ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΝΕΝΑ Η ΧΗΜΙΚΟΥ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΝΕΝΑ Η ΧΗΜΙΚΟΥ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΣΧΕΣΗ ΟΜΗΣ- ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2004

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΝΕΝΑ Η ΧΗΜΙΚΟΥ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΣΧΕΣΗ ΟΜΗΣ- ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τοµέα Χηµικής Τεχνολογίας και Βιοµηχανικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπλ. Καθηγήτρια Μ. Τσιµίδου Καθηγητής. Μπόσκου Αναπλ. Καθηγητής Ε. Μπακάλµπασης Καθηγητής Α. Βάρβογλης Καθηγητής Κ. Τσίπης Αναπλ. Καθηγητής Β. Κιοσέογλου Επικ. Καθηγητής Γ. Μπλέκας Επιβλέπουσα καθηγήτρια Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης

Η έγκριση της ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του ΑΠΘ δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα. Νόµος 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2

Στους γονείς µου, στη Νaty, στους αδικηµένους της φύσης και σε όσους έφυγαν νωρίς

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Κύριος στόχος της διατριβής αυτής ήταν η µελέτη βιοφαινολών µε αντιοξειδωτικές ιδιότητες και η σχέση δοµής δραστικότητας. Η πειραµατική µελέτη πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, Τµήµα Χηµείας, Α.Π.Θ. κατά το χρονικό διάστηµα Νοέµβριος 2000-Νοέµβριος 2003. Παράλληλα πραγµατοποιήθηκε και υπολογιστική µελέτη τόσο στο Εργαστήριο Εφαρµοσµένης Κβαντικής Χηµείας, Τµήµα Χηµείας, Α.Π.Θ. όσο και στο Εργαστήριο Υπολογιστικής Χηµείας και Βιοπληροφορικής,, Πανεπιστήµιο Zibo, στην Κίνα. Εκφράζω τις θερµές ευχαριστίες µου στην Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Μ. Τσιµίδου, επιβλέπουσα καθηγήτρια, για την υπόδειξη του θέµατος, για την επιµονή της και την ενθάρρυνση να ασκηθώ σε τεχνικές που εφαρµόζονται σε άλλα εργαστήρια του εξωτερικού, µέσω συνεργασιών, κατά τη διάρκεια της διατριβής συµβάλλοντας στην αρτιότερη επιστηµονική µου κατάρτιση. Την ευχαριστώ επίσης για την καθοδήγηση και αµέριστη επιστηµονική συµπαράσταση σε όλη τη διάρκεια της εργασίας, την οικονοµική βοήθεια µε τη συµµετοχή µου σε ερευνητικά προγράµµατα (ΠΑΒΕ, RAFT) καθώς και την ουσιαστική βοήθεια για τη συγγραφή και την παρουσίαση αυτής της διατριβής. Τον Καθηγητή κ.. Μπόσκου, µέλος της συµβουλευτικής επιτροπής, ευχαριστώ θερµά για το ενδιαφέρον που έδειξε για την πορεία της διατριβής, την οικονοµική ενίσχυση µε τη συµµετοχή µου σε ερευνητικά προγράµµατα (ΕΠΕΤ ΙΙ) καθώς και για τις υποδείξεις και διορθώσεις των δοκιµίων της διατριβής. Θερµές ευχαριστίες απευθύνω στον Αναπλ. Καθηγητή κ. Ε. Μπακάλµπαση, µέλος της συµβουλευτικής επιτροπής, για την εκπαίδευση µου σε υπολογιστικές µεθόδους, τη συνεργασία του στην πραγµατοποίηση υπολογισµών που έχουν συµπεριληφθεί στην παρούσα διατριβή καθώς και τις διορθώσεις και υποδείξεις που συνέβαλαν στην αρτιότερη εµφάνιση του δοκιµίου. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή κ. Α. Βάρβογλη, Καθηγητή κ. Κ.Τσίπη, Αναπλ. Καθηγητή κ. Β. Κιοσέογλου και Επικ. Καθηγητή κ. Γ. Μπλέκα, µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής για τις υποδείξεις στη διόρθωση των δοκιµίων. Ευχαριστώ τον Αναπλ. Καθηγητή κ. Κιοσέογλου επίσης και για τις συµβουλές του στην παρασκευή των γαλακτωµάτων. Ευχαριστίες απευθύνω στον Καθηγητή κ. Κυριακίδη (Εργαστήριο Βιοχηµείας) για τη διάθεση της ράβδου υπερήχων που χρησιµοποιήθηκε στην παρασκευή των λιποσωµάτων. Ευχαριστίες οφείλω στον καθηγητή.y. Zhang (Laboratory of omputational hemistry and Bioinformatics, University of Zibo, Shandong, P.R.hina) για την πρόσθετη εκπαίδευση που µου προσέφερε στις υπολογιστικές µεθόδους κατά το διάστηµα παραµονής

µου στην Κίνα και για τη συνεργασία του στην πραγµατοποίηση υπολογισµών που έχουν συµπεριληφθεί στην παρούσα διατριβή. Επίσης ευχαριστώ τον καθηγητή βοτανικής B.S. Zhao για τη συλλογή των φύλλων από τα φυτά του βοτανικού κήπου του Πανεπιστηµίου Zibo που µελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Ευχαριστώ τον Επικ. Καθηγητή κ. J. Vervoort (Laboratory of Biochemistry, Wageningen University, The Netherlands) για την εκπαίδευσή µου σε αναλυτικές τεχνικές (L-MS), καθώς και το ΙΚΥ για την υποτροφία Erasmus µε την οποία µου δόθηκε η ευκαιρία να επισκεφτώ την Ολλανδία και το Πανεπιστήµιο του Wageningen. Ευχαριστώ την εταιρεία Sigma hemical o., (St. Louis, M, USA) για τη δωρεά δείγµατος της διυδροευγενόλης που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή. Ευχαριστώ την Επιτροπή Ερευνών του ΑΠΘ για την οικονοµική υποστήριξη, µέσω βραβείου αριστείας το έτος 2001. Επίσης, τη ΓΓΕΤ για την οικονοµική ενίσχυση µέσω διακρατικής συνεργασίας Ελλάδας-Κίνας που επέτρεψε και την κάλυψη των εξόδων για την πραγµατοποίηση της επίσκεψής µου στην Κίνα. Επίσης ευχαριστώ όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων για τη φιλική ατµόσφαιρα συνεργασίας που µου πρόσφεραν κατά τη διάρκεια της διατριβής. Εκφράζω τις θερµές ευχαριστίες µου στη συνάδελφο, Ελένη Ψωµιάδου (Λέκτορα, Τµήµατος Χηµείας, Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων) για τη συνεργασία, την ηθική συµπαράσταση και ενθάρρυνση. Θα ήθελα ακόµη να ευχαριστήσω τον συµφοιτητή µου και υποψήφιο διδάκτορα Γ. Καλαντζάκη για τη συνεργασία και ηθική συµπαράσταση. Ευχαριστίες απευθύνω προς την υποψήφια διδάκτορα L.F. Wang (Zibo University) και τον επιστηµονικό συνεργάτη Z.L. Sun για το διάστηµα παραµονής µου στην Κίνα. Επίσης, ευχαριστώ τους συναδέλφους διδάκτορες Β. Εξάρχου, Ι. Φιαµέγκο, την υποψήφια διδάκτορα S. Moco και τον τεχνικό S. Boeren για τη συνεργασία τους το διάστηµα παραµονής µου στην Ολλανδία. Ευχαριστώ επίσης τους υποψήφιους διδάκτορες του Εργαστηρίου Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων Α. Κοΐδη, Σ. Ορδούδη και. Γρηγοριάδου για την συναδελφική και φιλική ατµόσφαιρα στον εργαστηριακό χώρο. Στην οικογένεια µου και στη Νaty εκφράζω την ευγνωµοσύνη µου για τη συνεχή συµπαράσταση, την κατανόηση και την ενθάρρυνση που µου προσέφεραν σε όλη τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής. Νικόλαος Νενάδης Θεσσαλονίκη, Μάρτιος 2004

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ..... 1 1.1 ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ... 2 1.1.1. Γενικά.... 2 1.1.2 Κατηγορίες χηµικών ενώσεων που χαρακτηρίζονται ως βιοφαινόλες. 4 1.1.3 Αναζήτηση νέων βιοφαινολών και νέων πηγών βιοφαινολών... 6 1.2 ΣΧΕΣΗ ΟΜΗΣ-ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ (SAR) ΤΩΝ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ... 7 1.3 ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ ΜΕ ΣΚΟΠΟ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΧΕΣΗΣ ΟΜΗΣ- ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ... 11 1.3.1 Γενικά... 11 1.3.2 Πειραµατικές µέθοδοι εκτίµησης της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών... 11 1.3.2.1 Μέθοδος δέσµευσης της ρίζας του 1,1-διφαινυλο-2- πικρυλυδραζυλίου (DPP ).... 12 1.3.2.2 Μέθοδος δέσµευσης της κατιοντικής ρίζας του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6- σουλφονικού οξέος) (ABTS + )... 16 1.3.3 Υπολογιστικές µέθοδοι εκτίµησης της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών... 18 1.3.4 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των βιοφαινολών µε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης σε µοντέλα λιπαρών υποστρωµάτων... 22 1.3.4.1 οκιµές σε έλαια... 23 1.3.4.2 οκιµές σε συστήµατα διασποράς -... 24 1.4 ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΤΟΥ π-υ ΡΟΞΥΚΙΝΝΑΜΩΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ... 28 1.4.1 Γενικά.... 28 1.4.2 Συνήθεις φυσικές πηγές... 31 1.4.3 Σχέσεις δοµής-δραστικότητας... 32 i

1.5 ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ... 37 1.5.1 Γενικά... 37 1.5.2 Συνήθεις φυσικές πηγές... 39 1.5.3 Σχέσεις δοµής-δραστικότητας... 40 2 ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ-ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ....... 43 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 45 3.1 ΥΛΙΚΑ.... 46 3.1.1 Λιπαρές ύλες που χρησιµοποιήθηκαν στις δοκιµές δραστικότητας των βιοφαινολών...... 46 3.1.2 Φυτικό υλικό...... 46 3.2 ΠΡΟΤΥΠΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ...... 46 3.3 ΙΑΛΥΤΕΣ... 47 3.4 ΥΛΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ-ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ... 48 3.5 ΟΡΓΑΝΑ-ΣΥΣΚΕΥΕΣ... 48 3.6 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΟΜΗΣ- ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ.... 49 3.6.1 Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών. 49 3.6.1.1 οκιµή µε τη ρίζα DPP..... 49 3.6.1.1α Ανάπτυξη µεθοδολογίας για τη γρήγορη δοκιµή 49 3.6.1.1β Παρακολούθηση της αντίδρασης µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης.... 50 3.6.1.2. οκιµή µε τη ρίζα ABTS + 51 3.6.2 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µε επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης τριελαΐνης........ 52 3.6.2.1α Προετοιµασία υποστρώµατος.. 52 3.6.2.1β οκιµή πυριατηρίου στους 45 ο.. 53 3.6.3 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µε επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης σε συστήµατα διασποράς........ 53 3.6.3.1 Λιποσώµατα λεκιθίνης.. 53 3.6.3.2 Γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό. 54 ii

3.6.4 Εκτίµηση της οξειδοαναγωγικής ικανότητας των βιοφαινολών µε τη χρήση του αντιδραστηρίου Folin-iocalteu.... 56 3.6.5 Προσδιορισµός του συντελεστή κατανοµής (P) των βιοφαινολών σε µίγµα κ-οκτανόλης:νερού...... 56 3.6.6 Εκτίµηση της πολικότητας των βιοφαινολών µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TL).... 57 3.6.7. Στατιστική επεξεργασία αναλυτικών δεδοµένων. 57 3.7 B3LYP ΚΑΙ AM1/B3LYP ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΣΧΕΣΕΩΝ ΟΜΗΣ-ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ..... 57 3.8 ΠΑΡΑΛΑΒΗ, ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ ΑΠΟ ΦΥΤΑ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ LEAEAE... 59 3.8.1 Παρασκευή µεθανολικών εκχυλισµάτων... 59 3.8.2 Χρωµατοµετρικός προσδιορισµός ολικών φαινολών... 59 3.8.3 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µεθανολικών εκχυλισµάτων µε τη δοκιµή DPP.... 60 3.8.4 Εξέταση µεθανολικών εκχυλισµάτων για την παρουσία φαινολών µε χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών (DAD)... 60 3.8.5 Χαρακτηρισµός φαινολικών συστατικών µε χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανιχνευτές υπεριώδους (UV) και µαζών (MS) σε σειρά.. 61 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ.. 62 4.1 ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΓΡΗΓΟΡΗΣ ΟΚΙΜΗΣ DPP ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ SAR ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ 63 4.1.1 Επίδραση του χρόνου αντίδρασης και της σχετικής συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού... 65 4.1.2 Επίδραση του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση... 68 4.2 ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑΣ TΣ ΟΚΙΜΗΣ ABTS + ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ SAR ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ... 75 4.2.1 Επίδραση του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση... 76 4.2.2 Επίδραση της παρουσίας παραπροϊόντων της αντίδρασης στην ολική εκτίµηση της δραστικότητας των βιοφαινολών..... 77 iii

4.3 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΥΖΥΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΟΥ π- Υ ΡΟΞΥΚΙΝΝΑΜΩΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΦΕΪΚΟΥ, ΙΥ ΡΟΚΑΦΕΪΚΟΥ ΟΞΕΟΣ KAI ΣΥΓΓΕΝΩΝ ΜΟΝΟΦΑΙΝΟΛΩΝ.. 83 4.3.1 Πειραµατική προσέγγιση SAR... 83 4.3.1.1 οκιµή δέσµευσης ελευθέρων ριζών... 83 4.3.1.2 οκιµή εκτίµησης αναγωγικής ικανότητας βιοφαινολών... 90 4.3.1.3 Επιταχυνόµενη δοκιµή οξείδωσης καθαρισµένης τριελαΐνης... 92 4.3.1.4 Επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης σε συστήµατα διασποράς... 94 οκιµή σε λιποσώµατα λεκιθίνης... 95 οκιµή σε γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό... 98 4.3.2 Υπολογιστική προσέγγιση. SAR.... 101 4.3.2.1 Βελτιστοποίηση της γεωµετρίας των υπό µελέτη βιοφαινολών... 101 4.3.2.2 Ενθαλπία διάσπασης δεσµού (BDE) του φαινολικού υδροξυλίου των βιοφαινολών..... 104 4.3.2.3 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας (spin) ελευθέρων ριζών.... 105 4.3.2.4 Ιδιοτιµή του υψηλότερου κατεχόµενου µοριακού τροχιακού (ΗΟΜΟ)... 106 4.4 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΟΜΑ ΩΝ ΤΗΣ ΠΛΕΥΡΙΚΗΣ ΑNΘΡΑΚΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙ ΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΟΥ π-υ ΡΟΞΥΚΙΝΝΑΜΩΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΕΥΓΕΝΟΛΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΓΕΝΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ...... 108 4.4.1 Πειραµατική προσέγγιση SAR..... 110 4.4.1.1 οκιµή δέσµευσης ελευθέρων ριζών... 110 4.4.1.2 Επιταχυνόµενη δοκιµή οξείδωσης καθαρισµένης τριελαΐνης... 113 4.4.1.3 Επιταχυνόµενη δοκιµή οξείδωσης σε συστήµατα διασποράς... 115 οκιµή σε γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό... 115 4.4.2 Υπολογιστική προσέγγιση SAR.... 118 4.4.2.1 Βελτιστοποίηση της γεωµετρίας των υπό µελέτη βιοφαινολών... 118 4.4.2.2 Ενθαλπία ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου.... 120 4.4.2.3 Ενθαλπία διάσπασης δεσµού (BDE) του φαινολικού υδροξυλίου των βιοφαινολών... 120 4.4.2.4 υναµικό ιοντισµού (ΙΡ)... 121 iv

4.5 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΛΛΩΝ ΟΜΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΗΣ ΠΛΕΥΡΙΚΗΣ ΑΝΘΡΑΚΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙ ΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΣΕΚΟΪΡΙ ΟΕΙ ΩΝ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΗΣ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ... 125 4.5.1. Υπολογιστική προσέγγιση SAR... 126 4.5.2 Αναζήτηση νέων πηγών ελαιοευρωπαΐνης... 130 4.5.2.1 Παρασκευή µεθανολικών εκχυλισµάτων. 132 4.5.2.2 Εκτίµηση επιπέδων και αντιοξειδωτικής ικανότητας φαινολών στα µεθανολικά εκχυλίσµατα..... 132 4.5.2.3 Εξέταση µεθανολικών εκχυλισµάτων για την παρουσία φαινολών µε χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών (DAD)... 133 4.5.2.4 Χαρακτηρισµός ελαιοευρωπαΐνης µε χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανιχνευτές υπεριώδους (UV) και µάζας (MS) σε σειρά. 137 5. ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. 140 6. ΑBSTRAT 143 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.. 146 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ.. 165 v

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Σελ. Πίνακας 1.1 Ελεύθερες ρίζες που έχουν χρησιµοποιηθεί για την εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών από βιοφαινόλες..... 12 Πίνακας 4.1 Επίδραση του χρόνου αντίδρασης και της σχετικής συγκέντρωσης ΑΗ στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της DPP... 66 Πίνακας 4.2 Φυσικοχηµικές σταθερές των υπό µελέτη διαλυτών. 69 Πίνακας 4.3 Επίδραση του διαλύτη στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της DPP από τις ΑΗ κατά την εφαρµογή της γρήγορης δοκιµής (20 min).... 70 Πίνακας 4.4 Επίδρασης του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση στην ικανότητα των παραγώγων του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος να δεσµεύουν την ABTS +... 76 Πίνακας 4.5 Τιµές % RSA και TEA επιλεγµένων ΑΗ 80 Πίνακας 4.6 Εκτίµηση της ικανότητας των οξέων καφεϊκού και διυδροκαφεϊκού να δεσµεύουν τη DPP..... 84 Πίνακας 4.7 Εκτίµηση της ικανότητας µονοφαινολών να δεσµεύουν τη DPP..... 86 Πίνακας 4.8 Εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν την ABTS +... 89 Πίνακας 4.9 Αναγωγική ικανότητα ΑΗ µε τη χρήση του αντιδραστηρίου Folin-iocalteu..... 91 Πίνακας 4.10 Κατανοµή ΑΗ σε µίγµα κ-οκτανόλης:νερού (1:1, v/v) στους 37 ο..... 94 Πίνακας 4.11 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των ΑΗ στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d)...... 104 Πίνακας 4.12 Εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν τη DPP 110 Πίνακας 4.13 Εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν την ABTS +....... 113 vi

Πίνακας 4.14 Τιµές ενθαλπίας του ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-311+G (2d,2p)//ΑΜ1, T=298.15 K.... 120 Πίνακας 4.15 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-311+G (2d,2p)//ΑΜ1, T=298.15K... 121 Πίνακας 4.16 Τιµές δυναµικού ιοντισµού (ΙΡ) των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-31G (d)//αμ1, T=298.15 K... 122 Πίνακας 4.17 Επίπεδα ισοευγενόλης σε τρόφιµα και ποτά. 123 Πίνακας 4.18 Τιµές BDE και IP των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-31G (, p )//ΑΜ1.. 127 Πίνακας 4.19 Περιεχόµενο σε ολικές φαινόλες και %RSA τιµές µεθανολικών εκχυλισµάτων φύλλων από επιλεγµένα φυτά της οικογένειας leaceae..... 133 vii

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σελ. Σχήµα 1.1 Ασθένειες που συνδέονται µε την επιβλαβή δράση των ενεργών µορφών οξυγόνου... 3 Σχήµα 1.2 Ανθρακικός σκελετός κυριότερων κατηγοριών βιοφαινολών... 5 Σχήµα 1.3 Σταθεροποίηση φαινοξυ-ρίζας λόγω δοµών συντονισµού... 7 Σχήµα 1.4 Σταθεροποίηση φαινοξυ-ρίζας ο-διφαινόλης λόγω σχηµατισµού ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου.... 9 Σχήµα 1.5 Οξείδωση 1,4-διφαινόλης προς κινόνη κατά τη διαδοχική αντίδραση µε δύο υπεροξυ-ρίζες..... 10 Σχήµα 1.6 Ρίζα του 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίου (DPP ).... 13 Σχήµα 1.7 Κατιοντική ρίζα του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις- (3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ΑΒΤS + )... 16 Σχήµα 1.8 Οξείδωση του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3- αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ΑΒΤS) προς ΑΒΤS +..... 17 Σχήµα 1.9 Τυπική δοµή µικηλλίου... 25 Σχήµα 1.10 Α) δοµή και Β) τρισδιάστατη απεικόνιση φωσφατιδυλοχολίνης... 26 Σχήµα 1.11 Τυπική µορφή διπλοστιβάδας λιποσώµατος που αποτελείται από µόρια φωσφολιπιδίων..... 26 Σχήµα 1.12 Συνήθη υδροξυκινναµωµικά οξέα... 29 Σχήµα 1.13 Βιοσύνθεση παραγώγων π-υδροξυκινναµωµικού οξέος... 29 Σχήµα 1.14 Βιοσύνθεση κινναµωµικού και π-υδροξυκινναµωµικού οξέος µε την οδό του σικιµικού οξέος... 30 Σχήµα 1.15 Συντακτικός τύπος ροσµαρινικού οξέος... 31 Σχήµα 1.16 Πολυδροξυ-παράγωγα καφεϊκού οξέος που απαντούν σε φυτικά υλικά... 36 Σχήµα 1.17 Συντακτικοί τύποι ελαιοευρωπαΐνης και παραγώγων της...... 39 Σχήµα 1.18 Βιοσύνθεση ελαιοευρωπαΐνης... 40 Σχήµα 4.1 Υπό µελέτη φαινολικές ενώσεις: I) παράγωγα του π- υδροξυκινναµωµικού οξέος, II) ελαιοευρωπαΐνη, υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη και III) α-τοκοφερόλη και γνωστά συνθετικά φαινολικά αντιοξειδωτικά... 64 viii

Σχήµα 4.2 Επίδραση του διαλύτη στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της σταθερής ελεύθερης ρίζας DPP σε επιλεγµένα παράγωγα του κινναµωµικού οξέος κατά την παρακολούθηση της αντίδρασης µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης Α) σε αιθανόλη, Β) σε ακετονιτρίλιο... 73 Σχήµα 4.3 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) σε χρόνο 0-6 min κατά την αντίδραση µε Α) καφεϊκό οξύ (αιθανόλη), Β) καφεϊκό οξύ (p=7,4), Γ) π-κουµαρικό οξύ (αιθανόλη) και ) π- κουµαρικό οξύ (p=7,4)... 78 Σχήµα 4.4 Υπό µελέτη φαινολικές ενώσεις Α) απλές φαινόλες, Β) υδροξυβενζοϊκά οξέα, Γ) φλαβονοειδή... 79 Σχήµα 4.5 Τιµές σταθεράς ammett (σ) ενός φαινολικού υδροξυλίου... 80 Σχήµα 4.6 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) σε αιθανόλη (10 µμ) σε χρόνο 0-6 min κατά την αντίδραση µε Α) ρεσορκινόλη, Β) φλωρογλυκινόλη, Γ) 2,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ και ) µορίνη... 81 Σχήµα 4.7 Αντίδραση ο-διφαινολών µε τη ρίζα DPP... 85 Σχήµα 4.8 Συντακτικοί τύποι µονοφαινολών που διαφέρουν ως προς την παρουσία και τη θέση του διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα... 86 Σχήµα 4.9 Κινητική της αντίδρασης της ισοευγενόλης, διυδροευγενόλης και ευγενόλης µε τη DPP σε αιθανόλη... 87 Σχήµα 4.10 Προτεινόµενος µηχανισµός αντίδρασης της ευγενόλης µε τη ρίζα DPP... 88 Σχήµα 4.11 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) στο χρονικό διάστηµα 0-6 min κατά την αντίδραση µε το διυδροκαφεϊκό οξύ (10 µμ) σε αιθανόλη.... 90 Σχήµα 4.12 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης καφεϊκού, διυδροκαφεϊκού οξέος (10 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο... 92 Σχήµα 4.13 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης µονοφαινολών (30 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο... 93 Σχήµα 4.14 Επιταχυνόµενη οξείδωση λιποσωµάτων στους 37 ο παρουσία Α) καφεϊκού και Β) διυδροκαφεϊκού οξέος... 96 ix

Σχήµα 4.15 Επιταχυνόµενη οξείδωση λιποσωµάτων στους 37 ο παρουσία µονοφαινολών.... 97 Σχήµα 4.16 Οξείδωση γαλακτωµάτων τριελαΐνης σε νερό (10 % w/w) στους 37 ο παρουσία διφαινολών... 99 Σχήµα 4.17 Οξείδωση γαλακτωµάτων τριελαΐνης σε νερό (10 % w/w) στους 37 ο παρουσία µονοφαινολών... 100 Σχήµα 4.18 Βελτιστοποιηµένη δοµή Ι) καφεϊκού οξέος και ΙΙ) διυδροκαφεϊκού οξέος στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d)... 102 Σχήµα 4.19 Βελτιστοποιηµένη δοµή ΙΙΙ) ισοευγενόλης, ΙV) διυδροευγενόλης και V) ευγενόλης στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d) 103 Σχήµα 4.20 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου στις φαινοξυ-ρίζες Ι) καφεϊκού οξέος, II) διυδροκαφεϊκού οξέος, ΙΙΙ) ισοευγενόλης, ΙV) διυδροευγενόλης και V) ευγενόλης στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d)... 106 Σχήµα 4.21 Συντακτικοί τύποι λικαρίνης Α (Α) και πινορεσινόλης (Β)...... 109 Σχήµα 4.22 Συντακτικοί τύποι ισοευγενόλης και συγγενών ενώσεων... 109 Σχήµα 4.23 Κινητική της αντίδρασης του φερουλικού οξέος, του αιθυλεστέρα του φερουλικού οξέος, της κωνιφερυλαλκοόλης και της κωνιφερυλαλδεΰδης µε τη DPP σε αιθανόλη.... 111 Σχήµα 4.24 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) σε χρόνο 0-6 min κατά την αντίδραση µε την ισοευγενόλη (10 µμ) σε αιθανόλη.... 113 Σχήµα 4.25 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης ισοευγενόλης και συγγενών ενώσεων (30 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο... 114 Σχήµα 4.26 Οξείδωση γαλακτωµάτων τριελαΐνης σε νερό (10 %, w/w) στους 37 ο Παρουσία A (150 µμ) α) p=3,7 β) p=5,7 γ) απoσταγµένο νερό...... 117 Σχήµα 4.27 Βελτιστοποιηµένη δοµή Ι) φερουλικού οξέος, ΙΙ) κωνιφερυλαλκοόλης, ΙΙΙ) κωνιφερυλαλδεΰδης, ΙV) αιθυλεστέρα φερουλικού οξέος στο θεωρητικό επίπεδο ΑM1.... 119 Σχήµα 4.28 Συντακτικοί τύποι λιγκστροζίτη και επιλεγµένων παραγώγων του... 126 x

Σχήµα 4.29 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης καφεϊκού οξέος, ελαιοευρωπαΐνης και υδροξυτυροσόλης (10 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο..... 129 Σχήµα 4.30 Χάρτης παγκόσµιας κατανοµής των µελών της οικογένειας leaceae... 131 Σχήµα 4.31 Υγροχρωµατογραφικό προφίλ µεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων της Syringa oblata στα 254 nm (στήλη Nucleosil 100 RP 18 )... 134 Σχήµα 4.32 Υγροχρωµατογραφικό προφίλ µεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων της Syringa oblata στα 254 nm (στήλη hromolith RP18e)... 135 Σχήµα 4.33 UV-Vis φάσµα ελαιοευρωπαΐνης... 136 Σχήµα 4.34 Υγροχρωµατογραφικό προφίλ µεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων Fraxinus chinensis στα 254 nm (στήλη hromolith RP18e)... 136 Σχήµα 4.35 Σχήµα 4.36 Υγροχρωµατογραφικό προφίλ µεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων της lea europaea στα 254 nm (στήλη hromolith RP18e)... 137 Προφίλ ιόντων µεθανολικού εκχυλίσµατος φύλλων α) Fraxinus chinensis και β) Syringa oblata σε συνθήκες ανίχνευσης MS-NI... 138 Σχήµα 4.37 Φάσµα µαζών ελαιοευρωπαΐνης σε συνθήκες NI... 139 xi

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.1 ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ 1.1.1 Γενικά Ο όρος βιοφαινόλες (ΑΗ) χρησιµοποιείται όλο και περισσότερο εναλλακτικά αντί των συνήθων όρων φαινόλες ή πολυφαινόλες ή φαινολικές ενώσεις (arborne, 1989, uppett et al., 1997, Uccella, 2001, Yanishlieva, 2001). Ο όρος υποδηλώνει ότι οι ενώσεις είναι φυσικά µόρια που παρουσιάζουν κάποια ευεργετική επίδραση στον οργανισµό όταν καταναλώνονται καθηµερινά (Ηο, 1992, Saija and Uccella, 2001, Scalbert et al., 2002). Ο όρος αυτός υιοθετήθηκε στην παρούσα διατριβή καθώς οι ενώσεις που µελετήθηκαν είναι αφενός φυσικές και αφετέρου έχουν αναφερθεί ευεργετικές ιδιότητές τους στον οργανισµό (wen et al., 2000 a, Johnson, 2001, Kaur and Kappor, 2001, Virgili and Scaccini, 2001, Visioli and Galli, 2002). Κοινό δοµικό χαρακτηριστικό όλων των φαινολικών ενώσεων είναι ότι έχουν τουλάχιστον έναν αρωµατικό δακτύλιο µε υποκαταστάτη µια τουλάχιστον υδροξυ οµάδα (arborne, 1989). Οι συγκεκριµένες ενώσεις είναι δευτερογενείς µεταβολίτες και χρησιµεύουν στην άµυνα των φυτών απέναντι σε µικρόβια, έντοµα και ζώα, καθώς και από την υπεριώδη ακτινοβολία. Επιπλέον, συµβάλλουν στις µηχανικές ιδιότητες της δοµής του φυτού (π.χ. ελαστικότητα ιστού), στο χρώµα και στο άρωµά τους (Scalbert et al., 2002). Οι βιοφαινόλες εντοπίζονται µε διάφορες µορφές (γλυκοζίτες, πολυµερή κ.α.) σε όλα τα τµήµατα των φυτών από τις ρίζες και τα στελέχη µέχρι τα φύλλα και τους καρπούς. Η σηµασία των βιοφαινολών είναι µεγάλη όχι µόνο για τα φυτά, αλλά και για τον ανθρώπινο οργανισµό, καθώς παρουσιάζουν ευεργετικές ιδιότητες σε αυτόν, όταν προσλαµβάνονται µε την καθηµερινή τροφή. Για παράδειγµα, είναι γνωστό, ότι παράγωγα του βενζοϊκού οξέος και ορισµένα φλαβονοειδή έχουν αντιαλλεργική, αντισπασµολυτική, αντισηπτική, διουρητική, αγγειοδιασταλτική και καρδιοτονωτική δράση (Walker, 2000). Στο παρελθόν, οι βιοφαινόλες κατατάσσονταν από ορισµένους φορείς λόγω των θεραπευτικών τους ιδιοτήτων στην κατηγορία των βιταµινών (π.χ. βιταµίνες Ρ από τον FDA το 1968), ακόµα και σήµερα στη Γαλλία αναφέρονται ως βιταµίνες 2 καθώς δρούν συνεργιστικά µε το ασκορβικό οξύ στη θεραπεία του σκορβούτου και άλλων παθήσεων ( onnell and Fox, 2001). Το ενδιαφέρον για τις βιοφαινόλες αυξήθηκε σηµαντικά την τελευταία εικοσαετία και οδήγησε σε επιδηµιολογικές µελέτες τα αποτελέσµατα των οποίων 2

συνδέουν την πρόσληψή τους µέσω της κατανάλωσης φρούτων και λαχανικών µε την προστασία από καρδιαγγειακά νοσήµατα και τον καρκίνο (Kaur and Kappor, 2001). Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν επιφυλάξεις για την αύξηση της παρουσίας των βιοφαινολών στη διατροφή, καθώς αυτή προκαλεί µείωση της βιοδιαθεσιµότητας των πρωτεϊνών και των ιχνοστοιχείων ( onnell and Fox, 2001), παρατηρείται µια στροφή των ειδικών και των καταναλωτών προς τις ενώσεις αυτές. Η σπουδαιότητα των βιοφαινολών για την υγεία οφείλεται στις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες, δηλαδή, στην προστασία που παρέχουν έναντι των ενεργών µορφών οξυγόνου (Reactive xygen Species, RS) όπως για παράδειγµα 2,, RΟΟ και ΝΟ προϊόντων της διαδικασίας του ανθρώπινου µεταβολισµού. Όταν η παραγωγή των RS γίνει ανεξέλεγκτη και τα ενδογενή αντιοξειδωτικά συστήµατα του ανθρώπινου οργανισµού δεν είναι ικανά να τις ανενεργοποιήσουν, τότε µπορούν να προκαλέσουν σηµαντικές βλάβες στο DNA, τις πρωτεΐνες, τα σάκχαρα και τα λιπίδια καθώς είναι ιδιαίτερα δραστικές (Frankel, 1998). Έτσι οι RS συµβάλλουν στη διαδικασία της γήρανσης των κυττάρων, στην εµφάνιση του καρκίνου και διαφόρων καρδιαγγειακών παθήσεων, και γενικότερα στην εξασθένηση του ανοσοποιητικού συστήµατος (Σχήµα 1.1). Σχήµα 1.1 Ασθένειες που συνδέονται µε την επιβλαβή δράση των ενεργών µορφών οξυγόνου 3

Όµως, το µοριακό οξυγόνο, εκτός από την in vivo συµβολή του, µε τη µορφή οξυγονούχων ελευθέρων ριζών στην εµφάνιση διάφορων παθήσεων, αποτελεί τη βασική αιτία της ποιοτικής υποβάθµισης των τροφίµων ακόµα και όταν το περιεχόµενό τους σε λίπος είναι πολύ χαµηλό. Η αλλοίωση των τροφίµων µε την πάροδο του χρόνου, λόγω της επαφής µε το οξυγόνο, επηρεάζει την ευχυµία, το χρώµα, την υφή και την όλη εµφάνισή τους µε συνέπεια την υποβάθµιση της ολικής ποιότητας. Οι βιοφαινόλες, λόγω των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων, έχουν ιδιαίτερη σηµασία για τη βιοµηχανία τροφίµων καθώς ως πρόσθετα βοηθούν στη διατήρηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των τροφίµων για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα (Frankel, 1998). 1.1.2 Κατηγορίες χηµικών ενώσεων που χαρακτηρίζονται ως βιοφαινόλες Ο όρος βιοφαινόλες αναφέρεται συνήθως σε ενώσεις που η βιοσύνθεσή τους ακολουθεί την οδό του οξικού οξέος, του σικιµικού οξέος ή του συνδυασµού αυτών των δύο βιοσυνθετικών οδών (arborne, 1989). Ο ανθρακικός σκελετός των κυριότερων κατηγοριών βιοφαινολών δίνεται στο Σχήµα 1.2. Από τις συγκεκριµένες ενώσεις τα φλαβονοειδή, αποτελούν την πολυπληθέστερη κατηγορία (αριθµεί γύρω στις 4.000 ενώσεις) που µε τη σειρά τους κατατάσσονται σε υποκατηγορίες (arborne, 1989). Ωστόσο υπάρχουν και βιοφαινόλες, των οποίων η βιοσύνθεση ακολουθεί συνδυασµό άλλων οδών. Στις ενώσεις αυτές περιλαµβάνονται οι τοκοφερόλεςτοκοτριενόλες, τα φαινολικά διτερπένια (π.χ. καρνοσικό οξύ, καρνοσόλη), οι γλυκοζίτες σεκοϊριδοειδών (π.χ. ελαιοευρωπαΐνη) που θεωρούνται τερπένια (Jensen et al., 2002, ofius and Sonnewald, 2003). Εκτός από τα βασικά µέλη των σειρών του Σχήµατος 1.2, τα απλά παράγωγα και τους µεταβολίτες τους, αναφέρονται και πολυυδροξυ-παράγωγα (hen et al., 1999, Lu and Foo, 2001). 4

6 Απλές φαινόλες Βενζοκινόνες 6 n 6-1 --Βενζοϊκά οξέα 6-2 --Aκετοφαινόνες 3 6-2 --Φαινυλοξικά οξέα 6-3 ---Φαινυλοπροπένια 6-3 --------Χρωµόνες 2-6 - 3 ----Κινναµωµικά οξέα 2 -= 2 6-3 --------Κουµαρίνες 6-4 --------Ναφθοκινόνες 6 - n - 6 =- 6-1 - 6 --------Ξανθόνες 6-2 - 6 --------Στιλβένια 6-2 - 6 ---Ανθρακινόνες 6-3 - 6 --Φλαβονοειδή ( 6-3 )n ( 6-3 ) 2 ----Λιγνάνες 2 ( 6-3 )n----λιγνίνες 2 Tαννίνες----Συµπυκνωµένες Ταννίνες-----Υδρολυµένες Ο Σχήµα 1.2 Ανθρακικός σκελετός κυριότερων κατηγοριών βιοφαινολών ( onnell and Fox, 2001) 5

1.1.3 Αναζήτηση νέων βιοφαινολών και νέων πηγών βιοφαινολών Τις τελευταίες δεκαετίες έχει παρατηρηθεί µεταξύ των καταναλωτών αυξηµένη ζήτηση για φυσικά συστατικά που ενισχύουν τον ανθρώπινο οργανισµό (Johnson, 2001) αλλά και για τρόφιµα που περιέχουν όσο το δυνατό λιγότερα συνθετικά πρόσθετα (Miková, 2001). Η ζήτηση αυτή έχει οδηγήσει την έρευνα στην αναζήτηση συστατικών και την αγορά στη διάθεση τροφίµων που, όπως δηλώνει ο ορισµός τους, η κατανάλωσή τους επηρεάζει τον οργανισµό θετικά και µε συγκεκριµένο τρόπο. Σε αυτά τα συστατικά και τρόφιµα αποδίδονται συγκεκριµένες ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες πέρα των βασικών διατροφικών αναγκών (Gibson and Fuller, 1998) και για το λόγο αυτό ονοµάζονται λειτουργικά (functional). Τα λειτουργικά τρόφιµα σηµειώνουν αύξηση στις προτιµήσεις των καταναλωτών καθώς παρατηρείται σταδιακή αύξηση των πωλήσεών τους στην αγορά των τροφίµων (Sloan, 2000). Οι ερευνητές που ασχολούνται µε την αναζήτηση βιοφαινολών που µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως λειτουργικά συστατικά τροφίµων, προσπαθούν κυρίως να τις εντοπίσουν σε τρόφιµα ευρείας κατανάλωσης (π.χ. φρούτα, λαχανικά, δηµητριακά, όσπρια). Παράλληλα η αναζήτηση βιοφαινολών περιλαµβάνει και διερεύνηση της σύστασης φυτικών υλών, όπως µπαχαρικά, αρωµατικά φυτά και βότανα, που είναι γνωστό από το παρελθόν ότι έχουν θεραπευτικές ιδιότητες. Λόγω του µεγάλου ενδιαφέροντος που έχει εκδηλωθεί για τις βιοφαινόλες χαρακτηριστικός είναι ο προσανατολισµός της αναζήτησης και σε µη συµβατικές πηγές, όπως κάθε είδους φυτικό υλικό αλλά και παραπροϊόντα ή απόβλητα βιοµηχανιών τροφίµων. Για παράδειγµα, έρευνες έχουν γίνει σε φλοιούς καλλωπιστικών φυτών (Marinova et al., 1994), σε φλοιούς σπερµάτων σίκαλης και βρώµης (Watanabe et al., 1997, Xing and White, 1997), σε γίγαρτα (Saint-ricq de Gaulejac et al., 1999) ή σε απόβλητα ελαιοτριβείων (Visioli et al., 1999). Ο εντοπισµός νέων βιοφαινολών ή νέων πηγών πλούσιων σε γνωστές ή µη βιοφαινόλες έχει σηµασία για τη βιοµηχανία τροφίµων, καθώς µε την αξιοποίησή τους θα είναι δυνατή η προστασία των τροφίµων από την οξείδωση σύµφωνα µε τις αρχές της ορθής βιοµηχανικής πρακτικής που απαιτούν τη χρησιµοποίηση της µικρότερης αποτελεσµατικής ποσότητας προσθέτων. 6

1.2 ΣΧΕΣΗ ΟΜΗΣ-ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ (SAR) ΤΩΝ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ Οι βιοφαινόλες όπως και τα συνθετικά φαινολικά αντιοξειδωτικά ανήκουν στην κατηγορία των πρωτοταγών αντιοξειδωτικών. Τα πρωτοταγή αντιοξειδωτικά δρούν δεσµεύοντας τις ελεύθερες ρίζες µε µετατροπή τους σε σταθερά προϊόντα. Για την εξήγηση της δράσης των ΑΗ γίνονται δεκτοί δύο µηχανισµοί (Gordon, 1990). Ο πρώτος, που είναι και ο σηµαντικότερος από κινητική άποψη, περιλαµβάνει την απευθείας απόδοση ατόµου υδρογόνου από το φαινολικό υδροξύλιο προς τις υπεροξυ- (R ) ή τις αλκοξυ- (R ) ρίζες και την αντίστοιχη µετατροπή τους σε υδροϋπεροξείδια (R) ή υδροξυ- παράγωγα (R) (Αντιδράσεις R. 1 και R. 2). Ο δεύτερος µηχανισµός περιλαµβάνει δύο στάδια. Η ΑΗ ανάγει την R προς το αντίστοιχο ανιόν µε απόδοση µονήρους ηλεκτρονίου και στη συνέχεια ακολουθεί µετατροπή του ανιόντος σε υδροϋπεροξείδιο (Αντίδραση R. 3). Α+R Α +R (R. 1) Α+R Α +R (R. 2) Α+R R ---Α + R+Α (R. 3) Οι φαινοξυ-ρίζες (Α ) που παράγονται είναι λιγότερο δραστικές από τις RΟ και R καθώς σταθεροποιούνται λόγω δοµών συντονισµού (Σχήµα 1.3). Σχήµα 1.3 Σταθεροποίηση φαινοξυ-ρίζας λόγω δοµών συντονισµού Επίσης οι Α αντιδρούν µε οµοειδείς ή άλλου τύπου ελεύθερες ρίζες (π.χ. R ) προς σχηµατισµό σταθερών προϊόντων (Αντιδράσεις R. 4-R. 6), (Frankel, 1998). Α +Α Α-Α (R. 4) Α +RΟΟ RΟΟΑ (R. 5) Α +R RΑ (R. 6) 7

Όλες οι Α των ΑΗ µε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση δεσµεύονται µε τον παραπάνω τρόπο (R. 4-R. 6). Αντίθετα, στην περίπτωση ασθενών ΑΗ είναι δυνατόν να λάβουν χώρα και άλλες παράπλευρες αντιδράσεις που είναι όµως πιο βραδείες σε σχέση µε την R. 1. Έτσι, για παράδειγµα, η Α µπορεί να αντιδράσει µε το οξυγόνο ( 3 Ο 2 ) της ατµόσφαιρας και στη συνέχεια µε το λιπαρό υπόστρωµα (R), (R. 7 και R. 8) ή απευθείας µε το λιπαρό υπόστρωµα (R) και τα υδροϋπεροξείδια όταν δεν είναι σταθερή (R. 9, R. 10). Επίσης, η ίδια η ΑΗ µπορεί να οξειδωθεί απευθείας από το οξυγόνο ή και να αντιδράσει µε υπάρχοντα υδροϋπεροξείδια (R.11, R.12) εµφανίζοντας τελικά προοξειδωτική δράση. Α +Ο 2 ΑΟΟ (R. 7) ΑΟΟ +RΗ ΑΟΟΗ+R (R. 8) Α +RΗ ΑΗ+R (R. 9) Α + RΟΟΗ ΑΗ+RΟΟ (R. 10) ΑΗ+ Ο 2 Α + ΗΟΟ (R. 11) ΑΗ+RΟΟΗ Α +Η 2 Ο+RΟ (R. 12) Αντιοξειδωτική δράση παρουσιάζεται πάνω από µια συγκέντρωση, διαφορετική για κάθε ΑΗ, που ονοµάζεται κρίσιµη. Όταν όµως το επίπεδο προσθήκης είναι εξαιρετικά υψηλό αντί της αντιοξειδωτικής µπορεί να παρατηρηθεί και προοξειδωτική δράση (R. 11, R. 12). Όταν η ΑΗ απαντά σε υψηλές συγκεντρώσεις η ταχύτητα των αντιδράσεων R. 1, και R. 2 είναι σταθερή καθώς το περιεχόµενο σε RΟΟ και RΟ είναι περιορισµένο. Υπό αυτές τις συνθήκες αντιδράσεις όπως οι R. 7, R. 11 και R. 12, στις οποίες δε συµµετέχουν οι παραπάνω ρίζες, γίνονται πιο σηµαντικές µε αποτέλεσµα την παραγωγή R (R. 8 και R. 9). Χαρακτηριστικό παράδειγµα ΑΗ που µπορεί να εµφανίσει προοξειδωτική δράση µε αύξηση της συγκέντρωσης είναι η α-τοκοφερόλη (Pokorny, 1987). Όπως γίνεται φανερό η αντιοξειδωτική ικανότητα των ΑΗ εξαρτάται αφενός από την ευκολία απόδοσης ατόµου υδρογόνου προς τις ελεύθερες ρίζες και αφετέρου από τη σταθερότητα της φαινοξυ-ρίζας Α. Καθοριστικό ρόλο και στις δύο περιπτώσεις παίζουν 8

