Ρουτίνα χρήσης του συνεστιακού Μικροσκοπίου Leica TCS-SP

Ρουτίνα χρήσης του συνεστιακού Μικροσκοπίου Leica TCS-SP 1. Αρχή λειτουργίας του συνεστιακού µικροσκοπίου Η συνεστιακή µικροσκοπία στηρίζεται στο γεγονός ότι ο φωτισµός και η παρατήρηση είναι περιορισµένα σε ένα σηµείο του παρασκευάσµατος, µε τοποθέτηση διαφραγµάτων (pinhole) στους οπτικούς άξονες του συγκεντρωτή και του αντικειµενικού φακού (εικόνα 1). Με τον τρόπο αυτό, δεν ανιχνεύεται το φως που προέρχεται έξω από την περιοχή εστίασης. Εικόνα 1. Confocal principle. 1. συγκεντρωτής φακός, 2. αντικειµενικός φακός 1

Ανίχνευση σήµατος Το φως που εκπέµπεται από το επίπεδο εστίασης στο δείγµα περνά µέσα από την οπή του διαφράγµατος του ανιχνευτή για να δηµιουργήσει µια σηµειακή εικόνα στον φωτοπολλαπλασιαστή (PMT, photon multiplier tube). Ο φωτοπολλαπλασιαστής µετατρέπει τα φωτόνια σε ηλεκτρόνια. Στη συνέχεια το σήµα ψηφιοποιείται και αποστέλλεται στον ψηφιακό αναλυτή εικόνας. Είναι δυνατόν να ενισχυθεί αδύναµο σήµα µε ρύθµιση του δυναµικού (gain) στον σωλήνα. Είναι επίσης δυνατόν να κοπεί σήµα µη ειδικό (background) ορίζοντας το κατώτατο επίπεδο ανίχνευσης σήµατος (Offset). Με το σύστηµα αυτό έχουµε συνεστιακά τρία σηµεία: µία οπή που αφήνει να περάσει η πηγή φωτισµού ένα επίπεδο εστίασης του φωτός πάνω στο δείγµα µία οπή στο επίπεδο ανίχνευσης της εικόνας. Αυτά τα τρία σηµεία πρέπει να είναι οπτικά συζευγµένα και ευθυγραµµισµένα µε ακρίβεια το ένα προς το άλλο στο φωτεινό µονοπάτι του σχηµατισµού της εικόνας. Αυτό σηµαίνει συνεστιακό. Σαν συνέπεια, ο εκτός εστίασης φωτισµός δεν περνά στον ανιχνευτή και δεν συµβάλει στην τελική εικόνα. Η συνεστιακή µικροσκοπία παράγει λοιπόν εικόνες µεγάλης ευκρίνειας (sharp). Η συνολική εικόνα του δείγµατος παράγεται από οπτικές τοµές. Αυτό επιτρέπει την παρατήρηση παχιών δειγµάτων και επιτρέπει µεγαλύτερη ευκρίνεια χωρίς παρεµβολή του εκτός εστίασης φθορισµού. Περιορισµοί. Το συνεστιακό αποτέλεσµα και οι οπτικές τοµές δίνουν αποτελέσµατα µε κόστος µεγάλη µείωση του συνολικού ανιχνευόµενου όγκου. Για παράδειγµα σε διέγερση 488 nm, το πάχος της οπτικής τοµής που δίνεται από τον µαθηµατικό τύπο:, είναι περίπου 500 nm. Για ένα κύτταρο καλλιέργειας πάχους 12 µm, αυτό είναι µικρότερο από 1/20 του συνολικού όγκου. Pinhole = Airy 1 (confocal) Φωτοπολλαπλασιαστές PMTs: PMT1, PMT2, PMT3 Transmission PMT Συλλογή Εικόνας (Image acquisition) 2

Στην κλασσική µικροσκοπία ο σχηµατισµός της εικόνας είναι αυτόµατος. To φωτογραφικό φίλµ, ή το CCD chip στην camera ή στο ανθρώπινο µάτι, ανιχνεύουν όλη την εικόνα που εξέρχεται από το µικροσκόπιο, αµέσως. Αντίθετα, στο συνεστιακό µικροσκόπιο ο φωτισµός κατευθύνεται πάνω στο δείγµα σηµειακά µέσω ενός διχροϊκού καθρέφτη σε έναν σαρωτή. Το φως που εκπέµπεται από το δείγµα συλλέγεται και υφίσταται πάλι σάρωση µέσα από την οπή ανίχνευσης (detector pinhole) και φτάνει στον σωλήνα του φωτοπολλαπλασιαστή. Έτσι και ο φωτισµός και η ανίχνευση εξαρτώνται από µια διαδικασία σάρωσης. ηλαδή, η εικόνα δηµιουργείται µέσω σάρωσης. Αυτή η πληροφορία είναι χρήσιµη για τον νέο χρήστη στην προσπάθειά του να πάρει την πρώτη εικόνα. 2. Από τι αποτελείται το συνεστιακό µικροσκόπιο Εικόνα 2. Leica Confocal TCS SP Confocal scanner head, το οποίο περιλαµβάνει τη διάταξη διχροϊκών καθρεπτών και φίλτρων εκποµπής καθώς και τους ανιχνευτές PMT (photon multiplier tube) detectors 3

