ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΜΕΤΑΠΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΜΕΤΑΠΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΗΜΑΤΩΝ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΦΩΤΟΛΕΥΚΑΝΣΗ ΓΕΡΑΣΙΜΟΣ ΚΑΛΛΙΑΦΑΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Γκλώτσος Δημήτριος ΠΑΤΡΑ 2017

Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Κ. Κάβουρας Διονύσιος, Καθηγητής Τμήματος Μηχανικών Βϊοιατρικής Τεχνολογίας Κ. Σακελλαρόπουλος Γεώργιος, Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρικής Φυσικής Κ. Γκλώτσος Δημήτριος, Επίκουρος Καθηγητής, (Επιβλέπων)

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Δημήτρη Γκλώτσο επίκουρο καθηγητή του τμήματος μηχανικών βιοϊατρικής τεχνολογίας ΤΕΙ Αθηνών για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα όσο και για τη βοήθεια του, τις συμβουλές και την κατανόηση που έδειξε σε όλη τη διάρκεια της πραγματοποίησης της παρούσας εργασίας. Επίσης θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στη μητέρα μου Σταματία για όλα όσα έκανε για μένα σε όλα τα χρόνια των σπουδών μου. Ευχαριστώ επίσης τον αδερφό μου Μιχάλη, καθώς και τους φίλους μου για τη συμπαράσταση και τη βοήθεια τους.

Στη γιαγιά μου Ασπασία και τον παππού μου Μάκη Στην Παυλίνα

Περιεχόμενα Περίληψη... 1 Abstract... 2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 3 ΒΑΣΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ... 3 1.1 ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ... 3 1.2 ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΑ ΜΕΡΗ... 4 1.3 ΧΗΜΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ... 7 1.3.1 ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟΙ ΔΕΣΜΟΙ... 7 1.3.2. ΠΕΠΤΙΔΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ... 8 1.4.ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟΙ ΔΕΣΜΟΙ... 8 1.5 ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ... 10 1.5.1 ΔΟΜΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ... 12 1.6 ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ... 15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 20 2.1 FRAP... 20 2.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΣ... 21 2.2.1 ΟΠΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ... 21 2.2.2 ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ... 24 2.3 ΠΗΓΕΣ ΦΩΤΟΣ LASER... 30 2.4 ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ... 31 2.4.1 FRANCK-GORDON... 34 2.4.2 ΦΩΤΟΛΕΥΚΑΝΣΗ... 35 2.5 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΩΝ ΟΥΣΙΩΝ... 35 2.6 ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ FRAP... 37 2.7 ΔΙΑΧΥΣΗ... 39 2.7.1 ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΔΙΑΧΥΣΗΣ... 40 2.8 ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ... 40 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3... 42 3.1 ΝΤΕΤΕΡΜΙΝΙΣΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ... 42 3.2 ΜΟΝΤΕΛΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗΣ FRAP... 44 3.2.1 PURE DIFFUSION DOMINANT... 48 3.2.2 EFFECTIVE DIFFUSION... 49

3.2.3 REACTION DOMINANT... 50 3.2.4 ΜΟΝΤΕΛΟ ΔΙΠΛΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ... 51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4... 56 4.1 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ FRAP... 56 4.2 ΝΟΡΜΑΛΙΣΜΟΣ... 57 4.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ... 58 4.4 ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ... 60 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5... 61 5.1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 61 5.2 ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΠΑΝΑΦΟΡΑΣ... 61 5.3 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΑΙΡΙΑΣΜΑΤΟΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ... 63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6... 72 6.1 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ... 72 6.2 ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ... 73 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 75

Περίληψη Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη υπολογιστικών μοντέλων για την ανάκτηση σημάτων φθορισμού μετά από φωτολεύκανση. Συγκεκριμένα αναπτύχθηκε ένα ντετερμινιστικό μοντέλο για την ανάλυση των αντιδράσεων πρόσδεσης των πρωτεϊνών από πειράματα FRAP. Τα πειράματα FRAP από την ανάπτυξη της το 1970 είναι μια καθιερωμένη τεχνική για την εύρεση του συντελεστή διάχυσης των πρωτεϊνών στα βιομόρια. Η ανάπτυξη των φθοριζουσών πρωτεϊνών και η χρήση τους σαν σημαντές για την παρακολούθηση της συμπεριφοράς των πρωτεϊνών στο κυτταρικό περιβάλλον επιτρέπουν την απάντηση σε νέα ερωτήματα. Τα πειράματα FRAP ή αλλιώς πειράματα ανάκτησης φθορισμού μετά από φωτολεύκανση χρησιμοποιούνται ευρέως εδώ και πολλά χρόνια για την παρακολούθηση της κινητικής των βιομορίων. Η ανάπτυξη των φθοριζουσών πρωτεϊνών σε συνδυασμό με τη συνεστιακή μικροσκοπία και την αυξανόμενη υπολογιστική ισχύ θέτουν τα πειράματα FRAP σε κυρίαρχη θέση για τη διερεύνηση της κινητικής των βιομορίων αλλά και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Έτσι πέρα από τον υπολογισμό του συντελεστή διάχυσης είμαστε πλέον σε θέση να υπολογίζουμε και τους ρυθμούς της αντίδρασης πρόσδεσης. Για να το κάνουμε αυτό αναπτύξαμε ένα μαθηματικό μοντέλο που βασίζεται στην επίλυση των μερικών διαφορικών εξισώσεων της αντίδρασης αλλά και της διάχυσης που υπάρχει στο κυτταρικό περιβάλλον δίνοντας μας κλειστές αναλυτικές λύσεις. Με βάση κάποιες υποθέσεις για το κυτταρικό περιβάλλον και τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων καταλήγουμε σε 3 απλοποιημένα μοντέλα τα οποία περιγράφουν αρκετά καλά τις απλές αντιδράσεις πρόσδεσης αλλά δίνει και κάποια αποτελέσματα για τις περιπτώσεις με 2 καταστάσεις πρόσδεσης. Το παραπάνω μοντέλο ελέγχθηκε για τις προβλέψεις του με την τεχνική ταιριάσματος καμπύλης και έδωσε καλά αποτελέσματα με βάση τους δείκτες καλής προσαρμογής. [1]

Abstract The purpose of this paper is to develop computational models for the recovery of fluorescence signals after photobleaching. Specifically, a deterministic model was developed to analyze protein binding reactions from FRAP (Fluorescence Recovery After Photbleaching) experiments. FRAP experiments from its development in 1970 are an established technique for finding the diffusion coefficient of proteins in biomolecules. The development of fluorescent proteins and their use as taggers for monitoring the behavior of proteins in the cellular environment allow us to answer new questions. FRAP experiments have been widely used for many years to monitor the kinetics of biomolecules. The development of fluorescent proteins combined with confocal microscopy and increasing computational power put FRAP experiments in a dominant position to investigate the kinetics of biomolecules and their interactions. Thus, apart from calculating the diffusion coefficient, we are now able to calculate the rates of the binding reaction. To do this, we developed a mathematical model based on solving the partial differential equations of the reaction and the diffusion that exists in the cellular environment, giving us closed analytical solutions. Based on some assumptions about the cellular environment and the concentrations of the reactants, we come up with 3 simplified models that describe quite well the simple binding reactions but also give some results for the cases with 2 tethering states. The above model was tested for its predictions by the curve fit technique and yielded good results based on good adjustment indices. [2]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΒΑΣΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 1.1 ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ Το κύτταρο αποτελεί τη βασική δομική και λειτουργική μονάδα κάθε οργανισμού. Είναι μια συστηματικά οργανωμένη ομάδα μακρομορίων, που βρίσκονται σε δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Το κύτταρο διαθέτει μορφολογική, φυσική και χημική οργάνωση και είναι μια μονάδα της ζωής ανεξάρτητη ως προς την αυτορρύθμιση και την προσαρμοστικότητά του σε σχέση με το περιβάλλον. Αναπτύσσεται, αναπαράγεται και πολλαπλασιάζεται αλλά και πεθαίνει με το μηχανισμό της απόπτωσης. Μεγάλες ομάδες ομοειδών κυττάρων, χαρακτηρίζονται ως ιστοί, (π.χ. μυϊκός ιστός), οι οποίοι και αποτελούν την μονάδα δεύτερης τάξης στον ανθρώπινο οργανισμό, μετά τα κύτταρα.[1] Από βιοχημική άποψη τρία χαρακτηριστικά ξεχωρίζουν τα κύτταρα από τα άλλα χημικά συστήματα και είναι τα εξής: Η ικανότητα να αντιγράφουν τον εαυτό τους Η παρουσία ενζύμων και πολύπλοκων πρωτεϊνών που είναι απαραίτητες για τη ζωή Μια μεμβράνη που χωρίζει το κύτταρο από το περιβάλλον και του επιτρέπει να διατηρεί τη δική του χημική ταυτότητα. Το κύτταρο είναι η βασική, δομική, λειτουργική και βιολογική μονάδα σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Έχουμε 2 ειδών κυττάρων τα προκαρυωτικά και τα ευκαρυωτικά. Μια σχηματική αναπαράσταση ενός ευκαρυωτικού κυττάρου έχουμε στην εικόνα 1. Το βασικό χαρακτηριστικό των ευκαρυωτικών σε σχέση με τα προκαρυωτικά είναι η διαμερισματοποίηση, η παρουσία οργανιδίων δέσμιων στην μεμβράνη στα οποία λαμβάνουν χώρα συγκεκριμένες μεταβολικές αντιδράσεις. Το πιο σημαντικό από αυτά τα οργανίδια είναι ο πυρήνας στον οποίο βρίσκεται το DNA του κυττάρου. Άλλες διαφορές μεταξύ των δύο ειδών κυττάρου είναι: Το DNA του ευκαρυωτικού κυττάρου οργανώνεται σε ένα ή περισσότερα γραμμικά μόρια που λέγονται χρωμοσώματα τα οποία είναι ισχυρά δεμένα με ειδικές πρωτεΐνες που λέγονται ιστόνες και αποτελούν ουσιαστικό κομμάτι της δομής του χρωμοσώματος. [3]

Στα προκαρυωτικά κύτταρα το γενετικό υλικό σχηματίζει ένα μεγάλο κυκλικό μόριο DNA στο οποίο μια πληθώρα πρωτεϊνών δένεται ασθενώς.[1] 1.2 ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΑ ΜΕΡΗ Μεμβράνη Ένα κύτταρο μπορεί και υπάρχει σαν ξεχωριστή οντότητα λόγο της κυτταρικής μεμβράνης η οποία ρυθμίζει το πέρασμα υλικών μέσα και έξω από το κύτταρο και έχει πάχος 7-9 nm. Η βασική δομή της μεμβράνης σχηματίζεται από ένα δίκτυο μορίων φωσφολιπιδίων τα οποία κατανέμονται σε διπλοστοιβάδα με τις υδρόφοβες ουρές να δείχνουν προς τα μέσα και τις υδρόφιλες κεφαλές φωσφορικού άλατος να δείχνουν προς τα έξω. Πυρήνας Ο πυρήνας είναι το πιο εμφανές οργανίδιο στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Είναι μεγάλο, συχνά σφαιρικό σώμα και περιβάλλεται από τον πυρηνικό φάκελο ο οποίος συνίσταται από δύο ομόκεντρες μεμβράνες καθεμία από τις οποίες είναι λιπιδική διπλοστοιβάδα. Οι δύο μεμβράνες χωρίζονται από ένα κενό 20-40 nm και σε τακτά χρονικά διαστήματα ενώνονται δημιουργώντας πυρηνικούς πόρους μέσα από τους οποίους υλικά περνάνε μέσα από το πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Μέσα στον πυρήνα βρίσκονται τα χρωμοσώματα. Τα χρωμοσώματα όταν το κύτταρο δεν διαιρείται είναι ορατά σαν ένα κουβάρι λεπτών κλωστών που λέγεται χρωματίνη.[1-2] Το πιο διακεκριμένο σώμα μέσα στον πυρήνα είναι ο πυρηνίσκος στον οποίο δημιουργούνται τα ριβοσώματα. Μιτοχόνδρια Τα μιτοχόνδρια είναι από τα μεγαλύτερα οργανίδια μέσα στο κύτταρο και εκεί γίνεται η παραγωγή ενέργειας του κυττάρου αλλά επιπλέον έχουν σημαντικό ρόλο στην ανοσία και στο κυτταρικό θάνατο. Στα μιτοχόνδρια οργανικά μόρια διασπώνται αποδίδοντας ενέργεια και η ενέργεια αυτή επανασυσκευάζεται σε μικρότερες μονάδες πιο βολικές για τις περισσότερες κυτταρικές διεργασίες. Ο αριθμός των μιτοχονδρίων είναι ανάλογος με τις ενεργειακές απαιτήσεις του κυττάρου. Τα μιτοχόνδρια αποτελούνται από δύο στρώματα φωσφολιπιδίων που δημιουργούν μια ομαλή εξωτερική μεμβράνη η οποία σχηματίζει μια χαρακτηριστική σφαιρική ή κυλινδρική δομή και μια εσωτερική [4]

μεμβράνη με υψηλή ικανότητα δίπλωσης. Η εσωτερική μεμβράνη είναι η τοποθεσία όπου λαμβάνουν χώρα τα βιοχημικά γεγονότα (σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων) τα οποία θα παράγουν ενέργεια για το κύτταρο. Διπλώνοντας η εσωτερική μεμβράνη, η επιφάνεια αυξάνεται δύο με τρείς φορές σε σχέση με την επιφάνεια πριν τη δίπλωση και έτσι περισσότερη ενέργεια μπορεί να παραχθεί. Αυτές οι διπλώσεις λέγονται ακρολοφίες και είναι επιφάνειες όπου λαμβάνουν χώρα αντιδράσεις, και όσο πιο ενεργό είναι το μιτοχόνδριο τόσες περισσότερες ακρολοφίες έχει. Η ενέργεια που παράγεται είναι στη μορφή ενός μορίου που λέγεται τριφωσφορική αδενοσίνη η οποία αποθηκεύει αποτελεσματικά ενέργεια σε χημικούς δεσμούς ανάμεσα σε φωσφορικά μόρια. Δημιουργώντας και σπάζοντας αυτούς τους δεσμούς αποθηκεύεται και απελευθερώνεται ενέργεια αντίστοιχα. Το ΑΤΡ που σχηματίζεται στα μιτοχόνδρια μπορεί να κατανεμηθεί μέσω του κυττάρου για να διευκολύνει άλλες χημικές διαδικασίες.[1-2] Ενδοπλασματικό δίκτυο Είναι ένα δίκτυο διασύνδεσης επίπεδων σάκων, σωληνίσκων και καναλιών που βρίσκονται στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το μέγεθος του ενδοπλασματικού δικτύου δεν είναι καθορισμένο αλλά εξαρτάται από τη δραστηριότητα του κυττάρου. Υπάρχουν 2 κατηγορίες ενδοπλασματικού δικτύου το τραχύ (με ριβοσώματα) και το ομαλό (χωρίς ριβοσώματα) τα οποία όμως συνδέονται μεταξύ τους. Το τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο βρίσκεται σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα και κυριαρχεί σε κύτταρα τα οποία παράγουν μεγάλες ποσότητες πρωτεϊνών για εξαγωγή. Σε κύτταρα που ειδικεύονται στην σύνθεση ή στο μεταβολισμό λιπιδίων έχουμε μεγάλη παρουσία ομαλού ενδοπλασματικού δικτύου.[1] Σύμπλεγμα Golgi Αποτελείται από επίπεδους σάκους δέσμιους στη μεμβράνη που στοιβάζονται χαλαρά ο ένας πάνω στον άλλο και περιβάλλονται από σωληνάρια και κυστίδια.οι σάκοι αυτοί βρίσκονται ανάμεσα στον πυρήνα του κυττάρου και την κυτταρική μεμβράνη με μεθοδικό τρόπο. Αυτή η οργάνωση διευκολύνει την μεταφορά συγκεκριμένων πρωτεϊνών και λιπιδίων στο σύμπλεγμα Golgi. Η λειτουργία του είναι να δέχεται κυστίδια από το ενδοπλασματικό δίκτυο, να τροποποιεί και τις μεμβράνες και το περιεχόμενο των κυστιδίων και να ενσωματώνει τα τελικά προιόντα σε μεταφορικά κυστίδια ώστε να τα παραδώσουν σε άλλα μέρη του κυττάρου και κυρίως στην [5]

επιφάνεια του. Δηλαδή το σύμπλεγμα Golgi δρα σαν κέντρο συσκευασίας και μεταφοράς μακρομορίων όπως πρωτεΐνες και λιπίδια.[1] Λυσοσώματα Είναι ένα μεγάλο κυστίδιο που δημιουργείται στο σύμπλεγμα Golgi και ουσιαστικά είναι ένας μεγάλος μεμβρανώδης σάκος που περιέχει υδρολυτικά ένζυμα τα οποία μπορούν να διασπάσουν χημικούς δεσμούς. Τα ένζυμα αυτά χρησιμοποιούνται στη διάσπαση πρωτεϊνών, πολυσακχαριτών και λιπιδίων. Η μεμβράνη του λυσοσώματος κρατάει τα ένζυμα διαχωρισμένα από το υπόλοιπα περιεχόμενα του κυττάρου ούτως ώστε η διαδικασία αποδόμησης να είναι ρυθμισμένη. Αν το λυσόσωμα σπάσει τότε το κύτταρο θα καταστραφεί καθώς τα ένζυμα που περικλείει είναι ικανά να διασπάσουν όλους τους κύριους τύπους μακρομορίων που περιέχονται στο κύτταρο. Τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την υδρόλυση απαιτούν ένα όξινο περιβάλλον για να έχουν βέλτιστη απόδοση. Επιπλέον τα λυσοσώματα έχουν την ικανότητα να συγχωνεύονται με άλλα οργανίδια και να τρέφονται με μεγάλες δομές ή κυτταρικά θραύσματα, ενώ μέσω συνεργασίας με τα φαγοσώματα μπορούν να εκτελέσουν αυτοφαγία καθαρίζοντας έτσι κατεστραμμένες δομές.[1-2] Περοξισώματα Όπως και τα λυσοσώματα, τα περοξισώματα είναι κυστίδια που περιέχουν ένζυμα και βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Τα περοξείδια (αντιδραστικά μόρια τα οποία μπορούν να διασπάσουν χημικούς δεσμούς) που περιέχονται σε κυστίδια είναι διαχωρισμένα σε διαμερίσματα από τα υπόλοιπα περιεχόμενα του κυτταροπλάσματος για να προστατεύσουν το κύτταρο. Η λειτουργία τους βρίσκεται στον καταβολισμό πολύ μακρών αλυσίδων λιπαρών οξέων, d-αμινοξέων, πολυαμινοξέων. Περιλαμβάνουν κατά προσέγγιση 10% της ολικής δραστηριότητας των δύο ενζύμων στην πορεία των φωσφορικών πεντόζων που είναι σημαντικές στον ενεργειακό μεταβολισμό.[1] [6]