τα δοµικά χαρακτηριστικά της ΑΗ όπως η υποκατάσταση στον αρωµατικό δακτύλιο. Ο ρόλος των δοµικών χαρακτηριστικών στην αντιοξειδωτική ικανότητα των πρωτοταγών αντιοξειδωτικών, όπως οι συνθετικές και φυσικές φαινόλες, έχουν περιγραφεί σε µονογραφίες και σε άρθρα επισκόπησης (Pokorny, 1987, Gordon, 1990, Rice-Evans et al., 1996, uppett et al., 1997, Yanishlieva, 2001). Έτσι η απλή φαινόλη δεν εµφανίζει αντιοξειδωτική δράση παρά µόνο όταν υπάρχει υποκατάσταση σε ο- ή π- θέση µε οµάδες δότες ηλεκτρονίων (π.χ. υδροξυ-, αλκυλο-, µεθοξυ-) που προκαλούν αύξηση της ηλεκτρονιακής πυκνότητας στο φαινολικό υδροξύλιο. Με τον τρόπο αυτό ελαττώνεται η ενέργεια του δεσµού υδρογόνου-οξυγόνου και είναι δυνατή η ευκολότερη απόδοση ατόµου υδρογόνου προς τις R. Η υποκατάσταση σε µ- θέση δεν επιφέρει κάποια βελτίωση στην αντιοξειδωτική ικανότητα καθώς σε µια τέτοια θέση οι υποκαταστάτες έχουν ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα. Προϋπόθεση για καλή αντιοξειδωτική συµπεριφορά είναι η σταθερότητα της Α καθώς, διαφορετικά, αυτή θα δράσει προοξειδωτικά συµµετέχοντας σε παράπλευρες αντιδράσεις (R. 7-R. 10). Η σταθεροποίησή της οφείλεται σε δοµές συντονισµού (Σχήµα 1.3). Περαιτέρω σταθεροποίηση είναι δυνατή µε την υποκατάσταση σε ο- θέση µε υδροξυ- ή µε ογκώδεις αλκυλο- οµάδες. Στην πρώτη περίπτωση η εισαγωγή δεύτερης υδροξυ- οµάδας οδηγεί σε σταθεροποίηση της φαινοξυ-ρίζας λόγω σχηµατισµού ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου (Σχήµα 1.4). Κάτι τέτοιο δεν είναι δυνατό όταν υπάρχει άλλου τύπου υποκατάσταση και γιαυτό οι µονοφαινολικές ενώσεις παρουσιάζουν χαµηλότερη δραστικότητα. Σχήµα 1.4 Σταθεροποίηση φαινοξυ-ρίζας ο-διφαινόλης λόγω σχηµατισµού ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου Η παρουσία ογκωδών υποκαταστατών, όπως για παράδειγµα, δύο τριτοταγών βουτυλο- οµάδων στην ένωση ΒΗΤ (βουτυλο-υδροξυτολουένιο), αν και δεν ευνοεί το σχηµατισµό δεσµού υδρογόνου, προκαλεί φαινόµενα στερεοχηµικής παρεµπόδισης. Με 9

τον τρόπο αυτό αντιδράσεις όπως οι R. 9 και R. 10 επιβραδύνονται, καθώς η ρίζα δεν µπορεί να προσεγγίσει εύκολα το λιπαρό υπόστρωµα ή τα υδροϋπεροξείδια και να αλληλεπιδράσει µαζί τους. Το αποτέλεσµα είναι η ενίσχυση της αντιοξειδωτικής ικανότητας της φαινόλης. Από όσα αναφέρθηκαν προηγουµένως, η υποκατάσταση της φαινόλης µε υδροξυ- οµάδες έχει τη µεγαλύτερη σηµασία για την αποτελεσµατικότητα των ΑΗ. Εκτός από την πρόσθετη σταθεροποίηση που προσφέρει στην Α, η ηµικινοειδής ρίζα που παράγεται αρχικά µπορεί να οξειδωθεί περαιτέρω µε αντίδρασή της µε δεύτερη R προς κινόνη παρέχοντας και δεύτερο άτοµο υδρογόνου στις ελεύθερες ρίζες (Σχήµα 1.5). Επίσης είναι δυνατή η αλληλεπίδραση δύο Α που µπορούν να οδηγήσουν σε αναγέννηση ενός µορίου της αρχικής ΑΗ. Η σηµασία της παρουσίας πρόσθετων υδροξυ- οµάδων φαίνεται όταν υπάρχει και τρίτη στην ΑΗ. Έτσι η πυρογαλλόλη και τα παράγωγά της (π.χ. γαλλικό οξύ) είναι οι πλέον αποτελεσµατικές φαινόλες. Ωστόσο, περισσότερες από τρεις υδροξυ- οµάδες στον αρωµατικό δακτύλιο δεν ενισχύουν περισσότερο τη δραστικότητα. Αύξηση της αποτελεσµατικότητας παρατηρείται επίσης όταν υπάρχει και δεύτερος δακτύλιος µε κατεχολική οµάδα στο µόριο της ΑΗ. R R R R Σχήµα 1.5 Οξείδωση 1,4-διφαινόλης προς κινόνη κατά τη διαδοχική αντίδραση µε δύο υπεροξυ-ρίζες Σύµφωνα µε τα παραπάνω γίνεται φανερό, ότι οι σχέσεις δοµής-αντιοξειδωτικής ικανότητας (Structure Activity Relationship, SAR) που έχουν αναπτυχθεί ερµηνεύουν την αντιοξειδωτική δράση µε τα φαινόµενα που εισάγουν οι διάφοροι υποκαταστάτες. Η αντιοξειδωτική ικανότητα µιας ΑΗ καθορίζεται από τα δοµικά χαρακτηριστικά της ενώ 10

οι SAR εξαρτώνται από το υπόστρωµα στο οποίο γίνεται η µελέτη, τις συνθήκες της αντίδρασης (π.χ. θερµοκρασία, συγκέντρωση ΑΗ) και τελικά την έκφραση και ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Καθώς οι παραπάνω σχέσεις έχουν προκύψει κυρίως µε πειραµατικές µεθόδους, διατυπώθηκαν διάφορες θεωρίες ή υποθέσεις για την ερµηνεία κανονικοτήτων ή µη αναµενόµενων συµπεριφορών των ΑΗ. Έτσι, για παράδειγµα, η υπόθεση του πολικού παράδοξου (polar paradox) (Porter, 1980), διατυπώθηκε για την ερµηνεία της δραστικότητας πολικών και µη πολικών ΑΗ σε διάφορα λιπαρά υποστρώµατα ή ο σχηµατισµός χηλικών συµπλόκων µε ιόντα µεταβατικών µετάλλων από ΑΗ όπως τα φλαβονοειδή σε λιπαρά υποστρώµατα (udson and Lewis, 1983). Τα παραπάνω θα περιγραφούν αναλυτικότερα σε ενότητες που ακολουθούν και αναφέρονται στις µεθόδους που χρησιµοποιούνται στην αναζήτηση SAR. 1.3 ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ ΜΕ ΣΚΟΠΟ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΧΕΣΗΣ ΟΜΗΣ- ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ 1.3.1 Γενικά Οι µέθοδοι που χρησιµοποιούνται στη βιβλιογραφία για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των βιοφαινολών είναι πολλές και διαφορετικές. Μεταξύ των κυριότερων µεθοδολογιών περιλαµβάνονται αντιδράσεις των ΑΗ µε ελεύθερες ρίζες σε οργανικά ή υδατικά διαλύµατα καθώς και δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης σε µοντέλα λιπαρών υποστρωµάτων (π.χ. έλαια, γαλακτώµατα o/w, λιποσώµατα). Παρά την ευρεία εφαρµογή τους όλες οι µέθοδοι δεν έχουν εξετασθεί κατά πόσο εκφράζουν σχέσεις δοµής-δραστικότητας των ΑΗ. Για το λόγο αυτό πρόσφατα πολλές πειραµατικές µέθοδοι επαναξιολογούνται προκειµένου να εκτιµηθεί η καταλληλότητά τους για την εξαγωγή συµπερασµάτων SAR. Στην κατεύθυνση αυτή συµβάλλει και ο υπολογισµός µοριακών δεικτών που σκοπό έχουν την πρόβλεψη της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΗ. 1.3.2 Πειραµατικές µέθοδοι εκτίµησης της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών Η δραστικότητα των βιοφαινολών σχετίζεται κατεξοχήν µε την ικανότητά τους να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες µε απόδοση ατόµου υδρογόνου από το ή τα φαινολικά τους υδροξύλια. Έτσι, τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί µια ιδιαίτερη ερευνητική 11

δραστηριότητα που σχετίζεται µε την ανάπτυξη µεθόδων κατάλληλων για την εκτίµηση αποκλειστικά αυτής της ιδιότητας. Ορισµένες χαρακτηριστικές µέθοδοι παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.1. Πίνακας 1.1 Ελεύθερες ρίζες που έχουν χρησιµοποιηθεί για την εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών από βιοφαινόλες Ρίζες Αναφορά Ρίζα 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίου (DPP ) Blois, 1958 Κατιοντική ρίζα 2,2 -αζινο-δις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο- Miller et al., 1993 6-σουλφονικού οξέος) (ABTS + ) Ρίζα υδροξυλίου (Ο ) alliwell et al., 1987 Ρίζα σουπεροξειδίου (Ο - 2 ) Robak and Gryglewski, 1988 Η πιο συχνά ακολουθούµενη µεθοδολογία για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των βιοφαινολών στηρίζεται στη χρησιµοποίηση σταθερών συνθετικών ελευθέρων ριζών που έχουν τη δυνατότητα να δίνουν µε το νερό ή οργανικούς διαλύτες έγχρωµα διαλύµατα. Κατά την αντίδραση των συγκεκριµένων ριζών µε τις υπό εξέταση ενώσεις και εφόσον οι δεύτερες παρουσιάζουν αντιοξειδωτική δράση παρατηρείται σταδιακός ή άµεσος αποχρωµατισµός του διαλύµατος. Το γεγονός αυτό επιτρέπει τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της ρίζας σε διαφορετικές χρονικές στιγµές µε τη χρήση ενός απλού φασµατοφωτοµέτρου και κατά συνέπεια την έµµεση εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης των υπό µελέτη ΑΗ. Στη συνέχεια παρουσιάζονται αναλυτικά µε κριτικό τρόπο οι δύο πλέον χρησιµοποιούµενες µέθοδοι δέσµευσης ελευθέρων ριζών που µελετήθηκαν και χρησιµοποιήθηκαν για τη διερεύνηση σχέσεων δοµής-δραστικότητας στην παρούσα διατριβή. 1.3.2.1 Μέθοδος δέσµευσης της ρίζας του 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίου(DPP ) Η µέθοδος που περιλαµβάνει τη χρήση της σταθερής ελεύθερης ρίζας του 1,1- διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίου (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Σχήµα 1.6) είναι η πιο διαδεδοµένη στα πεδία των Επιστηµών Τροφίµων και Υγείας για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης (Blois, 1958, Brand-Williams et al., 1995, Bondet et al., 1997, hen-o, 1997, Von Gadow et al., 1997, Moon and Terao, 1998, Sanchez-Moreno et 12

al., 1998, Pekkarinen et al., 1999, Espin et al., 2000, Silva et al., 2000, Gordon et al., 2001, Kikuzaki et al., 2002, Son and Lewis, 2002, Goupy et al., 2003). Η DPP είναι µια από τις πρώτες συνθετικές ελεύθερες ρίζες που χρησιµοποιήθηκε από πολύ παλιά για τη µελέτη αντιδράσεων που ο µηχανισµός τους περιλαµβάνει την απόδοση ατόµου υδρογόνου (Braude et al., 1954, Russel, 1954, Blois, 1958, Mcgowan et al., 1959, Flood et al., 1972). 2 N N N N 2 N 2 Σχήµα 1.6 Ρίζα του 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίου (DPP ) Το ενδιαφέρον των ερευνητών για την εφαρµογή της συγκεκριµένης µεθόδου οφείλεται σε µια σειρά από ιδιότητες της ελεύθερης ρίζας. Συγκεκριµένα, σύµφωνα µε µετρήσεις ESR (Electron Spin Resonance) η DPP δε διµερίζεται και υπάρχει µε τη µονοµερή της µορφή τόσο σε στερεά κατάσταση όσο και σε διάλυµα (Russel 1954, Braude et al., 1954). Επίσης, ενώ η ίδια δέχεται πολύ εύκολα µονήρη ηλεκτρόνια ή άτοµα υδρογόνου, οξειδώνεται πολύ δύσκολα (Blois, 1958). Τα διαλύµατα της ρίζας είναι έγχρωµα, σχετικά σταθερά και η συγκέντρωσή της σε αυτά µπορεί να προσδιοριστεί µε µέτρηση της απορρόφησης στο ορατό (515 nm). απορρόφηση των διαλυµάτων της είναι σταθερή ακόµη και στην περίπτωση που χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα εκτός από πολύ αλκαλικά διαλύµατα και ανεξάρτητη της τιµής του p όταν αυτή κυµαίνεται µεταξύ 5,0 και 6,5 (Blois, 1958). Η συνήθης µεθοδολογία που ακολουθείται είναι απλή, γρήγορη και η αντίδραση γίνεται κάτω από ήπιες συνθήκες, ενώ µπορεί να εφαρµοστεί για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης υδρόφιλων και λιπόφιλων ενώσεων (Von Gadow et al., 1997, Yamaguchi et al., 1998). µελέτη της αντίδρασης της DPP µε ενώσεις δότες ατόµων υδρογόνου έχει µελετηθεί αρκετά τόσο µε εύρεση της στοιχειοµετρίας της αντίδρασης µε µελέτες κινητικής, όσο και µε προσπάθειες ταυτοποίησης των παραγόµενων προϊόντων (Braude et al., 1954, Blois, 1958, McGowan et al., 1959, onstantinescu et al., 1997, Bondet et 13

al., 1997, Suzuki et al., 2000). Ο Russel (1954) ταυτοποίησε το παράγωγο της DPP µε την κ-εξυλοµερκαπτάνη, ενώ οι Flood et al. (1972) µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας σε στατική φάση alumina και διαλύτη ανάπτυξης βενζόλιο διαχώρισαν τα προϊόντα της αντίδρασης της DPP µε την 2,4,6-τρι-βουτυλοβενζυλoθειόλη. Στην περίπτωση αυτή, το δευτερεύον προϊόν της αντίδρασης µετά από οξείδωση µε Pb 2 έδωσε µια ελεύθερη ρίζα µε φάσµα ESR που ήταν τυπικό µιας υποκατεστηµένης πικρυλικής ρίζας. Με τον τρόπο αυτό επιβεβαιώθηκε ότι όταν το µονήρες ηλεκτρόνιο της ρίζας σχηµατίσει ζεύγος µε εκείνο του ατόµου υδρογόνου που αποσπάται από µια ΑΗ ή µε εκείνο άλλου είδους ρίζα (R ), η απορρόφηση του διαλύµατος ελαττώνεται λόγω σχηµατισµού προϊόντων, µε κυριότερο το υποκίτρινο DPP-, όπως φαίνεται στις παρακάτω αντιδράσεις. DPP (ε Me=9660) +A DPP- ( ε Me=1640) +A (R.13) DPP +R DPP-R (R.14) Τα βασικά στάδια της µεθόδου περιλαµβάνουν την ανάµειξη διαλύµατος αντιοξειδωτικού µε διάλυµα της ρίζας και καταγραφή της ελάττωσης της απορρόφησης του διαλύµατος µε τη χρήση ενός φωτοµέτρου (515 nm) περιοδικά ή µετά από κάποιο καθορισµένο χρονικό διάστηµα. Η υπό µελέτη ένωση είναι κατά προτίµηση διαλυτοποιηµένη στον ίδιο διαλύτη µε εκείνο που χρησιµοποιείται για την παρασκευή του διαλύµατος της ρίζας ώστε να αποφευχθούν τυχόν προβλήµατα ανάµειξης. Aν και η DPP έχει χρησιµοποιηθεί πρόσφατα σε συνδυασµό µε τεχνικές όπως NMR, (Sawai and Sakata, 1998, Sawai and Moon, 2000), EPR, (Wettasinghe and Shahidi, 2000) και PL (Yamaguchi et al., 1998, Koleva et al., 2000) για την αξιολόγηση της δραστικότητας ΑΗ, η γρήγορη δοκιµή ή εκείνη της περιοδικής παρακολούθησης της αντίδρασης εξακολουθούν να είναι οι περισσότερο χρησιµοποιούµενες. Ο λόγος που τα δύο πρωτόκολλα προτιµούνται είναι πιθανότατα το χαµηλότερο κόστος και η απλή διαδικασία εκτέλεσης του πειράµατος σε σχέση µε εκείνη που περιλαµβάνει τη χρήση εξειδικευµένου εξοπλισµού µε τις άλλες τεχνικές. Προσεκτική διερεύνηση της βιβλιογραφίας δείχνει ότι µεταξύ των διαφόρων ερευνητών που χρησιµοποιούν τη συγκεκριµένη δοκιµή υπάρχουν διαφορές ως προς µια ή περισσότερες αναλυτικές παραµέτρους ακόµα και για το ίδιο πρωτόκολλο. Έτσι, 14

διαφορές εντοπίζονται στα επίπεδα των χρησιµοποιούµενων συγκεντρώσεων τόσο της ρίζας, όσο και των υπό µελέτη αντιοξειδωτικών (hen and o, 1997, Pekkarinen et al., 1999, Kikuzaki et al., 2002) καθώς και στις συνθήκες πραγµατοποίησης της αντίδρασης (ελεγχόµενη ή µη θερµοκρασία) (Bondet et al., 1997, Moon and Terao, 1998), την κινητική της και τη διάρκεια παρακολούθησής της (µερικά λεπτά έως ώρες) (Pekkarinen et al., 1999, Silva et al., 2000, Gordon et al., 2001) καθώς και στο περιβάλλον πραγµατοποίησής της (π.χ. αιθανόλη, µεθανόλη, οξικός αιθυλεστέρας) (Blois, 1958, Brand-Williams et al., 1995, Espin et al., 2000). Σε κάθε περίπτωση οι ερευνητές ακολουθούν τη µεθοδολογία που έχουν επιλέξει και στη συνέχεια αναλύουν τα αποτελέσµατα της δραστικότητας σε σχέση µε τα δοµικά χαρακτηριστικά των εκάστοτε ΑΗ, χωρίς να λαµβάνεται υπόψη η πιθανή επίδραση των αναλυτικών συνθηκών. Αναφορές στο ρόλο ορισµένων από τις συνθήκες της αντίδρασης και την πιθανή συµβολή τους στην τελική εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης εµφανίζονται µόνο περιστασιακά (Bondet et al., 1997, Abe et al., 2000). Επίσης διαφορές εντοπίζονται και στον τρόπο έκφρασης των αποτελεσµάτων. Οι πιο συνηθισµένες είναι η % ικανότητα δέσµευσης της ελεύθερης ρίζας (% Radical Scavenging Activity, %RSA), (π.χ. Pekkarinen et al., 1999) και η αποτελεσµατική συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού που είναι αναγκαία για την ελάττωση της αρχικής συγκέντρωσης της ρίζας στο µισό (Εfficient oncentration, E 50 ) (π.χ. Brand-Williams et al., 1995). Η σηµασία της έκφρασης των αποτελεσµάτων στη διατύπωση SAR δε φαίνεται να έχει µελετηθεί επαρκώς (Bondet et al., 1997, Sanchez-Moreno et al., 1998). Η δοκιµή µε την DPP όπως αναφέρθηκε στην αρχή της ενότητας χρησιµοποιείται συχνά για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µε σκοπό κυρίως την κατάταξη των ΑΗ µε σειρά δραστικότητας. Οι ενώσεις που επιλέγονται να µελετηθούν ανήκουν συνήθως σε διαφορετικές οµάδες µε αποτέλεσµα συχνά να διαφέρουν σηµαντικά στη δοµή (π.χ. ασκορβικό οξύ, α-τοκοφερόλη, ΒΗΤ, καφεϊκό οξύ κ.α) (Brand-Williams et al., 1995). Βέβαια σε κάθε περίπτωση η ανάλυση των αποτελεσµάτων αναφέρεται στα δοµικά χαρακτηριστικά, αλλά δε γίνεται µε τρόπο συστηµατικό. Οι εργασίες στις οποίες έχει χρησιµοποιηθεί η δοκιµή για την εκτίµηση της συνεισφοράς συγκεκριµένων δοµικών χαρακτηριστικών και την αναζήτηση SAR είναι µάλλον περιορισµένες (Silva et al., 2000, Son and Lewis, 2002). Οι Silva et al. (2000) µελετώντας την επίδραση της εστεροποίησης του καρβοξυλίου σε παράγωγα του καφεϊκού και του διυδροκαφεϊκού οξέος κατέληξαν σε αντικρουόµενα αποτελέσµατα 15

για το ρόλο της στην αντιοξειδωτική συµπεριφορά. Οι Son and Lewis (2002) µελετώντας σειρά από συνθετικά αµίδια και εστέρες του καφεϊκού οξέος διαπίστωσαν ότι η αντιοξειδωτική ικανότητα των ΑΗ ήταν σύµφωνη µε τον αριθµό των υδροξυοµάδων στην ένωση και ότι ενισχυόταν από την παρουσία και άλλων οµάδων που απέδιδαν άτοµα υδρογόνου στις ελεύθερες ρίζες (-ΝΗ, -S). 1.3.2.2 Μέθοδος δέσµευσης της κατιοντικής ρίζας του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ABTS + ) Πρόκειται για µια µέθοδο σχετικά πρόσφατη (Miller et al., 1993) στην οποία χρησιµοποιείται η κατιοντική ρίζα του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3- αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος), [2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid) diammonium salt], γνωστή και ως ABTS + (Σχήµα 1.7). - 3 S S S S 3 - N N N + N 4 + N 4 + N 2 5 2 5 Σχήµα 1.7 Κατιοντική ρίζα του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3- αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ABTS + ) Αν και πρόσφατη σχετικά, η δοκιµή έτυχε της προτίµησης των ερευνητών για το βασικό λόγο ότι µπορεί να εφαρµοστεί τόσο στην εκτίµηση της δραστικότητας υδρόφιλων όσο και λιπόφιλων αντιοξειδωτικών (Re et al., 1999). Η αντίδραση ολοκληρώνεται σε εξαιρετικά σύντοµο χρονικό διάστηµα µε παρακολούθηση της µεταβολής της απορρόφησης του διαλύµατος της ρίζας στα 734 nm. Η ABTS + είναι σταθερή σε θερµοκρασία δωµατίου, αλλά ασταθής άνω των 35 ο, όπως και σε τιµές p µεγαλύτερες από 7,5 (ano et al., 1998). διαλυτότητα και η σταθερότητά της, µε εξαίρεση την αιθανόλη, είναι περιορισµένη σε οργανικούς διαλύτες όπως π.χ. η ακετόνη (ano et al., 2000). Η µέθοδος µε τη συγκεκριµένη ρίζα χρησιµοποιείται κατεξοχήν για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µιγµάτων φαινολών που βρίσκονται σε 16

φυτικά εκχυλίσµατα, τρόφιµα (Lissi et al., 1999, Van den Berg et al., 1999, Tyrakowska, et al., 1999, Farombi et al., 2000, Arnao et al., 2001) αλλά και βιολογικά υγρά (Kirschbaum, 2001). Ωστόσο τα τελευταία χρόνια φαίνεται να χρησιµοποιείται και για τη µελέτη της δραστικότητας ΑΗ (Rice-Evans et al., 1996, Re et al., 1999, Van den Berg et al., 2000, Pannala et al., 2001). Το αναλυτικό πρωτόκολλο της δοκιµής µε την ABTS + ως πρώτο στάδιο περιλαµβάνει το σχηµατισµό της κατιοντικής ρίζας µε χηµική ή ενζυµική οξείδωση του ΑΒΤS. Η πρωτότυπη µεθοδολογία (Miller et al., 1993) περιελάµβανε τη χρήση ενζυµικού συστήµατος (µεθαιµοσφαιρίνη-η 2 Ο 2 ) για την παραγωγή της κατιοντικής ρίζας. Ωστόσο διαπιστώθηκαν λανθασµένες εκτιµήσεις σχετικά µε την ικανότητα των A να δεσµεύουν την ABTS +, καθώς η παραγωγή της γίνεται παρουσία του ΑΗ. Η λανθασµένη εκτίµηση αποδόθηκε στην αλληλεπίδραση ορισµένων φαινολικών ενώσεων, κυρίως φλαβονοειδών, µε το ενζυµικό σύστηµα και την παρεµπόδιση του σχηµατισµού της ABTS + (Strube et al., 1997, Frankel and Meyer, 2000). Με τον τρόπο αυτό εποµένως δε γίνονταν αποκλειστικά η εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της ελεύθερης ρίζας και τα αποτελέσµατα δεν ήταν αξιόπιστα. Στις τροποποιήσεις της αναλυτικής πορείας που ακολουθήθηκε δοκιµάστηκαν διάφορες οξειδωτικές ενώσεις. Οι Miller et al. (1996) χρησιµοποίησαν το Mn 2 που τελικά αντικαταστάθηκε από το υπερθειικό κάλιο (Re et al., 1999) καθώς το πρώτο µπορεί να οδηγήσει στο σχηµατισµό δις-κατιοντικής ρίζας (Σχήµα 1.8). - 3S S - S 3 S K 2 S 2 8 N N N N + + N N 4 4 2 5 2 5 K 2 S 2 8-3S S S S 3 - N N N + N + + N N 4 4 2 5 2 5 Σχήµα 1.8 Οξείδωση του δις-αµµωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3- αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ΑΒΤS) προς ΑΒΤS + 17

Με το τελευταίο πρωτόκολλο παραγωγής της ρίζας επιτυγχάνεται ο απευθείας σχηµατισµός της ABTS + χωρίς τον ενδιάµεσο σχηµατισµό άλλης ρίζας και η παραγωγή της έχει ολοκληρωθεί πριν την προσθήκη του αντιοξειδωτικού. Οι δύο αυτές τροποποιήσεις αποτελούν σηµαντικά πλεονεκτήµατα έναντι της πρωτότυπης µεθόδου καθώς έτσι εκτιµάται αποκλειστικά η ικανότητα των αντιοξειδωτικών να δεσµεύουν την ελεύθερη ρίζα. Μειονέκτηµα της µεθοδολογίας των Re et al. (1999) φαίνεται ότι αποτελεί η µεγάλη διάρκεια που απαιτείται για τη σταθεροποίηση του µητρικού διαλύµατος της ρίζας (~16h). Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε τιµές TEA (Trolox Equivalent Antioxidant apacity), δηλαδή, τη συγκέντρωση σε mm του Trolox (6-υδροξυ-2,5,7,8-τετραµεθυλοχρωµαν-2-ικό οξύ) που έχει δράση ανάλογη µε εκείνη ενός διαλύµατος αντιοξειδωτικού συγκέντρωσης 1 mm. Τα δεδοµένα που υπάρχουν στη βιβλιογραφία έχουν προκύψει από την εφαρµογή της δοκιµής σε υδατικό περιβάλλον και µάλιστα σε τιµή p 7,4. Ωστόσο η συγκεκριµένη δοκιµή είναι δυνατή και σε αλκοολικό περιβάλλον (Re et al., 1999). Συγκριτική µελέτη των αποτελεσµάτων για τις δύο δοκιµές που έγινε από τους παραπάνω ερευνητές επικεντρώθηκε κυρίως στις διαφορές που εντοπίζονται στη µέθοδο παραγωγής της ρίζας και όχι σε άλλες αναλυτικές παραµέτρους. Η συγκεκριµένη δοκιµή έχει εφαρµοστεί για µελέτες SAR κυρίως για την κατηγορία των φλαβονοειδών, που είναι και η πολυπληθέστερη οµάδα ΑΗ στη φύση και σε µικρότερο βαθµό για άλλες ΑΗ (Rice-Evans et al., 1996, Lien et al., 1999). Τα αποτελέσµατα ήταν σε γενικές γραµµές σύµφωνα µε τον αριθµό των υδροξυ- οµάδων στην ΑΗ. Σε ορισµένες περιπτώσεις παρατηρήθηκαν αποκλίσεις, χωρίς ωστόσο να δίνεται ιδιαίτερη έµφαση στην ερµηνεία τους. 1.3.3 Υπολογιστικές µέθοδοι εκτίµησης της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών Κατά τη διερεύνηση της σύστασης φυσικών προϊόντων µε σκοπό την αναζήτηση νέων αντιοξειδωτικών ταυτοποποιείται καθηµερινά µεγάλος αριθµός ενώσεων. Η αποµόνωσή τους σε ποσότητες που να καλύπτουν τις πειραµατικές ανάγκες για την εκτίµηση της δραστικότητας αποτελεί όµως επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία που ορισµένες φορές δεν ολοκληρώνεται λόγω του ευοξείδωτου χαρακτήρα των δοµών τους. Έτσι τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αυξηµένο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη και 18

εφαρµογή υπολογιστικών προσεγγίσεων κατάλληλων µοριακών δεικτών µιας γνωστής ένωσης που θα µπορούσαν να προβλέψουν τη δραστικότητά της σε περιπτώσεις που η πειραµατική µελέτη είναι δύσκολη ή ακόµα και αδύνατη (Tomiyama et al., 1993, Van Acker et al., 1996, Wright et al., 1997, Zhang, 1998, 1999 a, b). Μέχρι σήµερα, η υπολογιστική εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης έχει επικεντρωθεί στον υπολογισµό µοριακών δεικτών που µπορούν να χαρακτηρίσουν την ικανότητα των βιοφαινολών να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες (Van Acker et al., 1996, Wright et al., 1997, Zhang, 1998, Lien et al., 1999, Zhang, 1999 a, b, 2000, Bakalbassis et al., 2001, Wright et al., 2001). Καθώς η ικανότητα αυτή σχετίζεται µε την ισχύ του δεσµού Ο-Η στο φαινολικό υδροξύλιο (όσο πιο ασθενής ο δεσµός τόσο πιο ισχυρό το αντιοξειδωτικό), ή µε την τάση απόδοσης µονήρων ηλεκτρονίων, ο υπολογισµός τιµών που τις χαρακτηρίζουν µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την πρόβλεψη της δραστικότητας των ΑΗ. Μέχρι σήµερα έχει διερευνηθεί η σηµασία της τιµής του µήκους και της τάξης του δεσµού µεταξύ υδρογόνου και οξυγόνου στο φαινολικό υδροξύλιο, η τιµή στη διαφορά της ενθαλπίας σχηµατισµού της ελεύθερης ρίζας (Difference in eat of Formation, F) που συναντάται και ως ενθαλπία διάσπασης δεσµού (Bond Dissociation Enthalpy, BDE) του φαινολικού υδροξυλίου, η ιδιοτιµή του υψηλότερου κατεχόµενου µοριακού τροχιακού (ighest ccupied Molecular rbital, ΗΟΜΟ) και του δυναµικού ιοντισµού (Ionization Potential, ΙΡ) (Tomiyama et al., 1993, Van Acker et al., 1996, Yamamura et al., 1997, Wright et al., 1997, Zhang 1998, Lien et al., 1999, Bakalbassis et al., 2001, Wright et al., 2001). Στις υπολογιστικές προσεγγίσεις απαραίτητη προϋπόθεση αποτελεί η πειραµατική επαλήθευση των αποτελεσµάτων για την αξιολόγηση της σηµασίας του υπολογισµού των συγκεκριµένων ιδιοτήτων στην εκτίµηση της δραστικότητας. Σύµφωνα πάντα µε τα πειραµατικά αποτελέσµατα φαίνεται ότι η τιµή της BDE του φαινολικού υδροξυλίου είναι ο καταλληλότερος µοριακός δείκτης που µε τον υπολογισµό της εκφράζει την ικανότητα των αντιοξειδωτικών να αποδίδουν άτοµα υδρογόνου στις ελεύθερες ρίζες. Έτσι κάθε υπολογιστική προσέγγιση περιλαµβάνει οπωσδήποτε τον υπολογισµό της τιµής BDE. Σε µικρότερο βαθµό χρησιµοποιείται η ιδιοτιµή του ΗΟΜΟ (Migliavacca et al., 1997, Zhang, 1999 a) και η τιµή ΙΡ (Soffers et al., 1999, Wright et al., 2001) ως µέτρο της ικανότητας απόδοσης µονήρους ηλεκτρονίου. 19

Βάση των υπολογιστικών µεθόδων αποτελεί ο υπολογισµός της ενέργειας της υπό µελέτη ένωσης που προκύπτει από την επίλυση της ανεξάρτητης του χρόνου εξίσωσης του Schrödinger: ΗΨ=ΕΨ Το όλο σύστηµα περιγράφεται από την κυµατοσυνάρτηση Ψ που αποτελεί συνάρτηση των συντεταγµένων όλων των ηλεκτρονίων και των πυρήνων του συστήµατος. Ο τελεστής Η (Χαµιλτώνειος τελεστής) είναι ένας ενεργειακός τελεστής, που περιλαµβάνει την κινητική ενέργεια των ηλεκτρονίων, την κινητική ενέργεια των πυρήνων και τις δυναµικές ενέργειες, ελκτικές και απωστικές µεταξύ των ηλεκτρονίων και των πυρήνων του συστήµατος. Όταν ο τελεστής Η εφαρµοστεί στην κυµατοσυνάρτηση Ψ δίνει ως αποτέλεσµα το γινόµενο της ενέργειας του συστήµατος Ε, µε την κυµατοσυνάρτηση Ψ. Η συγκεκριµένη εξίσωση µπορεί να λυθεί επακριβώς µόνο για µονοηλεκτρονιακά συστήµατα (π.χ. Η, Ηe +, Η + 2 ) καθώς είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη για να επιλυθεί αναλυτικά. Για να γίνει αυτό εφικτό και ιδιαίτερα για τις µοριακές ενώσεις έχουν γίνει διάφορες προσεγγίσεις (Τσίπης, 1996, Τσίπης κ.α., 1997). Οι κυριότερες είναι: Η προσέγγιση Born-ppenheimer: Σύµφωνα µε τους Born-ppenheimer εξαιτίας της µεγάλης διαφοράς στη µάζα µεταξύ ηλεκτρονίων και πρωτονίων τα τελευταία κινούνται πολύ αργά, εποµένως µπορούν να θεωρηθούν σταθερά στο χώρο και η εξίσωση Schrödinger να επιλυθεί µόνο για τα ηλεκτρόνια. Έτσι η µορφή της εξίσωσης Schrödinger γίνεται απλούστερη. Η προσέγγιση της θεωρίας των Μοριακών Τροχιακών (Molecular orbital, ΜΟ): Στη συγκεκριµένη περίπτωση η κυµατοσυνάρτηση Ψ µπορεί να εκφραστεί ως συνάρτηση των µοριακών τροχιακών που είναι κατειληµµένα από τα ηλεκτρόνια για µια δεδοµένη ενεργειακή κατάσταση. Τα µοριακά τροχιακά στη συνέχεια θεωρείται ότι µπορούν να εκφραστούν ως γραµµικός συνδυασµός των επιµέρους ατοµικών τροχιακών (Linear ombination of Atomic rbitals, LA). Το σύνολο των κυµατοσυναρτήσεων των ατοµικών τροχιακών που χρησιµοποιούνται για την περιγραφή των µοριακών τροχιακών αποτελεί το λεγόµενο σύνολο βάσης. Με βάση τις παραπάνω προσεγγίσεις η επίλυση της εξίσωσης Schrödinger είναι δυνατή και γίνεται µε τη µέθοδο των διαδοχικών επαναλήψεων που ονοµάζεται και µέθοδος αυτοσυνεπούς πεδίου (Self onsistent Field, SF). Η µέθοδος προτάθηκε από το artree και συµπληρώθηκε από τον Fock µε την εισαγωγή της αρχής της 20

αντισυµµετρίας (Θεωρία artree-fock, F). Έτσι αρχικά γίνεται µια τυχαία επιλογή των ΜΟ, βάσει των οποίων θα υπολογιστούν νέα ΜΟ που στη συνέχεια θα αποτελέσουν εκ νέου τη βάση για την επανάληψη του υπολογισµού. Η διαδικασία επαναλαµβάνεται µέχρι τα ΜΟ που υπολογίζονται να µη διαφέρουν από εκείνα που χρησιµοποιήθηκαν στην αρχή του υπολογιστικού κύκλου. Το γεγονός αυτό συµβαίνει όταν η ενέργεια του συστήµατος µεταξύ δύο διαδοχικών κύκλων δεν αλλάζει ουσιαστικά, σύµφωνα πάντα µε ένα όριο που έχει τεθεί εξ αρχής. Αν και οι υπολογισµοί F µπορούν να δώσουν ικανοποιητικά αποτελέσµατα έχουν αναπτυχθεί διάφορες προσεγγίσεις για τη συντόµευση της υπολογιστικής διαδικασίας (ηµιεµπειρικές µέθοδοι) ή την αύξηση της ακρίβειας των παραγόµενων αποτελεσµάτων (π.χ. υπολογισµοί τύπου Full I, onfiguration Interaction), µε τους οποίους µπορεί να προσεγγισθεί η κυµατοσυνάρτηση µε ακρίβεια. Ab initio υπολογισµοί: Αποτελούν ακριβείς, αλλά και πολύπλοκους υπολογισµούς αφού στο πλαίσιο προσεγγίσεων όλα τα ολοκληρώµατα υπολογίζονται µε µια ακρίβεια µεγαλύτερη από 7-8 δεκαδικά ψηφία. Στην υπολογιστική διαδικασία συµπεριλαµβάνονται όλα τα ηλεκτρόνια της ένωσης, δηλαδή τόσο αυτά που ανήκουν στις στιβάδες σθένους όσο και αυτά που ανήκουν στις εσωτερικές στιβάδες των ατόµων που αποτελούν την ένωση. DFT υπολογισµοί: Στους υπολογισµούς του τύπου ab initio περιλαµβάνονται όλα τα ηλεκτρόνια της ένωσης αλλά δε λαµβάνονται υπόψη οι µεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές λαµβάνονται υπόψη µε την εφαρµογή της λεγόµενης θεωρίας συναρτησιακού παράγοντα πυκνότητας (Density Functional Theory). Σύµφωνα µε αυτή, η ενέργεια και όλες οι άλλες ηλεκτρονιακές ιδιότητες της βασικής κατάστασης µιας ένωσης καθορίζονται κατά τρόπο µοναδικό από την ηλεκτρονική πυκνότητα πιθανότητας ρ (r). Έτσι η ενέργεια µιας ένωσης αποτελεί συναρτησιακό παράγοντα του ρ. Ακόµα και στην περίπτωση των DFT υπολογισµών προτάθηκαν προσεγγίσεις που η καταλληλότητά τους ελέγχθηκε µε βάση την ακρίβεια των τιµών µοριακών ιδιοτήτων µε πειραµατικά δεδοµένα. Χαρακτηριστική είναι η προσέγγιση τοπικής πυκνότητας (Local Density Approximation, LDA) και η προσέγγιση τοπικής πυκνότητας spin (Local Spin Density Approximation, LSDA). Ηµιεµπειρικοί υπολογισµοί: Οι υπολογισµοί του τύπου ab initio ή DFT περιλαµβάνουν την επίλυση πολλών ολοκληρωµάτων για τον υπολογισµό της ενέργειας, µε αποτέλεσµα η υπολογιστική διαδικασία να είναι µεγάλη σε διάρκεια. Στους 21

ηµιεµπειρικούς υπολογισµούς χρησιµοποιούνται διάφορες προσεγγίσεις κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτυγχάνεται η µεγαλύτερη δυνατή απλοποίηση της υπολογιστικής διαδικασίας. Συγκεκριµένα, πολλά στοιχεία της µήτρας τους αγνοούνται ή προσεγγίζονται µε απλοποιηµένες εκφράσεις και συναρτήσεις που αντικαθίστανται από εµπειρικές παραµέτρους µε αποτέλεσµα τον περιορισµό του αριθµού των ολοκληρωµάτων που πρέπει τελικά να επιλυθούν. Επιπλέον, σε αυτούς τους υπολογισµούς λαµβάνονται υπόψη µόνο τα ηλεκτρόνια των στιβάδων σθένους των ατόµων που αποτελούν την ένωση ή για µια συγκεκριµένη τάξη ενώσεων τα π- ηλεκτρόνια της στιβάδας σθένους (Τσίπης κ.α., 1997). Με τον τρόπο αυτό το χρονικό διάστηµα που απαιτείται για την εκτέλεση ενός υπολογισµού συντοµεύεται. Οι ηµιεµπειρικές µέθοδοι (π.χ. Modified Neglect of Differential verlap, MND, Dewar and Thiel, 1977, Parametric Model 3, PM 3, Stewart, 1989, Austin Model 1, AM1, Dewar et al., 1985) χρησιµοποιούνται σήµερα ευρύτατα και από πειραµατικούς χηµικούς, ως εργαλείο ρουτίνας (Τσίπης, 1996). Οι ηµιεµπειρικοί υπολογισµοί εφαρµόζονται για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης (Yamamura et al., 1997, Zhang, 1998) ακόµα και σε συνδυασµό µε υπολογισµούς του τύπου DFT (Wright et al., 1997, 2001). Στην τελευταία περίπτωση, οι ηµιεµπειρικές µέθοδοι χρησιµοποιούνται για τη βελτιστοποίηση της γεωµετρίας της υπό µελέτη ένωσης και ακολουθούνται από έναν ενεργειακό υπολογισµό µοναδικού σηµείου (single point energy calculation) στο επίπεδο DFT µε βάση τη γεωµετρία που υπολογίστηκε στο ηµιεµπειρικό επίπεδο. Με τον τρόπο αυτό συντοµεύεται ο συνολικός χρόνος της υπολογιστικής διαδικασίας χωρίς να χάνεται σηµαντικά η ακρίβεια στον υπολογισµό της δοµής (Wright et al., 1997, 2001, Sun et al., 2002). 1.3.4 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των βιοφαινολών µε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης σε µοντέλα λιπαρών υποστρωµάτων Οι πειραµατικές µέθοδοι που περιγράφηκαν στην ενότητα 1.3.2 είναι πολύ σηµαντικές για την εκτίµηση σχέσεων δοµής-δραστικότητας καθώς και για τη διερεύνηση του µηχανισµού αντιοξειδωτικής ικανότητας των βιοφαινολών. Όµως οι συγκεκριµένες δοκιµές δεν περιλαµβάνουν την οξείδωση κάποιου λιπαρού υποστρώµατος. εδοµένου ότι τόσο τα τρόφιµα όσο και τα βιολογικά συστήµατα περιέχουν λιπίδια, η οξείδωση των οποίων είναι υπεύθυνη για τις ανεπιθύµητες 22

συνέπειες που αναφέρθηκαν στην ενότητα 1.1, η µελέτη της δραστικότητας των ΑΗ σε µοντέλα που τα προσοµοιάζουν είναι αναγκαία. Η µελέτη αυτή γίνεται µε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης. Τα αποτελέσµατα των δοκιµών αυτών, εκτός από τη διατύπωση SAR, έχουν και πρακτικό ενδιαφέρον για τη χρησιµότητα των βιοφαινολών στη βιοµηχανία τροφίµων και τη φαρµακευτική. 1.3.4.1 οκιµές σε έλαια Η αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των ΑΗ γίνεται κυρίως µε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης ελαίων. Η µελέτη της δραστικότητας πολλών ΑΗ σε έλαια οδήγησε σε σηµαντικό αριθµό δεδοµένων που επέτρεψαν τη διατύπωση SAR καθώς και διαφόρων υποθέσεων όπως το πολικό παράδοξο (Porter, 1980). Σύµφωνα µε την υπόθεση αυτή, πολικές ΑΗ (υδρόφιλες ΑΗ) είναι πιο αποτελεσµατικές σε µη πολικά λιπαρά υποστρώµατα, ενώ µη πολικές ΑΗ (λιπόφιλες) είναι αποτελεσµατικότερες σε πολικά. Στην περίπτωση των λιπών και των ελαίων, οι πολικές ΑΗ προσανατολίζονται στη διεπιφάνεια ελαίου-αέρα όπου το οξυγόνο υπάρχει σε σταθερή συγκέντρωση και σχηµατίζει υδροϋπεροξείδια µε το λιπαρό υπόστρωµα. Αντίθετα, οι λιγότερο πολικές ΑΗ διαλυτοποιούνται στη λιπαρή φάση όπου η συγκέντρωση του οξυγόνου ελαττώνεται σταδιακά κατά την πορεία της οξείδωσης και εποµένως είναι λιγότερο αποτελεσµατικές. Για το λόγο αυτό η προστασία των λιπών και των ελαίων από την οξείδωση επιτυγχάνεται ευκολότερα µε πολικές ΑΗ καθώς τα επίπεδα που πρέπει να χρησιµοποιηθούν είναι χαµηλότερα. Ωστόσo υπάρχουν και ενώσεις που η δράση τους δεν ερµηνεύεται µε βάση την παραπάνω υπόθεση. Εποµένως, τίθεται το ερώτηµα κατά πόσο οι συγκεκριµένες ενώσεις, όπως για παράδειγµα η ισοευγενόλη, αποκλίνουν από την υπόθεση του πολικού παράδοξου ή η ίδια η υπόθεση δεν είναι επαρκής για την ερµηνεία της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Μέτρο της πολικότητας των ΑΗ αποτελούν οι τιµές R f (Relative front) που εκτιµώνται για τις ΑΗ µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TL) (Porter et al., 1989) και οι τιµές του δεκαδικού λογάριθµου του συντελεστή κατανοµής (Log P) σε µίγµα κ- οκτανόλης-νερού (1:1, v/v) (Foti et al., 1996). Η εκτίµηση της αποτελεσµατικότητας µιας ΑΗ περιλαµβάνει την προσθήκη της σε λιπαρό υπόστρωµα (π.χ. λιπαρό οξύ, µεθυλεστέρας λιπαρού οξέος, µίγµατα τριακυλογλυκερολών) απαλλαγµένο από προοξειδωτικούς ή αντιοξειδωτικούς παράγοντες και στη συνέχεια παρακολούθηση της πορείας της οξείδωσης µε κάποια 23