Μικροσκόπιο Λάµπα φθορισµού. Το φως έρχεται από µια λάµπα υδραργύρου που δίνει ένα µίγµα µηκών κύµατος από το UV έως το κόκκινο. Ένα φίλτρο εκποµπής παρεµβάλλεται και ξεχωρίζει το επιθυµητό µήκος κύµατος. pc, οθόνες pc control panel, από το οποίο µπορούµε να ρυθµίσουµε τις εξής παραµέτρους PMT1 (photomultiplier 1), PMT2, PMT3, Phase, Pinhole, Zoom, Position Z/Y Laser box. Τα lasers δίνουν σηµειακή πηγή φωτισµού που επιτυγχάνεται µετά από πέρασµα από την οπή του διαφράγµατος (pinhole). H σηµειακή αυτή πηγή φωτός σαρώνει το δείγµα µε τη βοήθεια ενός σαρωτή. Η ταχύτητα µπορεί να ορισθεί σε αργή (καλύτερο σήµα) ή γρήγορη (αποφεύγουµε την καταστροφή του δείγµατος). laser Argon: 457, 488, 514 nm laser He/Neon: 543, 633 nm System electronics ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΙ ΦΑΚΟΙ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ Μεγέθυνση Αριθµητικό άνοιγµα (numerical aperture) υλικό στο οποίο καταδύεται ο φακός (immersion medium). 10x HC PL Fluotar 0.3 αέρας (ξηρός φακός) 20x HC PlanApo 0.7 αέρας (ξηρός φακός) 40x HCX PLApoCS 0.75-1.25 Λάδι (ελαιοκαταδυτικός φακός) 63x HCX PLApo 0.6-1.32 Λάδι (ελαιοκαταδυτικός φακός) *ΠΡΟΣΟΧΗ: 1. Οι ελαιοκαταδυτικοί φακοί 40x και 63x έχουν στο κάτω µέρος ένα δακτύλιο που περιστρέφεται και που µπορεί να υποχωρήσει. Περιστροφή του δακτυλίου µπορεί να επιτύχει καλύτερη εστίαση σε περίπτωση που χρησιµοποιείται καλυπτρίδα µε διαφορετικό πάχος. Επίσης προστατεύει τον φακό σε περίπτωση που από λάθος πλησιάσουµε πολύ το δείγµα. Κάθε φορά χρειάζεται να γίνεται έλεγχος και να επαναφέρεται ο δακτύλιος αυτός στη θέση του ώστε για να έχουµε την βέλτιστη εστίαση. 2. Όταν εστιάζουµε µε τον φακό 63x, σε λαµέλλα που είναι τοποθετηµένη στην πάνω άκρη στο πλακάκι κοντά στο έλασµα ο φακός 40x µπορεί να ακουµπά στην τράπεζα, µε αποτέλεσµα να µην δουλεύει ο κοχλίας Z-position στο control panel και να µην µπορεί να γίνει εστίαση. Επίσης ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΠΡΟΣΟΧΗ, ΓΙΑΤΙ ΥΠΑΡΧΕΙ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΝΑ ΚΑΤΑΣΤΡΑΦΕΙ Ο ΦΑΚΟΣ 40x 4

