9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΥΝΤΗΡΗΜΕΝΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ ΠΟΥ ΔΕΝ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΟΥΝ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΑ ΤΩΝ ΨΑΡΙΩΝ Μανουσάκη Τ. 1,2, Lagnel J. 1, Λαδουκάκης Μ. 2, Μαγουλάς Α. 1, Κωτούλας Γ. 1, Τσιγγενόπουλος Κ. 1 1 Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών 2 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης Περίληψη Στην εποχή της μετα-γονιδιωματικής, τα συντηρημένα στοιχεία στις περιοχές εκτός γονιδίων έχουν προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον καθώς θεωρούνται σημαντικά στην εξέλιξη της ομάδας των μεταζώων και ιδιαίτερα των σπονδυλωτών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν συγκριτικά τα 5 διαθέσιμα γονιδιώματα ψαριών, των Takifugu rubripes, Tetraodon nigroviridis, Danio rerio, Oryzias latipes και Gasterosteous aculeatus. Με χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, απομονώθηκε σε κάθε γονιδίωμα το τμήμα που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνες και βρίσκεται μεταξύ των γονιδίων. Η μελέτη είχε ως αποτέλεσμα την ανίχνευση 103 αλληλουχιών (CNEs) που είχαν τουλάχιστον 100 νουκλεοτιδικές βάσεις μήκος και 70% ομοιότητα μεταξύ τους στην περιοχή μεταξύ των γονιδίων στα γονιδιώματα. Από τη μελέτη των CNEs πρoέκυψε ότι τα μισά περίπου από αυτά δεν έχουν ανιχνευθεί από τις μέχρι τώρα συγκρίσεις γονιδιωμάτων. Επιπλέον, παρουσιάζουν τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά των συντηρημένων αλληλουχιών, όπως αυτά έχουν καθοριστεί από προηγούμενες εργασίες. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν την μειωμένη παρουσία CNEs στην ομάδα των τελεόστεων σε σχέση με τα υπόλοιπα σπονδυλωτά. Λέξεις κλειδιά: Τελεόστεοι, γονιδίωμα, συντηρημένες αλληλουχίες. STUDY OF THE CONSERVED NON-CODING ELEMENTS IN FISH GENOMES Manousaki T. 1,2, Lagnel J. 1, Ladoukakis M. 2, Magoulas A. 1, Kotoulas G. 1, Tsigenopoulos C. 1. 1 Institute of Marine Biology and Genetics, Hellenic Centre for Marine Research 2 Biology Department, University of Crete Abstract In the era of meta-genomics, conserved non-coding regions have attracted the attention of the researchers. They are believed, and in many cases proven, to play important key-role in the evolution of the vertebrates genomes. In this study, we explored the intergenic, non-coding part of the genomes of 5 fish, Zebrafish, Fugu, Tetraodon, Medaka and Stickleback. We designed an algorithm, which extracted the intergenic sequences of each genome, identified the conserved non-coding elements (CNEs) between them and compared them with those found in other studies and organisms. Fish found to contain only a few CNEs, 103, compared to other groups and other studies that used species with similar evolutionary distance. Half of them are shared with the other vertebrates, while the other half seem to be new to the known set of CNEs. An important fraction of their flanking genes are associated with regulation of transcription and development. They seem to be syntenic in most of the species studied, and they are mainly located near genes, also forming clusters. Thus, we propose that the new set of CNEs may play an important role in teleost or even vertebrate evolution. Keywords: Teleosts, non-coding, genome, conserved sequences. 