Εικόνα 1 Αναπαράσταση ευκαρυωτικού κυττάρου https://biologydictionary.net/wp-content/uploads/2016/12/eukaryotic-cell-structure-animal.jpg 1.3 ΧΗΜΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ Η ουσία των βιολογικών διεργασιών, η βάση δηλαδή της ομοιότητας των ζώντων οργανισμών είναι στην πιο θεμελιώδη σημασία της οι μοριακές αλληλεπιδράσεις. Η βιοχημεία είναι η χημεία που εμφανίζεται μέσα στους ζώντες οργανισμούς. Για να κατανοήσουμε τη βιοχημεία πρέπει να κατανοήσουμε το σχηματισμό των χημικών δεσμών. Υπάρχουν 2 είδη χημικών δεσμών, οι ομοιοπολικοί και οι μη ομοιοπολικοί δεσμοί οι οποίοι διαφέρουν ανάλογα με το είδος της ηλεκτρικής αλληλεπίδρασης μεταξύ των μορίων.[4] 1.3.1 ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟΙ ΔΕΣΜΟΙ Οι πιο ισχυροί δεσμοί που υπάρχουν στις βιοχημικές ουσίες είναι οι ομοιοπολικοί δεσμοί. Ο ομοιοπολικός δεσμός σχηματίζεται από το μοίρασμα ενός ζεύγους ηλεκτρονίων μεταξύ γειτονικών ατόμων. Ένας συνήθης ομοιοπολικός δεσμός άνθρακα- άνθρακα (C-C) έχει μήκος δεσμού 1.54 Angstrom και ενέργεια δεσμού 85 kcal mol 1 και επειδή η ενέργεια αυτή είναι σχετικά μεγάλη, χρειάζεται αρκετή [7]

ενέργεια για τη διάσπαση των ομοιοπολικών δεσμών. Σε περιπτώσεις που δύο άτομα μοιράζονται περισσότερα του ενός ζεύγη ηλεκτρονίων, σχηματίζονται πολλαπλοί ομοιοπολικοί δεσμοί οι οποίοι είναι ακόμη πιο ισχυροί από τους απλούς δεσμούς C-C με ενέργεια περίπου 175 kcal mol 1. Για ορισμένα μόρια μπορεί να υπάρχουν περισσότερα του ενός σχήματος ομοιοπολικών δεσμών που ονομάζονται δομές συντονισμού. Οι χημικές αντιδράσεις αφορούν τη διάσπαση και το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών. [3-4] 1.3.2. ΠΕΠΤΙΔΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ Ένας ομοιοπολικός δεσμός που συνδέει δυο διαδοχικά μονομερή αμινοξέα λέγεται πεπτιδικός δεσμός. Συγκεκριμένα πρόκειται για ένα ομοιοπολικό δεσμό, άνθρακα(c) - αζώτου (N) που συνδέει την ομάδα καρβοξυλίου (-COOH) ενός αμινοξέος με την αμινική ομάδα (-NH 2 ) ενός διπλανού του, εκλύοντας ένα μόριο ύδατος (H 2 O). Η βιοσύνθεση του πεπτιδικού δεσμού χρειάζεται την προσθήκη ελεύθερης ενέργειας. Παρόλα αυτά οι πεπτιδικοί δεσμοί είναι αρκετά σταθεροί κινητικά και η διάρκεια ζωής τους σε υδάτινο διάλυμα με απουσία καταλύτη πλησιάζει τα 1000 χρόνια. Ο πεπτιδικός δεσμός είναι βασικά επίπεδος και για αυτό το λόγο για κάθε ζεύγος αμινοξέων τα οποία συνδέονται με πεπτιδικό δεσμό υπάρχουν έξι άτομα που βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο: το άτομο α-άνθρακα και η ομάδα CO του πρώτου αμινοξέος καθώς και η ομάδα ΝΗ και το άτομο α-άνθρακα του δεύτερου αμινοξέος. Η εξήγηση αυτής της γεωμετρικής προτίμησης βρίσκεται στη φύση του πεπτιδικού δεσμού ο οποίος έχει, εν μέρει, χαρακτήρα διπλού δεσμού ο οποίος αποτρέπει την περιστροφή γύρω από τον εαυτό του.[1-4] 1.4.ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟΙ ΔΕΣΜΟΙ Εκτός από τους ομοιοπολικούς δεσμούς υπάρχουν και τρεις μη ομοιοπολική δεσμοί, οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, οι δεσμοί υδρογόνου και οι αλληλεπιδράσεις Van der Waals. 1. Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Μια ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση εξαρτάται από τα ηλεκτρικά φορτία των ατόμων. Η ενέργεια μιας ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης δίνεται από τον νόμο του Coulomb: Ε = kq 1 q 2 Dr (1) [8]

Όπου Ε είναι η ενέργεια, q 1 και q 2 είναι τα φορτία των 2 ατόμων, r είναι η απόσταση μεταξύ τους (σε angstroms), D η διηλεκτρική σταθερά του μέσου και k μια σταθερά. 2. Δεσμοί υδρογόνου. Οι δεσμοί υδρογόνου είναι σχετικά ασθενείς αλληλεπιδράσεις οι οποίες όμως είναι κρίσιμες για βιολογικά μακρομόρια όπως είναι οι πρωτεΐνες και το DNA. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι επίσης υπεύθυνες για πολλές ιδιότητες του νερού οι οποίες το καθιστούν έναν ιδιαίτερα πολυσχιδή διαλύτη. Σε έναν δεσμό υδρογόνου, ένα άτομο υδρογόνου μοιράζεται μεταξύ δύο άλλων σχετικά ηλεκτροαρνητικών ατόμων, όπως π.χ. οξυγόνου και αζώτου. Ο δότης δεσμού υδρογόνου είναι η ομάδα εκείνη που περιέχει τόσο το άτομο υδρογόνου όσο και το άτομο στο οποίο το υδρογόνο είναι το πιο σθεναρά δεσμευμένο. Αντίθετα ο δέκτης δεσμού υδρογόνου είναι το άτομο με την ασθενέστερη δέσμευση στο υδρογόνο. Οι δεσμοί υδρογόνου είναι ουσιαστικά ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Το σχετικά πιο ηλεκτροαρνητικό άτομο στο οποίο το υδρογόνο είναι δεσμευμένο ομοιοπολικά έλκει τα ηλεκτρόνια του δεσμού μακριά από το άτομο υδρογόνου ώστε το τελευταίο να αναπτύσσει μερικώς θετικό φορτίο (δ + ) και επομένως μπορεί να αλληλοεπιδράσει ηλεκτροστατικά με άτομο το οποίο έχει μερικώς αρνητικό φορτίο (δ ). Οι δεσμοί υδρογόνου είναι πολύ ασθενέστεροι από τους ομοιοπολικούς δεσμούς. Οι ενέργειες τους κυμαίνονται από 1-3 kcal mol 1 σε σύγκριση με τα 100 kcal mol 1 για ομοιοπολικό δεσμό άνθρακα- υδρογόνου. Το μήκος ενός δεσμού υδρογόνου είναι μεγαλύτερο από εκείνο του ομοιοπολικού δεσμού και οι πιο ισχυροί δεσμοί υδρογόνου έχουν την τάση να είναι ευθείς, δηλαδή τα άτομα του υδρογόνου, του δότη και του δέκτη δεσμού υδρογόνου βρίσκονται σε ευθεία γραμμή. Ένας δεσμός υδρογόνου απεικονίζεται σχηματικά παρακάτω στην εικόνα 2.[4-4] [9]

Εικόνα 2 Δεσμός υδρογόνου BERG JEREMY M. TYMOCZKO JOHN L. STRYER LUBERT (2015) Βιοχημεία 3. Αλληλεπιδράσεις Van der Waals. Η βάση των αλληλεπιδράσεων Van der Waals είναι ότι η κατανομή των ηλεκτρονικών φορτίων γύρω από ένα άτομο αλλάζει με την πάροδο του χρόνου. Σε μια δεδομένη στιγμή, η κατανομή του φορτίου δεν είναι απολύτως συμμετρική. Αυτή η πρόσκαιρη ασύμμετρη κατανομή ηλεκτρονικών φορτίων γύρω από ένα άτομο προκαλεί, μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, μια συμπληρωματική ασυμμετρία στην κατανομή ηλεκτρονίων γύρω από τα γειτονικά του άτομα. Η συνεπαγόμενη έλξη μεταξύ ενός ζεύγους ατόμων αυξάνεται καθώς αυτά πλησιάζουν, μέχρι να φτάσουν στην απόσταση επαφής Van der Waals. Σε αποστάσεις μικρότερες από αυτήν αναπτύσσονται πού ισχυρές απωστικές δυνάμεις, διότι τα νέφη των ηλεκτρονίων αλληλεπικαλύπτονται. 1.5 ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Οι πρωτεΐνες είναι τα μόρια που διεκπεραιώνουν τις σημαντικότερες κυτταρικές λειτουργίες. Όπως και το DNA είναι μακρομόρια, των οποίων οι δομικοί λίθοι είναι τα αμινοξέα. Συγκεκριμένα, αποτελούνται από συνδυασμούς 20 διαφορετικών αμινοξέων, τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς σχηματίζοντας μια πολυπεπτιδική αλυσίδα. Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και συμμετέχουν σε κάθε διαδικασία μέσα στα κύτταρα. Πολλές πρωτεΐνες δρουν ως ένζυμα που καταλύουν τις βιοχημικές αντιδράσεις, και είναι ζωτικής σημασίας στο μεταβολισμό. Άλλες πρωτεΐνες έχουν δομικές λειτουργίες, όπως [10]

οι πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού, οι οποίες συμβάλλουν στη διατήρηση της μορφής των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες είναι επίσης σημαντικές στη δια κυτταρική επικοινωνία και την κυτταρική σηματοδότηση. Όταν ο δεσμός υδρογόνου είναι σχετικά ασθενής, τα περισσότερα βιολογικά υλικά όπως πρωτεΐνες, σάκχαρα, λίπη και νουκλεϊνικά οξέα συντίθενται από μόρια των οποίων τα συστατικά τους άτομα συνδέονται μεταξύ τους με ομοιοπολικούς δεσμούς. Στους ομοιοπολικούς δεσμούς δύο ηλεκτρόνια μοιράζονται ανάμεσα στα τροχιακά των ενωμένων μορίων. Ένας πολύ σημαντικός ομοιοπολικός δεσμός είναι αυτός που ενώνει τα μονομερή αμινοξέων μεταξύ τους ώστε να σχηματιστούν οι πολυμερικές δομές των πρωτεϊνών και των πεπτιδίων. Παρόλο που υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός από αμινοξέα στη φύση οι περισσότερες πρωτεΐνες στα ζώα σχηματίζονται σχεδόν αποκλειστικά από 20 πολύ γνωστά αμινοξέα. Δομικά καθένα από αυτά αποτελείται από ένα άτομο υδρογόνου (H), μία αμινομάδα (ΝΗ 2 ) και ένα καρβοξυλικό οξύ.[4] Εικόνα 2 Σχηματική αναπαράσταση αμινοξέος http://1.bp.blogspot.com/_4ch_01hmrc8/sew0i0qtswi/aaaaaaaakva/acycu6jcxmq/s400/300px-aastructure.png Οι πρωτεΐνες είναι τα πιο πολυδύναμα μακρομόρια στους ζώντες οργανισμούς και εξυπηρετούν βασικές λειτουργίες σε σχεδόν όλες τις βιολογικές διεργασίες. Λειτουργούν ως καταλύτες, μεταφορείς και αποθηκευτές άλλων μορίων όπως το οξυγόνο, παρέχουν μηχανική στήριξη και ανοσοπροστασία, δημιουργούν κίνηση, διαβιβάζουν νευρικές ώσεις και ρυθμίζουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση. [11]

Διάφορες βασικές ιδιότητες επιτρέπουν στις πρωτεΐνες να συμμετέχουν σε ένα τόσο ευρύ φάσμα λειτουργιών οι οποίες είναι: 1. Οι πρωτεΐνες είναι γραμμικά πολυμερή δομούμενα από μονομερή αμινοξέων τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς. Η λειτουργία μιας πρωτεΐνης εξαρτάται άμεσα από την τρισδιάστατη δομή της και έχουν την ικανότητα να αναδιπλώνονται αυτόματα σε τρισδιάστατες δομές που καθορίζονται από την αλληλουχία των αμινοξέων του πρωτεϊνικού πολυμερούς. Επομένως οι πρωτεΐνες αντιπροσωπεύουν τη μετάβαση από το μονοδιάστατο κόσμο των αλληλουχιών στο τρισδιάστατο κόσμο μορίων που παρουσιάζουν μεγάλο εύρος λειτουργιών. 2. Οι πρωτεΐνες περιέχουν μια μεγάλη σειρά λειτουργικών ομάδων. Οι ομάδες περιλαμβάνουν αλκοόλες, θειόλες, θειοαιθέρες, καρβοξυλικές ομάδες, καρβαμίδια και ποικιλία βασικών ομάδων. Όταν συνδυάζονται σε διάφορες αλληλουχίες, οι λειτουργικές αυτές ομάδες ερμηνεύουν το φάσμα λειτουργιών των πρωτεϊνών. 3. Οι πρωτεΐνες μπορούν να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους και με άλλα βιολογικά μακρομόρια, για να δημιουργήσουν πολύπλοκα συσσωματώματα. Μέσα στα συσσωματώματα αυτά, οι πρωτεΐνες μπορούν να δράσουν συνεργειακά και να εμφανίσουν ιδιότητες που δεν υπήρχαν στα ανεξάρτητα μακρομόρια. Στα συσσωματώματα περιλαμβάνονται μακρομοριακές μηχανές που επιτυγχάνουν την ακριβή αντιγραφή του DNA, τη μεταγωγή σήματος μέσα στο κύτταρο, αλλά και πολλές άλλες απαραίτητες διεργασίες. 4. Μερικές πρωτεΐνες είναι σχεδόν άκαμπτες, ενώ υπάρχουν άλλες που εμφανίζουν μια σχετική ευκαμψία. Οι άκαμπτες μονάδες μπορούν να λειτουργήσουν ως δομικά στοιχεία του κυτταρικού σκελετού ή του συνδετικού ιστού. Τα τμήματα των πρωτεϊνών που εμφανίζουν περιορισμένη ευκαμψία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αρθρωτά τμήματα, ελατήρια ή μοχλοί απαραίτητα για την πρωτεϊνική λειτουργία, για τη σύνδεση πρωτεϊνών μεταξύ τους και με άλλα μόρια σε πολύπλοκα σύμπλοκα και για τη μετάβαση πληροφοριών μεταξύ κυττάρων αλλά και μέσα στα κύτταρα. 1.5.1 ΔΟΜΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Οι πρωτεΐνες έχουν μοναδική ακολουθία αμινοξέων που καθορίζονται γενετικά και συνθέτονται σε όλους τους ζώντες οργανισμούς με ένα κοινό μηχανισμό. Οι [12]

λειτουργικές πρωτεΐνες ενδέχεται να αποτελούνται από παραπάνω από μια πεπτιδική αλυσίδα. Η δομή τους αποτελείται από 4 επίπεδα εκ των οποίων τα τρία πρώτα οδηγούν στην τρισδιάστατη διαμόρφωση της πρωτεΐνης. Πρωτοταγής δομή Οι πρωτεΐνες είναι γραμμικά πολυμερή που δημιουργούνται δεσμεύοντας την α- καρβοξυλική ομάδα ενός αμινοξέος στην α-αμινική ομάδα ενός άλλου αμινοξέος με έναν πεπτιδικό δεσμό. Μια σειρά αμινοξέων που ενώνεται με πεπτιδικούς δεσμούς δημιουργούν μια πολυπεπτιδική αλυσίδα και κάθε μονάδα αμινοξέος στο πολυπεπτίδιο ονομάζεται κατάλοιπο. Μια πολυπεπτιδική αλυσίδα αποτελείται από ένα επαναλαμβανόμενο τμήμα που λέγεται κύρια αλυσίδα ή κορμός, και ένα μεταβλητό τμήμα, που αποτελείται από τις διαφορετικές πλευρικές αλυσίδες. Οι περισσότερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες περιέχουν από 50 έως 2000 κατάλοιπα και ονομάζονται πρωτεΐνες. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες είναι εύκαμπτες αλλά έχουν και καθορισμένη στερεοδιάταξη. Οι πρωτεΐνες έχουν μοναδικές αλληλουχίες αμινοξέων που καθορίζονται από γονίδια και η αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης συχνά ονομάζεται πρωτοταγής δομή. Δευτεροταγής Δομή Μια πολυπεπτιδική αλυσίδα είναι δυνατόν να αναδιπλώνεται σε κανονικά επαναλαμβανόμενες δομές δύο από τις οποίες είναι η α-έλικα και η β-πτυχωτή επιφάνεια. Η α-έλικα είναι μια δομή σπείρατος που σταθεροποιείται με ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου και έχει μια ραβδόμορφη δομή. Ο κορμός που έχει σχήμα σπείρατος, σχηματίζει το εσωτερικό της ράβδου και οι πλευρικές αλυσίδες εκτείνονται προς τα έξω σε μια ελικοειδή διάταξη. Η α-έλικα σταθεροποιείται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των ομάδων ΝΗ και CO της κύριας αλυσίδας. Η στροφή της έλικας μπορεί να είναι δεξιόστροφη ή αριστερόστροφη. Παρόλα αυτά οι δεξιόστροφες έλικες είναι πιο ευνοούμενες ενεργειακά διότι παρουσιάζουν λιγότερες στερικές συγκρούσεις μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων και του κορμού. Ουσιαστικά όλες οι α-έλικες που απαντούν στις πρωτεΐνες είναι δεξιόστροφες. [13]

Εικόνα 3 Σχηματική απεικόνιση α-έλικας (Α) Μοντέλο με σφαίρες και ράβδους (Β) απεικόνιση κορδέλας (Γ) απεικόνιση κυλίνδρου BERG JEREMY M. TYMOCZKO JOHN L. STRYER LUBERT (2015) Βιοχημεία Οι β-επιφάνειες σταθεροποιούνται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των πολυπεπτιδικών αλυσίδων και διαφέρουν σημαντικά από τις ραβδόμορφες α-έλικες. Η β-πτυχωτή επιφάνεια (ή απλώς β-επιφάνεια) είναι μια πολυπεπτιδική αλυσίδα που είναι απόλυτα απλωμένη, αντίθετα με το σφιχτό σπείραμα της α-έλικας. Μια β-επιφάνεια δημιουργείται όταν δύο ή περισσότερες β-πτυχώσεις συνδεθούν με δεσμούς υδρογόνου. Οι διαδοχικές β-πτυχώσεις στη β-επιφάνεια μπορεί να έχουν την ίδια κατεύθυνση (παράλληλη β-επιφάνεια) ή να έχουν αντίθετη κατεύθυνση (αντιπαράλληλη β-επιφάνεια). Η β-επιφάνεια είναι σημαντικό συστατικό πολλών πρωτεϊνών όπως οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν τα λιπαρά οξέα και είναι τόσο σημαντικές για το μεταβολισμό των λιπών αποτελούνται σχεδόν αποκλειστικά από β-επιφάνειες. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες μπορούν να αλλάξουν κατεύθυνση δημιουργώντας αντίθετες στροφές και θηλιές. Οι θηλιές σε αντίθεση με τις α-έλικες και τις β- επιφάνειες δεν έχουν κανονικές περιοδικές δομές. Η κατανομή της πρωτεϊνικής αλυσίδας σε α-έλικες β-πτυχώσεις και στροφές αποτελεί τη δευτεροταγή δομή. [14]