3. Πώς ανοίγουµε το σύστηµα Πριν ξεκινήσουµε να χρησιµοποιούµε το Confocal, καλό είναι να έχουµε ελέγξει το δείγµα µας στο κλασσικό µικροσκόπιο φθορισµού, ώστε να επιβεβαιώσουµε τη χρώση και την ποιότητα του δείγµατος. Επίσης, πρέπει να έχουµε αποφασίσει ποιο laser ή ποια lasers θα χρησιµοποιήσουµε. Τα βήµατα που ακολουθούµε για να ανοίξουµε το σύστηµα του Confocal είναι: Ανοίγουµε το διακόπτη Scan Electronics (κόκκινο κουµπί) και το κλειδί του laser HeNe Ανοίγουµε το διακόπτη (κόκκινο κουµπί) laser Argon και το κλειδί (µε προσοχή να στρέψουµε το κλειδί προς τα δεξιά, ως τη θέση start ) Ανοίξτε µόνο το laser που χρειάζεστε. Κάθε άνοιγµα-κλείσιµο των lasers κοστίζει χρόνο ζωής και κοστίζει. Αν οι χρωστικές σας διεγείρονται στα 458/476/488/514 nm ανοίξτε το Argon Laser. Αν η χρωστική σας διεγείρεται στα 546 ή 633 nm ανοίξτε το He-Ne laser στη συνέχεια ανοίγουµε µε την εξής σειρά: PC µικροσκόπιο λάµπα φθορισµού 4. Πώς εστιάζουµε στο δείγµα Στο µικροσκόπιο, κάτω από τους προσοφθάλµιους φακούς, υπάρχει ένας περιστρεφόµενος δακτύλιος µε φίλτρα: θέση 2: διεγείρουµε µε µπλε φως, για να δούµε τον πράσινο φθορισµό θέση 3: διεγείρουµε µε πράσινο φως, για να δούµε τον κόκκινο φθορισµό θέση 4: για να στείλουµε την εικόνα στο σύστηµα του Confocal. Κοιτώντας το δείγµα από τους προσοφθάλµιους φακούς επιλέγουµε ένα πεδίο που θέλουµε να παρατηρήσουµε πριν αρχίσουµε τη σάρωση. Τα φίλτρα αλλάζουν από τον δακτύλιο πάνω από τους φακούς. Στις θέσεις 2, 3 µπορούµε να δούµε πράσινο και κόκκινο φθορισµό αντίστοιχα. Η θέση 4 είναι για την σάρωση µε το laser. Για να περάσει το φως στους φωτοπολλαπλασιαστές τραβήξτε τον µοχλό στο πλάι αριστερά προς τα έξω και κλείστε το shutter του φθορισµού στα δεξιά του µικροσκοπίου. 5

Πώς αλλάζω τους φακούς όσο παρατηρώ το δείγµα? Ξεκινάµε µε τους φακούς που έχουν χαµηλότερη µεγέθυνση και βρίσκουµε την περιοχή ενδιαφέροντος. Στη συνέχεια, κατεβάζω την τράπεζα και εστιάζω ξανά µε τους φακούς που έχουν µεγαλύτερη µεγέθυνση, ως εξής: Αρχικά µε τον µακροµετρικό κοχλία, ανεβάζουµε την τράπεζα. Μόλις ακουµπήσει ο φακός στο λάδι, παρατηρούµε ότι απλώνεται/ διασπείρεται ο φθορισµός και τότε σταµατάµε να µετακινούµε τον µακροµετρικό κοχλία. Στη συνέχεια, εστιάζουµε µε τον µικροµετρικό κοχλία. Πώς βλέπουµε µε αντίθεση φάσης? Για να παρατηρήσουµε το δείγµα µας σε αντίθεση φάσης πρέπει να κλείσουµε το shutter του φθορισµού στα δεξιά του µικροσκοπίου και να ανοίξουµε (προς τα πάνω) τον διακόπτη κάτω δεξιά στο κουτί της λάµπας του διερχόµενου φωτός. Επίσης, πιέζουµε µέσα τον µοχλό vis, που βρίσκεται στη δεξιά κάτω πλευρά του µικροσκοπίου. 4. Συλλογή Εικόνας (Image acquisition) Αρχικά ανοίγουµε τον υπολογιστή. Το password είναι admin. Το συνεστιακό µικροσκόπιο Leica SP ελέγχεται από το software LCS (Leica Confocal Software). Κάνουµε διπλό κλικ στο εικονίδιο Leica Confocal Software για να ανοίξουµε το λογισµικό. Αρχικά, ορίζουµε το φακό που θα χρησιµοποιήσουµε µε το obj. Στη συνέχεια, ορίζουµε τη λειτουργία των φωτοπολλαπλασιαστών PMTs στην κάτω γραµµή του παραθύρου του Leica Confocal Software. Για τον κάθε φωτοπολλαπλασιαστή, πρέπει να ρυθµίσουµε: 1. το Gain, δηλαδή την ένταση του σήµατος που θα ανιχνευθεί. Ορίζω έτσι το ανώτατο όριο έντασης ώστε για να µην παίρνω κορεσµένο σήµα. 2. το Offset, δηλαδή το κατώτατο όριο του σήµατος που θα ανιχνεύσει ο φωτοπολλαπλασιαστής, για να µειώσουµε το θόρυβο. 6

Για τον κάθε φωτοπολλαπλασιαστή µπορείτε να χρησιµοποιήσετε ξεχωριστό κουµπί, ή ρυθµίζοντας µε δεξί κλικ τις 2 αυτές παραµέτρους στις συνθήκες smart gain/ smart offset, να αυξοµειώνεται η καθεµιά τους στην εικόνα που είναι επιλεγµένη κάθε φορά στη δεξιά οθόνη, όταν γίνεται παράλληλα σάρωση µε περισσότερα του ενός φθοριοχρώµατα. Η ρύθµιση αυτή των PMTs γίνεται ως εξής: gain PMT1 δεξί κλικ configuration smart gain και gain PMT2 δεξί κλικ configuration smart offset. Η ρύθµιση των smart gain και smart offset κατά τη διάρκεια της σάρωσης γίνεται από τους κοχλίες 1 και 2 του control panel αντίστοιχα. Πιέζουµε το εικονίδιο Beam (εικόνα 3). Αυτό ανοίγει ένα παράθυρο µε παραµέτρους. Μέσα από το παράθυρο αυτό, µπορούµε να ορίσουµε πολλές παραµέτρους λειτουργίας του µικροσκοπίου: 7

