ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΩΑΝΝΑ-ΑΓΓΕΛΙΚΗ Μ. ΣΙΓΑΛΑ ΧΗΜΙΚΟΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΩΑΝΝΑ-ΑΓΓΕΛΙΚΗ Μ. ΣΙΓΑΛΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ SRPK1 ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΙΚΡΟΜΟΡΙΑΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2018

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΩΑΝΝΑ-ΑΓΓΕΛΙΚΗ Μ. ΣΙΓΑΛΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ SRPK1 ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΙΚΡΟΜΟΡΙΑΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, Τομέας Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας, του Τμήματος Χημείας Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αν. Καθ. ΕΛΕΝΗ ΝΙΚΟΛΑΚΑΚΗ Καθ. ΘΕΟΔΩΡΑ ΧΟΛΗ-ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας, Α.Π.Θ. (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής), Τμήμα Χημείας, Α.Π.Θ. Αν. Καθ. ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΚΩΤΟΥΛΑ-ΔΗΜΗΤΡΙΑΔΟΥ (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής), Τμήμα Ιατρικής, Α.Π.Θ. Αν. Καθ. ΕΛΕΝΗ ΓΕΩΡΓΑΤΣΟΥ Αν. Καθ. ΘΩΜΑΣ ΓΙΑΝΝΑΚΟΥΡΟΣ Αν. Καθ. ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΠΑΝΤΑΖΑΚΗ Επ. Καθ. ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΣΑΡΛΗ (Τμήμα Ιατρικής, Παν. Θεσσαλίας) (Τμήμα Χημείας του Α.Π.Θ.) (Τμήμα Χημείας του Α.Π.Θ.) (Τμήμα Χημείας του Α.Π.Θ.)

Ιωάννα-Αγγελική Μ. Σιγάλα Α.Π.Θ. Μελέτη του βιολογικού ρόλου της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1 και έλεγχος της λειτουργικότητάς της υπό την επίδραση μικρομοριακών ενώσεων ISBN «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Ν.5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2).

Η παρούσα διδακτορική διατριβή χρηματοδοτήθηκε μερικώς από τη δράση εθνικής εμβέλειας «Διμερείς, πολυμερείς και περιφερειακές Ε & Τ συνεργασίες», Επιχειρησιακό Πρόγραμμα «Ανταγωνιστικότητα και Επιχειρηματικότητα» (ΕΠΑΝ-ΙΙ), Άξονας Προτεραιότητας (Α.Π.) 1 «Δημιουργία και Αξιοποίηση της Καινοτομίας Υποστηριζόμενης από Έρευνα και Τεχνολογική Ανάπτυξη» και από τα Περιφερειακά Επιχειρησιακά Προγράμματα (ΠΕΠ) των 5 Περιφερειών μεταβατικής στήριξης του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) 2007 2013.

Α ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος... 1 Συντμήσεις... 5 Σκοπός... 11 Α Εισαγωγή... 13 A.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης... 13 Α.1.1. Γενικά... 13 Α.1.2. Ιστορικό ανακάλυψης μελών της οικογένειας των SRPKs... 13 Α.1.3. Εξέλιξη της οικογένειας κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης... 17 Α.1.4. Έκφραση των SRPKs στους διάφορους ιστούς... 18 Α.1.5. Δομικά χαρακτηριστικά των SRPKs... 19 Α.1.6. Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/ αργινίνης.... 22 Α.1.7. Μηχανισμοί ρύθμισης της δραστικότητας της οικογένειας των SRPKs... 26 Α.1.8. Εξειδίκευση των SRPKs απέναντι στα υποστρώματά τους... 30 Α.1.9. Υποστρώματα και βιολογικές λειτουργίες των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης... 31 Α.1.9.1. Ρόλος των SRPKs στην ωρίμανση του πρόδρομου mrna.... 31 Α.1.9.2. Ρόλος των SRPKs στη σπερμιογένεση... 36 Α.1.9.3. Ρόλος των SRPKs στον κυτταρικό κύκλο και την αναδιοργάνωση της χρωματίνης.... 38 Α.1.10. Μηχανισμός φωσφορυλίωσης των υποστρωμάτων των SRPKs... 41 Α.2. Μικρομοριακοί αναστολείς των SRPKs... 46 Α.2.1. Γενικά... 46 Α.2.2. Αναστολείς των SRPKs... 46 A.3. SRPKs και ο ρόλος τους στον καρκίνο... 50 Α.3.1. Έκφραση και ρόλος των SRPKs σε διάφορους καρκίνους... 50 Α.3.1.1. Ουρογεννητικό... 51 Α.3.1.2. Γαστρεντερικό... 54 Α.3.1.3. Πνεύμονας... 58 Α.3.1.4. Σκελετικός μυς... 59 Α.3.1.5. Καρκίνος του μαστού... 60 Α.3.1.6. Καρκίνος κεφαλής-τραχήλου... 61 Α.3.1.7. Αιμοποιητικό... 62 Α.3.1.8. Δέρμα... 62 Α.3.1.9. Μάτι... 63 Α.3.2. Σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκονται οι SRPKs στον καρκίνο... 67 Α.3.2.1. Σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία εμπλέκονται οι SRPKs στον καρκίνο μέσο του SRSF1 παράγοντα ματίσματος.... 67 Α.3.2.2. Ο ρόλος της SRPK1 στο φαινότυπο των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (cancer stem cells-cscs)... 74 Α.3.3. Θεραπεία... 77

Α.4. Γλοιώματα... 79 Α.4.1. Στοιχεία ιστολογίας του νευρικού ιστού... 79 Α.4.2. Γλοιώματα... 80 Α.4.3. Ταξινόμηση των νεοπλασμάτων του κεντρικού νευρικού συστήματος... 81 Α.4.4. Επιδημιολογικά στοιχεία των γλοιωμάτων... 82 Α.5. Γλοιοβλάστωμα... 84 Α.5.1. Γενικά... 84 Α.5.2. Ιστοπαθολογικά στοιχεία... 84 Α.5.3. Συμπτώματα... 85 Α.5.4. Κυτταρική προέλευση... 85 Α.5.5. Γενετικές μεταλλάξεις... 85 Α.5.6. Σηματοδοτικά μονοπάτια στο γλοιοβλάστωμα... 88 Α.5.7. Θεραπεία... 92 Β Υλικά και Μέθοδοι... 96 B.1. Υλικά... 96 B.1.1. Χημικά αντιδραστήρια, αναλώσιμα και υλικά χρωματογραφίας... 96 B.1.2. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας... 97 B.1.3. Κυτταρικές σειρές... 99 Β.2. Μέθοδοι... 99 Β.2.1. Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων... 99 Β.2.2. Παρασκευή επιδεκτικών για μετασχηματισμό κυττάρων (competent cells)... 101 B.2.3. Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (transformation)... 101 B.2.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση... 102 B.2.5. Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το kit Hipure Plasmid Midiprep της εταιρείας Invitrogen... 103 B.2.6. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 104 B.2.7. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς... 106 B.2.8. Πέψη με ένζυμα περιορισμού... 106 B.2.9. Ηλεκτροφόρηση μορίων DNA σε πηκτές αγαρόζης... 107 B.2.10. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της συγκέντρωσης νουκλεϊνικών οξέων... 108 B.2.11. Σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο της SRPK1... 110 B.2.12. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST)... 110 B.2.13. Ανίχνευση δράσης κινάσης πρωτεϊνών με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους... 112 B.2.14. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250... 113 B.2.15. Αυτοραδιογραφία... 113 B.2.16. Κλινικά και παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών... 114 B.2.17. Ανοσοϊστοχημεία... 115 B.2.18. Στατιστική ανάλυση... 116 B.2.19. Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων... 117 B.2.20. Απομόνωση συνολικού RNA από κύτταρα... 118 B.2.21. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)... 118

B.2.22. Αναστολή της έκφρασης της SRPK1 με shrnas... 121 B.2.23. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη χρήση του kit XfectTM Transfection Reagent της εταιρείας Clontech... 123 B.2.24. Παρασκευή εκχυλισμάτων από ευκαρυωτικά καρκινικά κύτταρα... 125 B.2.25. Φωτομετρικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με την μέθοδο Bradford... 126 B.2.26. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE)... 126 B.2.27. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western blot)... 129 B.2.28. Ανοσοανίχνευση... 130 B.2.29. Έμμεσος ανοσοφθορισμός... 131 B.2.30. Χρωματομετρική μέθοδος ΜΤΤ... 132 B.2.31. Δοκιμή in vivo ματίσματος (In vivo splicing assay)... 134 B.2.32. Λογισμικά... 134 Γ Αποτελέσματα... 137 Γ.1. Μελέτη της κατανομής της SRPK1 στο φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο και σε ιστούς με γλοιοβλάστωμα. Συσχέτιση των επιπέδων έκφρασής της με τη βιωσιμότητα γλοιωματικών κυτταρικών σειρών και με την ευαισθησία τους σε χημειοθεραπευτικά... 137 Γ.1.1. Ανοσοϊστοχημική μελέτη της κατανομής της SRPK1 στο φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο... 137 Γ.1.2. Ανοσοϊστοχημική μελέτη της κατανομής της SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα... 140 Γ.1.3. Συσχέτιση ανάμεσα στην επιβίωση των ασθενών με γλοιοβλάστωμα και στα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 και τον βαθμό εκτομής του όγκου... 142 Γ.1.4. Μελέτη της έκφρασης και της υποκυτταρικής κατανομής της SRPK1 σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος... 143 Γ.1.5. Μελέτη της μείωσης των επιπέδων έκφρασης της SRPK1 στη βιωσιμότητα κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος... 146 Γ.1.6. Επίδραση της μείωσης των επίπεδων έκφρασης της SRPK1 στην ευαισθησία κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος σε χημειοθεραπευτικές ουσίες... 148 Γ.1.7. Έλεγχος επίδρασης της μείωσης των επίπεδων έκφρασης της SRPK1 στην ευαισθησία κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος στην τεμοζολομίδη... 153 Γ.2. Έλεγχος νέων μικρομοριακών ενώσεων ως πιθανοί αναστολείς της δράσης της SRPK1 Μελέτη του βιολογικού ρόλου της λυναμικίνης D... 158 Γ.2.1. Έλεγχος επίδρασης μικρομοριακών ενώσεων στη δραστικότητα της SRPK1... 158 Γ.2.2. Σύνθεση του αντιμικροβιακού φυσικού προϊόντος λυναμικίνη D... 162 Γ.2.3. Έλεγχος επίδρασης λυναμικίνης D στη βιωσιμότητα διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών... 164 Γ.2.4. Μελέτη της επίδρασης της λυναμικίνης D στο in vivo μάτισμα γονιδίων αναφοράς... 165 Γ.2.5. Έλεγχος επίδρασης της λυναμικίνης D στη δραστικότητα της SRPK1... 171 Γ.2.6. Μελέτη της επίδρασης της λυναμικίνης D στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές... 172 Γ.2.7. Έλεγχος επίδρασης λυναμικίνης D στην έκφραση της SRPK1... 173 Γ.3. Γ.3.1. Γ.3.2. Μελέτη των μοριακών μηχανισμών οι οποίοι ρυθμίζουν την υποκυτταρική κατανομή της SRPK1... 176 Διερεύνηση της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1 υπό την επίδραση στρεσογόνων παραγόντων... 176 Ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης ιστόνης γ-h2ax μετά από επίδραση στρεσογόνων παραγόντων... 178

Γ.3.3. Μελέτη του ρόλου την συνδετικής περιοχής του μορίου της SRPK1 στην υποκυτταρική εντόπισή της... 181 Γ.3.4. Έλεγχος της πρωτεϊνικής έκφρασης της SRPK1 υπό την επίδραση 5-FU και H2O2... 182 Γ.3.5. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων SRPK1-326Α, SRPK1-408Α και SRPK1-326Α/408Α υπό την επίδραση H2O2... 184 Γ.3.6. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων SRPK1-326D, SRPK1-408D και SRPK1-326D/408D υπό την επίδραση H2O2... 185 Γ.3.7. Εύρεση πιθανών θέσεων ουβικιτίνωσης στο μόριο της SRPK1... 187 Γ.3.8. Σημειακή μετάλλαξη των λυσινών 329 και 377 του μορίου της SRPK1 σε αργινίνες και έλεγχος έκφρασης των μεταλλαγμάτων... 190 Γ.3.9. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων SRPK1-329R και SRPK1-377R υπό την επίδραση H2O2... 191 Δ Συζήτηση Αποτελεσμάτων... 193 Περίληψη... 205 Summary... 209 Δημοσιεύσεις... 212 Βιβλιογραφία... 213

Α ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, από τον Μάρτιο του 2013 έως τον Σεπτέμβριο του 2017, υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κα Ελένης Νικολακάκη. Αντικείμενο της έρευνας αποτέλεσε η μελέτη του βιολογικού της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα, ο έλεγχος της λειτουργικότητάς της υπό την επίδραση νεοσυντιθέμενων οργανικών ενώσεων, όπως επίσης και η συνέχιση της μελέτης των μοριακών μηχανισμών οι οποίοι ρυθμίζουν την υποκυτταρική κατανομή της. Μετά την ολοκλήρωση αυτής της πορείας θα ήθελα καταρχήν να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα μου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Ελένη Νικολακάκη, για την εμπιστοσύνη την οποία επέδειξε στο πρόσωπό μου αναθέτοντάς μου το θέμα αλλά και για τη συνεχή και άμεση καθοδήγησή της σε κάθε βήμα της διατριβής, από τον σχεδιασμό των πειραμάτων μέχρι την τελική διόρθωση της εργασίας. Το όφελος το οποίο αποκόμισα από τη συνεργασία μας είναι τεράστιο, καθώς μου ενέπνευσε την αγάπη και το πάθος της για την πειραματική έρευνα στο αντικείμενο της Βιοχημείας. Σε αυτήν οφείλω τη γνώση της πλειοψηφίας των τεχνικών τις οποίες αποκόμισα κατά τη διάρκεια της παρούσας διατριβής και κυρίως των μεθόδων Μοριακής Βιολογίας και το χειρισμό των κυτταροκαλλιεργείων. Παράλληλα όμως, θέλω να δώσω και προσωπικές ευχαριστίες, καθώς πιστεύω πως η επιστημονική/ επαγγελματική διάσταση του ανθρώπου δεν πρέπει να υπερβαίνει την ανθρώπινη και η Ελένη Νικολακάκη είναι ένας άνθρωπος ο οποίος με στήριξε βαθύτατα σε όλες τις αγχώδεις καταστάσεις μου και αποτέλεσε πρότυπο στάσης ζωής για μένα για την γενναιοδωρία της, τον σεβασμό της προσωπικότητας των συνεργατών της και την ανεξάντλητη ενέργειά της. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στην Καθηγήτρια κα Θεοδώρα Χολή- Παπαδοπούλου και στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Βασιλική Κωτούλα- Δημητριάδου, μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για την εξαίρετη 1

συνεργασία μας, καθώς και τις πολύτιμες υποδείξεις τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Θωμά Γιαννακούρο για τις πολύτιμες γνώσεις τις οποίες μου προσέφερε σε θεωρητικό επίπεδο αλλά και σε επίπεδο εργαστηριακών βιοχημικών τεχνικών. Με χαρισματική μεταδοτικότητά με έφερε πιο κοντά στη βιολογία του κυττάρου και την λειτουργία των βιολογικών μακρομορίων. Δημιούργησε το κατάλληλο περιβάλλον για εποικοδομητικό διάλογο και αμφίπλευρη δημιουργική κριτική της δουλείας μας, σημαντικά εργαλεία ομαδικότητας και επιστημονικής σκέψης. Ευχαριστώ επίσης θερμά τις Αναπληρώτριες Καθηγήτριες κα Αναστασία Πανταζάκη και κα Ελένη Γεωργάτσου, μέλη της εξεταστικής επιτροπής, για τις εύστοχες υποδείξεις τους και το χρόνο τον οποίο αφιέρωσαν για τη διόρθωση της διατριβής. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια Βασιλική Σαρλή για την δυνατότητα την οποία μου έδωσε να συνεργαστώ με την ερευνητική της ομάδα και να αποκτήσω εμπειρία στην μελέτη του βιολογικού ρόλου οργανικών ουσιών. Στην πρώτη ενότητα της διατριβής μου, συνέβαλε πολύ η συνεργασία και η βοήθεια του γιατρού και ερευνητή Κώστα Τσάμη, καθώς εκτέλεσε τις μελέτες ανοσοϊστοχημείας και τον ευχαριστώ θερμά. Ευχαριστίες επίσης οφείλω στο Εργαστήριο Ανατομίας και Ιστολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ, για την παραχώρηση του συνεστιακού μικροσκοπίου απαραίτητο εργαλείο για τη μελέτη και τη λήψη φωτογραφιών των δοκιμασιών έμμεσου ανοσοφθορισμού. Παράλληλα ευχαριστώ και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Εμμανουήλ Παντερή του Τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ., για τη βοήθεια στη λήψη φωτογραφιών στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Τα λόγια και οι ευχαριστίες όμως δε θα μπορούσαν να αποτυπώσουν την σχέση την οποία απέκτησα με τη διδάκτορα Μαρία Κουτρουμάνη, με την οποία μοιραστήκαμε κοινές ανάγκες και δυσκολίες. Η Μαρία, παράδειγμα υπομονής, εργατικότητας και αισιοδοξίας, όλα αυτά τα χρόνια έκανε τη ζωή 2

μου στο εργαστήριο πολύ πιο ευχάριστη. Της οφείλω ευχαριστώ και για τη βοήθειά της στις εργαστηριακές μεθόδους και πρακτικές τις οποίες μου μετέδωσε, ειδικότερα στα πρώτα χρόνια μου στο εργαστήριο. Παράλληλα ευχαριστώ την υποψήφια διδάκτορα Αναστασία Κουκιάλη, μέλος της ερευνητικής μας ομάδας για την θερμή συνύπαρξη, όπως επίσης και τους διδάκτορες του εργαστηρίου μας Μακρίνα Δανιηλίδου, Πέτρο Κεχαγιόγλου, Στέλιο Καρούλια και Κατερίνα Βελάλη για τη συνεργασία και την πολύπλευρη βοήθειά τους. Ευχαριστίες οφείλω και στους υπόλοιπους υποψήφιους διδάκτορες αλλά και σε όλο το προσωπικό του εργαστηρίου Βιοχημείας για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον σύντροφό μου Παναγιώτη για την υπομονή, την αγάπη και τη συνεχή ενθάρρυνσή του, όπως και την Αλεξάνδρα και τους υπόλοιπους φίλους μου για την συμπαράστασή τους. Επίσης, ευχαριστώ πολύ θερμά και την οικογένειά μου, τη μητέρα μου, τον πατέρα μου, την Χρύσα και τον Σπύρο, οι οποίοι με στηρίζουν σε κάθε επίπεδο και σε κάθε απόφασή μου. 3

4

Α ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 5-FU: 5 -Fluorouracil A549: Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells ADP: Adenosine diphosphate Aha1: Human Activator of Hsp90 ATPase protein 1 Akt: PKB APS: Ammonium persulfate ASF/SF2: SRSF1 ATP: Adenosine triphosphate Bax: Bcl-2-like protein 4 BCIP: Bromo-chloro-indolyl phosphate BCL2: B-cell lymphoma 2 CDK: Cyclin-dependent kinase CDKN2A: Cyclin-dependent kinase Inhibitor 2A cdna: Complementary DNA CeSF2: C.elegans ASF/SF2 ortholog CK2: Casein kinase 2 DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole DMEM: Dulbecco s Modified Eagle s Medium DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid dntps: Deoxynucleotide triphosphates DSBs: DNA double strand breaks DSS: Distal splice site DTT: Dithiothreitol DUSP6: Dual specificity phosphatase 6 EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EGF: Epidermal Growth Factor EGFR: Epidermal growth factor receptor EMT: Epithelial to mesenchymal transition 5

FA: Formaldehyde FBS: Fetal bovine serum FDA: Federal Food and Drug Administration FSG: Fish skin gelatin GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GBM: glioblastoma (multiforme) GSK3: Glycogen synthase kinase-3 GST: Glutathione S-transferase GTP: Guanosine triphosphate H2AX: Histone H2A, member X H3: Histone H3 HDAC6: Histone deacetylase 6 HeLa: Human cervical adenocarcinoma cells Hepes: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HP1: Heterochromatin Protein 1 Hsp40: 40 kilodalton heat shock protein Hsp70: 70 kilodalton heat shock protein Hsp90: 90 kilodalton heat shock protein IC50: Half maximal inhibitory concentration IGF-1: Insulin growth factor 1 IgG: Immunoglobulin G IR: insulin receptor KD: Kinase domain Km: Michaelis constant LB: Luria-Bertani LBR: Lamin B Receptor Lys: Lysine MAPK: Mitogen-activated protein kinase MCL1: Myeloid cell leukemia 1 MDM2/4: Mouse double minute 2/4 homolog MEF2: Myocyte enhancer factor 2 MGMT: O-6-methylguanine-DNA methyltransferase mir: Micro RNAs M-MLV RT: Reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus 6

MOPS: 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid mrna: Messenger RNA mtor: Mammalian target of rapamycin MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NBT: Nitro blue tetrazolium NES: Nuclear Export Signal NF1: Neurofibromatosis type I Nlp3p: SR-like protein substrate NSCs: Neural stem cells P1: Protamine 1 p53: Tumor suppressor protein PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis PBS: Phosphate-buffered saline PCR: Polymerase chain reaction PDGFR: Platelet-Derived Growth Factor Receptor PFA: Paraformaldehyde PH: Pleckstrin homology PHLPP: PH domain leucine rich repeat phosphatase PI: Propidium iodide PIP2: Phosphatidylinositol (3,4) diphosphate PIP3: Phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate PKB: Protein kinase B PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride PP2A: Protein phosphatase 2A PSS: proximal splice site PTEN: Phosphatase and tensin homolog PΙ3Κ: Phosphatidylinositol-3-kinase, Rac1: Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Rb1: retinoblastoma protein 1 RNA: Ribonucleic acid RNAi: RNA interference RNase: Ribonuclease RNA-seq: RNA sequencing 7

RPKM: RPL17: RRM: RTK: RT-PCR: SAFB1: SC35: SDS: Ser: sirna: Sk-16a: Sk-18a: Sk-19a: Sk-21a: Sk-22a: Sk-23a: Sk-24a: Sk-25a: Sk-26a: Sk-27a: Sk-28a: Sk-31a: reads per kilo base per million mapped reads Ribosomal protein L17 RNA recognition motif Receptor Tyrosine Kinase Reverse transcription-polymerase chain reaction Scaffold attachment factor B1 SRSF2 Sodium dodecyl sulfate Serine Small interfering RNA N-(4-methoxyphenyl)-4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole-2 carboxamide N-(4-acetylphenyl)-4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole-2- carboxamide N-(3-cyanophenyl)-4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole-2- carboxamide N-(4-methoxyphenyl)-4,5-dimethyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole- 2-carboxamide 4,5-dimethyl-N,1-diphenyl-1H-imidazole-2-carboxamide 4,5-dimethyl-N-phenyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2- carboxamide N-(4-acetylphenyl)-4,5-dimethyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2- carboxamide N-(1H-indazol-5-yl)-4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole-2- carboxamide N-(1H-indazol-5-yl)-4,5-dimethyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2- carboxamide 4,5-dimethyl-1-phenyl-N-(pyridin-2-yl)-1H-imidazole-2- carboxamide 4,5-dimethyl-N-(pyridin-2-yl)-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2- carboxamide N-(3-cyanophenyl)-4,5-dimethyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2- carboxamide 8