Τριτοταγής δομή Η διαδρομή που ακολουθεί η πολυπεπτιδική αλυσίδα μιας πρωτεΐνης στο χώρο ονομάζεται τριτοταγής δομή. Στις τριτοταγείς δομές, παρότι ασύμμετρες, παρατηρούμε ένα γενικό κανόνα σχετικά με τις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων, ότι τα μη πολικά αμινοξέα βρίσκονται στο εσωτερικό της δομής. Η πολυπεπτιδική αλυσίδα αναδιπλώνεται έτσι ώστε οι υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες να θάβονται στο εσωτερικό της ενώ συγχρόνως οι φορτισμένες αλυσίδες να βρίσκονται εκτεθειμένες στην επιφάνεια. Τεταρτοταγής δομή Οι πρωτεΐνες που έχουν περισσότερες από μια πολυπεπτιδικές αλυσίδες εμφανίζουν το τέταρτο επίπεδο δομικής οργάνωσης. Κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα στις πρωτεΐνες αυτές ονομάζεται υπομονάδα. Η τεταρτοταγής δομή αναφέρεται στη χωροδιάταξη των υπομονάδων και τα είδη των αλληλεπιδράσεων που εμφανίζουν. Η απλούστερη δομή σε αυτό το επίπεδο είναι το διμερές που αποτελείται από δύο ίδιες υπομονάδες.[4] 1.6 ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Οι φθορίζουσες πρωτεΐνες είναι μέλη μιας δομικά ομόλογης κατηγορίας πρωτεϊνών η οποία έχει τη μοναδική ιδιότητα να μπορεί να σχηματίζει μόνη της χρωμοφόρα ορατού μήκους κύματος από μια ακολουθία τριών αρωματικών αμινοξέων μέσα στη δική τους αλληλουχία πολυπεπτιδίων. Η ανακάλυψη και η ανάπτυξη των φθορίζοντων πρωτεϊνών σαν μοριακές ετικέτες έχουν ενισχύσει την ικανότητα μας για μελέτη του εντοπισμού της πρωτεΐνης, της δυναμικής και των αλληλεπιδράσεων με τα ζώντα κύτταρα. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη πρωτεΐνη για τα πειράματα FRAP είναι η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη.[8] Η αρχική πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ανακαλύφθηκε στις αρχές της δεκαετίας του 1960 όταν ερευνητές που μελετούσαν τις ιδιότητες βιοφωταύγειας της μέδουσας Aequorea Victoria απομόνωσαν μια πρωτεΐνη βιοφωταύγειας μπλε χρώματος που ονομάζεται aequorin μαζί με μια άλλη πρωτεΐνη που ονομάστηκε GFP (Green Fluorescent Protein). Άσχετα με το αρχικό είδος ή με το βαθμό γενετικής χειραγώγησης όλες οι φθορίζουσες πρωτεΐνες έχουν μέγεθος περίπου 25 kd το οποίο είναι μεγάλο σε σύγκριση με τα οργανικά φθοροφόρα με μέσο μέγεθος περίπου 1 kd. [15]

Δομικά οι FP (Fluorescent Proteins) αποτελούνται από 11 β-πτυχωτές επιφάνειες οι οποίες σχηματίζουν δομή κυλίνδρου με το χρωμοφόρο μόριο να αποτελείται από λίγα σημαντικά αμινοξέα και να βρίσκεται εσωτερικά του βαρελιού και να προστατεύεται από τις αλλαγές του ph. Παρόλα αυτά όμως τα αμινοξέα των FP σε αντίθεση με τις διαλυτές πρωτεΐνες είναι φορτισμένα ή πολικά, με αποτέλεσμα να δένουν πολλά μόρια νερού και να τα κλειδώνουν σε στέρεους σχηματισμούς μέσα στην πρωτεΐνη. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα ο φθορισμός αυτών των πρωτεϊνών να εξαρτάται από το χημικό περιβάλλον που περικλείει το χρωμοφόρο. Αλλαγές στο τοπικό περιβάλλον του χρωμοφόρου παράγουν σημαντικές μεταβολές στα φασματικά χαρακτηριστικά, στη φωτοσταθερότητα, στην όξινη αντίσταση και σε άλλα φυσικές ιδιότητες.[8-12] Εικόνα 4 Το φθοροφόρο βρίσκεται στην α-έλικα η οποία είναι στο εσωτερικό ενός κούφιου κυλίνδρου που σχηματίζεται από 11 β-πτυχώσεις Florian Muller Numerical Simulation of Fluorescence Recovery After Photobleaching Experiments Ο μηχανισμός σχηματισμού του χρωμοφόρου είναι σχεδόν ίδιος σε κάθε FP ασχέτως με την πηγή. Η εξέταση των ακολουθιών αμινοξέων για πάνω από 100 φυσικά εμφανιζόμενων παραλλαγών χρωμοφόρων από πολλά είδη, έδειξαν ότι τέσσερα [16]

υπόλοιπα διατηρούνται. Το πρώτο υπόλοιπο είναι το G67 το οποίο είναι σημαντικό για την κυκλοποίηση του χρωμοφόρου. Το δεύτερο είναι το Y66 το οποίο επίσης συμμετέχει σημαντικά στο σχηματισμό του χρωμοφόρου, αν και μελέτες έχουν δείξει ότι οποιοδήποτε αρωματικό υπόλοιπο μπορεί να αντικαταστήσει το Y66 και για αυτό είναι περίεργο γιατί αυτό το αμινοξύ διατηρείται τόσο πολύ. Τα δύο τελευταία υπόλοιπα που διατηρούνται είναι τα R96 και το E222 όπου και τα δύο είναι καταλυτικά υπόλοιπα που βρίσκονται κοντά στο χρωμοφόρο και είναι ουσιαστικά για τη φάση της ωρίμανσης.[12-13] Το φάσμα της GFP από το Aequorea Victoria έχει μέγιστο σε μήκος κύματος 395 nm και ελάχιστο στα 475nm. Το μέγιστο εκπομπής είναι στα 509 nm. Μεταλλαγμένα παράγωγα της GFP τα οποία είναι μη τοξικά για τα κύτταρα και χρησιμοποιούνται στη μικροσκοπία φθορισμού είναι τα παρακάτω: EGFP (Enhanced GFP) S56T μετάλλαξη της GFP, πιο διαρκής φθορισμός και μέγιστο διέγερσης στα 488 nm το οποίο ταιριάζει με τα φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά των φίλτρων για FITC. Μέγιστο εκπομπής στα 509 nm. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) Ds-Red(RFP): Red Fluorescent Protein απομονώθηκε από τη θαλάσσια ανεμώνη Discosoma Coral (Διαφορετική πρωτεΐνη από τη GFP) [17]

Εικόνα 5 Φάσματα εκπομπής-απορρόφησης φθοριζουσών πρωτεϊνών http://jcs.biologists.org/sites/default/files/highwire/joces/114/5/837/embed/graphic-2.gif Η EBFP παράγεται με αντικατάσταση του ενζύμου Tyr 66 με μια ιστιδίνη η οποία μετατοπίζει το φάσμα απορρόφησης σε μια κορυφή 384 nm με εκπομπή στα 448 nm. Λόγω των χαρακτηριστικών απορρόφησης τα οποία την ξεχωρίζουν από την EGFP η EBFP ήταν από τις πρώτες πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν στην πολυχρωματική απεικόνιση. Άλλες πολυχρωματικές πρωτεΐνες που αναπτύχθηκαν ήταν οι ECFP και EYFP. Η ECFP είναι φωτεινότερη και παρουσιάζει μεγαλύτερη φωτοσταθερότητα στην απεικόνιση από ότι η EBFP, ενώ η EYFP η οποία σχεδιάστηκε με βάση τη κρυσταλλική δομή της GFP για να έχει ερυθρή μετατόπιση στα φάσματα εκπομπής και απορρόφησης ως προς την EGFP και τις υπόλοιπες πρωτεΐνες. Συνήθως στα πειράματα χρησιμοποιείται η ενισχυμένη GFP (EGFP) λόγω της φωτεινότητας, της φωτοσταθερότητας και της μη τοξικότητας της, ιδιότητες που επιτρέπουν την παρακολούθηση της δραστηριότητας των πρωτεϊνών σε μεγάλα χρονικά διαστήματα. Οι εφαρμογές των φθορίζοντων πρωτεϊνών χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: Δομικές και λειτουργικές μελέτες. Στις δομικές μελέτες οι φθορίζοντες [18]

πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται για μαρκάρισμα πρωτεϊνών, οργανιδίων, και ολόκληρων κυττάρων και τα σήματα φθορισμού χρησιμοποιούνται για να φωτίσουν τις ιδιότητες τους in vivo. Στις λειτουργικές μελέτες οι φθορίζοντες πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται για να διευκρινίσουν τη μοριακή κινητική συμπεριφορά.[14] [19]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2.1 FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) ονομάζεται μια οπτική τεχνική η οποία αναπτύχθηκε τη δεκαετία του 1970 από τον Axelrod και τους συνεργάτες του και οι αρχικές εφαρμογές του ήταν στην έρευνα της πλευρικής διάχυσης στις κυτταρικές μεμβράνες, ενώ σήμερα χρησιμοποιείται ευρέως για την παρακολούθηση της κινητικής των βιομορίων με σκοπό τη μελέτη σημαντικών κυτταρικών διεργασιών και κυρίως τη διαμεμβρανική διάχυση πρωτεϊνών. Η τεχνική αυτή μας βοηθά να εκτιμήσουμε το ρυθμό διάχυσης καθώς και το λόγο των μορίων που είναι κινητά και δεσμευμένα αλλά και για τη διάκριση μεταξύ ενεργού μεταφοράς και διάχυσης. Κατά την τεχνική FRAP, σε μια μικρή καθορισμένη περιοχή μέσα σε ένα μεγαλύτερο όγκο (όπως ο πυρήνας του κυττάρου) προκαλείται φωτολεύκανση με τη σύντομη εφαρμογή ισχυρής δέσμης laser με το κατάλληλο μήκος κύματος.. Αμέσως μετά τη φάση της λεύκανσης, φθορίζοντα μόρια από γειτονικές αλεύκαντες περιοχές θα αρχίσουν να διαχέονται στη λευκασμένη περιοχή με αποτέλεσμα την αύξηση του σήματος φθορισμού στην περιοχή μέχρις ότου το σήμα μέσα στην περιοχή να γίνει ίσο με το σήμα έξω από τη λευκασμένη περιοχή. Η ροή των νέων μορίων μέσα στη φωτολευκασμένη περιοχή χρησιμοποιείται σαν αναφορά των κινητικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών στο ζωντανό κύτταρο. Για το λόγο αυτό απαιτείται μια σταθερή πηγή φωτός ικανή για γρήγορη φωτολεύκανση μιας μικρής περιοχής στο πεδίο της εικόνας και έναν ανιχνευτή για απεικόνιση ολόκληρου του κυττάρου και του πυρήνα κατά τη διάρκειατης επαναφοράς. Η επακόλουθη επαναφορά του φθορισμού στη λευκασμένη περιοχή μετράται από μια έντονα εξασθενημένη δέσμη laser. Εάν το υπό μελέτη μόριο είναι κινητό, τα λευκασμένα μόρια θα διαχυθούν μακριά από την περιοχή λεύκανσης ενώ τα μη λευκασμένα θα διαχυθούν μέσα στην περιοχή λεύκανσης προκαλώντας επαναφορά του σήματος φθορισμού. Αντίθετα αν τα λευκασμένα μόρια είναι όλα ακίνητα δεν θα έχουμε διάχυση στην περιοχή με αποτέλεσμα μια ατελή επαναφορά του σήματος φθορισμού μέσα στην περιοχή σε σχέση με τον υπόλοιπο πυρήνα. Το σχήμα της καμπύλης επαναφοράς παρέχει πληροφορίες σχετικά με το κλάσμα των κινητών και ακίνητων μορίων στη λευκασμένη περιοχή, ταχύτητα διάχυσης και γεγονότα δέσμευσης.[6-15] [20]

Συνοψίζοντας τα πειράματα FRAP αποφέρουν πληροφορίες για τρεις παραμέτρους κίνησης: το συντελεστή διάχυσης, το ακίνητο κλάσμα και το χρόνο παραμονής στην ακίνητη κατάσταση. Υποθέτοντας ότι έχουμε στοιχειώδη κινητική πρόσδεσης, το μέγεθος του ακίνητου κλάσματος και της διάρκειας της ακινησίας αποφασίζονται από τους ρυθμούς on και off της προς μελέτης πρωτεΐνης, από και προς τα ακίνητα συγκροτήματα. Εικόνα 6 Φωτολεύκανση και επαναφορά φθορισμού Diaspro Alberto, (2011) «Optical Fluorescence Microscopy» Springer 2.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΣ Σε αυτή την ενότητα θα αναπτύξουμε τις αρχές λειτουργίας της απαραίτητης οργανολογίας για τα πειράματα FRAP. Αυτή αποτελείται από το συνεστιακό μικροσκόπιο, την πηγή laser και το φαινόμενο του φθορισμού. Αρχικά αναφέρουμε το οπτικό μικροσκόπιο και τους περιορισμούς του οι οποίοι μας οδηγούν στη χρήση της συνεστιακής μικροσκοπίας. Στη συνέχεια την πηγή laser και το ρόλο της στα πειράματα FRAP και τέλος το φαινόμενο του φθορισμού. 2.2.1 ΟΠΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Το σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο είναι ένα οπτικό όργανο το οποίο χρησιμοποιεί το ορατό φως (380-760 nm) για να παράγει μια μεθυσμένη εικόνα του αντικειμένου (ή δείγματος) το οποίο προβάλλεται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του παρατηρητή ή σε μια απεικονιστική συσκευή. Ο όρος σύνθετος χρησιμοποιείται λόγω της χρήσης δύο φακών, του αντικειμενικού φακού και του προσοφθάλμιου (ή οφθαλμικού) οι οποίοι μαζί παράγουν μια τελική μεγέθυνση της εικόνας ώστε M final = M obj M oc (2) [21]

Δύο εξαρτήματα του μικροσκοπίου παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό της εικόνας: Ο αντικειμενικός φακός ο οποίος συλλέγει το φως που διαθλάται από το δείγμα και σχηματίζει μια μεθυσμένη πραγματική εικόνα στο πραγματικό ενδιάμεσο επίπεδο κοντά στο οφθαλμικό, και ο συγκεντρωτικός φακός, ο οποίος εστιάζει το φως σε μια μικρή περιοχή του δείγματος. Στην εικόνα 7 απεικονίζεται ένα οπτικό μικροσκόπιο με τις συνιστώσες που το αποτελούν. Εικόνα 7 Οπτικό Μικροσκόπιο Fundamentals of light microscopy and electronic imaging Στην εικόνα 8 βλέπουμε πως δημιουργείται η μεγεθυσμένη εικόνα και πως την αντιλαμβάνεται το μάτι του παρατηρητή. Η εικόνα δείχνει επίσης τις θέσεις των σημαντικότερων εστιακών επιπέδων σε σχέση με τον αντικειμενικό φακό, τον οφθαλμικό και το μάτι. Το δείγμα τοποθετείται στην τράπεζα του μικροσκοπίου και εξετάζεται από τον αντικειμενικό φακό, ο οποίος παράγει μια μεθυσμένη πραγματική εικόνα του αντικειμένου στο επίπεδο της εικόνας του οφθαλμού. Όταν κοιτάμε στο μικροσκόπιο, ο οφθαλμός μαζί με τον κερατοειδή και τους φακούς προβάλλουν μια δεύτερη εικόνα στον αμφιβληστροειδή χιτώνα όπου γίνεται αντιληπτό και ερμηνεύεται από τον εγκέφαλο σαν μια μεγεθυσμένη δεύτερη εικονική εικόνα γύρω στα 25 cm μπροστά από το μάτι. [22]

Εικόνα 8 Αντίληψη της μεγεθυσμένης εικόνα του δείγματος Fundamentals of light microscopy and electronic imaging Παρόλο που η οπτική μικροσκοπία είναι μια χρήσιμη τεχνική για την εξέταση και μελέτη ενός δείγματος με λεπτομέρεια, υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί οι οποίοι θέτουν ένα όριο στη χρήση του. Οι περιορισμοί αυτοί έχουν να κάνουν με την ανάλυση του, τη μεγέθυνση του και την προβολή της επιφάνειας του.[9] Η διακριτική ικανότητα ενός οπτικού συστήματος δίνεται από την παρακάτω σχέση: λ d = 0. 61 nsinα (3) Όπου d είναι η διακριτική ικανότητα, 0.61 είναι ένας σταθερός αριθμός, λ είναι το μήκος κύματος του φωτός (ή της ακτινοβολίας γενικότερα), n είναι ο δείκτης διάθλασης του μέσου μεταξύ παρασκευάσματος και φακού και α είναι το μισό της γωνίας του φωτεινού κώνου που δέχεται ο φακός. Το αριθμητικό άνοιγμα (Α) του φακού εξαρτάται αποκλειστικά από την κατασκευή του φακού και ορίζεται από τη σχέση [23]

A = nsinα (4) Άρα εφόσον το οπτικό μικροσκόπιο συνήθως έχει ένα μέσο μήκος κύματος λ=500 nm και το αριθμητικό άνοιγμα ενός καλού φακού είναι 1.6 τότε η διακριτική ικανότητα του οπτικού μικροσκοπίου δεν μπορεί να ξεπεράσει τα d=200 nm. Βλέπουμε λοιπόν ότι το οπτικό μικροσκόπιο έχει ένα μέγιστο στη διακριτική ικανότητα το οποίο δε μπορεί να το ξεπεράσει με βελτίωση των φακών. Επίσης σε μεγάλη μεγέθυνση οι εικόνες των σημειακών αντικειμένων εμφανίζονται παραμορφωμένες. Συγκεκριμένα εμφανίζονται ασαφείς δίσκοι που περιβάλλονται από δακτυλίους διάθλασης που είναι γνωστοί σαν δίσκοι του Airy. Αυτοί οι δακτύλιοι διάθλασης περιορίζουν την ικανότητα του οπτικού μικροσκοπίου στην ανάλυση λεπτομερειών του δείγματος.[19] Η ισχύς ανάλυσης του οπτικού μικροσκοπίου είναι ένα μέτρο της ικανότητας του μικροσκοπίου να διακρίνει μεταξύ δύο γειτονικών δομικών λεπτομερειών χωρίς την εμφάνιση δακτυλίων του Airy. Το μέγεθος της περίθλασης και επομένως η ισχύς ανάλυσης ενός οπτικού μικροσκοπίου εξαρτάται από το μήκος κύματος του φωτός (λ) και το αριθμητικό άνοιγμα (NA) του αντικειμενικού φακού. Ως αποτέλεσμα, υπάρχει ένα ξεχωριστό όριο του οπτικού μικροσκοπίου για προβολή παρακείμενων δομικών λεπτομερειών με σαφήνεια, το οποίο είναι γνωστό ως το όριο περίθλασης του μικροσκοπίου. Οι περιορισμοί αυτοί οδηγούν στη χρήση πιο εξειδικευμένων μεθόδων μικροσκοπίας όπως είναι η συνεστιακή μικροσκοπία και η μικροσκοπία φθορισμού. 2.2.2 ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Η συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης αν και βρίσκεται σε πολύ γρήγορη εξέλιξη τα τελευταία χρόνια, η αρχή λειτουργίας της περιγράφηκε αρχικά από τον Minski το 1957. Αντίθετα με το κλασσικό τρόπο φωτισμού και παρατήρησης που γίνεται στο κοινό οπτικό μικροσκόπιο, η συνεστιακή μικροσκοπία στηρίζεται στο γεγονός ότι και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος. Η συνεστιακή μικροσκόπια είναι ένα ολοκληρωμένο σύστημα μικροσκοπίας το οποίο αποτελείται από ένα μικροσκόπιο φθορισμού, πολλαπλές πηγές φωτισμού laser, και ένα συνεστιακό κουτί ή μια κεφαλή σάρωσης με οπτικό και ηλεκτρονικό εξοπλισμό, [24]