1. Εισαγωγή Η ομάδα των τελεόστεων περιλαμβάνει περίπου το 95% των ψαριών και 50% όλων των σύγχρονων σπονδυλωτών και παρουσιάζει ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα ποικιλότητας που, εκτός από την οικολογία, τη μορφολογία, τη συμπεριφορά και άλλες όψεις της βιολογίας των ψαριών, επηρεάζει έντονα τα γονιδιώματά τους. Η εξέλιξή τους επηρεάστηκε σημαντικά από τον επιπλέον διπλασιασμό του γονιδιώματος, που έλαβε χώρα στην αρχή της εξελικτικής τους πορείας τους μετά το διαχωρισμό τους από τα υπόλοιπα ψάρια (Volff, 2005). Σύμφωνα με την πιο πρόσφατη θεωρία, είχαν προηγηθεί δύο άλλοι διπλασιασμοί ολόκληρου γονιδιώματος στην αρχή της εξελικτικής πορείας των σπον- -1155-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ δυλωτών και ένας μετά το διαχωρισμό των τελεόστεων (Volff, 2005). Η μελέτη του γονιδιώματος των σύγχρονων τελεόστεων μας οδηγεί στην ανίχνευση των γεγονότων που έλαβαν χώρα κατά την εξέλιξη, αλλά και των επιπτώσεών τους στους οργανισμούς. Από τις μελέτες αυτές προκύπτει ότι οι περιοχές των γονιδιωμάτων που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες παίζουν καθοριστικό ρόλο. Το μη κωδικοποιούν DNA (non-coding DNA, ncdna) αποτελεί ένα από τα χαρακτηριστικά των γονιδιωμάτων των μεταζώων που είναι σε μεγάλο βαθμό δύσκολο να εξηγηθεί. Για δεκαετίες οι επιστήμονες το αποκαλούν «DNA σκουπίδι» («junk DNA»). Τα τελευταία χρόνια, όμως, εμφανίζονται όλο και περισσότερες ενδείξεις σύμφωνα με τις οποίες το ncdna, ή ένα τμήμα αυτού, αποτελεί σημαντικό λειτουργικό κομμάτι των γονιδιωμάτων. Το λειτουργικό ncdna περιλαμβάνει cis ρυθμιστικά στοιχεία όπως ενισχυτές (enhancers), υποκινητές (promoters), matrix ή scaffold attachment regions, μονωτές (insulators) και αποσιωπητές (silencers) (Ludwig 2002). Η μελέτη της εξέλιξης των ρυθμιστικών στοιχείων έχει δύο σκέλη. Το πρώτο είναι η άμεση λειτουργική (functional) προσέγγιση, ενώ δεύτερη προσέγγιση αφορά στη σύγκριση γονιδιωμάτων. Η βασική ιδέα που κυριαρχεί στο χώρο της συγκριτικής γονιδιωματικής είναι ότι οι αλληλουχίες που παραμένουν σημαντικά συντηρημένες μεταξύ εξελικτικά απομακρυσμένων οργανισμών είναι, πιθανότατα, λειτουργικές (Elgar & Vavouri, 2008). Η σύγκριση της περιοχής του γονιδιώματος, που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνες, έφερε στο φως την ύπαρξη αλληλουχιών που παραμένουν συντηρημένες ακόμα και σε μακρινά φυλογενετικά είδη. Τα συντηρημένα, και πιθανότατα λειτουργικά, στοιχεία που εμφανίστηκαν με τη σύγκριση του ανθρώπινου γονιδιώματος με τα υπόλοιπα σπονδυλωτά ονομάζονται συντηρημένα στοιχεία της περιοχής του DNA που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνες, ή εν συντομία CNEs (conserved non-coding elements). Οι μελέτες που έχουν γίνει μέχρι τώρα και αφορούν συντηρημένες αλληλουχίες στα γονιδιώματα των σπονδυλωτών, έχουν επικεντρωθεί στις αλληλουχίες που έχουν από κοινού ο άνθρωπος με τα υπόλοιπα σπονδυλωτά. Οι αλληλουχίες αυτές φαίνεται να παίζουν σημαντικό λειτουργικό ρόλο όπως δείχνουν οι λειτουργικές μελέτες που πραγματοποιούνται. Από τις μέχρι τώρα μελέτες τα CNEs φαίνεται να διακρίνονται από τα παρακάτω χαρακτηριστικά (Elgar & Vavouri, 2008): Είναι παρόντα στα γονιδιώματα των περισσότερων μεταζώων. Βρίσκονται μεταξύ των γονιδίων, αλλά και μέσα στα γονίδια στις μη μεταφραζόμενες περιοχές (untrancribed regions, UTRs) και σε ιντρόνια (introns). Έχουν ιδιαίτερα χαμηλό ρυθμό αντικατάστασης ακόμα και σε μεγάλες εξελικτικές αποστάσεις. Η παρουσία τους στα χρωμοσώματα θεωρείται ότι προκαλεί έντονα το φαινόμενο της συνταινίας. Στην πλειονότητά τους, θεωρούνται ρυθμιστικά στοιχεία (π.