είδη για πειραματικές μελέτες [9]. 1.4.2 Klebsiella pneumoniae Η Klebsiella pneumoniae μπορεί να προκαλέσει βακτηριακή πνευμονία αλλά συναντάται πιο συχνά σε ουρολοιμώξεις και μολύνσεις της μήτρας λόγω των μικροβίων που βρίσκονται σε νοσοκομειακούς χώρους. Η Klebsiella είναι το δεύτερο σε σειρά βακτήριο μετά το E. coli που ευθύνεται για την πρόκληση ουρολοιμώξεων. Ασθενείς που είναι πιο ευάλωτοι στο βακτήριο αυτό είναι εκείνοι που έχουν χρόνια πνευμονία, πρόβλημα με τα έντερα, ρινική βλεννώδη ατροφία (nasal mucosa atrophy) και ρινοσκλέρομα (rhinoscleroma). Επίσης πιο ευαίσθητοι σε αυτό ο βακτήριο είναι οι αλκοολικοί, διαβητικοί και εκείνοι που έχουν πνευμονικά προβλήματα. Η πιο συχνή οδός μόλυνσης είναι από περιττώματα και ακολουθεί επαφή με μολυσμένα εργαλεία. Το βακτήριο Klebsiella είναι ανθεκτικό σε αντιβιοτικά όπως ampicillin, carbenicillin, και ceftazidime. Είναι ευαίσθητο σε αντιβιοτικά όπως aminoglycosides και cephalosporins. [10] 1.4.3 Proteus mirabilis Το βακτήριο Proteus mirabilis προκαλεί το 90% των μολύνσεων από κάθε άλλο είδος Proteus. Ένα αλκαλικό δείγμα από ούρα πιθανότατα υποδεικνύει μόλυνση από Proteus mirabilis. Μπορεί να διαγνωστεί εύκολα λόγω της ικανότητας κινητικότητας που έχει (swarming motility) και της ανικανότητά του να μεταβολίσει τη λακτόζη. Το ραβδοειδές του σχήμα έχει την ικανότητα να παράγει urease. Η urease μετατρέπει (υδροκαταλύει) την ουρία σε αμμωνία και έτσι κάνει τα ούρα πιο αλκαλικά. Αν δεν θεραπευτεί μπορεί να οδηγηθεί στη δημιουργία κρυστάλλων από struvite, calcium carbonate ή/και apatite. Αυτά τα βακτήρια μπορεί να βρεθούν μέσα σε πέτρες των νεφρών που μεγαλώνοντας μπορούν να προκαλέσουν έμφραξη και νεφρική -8-
ανεπάρκεια. Ο Proteus μπορεί να προκαλέσει μολύνσεις και στη μήτρα καθώς και σηψαιμία (septicemia) κυρίως σε ασθενείς νοσοκομείων. Ο Proteus είναι κυρίως ευαίσθητο σε αντιβιοτικά εκτός από τη tetracycline, και στα αντιβιοτικά cephalosporins και ampicillins πρώτης γενιάς. 1.5 Ανθεκτικότητα Δυστυχώς, με το πέρασμα του χρόνου τα βακτήρια γίνονται όλο και πιο ανθεκτικά στα αντιβιοτικά. Αυτό οφείλεται στην υπέρμετρη χρήση των αντιβιοτικών από τους ανθρώπους. Λόγω αυτού του φαινομένου τα είδη των βακτηρίων εξελίσσονται, μεταλλάσσονται και γίνονται πιο ανθεκτικά. Ένας άλλος λόγος, που δυσχεραίνει την κατάσταση είναι η χορήγηση των αντιβιοτικών σε ζώα, ώστε να μεγαλώσουν πιο γρήγορα. Επίσης τα βακτήρια όπως το E.coli μέσω πλασμιδίων μεταφέρουν το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά και σε άλλου είδους βακτήρια.[11] -9-