δοκιµή σταθερότητας (µέθοδος πυριατηρίου 40-60 ο, µέθοδος ενεργού οξυγόνου, AM 100 ο και διαβίβαση ρεύµατος αέρα, µέθοδος Rancimat θ 100 ο και διαβίβαση ρεύµατος αέρα). Κατά την προσθήκη της ΑΗ οι µεταβολές στο υπόστρωµα είναι αργές και το έλαιο αντιστέκεται στην οξείδωση καθώς η ΑΗ δεσµεύει τις ελεύθερες ρίζες. Η αντίσταση υποχωρεί όταν καταναλωθεί η ποσότητα της ΑΗ οπότε η οξείδωση επιταχύνεται. Η περίοδος αντίστασης του υποστρώµατος στην οξείδωση χαρακτηρίζεται ως περίοδος επαγωγής (induction period, Ι.Ρ.). Με την προσθήκη ΑΗ σε ένα υπόστρωµα η περίοδος επαγωγής αυξάνεται. Η αποτελεσµατικότητα µιας ΑΗ εκφράζεται συνήθως µε τον παράγοντα προστασίας (Protection Factor, PF) που δίνεται από την σχέση PF=ΙΡ ΑΗ /ΙΡ µαρτυρα (Pokorny, 1987). Ως µάρτυρας χρησιµοποιείται το λιπαρό υπόστρωµα απουσία ΑΗ. Η πορεία της αυτοξείδωσης του υποστρώµατος γίνεται µε προσδιορισµό των πρωτογενών ή/και δευτερογενών προϊόντων της οξείδωσης. Τα πρωτογενή προσδιορίζονται µε: α) ιωδιοµετρικό προσδιορισµό του αριθµού υπεροξειδίων, Α.Υ. (IUPA, 1987, method 2.501) και β) µέτρηση της απορρόφησης στα 232 nm (συζυγή διένια) (IUPA 1987, method 2.505). Τα δευτερογενή προϊόντα της οξείδωσης προσδιορίζονται µε: α) µέτρηση της απορρόφησης στα 268 nm (καρβονυλικές ενώσεις) (IUPA 1987, method 2.505), β) προσδιορισµό του αριθµού ανισιδίνης (α, β- ακόρεστες αλδεΰδες) (IUPA 1987, method 2.504), γ) προσδιορισµό προϊόντων οξείδωσης πολυακόρεστων οξέων (π.χ. µηλονική διαλδεΰδη) µε τη δοκιµή θειοβαρβιτουρικού οξέος (St. Angelo, 1996), δ) προσδιορισµό ορισµένων πτητικών δευτερογενών προϊόντων της οξείδωσης µε αέρια χρωµατογραφία (Frankel, 1998). Η αποτελεσµατικότητα των ΑΗ εκτός από την παρακολούθηση των µεταβολών του υποστρώµατος µε τις παραπάνω µεθόδους, είναι δυνατή σε ορισµένες περιπτώσεις και µε παρακολούθηση της τύχης των ίδιων των αντιοξειδωτικών κατά την πορεία της αυτοξείδωσης (π.χ. Ψωµιάδου, 2000). 1.3.4.2 οκιµές σε συστήµατα διασποράς Το γεγονός ότι στην πλειονότητά τους τα τρόφιµα, αλλά και τα βιολογικά συστήµατα εµπεριέχουν πολλά συστατικά σε διασπορά κάνει επιτακτική την ανάγκη µελέτης της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΗ σε µοντέλα που προσοµοιάζουν τα συστήµατα αυτά. Τέτοια µοντέλα αποτελούν τα γαλακτώµατα και τα λιποσώµατα. Στην περίπτωση των παραπάνω συστηµάτων η οξείδωση λαµβάνει χώρα στη διεπιφάνεια λιπαρής ύλης-νερού. Μελέτες της αντιοξειδωτικής δράσης στα 24

συγκεκριµένα συστήµατα έχουν οδηγήσει στο συµπέρασµα ότι αποτελεσµατική είναι η ΑΗ που µπορεί και εντοπίζεται στη λιπαρή ύλη ή στην παραπάνω διεπιφάνεια. Αυτό είναι δυνατό για τις λιπόφιλες ενώσεις, λόγω της µικρότερης πολικότητάς τους. Αντίθετα οι υδρόφιλες ΑΗ ως πιο πολικές εντοπίζονται κυρίως στην υδατική φάση, αρκετά µακριά δηλαδή από την περιοχή που λαµβάνει χώρα η οξείδωση (Frankel, 1998). Tα συστήµατα διασποράς που χρησιµοποιούνται στις διάφορες µελέτες αντιοξειδωτικής δράσης διακρίνονται συνήθως στις ακόλουθες γενικές κατηγορίες: Γαλακτώµατα ελαίου σε νερό (o/w). Αποτελούνται από σταγονίδια ελαίου διασκορπισµένα σε νερό. Για τη σταθεροποίησή τους χρησιµοποιούνται γαλακτωµατοποιητές (επιφανειοδραστικές ενώσεις) που παρουσιάζουν µεγαλύτερη διαλυτότητα στην υδατική φάση. Συνήθως, προτιµούνται µη ιονικοί γαλακτωµατοποιητές (π.χ. Tweens) (Belitz and Grosch, 1999). Γαλακτώµατα νερού σε έλαιο (w/o). Αποτελούνται από σταγονίδια νερού διασκορπισµένα σε έλαιο. Για τη σταθεροποίησή τους χρησιµοποιούνται γαλακτωµατοποιητές που παρουσιάζουν µεγαλύτερη διαλυτότητα στη λιπαρή φάση (π.χ. Spans). (Belitz and Grosch, 1999). Mικήλλια: Αποτελούνται από λιπαρά οξέα τα οποία όταν διασπείρονται στο νερό σχηµατίζουν συσσωµατώµατα (Σχήµα 1.9). Σε αυτά το πολικό τµήµα των οξέων βρίσκεται στην υδατική φάση ενώ το µη πολικό στη λιπαρή φάση. Τα µικήλλια των λιπαρών οξέων είναι δυνατόν να φέρουν φορτίο όταν για παράδειγµα σχηµατιστούν παρουσία SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ή να είναι ηλεκτρικά ουδέτερα όταν σχηµατίζονται, για παράδειγµα, παρουσία Tweens (Frankel, 1998). Σχήµα 1.9 Τυπική δοµή µικηλλίου 25

Λιποσώµατα: Τα λιποσώµατα αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια που είναι τα κύρια συστατικά των βιολογικών µεµβρανών. Η λεκιθίνη είναι ένα µίγµα εστέρων του φωσφατιδικού οξέος κυρίως µε την αζωτούχο βάση χολίνη (φωσφατιδυλοχολίνη) (Σχήµα 1.10 Α και Β), αλλά και την αιθανολαµίνη ή την ινοσιτόλη. Όπως φαίνεται από την τρισδιάστατη απεικόνισή της οι δύο αλυσίδες λιπαρών οξέων είναι σχεδόν παράλληλες, ενώ η οµάδα της φωσφατιδυλοχολίνης είναι προσανατολισµένη προς την αντίθετη κατεύθυνση. Εποµένως, όταν είναι σε διασπορά έχουν την τάση να σχηµατίζουν διαδοχικές διπλοστιβάδες (Σχήµα, 1.11). Με τον τρόπο αυτό τα συγκεκριµένα µοντέλα θεωρούνται ότι προσοµοιάζουν τις κυτταρικές µεµβράνες. Η µελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης σε λιποσώµατα δίνει επαγωγικά πληροφορίες για την πρόβλεψη της συµπεριφοράς τους in vivo (Frankel, 1998). R R P N( 3 ) 3 Α - Σχήµα 1.10 Α) δοµή και Β) τρισδιάστατη απεικόνιση φωσφατιδυλοχολίνης Β ιπλοστιβάδα ιπλοστοιβάδα Λιποσωµάτων λιποσωµάτων σε σε νερό Υδρόφιλο τµήµα Υδρόφοβο τµήµα Σχήµα 1.11 Τυπική µορφή διπλοστιβάδας λιποσώµατος που αποτελείται από µόρια φωσφολιπιδίων 26

Η παρακολούθηση της πορείας της οξείδωσης γίνεται µε ανάλογο τρόπο, όπως στην περίπτωση των ελαίων-µοντέλων. Οπωσδήποτε όµως οι τρόποι προσδιορισµού πρωτογενών και δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης προσαρµόζονται στα νέα πειραµατικά δεδοµένα. Για παράδειγµα αναφέρεται η µέθοδος του θειοκυανικού σιδήρου για προσδιορισµό των υδροϋπεροξειδίων σε γαλακτώµατα (Μei et al., 1999), των συζυγών διενίων και της εξανάλης (uang et al., 1996). Σε άλλες περιπτώσεις µέρος του ελαίου εκχυλίζεται και ακολουθεί πραγµατοποίηση των προσδιορισµών που περιγράφηκαν στην ενότητα 1.3.4.1. Αξίζει να σηµειωθεί ότι σε συστήµατα όπως τα λιποσώµατα, το µέγεθος των ΑΗ παίζει σηµαντικό ρόλο στη διατύπωση SAR. Έτσι, ενώσεις µε µεγάλο µέγεθος, όπως για παράδειγµα η α-τοκοφερόλη, δεν µπορούν πιθανότατα να διαπεράσουν τις διπλοστιβάδες µε αποτέλεσµα η δραστικότητά τους να περιορίζεται (Niki et al., 1985, Nenadis et al., 2003 a). Λόγω του πρωτοκόλλου που εφαρµόζεται, ως εκκινητές της οξείδωσης χρησιµοποιούνται συνήθως ιόντα µεταβατικών µετάλλων. Τα ιόντα αυτά επιταχύνουν τη διαδικασία της οξείδωσης, καθώς µπορεί να διασπάσουν τα υπάρχοντα υδροϋπεροξείδια προς ελεύθερες ρίζες (R. 15 και R. 16). Μ n+ + R Μ (n+1)+ +R + Ο (15) Μ (n+1)+ + R Μ n+ +R + + (16) Στην περίπτωση που στο σύστηµα υπάρχει κάποια φαινολική ένωση είναι πιθανό να αλληλεπιδράσει οξειδοαναγωγικά µε τα ιόντα αυτά (Mei et al., 1999). Η αναγωγική ικανότητα των ΑΗ µπορεί να προκαλέσει αύξηση του προοξειδωτικού χαρακτήρα των ιόντων καθώς τα τελευταία στη χαµηλότερη βαθµίδα σθένους παρουσιάζονται ως ισχυρότεροι προοξειδωτικοί παράγοντες (Prior and ao, 1999). Με τον τρόπο αυτό οι ΑΗ µπορεί να δράσουν προοξειδωτικά. Ωστόσο οι ΑΗ που διαθέτουν για παράδειγµα κατεχολική οµάδα και εφόσον το επιτρέπουν οι συνθήκες, είναι δυνατό να δράσουν ως δευτεροταγή αντιοξειδωτικά, ακόµα και όταν λόγω πολικότητας, αναµένεται να βρίσκονται στην υδατική φάση. Αυτό επιτυγχάνεται µε τη δέσµευση των µετάλλων µε σχηµατισµό χηλικού συµπλόκου, που έχει ως αποτέλεσµα την παρεµπόδιση της προοξειδωτικής δράσης των µετάλλων. Στο συµπέρασµα αυτό έχει οδηγήσει η 27

παρατήρηση µεταβολών του φάσµατος των φαινολών σε p=7,4 παρουσία ή απουσία ιόντων µετάλλων (Natella et al., 1999). Με βάση τα παραπάνω, είναι φανερό ότι η εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης στα συστήµατα διασποράς είναι µια επίπονη διαδικασία ειδικά στην περίπτωση που αναζητούνται SAR. Ωστόσο φαίνεται ενδιαφέρον κατά πόσο µπορεί κανείς να πραγµατοποιήσει µια τέτοια αναζήτηση. Έτσι, σχετικά πρόσφατα, ερευνητές επιχείρησαν να αναζητήσουν SAR σε συστήµατα διασποράς λινελαϊκού οξέος (Foti et al., 1996, uvelier et al., 2000, Son and Lewis, 2002) και σε λιποσώµατα (Arora et al., 1998). Οι Foti et al. (1996) διαπίστωσαν ότι ηλεκτροστατικές απωθήσεις µεταξύ του SDS που χρησιµοποιήθηκε ως γαλακτωµατοποιητής και των ανιόντων των οξέων σε τιµή p=7,4 ήταν υπεύθυνες για τη µικρή αντιοξειδωτική δράση των τελευταίων. Αντίθετα οι αντίστοιχοι εστέρες που δεν επηρεάζονται από τέτοια φαινόµενα ήταν πιο αποτελεσµατικοί. Οι uvelier et al. (2000) όπως και οι Son and Lewis (2002) παρατήρησαν ότι η αντιοξειδωτική δράση των υπό µελέτη ΑΗ ερµηνεύονταν µε βάση το πολικό παράδοξο. Στην περίπτωση των λιποσωµάτων οι Arora et al. (1998) διαπίστωσαν µεγαλύτερη δράση για τις ενώσεις µε κατεχολική οµάδα κυρίως λόγω σχηµατισµού χηλικών συµπλόκων µε τα ιόντα σιδήρου κάτω από τις συνθήκες του πειράµατος. 1.4 ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΤΟΥ π-υ ΡΟΞΥΚΙΝΝΑΜΩΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ 1.4.1 Γενικά Τα παράγωγα του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος είναι φυσικές φαινολικές ενώσεις που περιλαµβάνουν έναν αρωµατικό δακτύλιο µε µια πλευρική αλυσίδα αποτελούµενη από τρία άτοµα άνθρακα ( 6-3 ). Τα τέσσερα πιο διαδεδοµένα στη φύση οξέα είναι το π-κουµαρικό, το καφεϊκό, το φερουλικό και το σιναπικό οξύ, ενώ πιο σπάνια απαντώνται το ο-και µ-κουµαρικό οξύ (Σχήµα 1.12) (lifford, 2000). Οι συγκεκριµένες ενώσεις δεν υπάρχουν συνήθως σε ελεύθερη µορφή, εκτός και αν είναι προϊόντα χηµικής ή ενζυµικής υδρόλυσης. Για παράδειγµα, το καφεϊκό οξύ αντιπροσωπευτικό µέλος της τάξης των υδροξυκινναµωµικών, βρίσκεται ως εστέρας µε οξέα (κινικό, µηλικό), ως γλυκοζίτης µε σάκχαρα (γλυκόζη, ραµνόζη), ως αµίδιο µε αµίνες (πουτρεσκίνη) (arborne, 1989) καθώς και µε άλλες µορφές (hen et al., 1999, 28

hesson et al., 1999). Ακόµα τα υδροξυκινναµωµικά, όπως για παράδειγµα το χλωρογενικό οξύ, απαντώνται και σε διάφορες ισοµερείς µορφές (π.χ. νεοχλωρογενικό, κρυπτοχλωρογενικό) (Nakatani et al., 2000). Στα υδατικά εκχυλίσµατα τα παραπάνω παράγωγα υφίστανται ισοµερείωση από την πιο σταθερή trans διαµόρφωση στη cis ειδικά µε την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας (arborne, 1989). 3 =- =- 3 καφεϊκό οξύ σιναπικό οξύ 3 =- =- φερουλικό οξύ π-κουµαρικό οξύ Σχήµα 1.12 Συνήθη υδροξυκινναµωµικά οξέα Τα υδροξυκινναµωµικά οξέα όσο και άλλες φαινολικές ενώσεις σχηµατίζονται από το κινναµωµικό ή το π-υδροξυκινναµωµικό οξύ µε αντιδράσεις οξείδωσης, µεθυλίωσης κ.α. (Σχήµα 1.13). Τα δύο παραπάνω οξέα βιοσυντίθενται κατά την οδό του σικιµικού οξέος (Σχήµα 1.14). Κύκλος alvin ΗΟ ΗΟ σικιµικό οξύ 2 -- N 2 L-φαινυλαλανίνη π-υδροξυκινναµωµικό -N 3-2 υδροξυακετοφαινόνες υδροξυβενζοϊκά οξέα =- ο-οξείδωση υδροξυκουµαρίνες φλαβονοειδή και ισοφλαβονοειδή ξανθόνες και υδροξυστιλβένια = 2 π-υδροξυκινναµωµική αλκοόλη Σχήµα 1.13 Βιοσύνθεση παραγώγων π-υδροξυκινναµωµικού οξέος (arborne, 1989) 29

- P 2 φωσφοενολοπυροσταφυλικό = = 2 3-δεϋδροκινικό οξύ 2 P 4 φωσφορική D-ερυθρόζη 2 -P 7-φωσφο-3-δεοξυ-Dαραβινο-επτουλοζονικό οξύ - 2 -P 2 σικιµικό οξύ 2 -- χορισµικό οξύ 2 2 -N 2-3-δεϋδροσικιµικό οξύ R πρoφαινικό οξύ 2-2 - 2 ή -Η 2 Ο εναµίνωση απαµίνωση R R α-κετονοξύ R= (φαινυλαλανίνη) R= ή ή ΟΗ (τυροσίνη) R= (κινναµωµικό οξύ) ή ΟΗ (π-υδροξυκινναµωµικό οξύ) Σχήµα 1.14 Βιοσύνθεση κινναµωµικού και π-υδροξυκινναµωµικού οξέος µε την οδό του σικιµικού οξέος 30

Η βιοσύνθεση περιλαµβάνει µια αλδολική συµπύκνωση του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος και του υδατάνθρακα φωσφορική ερυθρόζη, µεταβολίτες αµφότεροι της γλυκόζης. Το προϊόν της προσθήκης είναι ένα παράγωγο επτόζης το οποίο υφίσταται κυκλοποίηση προς το 3-δεϋδροκινικό οξύ. Το τελευταίο µε αφυδάτωση µετατρέπεται προς δεϋδροσικιµικό και µε αναγωγή προς σικιµικό οξύ. Το σικιµικό οξύ µε τη συµβολή βακτηρίων που δεσµεύουν άζωτο µετατρέπεται σε αµινοξέα όπως η φαινυλαλανίνη και η τυροσίνη που τελικά µε ενζυµική απαµίνωση καταλήγουν αντιστοίχως στο κινναµωµικό και το π-υδρoξυκινναµωµικό οξύ (Samuelsson, 1996). 1.4.2 Συνήθεις φυσικές πηγές Ενώσεις όπως το καφεϊκό, το φερουλικό και το π-κουµαρικό οξύ αποτελούν µερικές από τις πιο αντιπροσωπευτικές ΑΗ που συναντά κανείς στα δηµητριακά (Shahidi and Wanasundara, 1992). Η παρουσία του χλωρογενικού, του καφεϊκού, του ισοχλωρογενικού, του φερουλικού και του π-κουµαρικού οξέος έχει επίσης διαπιστωθεί και στη σόγια (Shahidi and Wanasundara, 1992). Το χλωρογενικό βρίσκεται σε σηµαντικές ποσότητες στους κόκκους καφέ και υδρολύεται κατά την παρασκευή ροφήµατος προς καφεϊκό οξύ (lifford, 2000). Η συγκέντρωση των υδροξυκινναµωµικών οξέων στον καρπό του καφέ µπορεί να φτάσει έως 56.000 mg/kg (King and Young, 1999). Επίσης, σηµαντική πηγή τους αποτελούν τόσο τα εκχυλίσµατα, όσο και τα ίδια τα αρωµατικά φυτά που ανήκουν στην οικογένεια Lamiaceae, όπως εκείνο του γένους της ρίγανης (regano). Σε αυτό έχει διαπιστωθεί η παρουσία του καφεϊκού οξέος, αλλά και ενός εστέρα του, του ροσµαρινικού οξέος (Σχήµα 1.15) σε υψηλές, µάλιστα, συγκεντρώσεις (Kikuzaki and Nakatani, 1989, Exarchou et al., 2002). Σχήµα 1.15 Συντακτικός τύπος ροσµαρινικού οξέος 31

Το ροσµαρινικό οξύ εκτός από τα φυτά της οικογένειας Lamiaceae υπάρχει και σε φυτά άλλων οικογενειών (Petersen and Simons, 2003). Στις πηγές των υδροξυκινναµωµικών οξέων συγκαταλέγονται τα σταφύλια και το κρασί καθώς περιέχουν καφεϊκό, φερουλικό και σιναπικό οξύ αλλά και τους αντίστοιχους εστέρες µε το τρυγικό οξύ, δηλαδή τα οξέα καφταρικό, φερταρικό και π-κουταρικό (Teissedre et al., 1996, Meyer et al., 1998, lifford, 2000). Άλλες πηγές υδροξυκινναµωµικών οξέων αποτελούν τα κεράσια (290-1280 mg/kg), τα αχλάδια (44-1270 mg/kg) καθώς και διάφορα είδη βατόµουρων (1881-2112 mg/kg) (King and Young, 1999). Σε πολλά από τα υδροξυκινναµωµικά οξέα αποδίδονται ευεργετικές ιδιότητες. Έτσι, για παράδειγµα, το ροσµαρινικό οξύ έχει αναφερθεί ότι έχει αντιµεταλλαξιογόνο και αντιβακτηριδιακή δράση (Petersen and Simons, 2003). Το καφεϊκό και το χλωρογενικό οξύ έχουν αντιµεταλλαξιογόνο, αντικαρκινική δράση, ενώ προστατεύουν το DNA από πιθανές βλάβες (Tapiero et al., 2002). Ο βιολογικός ρόλος των υδροξυκινναµωµικών συνδέεται συνήθως µε τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες. 1.4.3 Σχέσεις δοµής-δραστικότητας Τα παράγωγα του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος, όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 1.4.2, είναι ευρύτατα διαδεδοµένα στο φυτικό βασίλειο και έχουν µελετηθεί σε µεγάλο βαθµό µε σκοπό τη διερεύνηση της σηµασίας των δοµικών τους χαρακτηριστικών στην αντιοξειδωτική ικανότητα. Παρά το µεγάλο αριθµό των σχετικών εργασιών τα συµπεράσµατα δεν οδηγούν µε ασφάλεια σε σχέσεις SAR, ούτε είναι πάντοτε συγκρίσιµα µεταξύ τους. Τη διαπίστωση αυτή υποστηρίζει το γεγονός ότι χρησιµοποιούνται πολλές και διαφορετικές συνθήκες για την αξιολόγηση της αποτελεσµατικότητας των ΑΗ. Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα κυριότερα ευρήµατα για την δραστικότητά τους. Οι ενώσεις της οµάδας που έχουν κατεξοχήν µελετηθεί σε διαφορετικές πειραµατικές συνθήκες είναι τα π-κουµαρικό οξύ, φερουλικό οξύ και καφεϊκό οξύ. Το π-κουµαρικό οξύ έχει βρεθεί σχεδόν αδρανές τόσο σε δοκιµές µε ελεύθερες ρίζες (Βrand-Williams et al., 1995, Von Gadow et al., 1997, hen et al., 1999, Natella et al., 1999, Fukumoto and Maza, 2000), όσο και σε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης λιπαρών υποστρωµάτων (Nergiz, 1991, Marinova and Yanishlieva, 1992, 1994, 1996, Nardini et al., 1999, uvelier et al., 2000). 32

εισαγωγή µιας µεθοξυ- οµάδας σε ο- θέση ως προς το φαινολικό υδροξύλιο (φερουλικό οξύ) ενισχύει την αντιοξειδωτική ικανότητα. Έτσι, το φερουλικό αποδίδει ευκολότερα άτοµο υδρογόνου προς τις ελεύθερες ρίζες, καθώς µε τη δοκιµή DPP σηµείωσε 4-10 φορές µεγαλύτερη δράση από το π-κουµαρικό οξύ (Von Gadow et al., 1997, hen et al., 1999, Fukumoto and Maza, 2000). Η µεγαλύτερη δραστικότητα του φερουλικού οξέος σε σχέση µε εκείνη του π-κουµαρικού έχει διαπιστωθεί και σε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης λιπαρών υποστρωµάτων. Για παράδειγµα, κατά την οξείδωση χοίρειου λίπους σε έντονες συνθήκες οξείδωσης (100 o, ροή αέρα 100 ml/min) και για επίπεδα προσθήκης 200-2000 mg/kg βρέθηκε 1,3-3,5 πιο αποτελεσµατικό από το π-κουµαρικό (Marinova and Yanishlieva, 1992). Οι διαφορές στη δραστικότητα ήταν µεγαλύτερες µε την αύξηση της συγκέντρωσης των ΑΗ στο υπόστρωµα. Οι uvelier et al. (2000) αναφέρουν ότι το φερουλικό σηµείωσε τριπλάσια δραστικότητα από εκείνη του του π-κουµαρικού και σε σύστηµα διασποράς (γαλάκτωµα λινελαϊκού οξέος) στους 30 o. Η παρουσία δεύτερης υδροξυ- οµάδας σε ο- θέση (καφεϊκό οξύ) ενισχύει ακόµα περισσότερο την αντιοξειδωτική δράση, σε συµφωνία µε τις ισχύουσες αρχές SAR. Συγκεκριµένα, το καφεϊκό οξύ έχει αναφερθεί ότι δεσµεύει 1,5-4 φορές περισσότερο τις ελεύθερες ρίζες από το φερουλικό οξύ σύµφωνα µε δοκιµές δέσµευσης της DPP (Βrand-Williams et al., 1995, Von Gadow et al., 1997, hen et al., 1999). Το καφεϊκό οξύ παρουσιάζει πολύ µεγαλύτερη δράση και σε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης ελαίων-µοντέλων. Οι Marinova and Yanishlieva (1994) κατά την οξείδωση µεθυλεστέρων χοίρειου λίπους αλλά και µεθυλεστέρων ηλιελαίου σε έντονες συνθήκες οξείδωσης (100 o, ροή αέρα 100 ml/min) διαπίστωσαν ότι το καφεϊκό οξύ ήταν πολύ πιο αποτελεσµατικό από το φερουλικό οξύ. Οι µεταξύ τους διαφορές στη δραστικότητα επηρεάζονταν κυρίως από τον τύπο του υποστρώµατος. Έτσι, στο χοίρειο λίπος το καφεϊκό σηµείωσε 5-10 φορές µεγαλύτερη δράση από το φερουλικό, ενώ σε µεθυλεστέρες ηλιελαίου η δράση του ήταν 15 φορές υψηλότερη. Σε συστήµατα διασποράς που περιελάµβαναν δοκιµές οξείδωσης της LDL (Low Density Lipoprotein) παρουσία ιόντων χαλκού (37 o, p=7,4) (Meyer et al., 1998, Nardini et al., 1999, Natella et al., 1999) το καφεϊκό οξύ βρέθηκε 4-6 φορές δραστικότερο από το φερουλικό οξύ. Η δραστικότητά του αποδόθηκε στην ικανότητα να δεσµεύει τα ιόντα του χαλκού, που χρησιµοποιείται ως εκκινητής της οξείδωσης, µε σχηµατισµό χηλικού συµπλόκου. Αντίθετες µε τις παραπάνω είναι οι παρατηρήσεις των uvelier et al. (2000) που 33

χρησιµοποίησαν ιόντα σιδήρου παρουσία ασκορβικού οξέος για την εκκίνηση της οξείδωσης σε γαλάκτωµα λινελαϊκού οξέος (30 o ) και βρήκαν ότι το φερουλικό οξύ είχε περίπου τριπλάσια δράση από εκείνη του καφεϊκού. Μελετώντας και άλλες ΑΗ υπό τις ίδιες συνθήκες συµπέραναν ότι η ικανότητα σχηµατισµού χηλικού συµπλόκου δε φάνηκε να παίζει ιδιαίτερο ρόλο στην δραστικότητα στο συγκεκριµένο σύστηµα και ερµήνευσαν τη συµπεριφορά κυρίως µε βάση την υπόθεση του πολικού παράδοξου. Μεγαλύτερη δραστικότητα για το φερουλικό οξύ σε σχέση µε εκείνη του καφεϊκού οξέος (4 φορές) έχει επίσης αναφερθεί και από τους Pekkarinen et al. (1999) σε γαλάκτωµα µεθυλεστέρων λινελαϊκού οξέος (40 o, σε κλειστά φιαλίδια). Στην περίπτωση αυτή δε χρησιµοποιήθηκε εκκινητής της οξείδωσης. Οι συγκεκριµένοι ερευνητές απέδωσαν τη χαµηλότερη δραστικότητα του καφεϊκού σε πιθανό σχηµατισµό δεσµών υδρογόνου µε το γαλακτωµατοποιητή που χρησιµοποιήθηκε (Tween 20). Η παρουσία δύο µεθοξυ- οµάδων σε ο- θέση ως προς το φαινολικό υδροξύλιο (σιναπικό οξύ) και η σηµασία τους στην αντιοξειδωτική συµπεριφορά έχει µελετηθεί σε µικρότερο βαθµό. Η εισαγωγή δεύτερης µεθοξυ- οµάδας φαίνεται ότι την ενισχύει όπως έχουν δείξει συγκριτικές µελέτες της δραστικότητάς του σιναπικού οξέος και του φερουλικού οξέος. Συγκεκριµένα το πρώτο βρέθηκε ότι δέσµευε 1,2-2 φορές περισσότερο την ελεύθερη ρίζα DPP από το δεύτερο (Pekkarinen et al., 1999, Bakalbassis et al., 2001, Kikuzaki et al., 2002), ενώ ήταν πιο αποτελεσµατικό και σε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης λιπαρών υποστρωµάτων. Το σιναπικό βρέθηκε 5 φορές πιο αποτελεσµατικό κατά την οξείδωση µεθυλεστέρων του λινελαϊκού οξέος σε διαλύτη δωδεκάνιο και έντονες συνθήκες οξείδωσης (110 ο και διαβίβαση αέρα) σύµφωνα µε τους uvelier et al. (1992). Οι Kikuzaki et al. (2002) παρατήρησαν 4 φορές µεγαλύτερη δραστικότητα για το σιναπικό οξύ σε σχέση µε εκείνη του φερουλικού, επίσης σε µεθυλεστέρες λινελαϊκού οξέος και σε υψηλή θερµοκρασία (90 ο και διαβίβαση αέρα). Στο ίδιο υπόστρωµα αλλά σε πιο ήπιες συνθήκες οξείδωσης (40 ο, ανοιχτά φιαλίδια) οι Pekkarinen et al. (1999) βρήκαν ακόµα µεγαλύτερη δραστικότητα για το σιναπικό (8 φορές) από εκείνη του φερουλικού οξέος. Σε ανάλογες παρατηρήσεις έχουν καταλήξει και άλλοι ερευνητές εφαρµόζοντας έντονες συνθήκες οξείδωσης (θ 100 ο, µε διαβίβαση ρεύµατος αέρα) και µε διαφορετικά λιπαρά υποστρώµατα (Marinova and Yanishlieva, 1992, 1994, Bakalbassis et al., 2001). Ωστόσο, σε συστήµατα διασποράς όπως σε γαλάκτωµα µεθυλεστέρων λινελαϊκού οξέος (40 o ), οι δύο ενώσεις φαίνεται ότι έχουν ανάλογη συµπεριφορά (Pekkarinen et al., 1999). 34

Ενδιαφέρον παρουσιάζει η συγκριτική µελέτη του σιναπικού οξέος µε το καφεϊκό οξύ. Όσον αφορά την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών τα αποτελέσµατα που έχουν βρεθεί είναι αντικρουόµενα. Έτσι, το πρώτο ακόµα και µε την ίδια δοκιµή (DPP ) αναφέρεται ότι είναι άλλοτε 1,1 φορές ισχυρότερο (Pekkarinen et al., 1999) και άλλοτε 1,5-2 φορές ασθενέστερο από το καφεϊκό οξύ (Bakalbassis et al., 2001, Kikuzaki et al., 2002). Στην περίπτωση δοκιµών σε έλαια το καφεϊκό οξύ παρουσιάζεται ακόµα και 5 φορές ισχυρότερο από το σιναπικό οξύ για τα ίδια επίπεδα προσθήκης (200-2000 mg/kg) ακόµη και σε έντονες συνθήκες οξείδωσης (100 o, ροή αέρα 100 ml/min) (Marinova and Yanishlieva, 1992, 1994). Ωστόσο υπάρχουν και άλλες µελέτες σε πιο ήπιες συνθήκες (40 ο ) που έχουν γίνει σε µεθυλεστέρες λινελαϊκού οξέος από τις οποίες δε διαπιστώθηκαν διαφορές στη συµπεριφορά των δύο οξέων (Pekkarinen et al., 1999). Στην κατηγορία των παραγώγων του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος έχει µελετηθεί και ο ρόλος άλλων δοµικών χαρακτηριστικών στην αντιοξειδωτική τους ικανότητα, όπως του εστεροποιηµένου καρβοξυλίου της πλευρικής ανθρακικής αλυσίδας. Η σύγκριση έχει γίνει κυρίως µεταξύ του καφεϊκού οξέος και του εστέρα του µε το κινικό οξύ (χλωρογενικό οξύ). Έτσι έχει διαπιστωθεί ότι η εστεροποίηση στην πλευρική αλυσίδα µε το κινικό οξύ οδηγεί σε ελάττωση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών όπως φάνηκε σε δοκιµές δέσµευσης της DPP (hnishi et al., 1994, hen and o, 1997) και της Ο - 2 (Nakatani et al., 2000). Στις συγκεκριµένες δοκιµές το καφεϊκό οξύ βρέθηκε 1,2 περίπου φορές πιο αποτελεσµατικό. Ανάλογες παρατηρήσεις για τη δραστικότητα των δύο οξέων έγιναν και σε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης σε λιπαρά υποστρώµατα. Οι hen and o (1997) χρησιµοποιώντας τη δοκιµή Rancimat (110 ο, ροή αέρα 20 ml/min) σε χοίρειο λίπος διαπίστωσαν ότι το καφεϊκό οξύ ήταν 1,4 φορές ισχυρότερο από το χλωρογενικό οξύ. Οι uvelier et al. (1992) ανέφεραν 2 φορές µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα για το καφεϊκό οξύ σε µεθυλεστέρες λινελαϊκού οξέος σε διαλύτη δωδεκάνιο στους 110 ο, ενώ οι Nakatani et al. (2000) σε έλαιο σιλικόνης που περιείχε 10% µεθυλεστέρες λινελαϊκού οξέος βρήκαν 3 φορές ισχυρότερο το παραπάνω οξύ από το χλωρογενικό στους 90 ο. Ωστόσο, η εστεροποίηση του καρβοξυλίου του καφεϊκού οξέος µε µεθανόλη, αιθανόλη και προπανόλη φαίνεται ότι ενισχύει την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών. Οι συγκεκριµένοι εστέρες βρέθηκαν 1,5 φορές πιο αποτελεσµατικοί από το οξύ µε τη δοκιµή DPP (Silva et al., 2000). Αντίθετα αποτελέσµατα έχουν αναφερθεί για την περίπτωση του φερουλικού 35

οξέος και των αντίστοιχων εστέρων του επίσης µε τη δοκιµή DPP καθώς οι εστέρες παρουσίασαν 1,2-1,5 φορές χαµηλότερη δράση από εκείνη του οξέος (Kikuzaki et al., 2002). Η εστεροποίηση του καρβοξυλίου φαίνεται ότι ενισχύει την αποτελεσµατικότητα των υδροξυκινναµωµικών οξέων κυρίως σε συστήµατα διασποράς. Σε δοκιµές που έγιναν σε µικήλλια λινελαϊκού οξέος παρουσία SDS (p=7,4) οι µεθυλεστέρες του καφεϊκού, του φερουλικού και του π-κουµαρικού οξέος βρέθηκαν 2-5 φορές δραστικότεροι από τα αντίστοιχα οξέα (Foti et al., 1996, halas et al., 2001). Η διαφορά αυτή αποδόθηκε στην ελάττωση της πολικότητας των εστέρων που επιτρέπει την αύξηση της συγκέντρωσής τους στη λιπαρή φάση, αλλά και σε ηλεκτροστατικές απώσεις µεταξύ του SDS και της ιονισµένης καρβοξυλικής οµάδας των οξέων. Η παρουσία περισσότερων της µιας κατεχολικών οµάδων φαίνεται ότι ενισχύει την αντιοξειδωτική ικανότητα, όπως έχει βρεθεί σε συγκριτικές µελέτες για το ροσµαρινικό και το καφεϊκό οξύ µε τη δοκιµή DPP. Οι hen and o (1997) και οι hen et al. (1999) αναφέρουν 1,7 και 1,3 φορές µεγαλύτερη ικανότητα για το ροσµαρινικό µε τη συγκεκριµένη δοκιµή. Ωστόσο, µε την ίδια δοκιµή οι Βrand- Williams et al. (1995) βρήκαν 1,3 φορές περισσότερο αποτελεσµατικό το καφεϊκό οξύ. σηµασία της παρουσίας περισσότερων κατεχολικών οµάδων έχει µελετηθεί και σε ενώσεις, όπως το σαλβιανολικό, το Β λιθοσπερµικό οξύ, καθώς και άλλα πολυυδροξυπαράγωγα που έχουν ταυτοποιηθεί σχετικά πρόσφατα στη Salvia Miltiorrhizae και τη Salvia officinalis (Σχήµα 1.16) (hen et al., 1999, Lu and Foo, 2001). Για παράδειγµα, το Β λιθοσπερµικό οξύ έχει βρεθεί 2,5 φορές πιο αποτελεσµατικό από το ροσµαρινικό οξύ και 3,5 φορές από το καφεϊκό οξύ (hen et al., 1999). B Λιθοσπερµικό οξύ Σαλβιανολικό οξύ Σχήµα 1.16 Πολυυδροξυ-παράγωγα καφεϊκού οξέος που απαντούν σε φυτικά υλικά 36

Οι βιοφαινόλες κατά την πρόσληψή τους από τον άνθρωπο είναι δυνατόν να υποστούν διάφορες αλλαγές στη δοµή τους µε αποτέλεσµα οι δραστικές in vivo ενώσεις να είναι περισσότερο ή και λιγότερο διαφορετικές δοµικά από τις µητρικές. Έτσι, τελευταία παρατηρείται µια στροφή του ενδιαφέροντος των ερευνητών σε µελέτες βιοδιαθεσιµότητας των ΑΗ, αλλά και ταυτοποίησης των µεταβολιτών τους. Χαρακτηριστικό παράδειγµα για την περίπτωση των παραγώγων του π- υδροξυκινναµωµικού οξέος είναι το διυδροκαφεϊκό οξύ που αποτελεί προϊόν αποικοδόµησης του καφεϊκού και της εριοκιτρίνης (γλυκοζίτη της εριοδικτυόλης) κατά τη δράση εντερικών βακτηρίων (Moon and Teraο, 1998). Η συγκεκριµένη ένωση έχει πρόσφατα προσελκύσει το ενδιαφέρον των ερευνητών καθώς φαίνεται ότι είναι ισχυρό αντιοξειδωτικό (Moon and Teraο, 1998, hen et al., 1999, Silva et al., 2000). Η παρατήρηση των µέχρι σήµερα πειραµατικών ευρηµάτων δείχνει ότι οι συνθήκες που χρησιµοποιούνται κάθε φορά για την αξιολόγηση των ΑΗ επηρεάζουν τη διατύπωση SAR. Σηµαντικός είναι ο ρόλος της θερµοκρασίας που ειδικά στις δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης σε έλαια είναι πολύ υψηλή. Στην περίπτωση αυτή τα αποτελέσµατα για τις παρατηρούµενες διαφορές δεν είναι ασφαλή καθώς τα υδροϋπεροξείδια καταστρέφονται και διάφορες παράπλευρες αντιδράσεις µπορούν να λάβουν χώρα (π.χ. πολυµερισµός, κυκλοποίηση) που δε συµβαίνουν στις συνήθεις συνθήκες αποθήκευσης (Frankel, 1998). Επειδή τα παράγωγα του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος, όπως το καφεϊκό οξύ, παρουσίασαν ισχυρότερη δράση από εκείνη γνωστών αντιοξειδωτικών που χρησιµοποιούνται στα τρόφιµα (π.χ. α-τοκοφερόλη, BT) η διευκρίνηση των σχέσεων δοµής-δραστικότητας για τα παράγωγα αυτής της κατηγορίας φαίνεται να έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. 1.5 ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ 1.5.1 Γενικά Τα ιριδοειδή και τα σεκοϊριδοειδή είναι ενώσεις, συνήθως γλυκοζιτικώς ενωµένες, που προκύπτουν κατά το δευτερογενή µεταβολισµό των τερπενίων και θεωρούνται πρόδροµοι αλκαλοειδών του ινδολίου. Στην οικογένεια leaceae, τα σεκοϊριδοειδή παράγονται συνήθως από γλυκοζίτες (ολεοζίτες) που χαρακτηρίζονται 37

από µια εξωκυκλική 8, 9-ολεφινική οµάδα, συνδυασµό του ελενολικού οξέος µε ένα σάκχαρο (Soler-Rivas et al., 2000). Χαρακτηριστική ένωση αυτής της κατηγορίας αποτελεί η ελαιοευρωπαΐνη. Πρόκειται για ένα γλυκοζίτη της 2-(3,4-διυδροξυφαινυλο) αιθανόλης (υδροξυτυροσόλη) που εντοπίζεται στο εσωτερικό των φυτικών ιστών. Όταν για κάποιο λόγο (έντοµα, ζώα) οι ιστοί υποστούν βλάβη, η ένωση υδρολύεται προς σχηµατισµό της αγλυκόνης που στη συνέχεια αλληλεπιδρά µε τις φυτικές πρωτεΐνες καθιστώντας µη δυνατή την πέψη τους (Jensen et al., 2002). Η παρουσία της συγκεκριµένης ένωσης διαπιστώθηκε να υπάρχει τόσο στους καρπούς όσο και στα φύλλα του ελαιόδεντρου (lea europaea) στις αρχές του 20 ου αιώνα. Κατά την ωρίµανση του καρπού, πιθανώς, λόγω της δράσης ενζύµων (π.χ. εστεράσες), την κατεργασία του ελαιόκαρπου για την αποπίκρανσή του ή ακόµα και κατά τη διαδικασία παραγωγής του ελαιολάδου η συγκεκριµένη ένωση είναι δυνατό να υποστεί αλλαγές στη δοµή της και να δώσει µεγάλο αριθµό παραγώγων (Soler-Rivas et al., 2000). Έτσι, για παράδειγµα, κατά την ωρίµανση της ελιάς η ελαιοευρωπαΐνη µετατρέπεται σταδιακά στην αποµεθυλοελαιοευρωπαΐνη. Άλλες αλλαγές που συµβαίνουν στη δοµή της είναι και η υδρόλυση του γλυκοζίτη προς σχηµατισµό της αγλυκόνης και ισοµερών της ενώσεων (Montedoro et al., 1993). Επιπλέον, είναι δυνατή η διάνοιξη του δακτυλίου του ελενολικού οξέος, η αποκαρβοξυλίωση ή τελικά ο σχηµατισµός µικρότερου µοριακού βάρους ενώσεων όπως η υδροξυτυροσόλη και ο οξικός της εστέρας (Brenes et al., 1999). Η δοµή της ελαιοευρωπαΐνης και διαφόρων παραγώγων της δίνονται στο Σχήµα 1.17. Οι συνεχείς προσπάθειες των ερευνητών για τη διερεύνηση της σύστασης των προϊόντων της ελιάς µε τη βοήθεια δυναµικών τεχνικών (NMR, MS) είναι δυνατόν να οδηγήσει στο µέλλον στη διευκρίνιση της δοµής και άλλων δραστικών παραγώγων. Η βιοσύνθεση της ελαιοευρωπαΐνης φαίνεται ότι ακολουθεί συνδυασµό βιοσυνθετικών οδών. Ωστόσο στη βιβλιογραφία δε βρέθηκε κάποια σχετική αναφορά, ενώ περιγράφεται η βιοσύνθεση εκείνου του τµήµατός της που την κατατάσσει στα σεκοϊριδοειδή (Σχήµα 1.18). 38

3 Glc Glc ελαιοευρωπαΐνη, ΟL [1] αποµεθυλοελαιοευρωπαΐνη [2] 3 3 3 αγλυκόνη ελαιοευρωπαΐνης, I [3] αλδεϋδική µορφή αγλυκόνης ελαιοευρωπαΐνης [4] αγλυκόνη ελαιοευρωπαΐνης, ΙΙ [5] αγλυκόνη ελαιοευρωπαΐνης, ΙII [6] αγλυκόνη ελαιοευρωπαΐνης, IV [7] 3 οξικός εστέρας υδροξυτυροσόλης [8] υδροξυτυροσόλη T [9] Σχήµα 1.17 Συντακτικοί τύποι ελαιοευρωπαΐνης και παραγώγων της 1.5.2 Συνήθεις φυσικές πηγές Η πιο γνωστή πηγή ελαιοευρωπαΐνης είναι τα φύλλα της ελιάς και οι καρποί της πριν από το στάδιο της ωρίµανσης (πράσινοι καρποί). Στα φύλλα βρίσκεται σε υψηλή συγκέντρωση 60-90 mg/g (Le Tutour and Guedon, 1992) ενώ στον ελαιόκαρπο η συγκέντρωσή της µπορεί να φτάσει µέχρι και 14% επί ξηρού βάρους (Amiot et al., 1986). Έχει ταυτοποιηθεί και σε ορισµένα άλλα φυτά της οικογένειας leaceae, στοιχεία όµως για τα επίπεδα στα οποία απαντάται σε αυτά τα φυτά δεν υπάρχουν. Οι ευεργετικές ιδιότητες της ελαιοευρωπαΐνης και των παραγώγων της που βρίσκονται κύρια στα προϊόντα της ελιάς, βασικού χαρακτηριστικού της Μεσογειακής διατροφής, συνδέονται µε χαµηλή συχνότητα εµφάνισης διαφόρων τύπων καρκίνου και καρδιαγγειακών παθήσεων. Πιο συγκεκριµένα, έρευνες που έχουν γίνει για την ελαιοευρωπαΐνη αναφέρουν ότι προστατεύει από την εµφάνιση όγκων, ενώ επίσης παρουσιάζει υποχοληστερολαιµική, αντισπασµολυτική δράση και προκαλεί µείωση της αρτηριακής πίεσης (Soler-Rivas, et al., 2000). Παράγωγά της όπως η υδροξυτυροσόλη έχουν αντιβακτηριδιακή δράση. Ο βιολογικός ρόλος των ενώσεων αυτών εκτός από τα 39

παραπάνω συνδέεται µε την ικανότητα τους να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες (Saija et al., 1998, Deiana et al., 1999). Μεβαλονικό οξύ Γερανιόλη 10-υδροξυγερανιόλη ΟΗ ΟΗ ΟΗ Ιριδοδιάλη Ιριδοτριάλη αγλυκόνη του δεοξυλογανικού οξέος ΟΟΗ Glc Glc Me Glc Glc Me Glc Me Glc Glc Glc Me Glc λιγκστροζίτης Σχήµα 1.18 Βιοσύνθεση ελαιοευρωπαΐνης Ελαιοευρωπαΐνη 1.5.3 Σχέσεις δοµής-δραστικότητας Η αντιοξειδωτική συµπεριφορά της ελαιοευρωπαΐνης έχει διερευνηθεί σε διάφορα συστήµατα. Ωστόσο, τα στοιχεία για τη δραστικότητά της αλλά και άλλων παραγώγων της είναι περιορισµένα. Ο λόγος είναι κυρίως η δυσκολία αποµόνωσης των ενώσεων και ο ευοξείδωτος χαρακτήρας τους. Οι περισσότερες µελέτες περιορίζονται στη µελέτη δραστικότητας της ελαιοευρωπαΐνης συγκριτικά µε εκείνη της υδροξυτυροσόλης και της τυροσόλης. Οι δυο τελευταίες προκύπτουν κατά την υδρόλυση του γλυκοζίτη στο στάδιο της ωρίµανσης του ελαιοκάρπου (Angerosa et al., 40