χ., ενισχυτές, μονωτές). Συχνά, βρίσκονται κοντά σε γονίδια που συμμετέχουν στην ανάπτυξη των οργανισμών. Έτσι έχουν αναλυθεί, σχεδόν αποκλειστικά, συντηρημένα στοιχεία που εμφανίστηκαν στην εξελικτική πορεία των τετραπόδων (σύγκριση ανθρώπου με τα υπόλοιπα τετράποδα) ή των σπονδυλωτών γενικότερα (σύγκριση ανθρώπου ψαριού). Συνεπώς, προκύπτει το ερώτημα για την ύπαρξη λειτουργικών στοιχείων που εμφανίστηκαν και εξελίχθηκαν στην γραμμή των τελεόστεων, μετά το διαχωρισμό τους από τα τετράποδα. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη των γονιδιωμάτων των τελεόστεων για την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό συντηρημένων στοιχείων σε αυτά. 2. Υλικά και Μέθοδοι Η παρούσα εργασία υλοποιήθηκε αποκλειστικά με χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής και την ανάπτυξη αλγορίθμων. Χρησιμοποιήθηκε το τοπικό υπολογιστικό σύστημα του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής που αποτελείται από 8 επεξεργαστές Intel Xeon 64-bit, 3GHZ και 32 GBytes RAM. -1156-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Χρησιμοποιήθηκαν αλληλουχίες από γονιδιώματα των ψαριών Danio rerio, Takifugu rubripes, Tetraodon nigroviridis, Oryzias latipes και Gasterosteus aculeatus και έγινε απομόνωση των περιοχών μεταξύ των γονιδίων στα 5 γονιδιώματα με χρήση FASTA αρχείων και των πληροφοριών που περιέχονταν στη βάση δεδομένων της Ensembl (www.ensembl.org). Στη συνέχεια, ανιχνεύθηκαν οι συντηρημένες περιοχές που ήταν μεγαλύτερες από 99 νουκλεοτιδικές βάσεις (bp) και είχαν τουλάχιστον 70% ομοιότητα. Οι αλληλουχίες που βρέθηκαν χαρτογραφήθηκαν στα χρωμοσώματα με χρήση του λογισμικού MAPCHART (Voorrips, 2001). Μελετήθηκαν οι κατηγορίες Gene Ontology των κοντινότερων σε αυτές γονιδίων και οι αποστάσεις τους από αυτά. Τα βήματα του αλγορίθμου στο σύνολό του (Εικ. 1), όπως αυτός υλοποιήθηκε, ήταν τα εξής: Απομόνωση των περιοχών μεταξύ των γονιδίων (intergenic) για κάθε γονιδίωμα με χρήση της βάσης δεδομένων της Ensembl και των αρχείων FASTA. Με αυτό τον τρόπο επιλέγουμε και τις περιοχές που δεν κωδικοποιούν (non-coding). Δημιουργία ενός αρχείου FASTA για κάθε είδος που περιείχε τις, μεταξύ των γονιδίων, περιοχές. Blast των αρχείων αυτών με αποτέλεσμα την ανίχνευση των περιοχών που υπάρχουν τουλάχιστον σε 2 είδη. Δημιουργία βάσης δεδομένων με τα blast outputs. Για κάθε περιοχή που βρέθηκε μεταξύ 2 ειδών γίνεται έλεγχος για την παρουσία της και στα άλλα 3 είδη. Δημιουργία βάσης δεδομένων με τις αλληλουχίες που βρίσκονται και στα 5 είδη που μελετώνται, με κριτήριο να είναι μεγαλύτερες από 99 bp και να έχουν τουλάχιστον 70% ομοιότητα. Εικ. 1: Διάγραμμα που περιγράφει τον αλγόριθμο που υλοποιήθηκε. -1157-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ 3. Αποτελέσματα Στην παρούσα εργασία, απομονώθηκε το τμήμα των γονιδιωμάτων των ειδών Takifugu rubripes, Tetraodon nigroviridis, Danio rerio, Oryzias latipes και Gasterosteous aculeatus, που δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνες και βρίσκεται μεταξύ των γονιδίων. Από τη σύγκριση των γονιδιωμάτων προέκυψαν 731 συντηρημένες αλληλουχίες (CNEs), που είχαν τουλάχιστον 100 νουκλεοτιδικές βάσεις μήκος και 70% ομοιότητα μεταξύ τους). Οι αλληλουχίες αυτές ελέγχθηκαν με το λογισμικό RepeatMasker (www.repeatmasker.com) για να αποκλειστούν εκείνες που αποτελούσαν επαναλαμβανόμενα