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 2.1 Εισαγωγή Στόχος της πειραματικής διαδικασίας, που ακολουθεί, είναι η δημιουργία μιας μεθόδου που θα επιτρέπει την εξακρίβωση της ευαισθησίας διαφόρων βακτηρίων σε αντιβιοτικά με φασματοσκοπία Ράμαν. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά είδη βακτηρίων, τα οποία εμφανίζονται πιο συχνά σε ουρολοιμώξεις. Σε αυτή την πειραματική διαδικασία τα βακτήρια που επιλέχθηκαν είναι escherichia coli, proteus mirabilis και klebsiella pneumoniae. Από κάθε είδος βακτηρίου χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά στελέχη. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε, για προετοιμασία των βακτηρίων και αντιβιοτικών πρν από τη φασματοσκοπία, αποτελείται από τα εξής στάδια: Α. Δημιουργία στερεάς καλλιέργειας Β. Μετατροπή των βακτηρίων από στερεά καλλιέργεια σε υγρή καλλιέργεια Γ. Επεξεργασία βακτηρίων ώστε να είναι έτοιμα για φασματοσκοπία Ράμαν. Δ. Εξακρίβωση των παραμέτρων που θα χρησιμοποιηθούν για τη φασματοσκοπία Ράμαν. Ε. Αναγνώριση αντιβιοτικού στο οποίο είναι ευαίσθητα τα στελέχη βακτηρίων. ΣΤ. Εξακρίβωση της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που σταματά την ανάπτυξη των βακτηρίων. Ζ. Έκθεση βακτηρίων στο αντιβιοτικό που είναι ευαίσθητα τα βακτήρια για διάφορους χρόνους. 2.2 Δημιουργία στερεάς καλλιέργειας Τα βακτήρια που χρησιμοποιήθηκαν λήφθηκαν από παγωμένο stock. Τα βακτήρια αυτά είναι αποθηκευμένα στους -75 o C έως -80 o C ώστε να διατηρηθούν. Για την απόψυξη των βακτηρίων πάρθηκε μια ποσότητα παγωμένων βακτηρίων με ειδικό πινέλο και αλείφθηκε σε τριβλίο άγαρ το οποίο έχει θρεπτικό υλικό. Το τριβλίο άγαρ με το βακτήριο στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε κλίβανο στους 37 o C για δεκαπέντε -10-
ώρες ώστε να αναπτυχθούν τα βακτήρια. Έτσι δημιουργήθηκε η στερεά καλλιέργεια βακτηρίων η οποία θα χρησιμοποιηθεί για την υλοποίηση των ακόλουθων πειραμάτων. 2.3 Μετατροπή των βακτηρίων από στερεά καλλιέργεια σε υγρή καλλιέργεια Για κάθε πειραματική διαδικασία απαραίτητη ήταν η μετατροπή των βακτηρίων από στερεά καλλιέργεια σε υγρή καλλιέργεια. Για να μετατραπούν τα βακτήρια από στερεά μορφή σε υγρή γινόταν το ακόλουθο πείραμα. 1. Αρχικά πάρθηκε το θρεπτικό υλικό. Ανοίχθηκε το μπουκάλι χωρίς να βγει εντελώς το πώμα. 2. Πιάστηκε η πιπέτα και ανοίχθηκε από την μια της πλευρά. 3. Στο ένα της άκρο μπήκε το εξάρτημα που αφαιρεί τον αέρα(αντλία) και τον αφαιρεί 4. Τοποθετείται για λίγο στη φωτιά η πιπέτα ώστε να αποστειρωθεί και να μην μολυνθεί η καλλιέργεια από άλλα μικρόβια 5. Αμέσως μετά τοποθετείται και το στόμιο του μπουκαλιού, του θρεπτικού υλικού, στη φωτιά για αποστείρωση 6. Στη συνέχεια τοποθετείται η πιπέτα στο μπουκάλι πιάνοντας όσα ml θρεπτικού υλικού χρειάζονταν για κάθε υγρή καλλιέργεια 7. Κλείνεται το μπουκάλι με το θρεπτικό υλικό αφού αποστειρώθηκε το πώμα. 8. Ακολούθως τοποθετείται στο δοχείο των 10ml το θρεπτικό υλικό μαζί με τα βακτήρια.(τα βακτήρια τα πιάνω με το inoculating loop) 9. Αναδεύθηκε το θρεπτικό υλικό και τα βακτήρια. 10. Μετά τοποθετούνται στο κλίβανο στους 37 ο C, την θερμοκρασία που αναπτύσσονται και αναπαράγονται τα βακτήρια. Μέσα στο κλίβανο υπάρχει ένας αναδευτήρας, ο οποίος ανακινεί τα μπουκαλάκια με τα βακτήρια ώστε αυτά να οξυγονώνονται και να αναπτύσσονται σωστά. Για την πλήρη ανάπτυξη των βακτηρίων απαιτούνται δεκαπέντε ώρες στους 37 ο C. Σε όλη τη διαδικασία είναι απαραίτητη η τεχνική αποστείρωσης με χρήση φωτιάς. Αυτό είναι απαραίτητο ώστε να μην μολυνθεί η καλλιέργεια από άλλα μικρόβια. -11-