Εικόνα 3. Το παράθυρο beam path setting, µέσα από το οποίο µπορούν να ρυθµιστούν εύκολα οι φασµατοσκοπικές παράµετροι. Στο παράθυρο beam path setting µπορούµε να ρυθµίσουµε: Ποιά γραµµή laser θα χρησιµοποιήσουµε και σε ποια ένταση (%). Για τις γραµµές του laser που θα χρησιµοποιήσουµε, µπορούµε να επιλέξουµε στην πάνω δεξιά πλευρά του παράθυρου beam, όπου υπάρχουν προκαθορισµένες ρυθµίσεις-set µε παραµέτρους. Με L είναι οι διαµορφωµένες από την εταιρεία Leica, ενώ µε U αυτές που έχουν φτιάξει οι χρήστες. Τα settings µπορεί να είναι είτε µονά, δηλαδή ενεργοποιούµε µία µόνο γραµµή laser, είτε διπλά (δηλαδή διεγείρουµε το δείγµα µε 2 γραµµές laser ταυτόχρονα), είτε τριπλά. Μπορούµε να ορίσουµε και να σώσουµε τις δικές µας παραµέτρους για τα πειράµατά µας. Ενεργοποιούµε όποιο set µε παραµέτρους θέλουµε µε double click. 8

Το εύρος φάσµατος εκποµπής, που θα δει ο κάθε φωτοπολλαπλασιαστής. Στο Confocal µπορούµε να επιλέξουµε το εύρος της εκποµπής των φθοριοχρωµάτων στα beam settings, ώστε να έχουµε τη λιγότερο δυνατή επικάλυψη των φασµάτων εκποµπής των φθοριοχρωµάτων (crosstalk). Το συνολικό εύρος φασµατοσκοπικής ανίχνευσης απεικονίζεται µε το φάσµα χρωµάτων από µπλε έως πράσινο και κίτρινο έως κόκκινο. Οι κάθετες γραµµές δείχνουν τα µήκη κύµατος διέγερσης (488nm, 543nm και 633nm). Οι στικτές γραµµές δείχνουν τα φάσµατα εκποµπής των φθοριοχρωµάτων, (στην περίπτωση της εικόνας 3 του FITC, TRITC και Cy5), και µας βοηθούν για να ορίσουµε το εύρος φάσµατος εκποµπής των φθοριοχρωµάτων (γκρι ορθογώνια κουτιά) που θα ανιχνεύσουµε στον φωτοπολλαπλασιαστή. Επίσης, υπάρχουν τα παράθυρα επιλογής του κάθε φθοριοχρώµατος ξεχωριστά. Τον διχροϊκό καθρέπτη. Για να παρατηρήσουµε φθορισµό, ο διχροϊκός καθρέπτης που χρησιµοποιούµε είναι ο TD 488/543/633 όταν χρησιµοποιούµε και τις τρεις γραµµές laser. Αν δουλεύουµε µε την γραµµή 488 µπορούµε να χρησιµοποιήσουµε και τον RSP500. Για να παρατηρήσουµε αντίθεση φάσης, ο διχροϊκός καθρέπτης που χρησιµοποιούµε είναι ο RSP500. Στη συνέχεια ορίζουµε τις 6 παραµέτρους που αναφέρονται στη σάρωση: scan Mode: default xyz Zoom: µπορώ να το ρυθµίσω µε τρεις τρόπους α) µε περιστροφή του αντίστοιχου κοχλία στο control panel, β) µε επιλογή κάποιου από τα ήδη υπάρχοντα Zoom, γ) µε ένα κλικ πάνω στο εικονίδιο zoom in και µετά ορισµό στην δεξιά οθόνη της περιοχής ενδιαφέροντος (κίτρινο πλαίσιο). Αφού κάνουµε Zoom, µπορούµε να µετακινηθούµε στο πεδίο µε τα βελάκια Scan Format: σχετίζεται µε την ανάλυση της εικόνας που παίρνουµε (δυνατές επιλογές 512x512 pixels το επιλέγω εάν έχω χαµηλής έντασης σήµα, χαµηλότερης ποιότητας εικόνα και 1024x1024 pixels-το επιλέγω εάν έχω υψηλής έντασης σήµα, υψηλότερης ποιότητας εικόνα) Scan Speed (Ταχύτητα σάρωσης) : 400 Hz 9