Sk-32a: N-(4-methoxyphenyl)-4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole- 2-carboxamide Sk-33a: N-(1H-indazol-5-yl)-4,5-dimethyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2- carboxamide Sk-34a: N-(1H-indazol-5-yl)-4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole-2- carboxamide Sk-7d: methyl 4,5-dimethyl-1-phenyl-1H-imidazole-2-carboxylate Sk-8c: methyl 4,5-dimethyl-1-(p-tolyl)-1H-imidazole-2-carboxylate SMN2: survival motor neuron 2 SOC: Super optimal broth SPHINX: (5-methyl-N-[2-(morpholin-4-yl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]furan-2-carboxamide) SR: Serine Arginine SR2: transportin-sr2 SRp20: Serine/arginine-rich splicing factor 3 SRPIN340: N-[2-(1-Piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4 pyridine carboxamide SRPKs: Serine/arginine protein kinases SRSF1: Serine/arginine-rich splicing factor 1 SRSF2: Serine/arginine-rich splicing factor 2 T98G: human glioblastoma tumor cells TCf: T-cell factor TCGA: The Cancer Genome Atlas TEMED: Tetramethylethylenediamine TERT: Telomerase reverse transcriptase TGF: Transforming growth factor Tip60: Histone acetyltransferase Tip60 Tra2β1: Splicing Factor Transformer-2β 1 U251MG: human glioblastoma tumor cells U87MG: human glioblastoma tumor cells VEGF: Vascular endothelial growth factor WHO: World Health Organization Βλ.: Βλέπε 9

10

Α ΣΚΟΠΟΣ Η διδακτορική διατριβή κινήθηκε σε τρεις άξονες: Ο πρώτος άξονας αφορούσε τον έλεγχο του βιολογικού ρόλου της SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα. Αρχικά ελέγχθηκε η έκφραση της SRPK1 στο επίπεδο του ιστού αλλά και σε καρκινικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος ενώ στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της αναστολής της κινάσης στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε συνδυασμό και με διάφορα χημειοθεραπευτικά. Ο δεύτερος άξονας αφορούσε την επίδραση μικρομοριακών οργανικών ενώσεων, τις οποίες συνέθεσε η ερευνητική ομάδα της επίκουρης καθηγήτριας Βασιλικής Σαρλή του Εργαστηρίου Οργανικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, στα επίπεδα έκφρασης και τη δραστικότητα της SRPK1. Στα πλαίσια των πειραμάτων του δεύτερου αυτού άξονα μελετήθηκε και ο ρόλος της λυναμικίνης D, μιας φυσικά προερχόμενης, μικρού μοριακού βάρους ένωσης η οποία συντέθηκε εργαστηριακά από την ομάδα της Β. Σαρλή, στο ιδιοσύστατο και εναλλακτικό μάτισμα και η αλληλεπίδρασή της με την SRPK1. Ο τρίτος άξονας αφορούσε τη περαιτέρω διαλεύκανση του μοριακού μηχανισμού ο οποίος ρυθμίζει την υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1. Επιβεβαιώθηκε ο καθοριστικός ρόλος της φωσφορυλίωσης στη μετατόπισή της στον πυρήνα υπό την επίδραση γενοτοξικών παραγόντων οι οποίοι προκαλούν δίκλωνα σπασίματα στο DNA, ενώ παράλληλα ελέγχθηκε και ο πιθανός ρόλος της ουβικιτίνωσης δύο λυσινών στη συνδετική περιοχή της κινάσης. 11

12

Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Α.1.1. Γενικά Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases- SRPKs) ανήκουν στην οικογένεια κινασών σερίνης/θρεονίνης. Οι κινάσες αυτές αναγνωρίζουν στα υποστρώματά τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια σερίνης/αργινίνης και τα τροποποιούν φωσφορυλιώνοντας σερίνες (Giannakouros et al. 2011). Διατηρούν συνεχώς την ενεργή τους διαμόρφωση χωρίς να απαιτούν μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις για να καταλύσουν την προσθήκη της φωσφορικής ομάδας στα υποστρώματά τους (Ngo et al. 2007). Ο κυριότερος βιολογικός τους ρόλος είναι η ρύθμιση του ματίσματος του πρόδρομου mrna. Τα μέλη της οικογένειας των SRPKs είναι διατηρημένα εξελικτικά και μπορούμε να τα εντοπίσουμε από τη ζύμη μέχρι τον άνθρωπο (Kuroyanagi et al. 2000; Siebel et al. 1999; Takeuchi and Yanagida 1993; Wang et al. 1998). Στο παρακάτω θεωρητικό μέρος θα αναπτυχθούν κάποια βασικά γνωρίσματα των μελών αυτής της οικογένειας κινασών, όπως η εντόπισή τους στους διάφορους ιστούς και η κατανομή τους στο κύτταρο, τα δομικά τους χαρακτηριστικά, ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η δράση τους καθώς και τα υποστρώματα στόχοι τους, αλλά και ο μηχανισμός με τον οποίο τα τροποποιούν. Α.1.2. Ιστορικό ανακάλυψης μελών της οικογένειας των SRPKs Το 1994 κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά η SRPK1 από HeLa κύτταρα (J.-F. F. Gui et al. 1994; J.-F. Gui, Lane, and Fu 1994). Το γονίδιό της βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 (θέση 6p21.2-p21.3) (Wang et al. 1999). Ο όρος SR αποδόθηκε σε αυτήν την κινάση, όπως και στην ευρύτερη οικογένεια, καθώς απομονώθηκε κατά τη διάρκεια πειραμάτων για την εύρεση 13

των υπεύθυνων κινασών για τη φωσφορυλίωση των μελών της οικογένειας των SR παραγόντων ματίσματος όπως ο SRSF1 (ASF/SF2) και ο SRSF2 (SC35). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η SRPK1 επάγει την αποσυναρμολόγηση των πυρηνικών σωματίων (nuclear speckles) και ότι μεγάλες ποσότητές της αναστέλλουν το μάτισμα in vitro. Μετά από έρευνα σε βάσεις δεδομένων νουκλεοτιδικών ακολουθιών για την SRPK1 βρέθηκε ότι εμφάνιζε μεγάλη ομολογία με την μερικώς χαρακτηρισμένη κινάση Dsk1, η οποία είχε κλωνοποιηθεί το 1993 (J.-F. Gui et al. 1994). Κατά τη νουκλεοτιδική σύγκριση βρέθηκε επίσης μια περιοχή και στα δύο μόρια η οποία διακόπτει την καταλυτική περιοχή των κινασών σε δύο δομικές οντότητες και ονομάστηκε συνδετική περιοχή (spacer domain) η οποία είναι χαρακτηριστική για τις SR κινάσες. Η Dsk1, του ζυμομύκητα Schizosaccharomyces pombe, χαρακτηρίστηκε ως μια κινάση της οποίας το μοτίβο φωσφορυλίωσης και η υποκυτταρική της εντόπιση εξαρτώνται από τον κυτταρικό κύκλο (Giannakouros et al. 2011; Takeuchi and Yanagida 1993). Το 1998 δημοσιεύτηκε η κλωνοποίηση του γονιδίου της SRPK2 στον άνθρωπο (Wang et al. 1998) και σχεδόν παράλληλα και στο ποντίκι (Kuroyanagi et al. 1998) με τα γονίδιά τους να βρίσκονται στο χρωμόσωμα 7 (θέση 7q22-q31.1) και στο χρωμόσωμα 5 (θέση 5 9.0 cm) αντίστοιχα (Wang et al. 1999). Η SRPK2 εμφάνισε μεγάλη νουκλεοτιδική ομολογία ως προς την SRPK1, παρόμοια δραστικότητα SR κινάσης και εξειδίκευση στα υποστρώματά της. Επίσης, έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με τον προ-αποπτωτικό παράγοντα acinus, ο οποίος διαθέτει μια περιοχή πλούσια σε διπεπτίδια σερίνης/αργινίνης (Jang et al. 2008). Λόγω της έλλειψης εναλλακτικού ματίσματος στον Saccharomyces cerevisiae είχε προβλεφθεί η απουσία μελών των SRPKs στον ζαχαρομύκητα. Το 1999 όμως, ο Siebel και οι συνεργάτες του, δημοσίευσαν δομικές και βιοχημικές ενδείξεις οι οποίες καταδεικνύουν την Sky1 ως μια πρωτεϊνική SR κινάση. Βρέθηκε πως μπορεί να φωσφορυλιώνει SR παράγοντες ματίσματος των θηλαστικών in vivo (J. M. M. Yeakley et al. 1999) αλλά και SR ομοιάζουσες πρωτεΐνες των SRPKs στο S. Cerevisiae, όπως η Npl3p, οι οποίες εμπλέκονται στην έξοδο του mrna από τον πυρήνα (Siebel et al. 1999). 14

Το 2000 κλωνοποιήθηκε η SPK-1 του Caenorhabditis elegans η οποία εμφάνισε μεγάλη ομολογία με την SRPK1 και παρόμοια δράση κινάσης. Επίσης βρέθηκε ότι το νηματώδες σκουλήκι διαθέτει και εκφράζει γονίδια της οικογένειας των SR πρωτεϊνών όπως ο CeSF2 (μεγάλη ομολογία ως προς τον SRSF1). Πειράματα RΝA παρεμβολής ανέδειξαν ότι η SPK-1 (και ο CeSF2) παίζει σημαντικό ρόλο στα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης αυτού του οργανισμού (Kuroyanagi et al. 2000). Επτά χρόνια μετά την κλωνοποίηση της πρώτης ανθρώπινης SRPK, το 2001, κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε η SRPK1a, η οποία αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του μεταγράφου του γονιδίου της SRPK1. Το γονίδιο εντοπίζεται, όπως και αυτό της SRPK1, στο χρωμόσωμα 6 (θέση 6p21.2-p21.3) (Nikolakaki et al. 2001). Πιο συγκεκριμένα, κατά την κλωνοποίηση της SRPK1 απομονώθηκε ένας κλώνος ο οποίος περιείχε 513 ζεύγη βάσεων εμβόλιμα ανάμεσα στα 2 πρώτα εξόνια της SRPK1 (Σχήμα Α.1.1). Στα άκρα της εμβόλιμης ακολουθίας εντοπίστηκαν 5 και 3 περιοχές ματίσματος οι οποίες υποδεικνύουν ότι αυτή η ακολουθία της SRPK1a αντιστοιχεί σε ένα ιντρόνιο της SRPK1, το οποίο αν δεν εξαιρεθεί κατά τη διαδικασία του ματίσματος, μεταγράφεται η SRPK1a. Στην ίδια μελέτη ανιχνεύτηκε και η αντίστοιχη πρωτεΐνη στο αναμενόμενο μεγαλύτερο μοριακό βάρος λόγω των 171 επιπλέον αμινοξέων στην αμινο-τελική περιοχή. Οι δύο κινάσες εμφανίζουν ομοιότητες στην υποκυτταρική τους κατανομή και στην εξειδίκευση απέναντι στα υποστρώματά τους. Πειράματα σε σύστημα δύο υβριδίων της ζύμης έδειξαν την αλληλεπίδραση του αμινο-τελικού άκρου της SRPK1a με την πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1). Σε μεταγενέστερη δημοσίευση βρέθηκε ότι οι πρωτεΐνες SAFB είναι αναστολείς της δραστικότητας των SRPK1 και SRPK1a in vitro, εμπλέκοντας έτσι τις SRPKs στην υποπυρηνική οργάνωση και στη ρύθμιση της χρωματίνης (Tsianou et al. 2009). Το 2003 κλωνοποιήθηκε το πρώτο μέλος των SRPKs στα πρωτόζωα, η TcSRPK από τον οργανισμό Trypanosoma cruzi στον οποίο παρατηρείται cis και trans μάτισμα. Η κινάση αυτή εμφανίζει μεγάλη ομολογία ως προς τη λειτουργικότητα και την πρωτοταγή δομή της με τα υπόλοιπα μέλη των SRPKs (Portal et al. 2003). 15

Σχήμα Α.1.1. Σχηματική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος της SRPK1a. Α. Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τμήμα των 513 bp, το οποίο αποτελεί ιντρόνιο της SRPK1. Β. Σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας η οποία κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a με την ακολουθία την οποία κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. C. Η νουκεοτιδική ακολουθία η οποία περιβάλλει το τμήμα των 513 bp. D. Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος οι οποίες βρίσκονται στα όρια μεταξύ των εξoνίων 1a και 1b και του τμήματος των 513 bp (Nikolakaki et al. 2001). Το 2005, σε μια προσπάθεια να βρεθούν γονίδια στόχοι του μεταγραφικού παράγοντα MEF2 (myocyte enhancer factor 2) με μικροσυστοιχίες γονιδίων, ανακαλύφθηκε η SRPK3 του ποντικού, το γονίδιο της οποίας βρίσκεται στο χρωμόσωμα Χ (θέση X A7.3) (Nakagawa et al. 2005). Η μελέτη έδειξε ότι η κινάση εκφράζεται στον σκελετικό μυ και είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη και την ομοιόστασή του, καθώς 16

διαγονιδιακά ποντίκια από τα οποία τους έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της SRPK3 παρουσιάζουν κεντροπυρηνική μυοπάθεια. Εκφράζεται επίσης και στην καρδιά. Το 2010 κλωνοποιήθηκε η SRPK3 από τον χοίρο, η οποία εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό μυ όπως η αντίστοιχη κινάση του ποντικού, αλλά και στη μήτρα και τους όρχεις (Xu et al. 2011). Η ανθρώπινη SRPK3 κλωνοποιήθηκε το 2015 από κύτταρα μυοβλαστών και εκφράζεται επίσης στην καρδιά και το σκελετικό μυ (Zhang, Zhu, and Davie 2015). Στη Drosophila, ταυτοποιήθηκε το 2009 ένα ομόλογο της SRPK, η Srpk79D. Η κινάση αυτή εμπλέκεται στη διαδικασία της ανάπτυξης των συνάψεων των νευρώνων στο νευρικό σύστημα (Johnson, Fetter, and Davis 2009; Nieratschker et al. 2009). Το 2009 κλωνοποιήθηκε από τον οργανισμό Physarum polycephalum η PSRPK, η οποία εμφανίζει 56% ομολογία με την SRPK1 με τις ομόλογες ακολουθίες να βρίσκονται στις καταλυτικές περιοχές (Liu et al. 2009). Α.1.3. Εξέλιξη της οικογένειας κινασών πρωτεϊνών σερίνης/ αργινίνης Η κλωνοποίηση της κινάσης TcSRPK1 του πρωτοζώου Trypanosoma cruzi, στο οποίο παρατηρείται trans- και cis- μάτισμα, αποτελεί ένδειξη ότι ο γενικός μηχανισμός ελέγχου της επεξεργασίας του mrna στους ευκαρυώτες, αναπτύχθηκε νωρίς κατά την εξέλιξη (Portal et al. 2003). Τα ομόλογα γονίδια (αυτά τα οποία εκφράζονται αλλά και υποθετικά) των SRPKs σε διάφορους οργανισμούς τα οποία καταγράφονται στις βάσεις δεδομένων, είναι πλέον πάνω από χίλια. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι ο αριθμός των αντιγράφων των γονιδίων των SRPKs στο γονιδίωμα του κάθε οργανισμού δεν είναι ανάλογος με την εξελικτική τάξη στην οποία ανήκει (Giannakouros et al. 2011). Δηλαδή μπορεί να συναντήσουμε μύκητες με εννέα αντίγραφα και θηλαστικά, όπως ο άνθρωπος και το ποντίκι με τρία. Άρα πιθανώς τα γονίδια των SRPKs να υπόκεινται σε εξελικτική πίεση, η οποία απαιτεί την ύπαρξη πολλαπλών αντιγράφων σε κάθε νέο είδος το οποίο δημιουργείται. Η ύπαρξη ψευδογονιδίων (για παράδειγμα των SRPK1 και SRPK2 στο ανθρώπινο γένωμα, και της SRPK1 στο γένωμα του ποντικού) αντικατοπτρίζουν τα λάθη τα οποία μπορεί να 17

προκύπτουν κατά την διαδικασία δημιουργίας νέων γονιδίων SRPK (Giannakouros et al. 2011; Wang et al. 1999). Επίσης, ενδιαφέρον παρουσιάζει και η έλλειψη ομολογίας μεταξύ των γονιδίων των SRPKs στην ενδιάμεση συνδετική περιοχή (spacer domain). Μπορεί να είναι χαρακτηριστική η ύπαρξή της, η οποία διαχωρίζει την καταλυτική περιοχή σε δύο διακριτές περιοχές, αλλά η αλληλουχία, το μέγεθος και η λειτουργικότητά της είναι διαφορετικά για κάθε μέλος της οικογένειας. Επίσης, ολόκληρη η αλληλουχία των συνδετικών περιοχών, η οποία εξετάστηκε μεταξύ των μελών των SRPKs, κωδικοποιείται από ένα και μοναδικό εξόνιο. Αυτό το γεγονός μπορεί να αποτελεί μια ένδειξη ότι η συνδετική περιοχή έχει εξελιχθεί αυτόνομα από τις άλλες περιοχές του μορίου (Giannakouros et al. 2011). Το αμινο-τελικό άκρο είναι και αυτό διαφορετικό ως προς την πρωτοταγή δομή σε κάθε κινάση και αποτελεί την περιοχή του mrna η οποία υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα. Α.1.4. Έκφραση των SRPKs στους διάφορους ιστούς O τρόπος ο οποίος κατανέμονται οι SRPKs στα όργανα και τους ιστούς δεν είναι πανομοιότυπος για όλα τα μέλη της. Ανάλυση κατά Northern έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται στο ποντίκι και στον άνθρωπο σε μεγαλύτερο βαθμό στους όρχεις έχοντας μικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς (Papoutsopoulou et al. 1999). Πειράματα RNA-seq για την SRPK1 (Σχήμα Α.1.2) επιβεβαίωσαν την κυριαρχία έκφρασής της στους όρχεις (Fagerberg et al. 2014) Παρόμοια εικόνα έδειξε και η μελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όμως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασής της στους διάφορους ιστούς ήταν σημαντικά μικρότερα (Nikolakaki et al. 2001). Η SRPK2 εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο και τους όρχεις και μετρίως στην καρδιά και το σκελετικό μυ (Wang et al. 1998). Η SRPK3 του ποντικού έχει βρεθεί ότι εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό μυ (Nakagawa et al. 2005), ενώ η αντίστοιχη κινάση στο γουρούνι εκφράζεται επίσης στην καρδιά και το σκελετικό μυ αλλά και στη μήτρα και τους όρχεις (Xu et al. 2011). Τέλος η Srpk79D της Drosophila, εκφράζεται ιστοειδικά στους νευρώνες (Johnson et al. 2009). Οι παραπάνω παρατηρήσεις μας οδηγούν 18

στο συμπέρασμα ότι η λειτουργικότητα της κάθε κινάσης μπορεί να είναι εξειδικευμένη για κάθε ιστό ξεχωριστά. Σχήμα Α.1.2. Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης SRPK1 σε διάφορους ιστούς. Προσδιορισμός της έκφρασης του γονιδίου της SRPK1 σε 27 διαφορετικούς ιστούς με RNAseq ανάλυση δειγμάτων από 95 ανθρώπους. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης αποδίδεται ως ο αριθμός αναγνώσεων ανά 1000 βάσεις (RPKM). Α.1.5. Δομικά χαρακτηριστικά των SRPKs Οι SRPKs είναι διατηρημένες κινάσες, εμφανίζοντας μεγάλη ομολογία στο ~70% της αμινοξικής τους ακολουθίας. Η ομολογία αυτή εντοπίζεται στις περιοχές με καταλυτική δράση, δηλαδή στις περιοχές με δράση κινάσης. Ένα κοινό χαρακτηριστικό της οικογένειας αυτής των πρωτεϊνικών κινασών, όσον αφορά την πρωτοταγή δομή τους αποτελεί η ύπαρξη μιας ακολουθίας αμινοξέων, η οποία διακόπτει την καταλυτική περιοχή, δημιουργώντας δύο διακριτές περιοχές με δράση κινάσης (Σχήμα Α.1.3). Η χαρακτηριστική αυτή περιοχή, η οποία ονομάζεται συνδετική (spacer domain), είναι συνήθης για τις κινάσες τυροσίνης, αλλά όχι για τις κινάσες σερίνης/θρεονίνης (Wang et al. 1998). Η συνδετική περιοχή δεν είναι διατηρημένη μεταξύ των μελών, αλλά παίζει σημαντικό ρόλο στην σταθεροποίηση της καταλυτικής περιοχής και στην υποκυτταρική εντόπιση της κινάσης (Chan and Ye 2013). Άλλες περιοχές οι οποίες δεν παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία είναι οι αμινο και καρβοξυ-τελικές περιοχές των κινασών. Η αμινο-τελική περιοχή της SRPK2 είναι πλούσια σε προλίνες, ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Ομοίως με την 19

SRPK2, η προεξέχουσα αμινο-τελική περιοχή της SRPK1a (εναλλακτικό προϊόν ματίσματος της SRPK1 με 171 αμινοξέα παραπάνω) είναι πλούσια σε προλίνες (Nikolakaki et al. 2001). Σχήμα Α.1.3. Σχηματική αναπαράσταση των SRPKs ποντικού. Τα τρία μέλη της οικογένειας εμφανίζουν μεγάλη ομολογία στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), όπου εμφανίζονται με γκρι σκίαση, αλλά διαφέρουν στο αμινο-τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή (hinge region) (εμφανίζονται με άσπρα ορθογώνια). Το αμινο-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Τα ποσοστά δηλώνουν την ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία, ενώ δίνονται και οι αριθμοί των αμινοξέων (Nakagawa et al. 2005). Η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή της SRPK1 έχουν μελετηθεί πιο διεξοδικά από κάθε άλλο μέλος της οικογένειας των SR πρωτεϊνικών κινασών. Η κρυσταλλική δομή του μορίου της SRPK1, την οποία έχουμε στη διάθεσή μας δεν διαθέτει την μεγάλη ενδιάμεση συνδετική αλληλουχία καθώς και τα πρώτα 74 αμινοξέα του αμινο-τελικού του άκρου. Το μετάλλαγμα αυτό ονομάστηκε SRPK1ΔΝS1. Η παράλειψη αυτή έγινε για να διευκολυνθεί η κρυστάλλωση του μορίου, χωρίς όμως να επηρεάζεται η δραστικότητα της κινάσης, καθότι όταν αυτές οι δύο περιοχές αφαιρεθούν, η κινάση συνεχίζει να είναι ενεργή (Ngo et al. 2007). Σύμφωνα με αυτήν την κρυσταλλική δομή, η SRPK1 παίρνει μια χαρακτηριστική, για τις περισσότερες ευκαρυωτικές κινάσες, δίλοβη διαμόρφωση (Σχήμα Α.1.4). Ο μικρός λοβός, ο οποίος βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης, συνίσταται κυρίως από β-πτυχωτά φύλλα. Ο μεγαλύτερος λοβός, ο οποίος βρίσκεται στο καρβοξυ-τελικό άκρο, αποτελείται κυρίως από α-έλικες. Στο μικρό λοβό βρίσκεται η θέση δέσμευσης του ATP, ενώ στο μεγάλο λοβό η θέση δέσμευσης του υποστρώματος. Στην κρυσταλλική δομή έχουν συμπεριληφθεί και δύο μικρές έλικες της συνδετικής 20