1995). Η τυροσόλη ως µονοφαινόλη παρουσιάζει µικρή αντιοξειδωτική δράση όπως έχουν δείξει δοκιµές δέσµευσης ελευθέρων ριζών, αλλά και επιταχυνόµενης οξείδωσης σε λιπαρά υποστρώµατα (himi et al., 1991, Papadopoulos and Boskou, 1991, Saija et al., 1998, Fogliano et al., 1999, Benavente-Garcia et al., 2000, De la Puerta et al., 2001). Αντίθετα η ελαιοευρωπαΐνη και η υδροξυτυροσόλη, καθώς διαθέτουν µια κατεχολική οµάδα, είναι ισχυρότερα αντιοξειδωτικά. Όσον αφορά την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών, η υδροξυτυροσόλη φαίνεται ότι είναι σε γενικές γραµµές δραστικότερη από την ελαιοευρωπαΐνη. Συγκεκριµένα έχει αναφερθεί ότι 1,8 φορές πιο αποτελεσµατική µε την δοκιµή δέσµευσης της ABTS + (Benavente-Garcia et al., 2000), 1,2 µε τη δοκιµή DPP (Gordon et al., 2001) και 1,3 µε τη δοκιµή DMPD + (N, N- dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) (Briante et al., 2001). Αντικρουόµενα είναι τα αποτελέσµατα για τις δύο ενώσεις όσον αφορά τη δέσµευση ριζών υδροξυλίου. Έτσι, οι wen et al. (2000 b) αναφέρουν ότι η υδροξυτυροσόλη παρουσίασε 5,8 φορές µεγαλύτερη δράση, ενώ οι himi et al. (1991) 1,8 φορές µικρότερη από την ελαιοευρωπαΐνη. Οι διαφορές που αναφέρθηκαν από τους δύο ερευνητές πιθανόν οφείλονται στο διαφορετικό σύστηµα που χρησιµοποίησαν για την παραγωγή των ριζών και τον τρόπο αξιολόγησης της αντιοξειδωτικής δράσης των ΑΗ. Η υδροξυτυροσόλη σε ισοµοριακές ποσότητες µε την ελαιοευρωπαΐνη (0,3 mmol/kg) βρέθηκε πολύ πιο δραστική (7 φορές) κατά την οξείδωση καθαρισµένων τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου στους 60 o. Αντίθετα σε γαλάκτωµα τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου (60 o ) ο γλυκοζίτης είχε την ίδια ή και καλύτερη δράση (1,3 φορές) από την αλκοόλη. Η συµπεριφορά αυτή διαπιστώθηκε σε p 5,5 και 7,4 (Gordon et al., 2001). Σε µικήλλια λινελαϊκού οξέος έχουν αναφερθεί αντικρουόµενα αποτελέσµατα. Έτσι, οι himi et al. (1991) παρατήρησαν παρόµοια δράση για τις δύο ΑΗ, ενώ οι Saija et al. (1998) βρήκαν 1,2 φορές πιο αποτελεσµατική την ελαιοευρωπαΐνη και οι Briante et al. (2001) 3,5 φορές λιγότερο δραστική. Σε µικρότερο βαθµό φαίνεται ότι έχουν µελετηθεί άλλα δοµικά χαρακτηριστικά. Έτσι, η εστεροποίηση του υδροξυλίου της πλευρικής αλυσίδας της υδροξυτυροσόλης µε το οξικό οξύ φαίνεται ότι προκαλεί ελάττωση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών καθώς ο οξικός εστέρας βρέθηκε 1,3 φορές λιγότερο αποτελεσµατικός από την αλκοόλη µε τη δοκιµή DPP (Gordon et al., 2001). Οι ίδιοι ερευνητές σε δοκιµές οξείδωσης καθαρισµένων τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου (60 o ) διαπίστωσαν ότι ο εστέρας ήταν 1,1 φορά λιγότερο δραστικός από την αλκοόλη, αλλά 1,3 φορές πιο δραστικός σε γαλάκτωµα τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου (60 o ). 41

Η ελαιοευρωπαΐνη είναι δυνατόν να υποστεί διάφορες δοµικές αλλαγές και να δώσει πολλούς τύπους αγλυκόνης που διαφέρουν άλλοτε λιγότερο και άλλοτε περισσότερο δοµικά από αυτή. Τα πειραµατικά δεδοµένα για τη δραστικότητα των παραγώγων της είναι ελάχιστα. ι Fogliano et al. (1999) σε µικήλλια λινελαϊκού οξέος (50 o, p=7,4) αναφέρουν ότι η ενωµένη µε την υδροξυτυροσόλη διαλδεϋδική µορφή του ελενολικού οξέος (ένωση 7, Σχήµα 1.17) σηµείωσε 3 φορές µεγαλύτερη δραστικότητα από την υδροξυτυροσόλη. Η ίδια ένωση αναφέρεται ως 1,3 φορές λιγότερο αποτελεσµατική από την ελαιοευρωπαΐνη µε τη δοκιµή DPP (Martins and Gordon, 2001). Συγκριτική µελέτη σε διάφορα συστήµατα έχει πραγµατοποιηθεί για την ελαιοευρωπαΐνη, την αλδεϋδική µορφή της αγλυκόνης της και την υδροξυτυροσόλη (Gordon et al., 2001). Οι συγκεκριµένοι ερευνητές διαπίστωσαν ότι η αγλυκόνη ήταν αποτελεσµατικότερη των άλλων δύο ενώσεων µε τη δοκιµή DPP (1,8 και 1,6 φορές αντίστοιχα). Σε δοκιµές οξείδωσης καθαρισµένων τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου (60 o ) ο ίδιος τύπος αγλυκόνης βρέθηκε 8 περίπου φορές πιο αποτελεσµατικός από τον γλυκοζίτη και 1,1 φορές λιγότερο δραστικός από την αλκοόλη σε ισοµοριακές ποσότητες. Σε δοκιµές που έγιναν σε γαλάκτωµα της ίδιας λιπαρής ύλης (60 o, p=5,5) από τους παραπάνω ερευνητές, η αγλυκόνη παρουσιάστηκε 1,7 και 2,2 φορές αντιστοίχως αποτελεσµατικότερη από το γλυκοζίτη και την αλκοόλη. Οι διαφορές στη δραστικότητα µειώθηκαν αισθητά όταν το πείραµα επαναλήφθηκε σε p=7,4. Στην περίπτωση αυτή η αγλυκόνη βρέθηκε µόνο 1,2 φορές πιο δραστική από τις άλλες δύο ενώσεις. εδοµένου ότι ενώσεις όπως η υδροξυτυροσόλη φαίνεται ότι είναι εξίσου ή πιο δραστικές από τα υδροξυκινναµωµικά οξέα, όπως το καφεϊκό οξύ αλλά και την α- τοκοφερόλη και λαµβάνοντας υπόψη ότι στη φύση βρίσκονται κυρίως σε δεσµευµένη µορφή, η αναζήτηση SAR για διάφορα µέλη της συγκεκριµένης κατηγορίας παρουσιάζει ενδιαφέρον. 42

2. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ

Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν η αναζήτηση σχέσεων δοµής-αντιοξειδωτικής ικανότητας (SAR) βιοφαινολών. Οι βιοφαινόλες που µελετήθηκαν ήταν: Α) σειρά από µεταβολίτες και παράγωγα του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος Β) σειρά από παράγωγα της ελαιοευρωπαΐνης Όλες οι ενώσεις αυτές παρουσιάζουν ενδιαφέρον ως πρόσθετα τροφίµων και ως λειτουργικά συστατικά. Οι ενώσεις της κάθε κατηγορίας δε διέφεραν µεταξύ τους ως προς τον αριθµό των φαινολικών υδροξυλίων αλλά σε ορισµένα δοµικά χαρακτηριστικά άλλων υποκαταστατών, η σηµασία των οποίων δεν έχει επαρκώς υποστηριχθεί. Συγκεκριµένα στη διατριβή εξετάστηκε συστηµατικά πώς δοµικές µεταβολές στην ανθρακική αλυσίδα των υποκαταστατών επηρεάζουν την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών αλλά και τη συµπεριφορά των ΑΗ σε µοντέλα λιπαρών υποστρωµάτων που προσοµοιάζουν φυσικά ή τεχνητά τρόφιµα. Τα δοµικά χαρακτηριστικά που µελετήθηκαν ήταν η παρουσία και η θέση ενός διπλού δεσµού στην ανθρακική αλυσίδα, η παρουσία χαρακτηριστικών οµάδων σε αυτή και το µέγεθος της αλυσίδας σε συνδυασµό µε την παρουσία χαρακτηριστικών οµάδων. Της µελέτης προηγήθηκε εξέταση των πειραµατικών συνθηκών που επηρεάζουν τα αναλυτικά αποτελέσµατα των µεθόδων που χρησιµοποιήθηκαν και κατ επέκταση τη διαµόρφωση SAR. Όπου κρίθηκε απαραίτητο έγινε τροποποίηση των µεθόδων ώστε να είναι δυνατή η εξαγωγή συµπερασµάτων µε βάση τα δοµικά χαρακτηριστικά των υπό εξέταση βιοφαινολών. Υπολογιστικές µέθοδοι χρησιµοποιήθηκαν επικουρικά (περίπτωση µεταβολιτών και παραγώγων του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος) ή για την πρόβλεψη σχέσεων δοµήςαντιοξειδωτικής ικανότητας (περίπτωση παραγώγων της ελαιοευρωπαΐνης). Τα συµπεράσµατα για την αξιολόγηση των παραπάνω βιοφαινολών οδήγησαν στην αναζήτηση νέων µη συµβατικών πηγών για τις δραστικότερες από αυτές. 44

3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

3.1 ΥΛΙΚΑ 3.1.1 Λιπαρές ύλες που χρησιµοποιήθηκαν στις δοκιµές δραστικότητας των βιοφαινολών Οι λιπαρές ύλες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τριελαΐνη (~65%, από safflower oil, Fluka, Buchs, Switzerland) και λεκιθίνη σόγιας [L-phosphatidylcholine (P)~40%] (Sigma hemical ο., St. Louis, Μ, USA). 3.1.2 Φυτικό υλικό Tα φύλλα των φυτών Ligustrum quihoui, Fraxinus chinensis, Jasminum polyanthum, Syringa oblata Lindl var. alba και Forsythia viridissima (leaceae) συλλέχθηκαν τον Ιούλιο και τον Αύγουστο του 2002 από το βοτανικό κήπο του Πανεπιστηµίου της πόλης Zibo (Επαρχία Shandong, Λαϊκή ηµοκρατία της Κίνας). Τη συλλογή επέβλεψε ο καθηγητής βοτανικής Zhao Bo Sheng. Tα φύλλα ελιάς συλλέχθηκαν από το κτήµα του κ. Α. Μπλέκα (Καλλικράτεια, Χαλκιδική). Τα φύλλα αφού καθαρίστηκαν από τη σκόνη µε ρεύµα αέρα λυοφιλιώθηκαν και διατηρήθηκαν σε ατµόσφαιρα αζώτου στους 23 0 µέσα σε σφραγισµένα γυάλινα δοχεία. 3.2 ΠΡΟΤΥΠΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ Η προµήθεια των πρότυπων ενώσεων που χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη των σχέσεων δοµής-αντιοξειδωτικής δράσης έγινε από διάφορες εταιρείες. Συγκεκριµένα: α) οι ενώσεις 3-(3,4-διυδροξυφαινυλο) προπανοϊκό οξύ, (διυδροκαφεϊκό οξύ) (98%), 3- (2-υδροξυφαινυλο)-2-προπενοϊκό οξύ (ο-κουµαρικό οξύ) (99%), 3-(4-υδροξυφαινυλο)- 2-προπενοϊκό οξύ (π-κουµαρικό οξύ) (99%), 3-(4-υδροξυ-3,5-διµεθοξυφαινυλο)-2- προπενοϊκό οξύ (σιναπικό οξύ) (98%), 3--(3,4-διυδροξυκινναµυλ)-D-κινικό οξύ (χλωρογενικό οξύ) (95%), 2-(4-υδροξυφαινυλο)-αιθανόλη (τυροσόλη) (98%), 2(3)- τριτοταγής-βουτυλο-4-υδροξυανισόλη (BA) (99%), 3,5-δι-τριτοταγές-βουτυλο-4- υδροξυτολουένιο, (BT) (99%), 2-τριτοταγής-βουτυλο υδροκινόνη (TBQ) (97%), 1,3- διυδροξυβενζόλιο (ρεσορκινόλη) (99%), 1,4-διυδροξυβενζόλιο (υδροκινόνη) (99%), 2,3-διυδροξυβενζοϊκό οξύ (πυροκατεχικό οξύ) (99%), 2,5-διυδροξυβενζοϊκό οξύ (γεντισικό οξύ) (98%), 3,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ (πρωτοκατεχικό οξύ) (98%), 3,4,5- τριυδροξυβενζοϊκό οξύ (γαλλικό οξύ) (99%), 3,5,7,3',4'-πενταϋδροξυφλαβόνη 46

(κερκετίνη) (99%) και 3,5,7,2',4'-πενταϋδροξυφλαβόνη (µορίνη) (91%) ήταν από τη Sigma hemical ο., (St. Louis, Μ, USA). β) οι ενώσεις 3-(4-υδροξυ-3-µεθοξυφαινυλο)-2-προπενοϊκό οξύ (φερουλικό οξύ) (99%), 3-(3-υδροξυ-4-µεθοξυφαινυλο)-2-προπενοϊκό οξύ (ισοφερουλικό οξύ) (97%), 2-µεθοξυ- 4-προπυλιδενοφαινόλη (ισοευγενόλη) (99%), 2-µεθοξυ-4-αλλυλοφαινόλη (ευγενόλη) (99%), 2-µεθοξυ-4-προπυλοφαινόλη (διυδροευγενόλη) (99%), 3-(4-υδροξυ-3- µεθοξυφαινυλο)-2-προπενάλη (κωνιφερυλαλδεΰδη) (98%), 3-(4-υδροξυ-3- µεθοξυφαινυλο)-2-προπενοϊκός αιθυλεστέρας (αιθυλεστέρας φερουλικού οξέος) (98%), 3-φαινυλο-2-προπενοϊκό οξύ (κινναµωµικό οξύ) (99%) και 2,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ (ρεσορκυλικό οξύ) (97%) αγοράστηκαν από την Aldrich hemical ο., (Steinheim, Germany). γ) οι ενώσεις 3-(3-υδροξυφαινυλο)-2-προπενοϊκό οξύ (µ-κουµαρικό οξύ) (99%), 3-(4- υδροξυ-3-µεθοξυφαινυλο)-2-προπενόλη (κωνιφερυλαλκοόλη) (99%) και 1,2- διυδροξυβενζένιο (κατεχόλη) (98%) ήταν από τη Fluka, (Buchs, Switzerland). δ) οι ενώσεις 3-(3,4-διυδροξυφαινυλο)-2-προπενοϊκό οξύ (καφεϊκό οξύ) (98%) και 6- υδροξυ-2,5,7,8-τετραµεθυλο-χρωµαν-2-ικό οξύ (Τrolox) (97%) από τη Riedel de aën, (Seelze, Germany), Οι ενώσεις 3,4-διυδροξυκινναµωµικό οξύ-(r)-1-καρβοξυλο-2-(3,4- διυδροξυφαινυλο)-αιθυλεστέρας, (ροσµαρινικό οξύ) (97%) και ελαιοευρωπαΐνη (98%) ήταν της Röth, (Karlsruhe, Germany), ενώ τέλος οι ενώσεις α-τοκοφερόλη (98%) και 1,3,5-τριυδροξυβενζένιο (φλωρογλυκινόλη) (99%) αγοράστηκαν από τη Merck, (Darmstadt, Germany). 2-(3,4-διυδροξυφαινυλο)-αιθανόλη (υδροξυτυροσόλη) ήταν ευγενική προσφορά του Επίκουρου Καθηγητή Γ. Μπλέκα (Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, ΑΠΘ). 3.3 ΙΑΛΥΤΕΣ Οι διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν της µέγιστης καθαρότητας. Χρησιµοποιήθηκαν αιθανόλη (PL 95%), από τη Riedel de aën, (Seelze, Germany), κ-εξάνιο (PL 95%), χλωροφόρµιο (99,8%), µεθανόλη (PL 99,8%), κ-οκτανόλη (99%), ακετονιτρίλιο (PL 95%) και οξικό οξύ (99,7%) από την Panreac Quimica, (Barcelona, Spain). Για τη χρωµατογραφική ανάλυση των τοκοφερολών και των χρωστικών χρησιµοποιήθηκαν κ-εξάνιο και ισοοκτάνιο (PL 95%) της Baker, (Deventer, olland), και 2-προπανόλη (hromasolv) της Riedel de aën. τριτοταγήςβουτυλική αλκοόλη (αναλυτικώς καθαρή) ήταν από την Fluka (Buchs, Switzerland) και 47

το µυρµηκικό οξύ (98%) από τη Merck (aarleem, The Netherlands). Το νερό που χρησιµοποιήθηκε στην υγροχρωµατογραφική ανάλυση παράγονταν στο εργαστήριο µε συσκευή τύπου Milli-Q Water Purification System, (Milliprore, Milford, MA, USA). 3.4 ΥΛΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ-ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Για τη χρωµατογραφία στήλης χρησιµοποιήθηκαν πυριτικό οξύ (mesh size 100-200) από τη Sigma hemical o., (St. Louis, ΜΟ, USA), γη διατόµων (Kieselghur) από τη Riedel de- aën, (Seelze, Germany) και ενεργός άνθρακας (<100 mesh) από την Aldrich hemical o. (Dorset, UK). Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ικανοποιούσαν το βαθµό καθαρότητας που απαιτεί η κάθε ανάλυση. Η σταθερή ρίζα 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζύλιο (DPP ) (~90%), το δις-αµµωνιακό άλας του 2,2 αζινο-δις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφoνικού οξέος) (ABTS) (~98%), το υπερθεϊικό κάλιο (99%) (K 2 S 2 8 ) που χρησιµοποιήθηκε για την οξείδωση του ABTS προς την κατιοντική ρίζα. ΑΒΤS + και ο οξικός χαλκός (u( 2 3 Ο 2 ) 2 2 ) για την οξείδωση των λιποσωµάτων ήταν από τη Sigma hemical o. Το ιωδιούχο κάλιο (99,5%) για τον προσδιορισµό του αριθµού υπεροξειδίων ήταν της Riedel de aën. Το διχλωριούχο βάριο (Βαl 2 2 2 ) ήταν από τη Merck (Darmstadt, Germany), ο θειικός σίδηρος (FeS 4 7 2 ) (99%), το ανθρακικό νάτριο (Νa 2 3 ), (99,8%), ο τριχλωριούχος σίδηρος (Fel 3 6 2 ) (99,5%) και το αντιδραστήριο Folin-iocalteu ήταν από την Panreac Quimica (Barcelona, Spain). Το υδροχλωρικό οξύ (12 Ν), το οξικό νάτριο ( 3 Na), (99,5%) το χλωριούχο νάτριο (Nal), (99,8%) το µονόξινο φωσφορικό νάτριο (Na 2 P 4 ), (99,8%) και το δισόξινο φωσφορικό κάλιο (K 2 P 4 ), (99,8%) ήταν από τη Riedel de aën. 3.5 ΟΡΓΑΝΑ-ΣΥΣΚΕΥΕΣ Φασµατοφωτόµετρο UV-Vis διπλής δέσµης U-2000 itachi (Tokyo, Japan) χρησιµοποιήθηκε για την καταγραφή φασµάτων και απορροφήσεων. Για την παρασκευή των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκε οµογενοποιητής Ikasonic sonicator (Janke and Kunkel Gmb and o., KG., Staufen, Germany) και για την παρασκευή των λιποσωµάτων ράβδος υπερήχων (UP 200S, dr.ielscher Gmb, Berlin, Germany). To µέγεθος των σταγονιδίων στα γαλακτώµατα που παρασκευάστηκαν µετρήθηκε µε συσκευή Mastersizer 2000 (Malvern Inst., Malvern, UK). 48

Η ανάλυση των µεθανολικών εκχυλισµάτων έγινε σε υγρό χρωµατογράφο της εταιρείας Finnigan (Thermo-separation products, San Jose, USA). Το σύστηµα περιελάµβανε αντλία βαθµωτής έκλουσης τεσσάρων διαλυτών τύπου P4000 συνδεδεµένη σε σειρά µε ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών UV 6000 LP. Η εισαγωγή του δείγµατος έγινε µε βαλβίδα εισαγωγής Rheodyne 7125 (otati, A, USA), LP µε βρόχο 20 µl. Η καταγραφή, αποθήκευση και επεξεργασία των χρωµατογραφηµάτων και του φάσµατος κάθε χρωµατογραφικής κορυφής έγινε µε τη βοήθεια του λογισµικού hrom Quest για Windows NT, (Thermo Quest Inc., San Jose, USA). Η ανάλυση των µεθανολικών εκχυλισµάτων από τα φυτά Fraxinus chinensis και Syringa oblata µε PL UV-MS έγινε και σε σύστηµα TSP Spectra από την εταιρεία Finnigan (Thermo-separation products, San Jose, USA) στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Πανεπιστηµίου Wageningen, της Ολλανδίας. Το σύστηµα περιελάµβανε έναν ρυθµιστή τύπου SN 4000, αντλία βαθµωτής έκλουσης τεσσάρων διαλυτών τύπου P4000, αυτόµατο δειγµατολήπτη AS3000, ανιχνευτή υπεριώδους UV2000 και έναν αναλυτή µάζας παγίδας ιόντων τύπου Finnigan LQ. Ως πηγή ιόντων χρησιµοποιήθηκε ιονισµός ψεκασµού ηλεκτρονίων (Electron Spray Ionization, ESI). καταγραφή και επεξεργασία των δεδοµένων έγινε µε το λογισµικό Finnigan Xcalibur (Thermo Quest, Breda, The Netherlands). 3.6 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΟΜΗΣ- ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ. 3.6.1 Εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών 3.6.1.1 οκιµή µε τη σταθερή ρίζα DPP 3.6.1.1α Ανάπτυξη µεθοδολογίας για τη γρήγορη δοκιµή Σε γυάλινη κυψελίδα µεταφέρθηκαν 2960 µl αιθανολικού διαλύµατος DPP 0,1 mm και σε αυτά προστέθηκαν 40 µl αιθανολικού διαλύµατος αντιοξειδωτικού (ΑΗ) 1 mm ώστε ο λόγος [ΑΗ]/[DPP ] στην κυψελίδα να είναι 0,13. Αµέσως µετρήθηκε η απορρόφηση στα 516 nm, που µετρήθηκε και µετά από παρέλευση 10 min σύµφωνα µε το πρωτόκολλο των Pekkarinen et al. (1999), καθώς και µετά από παρέλευση 15 και 20 min. Για τον περιορισµό του πειραµατικού σφάλµατος οι κυψελίδες θερµοστατήθηκαν 49

στους 25 ο. Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως %RSA=[Abs 516 (t=0) Abs 516 (t)] 100/Abs 516 (t=0). Οι µετρήσεις για κάθε ΑΗ πραγµατοποιήθηκαν εις τριπλούν. Στο τέλος κάθε σειράς µετρήσεων έγινε και λευκός προσδιορισµός για τη διόρθωση των τιµών %RSA. Η πειραµατική διαδικασία πραγµατοποιήθηκε επίσης και για λόγους [AΗ]/[DPP ] 0,25 και 0,5. Στην περίπτωση αυτή οι αντίστοιχες αρχικές συγκεντρώσεις των διαλυµάτων των ΑΗ ήταν 1,85 mm και 3,7 mm. Ο έλεγχος της επαναληψιµότητας της µεθόδου έγινε µε την πραγµατοποίηση πολλαπλών µετρήσεων για το καφεϊκό οξύ (V%=±0,6 για %RSA= 46,7 και n=5). Τέλος, η παραπάνω πειραµατική διαδικασία εφαρµόσθηκε για το λόγο [AΗ]/[DPP ]= 0,25 και µε διαλύτη α) ακετονιτρίλιο και β) τριτοταγή βουτυλική αλκοόλη. 3.6.1.1β Παρακολούθηση της αντίδρασης µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης Σε γυάλινη κυψελίδα µεταφέρθηκαν 2,9 ml αιθανολικού διαλύµατος DPP (0,1 mm) και προστέθηκε 0,1 ml διαλύµατος που περιείχε αντιοξειδωτικό (ΑΗ) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (εκφρασµένες ως [AΗ]/[DPP ], mol/mol). Η µείωση της συγκέντρωσης της DPP παρακολουθήθηκε µε µετρήσεις της απορρόφησης στα 516 nm µέχρι η αντίδραση να φτάσει σε σταθερή κατάσταση (steady state). Η ακριβής συγκέντρωση της ρίζας στο µίγµα της αντίδρασης υπολογίστηκε µε βάση την καµπύλη αναφοράς που κατασκευάστηκε από τις απορροφήσεις διαλυµάτων της ρίζας µε συγκεντρώσεις από 0,1 mm έως 0,01 mm. Για κάθε χρησιµοποιούµενη συγκέντρωση ΑΗ έγινε διάγραµµα κινητικής της αντίδρασης. Από τα διαγράµµατα αυτά υπολογίστηκε η συγκέντρωση της ρίζας στη σταθερή κατάσταση (ως % της αρχικής συγκέντρωσης). Στη συνέχεια κατασκευάστηκε διάγραµµα της συγκέντρωσης της ρίζας (ως % της αρχικής συγκέντρωσης) στη σταθερή κατάσταση ως συνάρτηση του λόγου [AΗ]/[DPP ]. Τα νέα διαγράµµατα που προέκυψαν χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό της αποτελεσµατικής συγκέντρωσης (Εfficient oncentration, E 50 ) δηλ. της ποσότητας του αντιοξειδωτικού που απαιτείται για την ελάττωση της αρχικής συγκέντρωσης της DPP κατά 50%. [Χαµηλότερη τιµή της E 50 συνεπάγεται υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση]. Επιπλέον υπολογίστηκαν η ικανότητα δέσµευσης ελεύθερης ρίζας (Antiradical Power, ARP) που ορίζεται ως 1/E 50 καθώς και ο χρόνος Τ E50 που είναι απαραίτητος για την επίτευξη της σταθερής κατάστασης όταν η συγκέντρωση είναι ίση µε την αποτελεσµατική (E 50 ). Ο χρόνος Τ E50 χρησιµοποιήθηκε στη συνέχεια για τον υπολογισµό της αποτελεσµατικότητας δέσµευσης ελευθέρων 50

ριζών (Antiradical Efficiency, ΑΕ) που ορίζεται ως 1/E 50 Τ E50 (Sanchez-Moreno et al., 1998). Για τη µελέτη της επίδρασης του διαλύτη στην αντιοξειδωτική δράση του καφεϊκού, διυδροκαφεϊκού και ροσµαρινικού οξέος πραγµατοποιήθηκαν σειρές πειραµάτων για λόγους συγκεντρώσεων [AΗ]/[DPP ] (0,1, 0,15, 0,2 και 0,25). Η πειραµατική διαδικασία στην περίπτωση του καφεϊκού οξέος και των παραγώγων του επαναλήφθηκε τρεις φορές για κάθε ένωση και έξι διαφορετικές συγκεντρώσεις [AΗ]/[DPP ]. Οι τιµές των λόγων [AΗ]/[DPP ] ήταν διαφορετικές για κάθε ένωση και επιλέχθηκαν µε βάση τη δραστικότητά τους µετά από σειρά δοκιµαστικών πειραµάτων. Στην περίπτωση πειραµάτων µε το φερουλικό οξύ και τις συγγενείς µε αυτό ΑΗ πραγµατοποιήθηκαν σειρές πειραµάτων για οκτώ διαφορετικούς λόγους συγκεντρώσεων [AΗ]/[DPP ] που ήταν 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 0,55, 0,6 και 0,8. 3.6.1.2 οκιµή µε τη ρίζα ABTS + ιάλυµα ρίζας ABTS + παρασκευάσθηκε µε ανάµειξη 5 ml ενός υδατικού διαλύµατος ABTS συγκέντρωσης 7mM και 88 µl υδατικού διαλύµατος K 2 S 2 8 συγκέντρωσης 140 mm (2,45 mm τελική συγκέντρωση) σύµφωνα µε τους Re et al. (1999). Το διάλυµα αυτό µετά από παρέλευση 16 h αραιώθηκε µε αιθανόλη έτσι ώστε το νέο διάλυµα να παρουσιάζει απορρόφηση 0,7 ±0,05 στα 734 nm (διάλυµα εργασίας). Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν διαλύµατα των υπό εξέταση ΑΗ σε αιθανόλη κατάλληλης συγκέντρωσης ώστε η τελική συγκέντρωση στο διάλυµα αντίδρασης να είναι 0-15 µμ. Ορισµένη ποσότητα διαλύµατος ΑΗ (10 µl) προστέθηκε σε 1 ml διαλύµατος εργασίας της ρίζας και η απορρόφηση στα 734 nm καταγράφηκε σε χρόνο 0 min και µετά από 6 min. Με βάση τα πειραµατικά δεδοµένα κατασκευάστηκαν διαγράµµατα συγκέντρωσης ως προς την % ελάττωση της απορρόφησης. Από τα διαγράµµατα αυτά υπολογίστηκε η συγκέντρωση του Trolox για την οποία η % ελάττωση της απορρόφησης της κατιοντικής ρίζας στα 734 nm ήταν ανάλογη µε εκείνη διαλύµατος 1mM αντιοξειδωτικού. Η τιµή αυτή υπολογίστηκε από διάγραµµα τριών σηµείων και κάθε τιµή αντιστοιχούσε στο µ.ο. τριών µετρήσεων. Για κάθε ένωση και συγκέντρωση οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η παραπάνω πειραµατική διαδικασία πραγµατοποιήθηκε για τα παράγωγα του κινναµωµικού οξέος και παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών αλάτων (p=7.4). 51

3.6.2 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µε επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης τριελαΐνης 3.6.2.1α Προετοιµασία υποστρώµατος Ως υπόστρωµα χρησιµοποιήθηκε τριελαΐνη απαλλαγµένη από προ- /αντιοξειδωτικούς παράγοντες. Ο καθαρισµός του υποστρώµατος έγινε µε χρωµατογραφία στήλης. Το έλαιο (100g /500mL κ-εξανίου) καθαρίσθηκε διαδοχικά σε τρεις χρωµατογραφικές στήλες (60 cm x 4 cm i.d.). Οι δύο πρώτες στήλες πληρώθηκαν µε 45 g µίγµατος ενεργού άνθρακα και γης διατόµων (1:2 m/m). Η τρίτη πληρώθηκε µε 90 g ενεργοποιηµένου πυριτικού οξέος (Ψωµιάδου, 2000). Η ενεργοποίηση του πυριτικού οξέος έγινε αφού προηγήθηκε πλύση µε αποσταγµένο νερό (3 φορές) και µεθανόλη (2 φορές) και ξήρανση σε φούρνο στους 120 ο για 12 ώρες και στους 200 ο για άλλες 12 ώρες. Η συλλογή του προϊόντος έκλουσης από τη στήλη έγινε σε προζυγισµένη φιάλη και συνεχίστηκε µέχρις ότου όλη η ποσότητα του διαλύτη διήλθε από τη στήλη. Η αποµάκρυνση του διαλύτη έγινε σε περιστροφικό εξατµιστήρα κενού στους 40 o. Μετά από την αποµάκρυνση και των ιχνών του διαλύτη µε διαβίβαση αζώτου υπολογίστηκε σταθµικά η απόδοση της διαδικασίας του καθαρισµού και η καθαρισµένη τριελαΐνη αποθηκεύθηκε σε καταψύκτη στους 23. Η αποµάκρυνση χλωροφυλλών και καροτενοειδών κατά τα διάφορα στάδια καθαρισµού ελέγχθηκε υγροχρωµατογραφικά µε βάση τη µέθοδο των Psomiadou and Tsimidou (1998). Η πλήρης αποµάκρυνση προοξειδωτικών και αντιοξειδωτικών έγινε δυνατή µε τη διέλευση του υλικού από τις δύο στήλες του ενεργού άνθρακα. Η στήλη του πυριτικού οξέος κρίθηκε απαραίτητη για την αποµάκρυνση ενός πολικού συστατικού, η παρουσία του οποίου διαπιστώθηκε υγροχρωµατογραφικά. Η επιτυχία ή µη του καθαρισµού της τριελαΐνης από προ-/αντιοξειδωτικούς παράγοντες εκτιµήθηκε και µε προσδιορισµούς φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών της µετά από κάθε χρωµατογραφικό καθαρισµό. Ο αριθµός υπεροξειδίων, οι σταθερές K 232, K 270 (όπου K λmax = απορρόφηση στο λ max / (g/100 ml) ) προσδιορίστηκαν σύµφωνα µε τις σχετικές µεθόδους της IUPA (IUPA, 1987). Η παρουσία των χρωστικών ελέγχθηκε και µε µετρήσεις της απορρόφησης στα 430, 460, 550, 630 και 670 nm. Η εξέταση της σύστασης των υποστρωµάτων σε τριακυλογλυκερόλες έγινε υγροχρωµατογραφικά (E, 1991). Τα ποιοτικά χαρακτηριστικά της τριελαΐνης δίνονται στο Παράρτηµα (Πίνακας Π1-Π3). 52

3.6.2.1β οκιµή πυριατηρίου στους 45 ο Σε κωνικές φιάλες (100 ml) ζυγίσθηκε καθορισµένη ποσότητα καθαρισµένης τριελαΐνης (3.6.2.1α) στην οποία προστέθηκαν οι υπό µελέτη ΑΗ µε τη µορφή διαλύµατος κατάλληλης συγκέντρωσης σε αιθανόλη. Στη συνέχεια ο διαλύτης αποµακρύνθηκε µε διαβίβαση αζώτου στο σκοτάδι και µαγνητική ανάδευση σε θερµοκρασία δωµατίου. Ποσότητα 2,5 g από κάθε σειρά δειγµάτων µεταφέρθηκε σε διαφανή γυάλινα φιαλίδια (18 mm i.d.) ποιότητας pharmacopeia. Οι ζυγίσεις έγιναν σε µικροαναλυτικό ζυγό (±0,001 g). Η πορεία της οξείδωσης παρακολουθήθηκε µε περιοδική µέτρηση του αριθµού υπεροξειδίων. Οι µετρήσεις έγιναν σε 1 g δείγµατος. Όλοι οι προσδιορισµοί έγιναν εις διπλούν µετά από έλεγχο της επαναληψιµότητας των µεθόδων. Η επαναληψιµότητα της µεθόδου προσδιορισµού του αριθµού υπεροξειδίων ήταν V%=±2,6 για A.Y.=10 meq 2 /kg, n=7. Η συγκέντρωση της ΑΗ στην τριελαΐνη ήταν 10 mg/kg (καφεΐκό οξύ, διυδροκαφεϊκό οξύ, Trolox, υδροξυτυροσόλη, ελαιοευρωπαΐνη) και 30 mg/kg (ευγενόλη, ισοευγενόλη, διυδροευγενόλη, φερουλικό οξύ, αιθυλεστέρας του φερουλικού οξέος, κωνιφερυλική αλδεΰδη, κωνιφερυλική αλκοόλη). 3.6.3 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µε επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης σε συστήµατα διασποράς 3.6.3.1 Λιποσώµατα λεκιθίνης είγµατα λιποσωµάτων από λεκιθίνη σόγιας παρασκευάσθηκαν ως εξής: Αρχικά έγινε διασπορά 3 g λεκιθίνης σε 50 ml δις-αποσταγµένο νερό (το νερό προστέθηκε µε προχοΐδα), µε τη βοήθεια γυάλινης ράβδου, πεπλατυσµένης στο ένα άκρο. Ακολούθως έγινε οµογενοποίηση σε συσκευή υπερήχων τύπου ράβδου (10 ml διαλύµατος λιποσωµάτων για 2,5 min περίπου). Ο συνολικός χρόνος οµογενοποίησης ήταν 12 min. Στη συνέχεια σε εσµυρισµένες κωνικές φιάλες των 100 ml προστέθηκαν µε τη σειρά που αναφέρονται 0,5 ml διαλύµατος της ΑΗ (µε σιφώνιο ακριβείας), 4mL λιποσώµατος (επίσης µε τη βοήθεια σιφωνίου ακριβείας) και 25,5 ml δις-αποσταγµένου νερού (µε προχοϊδα), έτσι ώστε ο συνολικός όγκος του διαλύµατος να είναι 30 ml (Yi et al., 1997). Η τελική συγκέντρωση στο σύστηµα των ισοευγενόλης, ευγενόλης, διυδροευγενόλης και Trolox ήταν αντίστοιχα 5, 15 και 30 µμ. Για την περίπτωση των ενώσεων καφεϊκού και διυδροκαφεϊκού οξέων οι τελικές συγκεντρώσεις που 53

χρησιµοποιήθηκαν ήταν 5, 10, 15, 30, 45, 60, 80, 150 και 500 µμ. Μετά την προσθήκη του αντιοξειδωτικού στο σύστηµα ακολούθησε νέα οµογενοποίηση για 2 min σε λουτρό υπερήχων και µέτρηση της απορρόφησης (χρόνος µηδέν). Η επιταχυνόµενη οξείδωση των λιποσωµάτων έγινε δυνατή µε την προσθήκη 30 µl οξικού χαλκού (3 µμ) υπό ανάδευση (120 rpm, 37 ο ). Η απορρόφηση του δείγµατος στα 234 nm καταγράφηκε κάθε 24 h για 4 µέρες µε ζύγιση 0,1 g δείγµατος σε ογκοµετρική φιάλη των 5mL και πλήρωση µε µεθανόλη µέχρι τη χαραγή. Τα αποτελέσµατα εκφράσθηκαν ως υδροϋπεροξείδια (mmole/kg φωσφατιδυλοχολίνης). Η συγκέντρωση των υδροϋπεροξειδίων (mole/l) υπολογίστηκε από την εξίσωση Lambert-Beer: A=ε b όπου ε=26000 L/cm.mol, και στη συνέχεια έγινε µετατροπή σε mmol/kg (han and Levett, 1977). 3.6.3.2 Γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό Παρασκευάστηκαν γαλακτώµατα ελαίου σε νερό (10% w/w) (~50 ml) σε κωνικές φιάλες των 100 ml. Τα γαλακτώµατα παρασκευάστηκαν µε ανάµειξη 44,5 ml νερού, 4,8 g τριελαΐνης καθαρισµένης από αντι-/προοξειδωτικούς παράγοντες (βλ. 3.6.2.1α) και 0,49 g γαλακτωµατοποιητή Τween 20. Αρχικά έγινε προσθήκη του γαλακτωµατοποιητή στο νερό στάγδην µε µηχανική ανάδευση. Στη συνέχεια προστέθηκε στάγδην η τριελαΐνη. Η προσθήκη έγινε µε ελαφρά µηχανική ανάδευση. Ακολούθως το µίγµα οµογενοποιήθηκε για 1 min στις 13500 rpm. Το µέγεθος των σταγονιδίων ήταν 3,2 µm. Οι σειρές γαλακτωµάτων που παρασκευάστηκαν περιείχαν α) τις ευγενόλη, ισοευγενόλη, διυδροευγενόλη, και Trolox σε συγκεντρώσεις 15, 50 και 150 µμ (τελική συγκέντρωση ως προς το έλαιο) και β) το καφεϊκό οξύ και το διυδροκαφεϊκό οξύ σε συγκεντρώσεις 150, 300 και 1000 µμ. Το φερουλικό οξύ και οι συγγενείς µε αυτό ΑΗ µελετήθηκαν σε συγκέντρωση 150 µμ. Στην τελευταία περίπτωση γαλακτώµατα παρασκευάστηκαν τόσο µε αποσταγµένο νερό όσο και µε ρυθµιστικό διάλυµα οξικών (p 3,7 και 5,7). Η πορεία της αυτοξείδωσης (ανάδευση 120 rpm, 37 ο ) παρακολουθήθηκε µε περιοδική µέτρηση του αριθµού υπεροξειδίων µε τη µέθοδο του θειοκυανικού σιδήρου (ferric thiocyanate method) (Santha and Decker, 1994). Οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν κάθε 24h για 4 µέρες. 54

Ορισµένη ποσότητα γαλακτώµατος (20-35 µl) ανάλογα µε το βαθµό οξείδωσης αναµίχθηκε µε 9,8 ml µίγµατος χλωροφορµίου-µεθανόλης (7:3 v/v) σε κυλίνδρους που έφεραν πώµα και αναδεύτηκαν σε vortex για 2-4s. Στη συνέχεια προστέθηκαν 50 µl διαλύµατος θειοκυανικού αµµωνίου και ακολούθησε ανάµειξη για 2-4s και προσθήκη 50 µl διχλωριούχου σιδήρου µε νέα ανάµιξη. Μετά την παρέλευση 5 min µετρήθηκε η απορρόφηση του διαλύµατος στα 500 nm. Οι µετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Σε κάθε σειρά µετρήσεων πραγµατοποιήθηκε και λευκός προσδιορισµός. Η ποσοτική έκφραση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη βοήθεια καµπύλης αναφοράς µε τριχλωριούχο σίδηρο. Για την κατασκευή της χρησιµοποιήθηκαν διαλύµατα συγκέντρωσης 0-6 mg/ml. 50 µl από κάθε διάλυµα αναµείχθηκαν µε 9,8 ml µίγµατος χλωροφορµίου-µεθανόλης και στη συνέχεια για τη µέτρηση της απορρόφησης ακολουθήθηκε η πορεία που περιγράφηκε προηγουµένως. Ο αριθµός υπεροξειδίων (Α.Υ.) υπολογίστηκε από τη σχέση: (Α.Υ.)=(As-Ab-b)/a (55,84 m 0 ). Όπου Αs=απορρόφηση δείγµατος. Αb=απορρόφηση λευκού προσδιορισµού, a, b= οι συντελεστές της καµπύλης αναφοράς y=ax + b, m 0 = η µάζα σε g του ελαίου στο γαλάκτωµα. Για γαλακτώµατα 10% w/w, m 0 =0,1 µάζα σε g γαλακτώµατος. Για διευκόλυνση του αναγνώστη παρουσιάζονται αναλυτικά οι τρόποι παρασκευής των διαλυµάτων των αντιδραστηρίων που χρησιµοποιήθηκαν. i. ιάλυµα διχλωριούχου σιδήρου: 0,08 g διχλωριούχου βαρίου ζυγίστηκαν και µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml που συµπληρώθηκε µε νερό µέχρι τη χαραγή ( ιάλυµα Α). 0,1 g θειικού σιδήρου ζυγίστηκαν και µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml που συµπληρώθηκε µε νερό µέχρι τη χαραγή ( ιάλυµα Β). Το ιάλυµα Α προστέθηκε αργά και µε ανάδευση στο ιάλυµα Β. Στη συνέχεια προστέθηκαν 0,4 ml 10 N υδροχλωρικού οξέος. Μετά από παραµονή το υπερκείµενο υγρό διαχωρίστηκε από το θειικό βάριο που καταβυθίστηκε µε σιφώνιο. ii ιάλυµα θειοκυανικού αµµωνίου: 3 g θειοκυανικού αµµωνίου ζυγίστηκαν και µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml που συµπληρώθηκε µε νερό µέχρι τη χαραγή. Προσοχή: Το διάλυµα του διχλωριούχου σιδήρου πρέπει να παρασκευάζεται κάθε φορά λίγο πριν από τη χρήση. 55

3.6.4 Εκτίµηση της οξειδοαναγωγικής ικανότητας των βιοφαινολών µε τη χρήση του αντιδραστηρίου Folin-iocalteu Για κάθε υπό εξέταση ΑΗ παρασκευάστηκε µεθανολικό διάλυµα συγκέντρωσης 5 mm και από αυτό µε διαδοχικές αραιώσεις διαλύµατα συγκέντρωσης 0,5, 1 και 1,5 mm. Ορισµένη ποσότητα (500 µl) από το διάλυµα κάθε ΑΗ µεταφέρθηκε σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml όπου προστέθηκαν επίσης 5 ml νερού και 500 µl αντιδραστηρίου Folin-iocalteu. Ακριβώς µετά από τρία λεπτά προστέθηκε 1 ml κορεσµένου διαλύµατος Να 2 3 και το µίγµα αραιώθηκε στα 10 ml µε νερό. Μετά από µια ώρα αποθήκευσης στο σκοτάδι µετρήθηκε η απορρόφηση στα 725 nm ως προς διάλυµα αναφοράς. Με βάση τα πειραµατικά δεδοµένα κατασκευάστηκαν διαγράµµατα συγκέντρωσης της ΑΗ προς τη µετρούµενη απορρόφηση. Από τις καµπύλες που κατασκευάστηκαν για κάθε ΑΗ υπολογίστηκε η συγκέντρωση της ΑΗ για την οποία η απορρόφηση του διαλύµατος µέτρησης στα 725 nm ήταν ανάλογη µε εκείνη διαλύµατος 1 mm Trolox. Η τιµή αυτή υπολογίστηκε µε διαίρεση των τιµών της κλίσης της καµπύλης κάθε ΑΗ µε εκείνη της καµπύλης του Trolox. Τα αποτελέσµατα δόθηκαν ως µ.ο. τριών πειραµάτων. 3.6.5 Προσδιορισµός του συντελεστή κατανοµής (P) των βιοφαινολών σε µίγµα κ-οκτανόλης:νερού Παρασκευάστηκε διάλυµα (0,1 mm) της κάθε ΑΗ σε κ-οκτανόλη που θερµοστατήθηκε για 1 h στους 37 ο. Στη συνέχεια καταγράφηκε το φάσµα της ένωσης στο υπεριώδες και µετρήθηκε η απορρόφηση στο µέγιστο µήκος κύµατος Αmax 0. Ακολούθησε ανάµιξη ίσων όγκων (2 ml) διαλύµατος της ΑΗ σε κ-οκτανόλη και νερό σε vortex για 1 min. Μετά το διαχωρισµό των δύο στιβάδων, 1 ml από τη στιβάδα της κ-οκτανόλης µεταφέρθηκε µε σιφώνιο σε κατάλληλη κυψελίδα χαλαζία. Η απορρόφηση Αmax t τις οργανικής στιβάδας µετρήθηκε στο ίδιο µέγιστο µήκος κύµατος µετά από παραµονή 30 min και κατά τακτά χρονικά διαστήµατα µέχρις ότου να µην παρατηρείται σηµαντική διαφορά ανάµεσα σε δύο διαδοχικές µετρήσεις. Ο συντελεστής κατανοµής στην οργανική φάση Pο προσδιορίστηκε από τη σχέση: Pο=Αmax 0 /(Αmax 0 - Αmax t )= 0 /( 0 - t ). Για τα παράγωγα του φερουλικού οξέος ο δεκαδικός λογάριθµος 56