Pinhole size: το µικροσκόπιο λειτουργεί συνεστιακά όταν το Pinhole είναι ρυθµισµένο στο 1 Airy unit. Σε περίπτωση που δεν υπάρχει καλό σήµα, µπορώ να αυξήσω λίγο το Pinhole, ώστε να αυξηθεί το σήµα, στην περίπτωση αυτή στην εικόνα παίρνω και σήµα από φθορισµό εκτός επιπέδου εστίασης. image Avg - AVERAGE: για να απορριφθεί το µη ειδικό σήµα (θόρυβος). Καθορίζει πόσες φορές θα γίνει σάρωση από το laser του κάθε σηµείου. Η τελική ένταση του φθορισµού που προέρχεται από κάθε σηµείο είναι η µέση τιµή. Ένας γενικότερος κανόνας είναι να χρησιµοποιούµε 3-4 average. Πρέπει να θυµόµαστε ότι όσο πιο υψηλή τιµή average επιλέξουµε, τόσο πιο πολύ καταστρέφουµε το δείγµα. Η επιλογή υψηλού average γίνεται όταν έχουµε καλή χρώση µε έντονο φθορισµό και θέλουµε να δούµε µικρές µορφολογικές δοµές του κυττάρου µε µεγάλη λεπτοµέρεια. * για να στείλουµε την εικόνα στον υπολογιστή, πρέπει να τοποθετήσουµε τον περιστρεφόµενο δακτύλιο µε τα φίλτρα φθορισµού στην κεφαλή του µικροσκοπίου πάνω από τους φακούς στη θέση 4 και να τραβήξουµε το µοχλό στο πλάι αριστερά προς τα έξω. Αφού ορίσουµε όλες αυτές τις παραµέτρους, και έχουµε στείλει την εικόνα στον υπολογιστή, επιλέγουµε τη σάρωση Continuous. Ενώ γίνεται η σάρωση, ρυθµίζουµε τις παραµέτρους: gain και offset, περιστρέφοντας τους κοχλίες 1 και 2 του control panel αντίστοιχα. την βέλτιστη ένταση του σήµατος (glow over and under pseudocolors OU ή Q- LUT- look up tables). Με την επιλογή αυτή ουσιαστικά προσδιορίζονται οι περιοχές υψηλής και χαµηλής έντασης φθορισµού και έτσι ελέγχεται ο κορεσµός και αντίστοιχα ο θόρυβος του φθορισµού στην εικόνα. Όλα τα φθοριοχρώµατα µπορούµε να τα δούµε µε την επιλογή glow over and under. Ο σκοπός είναι το background της εικόνας να γίνει µαύρο και να µην υπάρχουν περιοχές µε κορεσµένο φθορισµό- έντονο µπλε χρώµα. Επίσης δεν θα πρέπει να υπάρχει πράσινο χρώµα έτσι ώστε να µην χάνεται ειδικό σήµα. το Z-level, για να πάρουµε την οπτική τοµή που δείχνει την περιοχή που µας ενδιαφέρει 10

To Pinhole επίσης µπορεί να ρυθµιστεί σε τιµή άλλη από το 1 airy. Υψηλή τιµή όµως κάνει συµβιβασµούς στην καθαρότητα (διακριτική ποιότητα) της εικόνας και στην συνεστιακότητα. Αυτό γίνεται σε περίπτωση που έχετε πολύ ασθενές σήµα. Κατά τη διάρκεια της σάρωσης, η εικόνα φαίνεται στην οθόνη δεξιά. Αν η εικόνα είναι ικανοποιητική σταµατείστε την συνεχή (continuous) σάρωση. Μπορείτε να αφήσετε και λίγο background και να κάνετε περισσότερες φορές σάρωση (δηλαδή να βάλουµε µεγαλύτερο αριθµό AVERAGE). Η τιµή του average 4-8 φορές είναι καλή στις περισσότερες περιπτώσεις αν έχετε καλό σήµα. Αν όµως θέλετε να διακρίνετε πολύ λεπτές δοµές θα δοκιµάσετε µεγαλύτερο average. Αν ενδιαφέρεστε για απεικόνιση συγκεκριµένης περιοχή του πεδίου που βλέπετε στην οθόνη µπορείτε να κάνετε Zoom In (κατά τη διάρκεια του continuous) και να µεγενθύνετε. Για να πάρετε την τελική εικόνα, επιλέγουµε Single Scan (µε τον τρόπο αυτό σώζεται η εικόνα χωρίς scale bar). Στην περίπτωση που θέλουµε να έχουµε και το scale bar, τότε, και κάνουµε δεξί κλικ πάνω στην εικόνα send to selection snapshot. To snapshot είναι ουσιαστικά µία εντολή printscreen. Ε Ω ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΕΙΚΟΝΩΝ ΣΤΟ PHOTOSHOP/ IMAGE-PRO, ΓΙΑΤΙ Η ΕΙΚΟΝΑ SNAPSHOT ΕΧΕΙ ΑΛΛΕΣ ΙΑΣΤΑΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΙΚΟΝΑ RAW. Το scale bar µπορείτε να το βάλετε στις εικόνες και µετά, µε το πρόγραµµα ImageJ. ΟΤΑΝ ΘΕΛΟΥΜΕ ΝΑ ΣΥΛΛΕΞΟΥΜΕ ΤΟΜΕΣ (Series): Στην περίπτωση αυτή, θα πρέπει να ορίσουµε την πάνω και κάτω θέση, που ορίζουν το συνολικό πάχος του δείγµατος που θα απεικονισθεί. Στη διάρκεια του Continuous, µετακινούµε τον κοχλία Position Z/Y και βρίσκουµε τη θέση από όπου θέλουµε να ξεκινήσουν οι τοµές. Τότε, επιλέγουµε Begin (η επιλογή Begin πρέπει να είναι αρχικά γκρι για να βάλουµε την τιµή). Στη συνέχεια, µετακινούµε τον κοχλία Position Z/Y προς 11