αλληλουχίας, η αs1 και αs2 οι οποίες φαίνεται να αλληλεπιδρούν με τον μικρό και τον μεγάλο λοβό αντίστοιχα (Ngo et al. 2007). Σχήμα Α.1.4. Συνολική δομή της SRPK1ΔNS1. Διάγραμμα τύπου κορδέλας της μεταλλαγμένης SRPK1 της οποίας της λείπει το μεγαλύτερο μέρος του αμινο-τελικού άκρου της και της συνδετικής περιοχής (Ngo et al. 2007). Περαιτέρω μελέτη στη δομή της SRPK1, αποκάλυψε ότι ο βρόγχος ενεργοποίησης παραμένει ενεργός, χωρίς την αναγκαιότητα αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες, γεγονός το οποίο δεν είναι σύνηθες για δομές άλλων ενεργών κινασών. Προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής σε μεταλλάγματα της SRPK1 μέσα στο βρόγχο ενεργοποίησης, έδειξαν ότι παραμένουν ενεργά, αντισταθμίζοντας αυτές τις αλλαγές με συμπληρωματικές αλληλεπιδράσεις, οι οποίες διατηρούν το μικροπεριβάλλον χημικώς ικανό για κατάλυση (Ngo et al. 2007). Στην Σχήμα Α.1.4 διακρίνεται επίσης μια αλληλουχία, μέσα στην περιοχή κινάσης αλλά πολύ απομακρυσμένη από το ενεργό της κέντρο, γνωστή ως MAPK αλληλουχία (ΜΑΡΚ insert). Η κρυσταλλική δομή των ακτίνων Χ αποκάλυψε ότι το υπόστρωμα, δε δεσμεύεται στο ενεργό κέντρο, 21

όπως αναμενόταν, αλλά σε μια αύλακα η οποία δημιουργείται από την αλληλουχία MAPK, η οποία ενώνει τις έλικες αg και αh και ένα βρόγχο ο οποίος ενώνει τις έλικες αf και αg (Ghosh and Adams 2011). Όμως, μια τελευταία έρευνα δημοσιευμένη το 2017, παρέθεσε αποδείξεις για την ύπαρξη δισουλφιδικών δεσμών στο μόριο της SRPK1 οι οποίες σταθεροποιούν την τριτοταγή δομή του και μάλιστα μέσα στη συνδετική περιοχή. Μεταλλαγμένα μόρια SRPK1 σε κυστεΐνες οι οποίες βρίσκονται στην συνδετική περιοχή αλλά και στα εσωτερικά άκρα των δύο καταλυτικών περιοχών, έχουν μειωμένη δραστικότητα. Έτσι, ενώ η συνδετική περιοχή θεωρούνταν αμέτοχη στη καταλυτική ικανότητα της κινάσης σχηματίζοντας ένα βρόγχο έξω από το ενεργό της κέντρο, τώρα αποδείχθηκε ότι οι προτεινόμενοι δισουλφιδικοί δεσμοί βοηθούν την SRPK1 να πάρει την ενεργή της διαμόρφωση, φέρνοντας τις δύο καταλυτικές περιοχές κοντά τη μία στην άλλη και είναι απαραίτητοι για τη δραστικότητα της κινάσης. Στο ερώτημα όμως, για το πώς η μεταλλαγμένη SRPK1, της οποίας της έχει αφαιρεθεί η συνδετική περιοχή συνεχίζει να είναι δραστική, προτείνεται ως απάντηση ότι το μετάλλαγμα αποκτά μια δομή η οποία προσομοιάζει την πραγματική δομή της κινάσης, καθώς η αφαίρεση της συνδετικής περιοχής φέρνει τεχνητά τις δύο καταλυτικές περιοχές πολύ κοντά τη μία στην άλλη, υποκαθιστώντας τη φυσιολογική δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών (Koutroumani et al. 2017). Α.1.6. Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/ αργινίνης Μέχρι και σήμερα παραμένει ασαφής ο τρόπος με τον οποίο κατανέμονται οι SRPKs μέσα στο κύτταρο, αλλά και ο μηχανισμός ο οποίος τον καθορίζει. Συναντώνται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, αλλά δεν αποκλείονται από τον πυρήνα, έχοντας έτσι μια ευρεία δράση, φωσφορυλιώνοντας και κυτταροπλασματικούς αλλά και πυρηνικούς SR παράγοντες ματίσματος (Giannakouros et al. 2011). Όπως έχει αναφερθεί ήδη, η υποκυτταρική εντόπιση της Dsk-1 εξαρτάται από τον κυτταρικό κύκλο (Takeuchi and Yanagida 1993). Με παρόμοιο τρόπο δείχθηκε ότι συμπεριφέρεται και η SRPK1. Σε πειράματα με 22

συγχρονισμένα κύτταρα HeLa με τη μέθοδο του αποκλεισμού με θυμιδίνη, λίγο πριν τη φάση M, η SRPK1 μεταφέρεται στον πυρήνα (Ding et al. 2006). Σε προηγούμενες μελέτες πάνω στην SR κινάση Dsk-1 της ζύμης βρέθηκε μέσα στην συνδετική περιοχή, μια αλληλουχία η οποία θα μπορούσε να δρα ως σήμα εξόδου από τον πυρήνα (Nuclear Export Signal, NES). Το NES βρίσκεται υπό την ρύθμιση του αναστολέα της εξόδου από τον πυρήνα, λεπτομυκίνη Β (Nishida et al. 1997).Μελέτες όμως από την ερευνητική ομάδα του Dr. Fu απέκλεισαν την παρουσία ενός λειτουργικού NES στις SRPKs των θηλαστικών. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η υποκυτταρική κατανομή της SRPK1 είναι ανεξάρτητη της δράσης της λεπτομυκίνης Β (Ding et al. 2006). Το 2006 ο Ding και οι συνεργάτες του έκαναν μια ενδελεχή μελέτη της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1. Με χρήση κατάλληλου αντισώματος απέναντι στην ενδογενή SRPK1 σε HeLa κύτταρα, εντόπισαν την κινάση κυρίως στο κυτταρόπλασμα με ένα κλάσμα της να είναι ορατό και στον πυρήνα (Σχήμα Α.1.5. Α-C). Μετά από σημειακή μετάλλαξη της SRPK1 στην λυσίνη 109, η οποία βρίσκεται στη θέση δέσμευσης του ATP της κινάσης, με στόχο να απωλέσει την δραστικότητά της, αυτή παρέμενε στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα Α.1.5, D F). Η απαλοιφή όμως της συνδετικής αλληλουχίας της κινάσης οδήγησε στην πλήρη μετατόπιση του μεταλλάγματος στον πυρήνα κάτι το οποίο είχε παρατηρηθεί και σε άλλα μέλη της οικογένειας των SRPKs (Σχήμα Α.1.5, G I) (Siebel et al. 1999; Takeuchi and Yanagida 1993). Ο συνδυασμός όμως της ανενεργής SRPK1, από την οποία έχει αφαιρεθεί η συνδετική αλληλουχία σε ένα μετάλλαγμα, καταμερίζει την κινάση και στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα Α.1.5, J L). Άρα μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η δραστικότητα της SRPK1 είναι και αυτή μια προϋπόθεση για την είσοδό της στον πυρήνα (Ding et al. 2006). 23

Σχήμα Α.1.5. Ο ρόλος της συνδετικής αλληλουχίας και της ενεργής διαμόρφωσης στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1. Α. SRPK1, D. ανενεργή SRPK1(K109M), G. SRPK1- ΔS, η οποία δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία, J. SRPK1-ΔS(K109M), η οποία είναι και ανενεργή και δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία Β, E, H, K., παράγοντας ματίσματος SC35 και (C, F, I, L) μίξη των αντίστοιχων εικόνων (merge) (Ding et al. 2006). Μετά την καθολική αποδοχή ότι η αφαίρεση της συνδετικής αλληλουχίας από το μόριο της SRPK1 οδηγεί στην μετατόπισή της στον πυρήνα, το 2009 ο Dr Fu με την ερευνητική ομάδα του, προσπάθησαν να βρουν τον τρόπο, με τον οποίο το κύτταρο, ρυθμίζει την υποκυτταρική εντόπιση της κινάσης και κατ επέκταση, το μάτισμα στον πυρήνα. Έδειξαν λοιπόν ότι η SRPK1, μέσω της συνδετικής αλληλουχίας αλλά και μέρους της καταλυτικής της περιοχής, αλληλεπιδρά άμεσα με δύο μοριακούς συνσυνοδούς, τον Hsp40 και τον Aha1. Ο δύο αυτοί συνοδοί διαμεσολαβούν στην προσάρτηση και των μοριακών συνοδών Hsp70 και Hsp90 και την τελική συγκρότηση του συμπλόκου στο κυτταρόπλασμα. Η αναστολή της δράσης ATPάσης του μοριακού συνοδού Hsp90, με επίδραση 17-AAG, οδηγεί στην αποδέσμευση της SRPK1 από το σύμπλοκο και την μετατόπισή της της πυρήνα (Zhong et al. 2009). 24

Όπως φαίνεται και στην Σχήμα Α.1.6, η SRPK1 συγκρατείται στο κυτταρόπλασμα από το σύμπλοκο Hsp70/Hsp90 των μοριακών συνοδών οι οποίοι παράλληλα υποβοηθούν την αναδίπλωση της κινάσης στην ενεργή διαμόρφωση. Η κυτταροπλασματική SRPK1 μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση SR παραγόντων ματίσματος οι οποίοι βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα, μια τροποποίηση, η οποία αποτελεί προϋπόθεση για την είσοδό τους στον πυρήνα. Κάτω από συνθήκες στρες η SRPK1 απελευθερώνεται από το σύμπλοκο των μοριακών συνοδών και μεταφέρεται μετέπειτα στον πυρήνα του κυττάρου. Το κύτταρο κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ρυθμίζει το μάτισμα με αυτόν το μηχανισμό ελεγχόμενης απελευθέρωσης της SRPK1. Αλλά, όπως έχουμε αναφερθεί και νωρίτερα, η μεγάλη συσσώρευση της SRPK1 στον πυρήνα οδηγεί σε αναστολή του ματίσματος (Zhong et al. 2009). Σχήμα Α.1.6. Σχηματική αναπαράσταση του ρόλου των μοριακών συνοδών στην υποκυτταρική κατανομή της SRPK1 στη φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος και στο μάτισμα του πρόδρομου mrna (Zhong et al. 2009). Σε μεταγενέστερη δημοσίευση της ίδιας ερευνητικής ομάδας βρέθηκε ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των SRPK1/SRPK2 και των μοριακών συνοδών τους, βρίσκονται καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGF. 25

Πιο συγκεκριμένα, με χρονοεξαρτώμενα πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης, έδειξαν ότι κατά την επαγωγή του μονοπατιού EGF σταδιακά μειώνονταν η αλληλεπίδραση του Hsp70 με τις δύο κινάσες, ενώ αυξάνονταν με τον Hsp90. Άρα, τα σύμπλοκα τα οποία σχηματίζει ο μοριακός συνοδός Hsp70 με τις κινάσες είναι υπεύθυνα για την αγκυροβόλησή τους στο κυτταρόπλασμα, ενώ ενεργό ρόλο στη μετατόπιση των κινασών στον πυρήνα παίζουν τα σύμπλοκα τα οποία περιέχουν τον μοριακό συνοδό Hsp90 (Zhou et al. 2012). Ανακεφαλαιώνοντας, τα παραπάνω δεδομένα ενισχύουν την άποψη ότι στην οικογένεια των SRPKs, η συνδετική αλληλουχία λειτουργεί ως μια «κυτταροπλασματική άγκυρα», η οποία, ανάλογα με τη διαμόρφωση (ενεργή ή ανενεργή) του ενζύμου, ρυθμίζει την είσοδο στον πυρήνα. Α.1.7. Μηχανισμοί ρύθμισης της δραστικότητας της οικογένειας των SRPKs Το μάτισμα του πρόδρομου mrna υπόκειται σε ρύθμιση από αναπτυξιακούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες, χωρίς όμως να είναι πλήρως γνωστός ο τρόπος μετάδοσης σήματος από το ερέθισμα στον τελικό αποδέκτη, δηλαδή τη γονιδιακή έκφραση. Όπως αναλύθηκε και νωρίτερα, οι SRPKs διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στο εναλλακτικό μάτισμα γονιδίων μέσω της φωσφορυλίωσης των SR παραγόντων ματίσματος. Παρόλο που διατηρούν συνεχώς την ενεργή τους διαμόρφωση, κρίνεται πολύ σημαντική η εξερεύνηση των ανοδικών σημάτων τα οποία ρυθμίζουν τη δράση των SRPΚs. Το 2012, ο Zhou και οι συνεργάτες του δημοσίευσαν μια εργασία για το ρόλο του άξονα της Akt, των SRPKs και των SR παραγόντων ματίσματος στη μεταγωγή σήματος από τον EGF (Epidermal Growth Factor) στη ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος στον πυρήνα. Έδειξαν ότι προσθήκη EGF σε κύτταρα οδήγησε στην ενεργοποίηση της PI3K και μετέπειτα της Akt (Σχήμα Α.1.7). Στη συνέχεια, η Akt ενεργοποιεί την SRPK1 με έναν ασυνήθιστο αλλοστερικό μηχανισμό χωρίς την άμεση προσθήκη φωσφορικών ομάδων. Πρότειναν ότι η ενεργοποιημένη Akt προσδένεται και επάγει την αυτοφωσφορυλίωση της SRPK1. Έτσι η Akt μπορεί να επάγει τη φωσφορυλίωση της SRPK1 έμμεσα, καθώς η τελευταία δεν έχει κάποιο 26

μοτίβο αναγνώρισης για την άμεση φωσφορυλίωσή της από την πρώτη. Το σημαντικό εύρημα είναι ότι μειώθηκε η επαγωγή του εναλλακτικού ματίσματος μέσω του EGF μετά από αδρανοποίηση των SRPK1 και SRPK2 με χρήση RNAi, άρα ότι οι δύο κινάσες αποτελούν ενδιάμεσο απαραίτητο κρίκο στη μετάδοση του σήματος. Η ενεργοποιημένη SRPK1 εισέρχεται στον πυρήνα εξαρτώμενη από το σύμπλοκο των μοριακών συνοδών του Hsp90, έχοντας ήδη αποδεσμευτεί από το σύμπλοκο των μοριακών συνοδών του Hsp70 (Zhou et al. 2012). Ένας ακόμα τρόπος συγκράτησης των SRPKs στο κυτταρόπλασμα πιθανόν να επιτελείται και από την οικογένεια πρωτεϊνών 14-3-3. Οι SRPK1 και SRPK2 αλληλεπιδρούν με την 14-3-3β και αυτή η αλληλεπίδραση αυξάνεται σταδιακά σε απόκριση του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGF, ενώ η υπερέκφραση της πρωτεΐνης αυτής παρεμποδίζει την πρόσδεση των μοριακών συνοδών Hsp70/Hsp90 με τις κινάσες (Σχήμα Α.1.6) (Zhou et al. 2012). Σχήμα Α.1.7. Περιληπτικό μονοπάτι της σηματοδότησης του EGF μέσω του άξονα Akt- SRPK-SR πρωτεϊνών για τη ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος στον πυρήνα. Ο Hsp70 είναι υπεύθυνος για την αναστολή της εισόδου των κινασών στον πυρήνα, ενώ ο Hsp90 εκτοπίζει τον Hsp70 διευκολύνοντας την είσοδο. Η 14-3-3 αποτρέπει την υπερβολική συσσώρευση των SRPKs στον πυρήνα (Zhou et al. 2012). 27

Ένα μεγάλο εύρος εργασιών συμφωνούν στο ότι καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της δράσης των SRPKs παίζει η υποκυτταρική τους κατανομή. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, η αλληλουχία στο μόριο των SRPKs στην οποία κυρίως οφείλεται η υποκυτταρική τους θέση, είναι η συνδετική αλληλουχία. Αυτή η ασυνήθιστα μεγάλη αλληλουχία είναι ξεχωριστή για κάθε μέλος της οικογένειας των SRPKs και χωρίζει την πολύ διατηρημένη καταλυτική περιοχή σε δύο. Αφαίρεση αυτής της αλληλουχίας οδηγεί στην πυρηνική εντόπιση των Dsk-1 και Sky1 (Siebel et al. 1999; Takeuchi and Yanagida 1993). Επιπρόσθετα, η απομάκρυνση της συνδετικής περιοχής των SRPK1 και SRPK2 οδηγεί επίσης σε αυξημένη πυρηνική εντόπισή τους, προκαλώντας συσσώρευση μεταγραφικών παραγόντων (Takeuchi and Yanagida 1993). Η παροδική αλληλεπίδραση των SRPKs με πρωτεϊνικά σύμπλοκα τα οποία δεν μετακινούνται μέσα στο κύτταρο, μπορεί να αποτελεί άλλο ένα σημείο ρύθμισης της δραστικότητάς τους. Κατά την πρώτη κλωνοποίηση και χαρακτηρισμό της SRPK1a, προϊόν εναλλακτικού ματίσματος της SRPK1, βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1) μέσω της χαρακτηριστικής πρόσθετης αλληλουχίας της στο αμινο-τελικό της άκρο (Nikolakaki et al. 2001). Σε μεταγενέστερα πειράματα της ίδιας ομάδας βρέθηκε ότι οι SRPK1 και SRPK1a αλληλεπιδρούν άμεσα με τις SAFB1 και SAFB2 αλλά σε διαφορετικό βαθμό. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις αναστέλλουν τη δράση των κινασών in vitro, ενώ πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης και υποκυτταρικής κλασμάτωσης δείχνουν ότι η αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας εντοπίζεται και in vivo (Tsianou et al. 2009). Οι SAFB πρωτεΐνες απομονώνονται από υποπυρηνικά σωμάτια, η δημιουργία των οποίων επάγεται από το στρες, μαζί με παράγοντες ματίσματος και μόρια RNA. Άρα, λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω, μπορούμε να θεωρήσουμε ότι η αλληλεπίδραση των SRPK1/1a με τις SAFB και η επακόλουθη αναστολή της δράσης των κινασών, αποτελεί άλλον ένα μηχανισμό ρύθμισης της δραστικότητάς τους (Giannakouros et al. 2011). O SRSF2 ανήκει στην κατηγορία των SR παραγόντων ματίσματος και αποτελεί υπόστρωμα για τις SRPKs. Σε μια έρευνα του 2011, (Edmond et al. 28

2011), βρέθηκε για πρώτη φορά ότι η ακετυλίωση του SRSF2 στη λυσίνη 52, η οποία βρίσκεται μέσα στην περιοχή αναγνώρισης του RNA, οδηγεί στην αποικοδόμησή του στο πρωτεόσωμα. Υπεύθυνη για αυτήν την ακετυλίωση είναι η ακετυλοτρανσφεράση Tip60, ενώ η απακετυλάση HDAC6 δρα ως θετικός ρυθμιστής των επιπέδων του SRSF2 αντιστρέφοντας το αποτέλεσμα της δράσης της Tip60 (Σχήμα Α.1.8). Παράλληλα όμως, η Tip60, μειώνει και την φωσφορυλίωση του SRSF2 από τις SRPK1 και SRPK2 εμποδίζοντας την είσοδο των κινασών στον πυρήνα. Σχήμα Α.1.8. Ρόλος της ακετυλοτρανσφεράσης Tip60 στη ρύθμιση των πρωτεϊνικών επιπέδων του SRSF2. Η Tip60 ακετυλιώνει τον SRSF2 στη λυσίνη 52 και αποτρέπει την είσοδο των SRPK1/2 στον πυρήνα. Ο SRSF2 γίνεται αντικείμενο πρωτεόλυσης από το πρωτεόσωμα καθώς βρίσκεται υπερακετυλιωμένος και υποφωσφορυλιωμένος. Αντισταθμιστική δράση επιτελεί η απακετυλάση HDAC6 (Edmond et al. 2011). Μένει να διερευνηθεί περαιτέρω αν η Tip60 στοχεύει άμεσα στο μόριο των SRPKs ακετυλιώνοντάς το ή έμμεσα, μέσω κάποιου άλλου παράγοντα, ρυθμίζοντας έτσι την υποκυτταρική τους κατανομή (Edmond et al. 2011). Προς αναζήτηση άμεσων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των SRPKs, οι ερευνητές στόχευσαν στην εύρεση κινασών, οι οποίες μέσω της φωσφορυλίωσης, πιθανώς μπορούν να ρυθμίζουν την ενζυμική δραστικότητα ή/και την υποκυτταρική εντόπιση των SR κινασών μέσα στα κύτταρα. Σε αυτήν τη οδό κινήθηκαν ο Μυλωνής και οι συνεργάτες του, οι οποίοι έδειξαν πρώτοι ότι η φωσφορυλίωση της SRPK1 στις σερίνες 51 και 555 από την CK2 αυξάνει την δραστικότητά της κατά έξι φορές in vitro (Mylonis and Giannakouros 2003). Η σερίνη 55 βρέθηκε να τροποποιείται από την CK2 και in vivo, όπως έδειξαν φωσφοπρωτεωμικές αναλύσεις (Giannakouros et al. 29

2011). Η SRPK2 φωσφορυλιώνεται από την ενεργοποιημένη Akt στη θρεονίνη 492, τροποποίηση η οποία επάγει την μεταφορά της στο πυρήνα (Jang et al. 2009), όπως επίσης έχει δημοσιευθεί ότι φωσφορυλίωση της σερίνης 581 στην SRPK2 ρυθμίζει την υποκυτταρική της εντόπιση (Vivarelli et al. 2013). Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής της διατριβής, η Μαρία Κουτρουμάνη μελετώντας πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης βρήκε ότι η μετάλλαξη τόσο της θρεονίνης 326 όσο και της σερίνης 408 παρεμποδίζει τη μετακίνησή της SRPK1 στον πυρήνα. Δεν είναι όμως γνωστό, ποια κινάση είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των δύο αυτών θέσεων (Κουτρουμάνη Μαρία 2016). Α.1.8. Εξειδίκευση των SRPKs απέναντι στα υποστρώματά τους Όπως έχει προαναφερθεί, οι SRPKs φωσφορυλιώνουν κατάλοιπα σερίνης τα οποία βρίσκονται σε περιοχές πλούσιες σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης των υποστρωμάτων τους, γνωστά ως RS περιοχές. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι SRPKs φαίνεται να είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (-R-S-R-S-R-S-). Σε πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης, χρησιμοποιώντας ως κινάση την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και υποστρώματα τα οποία περιείχαν μόνο δύο επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση (Papoutsopoulou et al. 1999). Ακόμη έχει δειχτεί ότι η αντικατάσταση της σερίνης από θρεονίνη ή της αργινίνης από λυσίνη στις RS ακολουθίες, έχει ως αποτέλεσμα τη μη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων από την SRPK1 (Wang et al. 1998). Ακόμη, in vitro πειράματα τα οποία έγιναν χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 με διάφορους παράγοντες ματίσματος του mrna, οι οποίοι προέρχονται από διαφορετικούς οργανισμούς, έδειξαν ότι οι κινάσες αυτές προτιμούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης οι οποίες είναι τοποθετημένες ανάμεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αμινοξέα αργινίνης και δευτερευόντως ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al. 1998). 30