του συντελεστή κατανοµής (LogP) υπολογίστηκε µε τη βοήθεια του προγράµµατος hemdraw σύµφωνα µε τη µέθοδο των Broto et al. (1984). 3.6.6 Εκτίµηση της πολικότητας των βιοφαινολών µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας Η πολικότητα του φερουλικού οξέος και των συγγενών ΑΗ εκτιµήθηκε µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας σε πλάκες αλουµινίου διαστάσεων 20x20 cm επιστρωµένες µε Silica Gel 60, F 254, πάχους στιβάδας 0,2 mm της Merck (Darmstadt, Germany). Το σύστηµα ανάπτυξης που χρησιµοποιήθηκε ήταν l 3 /Me/ 3 (19:1:0.5, v/v/v) (Porter et al., 1989). Η πολικότητα των ενώσεων εκφράστηκε ως τιµή R f (Relative front) που είναι ίση µε το λόγο της απόστασης που διήνυσε η υπό µελέτη ένωση προς εκείνη που διήνυσε το σύστηµα ανάπτυξης (mm). 3.6.7. Στατιστική επεξεργασία αναλυτικών δεδοµένων Τα αποτελέσµατα των πειραµατικών δοκιµών για τη µελέτη των σχέσεων δοµής δραστικότητας αξιολογήθηκαν µε ανάλυση διασποράς (ΑΝΟVA). Οι διαφορές µεταξύ των µέσων όρων εκτιµήθηκαν µε τη δοκιµή Duncan s Multiple Range. Η πιθανότητα ήταν 0,05. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων πραγµατοποιήθηκε µε το πακέτο SPSS 7.5 (SPSS Inc., hicago, USA). 3.7 B3LYP ΚΑΙ AM1/B3LYP ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΣΧΕΣΕΩΝ ΟΜΗΣ-ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΒΙΟΦΑΙΝΟΛΩΝ Η γεωµετρία των δοµών των καφεϊκού και διυδροκαφεϊκού οξέος, και των µονοφαινολών ισοευγενόλης, διυδροευγενόλης και ευγενόλης βελτιστοποιήθηκαν µε την εφαρµογή της θεωρίας συναρτησιακού παράγοντα πυκνότητας (DFT) µε τη βοήθεια της συναρτησιακής B3LYP (Becke 3 Lee Yang Parr) και για την περίπτωση των αντίστοιχων φαινοξυ-ριζών µε τη βοήθεια της UB3LYP (Unrestricted B3LYP). Οι υπολογισµοί πραγµατοποιήθηκαν σε σύνολο βάσης 6-31+G(d) σύµφωνα µε τους Βakalbassis et al. (2001). Οι υπολογισµοί έγιναν στο Εργαστήριο Εφαρµοσµένης 57

Κβαντικής Χηµείας του ΑΠΘ υπό την επίβλεψη του Αναπλ. Καθηγητή Ε. Μπακάλµπαση. Ως ολική ενθαλπία για τη µητρική ένωση στους 298 K ορίζεται το άθροισµα της θερµικής διόρθωσης της ενθαλπίας και της ενέργειας που υπολογίζεται από τη συναρτησιακή B3LYP καθώς για το σχηµατισµό της φαινοξυ-ρίζας ένα άτοµο υδρογόνου αποµακρύνεται από το φαινολικό υδροξύλιο σε κάθε µητρική ένωση. Η ολική ενθαλπία για τη φαινοξυ-ρίζα στους 298 K ορίζεται ως το άθροισµα της θερµικής διόρθωσης της ενθαλπίας και της ενέργειας που υπολογίζεται από τη συναρτησιακή UB3LYP. Στον υπολογισµό της ενθαλπίας διάσπασης δεσµού BDE συµπεριλαµβάνεται και η ενθαλπία του ατόµου υδρογόνου στους 298 Κ. Στην τιµή της θερµικής διόρθωσης της ενθαλπίας περιλαµβάνεται και η τιµή της ενέργειας µηδενικού σηµείου. Η BDE στους 298 K ορίζεται ως η διαφορά στην ενθαλπία της αντίδρασης: Ar Ar + όπου, Ar, Ar και είναι η µητρική ένωση, η αντίστοιχη φαινοξυ ρίζα και το άτοµο υδρογόνου. Η γεωµετρία του φερουλικού οξέος και των συγγενών µε αυτό ενώσεων καθώς και της ελαιοευρωπαΐνης, του λιγκστροζίτη και των συγγενών τους ενώσεων βελτιστοποιήθηκαν µε την εφαρµογή του Μοντέλου Austin 1 (Dewar et al., 1985). Για τις βελτιστοποιηµένες δοµές υπολογίστηκε στη συνέχεια η ολική ενθαλπία µε εφαρµογή της συναρτησιακής B3LYP σε σύνολο βάσης 6-311+G (2d, 2p) και της RB3LYP για τις αντίστοιχες φαινοξυ- ρίζες στο ίδιο σύνολο βάσης (Wright et al., 2001). Μόνο στην περίπτωση της ελαιοευρωπαΐνης, του λιγκστροζίτη και των συγγενών ενώσεων για τον υπολογισµό της BDE χρησιµοποιήθηκε ως σύνολο βάσης το 6-31G (,p ), όπου το p έχει τιµή 1,0 (Wright et al., 1997). Για τις υπό µελέτη ενώσεις εκτός από την τιµή BDE υπολογίστηκε και η τιµή του δυναµικού ιοντισµού IP. Ως ΙΡ στους 298 K ορίζεται η διαφορά της ενθαλπίας της αντίδρασης Ar ArΗ + όπου, Ar και ArΗ + είναι η µητρική ένωση και η αντίστοιχη κατιοντική ρίζα που προκύπτει µε την απόδοση µονήρους ηλεκτρονίου από τη µητρική ένωση. Στην περίπτωση του φερουλικού οξέος και παραγώγων του ως σύνολο βάσης χρησιµοποιήθηκε το 6-31G(d). Στην περίπτωση της ελαιοευρωπαΐνης, του λιγκστροζίτη 58

και των συγγενών ενώσεων το σύνολο βάσης ήταν το ίδιο που χρησιµοποιήθηκε κατά τον υπολογισµό της BDE για τις ενώσεις αυτές. Οι υπολογισµοί αυτοί πραγµατοποιήθηκαν στο Εργαστήριο omputational hemistry and Bioinformatics του Πανεπιστηµίου Zibo (Shandong, Λ.. Κίνας), υπό την επίβλεψη του Καθηγητή ong Yu Zhang. Όλοι οι παραπάνω υπολογισµοί πραγµατοποιήθηκαν µε τη χρησιµοποίηση του λογισµικού Gaussian 98 για Windows. 3.8 ΠΑΡΑΛΑΒΗ, ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ ΑΠΟ ΦΥΤΑ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ LEAEAE 3.8.1 Παρασκευή µεθανολικών εκχυλισµάτων Ποσότητα 1 g λυοφιλιωµένων φύλλων από κάθε φυτό που τεµαχίστηκαν σε οικιακό µύλο πριν από την εκχύλιση τοποθετήθηκαν σε κωνικές φιάλες των 250 ml και εκχυλίστηκαν µε 50 ml µεθανόλης υπό ανάδευση (100 rpm) σε θερµοκρασία δωµατίου για 24 h. Οι φιάλες κατά τη διάρκεια της εκχύλισης διατηρήθηκαν στο σκοτάδι και κλειστές µε φύλλο αλουµινίου για την αποφυγή εξάτµισης του διαλύτη. Μετά το πέρας της εκχύλισης το εκχύλισµα διηθήθηκε και ο διαλύτης αποµακρύνθηκε σε περιστρεφόµενο εξατµιστήρα κενού (37 ο ). Στην περίπτωση των φυτών F. chinensis και S. oblata παρασκευάστηκε και δεύτερη σειρά εκχυλισµάτων σε λουτρό υπερήχων (30 min). 3.8.2 Χρωµατοµετρικός προσδιορισµός ολικών φαινολών Ο προσδιορισµός των ολικών φαινολικών συστατικών έγινε χρωµατοµετρικά µε τη χρησιµοποίηση του αντιδραστηρίου Folin-iocalteu. Περίπου 6 mg του µεθανολικού εκχυλίσµατος διαλύθηκαν σε 10 ml µεθανόλης. Στη συνέχεια 0,5 ml από το παραπάνω διάλυµα αραιώθηκαν µε 5 ml νερού σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml και προστέθηκαν 0,5 ml αντιδραστηρίου Folin- iocalteu. Μετά την πάροδο 3min από την προσθήκη του αντιδραστηρίου Folin- iocalteu προστέθηκε 1 ml κορεσµένου διαλύµατος Να 2 3 (35%) και έγινε αραίωση µε νερό στα 10 ml. Μετά από παρέλευση µιας ώρας µετρήθηκε η απορρόφηση στα 725 nm ως προς διάλυµα αναφοράς (Tsimidou et al., 1992). Με τη βοήθεια καµπύλης αναφοράς που κατασκευάστηκε µε χρησιµοποίηση διαλυµάτων καφεϊκού οξέος (10-120 59

µg\10 ml), υπολογίστηκε η συγκέντρωση των ολικών φαινολών εκφρασµένη σε καφεϊκό οξύ (ως mg/g ξηρού φυτικού εκχυλίσµατος). 3.8.3 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας µεθανολικών εκχυλισµάτων µε τη δοκιµή DPP Η εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης των φυτικών εκχυλισµάτων έγινε ως εξής. Σε γυάλινη κυψελίδα µεταφέρθηκαν 2,9 ml µεθανολικού διαλύµατος DPP 0,1 mμ και σε αυτά προστέθηκε 0,1 ml διαλύµατος 600 mg/kg ως προς φυτικό εκχύλισµα. Η απορρόφηση στα 516 nm µετρήθηκε σε χρόνο 0 και 30 min. Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν ως %RSA (V%=±1,2 και n=5). 3.8.4 Εξέταση µεθανολικών εκχυλισµάτων για την παρουσία φαινολών µε χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών (DAD) Ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός των φαινολικών συστατικών έγινε σε έγινε συγκριτικά σε χρωµατογραφική στήλη αντίστροφης φάσης Nucleosil 100 18, 5 µ (250 4,6 mm) και σε hromolith RP-18e (100 4,6 mm) της Merck, (Darmstadt, Germany) σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Το αρχικό σύστηµα έκλουσης ήταν αυτό που περιγράφεται από τους Pirisi et al. (2000). To σύστηµα αυτό χρησιµοποιήθηκε µετά από τροποποίηση στην τελική εξέταση των φυτικών εκχυλισµάτων µε τη στήλη hromolith και ήταν 2 (3,5 % οξικό οξύ, p=3,1) (A) και ακετονιτρίλιο (B) µε ροή 0,9 ml/min. Για το διαχωρισµό των φαινολικών συστατικών χρησιµοποιήθηκε σύστηµα βαθµωτής έκλουσης: 0-1min, 4% (B), 1-26 min, 30% (B), 26-36 min, 60% (B), 36-46 min, 60% (B), 46-50 min, 98% (B), 50-60 min, 4% (B). Ο ενέσιµος όγκος ήταν 10 µl. Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης έγινε καταγραφή του UV-Vis φάσµατος κάθε χρωµατογραφικής κορυφής στο εύρος 190-450 nm µε ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών. Η λήψη των χρωµατογραφηµάτων έγινε στα 254 nm και στα 280 nm. 60

3.8.5 Χαρακτηρισµός φαινολικών συστατικών µε χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης και ανιχνευτές υπεριώδους (UV) και µαζών (MS) σε σειρά Ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός των φαινολικών συστατικών έγινε σε χρωµατογραφική στήλη αντίστροφης φάσης Alltima 5 µ και διαστάσεων 150 x 2,1 mm. (Alltech, Associates, Inc., Deerfield, IL, USA). Το σύστηµα έκλουσης για το διαχωρισµό των συστατικών ήταν 2 (0,1 % µυρµηκικό οξύ, p=2,9) (A) και ακετονιτρίλιο (B) µε ροή 0,18 ml/min. Η βαθµωτή έκλουση των συστατικών έγινε όπως και στην παράγραφο 3.8.4. Ο ενέσιµος όγκος του δείγµατος ήταν 10 µl. Οι τιµές των παραµέτρων κατά την ανάλυση υπό συνθήκες ESI-NI είχαν ως εξής: Τάση ψεκασµού 4.5 kv (εφαρµογή στο άκρο της βελόνας ψεκασµού), φέρον αέριο (N 2 ) 79 (arbitary units), βοηθητικό αέριο (N 2 ) 55 (arbitary units), θερµοκρασία τριχοειδούς σωλήνα 200 ο και τάση στον τριχοειδή σωλήνα -12.00 V. Η βαθµονόµηση του φασµατογράφου µάζας έγινε µε εισαγωγή µεθανολικού διαλύµατος ελαιοευρωπαΐνης ως εξής: ύο σύριγγες τύπου amilton συνδέθηκαν µε την πηγή ιόντων ESI µε σύνδεσµο τύπου T έτσι ώστε κατά τη συνεχή έγχυση της ελαιοευρωπαΐνης κινητή φάση ίδιας σύστασης µε εκείνη µε την οποία εκλούεται η ένωση προστίθεται από τη δεύτερη σύριγγα για την προσοµοίωση των συνθηκών ανάλυσης. Η ανάµιξη και η έγχυση των δύο διαλυµάτων στην πηγή ιόντων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση ειδικής αντλίας (amilton, NV, USA) και ροή 5 µl/min. Η σάρωση ρυθµίστηκε να γίνει για m/z 70 800 µε ταχύτητα 0,50 s. Η λήψη των χρωµατογραφηµάτων έγινε στα 254 και 280 nm. Η ταυτοποίηση της ελαιοευρωπαΐνης έγινε µε καταγραφή του φάσµατος µάζας του ιόντος (Μ-Η ) και σύγκριση του µε το αντίστοιχο πρότυπης ένωσης (m/z 539,1) καθώς και µε σύγκριση της ΜS/MS θραυσµατοποίησης του ιόντος (Μ-Η ) που οδηγεί στο σχηµατισµό του ιόντος της αντίστοιχης αγλυκόνης (m/z 377). Η παραπάνω εργασία έγινε υπό την επίβλεψη του Επικ. καθηγητή Jacques Vervoort στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Πανεπιστηµίου Wageningen της Ολλανδίας. 61

4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ

4.1 ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΓΡΗΓΟΡΗΣ ΟΚΙΜΗΣ DPP ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ SAR ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ Ο κυριότερος µηχανισµός δράσης των ΑΗ είναι η δέσµευση ελευθέρων ριζών µε απόδοση ατόµου υδρογόνου. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 1.3.2.1, από τις υπάρχουσες µεθοδολογίες για την εκτίµηση αυτής της ιδιότητας, η περισσότερο χρησιµοποιούµενη µεταξύ των ερευνητών στα πεδία των Επιστηµών Τροφίµων και Υγείας είναι εκείνη που βασίζεται στην αντίδραση των ΑΗ µε τη σταθερή ελεύθερη ρίζα DPP. Τα πρωτόκολλα που ακολουθούνται για το σκοπό αυτό είναι δύο, εκείνο της γρήγορης δοκιµής και εκείνο της παρακολούθησης της αντίδρασης µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης (βλ. 1.3.2.1). Η χρησιµοποίηση της γρήγορης δοκιµής γίνεται κατεξοχήν για την αξιολόγηση µιγµάτων βιοφαινολών όπως τα φυτικά εκχυλίσµατα. Προσεκτική µελέτη της βιβλιογραφίας έδειξε ότι οι διάφοροι ερευνητές συχνά προτιµούν τη γρήγορη δοκιµή, ως απλούστερη και λιγότερο επίπονη, αλλά και για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας καθαρών βιοφαινολών (hen and o, 1997, Pekkarinen et al., 1999, Kikuzaki et al., 2002, Son and Lewis, 2002). Παρόλα αυτά, έχει παρατηρηθεί ότι µε την εφαρµογή της γρήγορης δοκιµής, ακόµα και για τις ίδιες ενώσεις, τα αποτελέσµατα των διαφόρων ερευνητών δεν είναι πάντοτε συγκρίσιµα. Πιθανή αιτία για τις παρατηρούµενες διαφορές φαίνεται ότι είναι οι εκάστοτε πειραµατικές συνθήκες. Οι συνθήκες της ανάλυσης µπορεί να οδηγήσουν και σε αντικρουόµενα συµπεράσµατα για τη δραστικότητα των ΑΗ (Pekkarinen et al., 1999, Kikuzaki et al., 2002). Ως εκ τούτου και για τις ανάγκες της παρούσας διατριβής κρίθηκε αναγκαία η διερεύνηση των αναλυτικών παραµέτρων που είναι δυνατό να επηρεάσουν την εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν τη DPP. Έτσι µελετήθηκε α) η επίδραση της χρονικής διάρκειας της παρακολούθησης της αντίδρασης αλλά και της διαφορετικής σχετικής συγκέντρωσης αντιοξειδωτικού [AΗ]/[DPP ] (mol/mol) και β) η επίδραση του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση στη δραστικότητα ενός µεγάλου αριθµού ΑΗ. Οι φαινολικές ενώσεις που εξετάστηκαν ήταν I) παράγωγα του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος, II) ελαιοευρωπαΐνη, υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη, III) α-τοκοφερόλη και γνωστά συνθετικά φαινολικά αντιοξειδωτικά που συχνά χρησιµοποιούνται ως ενώσεις αναφοράς σε δοκιµές εκτίµησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Οι συντακτικοί τύποι όλων των ενώσεων δίνονται για εποπτικούς λόγους στο Σχήµα 4.1. 63

B A Ι D E A A B D E Ροσµαρινικό οξύ ιυδροκαφεϊκό οξύ 2-2 - Καφεϊκό οξύ =- Χλωρογενικό οξύ Σιναπικό οξύ 3 3 =- Φερουλικό οξύ 3 =- Ισοφερουλικό οξύ 3 =- ο- Κουµαρικό οξύ =- µ- Κουµαρικό οξύ =- π- Κουµαρικό οξύ =- trans- Κινναµωµικό οξύ =- II 3 Glc ελαιοευρωπαΐνη υδροξυτυροσόλη τυροσόλη III t-bu t-bu t-bu t-bu 3 3 BA BT TBQ 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Trolox α-τοκοφερόλη Σχήµα 4.1 Υπό µελέτη φαινολικές ενώσεις: I) παράγωγα του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος, II) ελαιοευρωπαΐνη, υδροξυτυροσόλη και τυροσόλη και III) α-τοκοφερόλη και γνωστά συνθετικά φαινολικά αντιοξειδωτικά 64

4.1.1 Επίδραση του χρόνου αντίδρασης και της σχετικής συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού Η αντίδραση πραγµατοποιήθηκε σύµφωνα µε το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Pekkarinen et al. (1999) και περιλαµβάνει την πραγµατοποίηση της αντίδρασης για σχετική συγκέντρωση [AΗ]/[DPP ]=0,13 και την καταγραφή της απορρόφησης του διαλύµατος της ρίζας µετά από διάστηµα 10 min. Για τη µελέτη της επίδρασης του χρόνου και της σχετικής συγκέντρωσης [AΗ]/[DPP ] η απορρόφηση του διαλύµατος της ρίζας καταγράφηκε και µετά από διάστηµα 15 και 20 min. Η πειραµατική διαδικασία επαναλήφθηκε και για σχετικές συγκεντρώσεις [AΗ]/[DPP ] 0,25 και 0,5. Ο διαλύτης που χρησιµοποιήθηκε ήταν η αιθανόλη που αναφέρεται στις περισσότερες εφαρµογές, καθώς οι περισσότερες φαινολικές ενώσεις που έχουν εξεταστεί µε αυτή τη δοκιµή είναι πολικές (Blois, 1958, hnishi et al., 1994, hen et al., 1999, Pekkarinen et al., 1999, Silva et al., 2000). Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.1. Η σειρά παρουσίασης των ενώσεων έγινε σύµφωνα µε την ελάττωση της ικανότητας δέσµευσης της ελεύθερης ρίζας όπως αυτή προέκυψε από τη µελέτη για σχετική συγκέντρωση [AΗ]/[DPP ]=0,13. Με βάση τις τιµές %RSA φαίνεται ότι ΑΗ µε διαφορετικά δοµικά χαρακτηριστικά µπορούν να διαφοροποιηθούν ως προς την αντιοξειδωτική τους συµπεριφορά µε την εφαρµογή της γρήγορης δοκιµής µε τη DPP. Ο αριθµός των φαινολικών υδροξυλίων είναι καθοριστικός για την αποτελεσµατική δέσµευση ελευθέρων ριζών, όπως φάνηκε και για τις τρεις οµάδες ΑΗ που µελετήθηκαν. Έτσι, οι ΑΗ µε περισσότερα από ένα φαινολικά υδροξύλια (π.χ. διυδροκαφεϊκό οξύ, ροσµαρινικό οξύ, καφεϊκό οξύ) βρέθηκαν να είναι οι πιο αποτελεσµατικές ακόµα και σε χαµηλές τιµές του λόγου [AΗ]/[DPP ]. ΑΗ που διέθεταν µεθοξυ- οµάδες (π.χ. φερουλικό, ισοφερουλικό οξύ) ακολουθούσαν σε σειρά δραστικότητας, ενώ ενώσεις µε ένα µόνο φαινολικό υδροξύλιο και κανένα άλλο υποκαταστάτη ήταν σχεδόν αδρανείς. Στην περίπτωση των παραγώγων του π- υδροξυκινναµωµικού οξέος διαπιστώθηκε ότι το ροσµαρινικό οξύ ήταν 1,1 φορά λιγότερο δραστικό από το διυδροκαφεϊκό οξύ. Επίσης, η εισαγωγή και δεύτερης µεθοξυ- οµάδας στον αρωµατικό δακτύλιο (σιναπικό οξύ) φάνηκε ότι ενίσχυσε σηµαντικά την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών ώστε η δραστικότητα να είναι µεγαλύτερη από εκείνη ακόµα και διφαινολικών παραγώγων, όπως το χλωρογενικό οξύ. Η παρουσία µεθυλο- οµάδων στον αρωµατικό δακτύλιο των ΑΗ σε συνδυασµό µε ένα χρωµανικό δακτύλιο, όπως παρατηρήθηκε για την περίπτωση του Trolox και της α-τοκοφερόλης, ενίσχυσε σηµαντικά την ικανότητα των ΑΗ να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες. 65

Πίνακας 4.1. 66

Τα παραπάνω αποτελέσµατα ήταν σύµφωνα µε τις γενικές αρχές SAR (βλ. 1.2) µε εξαίρεση το σιναπικό οξύ που βρέθηκε αποτελεσµατικότερο από το χλωρογενικό οξύ (1,1 φορές) και το ροσµαρινικό οξύ που ήταν επίσης λιγότερο δραστικό (1,1 φορά) από το διυδροκαφεϊκό οξύ αν και άλλοι ερευνητές έχουν αναφέρει το αντίθετο (βλ. 1.4). Οι Pekkarinen et al. (1999), για τον ίδιο λόγο σχετικής συγκέντρωσης (0,13) αναφέρουν ότι το σιναπικό οξύ ήταν δραστικότερο (1,1 φορά) και από το καφεϊκό οξύ. Αν και στις περισσότερες περιπτώσεις παρατηρήθηκε αύξηση της %RSA µε το χρόνο αντίδρασης, το σύντοµο χρονικό διάστηµα (10-20 min) που χρησιµοποιείται στις γρήγορες δοκιµές δε φάνηκε να είναι παράµετρος που επηρεάζει τη σειρά ή το µέγεθος της σχετικής δραστικότητας όπως διαπιστώθηκε και από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων. Αντίθετα, ο λόγος της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού προς τη συγκέντρωση της ρίζας βρέθηκε να επηρεάζει κυρίως το µέγεθος της σχετικής δραστικότητας των υπό εξέταση ΑΗ. Για τις περισσότερες ΑΗ παρατηρήθηκε αύξηση της %RSA µε την αύξηση του λόγου [AΗ]/[DPP ] καθώς όλο και περισσότερα µόρια ΑΗ ήταν κάθε φορά διαθέσιµα για τη δέσµευση της ίδιας ποσότητας της ρίζας. Μεταβολές στην %RSA δεν εµφανίστηκαν στις περιπτώσεις που οι ΑΗ ήταν σχεδόν αδρανείς, όπως τα κουµαρικά οξέα και η τυροσόλη. Η παρατηρούµενη αύξηση των %RSA τιµών µε την αύξηση της σχετικής συγκέντρωσης των ΑΗ, κατά συνέπεια, επηρέασε και το µέγεθος των διαφορών στη δραστικότητα. Ενώσεις µε διαφορετικά δοµικά χαρακτηριστικά παρουσίασαν την ίδια περίπου δραστικότητα για το λόγο [AΗ]/[DPP ]=0,5. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτέλεσαν τα οξέα διυδροκαφεϊκό, καφεϊκό, ροσµαρινικό και σιναπικό, καθώς και η υδροξυτυροσόλη και το Trolox. Οι ενώσεις αυτές, αν και δοµικά διαφορετικές, για το συγκεκριµένο λόγο συγκεντρώσεων παρουσίασαν ανάλογη δραστικότητα, ενώ για λόγους [AΗ]/[DPP ]= 0,25 και 0,13 παρατηρήθηκε διαφοροποίηση στη δραστικότητά τους. Σύµφωνα µε τα παραπάνω αποτελέσµατα, αλλά και τη συνήθη πρακτική που παρουσιάζεται στη βιβλιογραφία, η αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΗ µε βάση µία µόνο συγκέντρωση µπορεί να δώσει τιµές %RSΑ ιδιαίτερα υψηλές ή εξαιρετικά χαµηλές, που ενδέχεται να οδηγήσουν τον αναλυτή σε υπερεκτίµηση ή υποτίµηση της ικανότητας των υπό µελέτη ενώσεων να δεσµεύουν τις ελεύθερες ρίζες. Επιπλέον, οι διαφορές στη δραστικότητα µεταξύ των ενώσεων µπορεί να µειωθούν τόσο, ώστε να µην είναι δυνατή η εξαγωγή συµπερασµάτων SAR. Σε ορισµένες µάλιστα περιπτώσεις τα αποτελέσµατα δε συµφωνούν µε τις αποδεκτές αρχές των σχέσεων δοµήςαντιοξειδωτικής ικανότητας των πρωτοταγών αντιοξειδωτικών. 67

Τα παραπάνω είναι ιδαίτερα σηµαντικά αν αναλογιστεί κανείς ότι η στοιχειοµετρία της αντίδρασης των ΑΗ µε τη DPP είναι διαφορετική σε πολλές περιπτώσεις. Σύµφωνα µε τους Brand-Williams et al. (1995) η στοιχειοµετρία που έχει αναφερθεί για το ροσµαρινικό οξύ είναι 3,3, για το καφεϊκό οξύ είναι 4,5, για το φερουλικό οξύ είναι 1,2, ενώ για τα BT και BA είναι 2,6. Η διαφορετική στοιχειοµετρία δεν είναι δυνατόν να φανεί σε µια γρήγορη δοκιµή, συνεπώς, η επιλογή της σχετικής συγκέντρωσης [AΗ]/[DPP ] σε µια γρήγορη δοκιµή συστήνεται να πραγµατοποιείται µετά από σχετική διερεύνηση. Η σχετική συγκέντρωση [AΗ]/[DPP ] θα πρέπει να επιλεγεί ώστε οι %RSA τιµές για τα πιο δραστικά αντιοξειδωτικά ή την ένωση αναφοράς (π.χ. Trolox) να κυµαίνονται µεταξύ 60-80 %, που, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης, επιτρέπει την παρατήρηση διαφορών στη δραστικότητα των ενώσεων. 4.1.2 Επίδραση του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση Το περιβάλλον στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση των ΑΗ µε τις ελεύθερες ρίζες φαίνεται να επηρεάζει την ικανότητα απόδοσης ατόµου υδρογόνου (Valgimigli et al., 1995) ιδιαίτερα όταν οι διαλύτες σχηµατίζουν δεσµό υδρογόνου µε αυτές (Valgimigli et al., 1995, 1996, 1999, Barclay et al., 1999). Αν και οι περισσότεροι από τους ερευνητές χρησιµοποιούν ως διαλύτη την αιθανόλη ή τη µεθανόλη, εντούτοις δε διαπιστώθηκε βιβλιογραφικά να έχει δοθεί έµφαση στην επίδραση που µπορεί να έχει ο διαλύτης στα αναλυτικά αποτελέσµατα µε τη DPP. Η επιλογή των δύο αλκοολών ως διαλυτών σχετίζεται µε το γεγονός ότι οι ΑΗ που ενδιαφέρουν τους ερευνητές στα πεδία των Επιστηµών Τροφίµων και Υγείας είναι συνήθως πολικές µε κύρια εξαίρεση τις τοκοφερόλες. Έτσι, κρίθηκε απαραίτητο να εκτιµηθεί η επίδραση του διαλύτη στην αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΗ. Εκτός από την αιθανόλη χρησιµοποιήθηκε συγκριτικά το ακετονιτρίλιο και η τριτοταγής βουτυλική αλκοόλη. Οι παραπάνω διαλύτες έχουν χρησιµοποιηθεί και παλαιότερα σε κινητικές µελέτες εκτίµησης της ικανότητας δέσµευσης της DPP από την α-τοκοφερόλη και τη φαινόλη (Valgimigli et al., 1995). Τόσο οι υπό εξέταση ΑΗ, όσο και η ελεύθερη ρίζα διαλύθηκαν στον ίδιο κάθε φορά διαλύτη για την αποφυγή προβληµάτων ανάµειξης κατά την αντίδραση. Η ικανότητα των διαλυτών να σχηµατίζουν δεσµό υδρογόνου µε τις ΑΗ εκφράζεται µε τη σταθερά β Η 2 (Abraham et al., 1990). Οι τιµές β Η 2 για τους τρεις διαλύτες δίνονται στον Πίνακα 4.2. Καθώς έχει αναφερθεί ότι και η πολικότητα του διαλύτη µπορεί να επηρεάζει την αντίδραση των ΑΗ µε τις ελεύθερες ρίζες (Yordanof and hristova, 1997, Foti and Ruberto, 2001), στον ίδιο πίνακα δίνονται και οι τιµές της διηλεκτρικής σταθερά ε r και της 68

εµπειρικής παράµετρου E N Τ, που αποτελούν µέτρο της πολικότητας των διαλυτών (Reichardt, 1988). Πίνακας 4.2 Φυσικοχηµικές σταθερές των υπό µελέτη διαλυτών ιαλύτης Αιθανόλη 0,44 24,55 0,654 Ακετονιτρίλιο 0,44 35,94 0,460 Τριτοταγής βουτυλική αλκοόλη 0,49 12,47 0,389 β 2 Η ε r E N Τ Με βάση τις τιµές β Η 2 θα αναµένονταν παρόµοιες τιµές %RSA για τις υπό εξέταση ΑΗ και στους τρεις διαλύτες, ή κάπως χαµηλότερες στην περίπτωση της τριτοταγούς βουτυλικής αλκοόλης. Τα αποτελέσµατα του Πίνακα 4.3 δεν επαλήθευσαν την παραπάνω υπόθεση. Συγκεκριµένα, στην περίπτωση που διαλύτης ήταν το ακετονιτρίλιο οι %RSA τιµές για όλες τις ενώσεις βρέθηκαν να είναι παρόµοιες µε εκείνες στην τριτοταγή βουτυλική αλκοόλη. Ειδικά για τα υδροξυκινναµωµικά οξέα και την οµάδα της υδροξυτυροσόλης οι %RSA τιµές στους διαλύτες αυτούς ήταν σηµαντικά χαµηλότερες από εκείνες σε αιθανόλη. Επίσης, όταν ο διαλύτης ήταν ακετονιτρίλιο ή τριτοταγής βουτυλική αλκοόλη, σηµειώθηκε σε ορισµένες περιπτώσεις αλλαγή στη σχετική σειρά δραστικότητας των ΑΗ. Το ροσµαρινικό οξύ βρέθηκε 1,6 φορές αποτελεσµατικότερο από το διυδροκαφεϊκό οξύ στο ακετονιτρίλιο και 1,5 φορές στην τριτοταγή βουτυλική αλκοόλη όταν στην αιθανόλη ήταν λιγότερο δραστικό (1,1 φορές). Το χλωρογενικό οξύ που βρέθηκε 1,4 φορές ισχυρότερο στο ακετονιτρίλιο και 1,7 φορές στην τριτοταγή βουτυλική αλκοόλη από το σιναπικό οξύ παρουσιάστηκε ασθενέστερο σε αιθανόλη (1,1 φορές). Το µέγεθος της διαφοράς στη σχετική δραστικότητα των φερουλικό και ισοφερουλικό οξέων επηρεάζεται από το διαλύτη. Η ελάχιστη δραστικότητα των κουµαρικών οξέων στην αιθανόλη µηδενίστηκε στους άλλους δύο διαλύτες. Η σειρά της αντιοξειδωτικής ικανότητας διατηρήθηκε στους τρεις διαλύτες και για την οµάδα των ενώσεων της υδροξυτυροσόλης. Το µέγεθος των διαφορών στη µεταξύ τους δραστικότητα και στην περίπτωση αυτή είχε σχέση µε το χρησιµοποιούµενο διαλύτη. 69

Πίνακας 4.3 Επίδραση του διαλύτη στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της DPP από τις ΑΗ κατά την εφαρµογή της γρήγορης δοκιµής (20 min) ΑΗ [AΗ]/[DPP ] (mol/mol)=0,25 Αιθανόλη Ακετονιτρίλιο Τριτοταγής βουτυλική αλκοόλη (%) RSA** ιυδροκαφεϊκό οξύ 93,9±0,5 a,a 45,7±0,4 a,b 46,3±0,2 a,b Ροσµαρινικό οξύ 88,4±0,4 a,a 71,2±0,1 b,b 65,7±0,2 b, Καφεϊκό οξύ 76,6±0,5 b,a 59,0±0,2 c,b 46,9±1,3 a, Σιναπικό οξύ 56,1±2,0 c,a 27,3±1,8 d,b 23,7±1,8 c,b Χλωρογενικό οξύ 52,0±0,6 d,a 37,5±0,4 e,b 40,3±1,5 d,b Φερουλικό οξύ 30,9±2,9 e,a 8,7±0,6 f,b 6,6±0,1 e,b Ισοφερουλικό οξύ 3,5±0,1 f,a 1,8±0,7 g,b 1,2±0,1 f,b ο-κουµαρικό οξύ 3,5±0,3 f 0 0 µ-κουµαρικό οξύ 2,6±0,6 f 0 0 π-κουµαρικό οξύ 3,6±0,4 f,a 1,2±0,5 g,b 0 trans-κινναµωµικό οξύ 0,5±0,2 g 0 0 Υδροξυτυροσόλη 57,0±0,2 a,a 32,1±0,8 a,b 31,2 ±0,8 a,b Ελαιοευρωπαΐνη 41,3±0,2 b,a 26,9±0,2 b,b 24,6±0,2 b,b Τυροσόλη 2,7±0,3 c 0 0 α-τοκοφερόλη 54,0±1,9 a,a 49,5±0,6 a,a 51,8±1,5 a,a Trolox 53,4±1,2 a,a 52,7±1,5 b,a 60,5±1,7 b,b TBQ 58,7±0,8 b,a 45,8±0,1 c,b 60,9±1,7 b,a BA 22,3±0,6 c,a 14,8±0,7 d,b 19,6±1,5 c,a BT 8,0±0,4 d,a 2,5±0,7 e,b 6,5±0,7 d,a *Οι ενώσεις παρατίθενται µε την ίδια σειρά που ακολουθήθηκε στον Πίνακα 4.1. **Μ.ο. τριών µετρήσεων (± τυπική απόκλιση). Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς πεζούς λατινικούς χαρακτήρες για κάθε οµάδα και οι τιµές στην ίδια σειρά µε διαφορετικούς κεφαλαίους λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Στην περίπτωση της α-τοκοφερόλης και των συνθετικών αντιοξειδωτικών η δραστικότητα δεν επηρεάστηκε σηµαντικά από το περιβάλλον της αντίδρασης αν και οι %RSA τιµές ήταν στατιστικά σηµαντικά διαφορετικές σε ορισµένες περιπτώσεις. 70

Τα πειραµατικά δεδοµένα υποδηλώνουν ότι η επίδραση του διαλύτη στην ικανότητα απόδοσης ατόµου υδρογόνου δεν µπορεί να εξηγηθεί µόνο µε βάση τη σταθερά β Η 2. Σύµφωνα µε τους Foti and Ruberto (2001) κατά την αντίδραση των ΑΗ µε τις υπεροξυ ρίζες σε ένα διαλύτη µε υψηλή τιµή διηλεκτρικής σταθεράς, η δέσµευση των ελευθέρων ριζών είναι δυνατό να γίνει µε τον ακόλουθο µηχανισµό: R + Ar (R ---Ar) διαλύτης (R ---- + Ar) διαλύτης (R--- Ar) διάχυση Ο µηχανισµός αυτός περιλαµβάνει αρχικά τη µεταφορά ενός ηλεκτρονίου από τη ρίζα προς τη φαινόλη µε σχηµατισµό ιονικού ζεύγους ρίζας-αη και στη συνέχεια την απόσπαση πρωτονίου από το υπεροξυ ανιόν. ιαλύτες που είναι πολικοί ευνοούν το µηχανισµό της µεταφοράς ηλεκτρονίου καθώς σταθεροποιούν καλύτερα το σχηµατιζόµενο ιονικό ζεύγος επιταχύνοντας έτσι την µεταφορά του πρωτονίου. Ο χαρακτηρισµός της πολικότητας ενός διαλύτη στηρίζεται συνήθως στις τιµές ε r καθώς ο προσδιορισµός της είναι ιδιαίτερα εύκολος. Έτσι, διαλύτες που έχουν τιµή ε r >15 χαρακτηρίζονται ως πολικοί, αν και υπάρχουν εξαιρέσεις στον κανόνα (Reichardt, 1988). Σύµφωνα µε τις τιµές της διηλεκτρικής σταθεράς και όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, η απόδοση ατόµου υδρογόνου θα έπρεπε να ευνοείται περισσότερο στο ακετονιτρίλιο. Κάτι τέτοιο όµως δεν υποστηρίζεται από τις χαµηλές τιµές %RSA των υδροξυκινναµωµικών οξέων και της οµάδας της υδροξυτυροσόλης σε αυτόν το διαλύτη. Ο χαρακτηρισµός της πολικότητας βάσει της σταθεράς E N Τ δείχνει ότι η αιθανόλη είναι αρκετά πιο πολική από το ακετονιτρίλιο που είναι παρόµοιας πολικότητας µε την τριτοταγή βουτυλική αλκοόλη. Οι υψηλές τιµές %RSA τιµές που παρατηρήθηκαν στην αιθανόλη µπορούν να δικαιολογηθούν µε βάση τις τιµές E N Τ. Οι τιµές E N Τ που δε διαφέρουν σηµαντικά για το ακετονιτρίλιο και τη βουτυλική αλκοόλη πιθανώς µπορεί να ερµηνεύουν και τις παρόµοιες %RSA που βρέθηκαν στους δύο αυτούς διαλύτες. Η παρόµοια συµπεριφορά που παρατηρήθηκε για την α-τοκοφερόλη και τα συνθετικά αντιοξειδωτικά στους τρεις διαλύτες πιθανώς να οφείλεται και σε φαινόµενα στερεοχηµικής παρεµπόδισης όπως έχει αναφερθεί και από τους Barclay et al. (1999) για το ΒΗΤ. Όλες οι παραπάνω παρατηρήσεις, που όµως δεν επιτρέπουν την εξαγωγή γενικών συµπερασµάτων οδήγησαν στην απόφαση να εκτιµηθεί η δραστικότητα των ΑΗ και µε 71

εφαρµογή του πρωτοκόλλου παρακολούθησης της αντίδρασης µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης. εδοµένου ότι το πρωτόκολλο αυτό είναι εξαιρετικά χρονοβόρο µελετήθηκαν επιλεκτικά τα οξέα διυδροκαφεϊκό, ροσµαρινικό και καφεϊκό ως ενώσεις που παρουσίασαν διαφορές στη σειρά δραστικότητας µε την αλλαγή του διαλύτη. Στο συγκεκριµένο πρωτόκολλο η ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών προκύπτει από την εκτίµηση της συµπεριφοράς µιας ΑΗ µε παρακολούθηση της αντίδρασης για πολλές συγκεντρώσεις µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης. Κατά συνέπεια, στη µέθοδο αυτή η επίδραση της σχετικής συγκέντρωσης και του χρόνου της αντίδρασης λαµβάνονται υπόψη, ενώ παράγοντες όπως η επίδραση του διαλύτη χρειάζονται διερεύνηση. Η νέα µελέτη έγινε στην αιθανόλη και το ακετονιτρίλιο. Από τα αποτελέσµατα αυτών των πειραµάτων προέκυψαν νέα στοιχεία για τη δραστικότητα των ενώσεων σε σχέση µε τη δοµή τους. Στο σχήµα 4.2 παρουσιάζονται οι διαφορές στην κινητική των αντιδράσεων για τις τρεις αυτές ενώσεις. Στο ίδιο σχήµα δίνονται επίσης τρόποι έκφρασης της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών όπως οι Ε 50 και ΑΕ, καθώς και οι τιµές Τ Ε50. Ως Τ Ε50 ορίζεται ο χρόνος που απαιτήθηκε για την επίτευξη σταθερής κατάστασης της αντίδρασης σε συγκέντρωση ίση µε την Ε 50. Με τον υπολογισµό των τιµών Ε 50, το ροσµαρινικό και το διυδροκαφεϊκό οξύ βρέθηκε ότι ήταν το ίδιο αποτελεσµατικά και µάλιστα περισσότερο απο το καφεϊκό οξύ στην αιθανόλη. Τα αποτελέσµατα ήταν σε συµφωνία µε εκείνα της γρήγορης δοκιµής (%RSA τιµές) στον ίδιο διαλύτη. Ο υπολογισµός όµως των τιµών ΑΕ οδήγησε σε ορισµένες µεταβολές στη σειρά δραστικότητας για τις τρεις ενώσεις που δεν ήταν δυνατόν να διαπιστωθούν µε τον υπολογισµό της Ε 50. Συγκεκριµένα, το καφεϊκό οξύ βρέθηκε να είναι το πιο αποτελεσµατικό καθώς η αντίδρασή του µε την ελεύθερη ρίζα ήταν ταχύτερη (Τ E50 =5,3), ενώ το ροσµαρινικό οξύ βρέθηκε να έπεται σε δραστικότητα. Το διυδροκαφεϊκό οξύ σηµείωσε τη βραδύτερη αντίδραση µε την DPP και βρέθηκε να είναι το λιγότερο αποτελεσµατικό. Η σχετική σειρά της δραστικότητας για τις υπό µελέτη ΑΗ βάσει των τιµών AE διατηρήθηκε και στην περίπτωση που διαλύτης ήταν το ακετονιτρίλιο. Είναι χαρακτηριστικό από το προφίλ της αντίδρασης όσο και τις τιµές AE ότι στην περίπτωση που ο διαλύτης ήταν το ακετονιτρίλιο η αντίδραση µε την ελεύθερη ρίζα ήταν βραδύτερη για το διυδροκαφεϊκό και το ροσµαρινικό οξύ ενώ οι επιµέρους διαφορές στη δραστικότητα µεγαλύτερες. Η πιο αργή κινητική της αντίδρασης στο ακετονιτρίλιο δεν είναι αναµενόµενη σύµφωνα µε τις τιµές της ε r. Αντίθετα ο χαρακτηρισµός της πολικότητας του διαλύτη σύµφωνα µε τις τιµές E N Τ, τουλάχιστο στη συγκεκριµένη περίπτωση, δικαιολογεί την ταχύτερη αντίδραση των ΑΗ στην αιθανόλη. 72

[DPP] (% αρχικής) A 100 80 60 40 20 0 Καφεϊκό οξύ Ε50=0,17 TE50=5,3 AE=1,12 Α 0 5 10 15 20 χρόνος, min [DPP] (% αρχικής) B 100 80 60 40 20 0 Καφεϊκό οξύ Ε50=0,23 TE50=5,2 AE=0,82 Β 0 5 10 15 20 χρόνος, min [DPP] (%αρχικής) 100 80 60 40 20 0 ιυδροκαφεϊκό οξύ Ε50=0,12 TE50=18 AE=0,46 0 5 10 15 20 χρόνος, min [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 ιυδροκαφεϊκό οξύ Ε50=0,19 TE50=85 AE=0,06 0 20 40 60 80 100 120 χρόνος, min [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 Ροσµαρινικό οξύ Ε50=0,11 TE50=10 AE=0,91 0 5 10 15 20 χρόνος (min) [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 Ροσµαρινικό οξύ Ε50=0,11 TE50=31 AE=0,29 0 10 20 30 χρόνος, min Σχήµα 4.2 Επίδραση του διαλύτη στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της σταθερής ελεύθερης ρίζας DPP σε επιλεγµένα παράγωγα του κινναµωµικού οξέος κατά την παρακολούθηση της αντίδρασης µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης Α) σε αιθανόλη, Β) σε ακετονιτρίλιο για σχετικές συγκεντρώσεις [AΗ]/[DPP ] (mol/mol)= 0,1, 0,15, 0,2 και 0,25 73