έναν υπολογιστή και μια οθόνη για απεικόνιση και κατάλληλο λογισμικό για τη συλλογή, επεξεργασία και ανάλυση των εικόνων. Η κεφαλή απεικόνισης παράγει τα σήματα φωτονίων που χρειάζονται ώστε να κατασκευαστεί η συνεστιακή εικόνα και περιλαμβάνει τις παρακάτω συσκευές: Εισόδους από μια ή περισσότερες πηγές φωτός laser Φίλτρα φθορισμού Ένας μηχανισμός σάρωσης βασισμένος σε γαλβανόμετρο Ένα ή περισσότερα μεταβλητά ανοίγματα οπών για παραγωγή συνεστιακής εικόνας Ένα φωτοπολλαπλασιαστικό σωλήνα ανίχνευσης για διαφορετικά μήκη κύματος φθορισμού. Οι οπτικές αρχές του συνεστιακού μικροσκοπίου είναι: Χρησιμοποιείται επί-φωτισμός, όπου η πηγή φωτός και ο ανιχνευτής είναι και οι δυο στην ίδια πλευρά του επιπέδου του δείγματος και χωρίζονται από αυτό από τον αντικειμενικό φακό ο οποίος λειτουργεί και σαν συγκεντρωτικός φακός και σαν αντικειμενικός. Η δέσμη laser διευρύνεται για να γεμίσει το οπίσθιο άνοιγμα του αντικειμένου και σχηματίζει ένα έντονο σημείο περιορισμένης διάθλασης το οποίο σαρώνεται από την κορυφή προς το κάτω μέρος του δείγματος με ένα πρότυπο που λέγεται raster. Η διαδικασία αυτή λέγεται σημειακή σάρωση. Το βασικό σημείο της συνεστιακής οπτικής είναι το άνοιγμα της οπής το οποίο δέχεται τα φωτόνια φθορισμού από το φωτισμένο εστιασμένο σημείο από το raster, αλλά αποκλείει τα σήματα φθορισμού από αντικείμενα πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο τα οποία όντας εκτός εστίασης, εστιάζονται στην οπή σαν δίσκοι με πολύ μεγαλύτερη διάμετρο. Ο συνδυασμός της σημειακής σάρωσης και της χρήσης της οπής σαν χωρικό φίλτρο στο επίπεδο της εικόνας είναι σημαντική για τη δημιουργία της συνεστιακής εικόνας. Για τη δημιουργία της εικόνας ενός δείγματος, η δέσμη laser σαρώνει το δείγμα με ένα μηχανισμό ο οποίος βασίζεται σε δύο υψηλής ταχύτητας δονούμενους καθρέφτες. Ο ένας καθρέφτης ταλαντώνεται αριστερά-δεξιά ενώ ο άλλος κινείται πάνω-κάτω. Τα φωτόνια φθορισμού που εκπέμπονται από ένα διεγερμένο σημείο του δείγματος συλλέγονται από τον αντικειμενικό φακό. Επειδή η ταχύτητα των καθρεφτών είναι αμελητέα σε σχέση με την ταχύτητα του φωτός, το φως από τον [25]

φθορισμό ακολουθεί τον ίδιο δρόμο στην επιστροφή και βρίσκεται στην ίδια θέση στον οπτικό άξονα όπως η αρχική δέσμη laser. Η διαδικασία αυτή λέγεται απόσάρωση (descanning). Έπειτα το φως από το φθορισμό περνάει από ένα διχρωϊκό καθρέφτη και εστιάζεται στη συνεστιακή οπή. Λόγω του ότι η απο-σάρωση γίνεται στιγμιαία η εικόνα στην οπή παραμένει πάντα σταθερή και δεν κινείται μπροστά ή πίσω. Διακυμάνσεις στην ένταση του φωτός μετατρέπονται σε συνεχή μεταβαλλόμενη τάση από το φωτοπολλαπλασιαστικό σωλήνα ανίχνευσης. Το αναλογικό σήμα γίνεται ψηφιακό σε τακτικά χρονικά διαστήματα από ένα μετατροπέα αναλογικό σε ψηφιακό για την παραγωγή pixels (ψηφιακά στοιχεία εικόνας) τα οποία αποθηκεύονται σε ένα πίνακα προσωρινής αποθήκευσης εικόνας και απεικονίζονται στην οθόνη ενός υπολογιστή. Άρα η συνεστιακή εικόνα ενός αντικειμένου ανακατασκευάζεται από σήματα φωτονίων και απεικονίζονται στον υπολογιστή. Αυτό το σύστημα λέγεται συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης laser. Η συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης laser είναι μια οπτική απεικονιστική τεχνική η οποία βελτιώνει την οπτική ανάλυση και αντίθεση μέσω της προσθήκης μιας χωρικής οπής η οποία τοποθετείται στο ίδιο επίπεδο με τους φακούς ώστε να εξαλείψει το φως εκτός εστίασης. Επιτρέπει την ανακατασκευή τρισδιάστατων δομών με σύνολα εικόνων τα οποία λαμβάνονται σε διαφορετικά βάθη μέσα σε ένα παχύ αντικείμενο μια τεχνική η οποία ονομάζεται οπτικός διαχωρισμός. Η συνεστιακή μικροσκοπία προσεγγίζει την ακρίβεια της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, αλλά είναι μη καταστρεπτική και δεν απαιτεί παράγοντες αντίθεσης και δείκτες στα κύτταρα όπως αυτοί της οπτικής μικροσκοπίας.[9-11] Η βασική αρχή της συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με λέιζερ (CLSM), είναι ότι το δείγμα φωτίζεται σε ένα εστιασμένο σημείο του λέιζερ και η εικόνα αναλύεται ουσιαστικά από τη σάρωση του πεδίου πάνω στο εστιασμένο αυτό σημείο. Αυτή η οπτική διάταξη προσφέρει μεγάλη ευελιξία στις στρατηγικές απεικόνισης. Ειδικότερα, επιτρέπει τη λήψη εικόνων με οπτικές τομές - δηλαδή, οι εικόνες στις οποίες συμβάλει το φως από τις περιοχές εκτός εστίασης. Η απεικόνιση με οπτικές τομές έχει ανοίξει ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών στη μικροσκοπία και επιτρέπει την παραγωγή των κινουμένων σχεδίων 3D. Για την απόκτηση υψηλής χωρικής ανάλυσης, χρησιμοποιούνται δύο φωτόνια που προέρχονται από το φαινόμενο του φθορισμού. Η [26]

βελτίωση μπορεί να κυμαίνεται μεταξύ κάποιων ορίων, στην περίπτωση των πολύ επίπεδων δειγμάτων, όπως τα χρωμοσώματα και τα έμβρυα. Εικόνα 9 Συνεστιακό μικροσκόπιο https://www.wur.nl/upload_mm/a/1/7/4d96744b-bf7f-4de8-89cc- 396240e12f26_CLSM1_df4315df_239x218.png Στην εικόνα 9 βλέπουμε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο laser. Σε αυτού του είδους τα μικροσκόπια η φωτεινή πηγή είναι ένα ή περισσότερα laser, η χρήση των οποίων σαν φωτεινές πηγές έχει 2 σημαντικά πλεονεκτήματα. Πρώτον το εύρος του φωτός διέγερσης καθορίζεται από την πηγή και όχι από φίλτρο διέγερσης με αποτέλεσμα να είναι πολύ στενότερο από τη μικροσκοπία φθορισμού (2-3 nm αντί για 20-30 nm) και δεύτερον για να φωτίσουμε ολόκληρο το ορατό πεδίο, η δέσμη laser πρέπει να σαρώσει το δείγμα διαδοχικά σημείο προς σημείο και γραμμή προς γραμμή. Ο φθορισμός που ανιχνεύεται σε κάθε σημείο μετριέται από ένα φωτοπολλαπλασιαστικό σωλήνα και η εικόνα σχηματίζεται συλλέγοντας όλα τα pixel σε μια εικόνα. Δυο διακριτές καταστάσεις μπορούν να συμβούν στην απεικόνιση φθορισμού οι οποίες οδηγούν σε μείωση της έντασης φθορισμού που συχνά αναφέρεται σαν ξεθώριασμα. Το πρώτο από αυτά τα γεγονότα ξεθωριάσματος είναι γνωστό σαν απόσβεση φθορισμού ορίζεται σαν η βιομοριακή διαδικασία στην οποία μειώνεται η κβαντική απόδοση του φθοροφόρου χωρίς αλλαγή στο φάσμα εκπομπής του φθορισμού. [27]

Προκαλείται από παράγοντες οξείδωσης, άλατα, βαρέα μέταλλα ή ενώσεις αλογόνων καθώς και από μεταφορά ενέργειας από ένα φθορίζον μόριο σε άλλο το οποίο βρίσκεται κοντά του. Το άλλο γεγονός που προκαλεί ξεθώριασμα είναι η φωτολεύκανση όπου σε αυτή την περίπτωση υψηλής έντασης φως υπό την παρουσία μοριακού οξυγόνου προκαλεί μη αναστρέψιμη ζημιά στο φθοροφόρο και το εμποδίζει από το να εκπέμψει φως. Η σκόπιμη λεύκανση μιας περιοχής του δείγματος και η μέτρηση της επαναφοράς της φωτολευκασμένης περιοχής μετρώνται στα πειράματα FRAP.[6-11] Στην πράξη το FRAP απαιτεί αρχικά μια σειρά από εικόνες έντασης φθορισμού για να πάρουμε τιμές για την ένταση τόσο στην περιοχή ενδιαφέροντος όσο και στον περιβάλλοντα χώρο της. Έπειτα η περιοχή ενδιαφέροντος φωτίζεται με υψηλής έντασης φως γεγονός που προκαλεί φωτολεύκανση στο φθοροφόρο μέσα στην περιοχή. Αυτό δημιουργεί μια σκούρα λευκασμένη περιοχή μέσα στο δείγμα. Τα φωτολευκασμένα μόρια στη συνέχεια αντικαθιστώνται από μη λευκασμένα με την πάροδο του χρόνου και αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης φθορισμού στο λευκασμένο σημείο. Για να έχουμε χρήσιμα δεδομένα πρέπει είναι σημαντικό το δείγμα να μην φωτολευκανθεί κατά τη διάρκεια της φάσης προ-λεύκανσης και επαναφοράς του πειράματος. Τα δεδομένα (ένταση φθορισμού) συλλέγονται γρήγορα προκειμένου να καταγράψουμε επιτυχώς την επαναφορά της λευκασμένης περιοχής. Η επαναφορά του φθορισμού συμβαίνει σαν αποτέλεσμα της ανταλλαγής διάχυσης ανάμεσα στα λευκασμένα και μη λευκασμένα μόρια. Το κλάσμα των φθορίζοντων μορίων που συμμετέχουν στην ανταλλαγή αναφέρεται σαν κινητό κλάσμα. Το κλάσμα των μορίων που δεν συμμετέχουν στην ανταλλαγή ανάμεσα στις λευκασμένες και μη λευκασμένες περιοχές αναφέρεται σαν δεσμευμένο κλάσμα. Η γνώση των λόγων των μοριακών ανταλλαγών παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τις ιδιότητες και τις αλληλεπιδράσεις των μορίων μέσα στο κυτταρικό περιβάλλον. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα του συνεστιακού μικροσκοπίου είναι ότι σε αυτό ελαττώνονται κατά πολύ τα μηνύματα από μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος με αποτέλεσμα να ενισχύεται η αντίθεση (contrast) του παρασκευάσματος. Αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει τη σάρωση του παρασκευάσματος όχι μόνο ως προς τους άξονες x και y αλλά και ως προς τον z άξονα (βάθος) με αποτέλεσμα να παίρνουμε καλά εστιασμένες τρισδιάστατες εικόνες που [28]

όμως δεν παρατηρούνται άμεσα, αλλά μέσω μικροϋπολογιστή με ειδικά προγράμματα (software) που κάνουν ψηφιοποίηση και ανακατασκευή της εικόνας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει αυτού του τύπου η μικροσκοπία σε συνδυασμό με το φθορισμό. Είναι γνωστό ότι είναι αδύνατο να παρατηρηθούν φθορίζοντα παρασκευάσματα πάχους μεγαλύτερου των 10 μm λόγω του δυνατού θορύβου από τα μη εστιασμένα σημεία του παρασκευάσματος. Η κλασσική προσέγγιση για τα πειράματα FRAP χρησιμοποιεί μικροσκόπιο επιφθορισμού ευρέος πεδίου για να παρακολουθήσει την ένταση φθορισμού πριν αλλά και μετά τη λεύκανση. Πρακτικά όμως χρησιμοποιείται συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης laser εξοπλισμένη με ακουστικο-οπτικό ρυθμιζόμενο φίλτρο (AOTF) το οποίο χρειάζεται για να μεταβάλλει γρήγορα την ισχύ του laser ανάμεσα στη χαμηλή ένταση απεικόνισης και στην υψηλή ένταση για τη λεύκανση. Η χρήση laser έχει 2 σημαντικές συνέπειες. Η πρώτη είναι ότι το εύρος ζώνης του φωτός διέγερσης καθορίζεται από την πηγή και όχι από φίλτρο διέγερσης και άρα είναι πολύ στενότερο από ότι στη μικροσκοπία φθορισμού, και δεύτερον για να φωτίσει όλο το ορατό πεδίο η δέσμη laser πρέπει να σαρώσει το δείγμα διαδοχικά σημείο προς σημείο και γραμμή προς γραμμή. Επίσης όσο υψηλότερος είναι ο συντελεστής διάχυσης του προς μελέτη μορίου τόσο μεγαλύτερη ταχύτητα απεικόνισης και ισχύς laser απαιτείται. Το AOTF είναι μια ηλεκτρο-οπτική συσκευή η οποία μας επιτρέπει τη διαμόρφωση της έντασης της φωταύγειας του laser. Μια συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης laser εξοπλισμένη με AOTF επιτρέπει στο χρήστη να μεταβάλει την ένταση της φωταύγειας pixel προς pixel. Το χαρακτηριστικό αυτό κάνει αυτή τη μικροσκοπία κατάλληλη για πειράματα FRAP αφού ο χρήστης μπορεί να ορίσει ένα αυθαίρετο μοτίβο λεύκανσης στο δείγμα και το AOTF μεταβάλλει την ένταση κατά τη διάρκεια της λεύκανσης από υψηλή, μέσα στο σημείο λεύκανσης σε αμελητέα στο εξωτερικό του. Χρησιμοποιούνται επίσης και οπτικά φίλτρα για να ξεχωρίσουν το φως διέγερσης από το φως εκπομπής: Το φίλτρο διέγερσης επιτρέπει μόνο σε επιλεγμένα μήκη κύματος διέγερσης να περάσουν προς το δείγμα [29]

Το φίλτρο φράγματος που έχει σχεδιαστεί για να απορροφά τα μήκη κύματος της διέγερσης και να επιτρέπει μόνο επιλεγμένα μήκη κύματος να περάσουν προς τον παρατηρητή ή σε άλλον ανιχνευτή Διχρωϊκο κάτοπτρο που είναι ένας καθρέφτης με επικάλυψη από ειδικό δείγμα που σχεδιάζονται για να προκαλούν την ανάκλαση του διεγείροντος φωτός προς το δείγμα, αφού είναι μικρότερου μήκους κύματος, και επιτρέπει τη διέλευση του εκπεμπόμενου φθορισμού προς τους προσοφθάλμιους φακούς.[9-11-6] 2.3 ΠΗΓΕΣ ΦΩΤΟΣ LASER Laser είναι μια συσκευή η οποία εκπέμπει φως μέσω της διαδικασίας της οπτικής ενίσχυσης που βασίζεται στην εξαναγκασμένη εκπομπή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Ο όρος laser είναι ακρωνύμιο για το light amplification by stimulated emission of radiation (ενίσχυση φωτός με εξαναγκασμένη εκπομπή ακτινοβολίας) και έχει πολύ ενδιαφέρουσες ιδιότητες που το καθιστούν ξεχωριστό σε σχέση με άλλες συσκευές εκπομπής φωτός. Το φως που παράγουν είναι μονοχρωματικό και σύμφωνο (χωρικά και χρονικά), διαδίδεται σε μια συγκεκριμένη κατεύθυνση σχηματίζοντας στενές δέσμες και έχει υψηλή ένταση. Μια σχηματική αναπαράσταση ενός laser φαίνεται στην εικόνα 10. Τα lasers που χρησιμοποιούνται συνήθως στην οπτική μικροσκοπία είναι υψηλής έντασης μονοχρωματικές πηγές φωτός. Η μονοχρωματική αυτή ακτινοβολία υψηλής έντασης χρησιμεύει ως εργαλείο για διάφορες τεχνικές όπως η οπτική παγίδευση, οι μελέτες απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο, η ανάκτηση φωτολεύκανσης και η ολική εσωτερική ανάκλαση φθορισμού. Επιπλέον τα lasers είναι η πιο κοινή πηγή φωτός για σάρωση στη συνεστιακή µμικροσκοπία φθορισμού και έχει χρησιμοποιηθεί, αν και όχι πολύ συχνά, στις συμβατικές ευρέως πεδίου έρευνες φθορισμού. Πιο συγκεκριμένα τα Laser κατηγοριοποιούνται ανάλογα με: το ενεργό τους υλικό (στερεά, υγρά ή αέρια), ως προς την αγώγιμότητα τους ή την περιοχή της εκπομπής τους.η χρησιμότητα τους εντοπίζεται σε κλάδους της βιομηχανίας, σε ιατρικές εφαρμογές καθώς και σε πολλούς ερευνητικούς τομείς της επιστήμης. Το σύστημα laser αποτελείται από τα ακόλουθα μέρη: [30]