Όσον αφορά στα κινητικά χαρακτηριστικά των SRPKs, οι μελέτες οι οποίες έγιναν χρησιμοποιώντας ως κινάση την SRPK1 και ως υπόστρωμα τον παράγοντα ματίσματος SRSF1, έδωσαν μια τιμή Κm 10 μμ για το ΑΤΡ, και μία πολύ μικρή τιμή Κm 0,07 μμ για το υπόστρωμα. Το γεγονός αυτό δείχνει την πολύ μεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώματά τους (J.- F. F. Gui et al. 1994). Α.1.9. Υποστρώματα και βιολογικές λειτουργίες των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα, η καταλυτική δράση των SRPKs εντοπίζεται σε περιοχές των υποστρωμάτων τους πλούσιες σε διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης. Εκεί, μεταφέρουν τη γ-φωσφορική ομάδα του ATP, στα κατάλοιπα σερίνης. Οι SRPKs έχουν την ικανότητα να φωσφορυλιώνουν και σε σχετικά διάσπαρτα RS διπεπτίδια, αρκεί να πληρούνται κάποιοι κανόνες, εμφανίζοντας έτσι μεγάλη εξειδίκευση απέναντι στα υποστρώματά τους. Στο σύνολο των πρωτεϊνών με RS περιοχές στα μόριά τους, κυριαρχούν οι SR παράγοντες ματίσματος οι οποίοι αποτελούν τα πιο μελετημένα υποστρώματα των SRPKs, η φωσφορυλίωση των οποίων είναι επιβεβαιωμένη πειραματικά in vitro και in vivo. Κάθε πρωτεΐνη η οποία περιέχει RS περιοχές, μπορεί να αποτελέσει δυνητικά υπόστρωμα των SRPKs. Μετά από μια μελέτη στο ανθρώπινο γονιδίωμα η οποία έδειξε ότι υπάρχουν πάνω από 100 πρωτεΐνες με περιοχές RS (Calarco et al. 2009), μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι SRPKs μέσω της φωσφορυλίωσης, πιθανώς μπορούν να ρυθμίσουν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες στις οποίες εμπλέκονται αυτές οι πρωτεΐνες. Πέρα λοιπόν από τη ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος, στη συνέχεια θα περιγραφούν συνοπτικά και άλλες βασικές κυτταρικές λειτουργίες στις οποίες εμπλέκονται οι SRPKs. Α.1.9.1. Ρόλος των SRPKs στην ωρίμανση του πρόδρομου mrna Η συσχέτιση των SRPKs με την ωρίμανση του πρόδρομου mrna ήταν αναμενόμενη καθώς η SRPK1 απομονώθηκε για πρώτη φορά ως μια κινάση η οποία φωσφορυλιώνει παράγοντες ματίσματος, όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα. Η τροποποίηση αυτή έδειχνε να αποτελεί προϋπόθεση για την συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος, ενώ παρουσία της κινάσης σε 31

μεγάλη ποσότητα ανέστειλε το μάτισμα. Παρόλα αυτά, στις SRPKs δεν έχει αποδοθεί ένας και μοναδικός ρόλος στη διαδικασία του ματίσματος, καθώς συμβάλουν σε πολλά στάδια και με ποικίλους τρόπους σε αυτό. Δείγμα αυτής της πολυπλοκότητας αποτελεί το γεγονός ότι η παρουσία τους μέσα στο κύτταρο δεν εντοπίζεται σε κάποιο κυτταρικό διαμέρισμα, αλλά κατανέμονται και δρουν και στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα έχοντας έτσι, ως υποστρώματα και κυτταροπλασματικούς και πυρηνικούς SR παράγοντες ματίσματος. Επίσης, η φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος μέσα στον πυρήνα εκτελείται και από άλλες κινάσες όπως οι CDKs, οι Akts και η Τοποϊσομεράση Ι (Giannakouros et al. 2011). Οι SR πρωτεΐνες (πλούσιες σε κατάλοιπα σερίνης S και αργινίνης R), ανήκουν στην κατηγορία των πρωτεϊνών οι οποίες προσδένονται στο RNA (RNA binding proteins-rbps) και είναι γνωστές για τη δράση τους ως ρυθμιστές του ιδιοσύστατου και του εναλλακτικού ματίσματος. Οι πρώτες πρωτεΐνες της οικογένειας αυτής οι οποίες ταυτοποιήθηκαν ήταν ο SRSF1 και ο SRSF2. Στο βασικό πυρήνα των SR πρωτεϊνών ανήκουν επτά πρωτεΐνες, οι οποίες πειραματικά αναγνωρίζονται από το αντίσωμα mab104. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν μία ή δύο περιοχές αναγνώρισης και δέσμευσης του RNA, RRMs (RNA Recognition Motifs) στο αμινο-τελικό τους άκρο, ενώ στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο υπάρχει η χαρακτηριστική RS περιοχή με τουλάχιστον πενήντα αμινοξέα, με σύσταση πάνω από 40% σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (Σχήμα Α.1.9) (Änkö 2014). 32

Σχήμα Α.1.9. Σχηματική αναπαράσταση των δομικών περιοχών των SR παραγόντων ματίσματος. Διακρίνονται μία ή δύο περιοχές δέσμευσης με το RNA (RRM - μπλε) και οι περιοχές των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS - μωβ) (Blanco and Bernabéu 2012). Στην περίπτωση του ιδιοσύστατου ματίσματος έχουν κεντρικό ρόλο κατά τη διάρκεια της συγκρότησης και ενεργοποίησης του σωματιδίου ματίσματος, ενώ στο εναλλακτικό μάτισμα ρυθμίζουν την επιλογή της θέσης της οποίας θα γίνει το μάτισμα του πρόδρομου mrna (Änkö 2014). Μετά τις πρώτες in vitro μελέτες οι οποίες ενέπλεξαν τις SRPKs με τη φωσφορυλίωση των SR πρωτεϊνών και τη ρύθμιση του ματίσματος, δημοσιεύτηκε η πρώτη έρευνα η οποία έδειξε ότι εμφανίζουν δράση πάνω στους παράγοντες ματίσματος και in vivo. Η έρευνα έδειξε ότι απαλοιφή του μοναδικού γονιδίου ομόλογου των SRPKs στον S. Cerevisiae (Sky1), οδήγησε σε αλλαγή της υποκυτταρικής εντόπισης SR πρωτεϊνών των θηλαστικών οι οποίες είχαν υπερεκφραστεί στη ζύμη. Συγκεκριμένα, η έλλειψη της Sky1, οδήγησε στην μετατόπιση του SRSF2 στο κυτταρόπλασμα, αλλά όχι του SRSF1, υποδεικνύοντας ότι η φωσφορυλίωση παίζει μεγάλο ρόλο στην είσοδο των SR παραγόντων ματίσματος στον πυρήνα, αλλά όχι με τον ίδιο τρόπο για κάθε παράγοντα (J. M. Yeakley et al. 1999). Επίσης η Sky1, σε επόμενες μελέτες έδειξε να φωσφορυλιώνει την Nlp3p, η οποία είναι μια SR πρωτεΐνη του S. Cerevisiae, η οποία μεταφέρει τα mrnas έξω από τον πυρήνα (Yun and Fu 2000). Σε άλλη μελέτη φάνηκε πως η φωσφορυλίωση της Nlp3p από την Sky1 απαιτείται για την απελευθέρωση του mrna (Gilbert, Siebel, and Guthrie 2001). 33

Στον άνθρωπο, οι μετακινούμενοι παράγοντες ματίσματος, όπως ο SRSF1, φωσφορυλιώνονται στο κυτταρόπλασμα από την SRPK1 και στη συνέχεια μεταφέρονται στον πυρήνα από την τρανσπορτίνη SR2, η οποία αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με φωσφορυλιωμένους SR παράγοντες ματίσματος. Στον πυρήνα, όταν δεν εμπλέκονται ενεργά στη διαδικασία της μεταγραφής, οι πρωτεΐνες SR βρίσκονται στα πυρηνικά σωμάτια (nuclear speckles), από τα οποία απελευθερώνονται όταν υποβάλλονται σε έναν νέο γύρο φωσφορυλίωσης. Πέραν της φωσφορυλίωσης στο κυτταρόπλασμα, οι SRPKs εμπλέκονται και στην τροποποίηση των SR παραγόντων ματίσματος και στον πυρήνα. Ο Fu και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι όταν οι κινάσες εισέρχονται στον πυρήνα (στην προκειμένη περίπτωση κάτω από συνθήκες στρες) αυξάνεται η φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος (Zhong et al. 2009). Επίσης, στα νευρικά κύτταρα, η SRPK2 φωσφορυλιώνεται από την Akt, μπαίνει στον πυρήνα και φωσφορυλιώνει τον παράγοντα ματίσματος SRSF2 (Jang et al. 2009). Τα πειραματικά δεδομένα τα οποία εμπλέκουν τις SRPKs στην επιλογή της θέσης ματίσματος είναι αρκετά. Πρώτα στη ζύμη, η Sky1 βρέθηκε να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες οι οποίες είναι υπεύθυνες για την επιλογή της 3 θέσης ματίσματος (Dagher and Fu 2001). Η Νικολακάκη και οι συνεργάτες της έδειξαν ότι τόσο η SRPK1 όσο και η SRPK1a είναι ικανές να μεταβάλλουν το μάτισμα ενός μινι-γονιδίου της πρωτεΐνης tau, κατά έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Nikolakaki et al. 2001). Ακόμα, η SRPK1 έχει βρεθεί να σχετίζεται με το U1-snRNP, το οποίο συμμετέχει στην επιλογή της 5 θέσης ματίσματος ενώ η SRPK2 απαιτείται για τη συγκρότηση του συμπλόκου U4/U6-U5 snrnp το οποίο σχετίζεται με την επιλογή της 3 θέσης του ματίσματος (Giannakouros et al. 2011). Σε πρόσφατη έρευνα δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά ένα σηματοδοτικό μονοπάτι, το οποίο έδειξε τη συνεργατική δράση δύο πρωτεϊνικών κινασών για τον έλεγχο του ματίσματος του πρόδρομου mrna. O Aubol και οι συνεργάτες του παρατήρησαν ότι η υπερέκφραση της CLK1, μιας πρωτεϊνικής κινάσης η οποία φωσφορυλιώνει και αυτή SR παράγοντες ματίσματος, αποδυναμώνει την επιλογή της θέσης ματίσματος. Το γεγονός αυτό έρχεται σε 34

αντίφαση με τη γενική θεώρηση ότι η φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος οδηγεί στην αποτελεσματική επιλογή της θέσης ματίσματος. Απάντηση σε αυτό έδωσε η παρατήρηση ότι η CLK1 προσδένεται με τις SR πρωτεΐνες, χωρίς όμως να έχει τη δυνατότητα να αποδεσμεύσει τις φωσφοπρωτεΐνες, με αποτέλεσμα να τις καθιστά ανενεργές. H CLK1 προσπερνά αυτήν τη δυσκολία δημιουργώντας μια συμβιωτική σχέση με την SRPK1. Σε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι οι CLK1 και SRPK1 έχουν την δυνατότητα να σχηματίζουν ένα σταθερό σύμπλοκο στον πυρήνα το οποίο σταθεροποιείται μέσω αλληλεπίδρασης του αμινο-τελικού άκρου της CLK1 με την περιοχή με δράση κινάσης της SRPK1 (Σχήμα Α.1.10). Η SRPK1 επάγει την αποδέσμευση του φωσφορυλιωμένου SRSF1 από την CLK1 βοηθώντας έτσι την πρόσδεσή του με τη μικρή πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη U1 (U1-small nuclear RiboNucleoProtein, snrnp) και κατ επέκταση την αναγνώριση της θέσης ματίσματος και τη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος (Aubol et al. 2016). 35

Σχήμα Α.1.10. Σχηματική αναπαράσταση του ρόλου της SRPK1 στη φωσφορυλίωση των SR πρωτεϊνών και στο μάτισμα. Α. H SRPK1, μετά την είσοδό της στον πυρήνα, συγκρατείται από την CLK1 δημιουργώντας ένα σύμπλοκο SRPK1-CLK1 το οποίο βοηθάει στην απελευθέρωση των φωσφορυλιωμένων παραγόντων ματίσματος από την CLK1 και προάγει τη διαδικασία του ματίσματος βοηθώντας την πρόσδεση με τη μικρή πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη U1 (U1 snrnp) (Aubol et al. 2016). Β. Καταλυτικός κύκλος της φωσφορυλίωσης μιας SR πρωτεΐνης από το σύμπλοκο SRPK1-CLK1. Η δημιουργία του συμπλόκου έγκειται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του αμινο-τελικού άκρου της CLK1 και την περιοχή με δράση κινάσης της SRPK1. Η SRPK1 φωσφορυλιώνει τα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης με κατεύθυνση από το καρβοξυ-τελικό στο αμινο-τελικό άκρο ενώ η CLK1 φωσφορυλιώνει κυρίως τα διπεπτίδια σερίνης/προλίνης. Η SRPK1 επάγει την απελευθέρωση της SR πρωτεΐνης με τον αποκλεισμό της αλληλεπίδρασης της CLK1 με την RS περιοχή. Α.1.9.2. Ρόλος των SRPKs στη σπερμιογένεση Όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα, η SRPK1 (Papoutsopoulou et al. 1999), η SRPK1a (Nikolakaki et al. 2001) και η SRPK2 (Wang et al. 1998) εκφράζονται κυρίως στους όρχεις. Η πρωτεύουσα λειτουργία τους, το εναλλακτικό μάτισμα 36

θα μπορούσε να εξηγεί την κυρίαρχη εντόπισή τους στα γεννητικά κύτταρα καθώς κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης, υπόκεινται σε διάφορα στάδια ωρίμανσης τα οποία απαιτούν διαφορετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Όμως, οι SR παράγοντες ματίσματος, οι οποίοι αποτελούν υποστρώματα των κινασών, δεν εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης συγκριτικά με άλλους ιστούς, υποδεικνύοντας ότι οι SRPKs έχουν και πρόσθετους ρόλους κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης (Giannakouros et al. 2011). Κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης συντελούνται πολυάριθμες μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές στη δομή της χρωματίνης όταν οι πρωταμίνες (μικρού μοριακού βάρους, πλούσιες σε αργινίνη βασικές πρωτεΐνες) αντικαθιστούν τις ιστόνες, προκαλώντας έτσι συμπύκνωσή της και τη στέρηση μεταγραφικής δραστηριότητας. Το κύριο μέλος της οικογένειας των πρωταμινών είναι η πρωταμίνη Ρ1. Είναι καλά συντηρημένη σε όλα τα σπονδυλωτά ζώα σε αντίθεση με το άλλο μέλος, την πρωταμίνη Ρ2 η οποία έχει εντοπιστεί μόνο στον άνθρωπο, το άλογο, το χάμστερ και το ποντίκι (Giannakouros et al. 2011). Η πρωταμίνη 1 στα πρώτα στάδια της σπερμιογένεσης λίγο μετά τη σύνθεσή της, φωσφορυλιώνεται και προσδένεται στο DNA ενώ στα ώριμα σπερματοζωάρια, αποφωσφορυλιώνεται (Chira et al. 1993). Η διαδικασία της φωσφορυλίωσης/αποφωσφορυλίωσης την οποία υπόκειται σε συνδυασμό με το ότι η πρωταμίνη Ρ1 έχει μια μικρή RS περιοχή μέσα στο μόριό της, την κατέστησε ιδανικό υπόστρωμα της κινάσης. Έτσι, η Ser8 και η Ser10 ( 7 RSQSRSR 13 ), ταυτοποιήθηκαν ως οι θέσεις φωσφορυλίωσης in vivo της ανθρώπινης πρωταμίνης P1 (Chira et al. 1993) και η SRPK1 αργότερα αποδείχθηκε ότι μπορεί να φωσφορυλιώσει την Ρ1 στις συγκεκριμένες θέσεις (Papoutsopoulou et al. 1999). Ο Μυλωνής και οι συνεργάτες του έδειξαν σε έρευνά τους ότι η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης P1 αποτελεί προϋπόθεση για την παροδική αλληλεπίδρασή της με τον υποδοχέα της λαμίνης B (LBR), μια πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, η οποία φέρει επίσης RS διπεπτίδια στο αμινο-τελικό της άκρο. Η αλληλεπίδραση αυτή στηρίζεται στην ύπαρξη των RS αλληλουχιών και στις δύο πρωτεΐνες αλλά με μία από τις δύο αλληλουχίες φωσφορυλιωμένη. Η αλληλεπίδραση της Ρ1 με τον πυρηνικό φάκελο, πιθανώς αποτελεί ένα ενδιάμεσο στάδιο πριν την εναπόθεσή της στη 37

χρωματίνη του σπέρματος (Mylonis et al. 2004). Στη βιβλιογραφία είχε ήδη αναφερθεί ότι οι πρωταμίνες συναντώνται αρχικά στην περιφέρεια του πυρήνα, ενισχύοντας την άποψη ότι ο πυρηνικός φάκελος παίζει σημαντικό ρόλο στην αντικατάσταση μεταβατικών πρωτεϊνών από τις πρωταμίνες κατά την σπερμιογένεση (Biggiogera et al. 1992). Α.1.9.3. Ρόλος των SRPKs στον κυτταρικό κύκλο και την αναδιοργάνωση της χρωματίνης Ο χαρακτηρισμός των SRPKs ως κινάσες ρυθμιζόμενες από τον κυτταρικό κύκλο τους αποδόθηκε γιατί η SRPK1, όπως και η ομόλογή της Dsk1 κατά τη φάση G2 μεταφέρονται στον πυρήνα. Επιπρόσθετα, η SRPK1 ήταν πέντε φορές πιο δραστική σε μεταφασικά εκχυλίσματα σε σύγκριση με τα μεσοφασικά απέναντι στα υποστρώματά της SRSF1 και SRSF2. H πρώτη λειτουργία σε σχέση με τον κυτταρικό κύκλο η οποία της προσδόθηκε, είναι η απελευθέρωση των SR παραγόντων ματίσματος από τα πυρηνικά σωμάτια και η ανακατανομή τους στο κυτταρόπλασμα κατά την μίτωση (Giannakouros et al. 2011). Η σύνδεση της χρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο συντελείται από διάφορα μακρομοριακά σύμπλοκα τα οποία εδρεύουν στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και λειτουργούν ως πλατφόρμες αγκυροβόλησης της ετεροχρωματίνης. Ο LBR είναι μια αναπόσπαστη πρωτεΐνη της εσωτερικής μεμβράνης. Το υδρόφιλο αμινο-τελικό του άκρο όπως και η καρβοξυ-τελική ουρά του, εκτείνονται στο νουκλεόπλασμα, ενώ η ενδιάμεση περιοχή του μορίου συνίσταται από οκτώ υδρόφοβες περιοχές οι οποίες διαπερνούν την πυρηνική μεμβράνη. Το αμινο-τελικό του άκρο είναι υπεύθυνο για τη συγκράτηση της ετεροχρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο κατά τη διάρκεια της μεσόφασης. Ο LBR έχει τη δυνατότητα να σχηματίζει ολιγομερή, δια μέσου των μη φωσφορυλιωμένων RS ακολουθιών, τα οποία εντοπίζονται σε διακριτές περιοχές της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Όταν δεν είναι φωσφορυλιωμένος αλληλεπιδρά ηλεκτροστατικά μέσω της αμινο-τελικής του - θετικά φορτισμένης ομάδας- με την αρνητικά φορτισμένη ετεροχρωματίνη (Σχήμα Α.1.11). Η φωσφορυλίωση του αμινο-τελικού του άκρου επιφέρει μείωση του θετικού φορτίου, πιθανώς μερική διάλυση των ολιγομερών και αποδυνάμωση της αλληλεπίδρασης με το DNA. Έτσι, πιθανόν να υπάρχει μια 38

ανακατανομή της ετεροχρωματίνης η οποία βρίσκεται συνδεδεμένη στην πυρηνική περιφέρεια. Κατά τη φάση της μίτωσης ο πυρηνικός φάκελος διασπάται και τα χρωμοσώματα αποσυνδέονται από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Η RS περιοχή του LBR υπερφωσφορυλιώνεται στην αρχή της μίτωσης από την SRPK1, η οποία εισέρχεται στο μεγαλύτερο ποσοστό της στον πυρήνα, πιθανώς από τις κινάσες Akt και Clk, οι οποίες τροποποιούν επίσης RS περιοχές αλλά και από την μιτωτική κινάση cdk1, η οποία φωσφορυλιώνει σερίνες εκατέρωθεν της RS αλληλουχίας (Nikolakaki, Mylonis, and Giannakouros 2017). Η υπερφωσφορυλίωση των RS ακολουθιών έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη διάλυση των ολιγομερών και την αποσύνδεση της χρωματίνης από την πυρηνική περιφέρεια. Σχήμα Α.1.11. Πιθανό μοντέλο αλληλεπίδρασης του LBR με την ετεροχρωματίνη και ο ρόλος της φωσφορυλίωσης. (Nikolakaki et al. 2017). Οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών με την χρωματίνη ρυθμίζονται πρωτογενώς με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των αμινο-τελικών ουρών των τεσσάρων ιστονών. Στην αρχή της μίτωσης, ταυτόχρονα με την αποσύνδεση της χρωματίνης από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και με την συμβολή της SRPK1, η οποία αναλύθηκε προηγουμένως, ακολουθεί ένας 39

συνδυασμός φωσφορυλιώσεων οι οποίες οδηγούν στη συμπύκνωση χρωματίνης. Πιο συγκεκριμένα, η κινάση Aurora B φωσφορυλιώνει την σερίνη 10 στην ουρά της ιστόνης H3, ενώ οι παράγοντες ματίσματος SRSF1 και SRp20 υπερφωσφορυλιώνονται από την SRPK1 με τελικό αποτέλεσμα τη δραματική μείωση της αλληλεπίδρασής τους με την ουρά της ιστόνης H3 και την αποδέσμευσή τους (Loomis et al. 2009). Η αποδέσμευση των δύο αυτών πρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης HP1, η οποία είναι ένα βασικό συστατικό της μεσοφασικής ετεροχρωματίνης, γεγονός το οποίο συμβάλει περαιτέρω στη συμπύκνωση της χρωματίνης. Η SRPK2 έχει φανεί επίσης ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση της μεταγραφής δύο κυκλινών. Οι κυκλίνες είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών οι οποίες ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο μέσω της ενεργοποίησης των κινασών εξαρτώμενων από τις κυκλίνες Cdk (cyclin-dependent kinase). O Jang και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι στα κύτταρα του αιμοποιητικού, η SRPK2 προσδένεται και φωσφορυλιώνει την SR πρωτεΐνη acinus ανακατανέμοντάς την έτσι από τα πυρηνικά σωμάτια στο νουκλεόπλασμα. Αυτό το γεγονός οδηγεί στην αύξηση της μεταγραφής της κυκλίνης Α1 αλλά όχι της Α2 (Jang et al. 2008). Η κυκλίνη D1 ανήκει στις κυκλίνες τύπου D των θηλαστικών και εμφανίζεται ειδικά στην φάση G1. Η κυκλίνη D1 αλληλεπιδρά με τις κινάσες CDK4 και CDK6, τις οποίες και ενεργοποιεί, προάγοντας την εξέλιξη της φάσης G1. Στα νευρικά κύτταρα, η SRPK2 πυροδοτεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου επάγοντας την απόπτωση μέσω της ρύθμισης της πυρηνικής κυκλίνης D1. Πιο συγκεκριμένα, η SRPK2 φωσφορυλιώνει τον SR παράγοντα ματίσματος SC35, απενεργοποιείται η p53 και αυτό οδηγεί στην αύξηση των επιπέδων της κυκλίνης D1 (Jang et al. 2009). 40