2.4 Επεξεργασία βακτηρίων ώστε να είναι έτοιμα για φασματοσκοπία Ράμαν Για να μπορεί να γίνει το πείραμα με φασματοσκοπία Ράμαν και να δοθούν τα σωστά αποτελέσματα πρέπει να αφαιρεθεί το θρεπτικό υλικό από την υγρή καλλιέργεια. Αυτό γίνεται επειδή το θρεπτικό υλικό προκαλεί φθορισμό και Ραμαν αποτρέποντας έτσι να παρθούν τα σωστά αποτελέσματα. Η διαδικασία που ακολουθείται ώστε να αφαιρεθεί το θρεπτικό υλικό από την υγρή καλλιέργεια και να μείνει μόνο το βακτήριο είναι: 1. Γίνεται ίση κατανομή του μίγματος θρεπτικού υλικού και βακτηρίου, το οποίο ήταν στο κλίβανο για δεκαπέντε ώρες ώστε να αναπαραχθεί, σε μικρά φιαλίδια των 1,5ml. 2. Γίνεται φυγοκέντριση των μικρών φιαλιδίων ώστε να διαχωριστεί το θρεπτικό υλικό και το βακτήριο. Το θρεπτικό υλικό επιπλέει ενώ το βακτήριο μένει στο πάτο. Τα φιαλίδια τοποθετούνται στο μηχάνημα έτσι ώστε το ένα να είναι απέναντι από το άλλο και το σύστημα να βρίσκεται σε ισορροπία. 3. Αφού γίνει η φυγοκέντριση αφαιρείται με μια πιπέτα προσεχτικά μόνο το θρεπτικό υλικό και μένει το βακτήριο. 4. Στη συνέχεια τοποθετείται στο φιαλίδιο με το βακτήριο 1 ml 1XPBS αναδεύεται και τοποθετείται στη φυγόκεντρο όπου φυγοκεντρείται για πέντε λεπτά. Γίνεται αφαίρεση του 1 ml 1XPBS που έμεινε στη επιφάνεια. 5. Ακολούθως τοποθετείται και πάλι 1 ml 1XPBS στο φιαλίδιο. Η διαδικασία που περιγράφτηκε στο στάδιο 4 λέγεται «πλύσιμο» και επαναλαμβάνεται ακόμα δυο φορές ώστε να αφαιρεθεί τελείως το θρεπτικό υλικό από το βακτήριο. 6. Αφού φυγοκεντρηθούν όλα τα φιαλίδια των 1.5ml το μίγμα αυτό των «καθαρών» βακτηρίων και του1xpbs τοποθετείται σε ένα μεγάλο φιαλίδιο των 10 ml. Σε αυτό το στάδιο μπορεί να ξεκινήσει το πείραμα με τη φασματοσκοπία Ράμαν. -12-
2.5 Αναγνώριση αντιβιοτικού στο οποίο είναι ευαίσθητα τα στελέχη βακτηρίων Για την αναγνώριση των αντιβιοτικών που είναι ευαίσθητα τα στελέχη βακτηρίων έγινε το κλασσικό αντιβιόγραμμα. Σε αυτό το στάδιο έγινε έλεγχος της ευαισθησίας των βακτηρίων χρησιμοποιώντας φιλτράκια αντιβιοτικού. Αυτή η διαδικασία γίνεται για επιβεβαίωση της ευαισθησίας των βακτηρίων σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Ανάλυση σταδίων τεχνικής του κλασσικού αντιβιογράμματος. 1. Χρησιμοποιείται ένα καθαρό τριβλίο. Από το τριβλίο με τα βακτήρια λαμβάνεται με μια μπατονέτα αποστειρωμένη μια μεγάλη ποσότητα βακτηρίων. Απλώνονται κάθετα οριζόντια και διαγώνια πάνω στο τριβλίο. 2. Ανάβει η φωτιά. Τοποθετείται η τσιμπίδα σε αιθανόλη στραγγίζεται λίγο και μετά την τοποθετείται στην φωτιά για να αποστειρωθεί 3. Με την αποστειρωμένη τσιμπίδα λαμβάνεται ένα φιλτράκι αντιβιοτικού και τοποθετείται στο τριβλίο με τα βακτήρια (η τσιμπίδα έρχεται σε επαφή μόνο με το φιλτράκι όχι με το βακτήριο). Τοποθετούνται 4 φιλτράκια αντιβιοτικών. o amoxycillin(πενικυλίνη τα βακτήρια είναι ανθεκτικά) o ciprofloxacin(κυνολίνη τα βακτήρια είναι ευαίσθητα) o cefuroxime( sodium κεφαλοσφορίνη δεύτερης γενιας ) o tricef bial(cefixine κεφαλοσφορίνη τρίτης γενίας) 4. Τοποθετούνται στο κλίβανο στους 37 βαθμούς ώστε να δράσει το φάρμακο. 