Το οπτικό αντηχείο που αποτελείται από γραμμική διάταξη δυο κατόπτρων Το ενεργό μέσο το οποίο είναι ένα υλικό ενδιάμεσα στα δυο κάτοπτρα(αέριο στη συγκεκριμένη περίπτωση το CO2) στο σωλήνα αυτό προστίθεται άζωτο N₂(25%) και ήλιο He(60-80%). Το μηχανισμό εξόδου Τρόποι άντλησης του ενεργού υλικού Ουσιαστικά είναι μια οπτική κοιλότητα (Fabry-Perot) που αφήνει τις αλληλεπιδράσεις φωτονίων με την ύλη και τα κάτοπτρα να λάβουν χώρο με το να διαφεύγει κομμάτι ακτινοβολίας από τον 2 ο ημιδιαπερατό ανακλαστήρα.[7] Εικόνα 10 Σχηματική αναπαράσταση laser Laser Φυσική και Τεχνολογία 2.4 ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ Ο φθορισμός σαν φαινόμενο είναι μέρος μιας μεγαλύτερης οικογένειας διαδικασιών φωταύγειας ή φωτοβολίας στην οποία μια ευαίσθητη ουσία απορροφά φως με σκοπό να το επανεκπέμψει (φωτόνια) κατά την αποδιέγερση από ηλεκτρονιακά διεγερμένες καταστάσεις μετά από κάποιο χρόνο. Οι διαδικασίες φωταύγειας παράγονται μέσω διέγερσης είτε μέσω φυσικών (όπως η απορρόφηση φωτός), μηχανικών (τριβή) ή χημικών διαδικασιών μπορούν να χωριστούν στο φθορισμό και το φωσφορισμό. Στην περίπτωση του φθορισμού το διεγερμένο ηλεκτρόνιο βρίσκεται σε μια απλή (singlet) κατάσταση και αποτελεί ζεύγος με ένα άλλο ηλεκτρόνιο της θεμελιώδους κατάστασης το οποίο έχει αντίθετο spin. Έτσι η αποδιέγερση στη θεμελιώδη κατάσταση που επιτρέπεται από τον κανόνα μετάβασης (ΔS=0) πραγματοποιείται γρήγορα με την [31]

εκπομπή ενός φωτονίου. Ο τυπικός χρόνος εκπομπής φθορισμού είναι περίπου 10 ns. Ο χρόνος αυτός (lifetime of fluorophore) είναι ο χρόνος που παραμένει το διεγερμένο ηλεκτρόνιο στη διεγερμένη κατάσταση μέχρι να επιστρέψει στη θεμελιώδη. Η περιγραφή των διαδικασιών απορρόφησης και εκπομπής ενός φωτονίου καθώς και όλων των διαδικασιών που μεσολαβούν γίνονται με τα διαγράμματα Jablonski που φαίνονται στην εικόνα 11. Σε αυτά τα διαγράμματα, η ενέργεια απεικονίζεται στον κάθετο άξονα και αυξάνει από κάτω προς τα πάνω ενώ ο χρόνος απεικονίζεται κατά μήκος του οριζόντιου άξονα, αυξανόμενος από αριστερά προς τα δεξιά. Σε θερμοκρασία δωματίου τα περισσότερα φθοροφόρα έχουν αρκετή ενέργεια ώστε να βρίσκονται στη θεμελιώδη κατάσταση (S0). Εικόνα 11 Διάγραμμα Jablonski https://qph.ec.quoracdn.net/main-qimg-bc69d92ed59efd28d919e8aeb41e996c Τα διαγράμματα αυτά χρησιμοποιούνται ως σημεία αναφοράς για τη μελέτη απορρόφησης και εκπομπής του φωτός και για την απεικόνιση όλων των διαδικασιών που συμβαίνουν στα μόρια. Υπάρχουν σε διάφορες μορφές ώστε να απεικονίσουν πληθώρα μοριακών διαδικασιών οι οποίες συμβαίνουν σε διεγερμένες καταστάσεις. Ένα διάγραμμα Jablonski όπως φαίνεται και στο σχήμα αποτελείται από τις απλές (singlet) καταστάσεις και πιο συγκεκριμένα από τις S 0, S 1, S 2 που αντιστοιχούν στη θεμελιώδη τη πρώτη και δεύτερη διεγερμένη κατάσταση. Καθένα από τα ενεργειακά [32]

επίπεδα του χρωμοφόρου αποτελείται από ένα σύνολο δονητικών επιπέδων με χαρακτηριστικούς αριθμούς 0,1,2 κτλ. Οι μεταβάσεις μεταξύ των καταστάσεων περιγράφονται με κάθετες γραμμές προκειμένου να δείξουμε ότι αυτές οι μεταβάσεις είναι στιγμιαίες, ενώ με έντονες οριζόντιες γραμμές υποδεικνύονται οι ηλεκτρονιακές ενεργειακές καταστάσεις. Συγκεκριμένα οι μεταβάσεις μεταξύ των ενεργειακών καταστάσεων πραγματοποιούνται σε χρόνους της τάξης των 10 15 sec ο οποίος είναι πολύ μικρός για οποιαδήποτε μετακίνηση του πυρήνα το οποίο είναι γνωστό σαν αρχή του Franck-Gordon. Σε θερμοκρασία δωματίου η θερμική ενέργεια δεν επαρκεί για να έχουμε αρκετό πληθυσμό στις διεγερμένες καταστάσεις. Η απορρόφηση συμβαίνει κυρίως από μόρια με τη χαμηλότερη δονητική ενέργεια. Η μεγάλη ενεργειακή διαφορά ανάμεσα στις S 0 και S 1 διεγερμένες καταστάσεις είναι πολύ μεγάλη για να έχουμε θερμικό πληθυσμό στην S1 και για αυτό το λόγο χρησιμοποιούμε φως και όχι θερμότητα για να προκαλέσουμε φθορισμό. Μετά την απορρόφηση του φωτός συμβαίνουν πολλές διεργασίες. Ένα φθοροφόρο συνήθως διεγείρεται σε κάποια υψηλότερα δονητικά επίπεδα είτε του S 1 είτε του S 2. Με ελάχιστες εξαιρέσεις μόρια σε συμπυκνωμένες φάσεις γρήγορα ηρεμούν στα χαμηλότερα δονητικά επίπεδα του S 1 μια διεργασία η οποία ονομάζεται εσωτερική μετατροπή και γενικά συμβαίνει σε χρόνο 10 12 s ή λιγότερο και αφού οι χρόνοι ζωής του φθορισμού είναι 10 8 s η εσωτερική μετατροπή γενικά ολοκληρώνεται πριν την εκπομπή. Ωστόσο αν τα δονητικά ενεργειακά επίπεδα επικαλύπτουν σε μεγάλο βαθμό τα ηλεκτρονιακά ενεργειακά επίπεδα υπάρχει πιθανότητα το διεγερμένο ηλεκτρόνιο να μπορεί να μεταβεί από ένα δονητικό επίπεδο μιας ηλεκτρονιακής κατάστασης σε ένα άλλο δονητικό επίπεδο μιας ηλεκτρονιακής κατάστασης χαμηλότερης ενέργειας. Αυτή η διεργασία λέγεται εσωτερική μετατροπή και είναι ταυτόσημη μηχανιστικά με δονητική χαλάρωση και παριστάνεται στο διάγραμμα Jablonski με μια καμπύλη γραμμή ανάμεσα σε δυο δονητικά επίπεδα σε διαφορετικές ηλεκτρονιακές καταστάσεις. Ένας άλλος δρόμος που μπορεί να πάρει το μόριο στη διασπορά της ενέργειας είναι η ενδοσυστημική διάβαση. Αυτή η διαδικασία συμβαίνει όταν το ηλεκτρόνιο αλλάζει πολλαπλότητα spin από μια διεγερμένη singlet κατάσταση σε μια διεγερμένη triplet κατάσταση. Είναι η πιο αργή διαδικασία στο διάγραμμα Jablonski πολλές τάξεις μεγέθους πιο αργή από το φθορισμό. Η ενδοσυστημική διάβαση οδηγεί σε πολλές [33]

ενδιαφέρουσες διαδρομές πίσω στη θεμελιώδη ηλεκτρονιακή κατάσταση μια από τις οποίες είναι ο φωσφορισμός. Ο φωσφορισμός είναι η εκπομπή φωτός από μια τριπλά (triplet) διεγερμένη κατάσταση, στην οποία το ηλεκτρόνιο στο διεγερμένο τροχιακό έχει ίδιο προσανατολισμό στο spin όπως το ηλεκτρόνιο στη θεμελιώδη κατάσταση. Μεταβάσεις στη θεμελιώδη κατάσταση δεν είναι επιτρεπτές και οι ρυθμοί εκπομπής είναι αργοί (10 3 10 0 s 1 ) και οι χρόνοι ζωής του φωσφορισμού είναι της τάξης των milliseconds μέχρι seconds. Τα παραπάνω περιγράφονται στο παρακάτω διάγραμμα Jablonski όπου φαίνονται όλοι οι δυνατοί τρόποι με τους οποίους μπορεί να αλληλοεπιδράσει το σύστημα. Ενώσεις που παρουσιάζουν ιδιότητες φθορισμού γενικά ονομάζονται ανιχνευτές φθορισμού αλλά χρησιμοποιείται ο όρος φθοριοχρώματα ή φθοροφόρα αν και ο τελευταίος όρος χρησιμοποιείται συνήθως για τα φθοριοχρώματα που είναι ενωμένα ομοιοπολικά ή μέσω προσρόφησης σε βιολογικά μακρομόρια όπως είναι τα νουκλεϊκά οξέα, τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες όπως η GFP (Green Fluorescent Protein). Ο φθορισμός ακολουθεί μια σειρά από διακριτά βήματα στην οποία το αποτέλεσμα είναι εκπομπή φωτονίου με μεγαλύτερο μήκος κύματος, μια διαδικασία που μπορεί να απεικονιστεί με τη βοήθεια των διαγραμμάτων Jablonski. Όταν φως ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος χτυπήσει ένα φθορίζον δείγμα τα άτομα, ιόντα ή μόρια εκεί απορροφούν ένα συγκεκριμένο κβάντο φωτός το οποίο σπρώχνει ένα ηλεκτρόνιο σθένους από τη θεμελιώδη κατάσταση Ε G (η αρχική κατάσταση στην οποία όλα τα ηλεκτρόνια έχουν αντίθετο spin και συνολικό spin μηδέν) σε ένα υψηλότερο ενεργειακό επίπεδο δημιουργώντας μια διεγερμένη κατάσταση E S. H διαδικασία είναι γρήγορη της τάξης των femtoseconds και απαιτεί ενέργεια τουλάχιστον ίση με ΔΕ = Ε s E G για να γεφυρωθεί το χάσμα ανάμεσα στις διεγερμένες και θεμελιώδη κατάσταση για να συμβεί η διέγερση. Μετά τη διέγερση σε υψηλότερη κατάσταση το ηλεκτρόνιο γρήγορα ηρεμεί στο χαμηλότερο δυνατό υπό επίπεδο το οποίο γίνεται σε εύρος των picoseconds. 2.4.1 FRANCK-GORDON Η αρχή των Franck-Gordon δηλώνει ότι ο πυρήνας σε ένα μόριο είναι πολύ μεγαλύτερος από τα ηλεκτρόνια ώστε οι κινήσεις του πυρήνα και των ηλεκτρονίων να μπορούν να θεωρηθούν χωριστές. Δηλαδή οι ηλεκτρονιακές μεταβάσεις συμβαίνουν [34]

σε χρόνους πολύ σύντομους σε σχέση με το χρόνο που χρειάζεται ο πυρήνας για να κινηθεί. Η διέγερση από τη θεμελιώδη κατάσταση είναι μια στιγμιαία διαδικασία στην οποία ο πυρήνας δεν έχει το χρόνο να επανακαθοριστεί κατά την απορρόφηση αλλάζοντας τις διαπυρηνικές αποστάσεις. Συγκεκριμένα κατά τη διάρκεια μιας ηλεκτρονιακής μετάβασης η αλλαγή από ένα δονητικό επίπεδο σε ένα άλλο είναι πιο πιθανόν να συμβεί εάν δύο δονητικές κυματοσυναρτήσεις επικαλύπτονται πιο καλά. 2.4.2 ΦΩΤΟΛΕΥΚΑΝΣΗ Μια από τις πολλές χρήσεις της συνεστιακής μικροσκοπίας είναι η απεικόνιση φθορισμού. Τα φθοροφόρα που χρησιμοποιούνται τείνουν να λευκάζουν όταν εκτίθενται σε μεγάλες ποσότητες φωτός. Η λεύκανση γενικά είναι ανάλογη της δόσης του φωτός, αν και υπάρχουν παραδείγματα μη γραμμικότητας, τόσο ευνοϊκών όσο και δυσμενών στις υψηλές εντάσεις της συνεστιακής μικροσκοπίας laser. Η φωτολεύκανση είναι μια φωτο-επαγόμενη διαδικασία στην οποία τα φθορίζοντα μόρια τελικά χάνουν την ικανότητά τους να εκπέμψουν φθορισμό όταν εκθέτονται σε επαναληπτικούς κύκλους διέγερσης και εκπομπής με αποτέλεσμα το ξεθώριασμα του φθορίζοντος χρώματος. Δηλαδή είναι η διαδικασία στην οποία το φθοροφόρο χάνει μόνιμα την ικανότητα του να φθορίζει. Κάθε φθοροφόρο έχει διαφορετικά χαρακτηριστικά φωτολεύκανσης. Η σταθερότητα τους μπορεί να χαρακτηριστεί από ένα μέσο αριθμό κύκλων απορρόφησης-εκπομπής όπου τα μόρια του φθοροφόρου υπόκεινται προτού φωτολευκανθούν μη αναστρέψιμα. Η φωτολεύκανση συνδέεται με τη ενδοσυστημική διάβαση δηλαδή τη μετάβαση από μια διεγερμένη singlet κατάσταση S1 σε μια διεγερμένη triplet κατάσταση Τ1. Η μετάβαση αυτή βγάζει το μόριο από τον κύκλο εκπομπής-απορρόφησης και καθώς η triplet κατάσταση έχει μεγαλύτερο χρόνο ζωής από τη singlet κατάσταση είναι χημικά πιο ενεργή. 2.5 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Η αυξανόμενη χρήση του φθορισμού στη μικροσκοπία σαν εργαλείο στη βιολογία έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση των αναγκών σε φθοροφόρα για απεικονιστικούς λόγους. Αυτή η ζήτηση κυμαίνεται από καλύτερα φθοροφόρα με βελτιωμένες φασματικές ιδιότητες, μέχρι σε πιο λειτουργικά φθοροφόρα που επιτρέπουν την απευθείας μελέτη μια συγκεκριμένης κυτταρικής λειτουργίας μέσω της αλλαγής των ιδιοτήτων της. Φθορίζοντα ανιχνευτή ή φθοροφόρο ονομάζουμε μια χημική ένωση η οποία μπορεί να επανεκπέμψει φως μετά τη διέγερση της από φωτόνια. Το φαινόμενο του φθορισμού [35]

συμβαίνει κατά κύριο λόγο στα αρωματικά μόρια. Συνηθισμένα αρωματικά μόρια των οποίων ο φθορισμός παρατηρείται στην καθημερινή ζωή είναι η κινίνη, η φλορεσκίνη και η ροδαμίνη που υπάρχουν στο μεταλλικό νερό και σε αντιπηκτικά αντίστοιχα. Πολλοί φθορίζοντες ανιχνευτές κατασκευάζονται γύρω από συνθετικές αρωματικές οργανικές χημικές ουσίες σχεδιασμένες να δεσμεύονται με ένα βιολογικό μακρομόριο (για παράδειγμα μια πρωτεΐνη ή νουκλεϊνικό οξύ) ή να εντοπίζονται εντός μιας ειδικής δομικής περιοχής, όπως ο κυτταροσκελετός, τα μιτοχόνδρια, το σύμπλεγμα Golgi, ενδοπλασματικό δίκτυο και πυρήνας. Χρησιμοποιούνται άλλοι ανιχνευτές για την παρακολούθηση δυναμικών διεργασιών και εντοπισμένων περιβαλλοντικών μεταβλητών, συμπεριλαμβανομένων συγκεντρώσεων ανόργανων μεταλλικών ιόντων, pη, αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και δυναμικού μεμβράνης. Οι φθορίζουσες χρωστικές είναι επίσης χρήσιμες στην παρακολούθηση της κυτταρικής ακεραιότητας (ζωντανός έναντι νεκρού και απόπτωσης), ενδοκυττάρωση, εξωκύτωση, ρευστότητα μεμβράνης, διακίνηση πρωτεϊνών, μεταγωγή σήματος και ενζυματική δραστηριότητα. Επιπλέον, οι φθορίζοντες ανιχνευτές έχουν εφαρμοστεί ευρέως στη γενετική χαρτογράφηση και την ανάλυση χρωμοσωμάτων στον τομέα της μοριακής γενετικής. Μια άλλη κατηγορία φθορίζουσων ουσιών είναι οι κβαντικές κουκίδες που είναι συστοιχίες από ημιαγωγούς σε κλίμακα νανομέτρου και γενικά παράγονται από πυρήνα CdSe ή CdTe και ένα φλοιό από ZnS και είναι υψηλά φθορίζοντα και φωτοσταθερά, ενώ μαζί με την υψηλή απόδοση φθορισμού είναι ικανά να παράγουν δεκάδες χιλιάδες φορές περισσότερα φωτόνια ανά φθοροφόρο σε σχέση με τις φθορίζουσες πρωτεΐνες. Παρόλα αυτά η χρήση τους στην βιολογία απαιτεί την ανάπτυξη βιοκατάλληλης επένδυσης ώστε να είναι υδατοδιαλυτά ξεπερνώντας έτσι την απώλεια φθορισμού μέσα σε υδάτινο περιβάλλον. Τέλος έχουμε τις φωτοχρωμικές βαφές οι οποίες αλλάζουν τις φασματικές τους ιδιότητες ανάλογα με το μήκος κύματος του φωτισμού, το οποίο πρέπει να είναι διαφορετικό από το μήκος κύματος διέγερσης. Η αλλαγή στις φασματικές ιδιότητες μπορεί να είναι μια μετατόπιση σε φάσματα απορρόφησης/εκπομπής ή στην ενεργοποίηση και απενεργοποίηση της απόδοσης φθορισμού με ή χωρίς αισθητή αλλαγή χρώματος.[13] [36]

2.6 ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ FRAP Η συνδεσμολογία για τα πειράματα FRAP παρουσιάζεται στην εικόνα 12 και περιλαμβάνει ένα μικροσκόπιο (συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης laser) μία φωτεινή πηγή (laser) και ένα φθορίζοντα ανιχνευτή. Η εκπομπή φθορισμού εξαρτάται από την απορρόφηση ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος ή χρώματος που περιορίζει την επιλογή λαμπών. Συνήθως χρησιμοποιείται υδράργυρος ευρέος φάσματος ή πηγή από ξένο (Xe), ή αργό (Ar) σε σύνδεση με οπτικό φίλτρο. Η φωτολεύκανση επιτυγχάνεται με χρήση κυκλικού σημείου και παλμού laser περίπου 40 mw στο 75% της ισχύς του και για χρόνο της τάξης των millisecond. Εικόνα 12 Πειραματική Διάταξη FRAP https://www.researchgate.net/profile/d_fygenson/publication/10856060/figure/fig2/as:281235046846469@1 444063068515/FIG-2-Schematic-of-the-FRAP-experimental-setup-The-same-laser-beam-is-used-tobleach.png Το δείγμα αρχικά τοποθετείται στο μικροσκόπιο και η τοποθεσία που μας ενδιαφέρει εστιάζεται. Το συνεστιακό διάφραγμα ανοίγει τελείως για να ανιχνεύσει όσο το δυνατόν περισσότερο φως από φθορισμό με μια δέσμη φωτισμού χαμηλής ισχύος, καθώς επίσης και για ελαχιστοποιηθεί η λεύκανση όταν καταγράφουμε την επαναφορά του φθορισμού. Στη συνέχεια ένα δίσκος με μια συγκεκριμένη διάμετρο έχει σχεδιαστεί στο λογισμικό λεύκανσης, μια χρονοσειρά καταγράφεται με CLSM με αποτέλεσμα να [37]