στοιχεία. Έτσι, καταλήξαμε σε 109 CNEs εκ των οποίων 6 υπάρχουν σε 2 αντίγραφα. Ο έλεγχος για την ύπαρξη των στοιχείων αυτών, σε βάσεις δεδομένων στο διαδίκτυο (CONDOR, TFCONES), έδειξαν ότι τα 57 από τα 103 CNEs έχουν ήδη αναγνωρισθεί από άλλες συγκρίσεις (κυρίως, ανθρώπου fugu). Ένα βασικό χαρακτηριστικό των CNEs ήταν η κατανομή τους, καθώς έχουν την τάση να συγκεντρώνονται σε ομάδες (clusters) και να μην κατανέμονται ομοιόμορφα στα χρωμοσώματα. Επιπλέον, από την κατανομή τους, παρατηρούμε ότι υπάρχει μεγάλη αντιστοιχία μεταξύ των χρωμοσωμάτων των ειδών. Είναι εύκολο να παρατηρήσει κανείς τη συνταινία που εμφανίζουν, καθώς ομάδες από γειτονικά CNEs χαρτογραφούνται σε «κοντινές» αποστάσεις μεταξύ τους στα χρωμοσώματα (Εικ. 2). Είναι εμφανές ότι, όταν εστιάζουμε σε εξελικτικά «κοντινά» είδη, η σχετική τους θέση δεν αλλάζει με εξαίρεση κάποιους ανασυνδυασμούς, τύπου αναστροφής, που έχουν λάβει χώρα σε μερικές περιπτώσεις. Στο σύνολο των συγκρίσεων διαπιστώνουμε ότι το Danio rerio παρουσιάζει τις μεγαλύτερες διαφορές σε σχέση με τα με τα υπόλοιπα είδη. Εικ. 2: Κατανομή των CNEs του χρωμοσώματος 2 του Tetraodon, στα χρωμοσώματα των υπόλοιπων ειδών και συγκριτική θέση αυτών. Εξαιρείται το Fugu που δεν έχει σαφώς διαχωρισμένες ομάδες σύνδεσης. Με έγχρωμες γραμμές παρουσιάζονται τα ομόλογα CNEs. Η μελέτη των CNEs συμπεριλάμβανε και τη μελέτη των κοντινότερών τους γονιδίων στην 5 και 3 πλευρά τους. Η μελέτη αυτή περιλαμβάνει 2 σκέλη. Το ένα είναι η βιολογική λειτουργία με την οποία σχετίζονται τα γονίδια (www.geneontology.org/go.doc.shtml) και το δεύτερο η απόστασή τους από τα CNEs. Όπως φάνηκε, το μεγαλύτερο ποσοστό και στις δύο κατευθύνσεις κατέχουν τα γονίδια που συμμετέχουν στη διαδικασία της μεταγραφής (Εικ. 3). Υψηλό ποσοστό έχουν και τα γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη των οργανισμών αλλά και τη μεταγωγή σήματος. Όσον -1158-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ αφορά στην απόσταση, φαίνεται πως τα περισσότερα είναι «κοντά» σε γονίδια καθώς απέχουν λιγότερο από 200Kb. Εικ. 3: Η ποσοστιαία κατανομή της λειτουργίας των γονιδίων που είναι πλησιέστερα στα CNEs ανεξάρτητα από την κατεύθυνσή τους, σύμφωνα με το χαρακτηρισμό Gene Ontology (GO) των γονιδίων. Γονίδια που σχετίζονται με τη μεταγραφή και τη ρύθμισή της καταλαμβάνουν το 48% του συνόλου. 4. Συζήτηση Τα αποτελέσματα που περιγράφηκαν στην προηγούμενη ενότητα συμπληρώνουν τη γνώση που μέχρι τώρα υπάρχει για τις συντηρημένες περιοχές μεταξύ ειδών τόσο απομακρυσμένων εξελικτικά, όσο οι τελεόστεοι που χρησιμοποιήθηκαν. Είναι γεγονός ότι προηγούμενες μελέτες ανίχνευσης CNEs σε είδη παρόμοιας εξελικτικής απόστασης με τα είδη που χρησιμοποιήσαμε, δηλαδή περίπου 310 εκ. χρόνια, έφεραν στο φως ένα πολύ μεγαλύτερο αριθμό τέτοιων στοιχείων. Παραδείγματα τέτοιων μελετών είναι η σύγκριση ανθρώπου σκύλου κοτόπουλου (310 εκ.χρόνια) (Hedges & Kumar 2003) που κατέληξε στην ύπαρξη 2343 συντηρημένων στοιχείων και η σύγκριση ανθρώπου fugu (450 εκ. χρόνια, Woolfe et al. 2005) κατέληξε σε 3583 στοιχεία. Όσον αφορά στη σύγκριση της εργασίας μας με τις υπόλοιπες δεν είναι δυνατόν να γίνει με έγκυρο τρόπο, καθώς θα έπρεπε να γνωρίζουμε την εικόνα στις UTRs και τα ιντρόνια. Ο αριθμός των 103 CNEs που βρέθηκε στη παρούσα εργασία αναμένεται να αυξηθεί ιδιαίτερα μετά την προσθήκη των CNEs που θα προκύψουν με τη μελέτη των UTRs και των ιντρονίων. Εντούτοις, και πάλι φαίνεται να