την αντίθετη κατεύθυνση και βρίσκουµε την περιοχή που θέλουµε να τελειώσει το series. Εκεί, επιλέγουµε End. Επίσης, µπορούµε να χρησιµοποιήσουµε το εικονίδιο Series, για να ορίσουµε το πάνω και κάτω όριο του series. Με τον τρόπο αυτό, υπολογίσαµε το συνολικό πάχος του δείγµατος που θέλουµε να παρατηρήσουµε. Στη συνέχεια, πρέπει να επιλέξουµε το πάχος της κάθε οπτικής τοµής που θα σαρωθεί και τον αριθµό των οπτικών τοµών που θα σαρωθούν στο δείγµα. Πηγαίνουµε στην επιλογή sections, όπου είτε βάζουµε τον αριθµό των τοµών που θέλουµε, είτε πηγαίνουµε στο others και ανοίγει το παράθυρο, που µας δείχνει το πάχος του δείγµατος (όπως το ορίσαµε µε τα begin και end). Εκεί, ορίζουµε το Step size (πάχος των τοµών), Προσοχή, το πάχος των τοµών να µην είναι µικρότερο από 0.2 µm. Μία αντιπροσωπευτική τιµή που µπορεί να χρησιµοποιηθεί είναι 0.5 µm calculate υπολογίζει τον αριθµό των τοµών-sections. Στη συνέχεια ρυθµίζουµε τον αριθµό των average που θέλουµε για κάθε τοµή και επιλέγουµε Series. CROSSTALK Εάν έχουµε σηµάνει το δείγµα µε 2 φθοριοχρώµατα, που τα φάσµατα εκποµπής τους βρίσκονται σχετικά κοντά, π.χ. Αlexa 488 και Αlexa 543, υπάρχει περίπτωση να υπάρχει κάποιο crosstalk. Για να σιγουρευτούµε, µπορούµε καθώς γίνεται σάρωση της εικόνας µε το διπλό set, να κλείσουµε τελείως την ένταση του φθορισµού στη γραµµή laser 488nm. Τότε, θα πρέπει να µην υπάρχει καθόλου σήµα στο κανάλι του πράσινου. Εάν βλέπουµε κάποιο σήµα, αυτό προέρχεται από το laser 543nm, οπότε µπορούµε να µειώσουµε την ένταση του laser 543nm, ώστε να µην βλέπουµε καθόλου σήµα στο κανάλι του πράσινου. Επίσης, µπορούµε να κλείσουµε τελείως την ένταση του φθορισµού στη γραµµή laser 543nm, οπότε δεν πρέπει να υπάρχει καθόλου σήµα στο κανάλι του κόκκινου. Εάν βλέπουµε κάποιο σήµα, αυτό προέρχεται από το laser 488nm, οπότε µπορούµε να µειώσουµε την ένταση του laser 488nm, ώστε να µην βλέπουµε καθόλου σήµα στο κανάλι του κόκκινου. Στην περίπτωση που υπάρχει µεγάλο crosstalk µεταξύ των φθοριοχρωµάτων µε τα οποία έχουµε σηµάνει το δείγµα, καλό είναι να χρησιµοποιήσουµε το sequential scanning (εικονίδιο seq). Με τον τρόπο αυτό γίνεται σάρωση του δείγµατος χωριστά µε κάθε γραµµή laser και όχι ταυτόχρονα (όπως συµβαίνει όταν έχουµε επιλέξει κάποιο διπλό 12