πάρουμε μια στοίβα εικόνων. Η πρώτη εικόνα από τη σειρά δείχνει το δείγμα πριν τη λεύκανση, η δεύτερη δείχνει το δίσκο τη στιγμή της λεύκανσης και οι επόμενες εικόνες δείχνουν τη διαδικασία της επαναφοράς μετά τη λεύκανση. Το χρονικό διάστημα ανάμεσα στις εικόνες ρυθμίζεται από το χρήστη με ελάχιστο τα 2.3 s για ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σε 512 512 pixels ανά εικόνα και μια λογική ταχύτητα σάρωσης. Η επιλογή της περιόδου του χρόνου εξαρτάται από την ταχύτητα της επαναφοράς. Εικόνα 13 Χρονική εξέλιξη πειράματος FRAP Τα πειράματα FRAP εκτελέστηκαν με τη βοήθεια ενός συνεστιακού μικροσκοπίου Zeiss 510 με αριθμητικό άνοιγμα 100 /1.3 ΝΑ σε στόχο εμβάπτισης λαδιού. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C με έναν επωαστήρα σταδίου ροής αέρα. Η λεύκανση πραγματοποιήθηκε με κυκλικό σημείο χρησιμοποιώντας ένα laser Ar με μήκη κύματος 488 και 514 nm και με λειτουργία στο 75% της ισχύς του. Μια επανάληψη χρησιμοποιήθηκε για τον παλμό λεύκανσης με διάρκεια 0.8-4 ms ανάλογα με το μέγεθος του σημείου λεύκανσης. Η επαναφορά του φθορισμού παρακολουθήθηκε σε χαμηλή ένταση του laser (0.2% σε 40 mw laser) και σε χρονικά διαστήματα από 0.8-4 ms ανάλογα και πάλι με το πείραμα.[15-17] [38]

2.7 ΔΙΑΧΥΣΗ Η διάχυση είναι μια από τις σημαντικότερες διαδικασίες μοριακής μεταφοράς στη βιολογία. Η εσωτερική θερμική ενέργεια κάθε μορίου και ατόμου δημιουργεί την παθητική μεταφορά που είναι γνωστή ως διάχυση. Η διάχυση είναι μια φυσική διαδικασία στην οποία ύλη μεταφέρεται από μια περιοχή του συστήματος σε μια άλλη σαν αποτέλεσμα τυχαίων μοριακών κινήσεων. Η μεταφορά γίνεται από την περιοχή υψηλότερης συγκέντρωσης στην περιοχή χαμηλότερης συγκέντρωσης. Η διαφορά της συγκέντρωσης ανάμεσα στις δύο περιοχές είναι γνωστή σαν βάθμωση της συγκέντρωσης. Η διάχυση είναι το μακροσκοπικό αποτέλεσμα της τυχαίας θερμικής κίνησης η οποία είναι γνωστή σαν κίνηση Brown σε μικροσκοπική κλίμακα. Η μαθηματική θεμελίωση της διάχυσης βασίζεται στην υπόθεση ότι ο ρυθμός μεταφοράς της μάζας είναι ανάλογος της βάθμωσης της συγκέντρωσης. Ο πρώτος νόμος του Fick (1855) σχετίζει τη διαχεόμενη ροή με τη συγκέντρωση με την υπόθεση ότι υπάρχει σταθερή κατάσταση. Με βάση τις παραπάνω υποθέσεις και θεωρώντας ένα διάνυσμα ροής της διάχυσης J [mol m 2 s 1 ] το οποίο περιγράφει τη ροή της μάζας στις τρεις διαστάσεις, η συνολική ροή υπολογίζεται σαν η χωρική βάθμωση της συγκέντρωσης c [mol m -3 ] σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο: J = D (e c x x + e c y y + e c z ) = D c (5) z Η σταθερά αναλογίας είναι ο συντελεστής διάχυσης D [m 2 s -1 ], ενώ το αρνητικό πρόσημο υπάρχει για να δείχνει ότι η ροή γίνεται από περιοχές υψηλής συγκέντρωσης σε περιοχές χαμηλότερης συγκέντρωσης. Η διάχυση θα συνεχίζεται μέχρις ότου η βάθμωση μηδενιστεί. Ο δεύτερος νόμος του Fick προβλέπει πώς η διάχυση μεταβάλλει τη συγκέντρωση ως προς το χρόνο. Είναι μια μερική διαφορική εξίσωση η οποία στις τρεις διαστάσεις εκφράζεται ως εξής: c t = D 2 c (6) η οποία δηλώνει ότι ο ρυθμός μεταβολής της συγκέντρωσης σχετίζεται με τη δεύτερη παράγωγο κάθε χωρικής μεταβλητής όπως εκφράζεται από το τελεστή του Laplace 2. [39]

Η διάχυση αποτελεί έναν από τους βασικότερους τρόπους μεταφοράς και επικοινωνίας ανάμεσα στα κύτταρα. Η μελέτη της διάχυσης μας δίνει σημαντικές πληροφορίες για την κινητική των μορίων και του τρόπου που αλληλοεπιδρούν μέσα στο κύτταρο.[10] 2.7.1 ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΔΙΑΧΥΣΗΣ Μια σημαντική παράμετρος της διάχυσης είναι ο συντελεστής διάχυσης ο οποίος περιγράφει το πόσο αργά ή πόσο γρήγορα ένα αντικείμενο διαχέεται μέσω ενός ρευστού και αντιπροσωπεύει τη μέση τετραγωνική μετατόπιση των πρωτεϊνών στο χρόνο. Εξαρτάται τόσο από το μέγεθος και το σχήμα του αντικειμένου όσο και από το ιξώδες και τη θερμοκρασία του ρευστού. Ο συντελεστής διάχυσης για σφαιρικά σωματίδια μπορεί να υπολογιστεί από τις εξισώσεις Stokes-Einstein από όπου προκύπτει η παρακάτω σχέση για το συντελεστή διάχυσης D = kt 6πηR h (7) όπου Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία, η είναι το ιξώδες, το k είναι η σταθερά του Boltzmann και Rh είναι η υδροδυναμική ακτίνα του αντικειμένου. Στα περισσότερα βιολογικά πειράματα η απόλυτη θερμοκρασία είναι σταθερή και επομένως ο πιο σημαντικός παράγοντας για το D είναι το μέγεθος της πρωτεΐνης και το ιξώδες του μέσου. Η διάχυση στα πειράματα FRAP χρησιμοποιείται για να μελετήσουμε την κίνηση των μορίων μέσα και έξω από την περιοχή ενδιαφέροντος κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της φωτολεύκανσης στην οποία μόρια που έχουν χάσει το φθορισμό τους διαχέονται έξω από την περιοχή ενώ κύτταρα με φθορισμό διαχέονται μέσα στην περιοχή ώστε να έχουμε επαναφορά του φθορισμού που είναι και το ζητούμενο του πειράματος. 2.8 ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Οι φθορίζουσες χρωστικές λαμβάνονται απευθείας από τα κύτταρα. Ενσωματώνονται και συγκεντρώνονται σε ειδικά υποκυτταρικά διαμερίσματα ενώ τα ζωντανά κύτταρα τοποθετούνται σε μια πλάκα μικροσκοπίου και εξετάζονται από ένα μικροσκόπιο. Στη συνέχεια έχουμε τη διαδικασία του ανοσοφθορισμού η οποία περιλαμβάνει τη χρήση αντισωμάτων στα οποία έχει συνδεθεί ένα φθορίζοντας ανιχνευτής. Τα αντισώματα είναι κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν και δεσμεύονται επιλεκτικά με συγκεκριμένα μόρια στόχους μέσα στο κύτταρο. Το σήμα του φθορισμού μπορεί να [40]

ενισχυθεί με ένα μη επισημασμένο πρωτεύον αντίσωμα και η ανίχνευση του γίνεται με επισημασμένα δευτερεύοντα αντισώματα. Τέλος έχουμε τη σήμανση των πρωτεϊνών η οποία γίνεται με την τροποποίηση των κυττάρων ώστε να δημιουργήσουν τα δικά τους μόρια φθορισμού. Αυτά τα πρωτεϊνικά μόρια επισημαίνονται με ένα δείκτη φθορισμού. Όταν μια πρωτεΐνη τροποποιηθεί με αυτόν τον τρόπο τότε είναι δυνατή η μελέτη της θέσης αυτής της πρωτεΐνης και επίσης η παρακολούθηση των κινήσεων των πρωτεϊνών και των αλληλεπιδράσεων τους με άλλα κυτταρικά στοιχεία μέσα στο κύτταρο. [41]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Στο προηγούμενο κεφάλαιο περιγράψαμε αναλυτικά τα φυσικά φαινόμενα τα οποία εμφανίζονται στα πειράματα FRAP. Πέρα όμως από τα φαινόμενα που περιγράψαμε όπως ο φθορισμός και η διάχυση, στα πειράματα FRAP το βασικό αντικείμενο μελέτης και ανάλυσης είναι βιομόρια όπως είναι οι πρωτεΐνες, οι οποίες συμμετέχουν σε διάφορες αντιδράσεις μέσα και έξω από κύτταρα, τις οποίες πρέπει να ερμηνεύσουμε ώστε να λάβουμε σωστά και τεκμηριωμένα αποτελέσματα. Για αυτό το λόγο σε αυτό το κεφάλαιο θα αναπτύξουμε ένα μαθηματικό μοντέλο με βάση το οποίο θα ερμηνεύσουμε τις αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν οι πρωτεΐνες. 3.1 ΝΤΕΤΕΡΜΙΝΙΣΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Η ντετερμινιστική προσέγγιση στη χημική κινητική των αντιδράσεων χρησιμοποιείται από χημικούς και επιστήμονες της ζωής για να χαρακτηρίσουν τις χρονικές εξελίξεις σε μεγάλα συστήματα. Σε αυτό το κεφάλαιο εισάγουμε κύριες έννοιες όπως η εξίσωση χημικού ρυθμού, η σταθερά χημικού ρυθμού και η σχέση ανάμεσα στη σταθερή κατάσταση και τη χημική ισορροπία. Οι χημικές αντιδράσεις δεν είναι στιγμιαίες. Όταν ένα η περισσότερα μόρια αντιδρούν, το κάνουν σε μια περίοδο χρόνου που καθορίζεται από την φυσική της αντίδρασης (μοριακές συγκρούσεις λόγω κίνησης Brown, μεταφορά ηλεκτρονίων κ.α.). Αυτές οι χρονικές κλίμακες καθορίζουν πλήρως την αντίδραση από τις δυναμικές ιδιότητες των υλικών μέχρι τα χρονοδιαγράμματα της κυτταρικής και φυσιολογικής αντίδρασης του συστήματος. Η μελέτη των ρυθμών των χημικών αντιδράσεων λέγεται χημική κινητική. Η πιο κοινή ερώτηση για τις περισσότερες έρευνες στην κινητική είναι το πώς μεταβάλλεται μια ποσότητα με την πάροδο του χρόνου π.χ. ένα φάρμακο που πρέπει να δράσει σε μια συγκεκριμένη περιοχή. Η ποσότητα αυτή συνήθως μετράται σε mol, μάζα ή σε συγκεντρώσεις ουσιών. Τα μόρια συγκρούονται και αντιδρούν με τυχαίο τρόπο όπως δείχνει και η εικόνα 14. Επομένως ο αριθμός των μορίων ενός συγκεκριμένου είδους είναι μια τυχαία μεταβλητή. Παρόλα αυτά η χρονική εξέλιξη μακροσκοπικών ποσοτήτων ή συγκεντρώσεων των μορίων είναι συνήθως αρκετά αναπαραγωγίσιμη ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες. Αυτή η εμπειρική παρατήρηση έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη νόμων ρυθμών της πρόβλεψης του ρυθμού μεταβολής των μοριακών συγκεντρώσεων. [42]

Τέτοιοι νόμοι λέγονται ντετερμινιστικοί επειδή υπονοούν ότι η χρονική εξέλιξη των χημικών διαδικασιών είναι προκαθορισμένη από τις αρχικές συνθήκες. Τέτοια μοντέλα είναι συνήθη στη φυσική π.χ. οι νόμοι της κινηματικής, η κλασσική ηλεκτρομαγνητική θεωρία και η βαρύτητα. Εικόνα 14 Ένα χημικό σύστημα: Βιομοριακά είδη Α, Β και C βρίσκονται μέσα στο κυτταρόπλασμα ενός ευκαρυωτικού κυττάρου που ορίζει όγκο V. Δύο αντιδράσεις μπορούν να συμβούν: Α+Β C και C Α+Β. Αρχικά οι συγκεντρώσεις των A, B και C είναι 4/V 3/V και μηδέν αντίστοιχα (πρώτη εικόνα μέχρι την Τρίτη), η αντίδραση A+B C συμβαίνει δύο φορές και παράγει συγκεντρώσεις των A, B και C 2/V 1/V και 2/V αντίστοιχα. Έπειτα πραγματοποιείται η δεύτερη αντίδραση όπου στη δεύτερη και τέταρτη εικόνα είναι πανομοιότυπες μεταξύ τους. Lecca Paola, Laurenzi Ian, (2013), «Deterministic versus stochastic modelling in biochemistry and systems biology», Woodhead Publishing Μια ντετερμινιστική προσέγγιση στη χημική κινητική καθορίζει τις χρονικές εξελίξεις των ποσών κάθε χημικού είδους με πάρα πολύ μεγάλη ακρίβεια: Εάν γνωρίζουμε τα ποσά κάθε είδους σε κάποιο χρόνο t, μπορούμε να υπολογίσουμε τα ποσά σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή t > t. Γενικά αν ένα σύνολο εξισώσεων καθορίζουν μια ποσότητα συναρτήσει του χρόνου τότε η χρονική εξέλιξη είναι ντετερμινιστική. Στα ντετερμινιστικά μοντέλα σκοπός είναι η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για την περιγραφή της διάχυσης, της πρόσδεσης και της διαδικασίας της φωτολεύκανσης ώστε να προκύψουν εκφράσεις κλειστής μορφής για την επαναφορά του φθορισμού. Συνήθως τα μοντέλα αυτά χωρίζονται σε 3 κατηγορίες ανάλογα με το φαινόμενο που είναι κυρίαρχο και έτσι έχουμε τα μοντέλα διάχυσης, τα μοντέλα που κυριαρχούν οι αντιδράσεις και τα μοντέλα διάχυσης- αντίδρασης. Στα μοντέλα κυριαρχίας της διάχυσης θεωρούμε ότι η επαναφορά του φθορισμού εξαρτάται μόνο από τη δυναμική της διάχυσης καθώς τα μη λευκασμένα μόρια κινούνται στην περιοχή της λεύκανσης και οι αλληλεπιδράσεις πρόσδεσης είναι [43]

τελείως απούσες. Στα μοντέλα όπου κυριαρχούν οι αντιδράσεις η επαναφορά του φθορισμού μέσα στη λευκασμένη περιοχή θεωρούμε ότι εξαρτάται αποκλειστικά από τη δυναμική της κινητικής πρόσδεσης ενώ η διάχυση είναι στιγμιαία και απαρατήρητη και άρα αμελητέα. Σε αυτά τα μοντέλα έχουμε την παρουσία ενός ή περισσότερων εκθετικών όρων ανάλογα με τον αριθμό των σημείων πρόσδεσης. Τέλος στα μοντέλα διάχυσης- αντίδρασης (λέγονται και πλήρη μοντέλα) λαμβάνονται υπόψιν και οι δύο τύποι των αλληλεπιδράσεων γεγονός που τα κάνουν πιο ρεαλιστικά.[22-16] 3.2 ΜΟΝΤΕΛΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗΣ FRAP Αρχικά θεωρούμε την γενική εξίσωση που περιγράφει το FRAP για μια αντίδραση απλής πρόσδεσης (single binding) με την παρακάτω ονοματολογία: koff F + S kon C (8) Όπου το F παριστάνει τις ελεύθερες πρωτεΐνες, το S παριστάνει τα κενά σημεία πρόσδεσης και το C αντιπροσωπεύει τα δέσμια [FS] σύμπλοκα ενώ τα k on και k off είναι οι λόγοι on και off αντίστοιχα. Οι εξισώσεις που περιγράφουν το FRAP πρέπει να ενσωματώνει τη διάχυση με πιο γενική περίπτωση να είναι αυτή ενός συστήματος 3 συζευγμένων εξισώσεων οπου f= [F], s= [S] και c= [C]. f t = D f 2 f k on fs + k off c (9) s t = D s 2 s k on fs + k off c (10) c t = D c 2 c + k on fs k off c (11) Αυτές οι εξισώσεις μπορούν να απλοποιηθούν με 2 υποθέσεις οι οποίες είναι εφαρμόσιμες σε πολλά βιολογικά συστήματα. Η πρώτη υπόθεση είναι ότι το βιολογικό σύστημα έχει φτάσει σε ισορροπία πριν την έναρξη της φωτολεύκανσης. Για τις GFP πρωτεΐνες αυτό σημαίνει ότι το ολικό πόσο και της GFP πρωτεΐνης σύντηξης και των σημείων πρόσδεσης παραμένει σταθερό κατά τη διάρκεια της επαναφοράς φθορισμού. [44]