Η πολύ πιο αργή κινητική της αντίδρασης µε την ελεύθερη ρίζα που παρατηρείται για το διυδροκαφεϊκό οξύ στο ακετονιτρίλιο µπορεί πιθανότατα να εξηγήσει τη µικρότερη δραστικότητά του σε σχέση µε εκείνη του καφεϊκού στον ίδιο διαλύτη, όπως διαπιστώθηκε µε τη γρήγορη δοκιµή (4.1.1). Η ελευθερία περιστροφής που παρουσιάζει η προπανοϊκή αλυσίδα σε αντίθεση µε την προπενοϊκή (καφεϊκό οξύ), ενδέχεται να συµβάλλει στην πιο αργή κινητική της αντίδρασης που παρατηρήθηκε για το διυδροκαφεϊκό σε σχέση µε εκείνη του καφεϊκού λόγω στερεοχηµικών παρεµποδίσεων. Πολύ πρόσφατα οι Litwinienko and Ingold (2003) κατέληξαν σε ανάλογη διαπίστωση για την ικανότητα απόδοσης ατόµου υδρογόνου από ορισµένες φαινόλες προς την DPP. Συγκεκριµένα διαπίστωσαν ότι η αντίδραση ήταν ταχύτερη στην αιθανόλη παρά στο ακετονιτρίλιο. Οι ερευνητές όµως αυτοί έδωσαν διαφορετική ερµηνεία για την αυξηµένη δραστικότητα των ΑΗ σε αλκοολικό περιβάλλον. Συνέδεσαν την εντονότερη δραστικότητα των ΑΗ σε αιθανόλη µε το µερικό ιονισµό αυτών. Καθώς το Α αποδίδει ταχύτερα ηλεκτρόνια προς την ελεύθερη ρίζα, η πιθανή συµµετοχή τους στη δέσµευση της DPP όταν η δοκιµή πραγµατοποιείται σε αιθανόλη ή µεθανόλη µπορεί να οδηγήσει σε µια υπερεκτίµηση της δραστικότητας των ΑΗ. Στην παρούσα εργασία παρατηρήθηκε ότι τουλάχιστο για τα παράγωγα του κινναµωµικού οξέος και την οµάδα των ενώσεων της υδροξυτυροσόλης οι %RSA τιµές που καταγράφηκαν σε αιθανόλη ήταν µεγαλύτερες από εκείνες στους άλλους διαλύτες. 74

Πίνακας 4.1 Επίδραση του χρόνου αντίδρασης και της σχετικής συγκέντρωσης ΑΗ στην εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης της DPP 66 0,13 [AΗ]/[DPP ] (mol/mol) 0,25 0,5 10 min 15 min 20 min 10 min 15 min 20 min 10 min 15 min 20 min ΑΗ %RSA * ιυδροκαφεϊκό οξύ 50,9±0,3 a,a 58,7±1,1 a,b 63,2±0,2 a, 83,7±1,2 a,a 86,8±1,0 a,b 93,9±0,5 a, 94,2±0,1 a,a 94,6±0,1 a,a 94,6±0,1 a,a Ροσµαρινικό οξύ 49,2±0,8 a,α 53,6±1,1 b,b 56,9±0,5 b, 82,4±0,1 a,a 86,8±0,2 a,b 88,4±0,4 a, 92,7±0,4 a,a 91,2±0,2 b,a 93,4±0,2 a,a Καφεϊκό οξύ 46,8±0,2 b,a 47,5±0,7 c,a 47,7±0,6 c,a 63,6±0,8 b,a 71,3±1,2 b,b 76,6±0,5 b, 90,2±0,5 b,a 90,7±0,4 b,a 92,7±0,4 a,a Σιναπικό οξύ 36,5±0,7 c,a 37,1±0,7 d,a 37,5±0,5 d,a 54,4±2,1 c,a 55,4±2,1 c,a 56,1±2,0 c,a 88,1±2,0 b,a 88,4±1,8 c,a 88,4±1,8 b,a Χλωρογενικό οξύ 33,2±1,1 d,a 34,2±1,2 e,a 34,2±0,8 e,a 49,2±0,6 d,a 51,3±0,8 d,a 52,0±0,6 d,a 70,1±1,5 c,a 76,0±1,1 d,b 79,2±1,4 c, Φερουλικό οξύ 13,6±0,9 e,a 15,6±0,9 f,a 17,2±0,9 f,b 26,7±2,1 e,a 28,4±2,2 e,a 30,9±2,9 e,a 32,0±0,9 d,a 33,9±1,1 e,a 37,3±1,3 d,b Ισοφερουλικό οξύ 3,2±0,4 f,a 3,2±0,4 g,a 3,2±0,4 g,a 3,2±0,1 f,a 3,5±0,1 f,a 3,5±0,1 f,a 4,3±0,1 e,a 4,4±0,1 f,a 4,4±0,1 e,a ο-κουµαρικό οξύ 2,9±0,1 f,a 3,0±0,1 g,a 3,0±0,1 g,a 3,6±0,1 f,a 3,5±03 f,a 3,5±0,3 f,a 4,3±0,1 e,a 4,3±0,3 f,a 4,3±0,3 e,a µ-κουµαρικό οξύ 2,0±0,1 f,a 2,0±0,1 g,a 2,0±0,1 g,a 2,5±0,5 f,a 2,6±0,6 f,a 2,6±0,6 f,a 1,5±0,5 f,a 1,6±0,6 g,a 1,6±0,6 f,a π-κουµαρικό οξύ 2,4±0,1 f,a 2,3±0,1 g,a 2,4±0,1 g,a 3,6±0,5 f,a 3,6±0,5 f,a 3,6±0,4 f,a 3,3±0,5 e,a 3,3±0,5 g,a 3,3±0,4 e,a trans-κινναµωµικό οξύ 0,5±0,1 g,a 0,5±0,1 h,a 0,5±0,1 h,a 0,5±0,1 ga 0,5±0,2 g,a 0,5±0,2 g,a 0,5±0,1 g,a 0,5±0,1 h,a 0,5±0,1 g,a Υδροξυτυροσόλη 39,2±2,6 a,a 39,4±2,4 a,a 39,4±2,4 a,a 56,5±1,2 a,a 57,0±0,2 a,a 57,0±0,2 a,a 89,6±0,2 a,a 89,6±0,3 a,a 89,6±0,3 a,a Ελαιοευρωπαΐνη 25,0±0,7 b,a 25,1±0,7 b,a 25,1±0,7 b,a 41,3±0,6 b,a 41,3±0,2 b,a 41,3±0,2 b,a 81,9±0,2 b,a 82,3±0,3 b,a 82,3±0,3 b,a Τυροσόλη 2,5±0,5 c,a 2,5±0,5 c,a 2,5±0,5 c,a 2,6±0,2 c,a 2,7±0,3 c,a 2,7±0,3 c,a 2,8±0,3 c,a 2,8±0,3 c,a 2,8±0,3 c,a α-τοκοφερόλη 41,4±0,1 a,a 41,2±0,3 a,a 41,8±0,4 a,a 52,8±1,7 a,a 53,4±0,4 a,a 54,0±1,9 a,a 72,5±1,1 a,a 73,2±1,0 a,a 73,5±1,1 a,a Trolox 41,4±0,1 a,a 41,5±0,1 a,a 41,5±0,1 a,a 53,4±1,2 a,a 53,4±1,2 a,a 53,4±1,2 a,a 85,2±1,1 b,a 86,0±1,6 b,a 86,0±1,5 b,a TBQ 28,3±0,7 b,a 31,2±0,9 b,b 31,7±0,8 b,b 52,3±0,7 a,a 57,2±0,2 b,b 58,7±0,8 b,b 60,6±1,1 c,a 66,0±0,2 c,b 69,6±1,2 c, BA 14,3±0,5 c,a 18,0±0,6 c,b 21,5±0,6 c, 16,1±0,3 b,a 19,5±0,8 c,b 22,3±0,6 c, 39,9±0,8 d,a 41,4±0,6 d,a 47,6±0,8 d,b BT 4,3±0,4 d,a 5,0±0,6 d,a 5,1±0,4 d,a 5,7±0,5 c,a 7,2±0,4 d,b 8,0±0,4 d,b 6,5±0,4 e,a 8,1±0,5 e,b 9,9±0,3 e, *Μ. ο. τριών µετρήσεων (± τυπική απόκλιση) n=3. Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς πεζούς λατινικούς χαρακτήρες για κάθε οµάδα διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. ι τιµές στην ίδια σειρά και για κάθε λόγο [AΗ]/[DPP ] µε διαφορετικούς κεφαλαίους λατινικούς χαρακτήρες, διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%

4.2 ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑΣ TΣ ΟΚΙΜΗΣ ABTS + ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ SAR ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ Για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής συµπεριφοράς των βιοφαινολών συνήθως χρησιµοποιούνται περισσότερες από µία µέθοδοι, καθώς τα πειραµατικά αποτελέσµατα είναι δυνατόν να επηρεάζονται σηµαντικά από τη χρησιµοποιούµενη µέθοδο (Frankel and Meyer, 2000). Για το λόγο αυτό εξετάστηκε η καταλληλότητα και άλλων δοκιµών µε ελεύθερες ρίζες για τη διερεύνηση σχέσεων δοµής-δραστικότητας. Έτσι, επιλέχθηκε η δοκιµή της δεοξυριβόζης που περιλαµβάνει την εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν τη ρίζα υδροξυλίου. Η τελευταία είναι δυνατό να σχηµατιστεί in vivo κατά την αντίδραση οξειδοαναγωγής ιόντων µεταβατικών µετάλλων µε το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Οι συγκεκριµένες ρίζες είναι οι πιο δραστικές RS και είναι ιδιαίτερα βλαβερές για τον ανθρώπινο οργανισµό (Frankel, 1998). Στη συγκεκριµένη µεθοδολογία οι ρίζες παράγονται από ένα οξειδοαναγωγικό σύστηµα και στη συνέχεια οξειδώνουν τη δεοξυριβόζη. Η εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης στηρίζεται στη µέτρηση των προϊόντων της οξείδωσης (π.χ. µηλονική διαλδεΰδη) µε προσθήκη θειοβαρβιτουρικού οξέος. Προκαταρκτικά πειράµατα οδήγησαν στη διαπίστωση ότι η µέθοδος είναι κατάλληλη µόνο για υδρόφιλες ενώσεις. Η παρουσία οργανικού διαλύτη, ακόµα και σε µικρή συγκέντρωση στο µίγµα της αντίδρασης, είχε ως αποτέλεσµα την παρεµπόδιση της αντίδρασης, καθώς η απορρόφηση του έγχρωµου προϊόντος µετά από την προσθήκη θειοβαρβιτουρικού οξέος ήταν περίπου 0,1. Η παρατήρηση αυτή έγινε σε διάφορους οργανικούς διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή διαλυµάτων των ΑΗ όπως η αιθανόλη, το ακετονιτρίλιο και η ακετόνη. Επειδή δεν ήταν δυνατό να αποκλεισθεί εκ προοιµίου η µελέτη λιπόφιλων ΑΗ στην παρούσα διατριβή, εξετάστηκε και η καταλληλότητα της δοκιµής ABTS +. Η δοκιµή αυτή εφαρµόζεται τόσο σε υδρόφιλες, όσο και σε λιπόφιλες ενώσεις (Re et al., 1999), χρησιµοποιείται συχνά ακόµα και σε µελέτες δοµής-δραστικότητας (Rice-Evans, et al., 1996). Όλες οι ενώσεις που µελετήθηκαν µε τη δοκιµή DPP ελέγχθηκαν και ως προς τη συµπεριφορά τους µε την ABTS +. Παράλληλα, µελετήθηκε η επίδραση του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση. Η δοκιµή πραγµατοποιήθηκε τόσο σε αιθανόλη, όσο και σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών αλάτων (p=7,4), συνθήκη που χρησιµοποιείται στη βιβλιογραφία. Επίσης εξετάστηκε η πιθανή συµβολή παραπροϊόντων της αντίδρασης στην ολική δραστικότητα των ΑΗ. 75

4.2.1 Επίδραση του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση Τα αποτελέσµατα της επίδρασης του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση στη δραστικότητα των παραγώγων του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.4. Στον ίδιο πίνακα παρουσιάζονται αποτελέσµατα και για τις υπόλοιπες ενώσεις του Πίνακα 4.1 σε αιθανόλη. Πίνακας 4.4 Επίδρασης του περιβάλλοντος στο οποίο πραγµατοποιείται η αντίδραση στην ικανότητα των παραγώγων του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος να δεσµεύουν την ABTS + ΑΗ *TEA ΑΗ *TEA ιυδροκαφεϊκό οξύ 1,52±0,04 a,a (1,48±0.06 a,a ) Υδροξυτυροσόλη 0.90±0.05 b Ροσµαρινικό οξύ 2,13±0,09 b,a (2,18±0.08 b,a ) Ελαιοευρωπαΐνη 0.73±0.06 c Καφεϊκό οξύ 1,01±0,05 c,a (1,15±0.09 c,a ) Τυροσόλη 0.61±0.03 a Σιναπικό οξύ 1,27±0,07 d,a (2,09±0.11 b,b ) Χλωρογενικό οξύ 0,95±0,10 c,a (1,03±0.05 d,a ) α-τοκοφερόλη 0.75±0.07 c Φερουλικό οξύ 1,32±0,07 d,a (1,97±0.02 e,b ) TBQ 0.97±0.03 b Ισοφερουλικό οξύ 0,82±0,01 c,a (1,18±0.03 c,b ) BA 1.12±0.04 d ο-κουµαρικό οξύ 1,05±0,02 c,a (0,97±0.05 d,a ) BT 0.88±0.04 b µ-κουµαρικό οξύ 0,87±0,03 c,a (0,90±0.03 d,a ) π-κουµαρικό οξύ 2,00±0,12 b,a (2,39±0.09 f,b ) trans-κινναµωµικό οξύ 0 (0) *Μ.ο. τριών πειραµάτων (± τυπική απόκλιση). Οι τιµές ΤΕΑ εντός της παρένθεσης αναφέρονται σε p=7,4. Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς πεζούς λατινικούς και στην ίδια σειρά µε κεφαλαίους λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95% Κατά την εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν την ABTS + παρατηρήθηκε ότι όλες οι ενώσεις που διέθεταν ένα τουλάχιστο φαινολικό υδροξύλιο ήταν ιδιαίτερα αποτελεσµατικές. Όµως οι επιµέρους διαφορές στη δραστικότητα µεταξύ των ΑΗ ελαττώθηκαν σε σχέση µε εκείνες που παρατηρήθηκαν κατά τη δοκιµή µε τη DPP. Συγκεκριµένα, η δραστικότερη ΑΗ ως προς την ABTS +, δηλαδή το ροσµαρινικό οξύ, βρέθηκε µόλις 2,6 φορές αποτελεσµατικότερη από τη λιγότερο δραστική (ισοφερουλικό οξύ). Αντίθετα, στην περίπτωση της δοκιµής DPP, το διυδροκαφεϊκό οξύ ήταν 38 φορές ισχυρότερο από το σχεδόν αδρανές µ-κουµαρικό οξύ. Ακόµη στη δοκιµή ABTS +, ο αριθµός των φαινολικών υδροξυλίων δε φάνηκε να ενισχύει απαραίτητα τη δραστικότητα των ΑΗ. Έτσι, η σχετική σειρά δραστικότητας των ενώσεων δεν ήταν η αναµενόµενη µε 76

βάση την κλασσική άποψη για τις SAR και τα αποτελέσµατα από τη δοκιµή DPP (Πίνακας 4.1), καθώς, ενώσεις που χαρακτηρίστηκαν ως σχετικά αδρανείς µε τη δοκιµή DPP, όπως τα παράγωγα του κουµαρικού οξέος και το ισοφερουλικό οξύ, βρέθηκαν το ίδιο ή περισσότερο αποτελεσµατικά από ορισµένες διυδροξυ-φαινόλες. Συγκεκριµένα, το π-κουµαρικό οξύ παρουσίασε ανάλογη δραστικότητα µε εκείνη του ροσµαρινικού οξέος, ενώ το ισοφερουλικό οξύ και τα ο- και µ- κουµαρικά οξέα εµφάνισαν ανάλογη δράση µε εκείνη του καφεϊκού οξέος. Σε υδατικό περιβάλλον (p=7,4), αναµένεται αποπρωτονίωση της καρβοξυλικής οµάδας των παραγώγων του κινναµωµικού οξέος. Η παρουσία της οµάδας -=- µε πυρηνόφιλο χαρακτήρα, αντίθετα µε τον ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα της αδιάστατης µορφής αναµένεται να επηρεάζει την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών από τις ΑΗ (Ζhang et al., 1999). Με βάση τα πειραµατικά δεδοµένα οι διαφορές που παρατηρήθηκαν, αν και σηµαντικές σε ορισµένες περιπτώσεις, εντούτοις δεν µπορούν να υποστηρίξουν ότι το περιβάλλον της αντίδρασης αποτελεί κρίσιµη συνθήκη κατά την εφαρµογή της συγκεκριµένης µεθοδολογίας. 4.2.2 Επίδραση της παρουσίας παραπροϊόντων της αντίδρασης στην ολική εκτίµηση της δραστικότητας των βιοφαινολών Είναι γνωστό ότι οι διφαινόλες είναι πολύ πιο αποτελεσµατικές από τις µονοφαινόλες ως προς τη δέσµευση ελευθέρων ριζών. Εποµένως, η µη αναµενόµενη δραστικότητα που παρατηρήθηκε για ορισµένες µονοφαινόλες κατά την εφαρµογή του πρωτοκόλλου µε τη ρίζα ABTS + µπορεί να συνδέεται µε το µηχανισµό της αντίδρασής της µε τις ΑΗ ο οποίος δεν έχει διευκρινιστεί ακόµη πλήρως (Rice-Evans et al., 1996, Tyrakowska et al., 1999, Pannala et al., 2001). Η δέσµευση της ρίζας µε απόδοση ατόµου υδρογόνου δε φαίνεται να είναι πιθανή στην περίπτωση τουλάχιστο των αδιάστατων ΑΗ, καθώς ενώσεις όπως το π-κουµαρικό οξύ φαίνεται ότι είναι ασθενείς δότες ατόµου υδρογόνου (Bakalbassis et al., 2001). Επιπλέον, υπάρχοντα πειραµατικά δεδοµένα για το δυναµικό ιοντισµού του καφεϊκού, χλωρογενικού, διυδροκαφεϊκού, φερουλικού και π-κουµαρικού οξέος δεν µπορούν να υποστηρίξουν το µηχανισµό δέσµευσης της ελεύθερης ρίζας µε απόδοση ηλεκτρονίου καθώς το π- κουµαρικό οξύ βρέθηκε να έχει υψηλότερη τιµή δυναµικού από όλα τα συγκεκριµένα οξέα (Felice et al., 1976). Πρόσφατα (Arts et al., 2003), η µη αναµενόµενη συµπεριφορά ορισµένων φαινολών (π.χ. της ρεσορκινόλης) κατά την αντίδρασή τους µε την ABTS + συνδέθηκε µε το σχηµατισµό παραπροϊόντων που και τα ίδια δέσµευαν την ελεύθερη ρίζα. Στο 77

συµπέρασµα αυτό οι ερευνητές οδηγήθηκαν µετά από εξέταση των µεταβολών του φάσµατος της ABTS + στην ορατή περιοχή. Η µη αναµενόµενη συµπεριφορά του π- κουµαρικού οξέος, αλλά και η δραστικότητα άλλων παραγώγων του κινναµωµικού οξέος δε φάνηκε να µπορεί να αποδοθεί σε παρόµοια αίτια µε βάση τουλάχιστο τις παρατηρούµενες µεταβολές στο φάσµα τόσο σε αιθανόλη όσο και σε ρυθµιστικό διάλυµα (p=7,4) όπως φαίνεται ενδεικτικά για το καφεϊκό και το π-κουµαρικό οξύ στο Σχήµα 4.3 σε τελική συγκέντρωση 10 µμ. Α Β Αbs Γ Σχήµα 4.3 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) σε χρόνο 0-6 min κατά την αντίδραση µε Α) καφεϊκό οξύ (αιθανόλη), Β) καφεϊκό οξύ (p=7,4), Γ) το π- κουµαρικό οξύ (αιθανόλη) και ) το π-κουµαρικό οξύ (p=7,4) Ωστόσο, κατά την καταγραφή του φάσµατος στο διάστηµα των 6 min διαπιστώθηκε ότι η αντίδραση των ΑΗ συνεχίζοταν µε µοναδική εξαίρεση το καφεϊκό οξύ το οποίο αντέδρασε ταχύτατα. Προκειµένου να διαπιστωθεί αν οι παρατηρήσεις των Arts et al. (2003) επαληθεύονται και για άλλες ενώσεις εκτός από τη ρεσορκινόλη, µελετήθηκαν ενώσεις όπως η φλωρογλυκινόλη, το γαλλικό οξύ, διυδροξυβενζοϊκά οξέα και ορισµένα φλαβονοειδή. Οι ενώσεις αυτές είχαν κάποια κοινά δοµικά χαρακτηριστικά µε εκείνα της 78

οµάδας που µελέτησε ο Arts και οι συνεργάτες του και συγκεκριµένα διέφεραν ως προς τη σχετική θέση των φαινολικών υδροξυλίων στον αρωµατικό δακτύλιο (Σχήµα 4.4 Α, Β, Γ). (A) ρεσορκινόλη κατεχόλη υδροκινόνη φλωρογλυκινόλη (Β) R 6 R 5 R 4 R 3 Υδροξυβενζοϊκά οξέα R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 o-πυροκατεχικό ΟΗ ΟΗ Η Η Η β-ρεσορκυλικό ΟΗ Η ΟΗ Η Η Γεντισικό ΟΗ Η Η ΟΗ Η Πρωτοκατεχικό Η ΟΗ ΟΗ Η Η Γαλλικό Η ΟΗ ΟΗ ΟΗ Η R 2 (Γ) κερκετίνη µορίνη Σχήµα 4.4 Υπό µελέτη φαινολικές ενώσεις Α) απλές φαινόλες, Β) υδροξυβενζοϊκά οξέα, Γ) φλαβονοειδή Οι παραπάνω ενώσεις που επιλέχθηκαν ελέγχθηκαν αρχικά µε τη µέθοδο DPP προκειµένου να διαπιστωθεί α) αν όλες παρουσίαζαν κάποια δραστικότητα και β) αν εµφάνιζαν σηµαντική διαβάθµιση στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών. Με βάση τις τιµές %RSA (Πίνακας 4.5) η σχετική σειρά δραστικότητας ήταν η αναµενόµενη, σύµφωνα µε τις κλασικές αρχές SAR. 79

Πίνακας 4.5 Τιµές %RSA και TEA επιλεγµένων ΑΗ A %RSA *,a TEA* Απλές φαινόλες Φλωρογλυκινόλη 3,7±0,6 a 1,63±0,03 a Ρεσορκινόλη 2,7±0,8 a 1,14±0,04 b Κατεχόλη 65,1±0,8 b 0,97±0,02 c Υδροκινόνη 48,6±0,4 c 0,68±0,03 d Πολυδροξυβενζοϊκά οξέα 2,3-διυδροξυβενζοϊκό οξύ 75,2±2,9 d 1,94±0,07 e 2,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ 2,9±0,7 a 0,63±0,09 d 2,5-διυδροξυβενζοϊκό οξύ 82,1±1,0 e 1,81±0,02 f 3,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ 68,7±0,8 f 0,84±0,07 g 3,4,5-τριυδροξυβενζοϊκό οξύ 96,3±0,4 g 2,18±0,04 h Φλαβονοειδή Κερκετίνη 68,2±1,0 f 1,85±0,08 f Mορίνη 43,2±0,8 h 1,20±0,03 b *Μ.o. τριών πειραµάτων (± τυπική απόκλιση). Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς πεζούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. a ι % RSA τιµές των ΑΗ λήφθηκαν µε τη DPP Η φλωρογλυκινόλη και η ρεσορκινόλη (Σχήµα 4.4) βρέθηκαν σχεδόν αδρανείς ως προς τη DPP όπως αναµενόταν, λόγω της παρουσίας στο δακτύλιο µόνο υδροξυλίων µε ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα όπως φαίνεται από την τιµή της σταθεράς ammett (σ) στις συγκεκριµένες θέσεις (Σχήµα 4.5). -0,37 0,12 0,12-0,37-0,37 Σχήµα 4.5 Τιµές σταθεράς ammett (σ) ενός φαινολικού υδροξυλίου 80

Οι ίδιες ενώσεις δέσµευαν την ABTS + και µάλιστα περισσότερο από την κατεχόλη και την υδροκινόνη. Στην περίπτωση όµως των υδροξυβενζοϊκών παραγώγων και των φλαβονοειδών, η σχετική θέση των υδροξυλίων στον αρωµατικό δακτύλιο δε βρέθηκε να επηρεάζει τη σειρά δραστικότητας και τα αποτελέσµατα µε την ABTS + ήταν σύµφωνα µε τις αρχές SAR, όπως επιβεβαιώθηκε και µε τη δοκιµή DPP. Η καταγραφή του φάσµατος της ABTS + κατά την αντίδραση µε τις υπό µελέτη ενώσεις έγινε σε όλες τις περιπτώσεις. Η παρατήρηση σχηµατισµού παραπροϊόντων της αντίδρασης σηµειώθηκε µόνο στην περίπτωση των ενώσεων µε ηλεκτρονιόφιλα φαινολικά υδροξύλια (φλωρογλυκινόλη, ρεσορκινόλη, 2,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ και µορίνη) (Σχήµα 4.6). Η ρεσορκινόλη ήταν η µοναδική ένωση για την οποία παρατηρήθηκαν έντονες µεταβολές στο φάσµα της αντίδρασης µε την ελεύθερη ρίζα. Στις υπόλοιπες ενώσεις, ακόµα και στη φλωρογλυκινόλη που διαθέτει τρία υδροξύλια µε ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα ο σχηµατισµός παραπροϊόντων ήταν µικρότερος. Α Β Αbs Γ Σχήµα 4.6 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) σε αιθανόλη (10 µμ) σε χρόνο 0-6 min κατά την αντίδραση µε Α) τη ρεσορκινόλη, Β) τη φλωρογλυκινόλη, Γ) το 2,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ και ) τη µορίνη Από όσα διαπιστώθηκαν στην ενότητα αυτή φαίνεται ότι η δοκιµή µε την ABTS + δεν είναι κατάλληλη για τη µελέτη σχέσεων δοµής-δραστικότητας, καθώς ενώσεις που 81

αναµένεται να είναι αδρανείς ή χαµηλής δραστικότητας µε βάση τις ισχύουσες αρχές δοµής-δραστικότητας βρέθηκαν πιο αποτελεσµατικές από γνωστά ισχυρά αντιοξειδωτικά. Οπωσδήποτε όµως προσφέρει ένα µέτρο αξιολόγησης της παρουσίας δραστικών οµάδων στην ένωση. Είναι φανερό ότι ο µηχανισµός αντίδρασης της ρίζας αυτής µε τις ΑΗ χρειάζεται παραπέρα διερεύνηση που δεν εµπίπτει στο σκοπό αυτής της διατριβής. Για το λόγο αυτό, στη συνέχεια, η δοκιµή µε τη DPP χρησιµοποιήθηκε ως κύρια µέθοδος για την εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης των ελευθέρων ριζών. Πιο συγκεκριµένα, επιλέχθηκε το αναλυτικό πρωτόκολλο που περιλαµβάνει τη διαρκή καταγραφή της ελάττωσης της απορρόφησης της ρίζας µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης ώστε να είναι δυνατός ο υπολογισµός διαφόρων παραµέτρων για την εκτίµηση της δραστικότητας των ΑΗ. Η δοκιµή ABTS + χρησιµοποιήθηκε µόνο συµπληρωµατικά. 82

4.3 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΥΖΥΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΟΥ π- Υ ΡΟΞΥΚΙΝΝΑΜΩΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΦΕΪΚΟΥ, ΙΥ ΡΟΚΑΦΕΪΚΟΥ ΟΞΕΟΣ KAI ΣΥΓΓΕΝΩΝ ΜΟΝΟΦΑΙΝΟΛΩΝ Το καφεϊκό οξύ αποτελεί ένα από τα πιο χαρακτηριστικά παράγωγα του π- υδροξυκινναµωµικού οξέος που απαντάται στις φυτικές ύλες και είναι ισχυρό αντιοξειδωτικό (Shahidi and Wanasundara, 1992). Στον ανθρώπινο οργανισµό υφίσταται µετατροπές (π.χ. µεθυλιώσεις, αφυδρογόνωση κ.α.) που οδηγούν στο σχηµατισµό διαφόρων µεταβολιτών. Ένας από τους κύριους µεταβολίτες του καφεϊκού οξέος είναι το διυδροκαφεϊκό οξύ, που είναι προϊόν της δράσης εντερικών βακτηρίων (Moon and Teraο, 1998). Το διυδροκαφεϊκό οξύ είναι επίσης ισχυρό αντιοξειδωτικό, παρά την απουσία διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα, η σηµασία του οποίου στην ενίσχυση ή µη της δραστικότητας έχει µελετηθεί λίγο (Moon and Teraο, 1998, hen et al., 1999, Silva et al., 2000). Προκειµένου λοιπόν να διαπιστωθεί αν υπάρχει σηµαντική ή όχι διαφορά στη δραστικότητα των δύο ενώσεων που να δικαιολογεί την αναζήτηση ειδικών πηγών για κάθε µια από αυτές, έγιναν σειρές πειραµάτων εκτίµησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας σε διάφορες συνθήκες καθώς και υπολογισµοί µοριακών δεικτών που σχετίζονται µε αυτή. 4.3.1 Πειραµατική προσέγγιση SAR Κατά την πειραµατική προσέγγιση έγιναν δοκιµές δέσµευσης των ελευθέρων ριζών DPP και ABTS +, δοκιµή εκτίµησης της αναγωγικής ικανότητας, δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης σε έλαια (45 ο ) και σε συστήµατα διασποράς λιπαρών υλών (37 ο ).Τα συστήµατα διασποράς που επιλέχθηκαν χρησιµοποιήθηκαν ως µοντέλα που προσοµοιάζουν τις κυτταρικές µεµβράνες (λιποσώµατα) ή τρόφιµα (γαλακτώµατα ελαίου σε νερό, o/w). 4.3.1.1 οκιµή δέσµευσης ελευθέρων ριζών Καθώς οι ΑΗ δρουν κυρίως δεσµεύοντας ελεύθερες ρίζες, το καφεϊκό και το διυδροκαφεϊκό οξύ εξετάστηκαν ως προς την ικανότητα να δεσµεύουν την ελεύθερη ρίζα DPP. Η αντίδραση µεταξύ ΑΗ και DPP παρακολουθήθηκε µέχρι την επίτευξη 83

σταθερής κατάστασης. Όπως διαπιστώθηκε στην παράγραφο (4.1.2) µε το συγκεκριµένο πρωτόκολλο λαµβάνονται πληροφορίες για τη σχέση της δοµής-δραστικότητας των ΑΗ. Τα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα 4.6. Στον ίδιο Πίνακα παρουσιάζονται επίσης παράµετροι που υπολογίζονται κατά την παρακολούθηση της αντίδρασης µε τη συγκεκριµένη ρίζα µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης και χρησιµοποιούνται στη βιβλιογραφία για την εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών από τις ΑΗ (Brand-Williams et al., 1995, Sanchez-Moreno et al., 1998). Πίνακας 4.6 Εκτίµηση της ικανότητας των οξέων καφεϊκού και διυδροκαφεϊκού να δεσµεύουν τη DPP A E 50 ARP Στοιχειοµετρία αντίδρασης AE Τ E50 (min) Καφεϊκό οξύ 0,18±0,01ª 5,5±0,16ª 2,90±0,20ª 1,10±0,10ª 5,1±0,18 ιυδροκαφεϊκό 0,11±0,01 b 9,5±0,45 b 4,60±0,30 b 0,40±0,04 b 22,8±0,23 οξύ *Μέσος όρος τριών πειραµάτων (± sd=τυπική απόκλιση). Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Με βάση τις τιµές E 50 και ARP βρέθηκε ότι το καφεϊκό οξύ στο οποίο διατηρείται η συζυγία στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα ήταν λιγότερο αποτελεσµατικό από το διυδροανάλογό του. Ο λόγος της τιµής E 50 του καφεϊκού οξέος προς εκείνη της E 50 του διυδροκαφεϊκού οξέος ήταν 1,6, ανάλογος εκείνου που αναφέρεται από τους hen et al. (1999) αλλά δυο φορές µικρότερος σε σχέση µε αυτόν που δίνεται από τους Silva et al. (2000). Τα αποτελέσµατα ως προς την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών δεν ήταν σύµφωνα µε τα αντίστοιχα των Moon and Terao (1998) που δεν έδειξαν διαφορές µεταξύ των δύο ενώσεων. Η χαµηλότερη δραστικότητα του καφεϊκού οξέος σε σχέση µε το διυδροκαφεϊκό οξύ οφείλεται πιθανώς στον ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα του διπλού δεσµού, που επηρεάζει την ηλεκτρονιακή πυκνότητα στον αρωµατικό δακτύλιο και το φαινολικό υδροξύλιο του οξέος. Όταν στην έκφραση των αποτελεσµάτων ληφθεί υπόψη και η τιµή Τ E50, το καφεϊκό οξύ φαίνεται ότι είναι περίπου τρεις φορές πιο αποτελεσµατικό από το διυδροκαφεϊκό οξύ. Η σηµασία της παρατήρησης αυτής φαίνεται καλύτερα στο Σχήµα 4.2 της παραγράφου 4.1 όπου δίνεται το προφίλ της 84

αντίδρασης των δύο υπό εξέταση οξέων µε την ελεύθερη ρίζα DPP. Η εισαγωγή της τιµής Τ E50 στην έκφραση των αποτελεσµάτων αποδείχτηκε σηµαντική καθώς φαίνεται ότι ο χρόνος που απαιτείται για τη δέσµευση της ελεύθερης ρίζας επηρεάζεται από τα δοµικά χαρακτηριστικά των ΑΗ (Sanchez-Moreno et al., 1998) και το µηχανισµό της αντίδρασής τους µε τη DPP (Brand-Williams et al., 1995). Σύµφωνα µε τους Bondet et al. (1997) ορισµένες από τις ΑΗ αντιδρούν ταχύτατα µε τη DPP σε απλή στοιχειοµετρία µε τον αριθµό των διαθέσιµων φαινολικών υδροξυλίων. Για την πλειονότητα των αντιοξειδωτικών όµως, η αντίδραση είναι βραδύτερη και ο µηχανισµός πιο πολύπλοκος. Έτσι, το καφεϊκό οξύ δεσµεύει λιγότερες ρίζες DPP (2,9) από το διυδροανάλογό του (4,6) που αντιδρά βραδύτερα µε την ελεύθερη ρίζα. Ωστόσο και οι δύο ΑΗ βρέθηκε ότι δεσµεύουν περισσότερες ρίζες από τα φαινολικά υδροξύλια που διαθέτουν. Ο πολύπλοκος µηχανισµός αντίδρασης των ο- διφαινολών αποδίδεται στην αναγέννησή τους λόγω αλληλεπίδρασης δύο φαινοξυ-ριζών (Brand-Williams et al., 1995) όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.7. DPP Σχήµα 4.7 Αντίδραση ο-διφαινολών µε τη ρίζα DPP (Brand-Williams et al., 1995) Οι διαφορές στη δραστικότητα που παρατηρήθηκαν µεταξύ των δύο υπό µελέτη ΑΗ δεν εκτιµήθηκαν ως σηµαντικές και θεωρώντας ότι η παρουσία της κατεχολικής οµάδας ίσως επισκίαζε εκείνη άλλων δοµικών χαρακτηριστικών, όπως του διπλού δεσµού και της καρβοξυλικής οµάδας στην πλευρική αλυσίδα, η έρευνα συνεχίστηκε για µια σειρά µονοφαινολών. Οι µονοφαινόλες που επιλέχθηκαν (ισοευγενόλη, διυδροευγενόλη και ευγενόλη), διαφέρουν ως προς την παρουσία, αλλά και τη θέση του διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα (Σχήµα 4.8). 85

3 3 3 ισοευγενόλη διυδροευγενόλη ευγενόλη 2-µεθοξυ-4-προπυλιδενοφαινόλη 2-µεθοξυ-4-προπυλοφαινόλη 2-µεθοξυ-4-αλλυλοφαινόλη Σχήµα 4.8 Συντακτικοί τύποι µονοφαινολών που διαφέρουν ως προς την παρουσία και τη θέση του διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα Τα αποτελέσµατα για τη δραστικότητα αυτών των ενώσεων, καθώς και του Trolox που χρησιµοποιήθηκε για σύγκριση, µε τη δοκιµή DPP παρουσιάζονται εκφρασµένα µε διαφορετικούς τρόπους στον Πίνακα 4.7. Πίνακας 4.7 Εκτίµηση της ικανότητας µονοφαινολών να δεσµεύουν τη DPP A E 50 ARP Στοιχειοµετρία αντίδρασης AE Τ E50 (min) Ισοευγενόλη 0,49±0,03ª 2,04±0,11ª 1,02±0,06ª 1,50±0,23ª 1,2±0,13 ιυδροευγενόλη 0,22±0,01 b 4,70±0,28 b 2,33±0,11 b 0,03±0,00 b 151±6,9 Ευγενόλη 0,25±0,01 b 4,10±0,18 b 2,16±0,20 b 0,03±0,01 b 130,6±7,8 Trolox 0,21±0,01 b 4,75±0,25 b 2,40±0,10 b 1,77±0,47 a 2,8±0,65 *Μέσος όρος τριών πειραµάτων (±sd=τυπική απόκλιση). Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95% Σύµφωνα µε τις τιµές E 50 και ARP η ισοευγενόλη βρέθηκε δύο φορές λιγότερο δραστική από την διυδροευγενόλη και την ευγενόλη. Με βάση τη συγκεκριµένη έκφραση των αποτελεσµάτων οι διαφορές στη δραστικότητα των µονοφαινολών ήταν του ίδιου περίπου µεγέθους µε εκείνες που παρατηρήθηκαν στην περίπτωση του καφεϊκού και του διυδροκαφεϊκού οξέος. ιαπιστώθηκε όµως ότι υπήρχε µεγάλη διαφορά στην ταχύτητα µε την οποία αυτές αντιδρούν µε την ελεύθερη ρίζα όπως φαίνεται από τις τιµές Τ E50 και το Σχήµα 4.9. 86

[DPP] (% αρχικής) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ισοευγενόλη 0 5 10 15 20 25 χρόνος, min 0.08 0.2 0.4 0.5 0.55 0.6 [DPP] (% αρχικής) ιυδροευγενόλη 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 χρόνος, min 0.2 0.3 0.35 0.4 0.55 0.8 [DPP] (% αρχικής) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ευγενόλη 0 50 100 150 200 250 300 350 0.08 0.25 0.28 0.35 0.8 5.1 χρόνος, min Σχήµα 4.9 Κινητική της αντίδρασης της ισοευγενόλης, διυδροευγενόλης και ευγενόλης µε τη DPP σε αιθανόλη. (Οι αριθµοί παριστάνουν λόγους συγκεντρώσεων [ΑΗ]/[DPP ] (mol/mol) που απαιτήθηκαν για την κατασκευή της κάθε καµπύλης) 87

Κάτι τέτοιο δεν είχε παρατηρηθεί στην περίπτωση των δύο οξέων. Έτσι, µε τον υπολογισµό των τιµών ΑΕ η ισοευγενόλη που αντιδρά ταχύτατα µε την ελεύθερη ρίζα (Τ E50 =1,2) βρέθηκε 50 φορές πιο αποτελεσµατική από τις άλλες µονοφαινόλες. Σύµφωνα λοιπόν µε τις τιµές ΑΕ οι διαφορές µεταξύ των µονοφαινολών ήταν µεγαλύτερες από εκείνες που παρατηρήθηκαν στην περίπτωση των διφαινολών καθώς ο χρόνος αντίδρασης για τις πρώτες διέφερε σηµαντικά. Η παρουσία του διπλού δεσµού στο άκρο της πλευρικής ανθρακικής αλυσίδας (ευγενόλη) προκάλεσε αποτελέσµατα ανάλογα µε εκείνα που προκάλεσε η απουσία του (διυδροευγενόλη). Η αργή κινητική της διυδροευγενόλης πιθανότατα οφείλεται στον ίδιο πολύπλοκο µηχανισµό που έχει προταθεί για την αντίδραση της ευγενόλης µε την DPP (Σχήµα 4.10) (Brand-Williams et al., 1995). Αντίθετα, η ισοευγενόλη, όπως προκύπτει και από τη στοιχειοµετρία της αντίδρασης δεσµεύει µια ρίζα µε το υδρογόνο από το µοναδικό διαθέσιµο φαινολικό υδροξύλιο. 3 3 DPP- 2 -= 2 DPP DPP- DPP 3 -= 2 3 α) παροχή δευτέρου ατόµου υδρογόνου 3 2 -= 2 2 -= 2 γ) σχηµατισµός συµπλόκου DPP -= 2 DPP 3 3 β) διµερισµός 2 -= 2 3 2 -= 2 2 -= 2 2 -= 2 3 3 2 -= 2 Σχήµα 4.10 Προτεινόµενος µηχανισµός αντίδρασης της ευγενόλης µε τη ρίζα DPP (Brand-Williams et al., 1995) 88

Τόσο το καφεϊκό όσο και το διυδροκαφεϊκό οξύ αντέδρασαν βραδύτερα µε την ελεύθερη ρίζα σε σχέση µε το Trolox που συµπεριλήφθηκε στη µελέτη καθαρά για σύγκριση. Στην περίπτωση των µονοφαινολών µόνο η ισοευγενόλη παρουσίασε κινητική συµπεριφορά ανάλογη µε εκείνη του Trolox, καθώς οι άλλες δύο (διυδροευγενόλη, ευγενόλη) αντέδρασαν µε τη ρίζα εξαιρετικά αργά. Οι υπό µελέτη φαινολικές ενώσεις εκτιµήθηκαν και ως προς την ικανότητά τους να δεσµεύουν την κατιοντική ρίζα ABTS +. Τα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα (4.8). Πίνακας 4.8 Εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν την ABTS + ΑΗ TEA* Καφεϊκό οξύ 1,04±0,02 a ιυδροκαφεϊκό οξύ Ισοευγενόλη ιυδροευγενόλη Ευγενόλη 1,49±0,03 b 0,87±0,02 c 1,22±0,03 d 1,19±0,01 d *Μ. ο. τριών πειραµάτων (±sd=τυπική απόκλιση). Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95% Με βάση τις τιµές TEA τόσο το καφεϊκό οξύ όσο και η ισοευγενόλη βρέθηκαν λιγότερο αποτελεσµατικές από τα διυδροανάλογά τους, αν και οι διαφορές δεν ήταν σηµαντικές σε κάθε περίπτωση. Η σειρά της δραστικότητας ήταν σύµφωνη µε εκείνη βάσει των τιµών E 50 που εκτιµήθηκαν µε τη DPP. Επειδή η αντίδραση µε την ABTS + είναι σχετικά γρήγορη δεν ήταν δυνατόν να προσδιοριστεί παράµετρος αντίστοιχη µε την ΑΕ. Παρόλα αυτά κατά την καταγραφή του φάσµατος της αντίδρασης των δύο οξέων µε την ABTS + διαπιστώθηκε ότι το καφεϊκό οξύ αντιδρά ταχύτατα (Σχήµα 4.3) και µε διαφορετικό τρόπο από το διυδροκαφεϊκό οξύ. Η αντίδραση του τελευταίου µε την ελεύθερη ρίζα διαρκούσε σε όλο το διάστηµα παρακολούθησης του πειράµατος, δηλαδή τα 6 min (Σχήµα 4.11). 89

Αbs Σχήµα 4.11 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) στο χρονικό διάστηµα 0-6 min κατά την αντίδραση µε το διυδροκαφεϊκό οξύ (10 µμ) σε αιθανόλη 4.3.1.2 οκιµή εκτίµησης αναγωγικής ικανότητας βιοφαινολών Η παρουσία ιόντων µεταβατικών µετάλλων όπως του Fe, u και o σε ένα λιπαρό σύστηµα είναι συνηθισµένη. Τα ιόντα αυτά ακόµα και σε ίχνη µπορούν να δράσουν προοξειδωτικά, καταλύοντας τη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων των λιπαρών οξέων προς ελεύθερες ρίζες. Επίσης, στον ανθρώπινο οργανισµό όπου συναντώνται ως συστατικά µεταλλοπρωτεϊνών και παρουσία 2 2 είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε σχηµατισµό των ιδιαίτερα δραστικών ριζών υδροξυλίου µε αντίδραση του τύπου Fenton (Frankel, 1998). Fe 2+ + 2 2 + + Fe 3+ Στην περίπτωση που στο σύστηµα υπάρχει κάποια φαινολική ένωση και οι συνθήκες ή η δοµή της δεν ευνοούν τη δέσµευση των ιόντων µε σχηµατισµό χηλικού συµπλόκου, η ΑΗ είναι δυνατό να αλληλεπιδράσει οξειδοαναγωγικά µε τα ιόντα αυτά (Mei et al., 1999). Κατά την αντίδραση το ιόν του µετάλλου ανάγεται ενώ η ΑΗ οξειδώνεται. Με τον τρόπο αυτό προκαλείται αύξηση του προοξειδωτικού χαρακτήρα των ιόντων, καθώς τα τελευταία στη χαµηλότερη βαθµίδα σθένους παρουσιάζονται ως ισχυρότεροι προοξειδωτικοί παράγοντες (Prior and ao, 1999). Η εκτίµηση της αναγωγικής ικανότητας των ΑΗ γίνεται συνήθως µε δοκιµές όπως η FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) (Benzie and Strain, 1996). Με τη συγκεκριµένη δοκιµή εκτιµάται η ικανότητα των ΑΗ να ανάγουν τον Fe 3+ προς Fe 2+ που είναι ισχυρότερο προοξειδωτικό. Στη συνέχεια, εξετάσθηκε πόσο η αποτίµηση της 90