είναι ιδιαίτερα χαμηλός. Η τόσο μειωμένη παρουσία συντηρημένων στοιχείων μεταξύ των ψαριών έχει τονιστεί και άλλη μια φορά στο πρόσφατο άρθρο των Stephen et al., (2008), όπου έγινε η σύγκριση 2 υπο-συνόλων, με 3 είδη ψαριών σε κάθε ένα από αυτά. Σε κάθε υποσύνολο, η μελέτη του έφερε 40 περίπου συντηρημένες αλληλουχίες (>99bp, 100% όμοιες), με μόνο τις 20 να είναι κοινές και στα δύο. Η πιθανότερη εξήγηση είναι ότι οι τελεόστεοι υπέστησαν έναν επιπλέον διπλασιασμό ολόκληρου του γονιδιώματός τους που πιθανότατα «χαλάρωσε» την εξελικτική πίεση που ασκείται στα συντηρημένα στοιχεία. Είναι εντυπωσιακό, πως ενώ κάθε ένα από τα ψάρια έχει σχετικά μεγάλο αριθμό CNEs όταν συγκρίνεται με τον άνθρωπο, σαν σύνολο έχουν ελάχιστα κοινά μεταξύ τους. Αυτό σημαίνει ότι κάθε ένα από αυτά έχει διατηρήσει ένα διαφορετικό υποσύνολο από το αρχικό σύνολο των CNEs που κληρονόμησαν από τον κοινό πρόγονο τελεόστεων τετραπόδων. Από την ανάλυση, συμπεραίνουμε ότι τα 103 CNEs που βρέθηκαν στην παρούσα εργασία δι- -1159-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ ατηρούν τα χαρακτηριστικά των CNEs που έχουν αναγνωριστεί και σε άλλες μελέτες (Bejerano et al., 2004; Woolfe et al., 2005 κ.λπ.), όπως: συγκέντρωση σε ομάδες (clusters), συνταινία, υπεραντιπροσώπευση γονιδίων που σχετίζονται με τη μεταγραφή στο σύνολο των γειτονικών τους γονιδίων, βρίσκονται «κοντά» σε γονίδια (μέσα στα πλαίσια που έχουν οριστεί για την αλληλεπίδραση στοιχείων με γονίδια). Τέλος, ιδιαίτερα σημαντική είναι η ανίχνευση 46 νέων CNEs. Τα στοιχεία αυτά φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντικά για την εξέλιξη των γονιδιωμάτων των σπονδυλωτών και κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου τους που μέχρι τώρα παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. 5. Ευχαριστίες Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το έργο «Αριστεία του Ι.ΘΑ.ΒΙ.Γ.-ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. (Επιχειρησιακό Σχέδιο 2006-08)», από το οποίο επίσης χορηγήθηκε υποτροφία για την εκπόνηση ΜΤΕ στην Τ. Μανουσάκη. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Bejerano, G., Pheasant, M., Makunin, I., Stephen, S., Kent, W.J., Mattick, J.S. & Haussler, D., 2004. Ultraconserved elements in the human genome. Science, 304: 1321 1325. Ludwig, M.Z. 2002. Functional evolution of noncoding DNA. Current Opinion in Genetics & Development, 12(6): 634-639. Elgar, G. & Vavouri, T., 2008. Tuning in to the signals: noncoding sequence conservation in vertebrate genomes. Trends in Genetics, 24: 344-352. Hedges, S.B. & Kumar, S., 2003. Genomic clocks and evolutionary timescales. Trends in Genetics, 19: 200-206. Stephen, S., Pheasant, M., Makunin, I. V. & Mattick, J. S. 2008. Large-Scale Appearance of Ultraconserved Elements in Tetrapod Genomes and Slowdown of the Molecular Clock. Molecular Biology and Evolution, 25(2): 402-408. Volff, J.N., 2005.Genome evolution and biodiversity in teleost fish. Heredity, 94(3):280-294. Voorrips, R.E., 2002. MapChart: software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs. Journal of Heredity, 93:77-78. Woolfe, A., Goodson, M., Goode, D.K., Snell, P., Mcewen, G.K., Vavouri, T., Smith, S.F., North, P., Callaway, H., Kelly, K., Walter, K., Abnizova, I., Gilks, W., Edwards, Y.J., Cooke, J.E. & Elgar, G., 2005. Highly conserved non-coding sequences are associated with vertebrate development. PloS Biology, 3: 116-130. -1160-