5. Αν γύρω από το φιλτράκι η επιφάνεια είναι διαυγής, τότε το βακτήριο σκοτώθηκε, άρα το βακτήριο είναι ευαίσθητο στο φάρμακο. Αν δεν κάνει διαφορά σημαίνει ότι το βακτήριο είναι ανθεκτικό στο φάρμακο. Αυτό το πείραμα έγινε για διάφορα στελέχη βακτηρίων μέχρι να βρεθούν τρία στελέχη από κάθε είδος βακτηρίου τα οποία είναι ευαίσθητα στο ciprofloxacin. Τα βακτήρια που είναι ευαίσθητα είναι e.coli#2, e.coli#3, e.coli#, το klebsiella#15, klebsiella#23, klebsiella#19 και proteus#21, proteus#32, proteus#13. -13-
2.6 Εξακρίβωση της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που σταματά την ανάπτυξη των βακτηρίων Όταν βρέθηκαν τα βακτήρια τα οποία είναι ευαίσθητα σε ένα αντιβιοτικό (ciprofloxacin) ακολούθησε η εξακρίβωση της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που σταματά την ανάπτυξη των βακτηρίων. Πρώτο στάδιο αυτής της διαδικασίας ήταν να βρεθεί η συγκέντρωση των βακτηρίων ανά ml. Για αυτό το σκοπό δημιουργήθηκαν τρεις υγρές καλλιέργειες του κάθε είδους βακτηριών τα οποία είναι ευαίσθητα στο αντιβιοτικό ciprofloxacin. Τα βακτήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν e.coli#6 klebsiella#23 proteus#21. Αφού αναπαράχθηκαν και επεξεργάσθηκαν ήταν έτοιμα ώστε να τοποθετηθούν σε ειδικό φασματογράφο ο οποίος μετρά απορροφητικότητα ώστε να υπολογιστεί η συγκέντρωση των βακτηρίων ανά ml μετά από αναπαραγωγή δεκαπέντε ωρών. Πριν τοποθετηθεί το μπουκαλάκι με τα βακτήρια στο φασματογράφο έπρεπε να διαλυθούν τα βακτήρια σε θρεπτικό υλικό με αναλογία 1 θρεπτικό υλικό προς 2 βακτήρια. Η λειτουργία του μηχανήματος αυτού στηρίζεται στην αλληλεπίδραση διαφόρων στοιχείων-μορίων με ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία Δηλαδή χτύπα φως στο δείγμα όσο πιο πυκνό το δείγμα(στην περίπτωση των βακτηρίων όσο πιο μεγάλη συγκέντρωση ανά ml) τόσο πιο μεγάλη η απορρόφηση τόσο πιο μικρή η μετάδοση του φωτός. Η απορροφητικότητα (absorbance) μετριέται σε OD. Όπου 1OD = 8.10 8 cells/ml. Για τον proteus#21 μετρήθηκε A=0.430 OD και για την klebsiella#23 A=0.8 OD. Από αυτά τα στοιχεία συμπεραίνεται ότι για καλλιέργεια δεκαπέντε ωρών το βακτήριο klebsiella#23 αναπτύσσεται σε 6.4 10 8 cells/ml και το βακτήριο proteus#21 αναπτύσσεται σε 3.44 10 8 cells/ml. Με την πιο πάνω διαδικασία έγινε γνωστή η συγκέντρωση των βακτηρίων μετά από καλλιέργεια μιας μέρας Έτσι δεδομένου της συγκέντρωσης των βακτηρίων μετά από καλλιέργεια μιας μέρας και του MIC (minimal bactericidal concentration) [12] του αντιβιοτικού ciprofloxacin για το βακτήριο e.coli να είναι 0.004-0.015 μg/ml για 1.10 6 cells/ml βακτήρια (δηλαδή η μικρότερη ανασταλτική συγκέντρωση του αντιβιοτικού ciprofloxacin ώστε να εξολοθρεύσει το βακτήριο e.coli να κυμαίνεται στα 0.004-0.015 μg/ml για 1.10 6-14-