παραπάνω ιδιότητας µπορεί να δώσει πληροφορίες για τη δραστικότητα των ΑΗ. Οι Nenadis et al. (2003 b) εκτιµώντας την αναγωγική ικανότητα των υπό µελέτη ενώσεων µε τη δοκιµή FRAP διαπίστωσαν ότι το διυδροκαφεϊκό οξύ και η διυδροευγενόλη ήταν δύο περίπου φορές ισχυρότερα από το καφεϊκό οξύ και την ισοευγενόλη αντιστοίχως. Εποµένως, οι ενώσεις αυτές αναµένεται να ενισχύουν περισσότερο τον προοξειδωτικό χαρακτήρα ιόντων µετάλλων σε ένα λιπαρό υπόστρωµα. Για την επιβεβαίωση των παραπάνω παρατηρήσεων η αναγωγική ικανότητα των ο-διφαινολών και των µονοφαινολών έγινε και µε αντίδραση οξειδοαναγωγής µε το αντιδραστήριο Folin-iocalteu. Το τελευταίο χρησιµοποιείται για την εκτίµηση των επιπέδων των φαινολών σε φυτικά εκχυλίσµατα. Η επιλογή του αντιδραστηρίου στηρίχθηκε στην παρατήρηση ότι τα επίπεδα των φαινολών σε ένα εκχύλισµα εξαρτώνται από τη χρησιµοποιούµενη ένωση αναφοράς (Blekas et al., 2002). Έτσι, ανάλογα µε την πρότυπη ένωση και την αναγωγική της ικανότητα τα εκτιµώµενα επίπεδα των φαινολών στα υπό µελέτη εκχυλίσµατα ήταν άλλοτε χαµηλότερα και άλλοτε υψηλότερα. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν δίνονται στον Πίνακα 4.9. Για την εκτίµηση της αναγωγικής ικανότητας υιοθετήθηκε έκφραση παρόµοια µε εκείνη του υπολογισµού της τιµής TEA. Πίνακας 4.9 Αναγωγική ικανότητα ΑΗ µε τη χρήση του αντιδραστηρίου Folin- iocalteu ΑΗ mmol A ισοδύναµο µε 1mmol Trolox* Καφεϊκό οξύ 0,30±0,01 a ιυδροκαφεϊκό οξύ Ισοευγενόλη ιυδροευγενόλη Ευγενόλη 0,34±0,01 b 0,41±0,02 c 0,39±0,03 c 0,39±0,01 c *Μ. ο. τριών πειραµάτων (±sd=τυπική απόκλιση), Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95% 91

Οι τιµές του πίνακα δεν έδωσαν ιδιαίτερες πληροφορίες καθώς οι διαφορές µεταξύ των ενώσεων σε κάθε οµάδα δεν ήταν σηµαντικές. Η δοκιµή αυτή µπορεί να διαφοροποιεί ΑΗ που διαφέρουν ως προς τον αριθµό των φαινολικών υδροξυλίων, αλλά δεν αποδείχτηκε κατάλληλη για τη µελέτη SAR. 4.3.1.3 Επιταχυνόµενη δοκιµή οξείδωσης καθαρισµένης τριελαΐνης Οι Moon and Terao (1998) µελετώντας τη σηµασία του διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα ανέφεραν ότι η παρουσία του θα µπορούσε να επηρεάσει τη δραστικότητα των ΑΗ κατά την οξείδωση ελαίων που λαµβάνει χώρα µε το µηχανισµό ελευθέρων ριζών (Frankel, 1998). Στα µονοφασικά αυτά συστήµατα η δραστικότητα έχει αποδοθεί στον αριθµό και τη θέση των φαινολικών υδροξυλίων καθώς και στην πολικότητα των ενώσεων. Όταν όµως οι ενώσεις δε διαφέρουν στην πολικότητα, τα δοµικά τους χαρακτηριστικά είναι εκείνα που καθορίζουν την αντιοξειδωτική δράση (Foti et al., 1996). Η επέκταση της συζυγίας στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα είναι ένα δοµικό χαρακτηριστικό που θα µπορούσε να επηρεάζει την πολικότητα της ένωσης καθώς φαίνεται ότι επηρεάζει τη διαµόρφωσή της στο χώρο (Silva et al., 2000). Στην παρούσα εργασία η δραστικότητα των διυδροξυ-φαινολών εκτιµήθηκε σε τριελαΐνη ελεύθερη από αντι-/προοξειδωτικούς παράγοντες στους 45 o. Η πορεία της οξείδωσης παρακολουθήθηκε µε περιοδική µέτρηση του αριθµού υπεροξειδίων και τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στο Σχήµα 4.12. Αριθµός Υπεροξειδίων meq 2/ kg 200 150 100 50 0 Μάρτυρας +Καφεϊκό οξύ +Trolox + ιυδροκαφεϊκό οξύ 0 50 100 150 χρόνος, d Σχήµα 4.12 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης καφεϊκού, διυδροκαφεϊκού οξέος (10 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο. (Οι τιµές σε κάθε σηµείο είναι ο µ.ο. δύο µετρήσεων) 92

Όπως φαίνεται στο παραπάνω σχήµα η περίοδος επαγωγής (Ι.Ρ.) για το διυδροκαφεϊκό οξύ ήταν 130 ηµέρες και 1,2 φορές µεγαλύτερη από εκείνη του καφεϊκού οξέος (I.P.=110 d). Αν δεχτούµε την υπόθεση του πολικού παράδοξου (Porter, 1980), τότε το διυδροκαφεϊκό οξύ είναι αποτελεσµατικότερο λόγω της µεγαλύτερης πολικότητάς του. Παρόλα αυτά δε θα πρέπει να αγνοούνται παράγοντες όπως η σταθερότητα των επιµέρους φαινοξυ-ριζών ή πιθανές παράπλευρες αντιδράσεις που θα µπορούσαν να καθορίζουν την τελική δραστικότητα των ενώσεων (βλ. ενότητα 1.2) σε ένα τέτοιο σύστηµα. Σύµφωνα µε τις παρατηρήσεις που έγιναν για την περίπτωση των διφαινολών, αναµενόταν ότι η διυδροευγενόλη θα ήταν πιο αποτελεσµατική από την ισοευγενόλη. Αντίθετα, όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.13, η ισοευγενόλη (Ι.Ρ.=765 h) βρέθηκε να έχει 2,5 φορές µεγαλύτερη δραστικότητα από τις άλλες δύο µονοφαινόλες που µεταξύ τους ήταν ισοδύναµες (Ι.Ρ.=318). Η ισοευγενόλη φάνηκε λοιπόν να αποκλίνει από την υπόθεση του πολικού παράδοξου επιβεβαιώνοντας ανάλογη παρατήρηση των Brand- Williams et al. (1995) που έγινε κατά τη σύγκρισή της µε την ευγενόλη σε διάλυµα µεθυλεστέρων του λινελαϊκού οξέος και σε διαλύτη δωδεκάνιο στους 110 o. 250 Αριθµός Υπεροξειδίων meq 2/kg 200 150 100 50 0 0 200 400 600 800 1000 χρόνος, h Μάρτυρας +Ισοευγενόλη +Ευγενόλη + ιυδροευγενόλη Σχήµα 4.13 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης µονοφαινολών (30 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο. (Οι τιµές σε κάθε σηµείο είναι ο µ.ο. δύο µετρήσεων) 93

4.3.1.4 Επιταχυνόµενες δοκιµές οξείδωσης σε συστήµατα διασποράς Καθώς η πλειονότητα των τροφίµων είναι συστήµατα διασποράς στα οποία η οξείδωση δε λαµβάνει χώρα µε τον κλασσικό µηχανισµό που ισχύει στα έλαια (Frankel, 1998), θεωρήθηκε χρήσιµο να εξεταστεί η δραστικότητα των υπό µελέτη ΑΗ σε παρόµοια συστήµατα. Σε ένα τέτοιο περιβάλλον, παράγοντες όπως η πολικότητα των ΑΗ που επηρεάζει την κατανοµή τους στις επιµέρους φάσεις είναι καθοριστικοί για την αποτελεσµατικότητά τους (Mclemennts and Decker, 2000). Έτσι, πριν από την εκτίµηση της δραστικότητας των ΑΗ εκτιµήθηκε η πολικότητά τους. Ως µέτρο της ιδιότητας αυτής επιλέχθηκε ο προσδιορισµός του συντελεστή κατανοµής (P) σε µίγµα κ- οκτανόλης:νερού (1:1, v/v) (Foti et al., 1996). Οι τιµές που προσδιορίστηκαν δίνονται στον Πίνακα. 4.10. Πίνακας 4.10 Κατανοµή ΑΗ σε µίγµα κ-οκτανόλης:νερού (1:1, v/v) στους 37 ο ΑΗ P* Καφεϊκό οξύ ιυδροκαφεϊκό οξύ Ισοευγενόλη ιυδροευγενόλη Ευγενόλη Trolox 0,18±0,01 a 0,16±0,01 b 0,89±0,01 c 0,84±0,02 d 0,81±0,01 d 0,46±0,01 e *Μ. ο. (± sd=τυπική απόκλιση), n=3, Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Οι τιµές P έδειξαν ότι οι διφαινολικές ενώσεις ήταν περισσότερο υδρόφιλες σε σχέση µε τις µονοφαινόλες. Το Trolox είχε ενδιάµεση συµπεριφορά γεγονός που µπορεί πιθανώς να ερµηνεύσει την αποτελεσµατικότητά του τόσο σε έλαια όσο και σε συστήµατα διασποράς (uang et al., 1996, Frankel and Meyer, 2000). Βάσει των τιµών Ρ οι µονοφαινολικές ενώσεις αναµενόταν να είναι αποτελεσµατικότερες από τις διφαινόλες στα συστήµατα διασποράς που µελετήθηκαν στη συνέχεια. Αντίθετα, διαφορές στη συµπεριφορά των ΑΗ της κάθε οµάδας, λόγω πολικότητας, δεν αναµενόταν καθώς οι τιµές Ρ διέφεραν ελάχιστα µεταξύ τους. 94

οκιµή σε λιποσώµατα λεκιθίνης Η µελέτη των ΑΗ έγινε αρχικά σε λιποσώµατα λεκιθίνης παρουσία εκκινητή (οξικός χαλκός) σε θερµοκρασία 37 ο. Το σύστηµα αυτό χρησιµοποιήθηκε ως µοντέλο προσοµοίωσης των κυτταρικών µεµβρανών, καθώς τα φωσφολιπίδια κατά τη διασπορά τους στο νερό σχηµατίζουν διπλοστιβάδες (Frankel, 1998). Η θερµοκρασία διατηρήθηκε στους 37 ο, θερµοκρασία όµοια µε εκείνη του ανθρώπινου σώµατος, ενώ η χρήση του εκκινητή κρίθηκε απαραίτητη για την ολοκλήρωση της πειραµατικής διαδικασίας σε σύντοµο χρονικό διάστηµα. Σε µια προκαταρκτική εξέταση βρέθηκε ότι το καφεϊκό οξύ για τελική συγκέντρωση 15 µμ κατά την οξείδωση λιποσωµάτων λεκιθίνης ήταν αδρανές, ενώ το διυδροκαφεϊκό οξύ έδρασε προοξειδωτικά. Λόγω της µεγαλύτερης πολικότητάς τους, οι διφαινόλες αναµένονται να βρίσκονται στην υδατική κυρίως φάση. Στη φάση αυτή, η αντιοξειδωτική συµπεριφορά των ενώσεων µε κατεχολική οµάδα αποδίδεται στην ικανότητα σχηµατισµού συµπλόκου µε το χαλκό (Νardini et al., 1995). Στις συνθήκες του πειράµατος λόγω της χαµηλής τιµής p (4,5-3,1) του συστήµατος δεν ευνοείται ο ιονισµός της κατεχολικής οµάδας που θα µπορούσε να οδηγήσει σε σχηµατισµό συµπλόκου (Satue-Garcia et al., 1997). Στις συνθήκες αυτές οι ΑΗ σε χαµηλές συγκεντρώσεις δρουν ακόµα και ως προοξειδωτικά καθώς ενισχύεται η αναγωγική ικανότητά τους, οπότε παρατηρείται αναγωγή των ιόντων µετάλλων στην πιο δραστική µορφή τους (Mei et al., 1999). Για την καλύτερη κατανόηση της συµπεριφοράς των δύο διφαινολών πραγµατοποιήθηκαν συµπληρωµατικά πειράµατα για µεγάλο εύρος συγκεντρώσεων (5-500 µμ). Από τα πειραµατικά αποτελέσµατα (Σχήµα 4.14 Α και Β) προέκυψε ότι η τελική συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού στο σύστηµα είναι καθοριστική για την δραστικότητά του. Αντιοξειδωτική συµπεριφορά για το καφεϊκό οξύ παρουσιάσθηκε σε συγκεντρώσεις µεγαλύτερες από 30 µμ, ενώ για το διυδροκαφεϊκό σε συγκεντρώσεις µεγαλύτερες από 60 µμ. Σε κάθε περίπτωση το καφεϊκό οξύ ήταν αποτελεσµατικότερο από το διυδροανάλογό του. 95

Υδροϋπεροξείδια (mmol/kg P) 350 300 250 200 150 100 50 5 µm 10 µm 15 µμ 30 µμ 45 µμ 60 µμ 80 µμ 150 µμ 500 µμ µάρτυρας Α 0 0 1 2 3 4 χρόνος, d Υδροϋπεροξείδια (mmol/kg P) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 5µΜ 10µΜ 15µΜ 30µΜ 45µΜ 60µΜ 80µΜ 150µΜ 500µΜ µάρτυρας B 0 0 1 2 3 4 χρόνος, d Σχήµα 4.14 Επιταχυνόµενη οξείδωση λιποσωµάτων στους 37 ο παρουσία Α) καφεϊκού και Β) διυδροκαφεϊκού οξέος. (Οι τιµές των υδροϋπεροξειδίων είναι ο µ.ο. τριών µετρήσεων ± τυπική απόκλιση) Τα αποτελέσµατα στην περίπτωση των µονοφαινολών δίνονται στο Σχήµα 4.15. Η αποτελεσµατικότητα των µονοφαινολών παρουσιάσθηκε σε συγκεντρώσεις πολύ χαµηλότερες (5, 15 και 30 µμ) από εκείνες που απαιτήθηκαν για τις διφαινόλες λόγω της µεγαλύτερης κατανοµής τους στη λιπαρή φάση. 96

Υδροϋπεροξείδια mmol/kg P 400 350 300 250 200 150 100 50 0 5 µμ Μάρτυρας + Τrolox + Ισοευγενόλη + Eυγενόλη + ιυδροευγενόλη 10 21 32 43 54 χρόνος, d Υδροϋπεροξείδια mmol/kg P 400 350 300 250 200 150 100 50 0 15 µμ 01 21 32 43 54 χρόνος, d Υδροϋπεροξείδια mmol/kg P 400 350 300 250 200 150 100 50 0 30 µμ 01 21 32 43 54 χρόνος, d Σχήµα 4.15 Επιταχυνόµενη οξείδωση λιποσωµάτων στους 37 ο παρουσία µονοφαινολών. (Οι τιµές των υδροϋπεροξειδίων είναι ο µ.ο. τριών µετρήσεων ± τυπική απόκλιση) 97

Κατά τη µελέτη τόσο των διφαινολών, όσο και των µονοφαινολών φάνηκε ότι η επέκταση της συζυγίας στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα είναι επιθυµητό χαρακτηριστικό και επηρεάζει τη συµπεριφορά τους στα λιποσώµατα. Στην περίπτωση των µονοφαινολών δε διαπιστώθηκε απόκλιση από την υπόθεση του πολικού παράδοξου για την ισοευγενόλη. Η µικρότερη δραστικότητα του διυδροκαφεϊκού οξέος στα λιποσώµατα µπορεί να συνδέεται µε την αναγωγική του ικανότητα. Στην περίπτωση των µονοφαινολών το φαινόµενο αυτό ίσως είναι πιο περιορισµένο καθώς αυτές αναµένεται να βρίσκονται κυρίως στη λιπαρή φάση. Έτσι, οι διαφορές µεταξύ της ισοευγενόλης και των δύο άλλων µονοφαινολών ήταν σχετικά µικρότερες. οκιµή σε γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό Τα παραπάνω ΑΗ εξετάστηκαν και σε γαλακτώµατα ελαίου σε νερό (10% w/w) που προσοµοιάζουν τρόφιµα. Επειδή η αποτελεσµατικότητα των ΑΗ σε ένα σύστηµα διασποράς επηρεάζεται από την πολικότητα των ΑΗ, οι διφαινόλες ως πιο πολικές µελετήθηκαν σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις όπως 150, 300 και 1000 µμ ως προς την τριελαΐνη. Οι µονοφαινόλες µελετήθηκαν σε συγκεντρώσεις 15, 50 και 150 µμ. Τα αποτελέσµατα δίνονται στα Σχήµατα 4.16 και 4.17. Η σειρά δραστικότητας και στα γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό ήταν ανάλογη µε αυτή στα λιποσώµατα. Στην περίπτωση των διφαινολών, το διυδροκαφεϊκό έδρασε σχεδόν προοξειδωτικά και µόνο σε συγκέντρωση 1000 µμ συµπεριφέρθηκε ως αντιοξειδωτικό. Αντίθετα, το καφεϊκό, σε κάθε επίπεδο προσθήκης που χρησιµοποιήθηκε έδρασε αντιοξειδωτικά και συγκριτικά µε το διυδροανάλογό του βρέθηκε να είναι 2-4 φορές αποτελεσµατικότερο. Στο σύστηµα αυτό η δραστικότητα της ισοευγενόλης υπερείχε. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν µεταξύ των µονοφαινολών ήταν µικρές όταν τα χρησιµοποιούµενα επίπεδα προσθήκης ήταν χαµηλά (15 και 50 µμ), αλλά πιο χαρακτηριστικές σε υψηλότερα (150 µμ). Ο λόγος για τις µικρές διαφορές που παρατηρήθηκαν µεταξύ των µονοφαινολών πιθανώς συνδέεται µε το λιπόφιλο χαρακτήρα τους. 98

Αριθµός υπεροξειδίων meq 2/kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Μάρτυρας +Καφεϊκό οξύ + ιυδροκαφεϊκό οξύ 150 µμ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Αριθµός υπεροξειδίων meq 2/kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 300 µμ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Αριθµός υπεροξειδίων meq 2/kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1000 µμ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Σχήµα 4.16 Οξείδωση γαλακτωµάτων τριελαΐνης σε νερό (10 %, w/w) στους 37 ο παρουσία διυδροξυ-φαινολών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. (Οι τιµές του αριθµού υπεροξειδίων είναι ο µ.ο. τριών µετρήσεων± τυπική απόκλιση) 99

Αριθµός υπεροξειδίων meq Ο2/ kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Μάρτυρας + Trolox +Ευγενόλη +Ισοευγενόλη + ιυδροευγενόλη 15 µμ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Αριθµός υπεροξειδίων meq Ο2/kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 50 µμ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Αριθµός υπεροξειδίων meq Ο2/kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 150 µμ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Σχήµα 4.17 Οξείδωση γαλακτωµάτων τριελαΐνης σε νερό (10 %, w/w) στους 37 ο παρουσία µονοφαινολών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. (Οι τιµές του αριθµού υπεροξειδίων είναι ο µ.ο. τριών µετρήσεων± τυπική απόκλιση) 100

Είναι φανερό από τις δοκιµές και στα δύο συστήµατα διασποράς που χρησιµοποιήθηκαν ότι η παρουσία της κατεχολικής οµάδας δεν είναι ένα δοµικό χαρακτηριστικό που µπορεί να εξασφαλίσει µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα σε ένα τέτοιο σύστηµα. Η επέκταση της συζυγίας στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα ενισχύει την αποτελεσµατικότητα σε συστήµατα διασποράς. Αντίθετα µε τα αποτελέσµατα της δοκιµής δέσµευσης της ρίζας DPP, στην περίπτωση των συστηµάτων διασποράς οι σχετικές διαφορές στη δραστικότητα ήταν µεγαλύτερες µεταξύ των διφαινολών παρά µεταξύ των µονοφαινολών. 4.3.2 Υπολογιστική προσέγγιση SAR Η επίδραση του διπλού δεσµού στην αντιοξειδωτική δραστικότητα του καφεϊκού και του διυδροκαφεϊκού οξέος, αλλά και της οµάδας των µονοφαινολών µελετήθηκε και υπολογιστικά στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP της DFT. Η τιµή της ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού Ο-Η στο φαινολικό υδροξύλιο, η κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας (spin) των ελευθέρων ριζών και η ιδιοτιµή του υψηλότερου κατεχόµενου µοριακού τροχιακού (ΗΟΜΟ) υπολογίστηκαν στην αέρια φάση και σε σύνολο βάσης 6-31+G(d), σύµφωνα µε τους Bakalbassis et al. (2001). Οι υπολογισµοί πραγµατοποιήθηκαν σε µια προσπάθεια να εξεταστεί κατά πόσο οι σχετικές διαφορές που παρατηρήθηκαν στην πειραµατική διαδικασία υποστηρίζονταν ή και ήταν δυνατόν να προβλεφθούν µε κάποιο από τους παραπάνω µοριακούς δείκτες. 4.3.2.1 Βελτιστοποίηση της γεωµετρίας των υπό µελέτη βιοφαινολών Για την πραγµατοποίηση µιας υπολογιστικής µελέτης της αντιοξειδωτικής συµπεριφοράς των ΑΗ, απαραίτητη προϋπόθεση είναι η γνώση της γεωµετρίας τόσο των µητρικών ενώσεων, όσο και των αντίστοιχων ελεύθερων ριζών. Όπως προκύπτει από τη βιβλιογραφία, οι δοµές των υπό µελέτη ΑΗ δεν έχουν επιλυθεί ούτε πειραµατικά ούτε και θεωρητικά. Το γεγονός αυτό προσδίδει µια επιπλέον αξία στα αποτελέσµατα των θεωρητικών µας υπολογισµών. Έτσι λοιπόν οι δοµές των µητρικών ΑΗ καθώς και των αντίστοιχων ριζών βελτιστοποιήθηκαν αρχικά και στη συνέχεια έγινε ο υπολογισµός όλων των τιµών ενέργειας που προαναφέρθηκαν. Η βελτιστοποίηση της γεωµετρίας έγινε στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP της DFT. 101

102 Η δοµή των µητρικών ΑΗ, όπως προέκυψε µετά από τη διαδικασία βελτιστοποίησης της δοµής δίνεται για τις διφαινόλες στο Σχήµα 4.18 και για τις µονοφαινόλες στο Σχήµα 4.19. Ι ΙΙ Σχήµα 4.18 Βελτιστοποιηµένη δοµή Ι) καφεϊκού οξέος και ΙΙ) διυδροκαφεϊκού οξέος στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d)

103 ΙΙΙ IV V Σχήµα 4.19 Βελτιστοποιηµένη δοµή ΙΙΙ) ισοευγενόλης, ΙV) διυδροευγενόλης και V) ευγενόλης στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d)

Αντίθετα η διαµόρφωση στο χώρο των υπολοίπων ΑΗ είναι τρισδιάστατη όπως φαίνεται και στο παραπάνω σχήµα. Η απουσία του διπλού δεσµού σε συζυγιακή θέση στην πλευρική αλυσίδα επιτρέπει την ελεύθερη περιστροφή της πλευρικής αλυσίδας. περιστροφή αυτή, ενδέχεται να επηρεάζει τη δραστικότητα των ΑΗ ως προς τη δέσµευση ελεύθερων ριζών, καθώς εισάγονται φαινόµενα στερεοχηµικής παρεµπόδισης. Επίσης, η διαφορά στη διαµόρφωση των ΑΗ στο χώρο που επιφέρει η θέση του διπλού δεσµού στην πλευρική αλυσίδα µπορεί να επηρεάζει την πολικότητα των ΑΗ και κατά συνέπεια τη δραστικότητά τους σε λιπαρά υποστρώµατα. Για παράδειγµα ενδέχεται η τρισδιάστατη διαµόρφωση των ΑΗ να περιορίζει τη διέλευση από τις κυτταρικές µεµβράνες ή τα λιποσώµατα (Niki et al., 1985, Nenadis et al., 2003 a). Κάτι τέτοιο θα οδηγούσε σε περιορισµό της δραστικότητας in vivo. 4.3.2.2 Ενθαλπία διάσπασης δεσµού (BDE) του φαινολικού υδροξυλίου των βιοφαινολών Καθώς οι ΑΗ δεσµεύουν τις ελεύθερες ρίζες κυρίως µε απόδοση ατόµου υδρογόνου αρχικά υπολογίστηκε η τιµή της ενθαλπίας διάσπασης δεσµού (BDE) του φαινολικού υδροξυλίου που αποτελεί µέτρο της ικανότητας απόδοσης του φαινολικού υδρογόνου προς την ελεύθερη ρίζα (Bakalbassis et al., 2001, Wright et al., 2001, Zhang 1998, 1999 b, Zhang et al., 2000, 2001). Οι τιµές BDE δίνονται στον Πίνακα 4.11. Πίνακας 4.11 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των ΑΗ στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d) ΑΗ p α r b,c BDE d Καφεϊκό οξύ -648.510964-647.902003 69,68 ιυδροκαφεϊκό οξύ -649.707369-649.097288 70,38 Ισοευγενόλη -538.510172-537.892038 75,44 ιυδροευγενόλη -539.711098-539.089011 77,92 Ευγενόλη -538.500524-537.877529 78,58 a Ενθαλπία µητρικής ένωσης σε artree, b Ενθαλπία φαινοξυ-ρίζας, c Η Ενθαλπία του ατόµου υδρογόνου είναι 0.497912 artree, d BDE σε kcal/mol Το καφεϊκό οξύ, λόγω της µικρότερης τιµής BDE κατά 0,7 kcal/mol, δεσµεύει αποτελεσµατικότερα τις ελεύθερες ρίζες σε σχέση µε το διυδροανάλογό του. Η 104

διαφορά στις τιµές BDE φαίνεται ότι είναι µικρή καθώς µικρές ήταν και οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στη δραστικότητα των δύο ενώσεων µε τη δοκιµή DPP. Η τιµή BDE για την ισοευγενόλη βρέθηκε να είναι ~3 kcal/mol µικρότερη από εκείνη των δύο άλλων µονοφαινολών. Η διαφορά αυτή φαίνεται σηµαντική καθώς βάσει των τιµών ΑΕ η ισοευγενόλη ήταν 50 φορές πιο αποτελεσµατική από τις άλλες δύο. Η διυδροευγενόλη και η ευγενόλη που επίσης σηµείωσαν παρόµοια δράση πειραµατικά δε διέφεραν σηµαντικά στην τιµή της BDE (0,7 kcal/mol). Σε προηγούµενη εργασία (Bakalbassis et al., 2001) φάνηκε ότι η σειρά της δραστικότητας των ΑΗ σε µοντέλα ελαίων συµβάδιζε µε εκείνη που προέκυπτε βάσει των τιµών BDE. Στην προκειµένη περίπτωση µε βάση τις τιµές BDE η συµπεριφορά της ισοευγενόλης σε έλαια ήταν αναµενόµενη, ενώ η µεγαλύτερη δραστικότητα του διυδροκαφεϊκού οξέος δεν ήταν δυνατόν να δικαιολογηθεί. 4.3.2.3 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας (spin) των ελευθέρων ριζών Η αντιοξειδωτική συµπεριφορά µιας ΑΗ δεν χαρακτηρίζεται µόνο από την ευκολία µε την οποία αποδίδει άτοµα υδρογόνου από το φαινολικό υδροξύλιο στις ελεύθερες ρίζες. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η φαινοξυ-ρίζα που σχηµατίζεται µετά την απόδοση ατόµου υδρογόνου να είναι σταθερή και να µη συµµετέχει σε παράπλευρες αντιδράσεις. Συµµετοχή σε παράπλευρες αντιδράσεις ενδέχεται να οδηγήσει στην εµφάνιση προοξειδωτικής συµπεριφοράς (Pokorny, 1987). Η σταθερότητα των ελευθέρων ριζών στην περίπτωση των υπό µελέτη ΑΗ εκτιµήθηκε µε βάση τον υπολογισµό της κατανοµής της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου τους. Τα αποτελέσµατα δίνονται στο Σχήµα 4.20. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.20 οι ενώσεις που διαθέτουν το διπλό δεσµό σε συζυγιακή θέση στην πλευρική αλυσίδα σχηµατίζουν και τις σταθερότερες ελεύθερες ρίζες. Ο διπλός δεσµός µε τη συµµετοχή του σε συντονισµό συντελεί στη διάχυση της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου σε όλο το συζυγιακό σύστηµα. Στις διυδρο ενώσεις και την ευγενόλη η διάχυση περιορίζεται µόνο στον αρωµατικό δακτύλιο. Εποµένως, οι φαινοξυ-ρίζες τόσο του καφεϊκού οξέος, όσο και της ισοευγενόλης είναι περισσότερο σταθερές και η πιθανότητα να λάβουν µέρος σε παράπλευρες αντιδράσεις είναι µικρότερη. 105

0,29 0,08 0,28-0,18-0,01 0,36 0,18-0,10 I 0,05 0,08 0,26 0,29-0,18 0,34-0,18 0,34-0,01-0,02 0,20-0,07 II 0,31 0,06 0,29-0,21-0,07 0,42 3 0,29-0,18-0,03 0,37 0,06 3 0,31-0,19-0,07 0,37 0,37 0,06 0,31-0,16-0,09 0,37 3-0,03 0,03 0,25-0,14 0,28-0,13 0,18-0,17 III IV V Σχήµα 4.20 Κατανοµή της ηλεκτρονιακής πυκνότητας του µονήρους ηλεκτρονίου στις φαινοξυ-ρίζες Ι) καφεϊκού οξέος, II) διυδροκαφεϊκού οξέος, ΙΙΙ) ισοευγενόλης, ΙV) διυδροευγενόλης και V) ευγενόλης στο θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-31+G(d) Η σταθερότερη φαινοξυ-ρίζα του καφεϊκού οξέος λόγω επέκτασης της συζυγίας στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα και του σχηµατισµού ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου, µπορεί να δικαιολογήσει πιθανότατα την ταχύτατη ολοκλήρωση της αντίδρασής του µε την ABTS +. Ωστόσο, ο υπολογισµός της κατανοµής της ηλεκτρονιακής πυκνότητας στις σχηµατιζόµενες φαινοξυ-ρίζες δε µπορεί να ερµηνεύσει τη µεγαλύτερη δραστικότητα του διυδροκαφεϊκού οξέος σε έλαια. 4.3.2.4 Ιδιοτιµή του υψηλότερου κατεχόµενου µοριακού τροχιακού (ΗΟΜΟ) Η δέσµευση των ελεύθερων ριζών από τις ΑΗ εκτός από την απόδοση ατόµου υδρογόνου, έχει αναφερθεί ότι µπορεί να γίνει και µε απόδοση ηλεκτρονίου (Gordon, 1990). Σε µια τέτοια περίπτωση η αντιοξειδωτική δράση των ΑΗ καθορίζεται από την ικανότητά τους να αποδίδουν ηλεκτρόνια. Μια κατάλληλη παράµετρος για την εκτίµηση της ικανότητας αυτής µπορεί να αποτελέσει ο υπολογισµός της ενέργειας του ΗΟΜΟ. Σύµφωνα µε τις ιδιοτιµές ΗΟΜΟ το διυδροκαφεϊκό οξύ µπορεί να αποδώσει ευκολότερα ηλεκτρόνια (-0,2239 a.u.) από το καφεϊκό οξύ (-0,2294 a.u.). Αντίθετα στην περίπτωση των µονοφαινολών, η ισοευγενόλη είναι η ένωση που αποδίδει ευκολότερα 106

ηλεκτρόνια (-0,2010 a.u.) σε σχέση µε τη διυδροευγενόλη (-0,2102 a.u.) και την ευγενόλη (-0,2132 a.u). Η σειρά δραστικότητας όπως προκύπτει βάσει των ιδιοτιµών ΗΟΜΟ βρίσκεται σε συµφωνία µε εκείνη σε έλαια. Ωστόσο χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση για τη σηµασία αυτής της παραµέτρου στην ερµηνεία πειραµατικών αποτελεσµάτων, ιδιαίτερα όταν έχουν εκφραστεί επιφυλάξεις για τη σηµασία της στην πρόβλεψη της δραστικότητας ΑΗ που σχηµατίζουν ενδοµοριακούς δεσµούς υδρογόνου (Zhang, 1999 a). Με βάση τα αποτελέσµατα της πειραµατικής κυρίως αλλά και της υπολογιστικής προσέγγισης προέκυψε ότι δεν είναι απαραίτητη η αναζήτηση νέων πηγών διυδροκαφεϊκού οξέος, καθώς το καφεϊκό που υπάρχει σε πολλές φυτικές πηγές βρέθηκε να είναι αποτελεσµατικότερο του διυδροανάλογού του στα περισσότερα συστήµατα που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη. Ενδιαφέρον για περαιτέρω εξέταση παρουσίασε η ισοευγενόλη που βρέθηκε να είναι σηµαντικό αντιοξειδωτικό κάτω από όλες τις πειραµατικές συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν. Οι ιδιότητες της ισοευγενόλης απαιτούν παραπέρα διερεύνηση. 107

4.4 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΟΜΑ ΩΝ ΤΗΣ ΠΛΕΥΡΙΚΗΣ ΑNΘΡΑΚΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙ ΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΟΥ π-υ ΡΟΞΥΚΙΝΝΑΜΩΜΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΗΣ ΙΣΟΕΥΓΕΝΟΛΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΓΕΝΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Στην προηγούµενη ενότητα (4.3) διαπιστώθηκε ότι η επέκταση της συζυγίας στην πλευρική υδρογονανθρακική αλυσίδα ορισµένων βιοφαινολών είναι επιθυµητό δοµικό χαρακτηριστικό για την αποτελεσµατική δέσµευση των ελευθέρων ριζών, που είναι εντονότερη στις µονοφαινόλες. Η συµπεριφορά της ισοευγενόλης παρουσίασε µεγάλο ενδιαφέρον καθώς κατά τη συγκριτική µελέτη µε άλλες συγγενείς της ενώσεις, όπως η ευγενόλη και η διυδροευγενόλη, βρέθηκε να πλεονεκτεί µε µη αναµενόµενο τρόπο. Επίσης, σε συγκεκριµένες πειραµατικές συνθήκες πλεονεκτούσε ακόµα και έναντι του καφεϊκού οξέος, που είναι γνωστό ισχυρό αντιοξειδωτικό. Η ισοευγενόλη είναι συστατικό του αιθερίου ελαίου αρωµατικών φυτών, ανήκει στην κατηγορία των φαινυλοπροπενίων και θεωρείται ότι προέρχεται από την αναγωγή του φερουλικού οξέος (Dawidar et al., 1998), παραγώγου του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος µε αντιοξειδωτική δράση, που απαντάται σε πολλά φυτικά υλικά (Faulds and Williamson, 1999). Η ισοευγενόλη, λόγω της επέκτασης της συζυγίας στην πλευρική αλυσίδα (1, 2-θέση) έχει την τάση να υφίσταται αλλαγές στη δοµή της (π.χ. εποξείδωση, υδροξυλίωση, οξειδωτικό πολυµερισµό κ.α) που οδηγούν στο σχηµατισµό ενώσεων όπως η κωνιφερυλαλδεΰδη και η κωνιφερυλαλκοόλη ή και πιο σύνθετων ενώσεων (Dawidar et al., 1998). Χαρακτηριστικό παράδειγµα τέτοιων ενώσεων αποτελεί η λικαρίνη Α (Σχήµα 4.21 Α), που αποµονώθηκε πρόσφατα από το φυτό Aristolochia pubescens και µπορεί να προκύψει µε οξειδωτικό πολυµερισµό της ισοευγενόλης (Nascimento and Lopes, 1999), αλλά και η πινορεσινόλη (Σχήµα 4.21 Β) που µπορεί να προκύψει µε οξειδωτικό πολυµερισµό της κωνιφερυλαλκοόλης (arborne 1989, Dawidar et al., 1998). 108

A 3 B 3 3 3 Σχήµα 4.21 Συντακτικοί τύποι λικαρίνης Α (Α) και πινορεσινόλης (Β) Λόγω της αξιοσηµείωτης δραστικότητας που παρουσίασε η ισοευγενόλη, αλλά και της εν γένει σπουδαιότητάς της καθώς αποτελεί πρόδροµη ένωση άλλων A, επιχειρήθηκε να µελετηθεί συγκριτικά µε ενώσεις που διέφεραν ως προς τη χαρακτηριστική οµάδα στο άκρο της ανθρακικής τους αλυσίδας. Οι οµάδες στο τέλος της αλυσίδας που επιλέχθηκαν ήταν (φερουλικό οξύ), -Ο 2 5 (αιθυλεστέρας φερουλικού οξέος), - 2 (κωνιφερυλαλκοόλη), - (κωνιφερυλαλδεΰδη) και - 3 (ισοευγενόλη) (Σχήµα 4.22). Όλες οι ενώσεις που µελετήθηκαν είναι βιοφαινόλες. Οι χαρακτηριστικές οµάδες φαίνεται να επηρεάζουν την πολικότητα των ΑΗ, ενώ επίσης η κάθεµιά τους εισάγει διαφορετικά ηλεκτρονιακά φαινόµενα (Ι, R) (ansch et al., 1991). 3 3 3 3 3 2 3 Φερουλικό οξύ Αιθυλεστέρας Κωνιφερυλαλκοόλη Κωνιφερυλαλδεΰδη Ισοευγενόλη Φερουλικού οξέος Σχήµα 4.22 Συντακτικοί τύποι ισοευγενόλης και συγγενών ενώσεων 109

4.4.1 Πειραµατική προσέγγιση SAR Η πειραµατική µελέτη της επίδρασης των χαρακτηριστικών οµάδων της πλευρικής αλυσίδας στη δραστικότητα των επιλεγµένων ενώσεων παραγµατοποιήθηκε µε παρακολούθηση της αντίδρασης δέσµευσης της ρίζας DPP µέχρι την επίτευξη σταθερής κατάστασης για διαφορετικές συγκεντρώσεις, µε δοκιµή δέσµευσης της ρίζας ABTS + καθώς και µε µελέτες επιταχυνόµενης οξείδωσης ελαίων και συστηµάτων διασποράς. 4.4.1.1 οκιµή δέσµευσης ελευθέρων ριζών Τα αποτελέσµατα της εκτίµησης της ικανότητας των υπό µελέτη ΑΗ να δεσµεύουν την ελεύθερη ρίζα DPP δίνονται στον Πίνακα 4.12. Στον ίδιο Πίνακα δίνονται και οι τιµές της σταθεράς σ p (Brown) παραµέτρου που εκφράζει το σύνολο των ηλεκτρονιακών φαινοµένων που εισάγει µια οµάδα σε ένα αρωµατικό δακτύλιο (ansch et al., 1991). Πίνακας 4.12 Εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν τη DPP A E 50 Στοιχειοµετρία AE T E50 σ p αντίδρασης (min) Φερουλικό οξύ 0,47 1,06 0,04 48 0,45 Αιθυλεστέρας 0,51 0,98 0,03 65 0,45 φερουλικού οξέος Κωνιφερυλαλδεΰδη 0,48 1,04 0,03 70 0,42 Κωνιφερυλαλκοόλη 0,43 1,16 0,86 2,7 0,00 Ισοευγενόλη 0,49 1,02 1,2 1,7-0,17 * (ansch et al., 1991) Σύµφωνα µε τη στοιχειοµετρία της αντίδρασης, όλες οι ενώσεις βρέθηκαν να είναι το ίδιο αποτελεσµατικές, καθώς δέσµευσαν µια ρίζα µε το µοναδικό διαθέσιµο φαινολικό τους υδροξύλιο. Και στην περίπτωση αυτή ο υπολογισµός της παραµέτρου ΑΕ, που περιελάµβανε και την τιµή T E50 βοήθησε στη διαφοροποίηση των ΑΗ ως προς την ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών. Συγκεκριµένα, η ισοευγενόλη και η 110

κωνιφερυλαλκοόλη λόγω της ταχύτερης αντίδρασης τους µε την ελεύθερη ρίζα βρέθηκαν 30 φορές πιο αποτελεσµατικές από τις υπόλοιπες ενώσεις. Το φερουλικό οξύ, ο αιθυλεστέρας του και η κωνιφερυλαλδεΰδη είχαν µεταξύ τους ανάλογη συµπεριφορά και λόγω της αργής κινητικής τους µε τη ρίζα οι τιµές ΑΕ ήταν ιδιαίτερα χαµηλές (ΑΕ=0,03). Η σηµασία της παρατήρησης αυτής φαίνεται καλύτερα στο Σχήµα 4.23 όπου παρουσιάζεται η κινητική της αντίδρασης των ενώσεων µε την ελεύθερη ρίζα. [τα στοιχεία για την ισοευγενόλη δόθηκαν στην ενότητα 4.3]. [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 φερουλικό οξύ 0 20 40 60 80 100 χρόνος, min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,55 0,6 0,8 [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 αιθυλεστέρας φερουλικού οξέος 0 20 40 60 80 100 χρόνος, min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,55 0,6 0,8 [DPP] (% αρχικής) 100 Ισοευγενόλη 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 χρόνος, min 0.08 0.2 0.4 0.5 0.55 0.6 κωνιφερυλαλδεΰδη κωνιφελυλακοόλη [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 χρόνος, min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,55 0,6 0,8 [DPP] (% αρχικής) 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 χρόνος, min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,45 0,5 0,55 0,8 Σχήµα 4.23 Κινητική της αντίδρασης του φερουλικού οξέος, του αιθυλεστέρα του φερουλικού οξέος, της κωνιφερυλαλκοόλης και της κωνιφερυλαλδεΰδης µε τη DPP σε αιθανόλη. (Οι αριθµοί παριστάνουν λόγους συγκεντρώσεων [ΑΗ]/[DPP ] (mol/mol) που απαιτήθηκαν για την κατασκευή της κάθε καµπύλης) 111

Οι ΑΗ που παρουσίασαν αργή κινητική αντίδρασης µε τη DPP στη συγκεκριµένη περίπτωση δε βρέθηκε να δεσµεύουν περισσότερες ρίζες από τα διαθέσιµα φαινολικά τους υδροξύλια. Η παρατήρηση αυτή ήταν αντίθετη µε εκείνη που έγινε σε προηγούµενη ενότητα (Πίνακας 4.7), για την ευγενόλη και τη διυδροευγενόλη. Η αργή κινητική που παρουσίασε το φερουλικό οξύ (T E50 = 48 min), σε σύγκριση µε τη γρήγορη κινητική της αντίδρασης µε το καφεϊκό οξύ (T E50 = 5 min), επιβεβαιώνει την άποψή µας ότι η παρουσία της κατεχολικής οµάδας µπορεί να επισκιάζει την επίδραση άλλων δοµικών χαρακτηριστικών της πλευρικής ανθρακικής αλυσίδας στην ικανότητα των ΑΗ να δεσµεύουν ελεύθερες ρίζες. Με βάση τα πειραµατικά δεδοµένα φαίνεται ότι η παρουσία των οµάδων 3 και 2 αυξάνουν την ηλεκτρονιακή πυκνότητα του φαινολικού υδροξυλίου µε αποτέλεσµα να είναι ευκολότερη η απόδοση ατόµου υδρογόνου προς τις ελεύθερες ρίζες. Η σειρά της αντιοξειδωτικής δράσης των ΑΗ όπως προέκυψε µε τις τιµές ΑΕ ήταν σε συµφωνία µε τον πυρηνόφιλο/ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα των οµάδων στο άκρο της ανθρακικής αλυσίδας, όπως αυτός ορίζεται από τη σταθερά σ p (Πίνακας 4.13). Το γεγονός αυτό είναι ιδαίτερα σηµαντικό στην περίπτωση της αναζήτησης νέων αντιοξειδωτικών, καθώς η γνώση των ηλεκτρονιακών φαινοµένων που µπορεί να εισάγουν διάφοροι υποκαταστάτες και περιγράφονται από κάποια σταθερά µπορεί να αποτελέσει τρόπο πρόβλεψης της αποτελεσµατικότητας ενός νέου ΑΗ. Ταυτόχρονα, οι ερευνητές είναι δυνατόν να προσανατολίζονται στην αναζήτηση ΑΗ µε συγκεκριµένα δοµικά χαρακτηριστικά. Παρά τις επιφυλάξεις που διατυπώθηκαν στην παράγραφο 4.2 οι πέντε µονοφαινόλες µελετήθηκαν και ως προς την ικανότητά τους να δεσµεύουν την κατιοντική ρίζα ABTS +. Τα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα 4.13. Ολες οι ενώσεις δέσµευαν την ελεύθερη ρίζα. Στην περίπτωση αυτή όµως η σειρά δραστικότητας δεν ήταν η αναµενόµενη µε βάση τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που συζητήθηκαν προηγουµένως ή τις παρατηρήσεις που έγιναν µε τη δοκιµή DPP, αν και οι επιµέρους διαφορές στη δραστικότητα δεν ήταν τόσο σηµαντικές. Επιπλέον, κατά την καταγραφή του φάσµατος της ισοευγενόλης κατά τη διάρκεια της αντίδρασης µε την ελεύθερη ρίζα (Σχήµα 4.24) δε διαπιστώθηκε συµπεριφορά ανάλογη µε εκείνη που παρατηρήθηκε για το καφεϊκό οξύ, δηλαδή ταχύτατη αντίδραση. 112

Πίνακας 4.13 Εκτίµηση της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν την ABTS + A Φερουλικό οξύ Αιθυλεστέρας φερουλικού οξέος Κωνιφερυλαλδεΰδη Κωνιφερυλαλκοόλη Ισοευγενόλη ΤEΑ* 1,31±0,02 a 0,72±0,03 b 1,15±0,02 c 0,95±0,00 d 0,92±0,01 d *Μ. ο. τριών πειραµάτων (±sd=τυπική απόκλιση. Οι τιµές στην ίδια στήλη µε διαφορετικούς λατινικούς χαρακτήρες διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95% Αbs Σχήµα 4.24 Περιοδική καταγραφή φάσµατος ABTS + (400-900 nm) σε χρόνο 0-6 min κατά την αντίδραση µε την ισοευγενόλη (10 µμ) σε αιθανόλη Έτσι, ακόµη µια φορά επιβεβαιώθηκαν οι γενικές παρατηρήσεις για τη χρησιµότητα της µεθόδου που δόθηκαν στην ενότητα 4.2. 4.4.1.2 Επιταχυνόµενη δοκιµή οξείδωσης καθαρισµένης τριελαΐνης Σύµφωνα µε στοιχεία που προέκυψαν στην ενότητα 4.3 κατά τη συγκριτική µελέτη της ισοευγενόλης µε τη διυδροευγενόλη και την ευγενόλη ως µέσων επιβράδυνσης της αυτοξείδωσης της τριελαΐνης, η ισοευγενόλη φάνηκε να αποκλίνει 113