setting από το beam path setting). Για παράδειγµα, εάν έχουµε σηµάνει το δείγµα µε 2 φθοριοχρώµατα, π.χ. Αlexa 543 και Αlexa 488, θα γίνει σάρωση του δείγµατος πρώτα µε τη γραµµή laser 543 nm και στη συνέχεια µε τη γραµµή laser 488 nm. Η διαδικασία γίνεται ως εξής: επιλέγουµε seq, και κάνουµε add πρώτα το setting Alexa 543. Μετά, επιλέγουµε και κάνουµε add το setting Alexa 488. Μπορούµε να συνδυάσουµε το sequential scanning µε τη συλλογή οπτικών τοµών. Στην περίπτωση αυτή, στο παράθυρο seq µπορούµε να επιλέξουµε είτε between stacks (συλλέγει όλες τις τοµές µε την πρώτη γραµµή laser και µετά συλλέγει όλες τις τοµές µε τη δεύτερη γραµµή laser), είτε between frames (συλλέγει π.χ. στην 1 η τοµή όλα τα χρώµατα και µετά προχωράει στην επόµενη τοµή). Για να λειτουργήσει το sequential scanning, πρέπει να κρατήσουµε ανοιχτό το παράθυρο του sequential scanning, και στη συνέχεια, να επιλέξουµε Series. * Θα πρέπει να θυµόµαστε ότι τα φθοριοχρώµατα που διεγείρονται στο υπέρυθρο, µε τη γραµµή laser 633 nm, είναι τα πιο ευαίσθητα και ο φθορισµός τους µπορεί πολύ γρήγορα να καταστραφεί (bleach). Για το λόγο αυτό, εάν χρησιµοποιούµε sequential scanning, καλό είναι να τα βάλουµε να τα πάρει πρώτα µε το add και να επιλέξουµε between stacks. ΕΞΙΑ ΟΘΟΝΗ ΤΟΥ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ Στη δεξιά οθόνη του υπολογιστή, εµφανίζεται η εικόνα. Έχουµε τις εξής επιλογές: Single channel: µε κλικ πάνω στο εικονίδιο αυτό, µία εικόνα καταλαµβάνει όλο το δεξιό panel Tiled: (δύο ή περισσότερα κανάλια), η περιοχή απεικόνισης χωρίζεται σε 4 panels. Το ενεργό panel έχει ένα κόκκινο στικτό περίγραµµα. Ovl-overlay: µε την επιλογή αυτή, γίνεται superimposition µέχρι και 3 καναλιών κόκκινο, πράσινο και µπλε. Κανάλια ανίχνευσης φθορισµού: Στην περιοχή αυτή εµφανίζεται το 1 ο κανάλι ανίχνευσης φθορισµού Στην περιοχή αυτή εµφανίζεται το 2 ο κανάλι ανίχνευσης φθορισµού 13

Στην περιοχή αυτή εµφανίζεται το 3 ο κανάλι ανίχνευσης φθορισµού Στην περιοχή αυτή είτε εµφανίζεται η εικόνα overlay είτε το 4 ο κανάλι ανίχνευσης φθορισµού Με κλικ σε κάθε ένα από αυτά, βλέπουµε χωριστά το κάθε κανάλι ανίχνευσης φθορισµού µιας εικόνας multifluorescence. CH1: channel 1 CH2: channel 2 CH3: channel 3 Gallery: χρησιµοποιείται για να εµφανίσουµε όλα τα z-sections, εάν έχουµε κάνει σάρωση του δείγµατος µε series Μπορούµε να συνδυάσουµε τον τρόπο απεικόνισης Gallery µε τις επιλογές Single και Tiled, για να εµφανίσουµε τις εικόνες από ένα ή περισσότερα κανάλια ανίχνευσης φθορισµού ταυτόχρονα. Ο τρόπος απεικόνισης Gallery µε το overlay µπορούν να συγχωνευτούν. Q-LUT: quaternary look up tables, η ένταση φθορισµού µιας εικόνας µεταφράζεται σε LUT (Look Up Tables) Πως ρυθµίζω τα επίπεδα κορεσµού του φθορισµού µιας εικόνας? Χρησιµοποιώντας ψευδοχρώµατα που υπάρχουν, είτε επιλέγοντας Look up tables είτε overunder Όταν έχουµε πάρει ένα series, µπορούµε χρησιµοποιώντας τις επιλογές first, last, prev, next να εµφανίσουµε τις αντίστοιχες εικόνες. Επίσης, µε την επιλογή play µπορούµε να παίξουµε τις series σαν ταινία. 5. Πειράµατα για ποσοτικοποίηση του φθορισµού στο Confocal. Tips on image acquisition: Beam path settings: να χρησιµοποιούµε κάθε φορά το ίδιο setting, χωρίς καµία αλλαγή στο εύρος του φάσµατος, ένταση του laser. Smart gain/smart offset: να είναι σε όλα τα δείγµατα στις ίδιες τιµές. Laser: ο κοχλίας που βρίσκεται στο laser box ρυθµίζει την ένταση και των δύο laser του Confocal. Control αρνητικό: µε βάση αυτό µηδενίζω το φθορισµό ή βάζω την ένταση του φθορισµού σε ένα επίπεδο background. Μετά πηγαίνω στο Image-pro ή στο ImageJ: για να δω τις διαφορές 6. Επεξεργασία εικόνας 14