Αυτό είναι λογικό αφού στα περισσότερα βιολογικά συστήματα η επαναφορά του FRAP έχει χρονοδιάγραμμα από δευτερόλεπτα μέχρι αρκετά λεπτά ενώ η GFP μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια ωρών και είναι τυπικά σε σταθερό επίπεδο κατά τη διάρκεια του FRAP πειράματος. Επομένως υποθέτουμε ισορροπία και συμβολίζουμε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις ισορροπίας των F, S και C με F eq, S eq, C eq. Παρόλο που η δράση της λεύκανσης μεταβάλλει το πλήθος των ορατών ελεύθερων και συμπλοκοποιημένων μορίων, δεν αλλάζει το πλήθος των ελεύθερων σημείων πρόσδεσης με αποτέλεσμα το s = S eq να είναι σταθερό σε όλη τη διάρκεια της επαναφοράς και έτσι απαλείφεται η δεύτερη εξίσωση από το σύστημα (2) και αντικαθιστούμε τη μεταβλητή s με το S eq στις εναπομένουσες εξισώσεις και ορίζουμε τη σταθερά αναλογίας ψευδό- πρώτης τάξης k on = k on S eq. Η δεύτερη υπόθεση που κάνουμε είναι ότι τα σημεία πρόσδεσης είναι μέρος ενός μεγάλου, σχετικά ακίνητου συγκροτήματος τουλάχιστον για την κλίμακα χρόνου και χώρου της μέτρησης FRAP. Αγνοώντας τη διάχυση του δέσμιου συγκροτήματος έχει σαν αποτέλεσμα να θέσουμε D c = 0 στις εκφράσεις του συστήματος (2). Με αυτές τις υποθέσεις το σύστημα (2) ανάγεται στο παρακάτω σύστημα 2 εξισώσεων. f t = D f 2 k on f + k off c (12) c t = k on f k off c (13) Πριν τη λεύκανση το σύστημα είναι σε ηρεμία και οι σταθερές F και C έχουν τιμές σταθερής κατάστασης F eq, C eq και ο λόγος ελεύθερων- δέσμιων μορίων βρίσκεται από τη σχέση df dt = dc dt = 0 k on F eq = k off C eq ή F eq = k off C (14) eq k on Κάνοντας αλλαγή μεταβλητών θέτοντας u = F eq f και v = C eq c οι παραπάνω εκφράσεις γίνονται: [45]

u t = D f 2 u k on u + k off v (15) v t = k on u k off v (16) Με αρχικές συνθήκες u(0) = { F eq r w 0 r > w και v(0) = { C eq r w 0 r > w Εφαρμόζοντας το μετασχηματισμό Laplace u (p, r) = e pt u(r, t)dt στο 0 παραπάνω σύστημα καταλήγουμε στις παρακάτω εξισώσεις: pu = D f 2 u k on u + k off v + u(0) (17) pv = k on u k off v + v(0) (18) Από αυτό το σύστημα η δεύτερη εξίσωση λύνεται εύκολα και δίνει ως λύση v = 1 (k p + k on u + v(0)) (19) off Αντικαθιστώντας αυτή τη λύση στην εξίσωση (9) έχουμε (p + k on D f 2 1 )u = k off (k p+k on u + v(0)) + u(0) (20) off Με ομαδοποίηση των όρων και διαιρώντας με το D f παίρνουμε την παρακάτω εξίσωση ( p D f + k on p D f (p + k off ) v(0) 2 ) u = D f (p + k off ) + u(0) (21) D f Και θέτοντας q 2 = ( p D f )(1 + k on ) (22) p + k off V = F eq (1 + k on ) (23) D f p + k off [46]

Καταλήγουμε στην εξίσωση 2 u q 2 u = { V 0 Η εξίσωση αυτή έχει λύση την παρακάτω r w r > w (24) u = V q 2 a 1I 0 (qr) r w (25) u = a 2 K 0 (qr) r > w (26) Όπου τα Ι 0 και Κ 0 είναι οι τροποποιημένες συναρτήσεις Bessel πρώτου και δεύτερου είδους αντίστοιχα. Οι σταθερές α 1 και α 2 προσδιορίζονται από την απαίτηση η u και η πρώτη παράγωγος της να είναι συνεχής κατά μήκος του συνόρου της περιοχής λεύκανσης και χρησιμοποιώντας τις ιδιότητες των συναρτήσεων Bessel Ι 0 = Ι 1 και K 0 = K 1 βρίσκουμε a 1 = (V q 2 ) qwk 1 (qw) (27) Εφόσον η επαναφορά του FRAP είναι το άθροισμα του ελεύθερου (f = F eq u) και δέσμιου φθορισμού (c = C eq v) πρέπει να υπολογίσουμε το μετασχηματισμό Laplace αυτού του αθροίσματος f + c = 1 u v. Αυτό μας δίνει το μετασχηματισμό Laplace της έντασης φθορισμού σαν συνάρτηση της ακτινικής θέσης μέσα στο σημείο λεύκανσης ως εξής: fluor (p, r) = 1 u v p = 1 p u (1 + k on ) p + k off C eq p + k off, r w (28) Στη συνέχεια για να πάρουμε την μετρούμενη επαναφορά FRAP πρέπει πρώτα να υπολογίσουμε τη μέση ένταση φθορισμού μέσα στο σημείο λεύκανσης. Ο μόνος όρος από την παραπάνω εξίσωση που εξαρτάται από το r είναι το u και άρα αρκεί να πάρουμε τη μέση τιμή αυτού μέσα στο σημείο και να αντικαταστήσουμε στην παραπάνω εξίσωση. [47]

2π Avg(u ) = 1 dθ [ V πw2 q 2 a 1 I 0 (qr)]rdr (29) 0 0 w Κάνοντας χρήση των ιδιοτήτων των συναρτήσεων Bessel (ri 1 (r)) = ri 0 (r) και αντικαθιστώντας στην παραπάνω εξίσωση καταλήγουμε στην παρακάτω έκφραση για frap (p) = 1 p F eq p (1 2K 1(qw)I 1 (qw)) (1 + k on ) p + k off C eq p + k off (30) την επαναφορά FRAP Το πλήρες αυτό μοντέλο περιγράφει όλες τις πιθανές συμπεριφορές της επαναφοράς FRAP με βάση τις υποθέσεις που κάναμε (ενιαία αντίδραση δέσμευσης υπό παρουσία διάχυσης).[16] 3.2.1 PURE DIFFUSION DOMINANT Αυτή η συμπεριφορά προκύπτει όταν τα περισσότερα φθορίζοντα μόρια είναι ελεύθερα και έτσι το FRAP μετράει κυρίως ελεύθερη διάχυση των φθοριζόντων μορίων. Για αυτό το ελεύθερο μέρος το δέσιμο μπορεί να αγνοηθεί και οι εξισώσεις του συστήματος (3) ανάγεται στην εξίσωση διάχυσης f t = D f 2 f η οποία δίνει σαν λύση τη παρακάτω σχέση: (31) Frap(t) = f(t) = e τd/2t [I 0 ( τ D 2t ) + I 1 ( τ D )] (32) 2t Όπου τ D = w2 D f [48]

Είναι το χαρακτηριστικό μέγεθος του μοντέλου με τη βοήθεια του οποίου υπολογίζουμε τη σταθερά διάχυσης D f, και w είναι η ακτίνα του κυκλικού σημείου λεύκανσης. Η γνώση της μακροσκοπικής συμπεριφοράς της διάχυσης μας επιτρέπει να εξάγουμε πληροφορίες για την πρωτεΐνη που διαχέεται και δεσμεύεται.[16-15] 3.2.2 EFFECTIVE DIFFUSION Σε αυτή την περίπτωση η διαδικασία της αντίδρασης είναι πολύ πιο γρήγορη από την διάχυση. Σε οποιαδήποτε θέση στη λευκασμένη περιοχή η αντίδραση δέσμευσης γρήγορα επιτυγχάνει τοπική ισορροπία. Έχουμε διαφορετική σταθερά διάχυσης τη D eff όπου χρησιμοποιείται ο όρος effective για να δηλώσουμε την καθυστερημένη διάχυση λόγω δεσίματος και ορίζεται από τη σχέση: D f D eff = (1 + (k on k off )) (33) Όπου ο όρος D f είναι η σταθερά διάχυσης του μορίου απουσία δεσίματος και οι λόγοι off- και pseudo-on ορίζονται όπως προηγούμενα. Ο λόγος k on είναι η σταθερά ψευδο-ισορροπίας δηλαδή ο λόγος των k off δεσμευμένων/αδέσμευτων μορίων. Η σταθερά D f υπολογίζεται αφού πρώτα μετρηθεί η επαναφορά FRAP για την GFP. Η σταθερά διάχυσης της GFP πρωτεΐνης μπορεί να υπολογιστεί επιτρέποντας στην επιπλέον μάζα σχετικά με την GFP μόνο και χρησιμοποιώντας το γεγονός ότι στην απλούστερη περίπτωση D M 1/3 και επομένως ο υπολογισμός του D eff μας δίνει και το k on k off. Ο περιορισμός για το effective diffusion είναι (k on w 2 /D f ) 1 και η κατάλληλη χρονική κλίμακα είναι η τ eff = (w 2 /D eff ) = (w 2 /D f )(1 + k on /k off ) Η απλοποίηση της εξίσωσης για το πλήρες μοντέλο ξεκινά παρατηρώντας ότι p + k off = k off (1 + p k off ) = k off (1 + p D f w 2 (k on + k off ) ) k off (34) Και αφού διαιρέσουμε με το τ eff η εξίσωση για το πλήρες μοντέλο γίνεται [49]

frap (p ) 1 p F eq p C eq k off τ eff (1 2K 1(q )I 1 (q )) (1 + k on ) k off (35) Ο τελευταίος όρος είναι αμελητέος επειδή στον παρονομαστή k off τ eff = ( w2 D f ) = (k off + k on ) 1 λόγω του περιορισμού της effective diffusion. Τελικά επειδή F eq (1 + (k on k off )) = 1 η παραπάνω εξίσωση ανάγεται στην frap (p ) 1 p 1 p (1 2K 1(q )I 1 (q )) (36) Η οποία με χρήση αντίστροφου μετασχηματισμού Laplace οδηγεί στην εξίσωση για κυκλικό σημείο λεύκανσης.[16] 3.2.3 REACTION DOMINANT Σε αυτή την περίπτωση η διάχυση είναι πολύ γρήγορη σε σχέση τόσο με τη δέσμευση όσο και με τη χρονική κλίμακα μέτρησης του FRAP. Συνεπώς τα ελεύθερα μόρια αμέσως ισορροπούν μετά τη λεύκανση f = F eq έτσι η διάχυση δεν ανιχνεύεται στην επαναφορά του FRAP. Άρα η πρώτη εξίσωση από το σύστημα (3) φεύγει και η δεύτερη εξίσωση γίνεται dc dt = k on F eq k off c (37) Ο πρώτος όρος στο δεξί μέλος είναι μια σταθερά και άρα αυτή η πρώτης τάξης γραμμική διαφορική εξίσωση έχει την παρακάτω λύση c(t) = ( k on F eq koff ) + Ke k offt (38) Από τη σχέση (4) γνωρίζουμε ότι ο πρώτος όρος στην παραπάνω εξίσωση απλοποιείται και είναι ίσος με C eq. Η σταθερά Κ υπολογίζεται από την αρχική συνθήκη c(0)=0 που προκύπτει από το γεγονός ότι μετά την κανονικοποίηση η συγκέντρωση των φθορίζοντων μορίων στη περιοχή λεύκανσης είναι μηδέν. Αυτό μας οδηγεί στη λύση [50]

c(t) = C eq (1 e k offt ) (39) Ο ολικός φθορισμός είναι ίσος με το άθροισμα f(t) + c(t) δηλαδή η σχέση που περιγράφει την ολική επαναφορά του φθορισμού σε αυτή την περίπτωση είναι: frap(t) = F eq + C eq (1 e k offt ) = 1 C eq e k offt (40) Όπου έχουμε χρησιμοποιήσει το γεγονός ότι F eq + C eq = 1 Επίσης στις παραπάνω εξισώσεις δεν έχουμε εξάρτηση από το σχήμα της λευκασμένης περιοχής. 3.2.4 ΜΟΝΤΕΛΟ ΔΙΠΛΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ Σε αυτό το μοντέλο έχουμε ένα δεύτερο ανεξάρτητο σημείο πρόσδεσης και η εξίσωση χημικού ρυθμού είναι η ακόλουθη k1on k2on F + S 1 C 1 F + S 2 C 2 (41) k1off Όπου οι δείκτες εδώ χρησιμοποιούνται για να ξεχωρίζουμε τα διαφορετικά σημεία πρόσδεσης. Εφαρμόζοντας τις ίδιες υποθέσεις με το μοντέλο για τη μια κατάσταση πρόσδεσης έχουμε το παρακάτω σύστημα εξισώσεων k2off f t = D f 2 f k 1on f + k 1off c 1 k 2on f + k 2off c 2 (42) c 1 t = k 1on k 1off c 1 (43) c 2 t = k 2onf k 2off c 2 (44) Και πάλι οι συγκεντρώσεις ισορροπίας Feq, C1eq και C2eq μπορούν να υπολογιστούν με τις ίδιες υποθέσεις που ισχύουν για το μοντέλο απλής πρόσδεσης δηλαδή: [51]

f t = c 1 t = c 2 t = 0 C k 1on k 2on 1eq = F eq, C k 2eq = F eq (45) 1off k 2off Με βάση τα παραπάνω και ακολουθώντας μια παρόμοια διαδικασία με το μοντέλο απλής πρόσδεσης μπορούμε να βρούμε μια αναλυτική λύση η οποία με το μετασχηματισμό Laplace έχει την παρακάτω μορφή frap (p) = 1 p F eq p (1 2K 1(qw)I 1 (qw)) (46) (1 + k 1on + k 2on ) p + k 1off p + k 2off C 1eq p + k 1off C 2eq p + k 2off (47) Όπου q 2 = ( p ) (1 + k 1on + k 2on ) (48) D f p+k 1off p+k 2off Για αυτό το σύστημα το σενάριο του pure diffusion dominant είναι και πάλι τετριμμένο. Αν υπάρχουν και οι δύο καταστάσεις πρόσδεσης, οι ρυθμοί off είναι μεγάλοι σε σχέση με τους ψευδό- on και τότε θα έχουμε Feq 1 και C1eq C2eq 0 και ο περισσότερος φθορισμός θα είναι ελεύθερος και άρα θα ικανοποιούν και πάλι το FRAP για ελεύθερη διάχυση. Αν οι συνθήκες είναι τέτοιες ώστε η πρόσδεση και στις δύο καταστάσεις να είναι γρήγορη σε σχέση με τη διάχυση τότε η περίπτωση του effective diffusion εξακολουθεί να ισχύει. Σε αυτή την περίπτωση η εξίσωση είναι η παρακάτω: f t = D f 2 f c 1 t c 2 t (49) Στην περίπτωση του effective diffusion, η διάχυση προκαλεί αλλαγές στην συγκέντρωση μέσα στο σημείο λεύκανσης, αλλά σε οποιαδήποτε θέση ή στιγμή οι δύο καταστάσεις πρόσδεσης γρήγορα επιτυγχάνουν τοπική ισορροπία. Στην τοπική ισορροπία ισχύει c 1 = (k 1on στην πρώτη εξίσωση του συστήματος έχουμε k 1off )f και c 2 = (k 2on k 2off )f και αντικαθιστώντας [52]

f t = D f 2 f (k 1on k 1off ) f t (k 2on k 2off ) f (50) t Ομαδοποιώντας τους όρους για το f συντελεστή που δίνεται από τη σχέση t παίρνουμε τη εξίσωση διάχυσης αλλά με D eff = D f (1 + k 1on + k 2on ) (51) k 1off k 2off Επομένως όταν ισχύει η περίπτωση της effective diffusion η καμπύλη FRAP που προκύπτει θα είναι κατάλληλη για το μοντέλο της διάχυσης και η προσαρμογή θα δώσει μια προσέγγιση για το Deff. Παρόλα αυτά αυτή η τιμή θα καθορίσει το άθροισμα των δυο σταθερών ψευδό-ισορροπίας και δεν θα είναι δυνατή η εξαγωγή περαιτέρω πληροφοριών για τους συγκεκριμένους ρυθμούς off και on για κάθε κατάσταση πρόσδεσης. Στην περίπτωση της Reaction dominant με δύο καταστάσεις πρόσδεσης η επαναφορά FRAP θα είναι το άθροισμα δύο εκθετικών και θα απαιτούνται τέσσερις παράμετροι για το ταίριασμα. Η εξίσωση που το περιγράφει θα είναι: frap(t) = F eq + C 1eq (1 e k 1offt ) + C 2eq (1 e k 2offt ) = 1 C 1eq e k 1offt C 2eq e k 2offt (52) Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα της ανάλυσης συγκεντρώνονται στα παρακάτω διαγράμματα όπου φαίνονται οι καμπύλες για κάθε περίπτωση που αναλύσαμε τόσο για τη μια κατάσταση πρόσδεσης όσο και για τις δύο καταστάσεις πρόσδεσης που αναφέρθηκαν παραπάνω. Οι παρακάτω καμπύλες προέκυψαν θεωρώντας κυκλικό σημείο λεύκανσης μέσα στο κύτταρο το οποίο θέσαμε ίσο με μισό μικρόμετρο (w = 0.5μm) ενώ για το συντελεστή διάχυσης θέσαμε μια τιμή η οποία συναντάται συχνά στη βιβλιογραφία και είναι ίση με Df = 30μm/s.[15-16] [53]

Εικόνα 15 Διαγράμματα Έντασης-Χρόνου Στην εικόνα 15 απεικονίζονται οι καμπύλες επαναφοράς για κάθε ένα από τα μοντέλα τα οποία προέκυψαν από τις υποθέσεις και τις απλοποιήσεις που θεωρήσαμε, ενώ στην εικόνα 16 απεικονίζονται όλες οι περιπτώσεις στο ίδιο διάγραμμα. Για τις καμπύλες αυτές υπολογίσαμε τους λόγους kon και koff και με βάση αυτούς προέκυψαν οι εξισώσεις και οι καμπύλες των μοντέλων. Για το Pure diffusion dominant θέσαμε τους λόγους k on=10-2 και k off=10 Για το effective diffusion θέσαμε τους λόγους kon=10 3.5 και koff=10 0 Για το reaction dominant θέσαμε kon=10-0.5 και koff=10-2 Για το full model θέσαμε kon=10 2 και koff=10-1 [54]

Εικόνα 16 Διάγραμμα συνολικής απεικόνισης [55]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 4.1 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ FRAP Σύμφωνα με την βιβλιογραφία τα πειραματικά δεδομένα που προκύπτουν μετά από ένα πείραμα FRAP αποτελούνται από καμπύλες επαναφοράς φθορισμού οι οποίες περιέχουν πληροφορίες σχετικά με τις παραμέτρους κινητικής και δυναμικής των πρωτεϊνών που μας ενδιαφέρουν. Αφού γίνει η ποιοτική εκτίμηση των ακατέργαστων δεδομένων ώστε να αφαιρεθούν τα δεδομένα χαμηλής ποιότητας, η ανάλυση δεδομένων FRAP περιλαμβάνει τα παρακάτω βήματα: 1. Προ επεξεργασία των ακατέργαστων δεδομένων, που περιλαμβάνει την εξάλειψη θορύβου και της συστηματικής διακύμανσης, με σκοπό να παραχθούν καθαρά και συγκρίσιμα δεδομένα. 2. Ποσοτική ανάλυση, που περιλαμβάνει τον υπολογισμό παραμέτρων με βάση τη μορφή της καμπύλης χρησιμοποιώντας τεχνικές ταιριάσματος καμπύλης (curve fitting) 3. Μοντελοποίηση, η οποία περιλαμβάνει την ανάπτυξη αναλυτικών εκφράσεων των διεργασιών της διάχυσης, πρόσδεσης και φωτολεύκανσης ώστε να προσδιοριστούν οι παράμετροι της κινητικής των πρωτεϊνών. Για την προεπεξεργασία των καμπυλών FRAP, πέρα από την ποσοτικοποίηση του φθορισμού στην περιοχή της φωτολεύκανσης, χρειάζονται επιπρόσθετες μετρήσεις σε άλλες περιοχές και συγκεκριμένα στη συνολική περιοχή φθορισμού και σε μια τυχαία περιοχή στο υπόβαθρο. Η προεπεξεργασία περιλαμβάνει την αφαίρεση των μέσων τιμών υποβάθρου σε κάθε χρονικό σημείο για τη διόρθωση του θορύβου και του αυτό φθορισμού και τη διαίρεση με την ολική κυτταρική ένταση σε κάθε χρονικό σημείο για να διορθωθούν οι διακυμάνσεις του laser κατά τη διάρκεια της φωτολεύκανσης. Επίσης διαιρούμε με τη μέση ένταση πριν τη φωτολεύκανση για να αφαιρέσουμε το συστηματικό σφάλμα κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Η ποσοτική ανάλυση έχει στόχο να υπολογίσει παραμέτρους που σχετίζονται με τη μορφή των καμπυλών επαναφοράς, όπως για παράδειγμα το ποσοστό των ακίνητων μορίων (που σχετίζεται με τη σταθεροποίηση της καμπύλης) και το χρόνο επαναφοράς στη μισή τιμή του μεγίστου. Αυτό το βήμα συνήθως γίνεται με την τεχνική ταιριάσματος καμπύλης που παρέχει μια πρώτη πρόχειρη ένδειξη για τη δυναμική ιδιαίτερα χρήσιμη για τη διαφορική ανάλυση. Ο σκοπός της είναι να περιγράψουμε [56]