από την υπόθεση του πολικού παράδοξου καθώς η δραστικότητά της δεν ήταν η αναµενόµενη. Για το λόγο αυτό κρίθηκε απαραίτητο να διερευνηθεί η πολικότητα της ισοευγενόλης και των υπό µελέτη ενώσεων. Η πολικότητα µιας ΑΗ εκτιµάται συνήθως µε βάση τον συντελεστή κατανοµής (P) σε µίγµα κ-οκτανόλης:νερού (1:1) αλλά και µε υπολογισµό των τιµών R f (Relative front) µετά από χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας. Η πολικότητα τις ισοευγενόλης και των άλλων ενώσεων εκτιµήθηκε στην παρούσα εργασία µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (Porter et al., 1989). Σύµφωνα µε τις τιµές R f (Retention factor) η σειρά ελαττούµενης πολικότητας ήταν: κωνιφερυλαλκοόλη (R f =0,57) <φερουλικό οξύ (R f =0,64) <κωνιφερυλαδλεΰδη (R f =0,76) <αιθυλεστέρας φερουλικού οξέος (R f =0,85) <ισοευγενόλη (R f =0,88). Βάσει της υπόθεσης του πολικού παράδοξου αναµενόταν ότι πιο αποτελεσµατικές θα ήταν οι ΑΗ µε τη µεγαλύτερη πολικότητα. Ωστόσο όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.25 παρατηρήθηκαν κάποιες αποκλίσεις από την αναµενόµενη συµπεριφορά. Αριθµός Υπεροξειδίων meq 2 / kg 300 250 200 150 100 50 0 0 200 400 600 800 χρόνος, h Μάρτυρας + Φερουλικό οξύ +Αιθυλεστέρας φερ. oξέος +Κωνιφερυλαλδεΰδη +Κωνιφερυλαλκοόλη +Ισοευγενόλη Σχήµα 4.25 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης ισοευγενόλης και συγγενών ενώσεων (30 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο. (Οι τιµές σε κάθε σηµείο είναι ο µ.ο. δύο µετρήσεων) 114

Η πιο πολική από τις ενώσεις, η κωνιφερυλαλκοόλη και η λιγότερο πολική ισοευγενόλη σηµείωσαν την ίδια δραστικότητα (IP=750 h) που ήταν µάλιστα 2,5 φορές υψηλότερη από εκείνη των υπόλοιπων ενώσεων (IP=300 h). Αντίθετα, το φερουλικό οξύ αν και πολικό παρουσίασε ανάλογη συµπεριφορά µε τις λιγότερο πολικές ΑΗ που ήταν ο αιθυλεστέρας του και η κωνιφερυλαλδεΰδη. Οι τρεις αυτές ενώσεις για το επίπεδο προσθήκης που χρησιµοποιήθηκε (30 ppm) µόλις που προστάτευαν την τριελαΐνη κατά την οξείδωση. Η καλύτερη αποτελεσµατικότητα της ισοευγενόλης έναντι αυτής του φερουλικού οξέος σε µοντέλα ελαίων έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία, χωρίς ωστόσο να δοθεί ιδιαίτερη έµφαση από τους ερευνητές στη σχέση δοµής-αντιοξειδωτικής ικανότητας (Terao et al., 1993, uvelier et al., 2000). Η αποτελεσµατικότητα των υπό µελέτη ΑΗ στην καθαρισµένη τριελαΐνη (45 o ) εξηγείται καλύτερα µε τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγουν οι υποκαταστάτες παρά µε την υπόθεση του πολικού παράδοξου. 4.4.1.3 Επιταχυνόµενη δοκιµή οξείδωσης σε συστήµατα διασποράς Η σειρά δραστικότητας των υπό µελέτη ΑΗ τόσο µε τη δοκιµή δέσµευσης της DPP, όσο και µε τη δοκιµή σε τριελαΐνη φαίνεται ότι ήταν σε συµφωνία µε τα ηλεκτρονικά φαινόµενα που εισάγουν οι διαφορετικοί υποκαταστάτες στο άκρο της ανθρακικής αλυσίδας. Οι ΑΗ µελετήθηκαν στη συνέχεια και σε συστήµατα διασποράς για να διαπιστωθεί κατά πόσο τα ηλεκτρονικά φαινόµενα στα συστήµατα αυτά επηρεάζουν την αποτελεσµατικότητα των ΑΗ ή αν άλλοι παράγοντες είναι πιο καθοριστικοί. οκιµή σε γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό Η µελέτη πραγµατοποιήθηκε σε γαλακτώµατα τριελαΐνης σε νερό παρουσία γαλακτωµατοποιητή Tween 20. Οι ΑΗ εξετάστηκαν σε ένα επίπεδο προσθήκης (150 µm) µε βάση τα αποτελέσµατα της ενότητας 4.3.1.4. Έτσι, παρασκευάστηκαν σειρές γαλακτωµάτων χρησιµοποιώντας αποσταγµένο νερό ή ρυθµιστικά διαλύµατα προκειµένου να διαπιστωθεί κατά πόσο η διακύµανση της τιµής p επηρεάζει τη σχετική σειρά της δραστικότητας των ενώσεων. Τα ρυθµιστικά διαλύµατα που χρησιµοποιήθηκαν είχαν τιµή p 3,7 και 5,7 αντίστοιχα. Η πρώτη τιµή επιλέχθηκε ως χαρακτηριστική τιµή όξινων τροφίµων (Muriana and Kanach, 1995), ενώ η δεύτερη ως 115

η αρχική τιµή p στα γαλακτώµατα µε αποσταγµένο νερό. Στην περίπτωση των γαλακτωµάτων µε αποσταγµένο νερό η τιµή p ελαττώθηκε από 5,7 σε 4,3 κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας, πιθανότατα λόγω σχηµατισµού οργανικών οξέων κατά την πορεία της οξείδωσης. Ταυτόχρονα, η πολικότητα των ΑΗ που καθορίζει την κατανοµή τους στη λιπαρή φάση και επηρεάζει την αποτελεσµατικότητά τους σε συστήµατα διασποράς (Mclemennts and Decker, 2000) εκτιµήθηκε και µε προσδιορισµό του λογαρίθµου του συντελεστή κατανοµής (Log P) σε µίγµα κ-οκτανόλης:νερού (1:1, v/v). Αυτή τη φορά ο προσδιορισµός του Log P δεν έγινε πειραµατικά αλλά υπολογιστικά µε τη βοήθεια του προγράµµατος hemdraw (Broto et al., 1984). Η εκτίµηση των τιµών LogP µε τον τρόπο αυτό είναι απλή και έχει αρχίσει να εµφανίζεται και στη βιβλιογραφία σε µελέτες SAR (Son and Lewis, 2002). Η σειρά λοιπόν αυξανόµενης κατανοµής στην οργανική φάση βάσει τον υπολογισθεισών τιµών LogP ήταν: κωνιφερυλαλκοόλη (1,33) <φερουλικό οξύ (1,42) <κωνιφερυλαλδεΰδη (1,82) <αιθυλεστέρας φερουλικού οξέος (2,02) <ισοευγενόλη (2,49). Η σειρά αυτή ήταν ίδια µε εκείνη που προέκυψε κατά την εκτίµηση της πολικότητας των ίδιων ενώσεων πειραµατικά µε χρωµατογραφία ΤL, εποµένως η τεχνική αυτή ίσως µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως εναλλακτική των πειραµατικών προσεγγίσεων. Βάσει των τιµών Log P φαίνεται ότι οι χαρακτηριστικές οµάδες στο άκρο της ανθρακικής αλυσίδας των συγκεκριµένων παραγώγων του π-υδροξυκινναµωµικού οξέος διαφοροποιούν τις ενώσεις σηµαντικώς ως προς την κατανοµή τους στη λιπαρή φάση. Εποµένως, η ισοευγενόλη, ο αιθυλεστέρας του φερουλικού οξέος, αλλά και η κωνιφερυλαλδεΰδη αναµένεται να είναι περισσότερο αποτελεσµατικές σε συστήµατα διασποράς, καθώς η χαµηλή πολικότητά τους εξασφαλίζει µεγαλύτερη κατανοµή στη λιπαρή φάση. Τα αποτελέσµατα της µελέτης για τις ενώσεις δίνονται στο Σχήµα 4.26. Οι ενώσεις παρουσίασαν αντιοξειδωτική δράση και στα τρία περιβάλλοντα. Η παρουσία των ρυθµιστικών διαλυµάτων που ήταν µίγµατα διαλυµάτων οξικού οξέος-οξικού νατρίου δε φάνηκε να επηρεάζει τη σειρά και το µέγεθος της δραστικότητας των ενώσεων, ίσως γιατί οι διαφορές των τιµών p στα τρία συστήµατα δεν ήταν σηµαντικές. Στην περίπτωση του µάρτυρα παρατηρήθηκε µια επιτάχυνση της οξείδωσης µε ελάττωση της τιµής του p. Η επιτάχυνση αυτή πιθανότατα να οφείλεται σε αύξηση της διαλυτότητας ιχνών µετάλλων που για τυχαίο λόγο υπάρχουν στο σύστηµα (Frankel, 1998). 116

A Αριθµός Υπεροξειδίων meq Ο2/ kg ελαίου 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Μάρτυρας +Κωνιφερυλαλδεΰδη + Ισοευγενόλη + Αιθυλεστέρας φερ. οξέος + Κωνιφερυλαλκοόλη + Φερουλικό οξύ 0 1 2 3 4 χρόνος, d Β Αριθµός Υπεροξειδίων meq Ο2/ kg ελαίου 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 χρόνος, d Γ 3000 Αριθµός Υπεροξειδίων meq Ο2/ kg ελαίου 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 χρόνος, d Σχήµα 4.26 Οξείδωση γαλακτωµάτων τριελαΐνης σε νερό (10 %, w/w) στους 37 ο παρουσία A (150 µμ) α) p=3,7 β) p=5,7 γ) απoσταγµένο νερό. (Οι τιµές του αριθµού υπεροξειδίων είναι ο µ.ο. τριών µετρήσεων± τυπική απόκλιση) 117

4.4.2 Υπολογιστική προσέγγιση SAR Η επίδραση των διαφορετικών υποκαταστατών στην αντιοξειδωτική συµπεριφορά της ισοευγενόλης και των άλλων ενώσεων µελετήθηκε και υπολογιστικά σε συνδυασµό µε τη χρήση του ηµιεµπειρικού µοντέλου ΑΜ1 και το θεωρητικό επίπεδο B3LYP/6-311+G (2d, 2p). Για τις ανάγκες της µελέτης έγινε υπολογισµός των τιµών της ενθαλπίας του ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου ( ΟΗ---Ο 3 ), της ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού Ο-Η του φαινολικού υδροξυλίου και του δυναµικού ιοντισµού (ΙΡ) στην αέρια φάση. Στην περίπτωση του υπολογισµού των τιµών ΙΡ το σύνολο βάσης που χρησιµοποιήθηκε ήταν το 6-31G (d). 4.4.2.1 Βελτιστοποίηση της γεωµετρίας των υπό µελέτη βιοφαινολών Οι υπό εξέταση ΑΗ λόγω της επέκτασης της συζυγίας στην πλευρική αλυσίδα αναµένεται να έχουν επίπεδη διαµόρφωση στο χώρο µε βάση και τα αποτελέσµατα της ενότητας 4.3.2.1 για την ισοευγενόλη. Στη συγκεκριµένη περίπτωση η βελτιστοποίηση της γεωµετρίας των υπό µελέτη ενώσεων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρησιµοποίηση του ηµιεµπειρικού µοντέλου ΑΜ1 ενώ η DFT χρησιµοποιήθηκε στη συνέχεια για τον υπολογισµό της ενέργειας. Η επιλογή αυτή στηρίχθηκε στα αποτελέσµατα των Sun et al. (2002) κατά τη σύγκριση των δοµών οµάδας φαινολικών ενώσεων µετά τη βελτιστοποίησή τους µε το µοντέλο ΑΜ1 και τη DFT σε σύνολο βάσης 6-31G (d,p). Η σύγκριση των αποτελεσµάτων οδήγησε στο συµπέρασµα ότι η µέθοδος ΑΜ1 έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσµατα καθώς η απόκλιση που παρατηρήθηκε στα µήκη των δεσµών ήταν της τάξης του 0,010 Å. Το γεγονός αυτό κρίθηκε σηµαντικό καθώς η βελτιστοποίηση της γεωµετρίας µε τη χρησιµοποίηση της ηµιεµπειρικής µεθόδου ΑΜ1 µπορεί να συµβάλλει στην εξοικονόµιση υπολογιστικού χρόνου, ενώ τα τελικά αποτελέσµατα δεν υπολείπονται σε ακρίβεια. Όπως είναι φανερό (Σχήµα 4.27) η διαµόρφωση και των άλλων τεσσάρων ενώσεων είναι ανάλογη µε εκείνη της ισοευγενόλης. Εποµένως τυχόν διαφορές στην δραστικότητα εκτιµάται ότι θα επηρεάζονται από τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγουν οι χαρακτηριστικές οµάδες και όχι σε φαινόµενα στερεοχηµικής παρεµπόδισης. 118

119

4.4.2.2 Ενθαλπία ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου Είναι γνωστό ότι οι φαινολικές ενώσεις που διαθέτουν υποκαταστάτες σε ο-θέση (π.χ. υδροξυ- ή µεθοξυ- οµάδες) ως προς το φαινολικό υδροξύλιο σχηµατίζουν ένα ενδοµοριακό δεσµό υδρογόνου που ευνοείται ενεργειακά (Zhang, 1999 b, De eer et al., 1999). Η παρουσία αυτού του δεσµού µπορεί να επηρεάζει την ικανότητα απόδοσης ατόµου υδρογόνου προς τις ελεύθερες ρίζες. Οι τιµές της ενθαλπίας του συγκεκριµένου δεσµού για τα υπό µελέτη ΑΗ δίνονται στον Πίνακα 4.14. Πίνακας 4.14 Τιµές ενθαλπίας του ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-311+G (2d,2p)//ΑΜ1, T=298.15 K. A p a p b Ενθαλπία ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου Φερουλικό οξύ -687,99-687,99 3,91 Αιθυλεστέρας -766,37-766,57 4,55 φερουλικού οξέος Κωνιφερυλαλδεΰδη -612,72-612,71 4,01 Κωνιφερυλαλκοόλη -613,90-613,89 3,93 Ισοευγενόλη -538,67-538,49 3,74 a Ενθαλπία µητρικής ένωσης που διατηρεί το δεσµό υδρογόνου σε artree b Ενθαλπία µητρικής ένωσης που δε διατηρεί το δεσµό υδρογόνου σε artree c Ενθαλπία ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου σε kcal/mol Τα αποτελέσµατα αυτά έδειξαν ότι η ισοευγενόλη είναι η ένωση που σχηµατίζει τον ασθενέστερο δεσµό υδρογόνου. Αντίθετα, ισχυρότερος φαίνεται να είναι ο συγκεκριµένος δεσµός στην περίπτωση του αιθυλεστέρα του φερουλικού οξέος. Ωστόσο η διαφορά στην τιµή της ενθαλπίας του ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου µεταξύ των ΑΗ και µε εξαίρεση τον αιθυλεστέρα (0,81 kcal/mol), ήταν περίπου 0,25 kcal/mol. Εποµένως, η συνεισφορά του ενδοµοριακού δεσµού υδρογόνου στην τελική δραστικότητα των ΑΗ αναµένεται να είναι µικρή. 4.4.2.3 Ενθαλπία διάσπασης δεσµού (BDE) του φαινολικού υδροξυλίου των βιοφαινολών Ο υπολογισµός της BDE του δεσµού - του φαινολικού υδροξυλίου έδωσε τις τιµές που παρουσιάζονται αναλυτικά στον Πίνακα 4.15. 120

Πίνακας 4.15 Τιµές ενθαλπίας διάσπασης (BDE) του δεσµού - των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-311+G (2d,2p)//ΑΜ1, T=298.15 K. A p a r b,c BDE d Φερουλικό οξύ -687,99-687,36 84,32 Αιθυλεστέρας -766,37-765,94 83,90 φερουλικού οξέος Κωνιφερυλαλδεΰδη -612,72-612,0,9 84,38 Κωνιφερυλαλκοόλη -613,90-613,27 81,52 Ισοευγενόλη -538,67-538,042 81,15 a Ενθαλπία µητρικής ένωσης σε artree, b Ενθαλπία φαινοξυ-ρίζας σε artree, c Η Ενθαλπία του ατόµου υδρογόνου είναι 0.497912 artree, d BDE σε kcal/mol Με βάση τις τιµές BDE που υπολογίστηκαν οι ΑΗ διαφοροποιήθηκαν σε δύο οµάδες. Συγκεκριµένα, η ισοευγενόλη και η κωνιφερυλαλκοόλη είχαν τις χαµηλότερες τιµές BDE κατά 2,4-3,1 kcal/mol από τις υπό εξέταση ΑΗ, γεγονός που υποδεικνύει ότι αναµένεται να δεσµεύουν αποτελεσµατικότερα τις ελεύθερες ρίζες. Οι υπόλοιπες τρεις είχαν παρόµοιες αλλά υψηλότερες τιµές BDE. Η προβλεπόµενη σειρά δραστικότητας ήταν σε συµφωνία µε εκείνη που προέκυψε βάσει των τιµών ΑΕ της δοκιµής µε την ελεύθερη ρίζα DPP αλλά και µε εκείνη του πειράµατος της οξείδωσης της τριελαΐνης στους 45 ο. Είναι φανερό λοιπόν ότι η κινητική της αντίδρασης πρέπει να λαµβάνεται υπόψη για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΗ. Ο χρόνος της αντίδρασης µιας ΑΗ µε την ελεύθερη ρίζα φαίνεται ότι συνδέεται άµεσα µε τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγονται από τους υποκαταστάτες στο µόριο της. Στην παρούσα µελέτη ενδιαφέρον ήταν το γεγονός ότι τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγουν οι υποκαταστάτες ακόµα και σε απόσταση από τον αρωµατικό δακτύλιο επηρεάζουν την αντιοξειδωτική ικανότητα των ΑΗ λόγω της συζυγίας σε βαθµό που να εκτιµάται πειραµατικώς και ποσοτικά. 4.4.2.4 υναµικό ιοντισµού (ΙΡ) Η δέσµευση ελεύθερων ριζών από τις ΑΗ είναι δυνατόν να γίνει εκτός από την απόδοση ατόµου υδρογόνου και µε απόδοση ηλεκτρονίου. Η ικανότητα αυτή µπορεί θεωρητικά να εκτιµηθεί µε τον υπολογισµό της ενέργειας του ΗΟΜΟ ή µε το δυναµικό 121

ιοντισµού (ΙΡ) (Wright et al., 2001, Zhang et al., 2001). Η ικανότητα µιας ΑΗ να αποδίδει ηλεκτρόνια στις ελεύθερες ρίζες δε συµβαδίζει απαραίτητα µε την ικανότητα απόδοσης ατόµου υδρογόνου, όπως διαπιστώθηκε στην ενότητα 4.3.2.4 για το καφεϊκόδιυδροκαφεϊκό οξύ. Για το λόγο αυτό εξετάστηκε υπολογιστικά κατά πόσο τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγουν οι διαφορετικοί υποκαταστάτες επηρεάζουν την ικανότητα των ΑΗ να αποδίδουν ηλεκτρόνια στις ελεύθερες ρίζες. Αυτή τη φορά επιλέχθηκε να υπολογιστεί η τιµή του ΙΡ καθώς προτείνεται ως πιο ακριβής από την ιδιοτιµή της ενέργειας του ΗΟΜΟ (Soffers et al., 1999). Τα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα 4.16. Πίνακας 4.16 Τιµές δυναµικού ιοντισµού (ΙΡ) των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-31G (d)//αμ1, T=298.15 K. A p a p +b IP c Φερουλικό οξύ -687,76-687,49 167,49 Αιθυλεστέρας -766,32-766,06 165,53 φερουλικού οξέος Κωνιφερυλαλδεΰδη -612,52-612,25 169,78 Κωνιφερυλαλκοόλη -613,68-613,44 155,10 Ισοευγενόλη -538,49-538,24 159,86 a Ενθαλπία µητρικής ένωσης σε artrees, b Ενθαλπία κατιοντικής ρίζας σε artrees, c IΡ σε kcal/mol Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.16 η σειρά της δραστικότητας των υπό µελέτη ΑΗ ήταν ανάλογη µε εκείνη βάσει των τιµών BDE. Πράγµατι, η κωνιφερυλαλκοόλη και η ισοευγενόλη είναι οι πλέον ευοξείδωτες ΑΗ λόγω τις µικρότερης τιµής ΙΡ. Στην περίπτωση των τιµών ΙΡ οι επιµέρους διαφορές που παρατηρήθηκαν ήταν µεγαλύτερες από εκείνες µε βάση τις τιµές BDE, καθώς η µέγιστη διαφορά στις τιµές ΙΡ ήταν περίπου 15 kcal/mol. Φαίνεται ότι τα ηλεκτρονιακά φαινόµενα που εισάγουν οι χαρακτηριστικές οµάδες στο άκρο της πλευρικής αλυσίδας επηρεάζουν περισσότερο την ικανότητα απόδοσης µονήρους ηλεκτρονίου από τις ΑΗ παρά την ικανότητά τους να αποδίδουν άτοµα υδρογόνου. 122

Με βάση τα δεδοµένα της πειραµατικής και της υπολογιστικής προσέγγισης βρέθηκε για ακόµη µια φορά ότι η ισοευγενόλη έχει αξιοσηµείωτη δραστικότητα και µάλιστα εντονότερη από το βιοσυνθετικώς συγγενές της φερουλικό οξύ. Η ισοευγενόλη χρησιµοποιείται σήµερα ως πρώτη ύλη για την παραγωγή της βανιλίνης, ως συστατικό αρωµάτων (0,4-0,8%), σαπουνιών (0,03-0,3%), απορρυπαντικών (0,003-0,3%) και ενυδατικών προϊόντων κοσµητικής (λοσιόν) (0,015-0,1%). Επίσης χρησιµοποιείται ως πρόσθετο σε τρόφιµα και ποτά (Πίνακας 4.17) καθώς κατατάσσεται στην κατηγορία των ασφαλών προσθέτων (GRAS) και η χρησιµοποίησή της έχει εγκριθεί από τον FDA των ΗΠΑ σε ποσότητες σύµφωνα µε τις αρχές της ορθής βιοµηχανικής πρακτικής (ΝI, 1984). Στη βιβλιογραφία δεν υπάρχουν δεδοµένα για πρόκληση καρκίνου, µεταλλάξεων ή τερατογενέσεων από τη χρήση της. Η απορρόφησή της από το ανθρώπινο δέρµα κυµαίνεται από 0,29-10,38% (το υψηλότερο ποσοστό απορρόφησης παρατηρήθηκε στην περίπτωση που η ένωση αποτελούσε συστατικό υδατικής λοσιόν) ενώ η αλλεργιογόνος δράση της χαρακτηρίζεται ως µέτρια (Motoyoshi et al., 1979). Πίνακας 4.17 Επίπεδα ισοευγενόλης σε τρόφιµα και ποτά (Furia and Bellanca, 1975) Προϊόν Συγκέντρωση (mg/kg) Μη αλκοολούχα ποτά 3,7 Παγωτά 3,8 Καραµέλες 5 Προϊόντα αρτοποιίας 11 Μαστίχες 0,3 1.000 Αρτύµατα 1 Η αντιοξειδωτική δράση της ισοευγενόλης σε συνδυασµό µε µια πρόσληψη από τη δίαιτα και τη χρήση στην κοσµητική υπαινίσσονται ένα πιθανό ευεργετικό βιολογικό ρόλο, αλλά αυτό πρέπει να µελετηθεί περεταίρω. Από την άποψη αυτή παρουσιάζει ενδιαφέρον και η αναζήτηση νέων φυσικών πηγών ισοευγενόλης ή παραγώγων της. ιερεύνηση της βιβλιογραφίας έδειξε ότι η ισοευγενόλη αποτελεί συστατικό του αιθερίου ελαίου πολλών και διαφόρων φυτών όπως Ylang-Ylang, γαρύφαλο, µοσχοκάρυδρο, γαρδένια, Sandalum album, larkia breweri, cotea porosa και Vetiveria zizamioides (Kirk-thmer, 1983). Ωστόσο δεν υπάρχουν πληροφορίες για τα 123

επίπεδά της σε αυτά, παρά µόνο ότι έχει ταυτοποιηθεί ως συστατικό του αιθερίου ελαίου. Η µόνη σηµαντική πηγή ισοευγενόλης φαίνεται ότι είναι το αιθέριο έλαιο του φυτού Psiada arguta Pers, που φύεται στον Άγιο Μαυρίκιο, καθώς αυτή αποτελεί το 56,5% της σύστασης του αιθερίου ελαίου του. Το φυτό αυτό όµως είναι προστατευόµενο είδος καθώς τελεί υπό εξαφάνιση (Gurib-Fakim et al., 2000). Εποµένως, ο µόνος τρόπος παραγωγής της παραµένει η χηµική µέθοδος παρασκευής της από την ευγενόλη µε ισοµερείωση, παρουσία καυστικού καλίου (Sax and Lewis, 1987). Η ευγενόλη που αποτελεί την πρώτη ύλη µπορεί να αποµονωθεί από το αιθέριο έλαιο κυρίως του γαρύφαλου, καθώς αποτελεί περίπου το 80% των συστατικών του (Gosselin et al., 1984). 124

4.5 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΛΛΩΝ ΟΜΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΗΣ ΠΛΕΥΡΙΚΗΣ ΑΝΘΡΑΚΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙ ΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΣΕΚΟΪΡΙ ΟΕΙ ΩΝ. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΗΣ ΕΛΑΙΟΕΥΡΩΠΑΪΝΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ Όπως και στις δύο προηγούµενες ενότητες αντικείµενο της µελέτης αποτέλεσε η δραστικότητα συγγενών µεταξύ τους βιοφαινολών µε σκοπό την καλύτερη αξιοποίηση υπαρχουσών ΑΗ και την αναζήτηση νέων πηγών. Στη συγκεκριµένη περίπτωση µελετήθηκε η επίδραση δοµικών χαρακτηριστικών της πλευρικής ανθρακικής αλυσίδας στην ικανότητα δέσµευσης ελευθέρων ριζών από την ελαιοευρωπαΐνη (ΟL) και τα παράγωγά της. Οι χηµικοί τύποι των ενώσεων αυτών δόθηκαν στο Σχήµα 1.10. Κοινό δοµικό χαρακτηριστικό των ενώσεων είναι η απουσία διπλού δεσµού στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα. Οι ενώσεις διέφεραν όµως στο µέγεθος ή και σε άλλα χαρακτηριστικά της αλυσίδας. Ορισµένα από τα παράγωγα διέφεραν σε µικρό βαθµό από την ελαιοευρωπαΐνη (π.χ. αποµεθυλοελαιοευρωπαΐνη), ενώ σε άλλες περιπτώσεις η διαφορά ήταν µεγαλύτερη, όπως η απουσία του σακχάρου (αγλυκόνες) ή ακόµα και ολόκληρου του τµήµατος της πλευρικής αλυσίδας που χαρακτηρίζει τα σεκοϊριδοειδή, δηλαδή του ολεοζίτη (περίπτωση υδροξυτυροσόλης και οξικού εστέρα της). ηλαδή, οι ενώσεις θα αναµένονταν να διαφέρουν µεταξύ τους ως προς τη δραστικότητα, λόγω στερεοχηµικών παρεµποδίσεων, διαφορών στις οµάδες που εισάγουν ηλεκτρονιακά φαινόµενα και διαφορών στην πολικότητα. εδοµένου ότι η εκτίµηση της ικανότητας δέσµευσης ελευθέρων ριζών για τις υπό εξέταση βιοφαινόλες δεν είναι δυνατή πειραµατικά για λόγους που έχουν προαναφερθεί (ενότητα 1.5), η εκτίµησή της έγινε υπολογιστικά. Καθώς η παρουσία της κατεχολικής οµάδας µπορεί να είναι καθοριστική για τη δραστικότητα των ενώσεων, σε βαθµό που να επισκιάζει το ρόλο των δοµικών διαφορών της πλευρικής αλυσίδας, όπως αναφέρθηκε και στην ενότητα 4.3, κρίθηκε χρήσιµο να µελετηθεί και µια σειρά συγγενών µονοφαινολών όπως ο λιγκστροζίτης (LIG), η αλδεϋδική µορφή της αγλυκόνης του και η τυροσόλη (Σχήµα 4.28). Ο λιγκστροζίτης ανήκει και αυτός στην κατηγορία των σεκοϊριδοειδών όπως η ελαιοευρωπαΐνη και υπάρχει στα φύλλα της ελιάς όσο και σε εκείνα άλλων φυτών της οικογένειας leaceae (Jensen et al., 2002). Οι συγκεκριµένες µονοφαινόλες επιλέχθηκαν ως αντιπροσωπευτικές των τριών κατηγοριών παραγώγων που εξετάστηκαν (γλυκοζίτες, αγλυκόνες, µικρού µοριακού βάρους φαινόλες). Στη µελέτη, χρησιµοποιήθηκε επίσης το καφεϊκό οξύ, ως ένωση αναφοράς, της οποίας η δραστικότητα µελετήθηκε σε προηγούµενη ενότητα (βλ. 4.3) πειραµατικά και υπολογιστικά. 125

3 Glc 3 λιγκστροζίτης, LIG [10] αλδεϋδική µορφή αγλυκόνης LIG [11] τυροσόλη, TYR [12] Σχήµα 4.28 Συντακτικοί τύποι λιγκστροζίτη και επιλεγµένων παραγώγων του 4.5.1. Υπολογιστική προσέγγιση SAR Η υπολογιστική προσέγγιση περιελάµβανε τον υπολογισµό των τιµών της BDE και του IP. Ο υπολογισµός των τιµών αυτών χρησιµοποιήθηκε ως µέτρο της εκτίµησης της ικανότητας των ΑΗ να δεσµεύουν τις ελεύθερες ρίζες µε τους δύο δυνατούς µηχανισµούς δράσης τους. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η ίδια µε εκείνη που χρησιµοποιήθηκε στην ενότητα 4.4. Περιελάµβανε δηλαδή συνδυαστική χρήση του ηµιεµπειρικού µοντέλου AΜ1 και της DFT. Αυτή τη φορά όµως, καθώς το µέγεθος ορισµένων από τις ενώσεις ήταν µεγάλο, ως σύνολο βάσης επιλέχθηκε το 6-31G (,p ), µικρότερο από εκείνο που χρησιµοποιήθηκε στις προηγούµενες περιπτώσεις (Wright et al., 1997). Τα αποτελέσµατα της υπολογιστικής προσέγγισης δίνονται στον Πίνακα 4.18. αρίθµηση των ενώσεων είναι σύµφωνη µε εκείνη που παρουσιάστηκε στα Σχήµατα 1.10 και 4.28. Στον ίδιο πίνακα, εκτός από τις τιµές BDE και IP παρατίθενται και οι τιµές Log P για τις υπό µελέτη ενώσεις που υπολογίστηκαν µε τη µέθοδο των Broto et al. (1984), αλλά και η τιµή του µοριακού τους βάρους ως ένδειξη του µεγέθους τους. Ο υπολογισµός των συγκεκριµένων τιµών θεωρήθηκε απαραίτητος, καθώς αποτελούν κριτήριο εκτίµησης της πολικότητας των ενώσεων. Οι διαφορές αυτές, αναµένεται να επηρεάζουν τη δραστικότητα των ΑΗ σε διάφορα συστήµατα λιπαρών υποστρωµάτων. Στον ίδιο πίνακα δίνεται και η τιµή του µοριακού βάρους κάθε παραγώγου ως ένδειξη του µεγέθους των υπό µελέτη ΑΗ. 126

Πίνακας 4.18 Τιµές BDE και IP των υπό µελέτη ενώσεων που υπολογίστηκαν στα επίπεδα B3LYP/6-31G (,p )//AM1, T=298.15 K. A - BDE a IP b LogP c Μ.Β. d 1 L e L-e f 175,40-0,97 540,19 L- g 79,89 2 Αποµεθυλο L e Αποµεθυλο L-e f 169,44-1,24 526,17 Αποµεθυλο L- g 80,08 3 Αγλυκόνη Ι e Αγλυκόνη Ι-e f 170,88 1,64 378,37 Αγλυκόνη Ι- g 78,57 4 Αλδεϋδικό Αγλυκόνη e Αλδεϋδικό Αγλυκόνη -e f 169,92 0,65 378,37 Αλδεϋδική Αγλυκόνη- g 78,69 5 Αγλυκόνη ΙΙ e Αγλυκόνη ΙΙ-e f 167,0 0,94 378,37 Αγλυκόνη ΙΙ- g 78,81 6 Αγλυκόνη ΙΙΙ e Αγλυκόνη ΙΙΙ- e f 177,22 1,14 320,34 Αγλυκόνη ΙΙΙ- g 78,55 7 Αγλυκόνη ΙV e Αγλυκόνη ΙV-e f 168,23 0,84 320,34 Αγλυκόνη ΙV- g 79,28 8 Εστέρας ΗΤ e Εστέρας ΗΤ-e f 169,42 1,39 196,2 Εστέρας ΗΤ- g 78,85 9 ΗΤ e ΗΤ e f 171,1 0,79 154,16 ΗΤ- g 78,38 10 LIG e LIG-e f 176,55-0,58 524,51 LIG- g 85,94 11 Αλδεϋδική αγλυκόνη LIG e Αλδεϋδική αγλυκόνη LIG -e f 171,39 1,04 362,14 Αλδεϋδική αγλυκόνη LIG - g 85,93 12 TYR e TYR-e f 177,4 1,18 138,16 TYR- g 85,35 13 Καφεϊκό e Καφεϊκό-e f 176,64 1,15 180,16 Καφεϊκό g 77,68 a Eνθαλπία διάσπασης δεσµού (kcal/mol), b υναµικό ιοντισµού (kcal/mol), c Συντελεστής κατανοµής, d Μοριακό βάρος, e Μητρική ένωση, f Κατιοντική ρίζα, g Φαινοξυ-ρίζα, ΟL=ελαιοευρωπαΐνη, ΗΤ=υδροξυτυροσόλη, LIG=λιγκστροζίτης, TYR=τυροσόλη 127

Με βάση τις τιµές BDE η ελαιοευρωπαΐνη και τα παράγωγά της δεν αναµένεται να είναι ικανότερα ΑΗ ως προς τη δέσµευση ελευθέρων ριζών από το καφεϊκό οξύ καθώς οι τιµές BDE που υπολογίστηκαν για αυτές ήταν µεγαλύτερες. Ωστόσο θα αναµενόταν να είναι αρκετά αποτελεσµατικά καθώς οι διαφορές στην τιµή της BDE από εκείνη του καφεϊκού είναι µικρότερες (0,7-2,4 kcal/mol) σε σχέση µε εκείνες που παρατηρήθηκαν από εκείνες µε τις µονοφαινόλες (7,6-8,2 kcal/mol). Σύµφωνα µε τις απόλυτες αριθµητικές τιµές της BDE για την ελαιοευρωπαΐνη και τα παράγωγά της η σειρά κατάταξής ως προς την δραστικότητά τους είναι η ακόλουθη: ΗΤ>Αγλυκόνη-ΙΙΙ>Αγλυκόνη-Ι>Αλδεϋδική-αγλυκόνη>Αγλυκόνη-ΙΙ>Εστέρας-ΗΤ> Αγλυκόνη-ΙV>ΟL>Αποµεθυλο-L Οι διαφορές στην τιµή της BDE για τις έξι πρώτες ενώσεις κυµαίνονται από 0,2 έως 0,5 kcal/mol. Οι τρεις τελευταίες παρουσιάζουν µεγαλύτερες διαφορές στην τιµή BDE σε σχέση µε την τιµή της υδροξυτυροσόλης (1,1-1,7 kcal/mol). Οι υπολογιστικές προσεγγίσεις περιλαµβάνουν ΑΗ που πολλές διαφέρουν συχνά σηµαντικά στις τιµές BDE (π.χ.3-23 kcal/mol) (Yamamura et al., 1997, Zhang et al., 1999, Wright et al., 2001). Για το λόγο αυτό δεν έχει δοθεί έµφαση στη σηµασία που έχουν µικρότερες τιµές διαφοράς στη BDE (<3 kcal/mol) στην αξιολόγηση της δραστικότητας των ΑΗ. Αναφορά στο θέµα έχει γίνει από τους Zhang and Wang, (2002) που σχολιάζoυν ότι ΑΗ που διαφέρουν στην τιµή της BDE κατά 0,8 kcal/mol αναµένεται να παρουσιάζουν παρόµοια δράση. Καθώς επίσης οι τιµές BDE φαινολικών ενώσεων που προσδιορίζονται πειραµατικά µε δυναµικές τεχνικές (π.χ. φασµατοσκοπία, ραδιόλυση) παρουσιάζουν τυπική απόκλιση 1-2 kcal/mol (Luo, 2003) είναι πολύ δύσκολο οι υπολογιστικές προσεγγίσεις να υποστηρίξουν διαφορά στην αντιοξειδωτική συµπεριφορά ενώσεων που διαφέρουν λιγότερο από 0,5 kcal/mol. Πραγµατικά, ενώσεις που εξετάστηκαν στις προηγούµενες ενότητες και διέφεραν στην τιµή της BDE κατά 0,7 kcal/mol παρουσίασαν παρόµοια δραστικότητα σε πειραµατικές συνθήκες. Ωστόσο για τις ενώσεις υδροξυτυροσόλη, ελαιοευρωπαΐνη, τυροσόλη και καφεϊκό οξύ κάτω από συνθήκες δέσµευσης ελευθέρων ριζών (βλ. Πίνακα 4.1) βρέθηκε ότι το καφεϊκό οξύ ήταν σαφώς πιο δραστικό από τις υπόλοιπες (1,3, 1,9 και 28 φορές αντιστοίχως για λόγο mol A/ mol DPP =0,25) και η υδροξυτυροσόλη 1,4 φορές αποτελεσµατικότερη από την ελαιοευρωπαΐνη, ενώ η τυροσόλη σχεδόν αδρανής. Σε δοκιµές επιταχυνόµενης οξείδωσης καθαρισµένης τριελαΐνης (45 o, επίπεδο προσθήκης 128

10 mg/kg) η υδροξυτυροσόλη βρέθηκε σαφώς καλύτερη (~4 φορές) από την ελαιοευρωπαΐνη αλλά και 1,2 φορές από το καφεϊκό (Σχήµα 4.29). Κατά συνέπεια, φαίνεται ότι οι τιµές BDE µπορούν να προβλέψουν τη συµπεριφορά ΑΗ κάτω από συνθήκες δέσµευσης ενός τύπου ριζών (π.χ. DPP ), όµως σε πιο πολύπλοκα συστήµατα που διατηρείται ο ίδιος µηχανισµός, ο συγκεκριµένος µοριακός δείκτης δεν επαρκεί. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα για την υδροξυτυροσόλη και την ελαιοευρωπαΐνη επιβεβαιώνονται και από εκείνα των Gordon et al. (2001) σε καθαρισµένες τριακυλογλυκερόλες ελαιολάδου (επίπεδο προσθήκης 0,3 mmol/kg) που βρήκαν την υδροξυτυροσόλη ακόµη πιο ισχυρή (7 φορές) από την ελαιοευρωπαΐνη. Οι δύο αυτές ΑΗ παρουσίαζαν διαφορά στις τιµές BDE~1,5 kcal/mol. Εποµένως, τίθεται το ερώτηµα ποια είναι η ελάχιστη τιµή στη διαφορά της BDE µεταξύ των ΑΗ που θα επέτρεπε την πρόβλεψη διαφορετικής αντιοξειδωτικής συµπεριφοράς. Η µικρή διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε γενικώς στις τιµές BDE πιθανώς οφείλεται στο ότι η τιµή της επηρεάζεται από τα τοπικά φαινόµενα (πχ. δεσµός υδρογόνου) που παρουσιάζονται κοντά στο φαινολικό υδροξύλιο (Wright et al., 2001). Έτσι, οι τιµές BDE φάνηκε να δίνουν σηµαντικές πληροφορίες στην περίπτωση που έγινε σύγκριση τιµών για τα παράγωγα της ελαιοευρωπαΐνης και τις τρεις µονοφαινόλες. Στην περίπτωση αυτή η διαφορά µεταξύ των δύο κατηγοριών ήταν ~5-8 kcal/mol, που δικαιολογεί την πρόβλεψη σηµαντικής διαφοράς στη δραστικότητα. Αριθµός Yπεροξειδίων meq 2 / kg ελαίου 200 150 100 50 0 Μάρτυρας +Καφεϊκό οξύ +Ελαιοευρωπαΐνη +Υδροξυτυροσόλη 0 50 100 150 χρόνος, d Σχήµα 4.29 Εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης καφεϊκού οξέος, ελαιοευρωπαΐνης και υδροξυτυροσόλης (10 mg/kg) µε τη δοκιµή φούρνου στους 45 ο. (Οι τιµές σε κάθε σηµείο είναι ο µ.ο. δύο µετρήσεων) 129

Κατά τη µελέτη των ΑΗ έγινε υπολογισµός και των τιµών ΙΡ που αντίθετα από την BDE επηρεάζεται από τη συνολική δοµή της ΑΗ (Wright et al., 2001). Σύµφωνα µε τις απόλυτες τιµές ΙΡ η σειρά κατάταξης είναι: Αγλυκόνη-ΙΙ>Αγλυκόνη-ΙV>Εστέρας-ΗΤ>Αποµεθυλο-L>Αλδεϋδική-αγλυκόνη> Αγλυκόνη-Ι>ΗΤ>ΟL>Αγλυκόνη-ΙΙΙ. σειρά δραστικότητας είναι διαφορετική από εκείνη που προέκυψε µε βάση τις τιµές της BDΕ. Ωστόσο, δε φαίνεται να µπορεί να γίνει κάποια πρόβλεψη για την αποτελεσµατικότητα των ΑΗ καθώς ενώσεις όπως η L, η Αγλυκόνη-ΙΙΙ και το καφεϊκό οξύ έχουν παρόµοιες τιµές µε εκείνες του LIG και της TYR. Ο υπολογισµός των τιµών της BDE και πολύ περισσότερο του ΙΡ δε φάνηκε στη συγκεκριµένη περίπτωση ότι µπορεί να οδηγήσει στην πρόβλεψη διαφορών στη δραστικότητα των ενώσεων. Με βάση την πολικότητα των ΑΗ (τιµές Log P), η εκτίµηση της οποίας είναι δυνατή και υπολογιστικά µε τη βοήθεια πακέτων προγραµµάτων συνήθων στο χηµικό εργαστήριο, αναµαίνεται να υπάρχουν διαφορές στη δραστικότητα των ΑΗ σε πραγµατικά συστήµατα. Είναι πιθανό ότι το µέγεθος του µορίου, η διαµόρφωσή στο χώρο αλλά και µεταβολές στη δοµή κατά τη διάρκεια της οξείδωσης µπορεί να καθορίζουν την τελική συµπεριφορά των ΑΗ. Είναι σαφές ότι η πειραµατική διαδικασία παρά τα όποια µειονεκτήµατα των συνθηκών ή ακόµα και το µακρύ χρόνο ολοκλήρωσης των πειραµάτων είναι απαραίτητο εργαλείο για την εκτίµηση της αντιοξειδωτικής δράσης ΑΗ που πρόκειται να χρησιµοποιηθούν ως πρόσθετα τροφίµων. 4.5.2 Αναζήτηση νέων πηγών ελαιοευρωπαΐνης Με βάση τα παραπάνω αποτελέσµατα είναι φανερό ότι τόσο η ελαιοευρωπαΐνη όσο και οι συγγενείς της διφαινολικές ενώσεις είναι αρκετά αποτελεσµατικές ως προς τη δέσµευση ελευθέρων ριζών χωρίς κατά κανόνα σηµαντικές διαφορές στη δραστικότητα. εδοµένου ότι η µητρική ένωση όλων των παραπάνω διφαινολών είναι η ΟL στην οποία αποδίδεται γνωστή βιολογική δράση (Soler-Rivas, et al., 2000) η αναζήτηση νέων πηγών είναι µια ενδιαφέρουσα πρόκληση. Μέχρι σήµερα κύρια διατροφική πηγή ελαιοευρωπαΐνης αποτελεί το ελαιόδεντρο (φύλλα, πράσινες ελιές) που όµως καλλιεργείται σε ορισµένες περιοχές όπως η λεκάνη της Μεσογείου. Παρόλα αυτά η lea europaea ανήκει σε ένα από τα 25 γένη και αποτελεί ένα 130

από τα 600 είδη περίπου της οικογένειας leaceae. Τα γένη της leaceae συναντώνται σε όλες της ηπείρους κυρίως στις εύκρατες και υποτροπικές ζώνες σε διάφορα υψόµετρα (Wallander and Albert, 2000). Στο χάρτη του Σχήµατος 4.30 παρουσιάζονται οι περιοχές όπου ευδοκιµούν τα µέλη της οικογένειας leaceae. Οι περιοχές αυτές είναι µεγάλες σε έκταση και σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία πολλά από τα καλλιεργούµενα είδη έχουν οικονοµική σηµασία για τις περιοχές αυτές. Έτσι, εκτός από το ελαιόδεντρο που καλλιεργείται για τον καρπό και το λάδι του, είδη του γένους Fraxinus χρησιµοποιούνται ως πρώτες ύλες ξυλείας, ενώ γένη όπως τα Ligustrum, Jasminum, Syringa και Forsythia χρησιµοποιούνται συνήθως ως καλλωπιστικά (Wallander and Albert, 2000). Σε χώρες µάλιστα όπως η Κίνα, φυτά της συγκεκριµένης οικογένειας όπως το Fraxinus chinensis είναι γνωστά στην παραδοσιακή ιατρική για τις φαρµακευτικές ιδιότητές τους. Από το συγκεκριµένο φυτό ο φλοιός και ο καρπός του χρησιµοποιούνται για την αντιµετώπιση φλεγµονών, πυρετού και άλλων ασθενειών, ενώ ως δραστική ένωση αναφέρεται κυρίως η φραξίνη (Li, 2002). Σχήµα 4.30 Χάρτης παγκόσµιας κατανοµής των µελών της οικογένειας leaceae Προσεκτική µελέτη της βιβλιογραφίας έδειξε ότι πολλές από τις ενώσεις που ανήκουν για παράδειγµα στην κατηγορία των σεκοϊριδοειδών είναι κοινές στα διάφορα γένη αυτής της οικογένειας, αλλά όχι απαραίτητα σε όλα τα είδη που περιλαµβάνει το κάθε γένος (Jensen et al., 2002). Έτσι κρίθηκε σκόπιµο να αναζητηθεί η ελαιοευρωπαΐνη 131