Α.1.10. Μηχανισμός φωσφορυλίωσης των υποστρωμάτων των SRPKs Οι πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/αργινίνης είναι φωσφοτρανσφεράσες, οι οποίες μεταφέρουν την γ-φωσφορική ομάδα του ATP στο υδροξύλιο της σερίνης. Ενώ ο μηχανισμός αυτός από χημικής σκοπιάς είναι απλός, η ενζυμική διαδικασία είναι πολύ περίπλοκη με στάδια όπως η αναγνώριση και δέσμευση του υποστρώματος, η απελευθέρωση του προϊόντος και η μεταφορά της φωσφορικής ομάδας, οι οποίες μπορεί να απαιτούν και δομικές αλλαγές της κινάσης (Adams 2001). Το 2008, ο Ngo και οι συνεργάτες του, χρησιμοποιώντας μεθόδους κρυστάλλωσης με ακτίνες Χ, συγκρυστάλλωσαν την SRPK1 με μια περιοχή σύνδεσης υψηλής συγγένειας του SRSF1 η οποία περιέχει το μοτίβο αναγνώρισης του RNA 2 (RRM2) και το αμινο-τελικό άκρο της περιοχής με τα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης σερίνης (N -RS1). Με την έρευνα αυτή δόθηκαν πληροφορίες για την αναγνώριση και την πρόσδεση του υποστρώματος στην SRPK1 και τις δομικές αλλαγές οι οποίες επέρχονται κατά την φωσφορυλίωση. Συγκεκριμένα, η σφαιρική περιοχή η οποία σχηματίζει το RRM2 του SRSF1 προσδένεται στην SRPK1 μέσω του αμινοκαι καρβοξυ-τελικού άκρου του μικρού και του μεγάλου λοβού αντίστοιχα. Επιπλέον, μια γραμμική περιοχή των επαναλαμβανόμενων RS διπεπτιδίων (N -RS1) (βλ. Σχήμα Α.1.14), δεσμεύεται εκτεταμένα στην αύλακα σύνδεσης, η οποία βρίσκεται στην περιοχή κινάσης. Τέλος, η πρώτη φωσφοσερίνη η οποία δημιουργείται δεσμεύεται σε μία βασική θέση εντός της καταλυτικής περιοχής (Ngo et al. 2008). Περαιτέρω κινητικές μελέτες έδειξαν ότι κατά την πορεία της φωσφορυλίωσης συντελείται μια κατευθυνόμενη ολίσθηση του RS πεπτιδίου του υποστρώματος, διαμέσου της αύλακας σύνδεσης, στο ενεργό κέντρο της κινάσης (Σχήμα Α.1.12). Μάλιστα, η ηλεκτραρνητική αύλακα σύνδεσης υποβοηθά την κατευθυνόμενη φωσφορυλίωση τροφοδοτώντας συστηματικά διπεπτίδια RS στο ενεργό κέντρο της SRPK1. Κατά τη εξέλιξη της φωσφορυλίωσης παρατηρείται το ξεδίπλωμα του β4 φύλλου της περιοχής RRM2 του υποστρώματος και πρόσδεση της υπόλοιπης σφαιρικά αναδιπλωμένης περιοχής RRM2 στην αύλακα σύνδεσης (Ngo et al. 2008). 41

. Σχήμα Α.1.12. Μοντέλο φωσφορυλίωσης του SRSF1 (ASF/SF2) από την SRPK1. A. Η SRPK1 δεσμεύει τον SRSF1 χρησιμοποιώντας τρία δομικά χαρακτηριστικά, έναν ηλεκτροθετικό θύλακα για το συντονισμό των φωσφοδιπεπτιδίων, την αύλακα σύνδεσης για την πρόσδεση της εκτεταμένης SR αλυσίδας και εκτεταμένες επιφάνειες επαφής στο αμινοκαι καρβοξυ-τελικό άκρο του μικρού και του μεγάλου λοβού αντίστοιχα οι οποίες αλληλεπιδρούν με τη σφαιρική περιοχή η οποία σχηματίζει το μοτίβο αναγνώρισης RNA 2 (RRM2) του SRSF1. Β. Η συνεχής φωσφορυλίωση επιφέρει ξεδίπλωμα του β4 φύλλου της σφαιρικής RRM2 περιοχής του SRSF1 όπως εκτείνεται δια μέσο της αύλακας σύνδεσης (Mao, Ceccarelli, and Sicheri 2008). H SRPK1 φωσφορυλιώνει αρκετές διαδοχικές σερίνες στο πλούσιο ηλεκτροθετικό περιβάλλον του υποστρώματος. Για να επιτελέσει αυτό το έργο, η κινάση θα πρέπει να ελιχθεί επιδέξια πάνω σε ένα υπόστρωμα του οποίου το φορτίο αλλάζει δραματικά μετά από κάθε νέα προσθήκη φωσφορικής ομάδας. Έτσι εγείρεται το ερώτημα αν η κινάση χρησιμοποιεί έναν συνεχή μηχανισμό φωσφορυλίωσης (processive phosphorylation) δηλαδή με το ένζυμο να προσδένεται στο υπόστρωμα μια φορά και να φωσφορυλιώνει όλες της διαθέσιμες θέσεις πριν αποδεσμευτεί από αυτό ή έναν ασυνεχή τρόπο φωσφορυλίωσης (distributive phosphorylation) κατά τον οποίο η κινάση αποδεσμεύεται από το υπόστρωμά της μετά από κάθε προσθήκη φωσφορικής ομάδας (Ghosh and Adams 2011). Σύμφωνα με τους Ghosh and Adams (2011), η SRPK1 αρχικά προσδένεται σε μια συγκεκριμένη περιοχή του υποστρώματος, SRSF1, το οποίο καλείται κουτί έναρξης (initiation box), το οποίο βρίσκεται μεταξύ της Ser 221 και της Ser 225 στο καρβοξυ-τελικό άκρο της RS1 περιοχής (βλέπε Σχήμα Α.1.13). Στη συνέχεια εκτελεί κατευθυνόμενη φωσφορυλίωση από το καρβοξυ-τελικό στο αμινο-τελικό άκρο της περιοχής RS1, προσθέτοντας πέντε 42

με οκτώ φωσφορικές ομάδες στις διαδοχικές σερίνες, με συνεχή τρόπο (processive phosphorylation). Ακολούθως, καθώς η κινάση προσθέτει φωσφορικές ομάδες, το τοπικό φορτίο αλλάζει, μειώνοντας έτσι σταδιακά την αγχιστεία της με το υπόστρωμα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αποδέσμευση της κινάσης και τη μεταβολή του μηχανισμού φωσφορυλίωσης από συνεχή σε ασυνεχή (distributive phosphorylation) δηλαδή για την τροποποίηση των υπόλοιπων σερινών δεσμεύεται και αποδεσμεύεται από το υπόστρωμα (Ghosh and Adams 2011). Σχήμα Α.1.13. Κατευθυνόμενη φωσφορυλίωση. H SRPK1 ξεκινάει τη φωσφορυλίωση από το κουτί έναρξης (Ser 221-225) στο κέντρο της RS περιοχής και συνεχίζει κατά μήκος της περιοχής RS1 με κατεύθυνση από το καρβοξυ-τελικό προς το αμινο-τελικό άκρο της περιοχής. Τα βέλη ανάλογα με την έντασή τους υποδεικνύουν ποιος μηχανισμός στην κάθε φάση της φωσφορυλίωσης προτιμάται, ο συνεχής ή ο ασυνεχής. Έτσι βλέπουμε ο συνεχής τρόπος φωσφορυλίωσης σταδιακά να μειώνεται, καθώς η SRPK1 φωσφορυλιώνει σερίνες και η αποδέσμευση της κινάσης να ευνοείται σε σχέση με την συνέχιση της αντίδρασης (Ghosh and Adams 2011). Τα περισσότερα δεδομένα για το μηχανισμό φωσφορυλίωσης, έχουν προέλθει από μελέτες πάνω στο κύριο υπόστρωμα της SRPK1, τον SRSF1. Όμως, οι περισσότερες SR πρωτεΐνες διαθέτουν λιγότερα επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια στο καρβοξυ-τελικό άκρο του μορίου τους, και γεννάται έτσι το ερώτημα με ποιόν τρόπο επηρεάζει το μήκος της SR ακολουθίας το μηχανισμό της φωσφορυλίωσης. Προς διαλεύκανση αυτού του ζητήματος, ο Aubol και οι συνεργάτες του, χρησιμοποίησαν στις μελέτες τους ένα εναλλακτικό υπόστρωμα το οποίο εμπεριέχει λιγότερα RS διπεπτίδια, το Tra2β(ΔN) (Σχήμα Α.1.14). Η Tra2β(ΔN) πρωτεΐνη είναι μία μεταλλαγμένη 43

μορφή της Tra2β1 από την οποία έχει αφαιρεθεί το Ν-τελικό άκρο παίρνοντας έτσι την κλασική δομή των SR πρωτεϊνών. Σχήμα Α.1.14. Σχηματική αναπαράσταση των RS περιοχών του SRSF1 και του Tra2β(ΔΝ). Στο πάνω μέρος φαίνονται οι δύο περιοχές αναγνώρισης του RNA (RRM1 και RRM2) του SRSF1 όπως και η αμινοξική αλληλουχία της RS περιοχής με τα πολλαπλά επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια. Στο κάτω μέρος φαίνεται η RRM περιοχή του Tra2β(ΔN) και η αμινοξική αλληλουχία της RS περιοχής με τα περιορισμένα (τέσσερα) επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια (Aubol et al. 2013) Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι το μήκος των επαναλαμβανόμενων RS διπεπτιδίων αλλάζει την κινητική της φωσφορυλίωσης. H RS περιοχή του Tra2β(ΔN), αντί να δεσμεύεται στην αύλακα σύνδεσης όπως στην περίπτωση του SRSF1, προσπερνά αυτήν τη δομική περιοχή. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του καθοριστικού αργού σταδίου της φωσφορυλίωσης. Πιο συγκεκριμένα, όπως βλέπουμε και στην Σχήμα Α.1.15, ενώ στη φωσφορυλίωση του SRSF1 το αργό στάδιο το οποίο καθόριζε την ταχύτητα της αντίδρασης ήταν η αποδέσμευση του νουκλεοτιδίου ADP, στην περίπτωση του Tra2β(ΔN) είναι η μεταφορά και η απελευθέρωση της πρωτεΐνης. Άρα η αύλακα σύνδεσης για της πρωτεΐνες με λίγες αλληλουχίες RS, καθίσταται περιττή (Aubol et al. 2013). Σχήμα Α.1.15. Σύγκριση μηχανισμών φωσφορυλίωσης ανάλογα με το μήκος της RS περιοχής του υποστρώματος. Α. Μεγάλη περιοχή επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων RS. Η αύλακα σύνδεσης προσανατολίζει την RS περιοχή για την αποδοτική μεταφορά της 44

φωσφορικής ομάδας και τη μεταφορά των αμινο-τελικών RS διπεπτιδίων στο ενεργό κέντρο. Το στάδιο το οποίο καθορίζει την ταχύτητα της αντίδρασης (αργό στάδιο) είναι η απελευθέρωση του ADP (nucleotide exchange). Β. Μικρή περιοχή επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων RS. Η αύλακα σύνδεσης παρακάμπτεται και μόνο τα τοπικά κατάλοιπα στο ενεργό κέντρο της κινάσης ελέγχουν την φωσφορυλίωση της RS περιοχής. Η μεταφορά της φωσφορικής ομάδας και η απελευθέρωση του ADP γίνονται γρήγορα αλλά το στάδιο το οποίο καθορίζει την ταχύτητα της αντίδρασης (αργό στάδιο) είναι η μετατόπιση των διπεπτιδίων (Aubol et al. 2013). 45

Α.2. Μικρομοριακοί αναστολείς των SRPKs Α.2.1. Γενικά Το εναλλακτικό μάτισμα στους διάφορους καρκίνους, υφίσταται πολλές διαφοροποιήσεις σε σχέση με τις μη παθολογικές καταστάσεις. Κατ επέκταση, όπως θα αναλυθεί και στην επόμενη ενότητα, οι SRPKs, οι οποίες κατά κύριο λόγο ρυθμίζουν το μάτισμα, διαφοροποιούνται ως προς την λειτουργία τους και την έκφρασή τους στους καρκίνους. Το γεγονός αυτό συμβάλει στην απορρύθμιση βασικών οδών σηματοδότησης, οδηγώντας σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, απώλεια του ελέγχου της απόπτωσης, καθώς επίσης και αυξημένη μεταναστευτική και διεισδυτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων. Έτσι, η παρουσία εναλλακτικών προϊόντων ματίσματος, τα οποία ευνοούν την καρκινογένεση ή την περαιτέρω ανάπτυξη του όγκου, καθιστά τα ίδια αλλά και τις κινάσες οι οποίες τα ρυθμίζουν, πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Α.2.2. Αναστολείς των SRPKs Οι πρώτες ενώσεις οι οποίες συντέθηκαν και ανέστειλαν την δράση της SRPK1 ήταν τρικυκλικά παράγωγα του κινοξαλινικού δακτυλίου. Η ανασταλτική τους δράση απέναντι στην κινάση κυμαίνεται από τιμές IC50 40nM μέχρι 1mM (Σχήμα Α.2.1). Σχήμα Α.2.1. Τρικυκλικά παράγωγα του κινοξαλινικού δακτυλίου (Székelyhidi et al. 2005). Η εξειδίκευσή τους δεν είναι ικανοποιητική καθώς τα πιο δραστικά παράγωγα ανέστειλαν και άλλες κινάσες όπως την κινάση τυροσίνης c-src (Székelyhidi et al. 2005). Το 2006, o Fukuhara και οι συνεργάτες του, με τη χρήση ενός συνθετικού πεπτιδίου επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων RS ως υπόστρωμα, 46

εξέτασαν χημικές βιβλιοθήκες για εύρεση ειδικών αναστολέων των SRPKs. Μετά από τη σάρωση 100.000 χημικών ενώσεων κατέληξαν σε μια ένωση του ισονικοτιναμιδίου (Σχήμα A.2.2). Ο SRPIN340 αναστέλλει εκλεκτικά την SRPK1 (IC50 = 0,14μΜ) και την SRPK2 (IC50 = 1,8μΜ) (Fukuhara et al. 2006). Σχήμα Α.2.2. Δομή του (SRPIN340). Η συγκρυστάλλωση της SRPK1 μαζί με τον αναστολέα της SRPIN340 ανέδειξε την δομή του συμπλόκου μετά από κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, ο αναστολέας δεσμεύεται στη θέση δέσμευσης του ATP του ενζύμου και επάγει την μετακίνηση του πεπτιδίου Leu168 Gly169 με σκοπό να εξοικονομηθεί χώρος για την ογκώδη τριφθορομεθυλο-ομάδα του SRPIN340 (Morooka et al. 2015). Η ίδια ερευνητική ομάδα ανακάλυψε και τον SRPIN803, ο οποίος αναστέλλει συγχρόνως την SRPK1 και την CK2. Η διπλή δράση αυτού του φαρμάκου κατέστειλε αποτελεσματικά την παραγωγή VEGF στα κύτταρα ARPE-19 (κύτταρα από το μελάγχρουν επιθήλιο του αμφιβληστροειδούς). Επιπλέον, ο SRPIN803 κατέστειλε τη χοριοειδική νεοαγγείωση σε μοντέλο ποντικιού. Άλλα παράγωγα του SRPIN340, τα οποία παρασκευάστηκαν με πρότυπο την δομή του, επέδειξαν μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα απέναντι σε κυτταρικές σειρές μυελογενούς και λεμφοειδούς λευχαιμίας σε σύγκριση με τον ίδιο (Siqueira et al. 2017). Η Gammons και οι συνεργάτες της χρησιμοποιώντας in vitro δοκιμασίες κινάσης και δοκιμασίες μετατόπισης θερμοκρασίας, ταυτοποίησαν το διϋποκατεστημένο φουράνιο SPHINX (Σχήμα A.2.3) ως εκλεκτικό αναστολέα απέναντι στην SPRK1 με τιμή IC50 0,58μΜ. Η δομή του SPHINX παρουσιάζει ομοιότητες με τον SRPIN340, διατηρώντας την τριφθορομεθυλοομάδα και μεταβάλλοντας δομικά τους άλλους υποκαταστάτες. 47

Σχήμα Α.2.3. Δομή του SPHINX. Διαπιστώθηκε επίσης σε in vitro πειράματα ότι ο SPHINX μείωσε την έκφραση των προ-αγγειογενετικών χωρίς να μειώνει την έκφραση των αντιαγγειογενετικών ισομορφών του VEGF σε κύτταρα ARPE-19 (Gammons et al. 2013). O SPHINX και ο SRPIN340 μείωσαν σημαντικά τη χοριοειδική νεοαγγείωση σε in vivo πειράματα και ως εκ τούτου αυτά τα μόρια τίθενται ως υποψήφια φάρμακα για τη θεραπεία νεοαγγειακών παθήσεων όπως ο εκφυλισμός της ωχράς κηλίδας (Bates et al. 2017). Η ιδία ερευνητική ομάδα, με βάση τον σκελετό του SPHINX, κατάφερε να συνθέσει πρόσφατα, το πιο εξειδικευμένο μόριο απέναντι στην SRPK1 το οποίο έχουμε στην διάθεσή μας ως σήμερα, ομομάζοντάς το SPHINX31. Σχήμα Α.2.4. Δομή του SPHINX31 και δράση απέναντι στην SRPK1 (Batson et al. 2017). Ο SPHINX31, έχει τιμές IC50 για την κινάση 5,9 nm και πειράματα φθορισμομετρικής διαφορικής σάρωσης (differential scanning fluorimetry, DSF) έδειξαν ότι ο αναστολέας ήταν δραστικός απέναντι στην SRPK1 σε αντίθεση με άλλες κινάσες οι οποίες εμπλέκονται στο μάτισμα. Η χορήγηση του SPHINX31 σε in vivo και in vitro πειράματα οδήγησε στην αναστολή της 48

δράσης της SRPK1 με αποτέλεσμα τη μείωση της φωσφορυλίωσης του SRSF1 και την εναλλαγή του τρόπου ματίσματος του VEGF-A, ευνοώντας την αντι-αγγειογενετική έναντι της προ-αγγειογενετικής ισομορφής (Σχήμα Α.2.4). Αυτή η ιδιότητα, είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης αιμοφόρων αγγείων σε μοντέλα χοριοειδικής νεοαγγείωσης σε in vivo (Batson et al. 2017). 49

A.3. SRPKs και ο ρόλος τους στον καρκίνο Οι μεταβολές στο εναλλακτικό μάτισμα αποτελούν ένα κοινό χαρακτηριστικό των ανθρώπινων όγκων. Οι παράγοντες ματίσματος οι οποίοι ρυθμίζουν αυτήν τη διαδικασία, φωσφορυλιώνονται από πολλές κινάσες, οι οποίες προσθέτουν φωσφορικές ομάδες σε πρωτεΐνες με περιοχές πλούσιες σε κατάλοιπα σερίνης και αργινίνης, όπως οι SRPKs, οι κινάσες τύπου cdc2 και η τοποϊσομεράση 1 αλλά και πρωτεϊνικές κινάσες όπως η Αkt. Η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος ρυθμίζει την υποκυτταρική τους εντόπιση και τις αλληλεπιδράσεις τους με τους μεταγραφικούς στόχους και έτσι συμβάλλει σημαντικά στην ωρίμανση του πρόδρομου mrna. Δημοσιευμένες μελέτες καταδεικνύουν ότι τα επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών όπως και οι κυτταρικές τους λειτουργίες, συνήθως διαταράσσονται σε καρκίνους. Η παρεκκλίνουσα λειτουργία των κινασών ματίσματος έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του τρόπου ματίσματος ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών όπως η p53 και κύριων ρυθμιστών της κυτταρικής σηματοδότησης όπως η ΜΑΡΚ, της απόπτωσης όπως ο MCL και της αγγειογένεσης όπως ο VEGF. Η δυσλειτουργία αυτών των ρυθμιστικών δικτύων συμβάλλει στον ογκογονικό μετασχηματισμό, τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, την ενισχυμένη μετανάστευση και διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων. Παρακάτω συνοψίζονται τα βιβλιογραφικά δεδομένα της έκφρασης των SRPKs σε διάφορα είδη καρκίνου και γίνεται μια προσπάθεια καταγραφής του ρόλου των κινασών αυτών στον καρκίνο. Επιπλέον, αναλύονται οι επιπτώσεις της έκφρασης των SRPKs στην απόκριση των όγκων και των καρκινικών κυττάρων στα χημειοθεραπευτικά, όπως επίσης και η δυνητική αξιοποίησή τους ως κλινικούς στόχους (Czubaty and Piekiełko-Witkowska 2017). Α.3.1. Έκφραση και ρόλος των SRPKs σε διάφορους καρκίνους Η έκφραση των SRPK1, SRPK2, και SRPK3, των τριών ανθρώπινων μελών της οικογένειας των SRPKs, όπως θα αναλυθεί σε αυτήν την ενότητα, ποικίλει στα διάφορα είδη καρκίνου. Μελέτες αναστολής της έκφρασης των κινασών αλλά και υπερέκφρασής τους, δίνουν απαντήσεις για τον ρόλο τους στην 50

καρκινογένεση και την εξέλιξη των όγκων όπως επίσης και για την ανταπόκρισή τους στα χημειοθεραπευτικά. Α.3.1.1. Ουρογεννητικό Νεοπλάσματα των όρχεων από γεννητικά κύτταρα Η πρώτη έρευνα η οποία εστίασε σε ένα μέλος των SRPKs σε καρκινικά κύτταρα έγινε το 2004 από τον Schenk και τους συνεργάτες του και αφορούσε την έκφραση της SRPK1 σε νεοπλάσματα των όρχεων από γεννητικά κύτταρα (testicular germ cell tumors-tgcts). Οι όγκοι από γεννητικά κύτταρα εμφανίζουν μεγάλη ευαισθησία στη χημειοθεραπεία με ενώσεις της πλατίνης με μόνο το 10% των ασθενών να εμφανίζουν αντίσταση. Προηγούμενες μελέτες της ίδιας ερευνητικής ομάδας, με σκοπό να ερευνήσουν τους κυτταρικούς μηχανισμούς οι οποίοι διέπουν την αντίσταση και την ευαισθησία στην cis-πλατίνη, ανέδειξαν την SKY1 του Saccharomyces cerevisiae ως μια πρωτεΐνη της οποίας η παρουσία της ήταν καθοριστική για την ευαισθησία των κυττάρων της ζύμης στη cis-πλατίνη, καθώς η διάσπαση/αποδιοργάνωση του γονιδίου της επέφερε αντίσταση σε αυτό το χημειοθεραπευτικό. Επιπρόσθετα, η ετερόλογη έκφραση της ανθρώπινης SRPK1 στα μεταλλαγμένα κύτταρα τα οποία δεν εξέφραζαν την SKY1, επανάφερε την ευαισθησία στη cis-πλατίνη. Το παραπάνω εύρημα σε συνδυασμό με τα μεγάλα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 στους φυσιολογικούς όρχεις των θηλαστικών, τους οδήγησε στην υπόθεση ότι τα επίπεδα της κινάσης αυτής μπορεί να συσχετίζονται με την ευαισθησία την οποία επιδεικνύουν οι TGCTs στη cis-πλατίνη. Έτσι, μελέτησαν τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 σε μη σεμινωματώδεις όγκους των TGCTs με πειράματα ανοσοϊστοχημείας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε τυχαία επιλεγμένους όγκους ασθενών και σε όγκους ασθενών οι οποίοι ανταποκρίνονταν στη βασική χημειοθεραπεία, τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 ήταν μεγάλα σε αντίθεση με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης τα οποία εμφάνιζαν ανθεκτικοί στην χημειοθεραπεία όγκοι ή όγκοι οι οποίοι ανταποκρίνονταν μόνο σε υψηλές δόσεις χημειοθεραπευτικού. Η στατιστικώς σημαντική διασύνδεση μεταξύ της ανταπόκρισης στη cis-πλατίνη και της αυξημένης έκφρασης της SRPK1 στα νεοπλάσματα των όρχεων από γεννητικά κύτταρα τους οδήγησε να 51