θεωρητικά τα πειραματικά δεδομένα με ένα μοντέλο (συνάρτηση ή εξίσωση) και να βρούμε τις παραμέτρους που σχετίζονται με αυτό το μοντέλο. Τα μοντέλα που είναι κύριας σημασίας είναι τα μηχανιστικά μοντέλα τα οποία σχεδιάζονται με πρωταρχικό στόχο να παρέχουν πληροφορίες για χημικές και βιολογικές διεργασίες που αφορούν το φαινόμενο που μας απασχολεί. Οι παράμετροι που υπολογίζονται από τα μηχανιστικά μοντέλα είναι ποσοτικές εκτιμήσεις πραγματικών ιδιοτήτων του συστήματος (σταθερές ρυθμού, σταθερές διάστασης) Η μοντελοποίηση περιλαμβάνει τη ανάπτυξη αναλυτικών εκφράσεων για όλες τις διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια του πειράματος (διάχυση, πρόσδεση και παραμέτρους φωτολεύκανσης) και το ταίριασμα των καμπυλών σε αυτές τις εκφράσεις. Η ανάπτυξη της ισχύς των υπολογιστών έχει κάνει εφικτή την ανάπτυξη και προσομοίωση μοντέλων διάχυσης, πρόσδεσης και φωτολεύκανσης σε ρεαλιστικά περιβάλλοντα.[20-24] 4.2 ΝΟΡΜΑΛΙΣΜΟΣ Τα κύτταρα παρουσιάζουν μεταβλητότητα στα επίπεδα φθορισμού όπως και στην πειραματική διαδικασία. Ο νορμαλισμός έχει σκοπό να ανακατανείμει τα δεδομένα σε ένα άξονα αναφοράς από μηδέν μέχρι ένα (0-1) αφαιρώντας τα παραπάνω φαινόμενα και επιτρέποντας τη σύγκριση των καμπυλών από διαφορετικά κύτταρα ή από διαφορετικά πειράματα. Ο νορμαλισμός χρησιμοποιείται για να διορθωθεί το σήμα από το υπόβαθρο, η απώλεια του φθορισμού η οποία προκύπτει από τη φωτολεύκανση μιας υποπεριοχής του κυττάρου και τέλος οποιαδήποτε άλλη απώλεια φθορισμού που συμβαίνει κατά τη διάρκεια συλλογής της επαναφοράς. Συνήθως χρησιμοποιείται ο διπλός νορμαλισμός ο οποίος λαμβάνει υπόψη τις διαφορές στην αρχική ένταση της περιοχής λεύκανσης και τον ολικό φθορισμό και υπολογίζεται από την παρακάτω σχέση: I norm (t) = I ref_pre I frap (t) I back (t) (53) I ref (t) I back (t) I frap_pre Όπου Inorm(t) είναι η ένταση μετά το νορμαλισμό, Ifrap(t) είναι η μέση μετρούμενη ένταση μέσα στο σημείο λεύκανσης, Iref είναι μέση μετρούμενη ένταση αναφοράς όλου του συνόλου που μελετάμε (κύτταρο, πυρήνας) και Iback είναι μέση μετρούμενη ένταση υποβάθρου έξω από το κύτταρο [57]

4.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ Η ανάλυση και επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων στη μελέτη μας έγινε με τη χρήση του προγραμματιστικού περιβάλλοντος Mathworks Matlab έκδοση R2017a και του FRAPAnalyzer από το οποίο λάβαμε τα πειραματικά δεδομένα. Για την προσομοίωση του πειράματος χρησιμοποιήσαμε δεδομένα από πειράματα FRAP πρωτεϊνών ακτίνης σεσημασμένων με την GFP πρωτεΐνη σε διάφορα κύτταρα. Η ακτίνη που απεικονίζεται στην εικόνα 17 είναι μια πρωτεΐνη η οποία αφθονεί στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα και συμμετέχει σε περισσότερες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης από οποιαδήποτε άλλη γνωστή πρωτεΐνη. Αυτές οι ιδιότητες μαζί με την ικανότητα της για μετάβαση μεταξύ μονομερών (G-actin) και νηματοειδών (Factin) καταστάσεων υπό τον έλεγχο νουκλεοτιδικής υδρόλυσης, ιόντων και ενός μεγάλου αριθμού από πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης την καθιστούν σημαντικό παράγοντα σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες από την κυτταρική κινητικότητα μέχρι τη διατήρηση του σχήματος του κυττάρου και της πολικότητας στη ρύθμιση της μεταγραφής του DNA. Επίσης μπορεί να αυτό συναρμολογείται σε δυναμικά νήματα σχηματίζοντας με αυτό τον τρόπο τον κυτταροσκελετό της. Λόγω της σημαντικής λειτουργίας που επιτελεί στα κύτταρα οποιαδήποτε διαταραχή στον κυτταροσκελετό της συνδέεται με την εμφάνιση πολλών νοσημάτων όπως καρκίνος, μυοπάθειες και νευροεκφυλιστικές διαταραχές. Σε φλοιώδεις περιοχές το ολικό σήμα φθορισμού προκαλείται από πρωτεΐνες δέσμιες στο φλοιό της ακτίνης και από πρωτεΐνες που είναι ελεύθερες να διαχέονται μέσω του πλέγματος του φλοιού της ακτίνης. Τα πειράματα FRAP χρησιμοποιούνται για να μπορέσουμε να απεικονίσουμε και να μελετήσουμε τη δομή και τη λειτουργία του κυτταροσκελετού της πρωτεΐνης. Ο κυτταροσκελετός της έχει σημαντικό ρόλο στο κύτταρο όπως είναι η οργάνωση της χωροταξικής διευθέτησης των οργανιδίων στα κύτταρα, κανονίζει τη δυναμική του μορίου και την κινητικότητα του και παρέχει έναν τρόπο επικοινωνίας με γειτονικά κύτταρα. Η σήμανση των πρωτεϊνών με την GFP επιτρέπει την παρακολούθηση όλων των ιδιοτήτων της ακτίνης και βοηθά στην εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων για τις λειτουργίες της.[28] Τα δεδομένα αυτά αναφέρονται στις κύριες αντιδράσεις που σχετίζονται με την ακτίνη όπως ο σχηματισμός του πυρήνα της ακτίνης, η συσχέτιση/αποσυσχέτιση των μονομερών στα άκρα των νημάτων, ΑΤΡ υδρόλυση και ανταλλαγή ADP-ATP μέσω [58]

σχηματισμού ADP-Pi. Αυτές οι βιοχημικές αντιδράσεις σχετίζονται με τη δομή των νημάτων, με τη σύνθεση νουκλεοτιδίων μονομερών ακτίνης και ακτινικών υπομονάδων στα νημάτια αλλά και στη γήρανση του νήματος (υδρόλυση ΑΤΡ). Εικόνα 17 Πρωτεΐνη Ακτίνης https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c9/g-actin_subdomains.png/300px-gactin_subdomains.png Η επεξεργασία των δεδομένων ξεκινά με τον καθορισμό των περιοχών ενδιαφέροντος (ROI), αναφοράς και FRAP ενώ στη συνέχεια επιλέγεται η χρονική στιγμή της φωτολεύκανσης, όπου επιλέξαμε να γίνει στο δέκατο δευτερόλεπτο. Στη συνέχεια έγινε ο νορμαλισμός των δεδομένων (double normalization) σύμφωνα με τη σχέση (53) και κατασκευάσαμε το διάγραμμα επαναφοράς την έντασης ως προς χρόνο το οποίο φαίνεται στο επόμενο κεφάλαιο. Η παραπάνω επεξεργασία των δεδομένων έγινε με τη [59]

χρήση του προγράμματος FRAPAnalyzer ενώ το διάγραμμα κατασκευάστηκε αφού εισήχθησαν τα επεξεργασμένα δεδομένα στο υπολογιστικό πακέτο Matlab. 4.4 ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Κατά προσέγγιση δέκα ξεχωριστά FRAPs εκτελέστηκαν και μετά πήραμε το μέσο όρο τους για να παραχθεί μια καμπύλη FRAP. Η χρονική ανάλυση παρέμεινε σταθερή όσο μετρούνταν η επαναφορά, αλλά αυτό οδήγησε σε ένα μεγάλο αριθμό πολύ κοντινών σημείων στη δεύτερη πιο αργή φάση του πειράματος. Για να το αποφύγουμε αυτό πήραμε το μέσο όρο 10-30 γειτονικών σημείων για την πιο αργή φάση του πειράματος. Αυτό δημιούργησε περίπου ισαπέχοντα σημεία κατά μήκος της καμπύλης επαναφοράς και επομένως αποφύγαμε να δώσουμε μεγαλύτερη βαρύτητα στη δεύτερη φάση της καμπύλης κατά τη διαδικασία του ταιριάσματος της καμπύλης. [60]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 5.1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σε αυτό το κεφάλαιο γίνεται η εξαγωγή και παρουσίαση των αποτελεσμάτων του ντετερμινιστικού μοντέλου με τη χρήση της μεθόδου ταιριάσματος καμπύλης (curve fitting) η οποία έγινε με τη βοήθεια του Matlab και συγκεκριμένα της υπορουτίνας curve fitting tool με την οποία ελέγξαμε πόσο καλά ταιριάζει η επαναφορά κάθε πρωτεΐνης στα συγκεκριμένα μοντέλα που αναπτύξαμε. Η μέθοδος αυτή μας δίνει εκτός από τη γραφική παράσταση της βέλτιστης καμπύλης και το διάγραμμα των υπολοίπων από τη μέθοδο των μη γραμμικών ελάχιστων τετραγώνων που χρησιμοποιήσαμε καθώς και τους δείκτες καλής προσαρμογής με τους οποίους καταλαβαίνουμε πόσο καλό ήταν το ταίριασμα. 5.2 ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΕΠΑΝΑΦΟΡΑΣ Αρχικά μετά την επεξεργασία των δεδομένων που έγινε στο προηγούμενο κεφάλαιο κατασκευάζουμε το διάγραμμα επαναφοράς της έντασης φθορισμού ως προς το χρόνο το οποίο παρουσιάζεται στην εικόνα 18 από το οποίο μπορούμε να βγάλουμε κάποια συμπεράσματα όσον αφορά την κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών. Εικόνα 18 Καμπύλες επαναφοράς πρωτεϊνών ακτίνης [61]

Είναι γνωστό ότι η καθυστέρηση στην επαναφορά της έντασης στα πειράματα FRAP συνδέεται με την παρουσία καταστάσεων πρόσδεσης (binding sites) ορισμένες φορές περισσότερες από μια. Ένας άλλος λόγος που προκαλεί καθυστέρηση είναι ότι η συγκεκριμένη πρωτεΐνη δεν παρουσιάζει μόνο φαινόμενα διάχυσης αλλά αλληλεπιδρά με το υπόστρωμα. Επίσης από το διάγραμμα αυτό μπορούμε να υπολογίσουμε διάφορες παραμέτρους της μοριακής δυναμικής όπως είναι το κλάσμα κινούμενουακίνητου μέρους της πρωτεΐνης αλλά και το χρόνος ημιζωής ο οποίος είναι ο χρόνος που απαιτείται για να φτάσει η ένταση στο μισό της αρχικής. Αν ολόκληρος ο πληθυσμός του υπό μελέτη μορίου είναι ελεύθερος να κινείται τότε η ένταση φθορισμού (το υπόβαθρο αφαιρέθηκε και διορθώθηκε για την απώλεια φθορισμού κατά τη διάρκεια της φωτολεύκανσης) στην καμπύλη επαναφοράς θα έπρεπε να έφτανε στο μέγιστο, στο 100% της αρχικής έντασης πριν την φωτολεύκανση. Η αλληλεπιδράσεις πρόσδεσης ενός μέρους των μορίων καθυστερεί ή ακινητοποιεί δομές και μειώνει το επίπεδο επαναφοράς του φθορισμού. Το κινητό και ακίνητο μέρος μπορεί να υπολογιστεί με την παρακάτω σχέση: F m = (I E I 0 )/(I I I 0 ) (54) Όπου το I E είναι η τελική τιμή της επαναφοράς της έντασης, I 0 είναι η ένταση μετά τη λεύκανση και I 0 η ένταση πριν τη λεύκανση. Έτσι βλέπουμε ότι η πρωτεΐνη ακτίνης στο κύτταρο 6 είναι αυτή που έχει την πιο αργή επαναφορά και αυτή δεν είναι πλήρης που σημαίνει ότι θα έχουμε κάποιο μέρος της πρωτεΐνης να κινείται ενώ κάποιο άλλο θα είναι ακίνητο. Ακόμα λόγω της καθυστέρησης που παρατηρούμε μπορούμε να πούμε πως η διάχυση δεν είναι το κυρίαρχο φαινόμενο και άρα θα έχουμε αλληλεπιδράσεις πρόσδεσης με το υπόστρωμα. Στο κύτταρο 4-2 η διάχυση φαίνεται να έχει μεγαλύτερη συνεισφορά ενώ και το κινητό μέρος της πρωτεΐνης έχει μεγαλώσει. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρούμε και από τις άλλες πρωτεΐνες ενώ το κύτταρο 3 βλέπουμε ότι έχει την πιο γρήγορη επαναφορά και το μεγαλύτερο κινητό μέρος που σημαίνει ότι έχει και τις λιγότερες αλληλεπιδράσεις πρόσδεσης και άρα πιο έντονα φαινόμενα διάχυσης από τα υπόλοιπα κύτταρα. [62]

Αυτά είναι κάποια από τα συμπεράσματα που μπορούμε να βγάλουμε με μια πρώτη εκτίμηση της μορφής των καμπυλών επαναφοράς. Για να είμαστε σε θέση να βγάλουμε πιο σωστά και τεκμηριωμένα συμπεράσματα πρέπει να προχωρήσουμε στη τεχνική ταιριάσματος καμπύλης και στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων προκειμένου να εκτιμήσουμε την ορθότητα και τη αξιοπιστία του ντετερμινιστικού μοντέλου που αναπτύξαμε. 5.3 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΑΙΡΙΑΣΜΑΤΟΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ Για να έχουμε όσο το δυνατόν καλύτερα τεκμηριωμένα αποτελέσματα και για να είμαστε σίγουροι για την ορθότητα τους πρέπει να προχωρήσουμε στην τεχνική ταιριάσματος καμπύλης (curve fitting). Για τη μέθοδο των μη γραμμικών ελάχιστων τετραγώνων που χρησιμοποιήσαμε χρειάζονται κάποιοι δείκτες που εξηγούν πόσο επιτυχημένο ήταν το ταίριασμα της καμπύλης. Οι δείκτες αυτοί είναι οι παρακάτω: Το SSE είναι το άθροισμα των τετραγώνων λόγω σφάλματος και τιμές κοντά στο μηδέν δείχνουν ότι το μοντέλο έχει μικρές συνιστώσες τυχαίου σφάλματος και άρα το ταίριασμα είναι πιο χρήσιμο για πρόβλεψη. Το SSE είναι η τετραγωνική διαφορά ανάμεσα σε κάθε παρατήρηση και τη μέση τιμή.[32-33] Το R-square είναι ένα μέτρο του πόσο επιτυχές είναι το ταίριασμα στην εξήγηση της διακύμανσης των δεδομένων. Δηλαδή το R-square είναι το τετράγωνο της συσχέτισης ανάμεσα στις τιμές απόκρισης και στις προβλεπόμενες τιμές απόκρισης. Παίρνει τιμές από μηδέν μέχρι ένα και μια τιμή κοντά στο ένα υποδεικνύει ότι ένα μεγαλύτερο ποσοστό διακύμανσης υπολογίζεται από το μοντέλο.[31-32] Στη συνέχεια έχουμε το adjusted r-square που είναι το παραπάνω μέτρο ρυθμιζόμενο με βάση τους βαθμούς ελευθερίας των υπολοίπων που είναι ο αριθμός των τιμών απόκρισης n μείον τους αριθμούς των ταιριασμένων συντελεστών m όπως υπολογίζονται από τις τιμές απόκρισης ν=n-m όπου ο ν υποδεικνύει τον αριθμό των ανεξάρτητων κομματιών πληροφορίας που περιλαμβάνουν n σημεία δεδομένων τα οποία απαιτούνται για τον υπολογισμό του αθροίσματος τετραγώνων. Παίρνει τιμές μικρότερες ή ίσες της μονάδας και όσο η τιμή πλησιάζει το ένα τόσο καλύτερο είναι το ταίριασμα, ενώ αρνητικές τιμές δείχνουν ότι το μοντέλο περιέχει όρους που δε βοηθούν στη πρόβλεψη της απόκρισης.[30-32] [63]

Το RMSE είναι η ρίζα του μέσου τετραγωνικού σφάλματος και υπολογίζει την τυπική απόκλιση του τυχαίου όρου στα δεδομένα και υπολογίζεται από τη σχέση RMSE=s= MSE όπου MSE είναι το μέσο τετραγωνικό σφάλμα MSE = SSE ν και αυτό όπως και το SSE μια τιμή κοντά στο μηδέν δείχνει ότι το ταίριασμα είναι κατάλληλο για πρόβλεψη. [30-31] Επίσης έχουμε και το διάγραμμα των υπολοίπων που μας δείχνει και αυτό το πόσο καλό είναι το ταίριασμα των δεδομένων με την καμπύλη. Τα υπόλοιπα μιας παρατηρούμενης τιμής είναι η διαφορά ανάμεσα στην παρατηρούμενη τιμή και την εκτιμώμενη τιμή της ποσότητας που μας ενδιαφέρει δηλαδή της έντασης. Θετικές τιμές των υπολοίπων υποδεικνύουν ότι η πρόβλεψη ήταν χαμηλή ενώ οι αρνητικές τιμές δείχνουν ότι η πρόβλεψη ήταν μεγάλη. Μια συμμετρική κατανομή των υπολοίπων γύρω από το μηδέν δείχνει ότι το μοντέλο περιγράφει αρκετά καλά τα δεδομένα και η συγκέντρωση σε χαμηλές τιμές στον άξονα y καθώς και η ανυπαρξία μοτίβου στην κατανομή τους επίσης δείχνουν ότι έχουμε καλές προβλέψεις.[32-33] Εικόνα 19 Ακτίνη κύτταρο 3 [64]