Όταν τελειώσει η σάρωση όλων των οπτικών τοµών πηγαίνοντας στο παράθυρο View, στο κάτω µέρος της αριστερής οθόνης εµφανίζονται µια σειρά εικονίδια για την επεξεργασία των εικόνων που έχουν ληφθεί. Με τις εντολές Max, Avg και Trans, δηµιουργείται µία εικόνα από όλες τις διαδοχικές λαµβανόµενες τοµές, προερχόµενη από διαφορετική µαθηµατική επεξεργασία για την κάθε εντολή: Avg: 2D average projection of a series/ µέσος όρος Max: maximum projection of a series/ προσθετικό σήµα Section: περιλαµβάνει όλες τις τοµές και µετακινώντας τον σταυρό στο σηµείο που έχουµε επικάλυψη των φθοριοχρωµάτων µπορούµε να διαπιστώσουµε εάν βρίσκονται στο ίδιο ή σε διαφορετικό επίπεδο και να έχουµε µια ένδειξη για τη συνεντόπιση τους. Επίσης µε την εντολή orth και κινώντας µε τον κέρσορα τον σταυρό που δηµιουργείται πάνω στην εικόνα, µπορούµε να επιτύχουµε σάρωση του σηµείου που επιλέξαµε υπό γωνία 90 ο (orthogonal sectioning), έτσι ώστε να επιβεβαιώσουµε αν έχουµε συν-εντοπισµό 2 φθοριοχρωµάτων ή όχι. Με δεξί κλικ πάνω στις εικόνες αυτές µπορούµε επίσης να τις σώσουµε µαζί µε το συνολικό folder που περιέχει όλες τις οπτικές τοµές που έχουν σαρωθεί (stack). Function Overview στο κάτω αριστερά πλευρικό παράθυρο. Scale bar grids και coordinates Εάν θέλω να επεξεργαστώ µόνο κάποιες από τις τοµές που πήρα, πηγαίνω στο Process Image processing Editing. Εκεί µπορώ να επιλέξω ποιες τοµές θέλω (από ποιά έως ποιά) apply. Μετά, πηγαίνω ξανά στο παράθυρο View, και κάνω την επεξεργασία των τοµών αυτών. Experiment overview πάνω αριστερό παράθυρο. Σηµαντική περιοχή για σώσιµο δεδοµένων. 15

Όλες οι φωτογραφίες σώζονται σαν αρχεία κάτω από ένα πείραµα. Όλα τα αρχεία σώζονται στην RAM µνήµη όχι στον σκληρό δίσκο. Πρέπει να τα αποθηκεύσετε στον σκληρό δίσκο όσο πιο γρήγορα γίνεται. Μπορείτε να αλλάξετε το όνοµα του κάθε αρχείου (δεξί κλικ. Rename). Αποθηκεύστε πρώτα τα αρχεία και µετά τους αλλάζετε το όνοµα, µήπως κάτι συµβεί και τα χάσετε. Τα αρχεία σώζονται µε ακρονύµιο *.lei entries. Εάν θέλουµε να σώσουµε µία εικόνα µε το scale bar της, την εµφανίζουµε στη δεξιά οθόνη και κάνουµε δεξί κλικ send to experiment selection snapshot. 7. Κλείσιµο του συστήµατος Αφού σώσουµε τα files στον σκληρό δίσκο, σβήνουµε το σύστηµα αντίστροφα µε τον τρόπο που το ανοίξατε, ως εξής: Κλείνουµε το Leica control software. Κλείνουµε τη λάµπα φθορισµού 30 λεπτά τουλάχιστον µετά το άνοιγµα Κλείνουµε το µικροσκόπιο Κλείνουµε το PC κλείνουµε τα lasers γυρνώντας τα κλειδιά, ΟΧΙ ΙΑΚΟΠΤΕΣ (Αφήνουµε να λειτουργήσει ο ανεµιστήρας, ώστε να αποφευχθεί η υπερθέρµανση) Mετά από 3 λεπτά, κλείσιµο του διακόπτη (κόκκινο κουµπί) laser HeNe και του 16

διακόπτη (κόκκινο κουµπί) laser Argon Καθαρίζουµε τους φακούς του µικροσκοπίου και την τράπεζα Σκεπάζουµε το µικροσκόπιο και τις οθόνες του PC µε τα ειδικά πλαστικά Συµπληρώνουµε το log book. Το aircondition πρέπει να µένει πάντα αναµµένο. 17