προτείνουν ως προγνωστικό δείκτη για την ανταπόκριση στα χημειοθεραπευτικά, τα επίπεδα έκφρασης της κινάσης (Schenk et al. 2004). Καρκίνος των ωοθηκών Ο καρκίνος των ωοθηκών (ovarian cancer) είναι ο δεύτερος πιο συχνά διαγνωσμένος γυναικολογικός καρκίνος στον κόσμο και προκαλεί περισσότερους θανάτους ετησίως από οποιονδήποτε άλλο καρκίνο του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος. Το 2012 δημοσιεύτηκε η πρώτη έρευνα η οποία εξέταζε τον ρόλο της SRPK1 στην πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών. Με πειράματα Western blot ανάλυσης, βρέθηκε ότι η SRPK1 υπερεκφράζεται σε τέσσερις από τις έξι κυτταρικές σειρές του καρκίνου των ωοθηκών σε σύγκριση με μια αθανατοποιημένη επιθηλιακή κυτταρική σειρά της επιφανείας των ωοθηκών. Παράλληλα, με πειράματα ανοσοϊστοχημείας βρέθηκε ότι η SRPK1 υπερεκφράζεται στο 55% των δειγμάτων από όγκο των ωοθηκών σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά δείγματα ωοθηκών. Επίσης, η μείωση της έκφρασης της SRPK1 με τη χρήση sirna σε κυτταρικές σειρές του καρκίνου των ωοθηκών επέφερε μείωση στον ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, βραδύτερη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και περιορισμένη ανάπτυξη εστιών χωρίς επίστρωση προσκόλλησης και μεταναστευτική ικανότητα in vitro. Αυτοί οι φαινότυποι συσχετίστηκαν με μεταβολές στα σηματοδοτικά μονοπάτια των ενεργοποιούμενων από µιτογόνα ερεθίσματα πρωτεϊνικών κινασών (Mitogen Activated Protein Kinases-MAPK) και της κινάσης πρωτεϊνών B (Akt/PKB), καθώς μειώθηκαν τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης (ενεργοποιημένης) πρωτεΐνης ΜΑΡΚ και Αkt στα κύτταρα τα οποία είχε αποσιωπηθεί γονιδιακά η SRPK1. Τέλος, η αναστολή της SRPK1 αύξησε την ευαισθησία στη θεραπεία με cis-πλατίνη (Odunsi et al. 2012). Αντίθετα όμως ήταν τα αποτελέσματα προγενέστερης έρευνας πάνω στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών Α2780, όπου η αναστολή της SRPK1 επέφερε αύξηση στην αντίσταση στη cis-πλατίνη (Schenk et al. 2001). Καρκίνος του προστάτη Ο καρκίνος του προστάτη (prostate cancer-pca) εμφανίζεται συνήθως σε άνδρες μεγάλης ηλικίας και είναι ο πρώτος σε συχνότητα καρκίνος στους 52

άνδρες των δυτικών κοινωνιών, αποτελώντας τη δεύτερη, μετά τον καρκίνο του πνεύμονα, αιτία θανάτου από νεοπλασματική νόσο. Με αφορμή την αυξημένη έκφραση του VEGF στη νόσο και την αποτυχία στα φαρμακευτικά μοντέλα τα οποία στόχευαν μόνο σε αυτόν για την αντιμετώπιση του PCa, το 2015, οι ερευνητές στράφηκαν στη διερεύνηση των μορίων τα οποία ελέγχουν το μάτισμά του βάζοντας στο στόχαστρο την SRPK1. Μετά από ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε δείγματα όγκων καρκίνου του προστάτη από διάφορους ασθενείς αποκαλύφθηκε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση της SRPK1 σε σύγκριση με τον καλοήθη ιστό (Bullock et al. 2016; Mavrou et al. 2015). Επίσης οι ερευνητές έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 συσχετίζονται με το στάδιο της νόσου αλλά και με τη διεισδυτική ικανότητα του όγκου (Bullock et al. 2016). Όταν ανέστειλαν την έκφραση της SRPK1 με γονιδιακή αποσιώπηση στα κύτταρα PC-3 του καρκίνου του προστάτη, παρατήρησαν μια μετατόπιση στο μάτισμα του VEGF-A από την προαγγειογενετική μορφή VEGF165 στην αντι-αγγειογενετική μορφή VEGF165b, με αποτέλεσμα να μειώνεται η ανάπτυξη του όγκου σε ξενομοσχεύματα όπως και η μικροαγγειακή πυκνότητα των όγκων. Η αναστολή της έκφρασης όμως δεν επηρέασε την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, την διεισδυτική ικανότητα και την μετανάστευση των κυττάρων PC-3, in vitro. Ανάλογα αποτελέσματα έδειξε και η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 με τη χρήση του ειδικού αναστολέα της SPHINX (Mavrou et al. 2015). Καρκίνος του νεφρού Το νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (renal cell carcinoma-rcc) είναι η τρίτη συχνότερη κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος. Εμφανίζεται συχνότερα σε άντρες, συνήθως στην έκτη και έβδομη δεκαετία της ζωής. Μέχρι πολύ πρόσφατα, ο ρόλος της SRPK1 στο RCC παρέμενε άγνωστος ώσπου το 2017, μια ερευνητική ομάδα έδειξε ότι η κινάση αυτή βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα σε ιστούς του νεφροκυτταρικού καρκινώματος αλλά και σε αντίστοιχες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 μειώνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, την μεταναστευτική και διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων RCC όπως επίσης και την ανάπτυξη του όγκου in vivo. Τέλος, βρέθηκε ότι η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 μειώνει σημαντικά τη φωσφορυλίωση των PI3K και Akt σε κύτταρα RCC. Με 53

αυτά τα δεδομένα, οι ερευνητές πρότειναν ότι οι αλλαγές στις καρκινικές ιδιότητες των κυττάρων, ύστερα από τη μείωση της έκφραση της SRPK1, οφείλονται στην καταστολή της οδού σηματοδότησης PI3K / Akt (Han et al. 2017). Α.3.1.2. Γαστρεντερικό Καρκίνος του παχέος εντέρου Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (colorectal cancer-crc) είναι ένας κακοήθης όγκος, ο οποίος αναπτύσσεται στην εσωτερική επιφάνεια του παχέος εντέρου και αποτελεί διεθνώς την τρίτη αιτία θανάτου από κακοήθη νόσο. H έκφραση της SRPK1 στον CRC φάνηκε να είναι και μειωμένη, αλλά κυρίως αυξημένη σε σχέση με υγιή γειτονικό ιστό (Hayes, Carrigan, and Miller 2007; Wang et al. 2014). Τα κύτταρα της υπο-σειράς της HT29 κυτταρικής σειράς του CRC, τα οποία αντιστέκονται στην οξαλιπλατίνη, εκφράζουν λιγότερο την SRPK1 σε σχέση με τα πρωταρχικά HT29 κύτταρα και επίσης η έκθεση των HT29 σε οξαλιπλατίνη οδηγεί στην αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της SRPK1. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε ένας συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης της SRPK1 και του βαθμού αντίστασης στην οξαλιπλατίνη. Συγκεκριμένα, χαμηλή μεταγραφή του γονιδίου της κινάσης αντιστοιχεί σε υψηλότερη συγκέντρωση αναστολής κατά 50% της οξαλιπλατίνης (IC50-η δόση η οποία απαιτείται για τη θανάτωση του 50% των κυττάρων) σε κύτταρα CRC (C. Plasencia et al. 2006). Σε αντίθεση με την προηγούμενη παρατήρηση για τον ρόλο της SRPK1 στην οξαλιπλατίνη, άλλη έρευνα έδειξε ότι η μείωση την έκφρασης της SRPK1 με τη χρήση sirna οδήγησε στην ευαισθητοποίηση των CRC κυττάρων στην γεμσιταμπίνη και την cis-πλατίνη. Επίσης, η μειωμένη έκφραση της κινάσης οδήγησε σε αύξηση της απόπτωσης των CRC κυττάρων, στη μείωση της φωσφορυλίωσης πολλών SR πρωτεϊνών όπως επίσης και στη μεταβολή του ματίσματος του μεταγράφου της MP2K κινάσης (Hayes et al. 2007). Ιδιαίτερη έμφαση έδωσαν άλλοι ερευνητές στο ρόλο της SRPK1 στον εναλλακτικό τρόπο ματίσματος του γονιδίου SLC39A14, το οποίο εκφράζει έναν μεταφορέα μεταλλικών ιόντων, και πιο συγκεκριμένα έδειξαν ότι το διαφορετικό μάτισμά του στον καρκίνο του CRC οφείλεται στην υπερέκφραση της SRPK1 (Thorsen et al. 2011). Επιπρόσθετα, στον CRC έχει 54

παρατηρηθεί αυξημένη παραγωγή του Rac1b, το οποίο είναι εναλλακτικό προϊόν ματίσματος του Rac1 (των Rho GTPασών), με την SRPK1 να παίζει ενεργό ρόλο σε αυτό, καθώς παρατηρήθηκε ότι αναστολή της οδηγεί σε μείωση της φωσφορυλίωσης του παράγοντα ματίσματος SRSF1 και κατ επέκταση στον περιορισμό της διαθεσιμότητάς του στον πυρήνα, ο οποίος σκοπό θα είχε να επάγει την συγκράτηση του εξονίου 3b στο πρόδρομο mrna του Rac1 (Σχήμα Α.3.3.) (Goncalves et al. 2014). Τέλος, μελέτες για το ρόλο της κινάσης στην αγγειογένεση έδειξαν ότι, η σίγαση της SRPK1 σε κύτταρα του CRC έχει ως αποτέλεσμα τη μειωμένη αγγειογένεση και ανάπτυξη όγκων, όταν αυτά εμβολιάστηκαν σε ποντίκια (Amin et al. 2011). Μελέτες για το ρόλο της SRPK2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου έδειξαν αυξημένη έκφρασή της σε δείγματα ασθενών. Η υπερέκφρασή της προώθησε την ανάπτυξη και την μετανάστευση κυττάρων του CRC ενώ αντίστροφα, η αναστολή της έκφρασής παρεμπόδισε την ανάπτυξη, την μετανάστευση και την ογκογένεση. Μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι η SRPK2 ενεργοποιεί το σηματοδοτικό μονοπάτι των ελεγχόμενων από εξωκυττάρια ερεθίσματα κινασών (Extracellular signal Regulated Kinases-ERK) μέσω αλληλεπίδρασης με τον ανοδικό ρυθμιστή τους, την Β-τύπου Raf κινάση (BRAF) (Wang et al. 2016). Καρκίνος του στομάχου Ο καρκίνος του στομάχου (gastric cancer-gc) είναι ένα από τα συνηθέστερα καρκινώματα και αποτελεί τη δεύτερη κατά σειρά αιτία θανάτου σχετιζόμενη με τον καρκίνο παγκοσμίως. Σε πρόσφατη μελέτη διερευνήθηκε η έκφραση και ο ρόλος της SRPK1 στον GC και τα αποτελέσματα μετά την ανοσοϊστοχημική μελέτη 158 ιστών έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της κινάσης εμφανίζονται αυξημένα με την αύξηση αυτή να συσχετίζεται σημαντικά με το προχωρημένο στάδιο του καρκίνου. Με τη χρήση καρκινικών κυτταρικών σειρών του GC έδειξαν ότι η υπερέκφραση της SRPK1 οδήγησε στην αυξημένη βιωσιμότητα και διηθητική ικανότητα των κυττάρων, ενώ σε αντίστροφα πειράματα αναστολής της έκφρασής της, τα ογκογονικά αυτά χαρακτηριστικά εξασθένησαν. Προς αναζήτηση των σηματοδοτικών μηχανισμών της SRPK1 οι οποίοι προάγουν την εξέλιξη του καρκίνου, βρήκαν 55

ότι η υπερέκφραση της κινάσης σε κύτταρα GC οδήγησε στην αύξηση βιομαρτύρων της επιθηλιακής προς μεσεγχυματική μετατροπής (epithelial to mesenchymal transition-emt) και στην αύξηση των φωσφορυλιωμένων μορφών της Akt και της ERK. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να αντιστραφεί με υπερέκφραση της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (protein phosphatase 2A- PP2A) και της διπλής εξειδίκευσης φωσφατάσης 6 (dual specificity phosphatase 6-DUSP6) (X. Xu et al. 2017). Σε μεταγενέστερη δημοσίευση από άλλη ερευνητική ομάδα επιβεβαιώθηκε η αυξημένη έκφραση της SRPK1 σε ιστούς και κυτταρικές σειρές του GC. Η έρευνα αυτή ήρθε όμως να προσθέσει και την παρατήρηση της αυξημένης έκφρασης του υποδοχέα του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα 1 (insulin-like growth factor receptor 1- IGF1R) η οποία συσχετίζεται άμεσα με τα αυξημένα επίπεδα της SRPK1 σύμφωνα με τον συντελεστή συσχέτισης Spearman στον GC. Επίσης εξέτασαν τη συσχέτιση της μετάδοσης σήματος στον άξονα IGF1-SRPK1 με το φαινόμενο της επιθηλιακής προς μεσεγχυματική μετατροπής (EMT). Με Western blot ανάλυση έδειξαν ότι σε κύτταρα GC τα οποία έχουν εκτεθεί σε αυξανόμενες ποσότητες IGF1, αυξήθηκαν και τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Αkt και της SRPK1, όπως επίσης και βιομαρτύρων οι οποίιοι σχετίζονται με την εξέλιξη του φαινομένου ΕΜΤ. Επιπρόσθετα, η γονιδιακή αποσιώπηση της SRPK1 είχε ως αποτέλεσμα να εξασθενήσει το παραπάνω φαινόμενο, τα κύτταρα GC να εφησυχάζουν στην G0/G1 φάση και να μειωθεί η ικανότητά τους για μετανάστευση και η διηθητική τους ικανότητα. Συμπερασματικά, οι ερευνητές πρότειναν ότι ο IGF1 επαγάγει την έκφραση της SRPK1 η οποία, μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της Akt, ελέγχει την εξέλιξη του φαινομένου ΕΜΤ και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου (Wang et al. 2017). Καρκίνος του παγκρέατος Το αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου (pancreatic ductal adenocarcinoma-pdac) αποτελεί την πιο συνήθη νεοπλασία του παγκρέατος και είναι ένας από τους πιο επιθετικούς και θανατηφόρους καρκίνους. Προέρχεται από καρκινική εξαλλαγή των επιθηλιακών κυττάρων των πόρων. Ανοσοϊστοχημική μελέτη στο πάγκρεας έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται κυρίαρχα στα επιθηλιακά κύτταρα των πόρων, ενώ η έκφρασή της αυξάνεται 56

στον αντίστοιχο καρκινικό ιστό όπως και στις κυτταρικές σειρές του PDAC. Σε πειράματα αναστολής της έκφρασης της κινάσης με τη χρήση sirna, προκλήθηκε μείωση στον πολλαπλασιασμό και αύξηση της απόπτωσης των κυττάρων του PDAC, αλλά και ευαισθητοποίηση αυτών στη γεμσιταμπίνη και τη cis-πλατίνη. Όσον αφορά τα καθοδικά σήματα τα οποία επηρεάζονται με την αναστολή της SRPK1, βρέθηκε ότι η μείωση στην έκφρασή της οδηγεί στην αύξηση του προαποπτωτικού παράγοντα Bax και τη μείωση του ριβοσωμικού παράγοντα RPL17, όπως επίσης και τη μείωση των φωσφορυλιωμένων μορφών των MAPK3, MAPK1 και MAPK14 (p38), μέσω της αλλαγής του ματίσματος του μετάγραφου της MAP2K2, το οποίο τις φωσφορυλιώνει (Hayes et al. 2006, 2007). Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (hepatocellular carcinoma-hcc) είναι ο πιο συχνός πρωτοπαθής κακοήθης όγκος του ήπατος στους ενήλικες και σήμερα αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο, μετά τον καρκίνο του πνεύμονα. Η έκφραση της SRPK1 βρέθηκε να είναι αυξημένη στο HCC, σε σύγκριση με υγιείς γειτονικούς ιστούς κα αυτή η αύξηση έχει μεγάλο βαθμό συσχέτισης με το κλινικό στάδιο της νόσου, το χρόνο επιβίωσης του ασθενούς αλλά και το φύλλο (Zhang et al. 2016; Zhou et al. 2013). Σε in vitro πειράματα, η υπερέκφραση της SRPK1 οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του HCC ενώ αναστολή της έκφρασής της κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Το ανενεργό μετάλλαγμα της κινάσης ανέστειλε την ανάπτυξη των υποδόρια εγχυμένων κυττάρων ξενομοσχευμάτων HCC σε ποντίκια. Επιπρόσθετα, η υπερέκφραση της SRPK1 αύξησε τη φωσφορυλίωση της Akt και της PI3K ενώ αντίθετα η καταστολή της εξασθένησε την επαγόμενη από τον EGF φωσφορυλίωση της Akt γεγονότα τα οποία υποδεικνύουν ότι το μονοπάτι PI3Κ/AKT επηρεάζεται από την SRPK1 στο HCC (Zhou et al. 2013). Τέλος, πρόσφατα βρέθηκε ότι το mir-1296, το οποίο δεσμεύεται στην περιοχή 3 UTR του γονιδίου της SRPK1 ελαττώνοντας τα επίπεδα μεταγραφής της, υπo-εκφράζεται στο HCC. Η επαγόμενη από την υποξία μειωμένη έκφραση του mir-1296 επάγει την μετάσταση και την επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή των HCC κυττάρων, πιθανώς μέσω του μονοπατιού σηματοδότησης SRPK1/Akt (Q. Xu et al. 2017). 57

Σε μελέτη η οποία έγινε για τον καθοριστικό πρωτεϊνικό παράγοντα Numb στο HCC βρέθηκε η SRPK2 να παίζει μεγάλο ρόλο στο εναλλακτικό μάτισμά του. Από το Numb μπορούν να προέλθουν δύο ώριμα mrnas με τη μία ισομορφή να περιέχει μια εκτεταμένη περιοχή πλούσια σε προλίνη (PRR L ) σε σύγκριση με την άλλη (PRR S ). Η PRR L εμφανίζει αυξημένη έκφραση στο HCC και συσχετίζεται με την επανεμφάνιση της νόσου και τον μικρό χρόνο επιβίωσης των ασθενών. Η SRPK2 ευνοεί την έκφραση της ισομορφής PRR L ενώ η αναστολή της οδηγεί στη συσσώρευση της PRR S ισομορφής του Numb. Επίσης, στην ίδια μελέτη βρέθηκε ότι ο μοριακός συνοδός Hsp90 καθορίζει την υποκυτταρική κατανομή της κινάσης επιδρώντας έτσι έμμεσα στο εναλλακτικό μάτισμα του Numb (Lu et al. 2015). Α.3.1.3. Πνεύμονας Ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (non-small-cell lung carcinoma- NSCLC) περιγράφει μια ομάδα καρκίνων του πνεύμονα οι οποίοι ονομάζονται «μη-μικροκυτταρικοί», επειδή τα κύτταρα τα οποία βρίσκονται στον όγκο δεν φαίνονται μικρά κάτω από το μικροσκόπιο. Οι τρεις κύριοι ιστολογικοί τύποι του NSCLC είναι το πλακώδες καρκίνωμα (squamous cell carcinoma-scc), το αδενοκαρκίνωμα (lung adenocarcinoma-adc) και το καρκίνωμα του πνεύμονα από μεγάλα κύτταρα (Large cell lung carcinoma-lclc). O Gout και οι συνεργάτες του, πρώτοι παρατήρησαν την αυξημένη έκφραση (πάνω από 70%) βασικών ρυθμιστών του ματίσματος όπως οι παράγοντες ματίσματος SRSF1/SRSF2 και οι κινάσες SRPK1/SRPK2 στους δύο τύπους του NSCLC, το SCC και το ADC, σε σχέση με τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα (Gout et al. 2012). Έδειξαν επίσης, ότι ο SRSF2 βρίσκεται κυρίως στη φωσφορυλιωμένη του μορφή και ότι η κύρια κινάση η οποία τον φωσφορυλιώνει είναι η SRPK2 καθώς υπάρχει μεγάλος βαθμός συσχέτισης της έκφρασής τους στο ADC γεγονός το οποίο είχε αποδειχθεί και σε προηγούμενη μελέτη σε κυτταρικά μοντέλα NSCLC (Edmond et al. 2011). Μελέτη για το ρόλο της SRPK1 στην εξέλιξη του NSCLC έδειξε ότι η υπερέκφρασή της επάγει την ανάπτυξη και την μεταναστευτική ικανότητα, ενώ αναστολή της έκφρασής της οδηγεί σε περιορισμένη ανάπτυξη, μετανάστευση και καρκινογεννητική ικανότητα των κυττάρων NSCLC. Παράλληλα, σε μηχανιστικές μελέτες φάνηκε ότι αυτά τα ογκογονικά χαρακτηριστικά της 58

SRPK1 πραγματοποιούνται μέσω της ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού της β-κατενίνης/tcf (παράγοντας ενίσχυσης των Τ λεμφοκυττάρων). Η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 μείωσε την φωσφορυλίωση της GSK3β, η οποία (η φωσφορυλιωμένη της μορφή) είναι αρνητικός ρυθμιστής της β-κατενίνης (Liu et al. 2016). Σε μεταγενέστερη μελέτη βρέθηκε ότι η έκφραση της SRPK1 έχει άμεση συσχέτιση με το κλινικό στάδιο και τον χρόνο επιβίωσης των ασθενών με NSCLC. Επίσης, η υπερέκφραση της κινάσης οδηγεί στη δημιουργία σφαιρoειδών στις καλλιέργειες και στην υιοθέτηση του φαινοτύπου των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (cancer stem cells-cscs) μέσω της ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού της Wnt/β-κατενίνης στον NSCLC (Gong et al. 2016). Α.3.1.4. Σκελετικός μυς Το ραβδομυοσάρκωμα (rhabdomyosarcoma-rms) είναι το συχνότερο σάρκωμα των μαλακών μορίων της παιδικής ηλικίας και είναι εξαιρετικά κακοήθες. Θεωρείται ότι προέρχεται από το αποτέλεσμα της αποτυχίας των πρόδρομων μυϊκών κυττάρων να διαφοροποιηθούν σε φυσιολογικό μυ. Πολλές διαταραχές σε κυτταρικές λειτουργίες συμβάλλουν στην εξέλιξη αυτού του παιδιατρικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του παρεκκλίνοντος εναλλακτικού ματίσματος. Η οικογένεια του μεταγραφικού παράγοντα ενίσχυσης των μυοκυττάρων 2 (Myocyte Enhancer Factor 2- MEF2) ρυθμίζει πολλές αναπτυξιακές διεργασίες όπως η μυογένεση. Η ισομορφή MEF2Cα1 εκφράζεται σε κύτταρα RMS, χωρίς να παρουσιάζει μυογενετική δραστικότητα, ενώ η έκφραση του MEF2Cα2 προσδίδει μυογενετική δράση και δεν εκφράζεται καθόλου στα κύτταρα του RMS. Η SRPK3 βρέθηκε μειωμένη στα κύτταρα του RMS ενώ φυσιολογικά εκφράζεται περισσότερο στο σκελετικό μυ και ο ρόλος της είναι να προάγει την επικράτηση της MEF2Cα2 στο μάτισμα. Η αποκατάσταση των επιπέδων έκφρασης της κινάσης ή του MEF2Cα2 με υπερέκφρασή τους σε κύτταρα RMS ενισχύει τη διαφοροποίηση και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση. (Zhang et al. 2015). 59

Α.3.1.5. Καρκίνος του μαστού Ο καρκίνος του μαστού αναφέρεται στην ανάπτυξη οποιουδήποτε κακοήθους όγκου στην περιοχή του μαστού. Αποτελεί μία από τις συχνότερα εμφανιζόμενες μορφές καρκίνου παγκοσμίως και είναι η πρώτη σε αριθμό κρουσμάτων στο γυναικείο πληθυσμό. Το 2007, έγινε η πρώτη αναφορά στην SRPK1 σε σχέση με τον καρκίνο του μαστού. Σε αυτήν την έρευνα, και οι ιστοί και τα κύτταρα καρκίνου του μαστού έδειχναν αυξημένη έκφραση της SRPK1 (Hayes et al. 2007). Ανοσοϊστοχημική μελέτη η οποία έγινε σε μεταγενέστερη έρευνα επιβεβαίωσε την αυξημένη έκφραση της SRPK1 στον καρκίνο του μαστού. Μετά από στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων οι ερευνητές έδειξαν ότι η έκφραση της SRPK1 συσχετίζεται σημαντικά με τα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου, δηλαδή χαμηλή έκφραση της SRPK1 οδηγεί σε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης των ασθενών, ενώ υψηλή έκφραση της κινάσης σε μικρότερο. Η πολυπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε ότι η απορρύθμιση της SRPK1 μπορεί να αποτελέσει έναν ανεξάρτητο προγνωστικό μάρτυρα για την έκβαση των ασθενών με καρκίνο του μαστού (Li et al. 2014). Η αναστολή της έκφρασης της κινάσης με τη χρήση sirna αύξησε την απόπτωση και επέφερε ευαισθητοποίηση των κυττάρων αυτού του τύπου καρκίνου στην cisπλατίνη και την γεμσιταμπίνη. Επίσης, η στοχευμένη αναστολή της SRPK1 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση των φωσφορυλιωμένων μορφών των MAPK3, MAPK1 και της Akt η οποία οφείλεται στην αλλαγή του ματίσματος του μετάγραφου της MAP2K2 που τις φωσφορυλιώνει (Hayes et al. 2007). O Lin και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν έναν ακόμα τρόπο με τον οποίο η μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 στα κύτταρα του καρκίνου του μαστού απορυθμίζει το μάτισμα. Συγκεκριμένα, έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση της SRPK1 προκαλεί την κυτταροπλασματική συσσώρευση της SR πρωτεΐνης RBM4 (RNA-binding motif protein 4) και η απουσία της τελευταίας από τον πυρήνα οδηγεί στην αδυναμία έκφρασης των προ-αποπτωτικών ισομορφών IR-B και MCL-1S (Lin et al. 2014). Τέλος, η Roosmalen και οι συνεργάτες της, χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητα μοντέλα ποντικού για την μετάσταση του καρκίνου του μαστού, έδειξαν, ότι έχοντας γονιδιακά αποσιωπημένη την κινάση, καταστέλλεται η 60

μετάσταση του όγκου και η αναδιοργάνωση των δομών της εστιακής προσκόλλησης (Roosmalen et al. 2015). Α.3.1.6. Καρκίνος κεφαλής-τραχήλου Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του οισοφάγου (ESCC) Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του οισοφάγου (Esophageal Squamous Cell Carcinomas-ESCC) είναι από τους πιο συχνούς ιδιαίτερα επιθετικούς καρκίνους του πεπτικού συστήματος. Έρευνα πάνω σε 120 δείγματα ιστών από ESCC έδειξαν την αυξημένη έκφραση της SRPK1 σε σχέση με την μειωμένη έκφραση στους γειτονικά υγιείς ιστούς. Επιπρόσθετα, η κινάση φάνηκε να είναι αυξημένη στα δείγματα από μεταστατικό ESCC σε σύγκριση με το μη μεταστατικό, με τους ερευνητές να προτείνουν τη χρήση της ως βιομάρτυρα για την μεταστατική πορεία και την πρόγνωση του ESCC. Η υπερέκφραση της αγρίου τύπου SRPK1 συνέβαλε στην αύξηση του πολλαπλασιασμού των ESCC. Αντίθετα, η αναστολή της έκφρασής της κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την μετάβασή τους από την G1 στη S φάση οδηγώντας τα σε απόπτωση και μείωσε την διεισδυτική και μεταναστευτική τους ικανότητα in vitro. Επιπρόσθετα, κατέστειλε και την ανάπτυξη των υποδόρια εγχυμένων ESCC κυττάρων σε ποντίκια. Επίσης, western blot ανάλυση κυττάρων με ανεσταλμένη την έκφραση της SRPK1 έδειξε μειωμένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης Akt και αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης κινάσης του αµινοτελικού άκρου του μεταγραφικού παράγοντα c-jun (c-jun N-terminal Kinase-JNK), εμπλέκοντας έτσι την SRPK1 στο μονοπάτι σηματοδότησης, το οποίο επάγεται από τον αναπτυξιακό παράγοντα β (Transforming growth factor β-tgf-β), το οποίο ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, μέσω της ρύθμισης της Αkt και της JNK στο ESCC (Ren et al. 2015). Η έκφραση της SRPK2 ελέγχθηκε σε έξι κυτταρικές σειρές του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος κεφαλής-τραχήλου (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma-HNSCC) σε σχέση με μη καρκινικά στοματικά κύτταρα και βρέθηκε αυξημένη ενώ η αναστολή της έκφρασής της μείωσε το σχηματισμό αποικιών και τη διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων (Radhakrishnan et al. 2016). 61

Α.3.1.7. Αιμοποιητικό Τ Λευχαιμία/Λέμφωμα των Ενηλίκων Η Τ Λευχαιμία/Λέμφωμα των Ενηλίκων (Adult T-cell leukemia/ lymphoma- ATL) είναι ένας σπάνιος καρκίνος του ανοσοποιητικού συστήματος. Τα πρώτα πειράματα RT-PCR έδειξαν ότι η SRPK1 εκφράζεται πολύ στην ATL, σε σύγκριση με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος, ενώ με Western blot ανάλυση φάνηκε η αυξημένη έκφραση της SRPK1 αποκλειστικά σε κύτταρα οξείας ATL (Hishizawa et al. 2005). Η οξεία μυελογενής λευχαιμία (acute myelogenous leukemia-aml) είναι καρκίνος των κυττάρων της λευκής σειράς, ο οποίος χαρακτηρίζεται από ραγδαία ανάπτυξη των λευκών αιμοσφαιρίων τα οποία συσσωρεύονται στο μυελό των οστών και εμποδίζουν την αιμοποίηση. Μελέτη σε ασθενείς με AML έδειξε αυξημένα επίπεδα της SRPK2 και της πρωτεΐνης acinus, ενώ η υπερέκφρασή τους σε κύτταρα AML, αύξησε τον πολλαπλασιασμό τους. Επιπρόσθετα, η αναστολή της έκφρασης της SRPK2 και του acinus στα κύτταρα AML έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασης της κυκλίνης Α1 και το σταμάτημα των κυττάρων στην φάση G1 (Jang et al. 2008). Επίσης, στα ανθρώπινα αθανατοποιημένα κύτταρα μυελογενούς λευχαιμίας K562 βρέθηκε ότι εκφράζεται κυρίαρχα η SRPK1 αλλά και η SRPK1a και ο λόγος της έκφρασής τους είναι κρίσιμος για τη διαφοροποίηση των κυττάρων (Sanidas et al. 2010). Α.3.1.8. Δέρμα Το μελάνωμα το οποίο αναπτύσσεται στο δέρμα καλείται δερματικό μελάνωμα (cutaneous melanoma-cm) και αποτελεί τον πιο συνήθη τύπο μελανώματος. Η πιο συχνή αιτία θανάτου των ασθενών είναι η μετάσταση του πρωτογενούς όγκου (συνήθως στο ήπαρ). Η εξέλιξη του όγκου προϋποθέτει τη διαδικασία της αγγειογένεσης, η οποία ρυθμίζεται από τον αυξητικό παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF-A). Η Gammons και οι συνεργάτες της θέλησαν να μελετήσουν το ρόλο της SRPK1 στη ρύθμιση της έκφρασης των ισομορφών του VEGF στο μελάνωμα. Εναύσματα για τη μελέτη αυτή αποτέλεσαν οι προηγούμενες παρατηρήσεις ότι ο VEGFxxxb εκφράζεται στη φυσιολογική επιδερμίδα στην περιφέρεια του μελανώματος 62

αλλά πολύ λιγότερο στους πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους (Pritchard- Jones et al. 2007) όπως επίσης και ότι η ρύθμιση του ματίσματος του VEGF γίνεται μέσω του παράγοντα ματίσματος SRSF1 ο οποίος φωσφορυλιώνεται από την SRPK1 (Nowak et al. 2010). Έτσι, σε κυτταρικές σειρές δερματικού μελανώματος εντοπίστηκε η έκφραση της SRPK1. Μεγαλύτερη έκφραση της SRPK1 και του SRSF1 εμφανίστηκε στις μεταστατικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις πρωτογενείς του μελανώματος. Επιπρόσθετα, η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 είτε με τη χρήση shrna είτε με φαρμακολογικούς αναστολείς, όπως ο SRPIN340, μείωσε την έκφραση του προ-αγγειογενετικού παράγοντα VEGF165 ενώ διατηρήθηκαν κανονικά επίπεδα της έκφρασης της αντι-αγγειογενετικής VEGF165b ισομορφής. Τέλος, η μειωμένη έκφραση της SRPK1 ελάττωσε την ανάπτυξη του όγκου in vivo σε πειράματα μεταμόσχευσης ανθρώπινων κυττάρων του μελανώματος σε ποντίκι (xenografts), αλλά δεν είχε καμία επιρροή στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό in vitro. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η SRPK1 μπορεί να αποτελέσει πιθανό στόχο για την αναστολή της ανάπτυξης του δερματικού μελανώματος in vivo καθώς καταστολή της έκφρασής της έχει σαν αποτέλεσμα τη απορρύθμιση του ματίσματος στον καρκίνο με κατεύθυνση την αποτροπή της αγγειογένεσης (Gammons et al. 2014). Α.3.1.9. Μάτι Ρετινοβλάστωμα Το ρετινοβλάστωμα (retinoblastoma-rb) είναι ο πιο κοινός όγκος του ματιού στην παιδική ηλικία και προσβάλλει ένα στα 15.000 παιδιά. Εντοπίζεται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα ο οποίιος βρίσκεται στο εσωτερικό του ματιού. Η χημειοθεραπεία με ενώσεις της πλατίνης παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση του καρκίνου αυτού. Με αφορμή μελέτες οι οποίες αναφέρθηκαν προηγουμένως, οι οποίες χαρακτήριζαν την SRPK1 ως μια πρωτεΐνη σχετιζόμενη με την ευαισθησία στη cis-πλατίνη, ερευνητές εξέτασαν τον ρόλο της SRPK1 στο ρετινοβλάστωμα. Μελέτη πάνω σε 63 αρχειακά περιστατικά ρετινοβλαστώματος συσχέτισε την έκφραση της SRPK1 με το στάδιο του καρκίνου και την έκθεση στη χημειοθεραπεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η SRPK1 ήταν μειωμένη στο 51% των όγκων, οι οποίοι 63

χαρακτηρίστηκαν ως πολύ προχωρημένου σταδίου. Σε όλα τα περιστατικά, όπου ο όγκος επανήλθε ή μεταστάθηκε, η SRPK1 εμφανίστηκε μειωμένη. Η μειωμένη έκφραση της SRPK1 στο ρετινοβλάστωμα προχωρημένου σταδίου η οποία παρατηρήθηκε, μπορεί να συνεισφέρει στους μηχανισμούς οι οποίοι διέπουν την αυξημένη αντίσταση στα χημειοθεραπευτικά (Krishnakumar et al. 2008). Οφθαλμικό μελάνωμα Το οφθαλμικό μελάνωμα (uveal melanoma-um) είναι ένας σπάνια εμφανιζόμενος καρκίνος αλλά είναι ο πιο συνήθης ενδοοφθαλμικός καρκίνος στους ενήλικες. Μελέτη η οποία έγινε παράλληλα και για το δερματικό μελάνωμα και αναλύθηκε εκτενέστερα προηγουμένως, έδειξε ότι καρκινικά κύτταρα οφθαλμικού μελανώματος εκφράζουν έντονα την SRPK1 σε σύγκριση με επιθηλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς. Επίσης, η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 στα κύτταρα του μελανώματος μείωσε την ανάπτυξη του όγκου in vivo λόγω του εναλλακτικού ματίσματος του VEGF (Gammons et al. 2014). Τέλος, ακολουθεί ο Πίνακας Α.3.1, ο οποίος συγκεντρώνει όλες της παραπάνω σχετικές με τις SRPKs αναφορές στους διάφορους τύπους καρκίνου. 64

Πίνακας Α.3.1. Έκφραση, ογκογονικός και ογκοκατασταλτικός ρόλος των SRPKs στους καρκίνους.* Νεοπλάσματα των όρχεων από γεννητικά κύτταρα Καρκίνος των ωοθηκών Καρκίνος του προστάτη Έκφραση στον καρκίνο SRPK1 SRPK1 Καρκίνος του νεφρού SRPK1 Καρκίνος του παχέος εντέρου Καρκίνος του στομάχου Αδενοκαρκίνωµα του παγκρέατος Συσχέτιση με κλινικό στάδιο Αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά SRPK1 (cis πλατίνη) Έκφραση άλλων βιομορίων που συσχετίζονται με τις SRPKs Αναστολή έκφρασης Πρωτεΐνες /μονοπάτια p MAPK p AKT SRPK1 VEGF165b, SRPK1 SRPK1 (οξαλιπλατίνη) Rac1b VEGF165 p AKT p PI3K SRPΚ2 p ERK SRPK1 IGF1R SRPK1 p MAPK1, p MAPK3, p p38 Rac1b VEGF165b Bax p MAPK1, p MAPK3, p p38,rpl17 Αναστολή έκφρασης κινάσης Ογκογονικά χαρακτηριστικά Ανάπτυξη in vivo Μετανάστευση Πολλαπλασιασμό Εξέλιξη κυτταρικού κύκλου Ευαισθησία στη cis πλατίνη Αντίσταση στη cis πλατίνη Ανάπτυξη in vivo Μικροαγγειακή πυκνότητα Ø Ανάπτυξη in vitro Ø Πολλαπλασιασμό in vitro Ø Διηθητική ικανότητα in vitro Ø Μετανάστευση in vitrο Ανάπτυξη in vivo Μετανάστευση Πολλαπλασιασμό Διεισδυτική ικανότητα Απόπτωση Ευαισθησία στη cis πλατίνη Ανάπτυξη in vivo Μετανάστευση Καρκινογένεση Απόπτωση Διηθητική ικανότητα Μετανάστευση Σταμάτημα στην G0/G1 φάση Απόπτωση Πολλαπλασιασμό Ευαισθησία στη cis πλατίνη Ευαισθησία στη γεμσιταμπίνη Υπερέκφραση Πρωτεΐνες /μονοπάτια Ευαισθησία στη γεμσιταμπίνη p ERK p AKT p ERK Υπερέκφραση Ογκογονικά χαρακτηριστικά Αλλαγή ματίσματος SLC39A14 Ανάπτυξη Μετανάστευση Βιωσιμότητα Διηθητική ικανότητα EMT

Πίνακας Α.3.1. (συνέχεια) Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα Έκφραση στον καρκίνο Συσχέτιση με κλινικό στάδιο Αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά Έκφραση άλλων βιομορίων που συσχετίζονται με τις SRPKs SRPK1 mir 1296 p AKT SRPK1 SRPΚ2 psrsf2 Αναστολή έκφρασης Πρωτεΐνες /μονοπάτια p GSK3beta β κατενίνης/ TCF Αναστολή έκφρασης κινάσης Ογκογονικά χαρακτηριστικά Ανάπτυξη in vivo Πολλαπλασιασμό Ανάπτυξη in vivo Μετανάστευση Καρκινογένεση Υπερέκφραση Πρωτεΐνες /μονοπάτια p AKT, p PI3K β κατενίνης/ TCF Ραβδομυοσάρκωμα SRPK3 MEF2Cα2 Καρκίνος του μαστού SRPK1 Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του οισοφάγου Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της κεφαλής τραχήλου SRPK1 SRPΚ2 κυτταροπλασματική p RBM4 p MAPK1, p MAPK3, p p38 IR B MCL 1S p AKT p JNK Απόπτωση Ευαισθησία στη cis πλατίνη Ευαισθησία στη γεμσιταμπίνη Μετάσταση Απόπτωση Ανάπτυξη in vivo Διηθητική ικανότητα Μετανάστευση Σταμάτημα στην G0/G1 φάση Σχηματισμό αποικιών Διεισδυτική ικανότητα Υπερέκφραση Ογκογονικά χαρακτηριστικά Πολλαπλασιασμός Ανάπτυξη Μετανάστευση Καρκινογένεση Διηθητική ικανότητα Ανάπτυξη Πολλαπλασιασμός Διαφοροποίησης Διαφοροποίησης Πολλαπλασιασμός Λευχαιμία SRPK1 κυκλίνης Α1 acinus SRPΚ2 Σταμάτημα στην G1 φάση Πολλαπλασιασμός Δερματικό SRSF1 Ανάπτυξη in vivo SRPK1 VEGF165 μελάνωμα VEGF165b Ø Πολλαπλασιασμό in vitro Οφθαλμικό μελάνωμα SRPK1 VEGF165 Ανάπτυξη in vivo Ρετινοβλάστωμα SRPK1 SRPK1 (cis πλατίνη) *Όλες οι βιβλιογραφικές αναφορές οι οποίες αφορούν τον πίνακα, αναφέρονται στην αντίστοιχη παράγραφο του εκάστοτε καρκίνου.

Α.3.2. Σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκονται οι SRPKs στον καρκίνο Οι SRPKs φαίνεται να δρουν ετερογενώς στην γένεση και την πορεία του όγκου καθώς επηρεάζουν διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου, για παράδειγμα, την αγγειογένεση στον καρκίνο του προστάτη και του παχέος εντέρου, την απόπτωση στον καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου και την μετανάστευση στον καρκίνο του μαστού όπως επίσης και την εκδήλωση φαινοτύπου δυνητικά βλαστικών κυττάρων (stem cell-like) στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Αυτή η πλειοτροπία δράσης τους μπορεί να σχετίζεται με την ενεργοποίηση διαφορετικών καθοδικών σηματοδοτικών μονοπατιών σε διάφορους καρκίνους (Bullock and Oltean 2017). Από την άποψη του μοριακού μηχανισμού όμως, στην πλειονότητα των περιπτώσεων, οι κινάσες αυτές, όπως και στα φυσιολογικά κύτταρα, ρυθμίζουν τον τρόπο του εναλλακτικού ματίσματος μέσω της φωσφορυλίωσης των κύριων υποστρωμάτων τους, των SR παραγόντων ματίσματος. Α.3.2.1. Σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία εμπλέκονται οι SRPKs στον καρκίνο μέσο του SRSF1 παράγοντα ματίσματος Όπως έχει αναλυθεί και προηγουμένως, η έκφραση των SRPKs όπως και τα επίπεδα έκφρασης και φωσφορυλίωσης των SR παραγόντων ματίσματος στους διάφορους όγκους, εμφανίζονται διαταραγμένα σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα. O SRSF1, το πιο καλά μελετημένο υπόστρωμα της SRPK1, έχει διαπιστωθεί ότι έχει ογκογονική δράση καθώς η υπερέκφρασή του σε αθανατοποιημένους ινοβλάστες έχει ως αποτέλεσμα την μετατροπή τους σε σαρκώματα όταν εγχύθηκαν σε ποντίκια (Karni et al. 2007). Πολλές διεργασίες εναλλακτικού ματίσματος στις οποίες διαμεσολαβεί ο άξονας SRPKs/SRSF1 έχουν συνδεθεί με την ογκογένεση όπως έχει είδη αναφερθεί, αλλά παρακάτω θα δοθεί έμφαση στις κυριότερες. Ρύθμιση των ισομορφών του VEGF από την SRPK1 και SRPK2 Η αγγειογένεση είναι μια διαδικασία δημιουργίας νέων αγγείων από προϋπάρχοντα, με σκοπό την επαρκή παροχή θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου στα αναπτυσσόμενα νεοπλάσματα. Ο αυξητικός παράγοντας του 67

αγγειακού ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor-vegf) είναι ένας από τους ισχυρότερους παράγοντες της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης. Ο παράγοντας ματίσματος SRSF1 και οι κινάσες οι οποίες ρυθμίζουν την λειτουργία του όπως οι SRPK1/2 διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του ματίσματος του VEGF. Από το εναλλακτικό μάτισμα του VEGF μπορούν να προκύψουν δυο οικογένειες ισομορφών, η προαγγειογενετική και αντι-αγγειογενετική, των οποίων τα mrna διαφέρουν στην 3 θέση ματίσματος του εξονίου 8 (Σχήμα Α.3.1.). Οι προ-αγγειογενετικές ισομορφές VEGFxxx, έχουν ως κοινό χαρακτηριστικό ότι προέρχονται από τη χρήση της εγγύς θέσης ματίσματος (proximal splice site-pss) του εξονίου 8 ενώ οι αντι-αγγειογενετικές ισομορφές VEGFxxxb, δημιουργούνται με τη χρήση μίας απομακρυσμένης θέσης ματίσματος (distal splice site-dss) με τα «xxx» να υποδηλώνουν τον αριθμό των αμινοξέων του ώριμου mrna το οποίο τελικά προκύπτει μετά το μάτισμα (Nowak et al. 2010). Σχήμα Α.3.1. Εναλλακτικός τρόπος ματίσματος του πρόδρομου mrna του VEGF. Η επιλογή της εγγύς θέσης ματίσματος (proximal splice site-pss) του εξονίου 8 οδηγεί στην παραγωγή των VEGFxxx ισομορφών ενώ η επιλογή μίας απομακρυσμένης θέσης ματίσματος 68

(distal splice site-dss) οδηγεί στην δημιουργία των αντι-αγγειογενετικών ισομορφών VEGFxxxb (Mavrou and Oltean 2016). Ο κυριότερος εκπρόσωπος της οικογένειας των αντι-αγγειογενετικών παραγόντων είναι ο VEGF165b ο οποίος ανταγωνίζεται τη δράση του προαγγειογεννετικού VEGF165. Ο SRSF1 προσδένεται στο πρόδρομο mrna του VEGF στην PSS θέση ματίσματος του εξονίου 8 και ευνοεί έτσι την παραγωγή των προ-αγγειογενετικών ισομορφών του VEGF. Η δράση του SRSF1 πάνω στο πρόδρομο-mrna του VEGF εξαρτάται από την πυρηνική εντόπιση του πρώτου, η οποία όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα, καθορίζεται από τη φωσφορυλίωσή του από την SRPK1 ή την SRPK2 (Σχήμα Α.3.2.) (Nowak et al. 2010). Σε μια άλλη έρευνα βρέθηκε ότι μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο του όγκου του Wilms-WT1, εμποδίζουν την μεταγραφική καταστολή της SRPK1, καθώς φυσιολογικά ο WT1 προσδένεται στον εκκινητή του γονιδίου της SRPK1 και καταστέλλει τη μεταγραφή της. Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 έχουν ως αποτέλεσμα την υπερφωσφορυλίωση του SRSF1 και την ακόλουθη πυρηνική μετατόπισή του, γεγονός το οποίο ωθεί τον λόγο VEGF165/VEGF165b υπέρ του προ-αγγειογενετικού VEGF165, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό όγκων με μεγάλη αγγειογένεση σε μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικού από ξενομοσχεύματα (Amin et al. 2011). 69

Σχήμα Α.3.2. Επίδραση του άξονα SRPK1-SRSF1 στο εναλλακτικό μάτισμα του VEGF και την αγγειογέννεση (Mavrou and Oltean 2016). Επίσης, η αναστολή της δραστικότητας της SRPK1, χρησιμοποιώντας τους ειδικούς αναστολείς SRPIN340 ή SPHINX αύξησε την έκφραση της αντιαγγειογενετικής ισομορφής VEGF165b σε κυτταρικές σειρές του καρκίνου του παχέος εντέρου και του προστάτη in vitro, ενώ σε μοντέλο ποντικού στον καρκίνο του προστάτη οδήγησε σε μικρότερους όγκους με μειωμένη μικροαγγειακή πυκνότητα (Corkery et al. 2015; Mavrou et al. 2015). Παραπλήσια ευρήματα έδειξαν και μελέτες πάνω στο δερματικό μελάνωμα, όπου η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 είτε με τη χρήση shrna είτε με φαρμακολογικούς αναστολείς, όπως ο SRPIN340, μείωσε την έκφραση του VEGF165 ενώ διατηρήθηκαν κανονικά επίπεδα της έκφρασης της ισομορφής VEGF165b και ελάττωσε επίσης την ανάπτυξη του όγκου σε πειράματα μεταμόσχευσης ανθρώπινων κυττάρων του μελανώματος σε ποντίκι (xenografts) (Gammons et al. 2014). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η SRPK1 μπορεί να αποτελέσει πιθανό στόχο για την αναστολή της ανάπτυξης όγκων in vivo, καθώς πειράματα με καταστολή της έκφρασής της έχουν σαν αποτέλεσμα την απορρύθμιση του 70

ματίσματος με κατεύθυνση την αποτροπή της αγγειογένεσης σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Ρύθμιση της Rho GTPάσης Rac1 από την SRPK1 Η Rac1 ανήκει στην οικογένεια των σηματοδοτικών Rho GTPασών. Η κύρια λειτουργία της οικογένειας είναι η ρύθμιση του κυτταροσκελετού και η κυτταρική κινητικότητα. Η απορρύθμισή τους έχει συσχετιστεί με διάφορους τύπους καρκίνου. Η έκφραση της Rac1b, η οποία είναι ένα πολύ ενεργό εναλλακτικό προϊόν ματίσματος της Rac1, εμφανίζεται αυξημένη στον καρκίνο του παχέος εντέρου και συσχετίζεται με την κακή πρόγνωση των ασθενών. Ο SRSF1 επάγει την συγκράτηση του εξονίου 3b στο πρόδρομο mrna της Rac1 (Σχήμα Α.3.3.). Ενεργό ρόλο σε αυτό παίζει η SRPK1, καθώς παρατηρήθηκε ότι η αναστολή της έκφρασής της, οδηγεί σε μείωση της φωσφορυλίωσης του SRSF1 και κατ επέκταση στον περιορισμό της διαθεσιμότητάς του στον πυρήνα με σκοπό να συμβάλει στη ρύθμιση του ματίσματος της Rac1. Σχήμα Α.3.3. Εναλλακτικό μάτισμα του μεταγράφου του γονιδίου της Rac1 οδηγεί στη δημιουργία δύο εναλλακτικών μορφών, την Rac1 και Rac1b, με την τελευταία να βρίσκεται σε μια συνεχώς ενεργή GTP-συνδεδεμένη κατάσταση (Silva et al. 2016). Αξιοσημείωτο είναι ότι η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου δεν εμποδίζει μόνο την πυρηνική μεταφορά του SRSF1, αλλά προκαλεί επίσης και την αποικοδόμησή του, περιορίζοντας περαιτέρω την ικανότητά του να ελέγχει τη ρύθμιση του ματίσματος της Rac1 (Goncalves et al. 2014). 71

Ρύθμιση του MCL1 από την SRPK1 Το γονίδιο της μυελοειδούς κυτταρικής λευχαιμίας 1 (myeloid cell leukemia1- MCL1) είναι μέλος της οικογένειας γονιδίων ρύθμισης της απόπτωσης BCL2. Το εναλλακτικό μάτισμα του MCL1 μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή δύο μεταγράφων, το MCL1L πλήρους μήκους το οποίο είναι αντι-αποπτωτικό και με απαλοιφή του εξονίου 2, το MCL1S, το οποίο διμερίζεται με το MCL1L και ανταγωνίζεται την αντι-αποπτωτική του δράση. Στον καρκίνο του μαστού, η έκφραση του SRSF1 έχει αποδειχθεί ότι ευνοεί την έκφραση της αντιαποπτωτικής ισομορφής MCL1L. Είναι πιθανό η SRPK1 να ευθύνεται για τον πυρηνικό εντοπισμό του SRSF1 και επομένως να ρυθμίζει το μάτισμα του MCL με παρόμοιο τρόπο όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τα γονίδια RAC1 και VEGF (Corkery et al. 2015). Όμως, έχει προταθεί ένας άλλος μηχανισμός σε μια πρόσφατη μελέτη, ανεξάρτητος από SR πρωτεΐνες αλλά με την εμπλοκή της πρωτεΐνης RBM4 (RNA-binding motif protein 4) η οποία έχει ογκοκατασταλτική δράση μεταβάλλοντας το εναλλακτικό μάτισμα των γονιδίων του υποδοχέα ινσουλίνης (insulin receptor-ir) και του MCL1 προς τις προ-αποπτωτικές τους ισομορφές. Η αυξημένη έκφραση της SRPK1 στον καρκίνο του μαστού οδηγεί στη φωσφορυλίωση της RBM4 και στη συσσώρευσή της στο κυτταρόπλασμα αποτρέποντάς της έτσι να κατευθύνει το μάτισμα των IR και MCL1 προς τις προ-αποπτωτικές τους ισομορφές IR-B και MCL1S αντίστοιχα (Σχήμα Α.3.4.). Η μείωση της ενδογενούς SRPK1 αποκαθιστά την προ-αποπτωτική επίδραση της RBM4 στα κύτταρα του καρκίνου του μαστού MCF-7. (Lin et al. 2014). 72

Σχήμα Α.3.4. Η δράση του δικτύου SRPK1-RBM4 στη ρύθμιση της απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Η αυξημένη έκφραση της SRPK1 επάγει την κυτταροπλασματική συσσώρευση της φωσφορυλιωμένης RBM4, περιορίζοντάς την έτσι από τον πυρήνα της οποίας ο φυσιολογικός της ρόλος θα ήταν η επαγωγή της έκφρασης των προαποπτωτικών ισομορφών IR-B και MCL1S. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των αντίστοιχων αντι-αποπτωτικών μορφών IR-Α και MCL1L (Lin et al. 2014). Ρύθμιση του MEF2C από την SRPK3 Ενώ η SRPK1 έχει λάβει την μεγαλύτερη προσοχή για το ρόλο της στην ογκογένεση, η SRPK3 βρέθηκε πρόσφατα να εμπλέκεται στην ογκογένεση στο ραβδομυοσάρκωμα (RMS) ως ρυθμιστής του εναλλακτικού ματίσματος του MEF2C (Σχήμα Α.3.5.). Η οικογένεια του μεταγραφικού παράγοντα ενίσχυσης των μυοκυττάρων 2 (Myocyte Enhancer Factor 2- MEF2) ρυθμίζει πολλές αναπτυξιακές διεργασίες όπως η μυογένεση. Το 2015, ο Zhang και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι το εναλλακτικό μάτισμα του πρόδρομου mrna του ΜΕF2, καθορίζει την μετέπειτα λειτουργία του στη φυσιολογική μυογένεση αλλά και στην ογκογένεση σε καρκινικά κύτταρα ραβδομυοσαρκώματος. Η ισομορφή MEF2Cα1 εκφράζεται παντού χωρίς να παρουσιάζει μυογενετική δραστικότητα, ενώ η έκφραση του MEF2Cα2, της ιστοειδικής για τους μυς ισομορφής του MEF2C, απαιτείται για την αποτελεσματική διαφοροποίηση. Πιο συγκεκριμένα, έδειξαν ότι υπάρχει μεγάλη διαφοροποίηση στο μάτισμα του εξονίου α του MEF2C δυσχεραίνοντας τη μεταγραφή της ισομορφής MEF2Cα2 σε σχέση με την ισομορφή MEF2Cα1 στα κύτταρα ραβδομυοσαρκώματος, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μυοβλάστες. 73

Σχήμα Α.3.5. Σχηματική απεικόνιση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος του MEF2C. Το πρόδρομο mrna του MEF2C υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα και στις ώριμες μορφές του μπορεί να συμπεριλαμβάνονται ή να παραλείπονται τα εξόνια α1, α2, β και γ. Τα εξόνια α1 και α2 είναι αμοιβαία αποκλειόμενα εξόνια (mutually exclusive exons) (Zhang et al. 2015). Η υπερέκφραση του MEF2Cα2 σε κύτταρα του RMS οδήγησαν σε αύξηση της μυογενετικής δραστικότητας και της διαφοροποίησης. Στην προσπάθειά τους να ανακαλύψουν τον λόγο για τον οποίο είναι μειωμένος ο MEF2Cα2, βρήκαν σε βάσεις δεδομένων βιβλιοπληροφορικής ότι ο μεταγραφικός παράγοντας SRSF1 εμπλέκεται στη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου του MEF2C και είναι αυξημένος κατά τη μυογένεση αλλά εκφράζεται πολύ και στα κύτταρα του RMS. Άρα, έψαξαν τα ανοδικά μονοπάτια τα οποία ρυθμίζουν την ενεργοποίηση του SRSF1 και βρήκαν την SRPK3 η οποία, όπως έχει αναφερθεί, εκφράζεται περισσότερο στο σκελετικό μυ. Στα πειράματά τους έδειξαν ότι η έκφραση της SRPK3 είναι μειωμένη στα κύτταρα του RMS και ότι η υπερέκφρασή της επάγει την μεταγραφή του MEF2Cα2 και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Τέλος, η αποκατάσταση των επιπέδων είτε του MEF2Cα2 είτε της SRPK3 με υπερέκφρασή τους, οδήγησε στη μείωση του πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης των κυττάρων του RMS (Zhang et al. 2015). Α.3.2.2. Ο ρόλος της SRPK1 στο φαινότυπο των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (cancer stem cells-cscs) Σε μια πρόσφατη έρευνα, ο Gong και οι συνεργάτες του, διερεύνησαν τον ρόλο της SRPK1 στην υιοθέτηση του φαινοτύπου των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (cancer stem cells-cscs) στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (non-small-cell lung carcinoma-nsclc). Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα αποτελούν έναν υποπληθυσμό των κυττάρων του όγκου με δυνατότητα αυτοανανέωσης και θεωρούνται σημαντικά στην εμφάνιση υποτροπής του όγκου, μετάστασης και αντίστασης στη χημειοθεραπεία. Όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα, τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 είναι αυξημένα στον NSCLC και έχουν άμεση συσχέτιση με το κλινικό στάδιο και τον χρόνο 74

επιβίωσης των ασθενών. Με υπερέκφραση της κινάσης σε κύτταρα NSCLC αυξήθηκαν οι μάρτυρες των CSCs και η δυνατότητα αυτοανανέωσης των κυττάρων ενώ η αναστολή της έκφρασής της αντέστρεψε τα αποτελέσματα. In vivo πειράματα σε ποντίκια έδειξαν ότι όγκοι οι οποίοι προέρχονται από κύτταρα NSCLC με υπερεκφρασμένη την SRPK1 ήταν μεγαλύτεροι ενώ ήταν μικρότεροι σε κύτταρα με ανεσταλμένη την έκφραση της κινάσης. Μετά από αυτά τα ευρήματα, πρότειναν ότι η SRPK1 δρα ως ένας ισχυρός παράγοντας προαγωγής των CSCs στο NSCLC. Στη συνέχεια θέλησαν να ελέγξουν αν η SRPK1 συνδέεται με το σηματοδοτικό μονοπάτι του Wnt/β- κατενίνης καθώς έχει αναφερθεί η εμπλοκή του στην ανάπτυξη διαφόρων ειδών καρκίνων αλλά και την ανάπτυξη και τη ρύθμιση της δραστηριότητας των CSC (Σχήμα Α.3.6.). Σχήμα Α.3.6. Σχηματική αναπαράσταση της οδού Wnt σε ενεργή (Α) και ανενεργή (Β) κατάσταση. (Α) Απουσία του προσδέτη Wnt, συγκροτείται στο κυτταρόπλασμα το σύμπλοκο αποικοδόμησης το οποίο αποτελείται από τις πρωτεΐνες CKIα (κινάση Ια της καζεΐνης), GSK- 3β (κινάση-3β της συνθάσης του γλυκογόνου), APC (πρωτεΐνη της αδενωματώδους πολυποδίασης) και AXIN (αξίνη) το οποίο φωσφορυλιώνει τη β-κατενίνη με αποτέλεσμα την ουβικιτινυλίωσή της και αποικοδόμησή της από το πρωτεάσωμα. (B) Παρουσία του Wnt, ο οποίος προσδένεται στους υποδοχείς Frizzled και LRP, προκαλείται η φωσφορυλίωση των Dishevelled και LRP και δημιουργούνται έτσι θέσεις πρόσδεσης για την αξίνη με αποτέλεσμα την επακόλουθη αποσταθεροποίηση του συμπλόκου αποικοδόμησης. Παρατηρείται έτσι η κυτταροπλασματική συσσώρευση της β-κατενίνης η οποία στη συνέχεια εισέρχεται στον πυρήνα και σχηματίζει σύμπλοκο με μεταγραφικούς παράγοντες Tcf, μετατρέποντάς τους από καταστολείς σε ενεργοποιητές των γονιδίων στόχων τους (Cyclin D1, c-myc, c-jun και Snail) (Dunn and Tolwinski 2016). Έδειξαν λοιπόν, ότι η υπερέκφραση της SRPK1 ενισχύει την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης και προάγει τη μεταγραφική δραστηριότητα των 75

μεταγραφικών παραγόντων TCF4/LEF1 (T-cell factor 4/lymphoid enhancing factor) σε κυτταρικές σειρές NSCLC, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του φαινότυπου CSC. Αντίθετα η παρεμπόδιση του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt/β-κατενίνης σε κυτταρικές σειρές του NSCLC οι οποίες υπερεκφράζουν την SRPK1 μείωσε τα επίπεδα έκφρασης των mrnas τα οποία αποτελούν καθοδικά γονίδια στόχους του μονοπατιού και μείωσε τον φαινότυπο τον οποίο ομοιάζει με βλαστικά κύτταρα (Gong et al. 2016). Οι ερευνητές προσπαθώντας να βρουν τον μηχανισμό με τον οποίο η SRPK1 εμπλέκεται στην υπερενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του Wnt ανέστειλαν την έκφρασή της οδηγώντας στη μείωση της φωσφορυλιωμένης μορφής (ανενεργή μορφή) της GSK-3β. Η κινάση GSK-3β φωσφορυλιώνει μαζί με την CKIα την β-κατενίνη με αποτέλεσμα την ουβικιτινυλίωσή της και αποικοδόμησή της από το πρωτεάσωμα, αποτρέποντας έτσι την συσσώρευσή της στο κυτταρόπλασμα και την επακόλουθη είσοδό της στον πυρήνα για την ενεργοποίηση της μεταγραφής. Μια άποψη αποδίδει την ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt στη φωσφορυλίωση της GSK-3β από την Akt. Έχει αναφερθεί ότι η οποιαδήποτε παρεκκλίνουσα από το φυσιολογικό έκφραση της SRPK1 οδηγεί στη συνεχή ενεργοποίηση της Αkt λόγω της αλληλεπίδρασης της πρώτης με την φωσφατάση PHLPP της Αkt (Wang et al. 2014). Έχει δειχθεί ότι, η φωσφορυλίωση της GSK-3β από την AKT στην Ser9 οδηγεί στην συσσώρευση της β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και στην μετέπειτα ενεργοποίηση της μεταγραφής του TCF σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Λαμβάνοντας υπόψιν ότι η Αkt βρίσκεται υπερενεργοποιημένη σε κύτταρα NSCLC, οι ερευνητές πρότειναν ότι είναι πιθανό η SRPK1 να ενεργοποιεί το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt μέσω της ενεργοποίησης της Αkt, η οποία αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή της β-κατενίνης (Liu et al. 2016). Όμως, μια άλλη έρευνα έδωσε έμφαση στην παραγωγή της β-κατενίνης και όχι στην ελλιπή αποικοδόμησή της ως αίτιο συσσώρευσής της, δείχνοντας ότι οι παράγοντες SRSF1 και SRSF9 ενισχύουν την μετάφραση της β-κατενίνης με τρόπο εξαρτώμενο από τον mtor (Fu et al. 2013). Μια πιθανότητα η οποία προτείνουν οι συγγραφείς σε ένα άρθρο επισκόπησης για τον ρόλο της SRPK1 στον καρκίνο, με βάση τα αποτελέσματα της τελευταίας έρευνας, είναι ότι η 76

μεγάλη έκφραση της SRPK1 που παρατηρείται στους όγκους, οδηγεί στην αυξημένη φωσφορυλίωση των SRSF1 και SRSF9 οι οποίοι με τη σειρά τους στρατολογούν την β-κατενίνη, όπως περιγράφηκε πιο πάνω (Bullock and Oltean 2017). Α.3.3. Θεραπεία Ένα στοιχείο το οποίο υποδεικνύει τον ρόλο τον οποίο κατέχουν οι SRPK1 και SRPK2 στον καρκίνο, αποτελεί η άμεση συσχέτιση της σταδιοποίησης και βαθμονόμησης του όγκου με τα επίπεδα έκφρασης αυτών των κινασών. Για το λόγο αυτό έχει προταθεί η χρήση της έκφρασης των SRPKs ως βιοδεικτών για πολλά είδη καρκίνου. Η στοχοποίηση του μηχανισμού ματίσματος βρίσκεται υπό έντονη διερεύνηση και αποτελεί ένα ελκυστικό θεραπευτικό εργαλείο για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι SRPKs είναι καθοριστικές στη ρύθμιση του ματίσματος, η διαμόρφωση της δραστηριότητάς τους αντιπροσωπεύει μια πιθανή προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων τα οποία στοχεύουν στο μάτισμα του πρόδρομου mrna στη θεραπεία του καρκίνου. Χωρίς ακόμα να έχει διασαφηνιστεί πλήρως η βιολογία των SRPKs και των καθοδικών οδών τις οποίες ρυθμίζουν, τα ερευνητικά δεδομένα τα οποία έχουν δημοσιευτεί ως σήμερα σχετικά με τα πιθανά πλεονεκτήματα της αναστολής τους, φαίνεται να είναι ενθαρρυντικά και έχουν προκαλέσει την αναζήτηση των ειδικών αναστολέων τους οι οποίοι θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για θεραπευτικούς σκοπούς. Η χρήση των αναστολέων των SRPKs έχει δοκιμαστεί πειραματικά για την απόκρισή τους σε διάφορα ήδη καρκίνου. Ο SRPIN340, όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα, είναι μια ένωση ισονικοτιναμιδίου η οποία αναστέλλει εκλεκτικά την SRPK1 και την SRPK2. Η επίδρασή του σε λευχαιμικά κύτταρα επέφερε μείωση της βιωσιμότητάς τους, επαγωγή της απόπτωσης όπως επίσης και αλλαγές στο εναλλακτικό μάτισμα των MAP κινασών, του VEGF και του FAS (Siqueira et al. 2015). Σημαντικό εύρημα αποτελεί ότι η χρήση αυτής της ένωσης μπορεί να αναστείλει την ογκογένεση καθώς τοπικές ενέσεις με SRPIN340 ελάττωσαν την ανάπτυξη του όγκου σε πειράματα μεταμόσχευσης ανθρώπινων κυττάρων μελανώματος του σε ποντίκι (Gammons et al. 2014). 77

Επιπρόσθετα, ένας ακόμα μικρός μοριακός αναστολέας της SRPK1, ο SPHINX, μείωσε την ανάπτυξη του όγκου όταν χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε όγκους από ανθρώπινο ξενομόσχευμα καρκίνου του προστάτη σε ποντίκια (Mavrou and Oltean 2016). Η χρήση των αναστολέων της SRPK1 σε in vitro πειράματα επέφερε αναστολή της φωσφορυλίωσης των SR πρωτεϊνών όπως επίσης και μια μεταβολή στο μάτισμα του VEGF από την προ-αγγειογενετική μορφή στην αντι-αγγειογενετική σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Bullock and Oltean 2017). Οι προαναφερθείσες μελέτες σχετικά με το ρόλο των SRPKs στο γενοτοξικό στρες, υποδηλώνουν ότι η έκφρασή τους σε κάθε τύπο καρκίνου μπορεί να επηρεάζει την ανταπόκριση στην χορηγούμενη χημειοθεραπεία. Δηλαδή, αναστολή της έκφρασης της SRPK1 ή μειωμένη έκφρασή της εξαρχής μπορεί να οδηγήσει στην ευαισθησία των κυττάρων σε ενώσεις της πλατίνης σε περιπτώσεις καρκίνου του μαστού, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και των ωοθηκών (Hayes et al. 2006, 2007; Odunsi et al. 2012). Αντίθετα έχει αναφερθεί ότι η μειωμένη έκφραση της SRPK1 επιφέρει αντίσταση στις ενώσεις της πλατίνης σε καρκίνους των ωοθηκών, των όρχεων και του ρετινοβλαστώματος (Krishnakumar et al. 2008; C Plasencia et al. 2006; Schenk et al. 2001, 2004). Όλα τα παραπάνω υποδεικνύουν ότι ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου η έκφραση των SRPKs διαφοροποιείται όπως και ο ρόλος τους και ότι οι αναστολείς των κινασών αυτών ανάλογα με τον όγκο στοχεύουν σε διαφορετικό κυτταρικό μηχανισμό. Επίσης, οι συνδυασμοί αναστολέων SRPKs με συμβατικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες θα μπορούσαν να παρέχουν νέες επιλογές θεραπείας για τους ασθενείς (Czubaty and Piekiełko- Witkowska 2017). 78

Α.4. Γλοιώματα Α.4.1. Στοιχεία ιστολογίας του νευρικού ιστού Ο νευρικός ιστός αποτελείται από τα νευρικά κύτταρα και τα νευρογλοιακά κύτταρα (ή νευρογλοία ή γλοία). Ο ρόλος των νευρώνων είναι η μετάδοση πληροφοριών μέσω των νευρικών σημάτων η οποία είναι και η βασική λειτουργία του κεντρικού νευρικού συστήματος. Τα νευρογλοιακά κύτταρα υποβοηθούν την λειτουργία των νευρώνων παρέχοντάς τις απαραίτητες θρεπτικές ουσίες, οξυγόνο αλλά και φυσική στήριξη. Επίσης, περιβάλλουν τον νευροάξονα των περισσότερων νευρώνων, συμβάλλοντας έτσι στη μόνωσή του και στη γρήγορη μεταφορά της νευρικής ώσης (Jäkel and Dimou 2017). Τα κύτταρα της γλοίας διακρίνονται σε τέσσερις υποκατηγορίες: τα αστροκύτταρα, τα ολιγοδενδροκύτταρα, τα επενδυματικά κύτταρα και τα μικρογλοιακά κύτταρα (Σχήμα Α.4.1). Σχήμα Α.4.1. Οι τέσσερις υποκατηγορίες των κυττάρων της γλοίας (Weller et al. 2015). 79

Τα αστροκύτταρα αποτελούν τον πιο άφθονο κυτταρικό τύπο στο σύνολο των νευρογλοιακών κυττάρων. Ο ρόλος τους είναι κυρίως στηρικτικός και τροφικός. Επίσης συμβάλλουν στην ομοιόσταση του ιοντικού νευρωνικού περιβάλλοντος, στη ροή του αίματος και στη συναπτική διαβίβαση. Τα ολιγοδενδροκύτταρα καλύπτουν τους νευροάξονες και είναι υπεύθυνα για τη δημιουργία του ελύτρου της μυελίνης δημιουργώντας έτσι μια συμβιωτική σχέση με τους νευρώνες. Τα επενδυτικά κύτταρα, καλύπτουν την κοιλιακή επιφάνεια του νευρικού συστήματος διατηρώντας την επιθηλιακή τους διάταξη. Τα περισσότερα διαθέτουν κροσσούς, βοηθώντας έτσι στη διακίνηση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Τέλος, τα μικρογλοιακά κύτταρα, είναι τα μικρότερα από τα κύτταρα της γλοίας, προέρχονται από τα μονοπύρηνα μακροφάγα και διαθέτουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες ενώ ενεργοποιούνται σε καταστάσεις βλάβης του νευρικού ιστού απομακρύνοντας τα κατεστραμμένα κυτταρικά στοιχεία (Μπαλογιάννης Σ. 1996). Α.4.2. Γλοιώματα Οι όγκοι οι οποίοι εντοπίζονται στον εγκέφαλο καλούνται νεοπλάσματα του κεντρικού νευρικού συστήματος και αναπτύσσονται στον εγκέφαλο και το νωτιαίο μυελό. Διακρίνονται σε πρωτοπαθή εγκεφαλικά νεοπλάσματα οι οποίοι είναι όγκοι οι οποίοι δημιουργούνται από κύτταρα που βρίσκονται φυσιολογικά στο κεντρικό νευρικό σύστημα και σε δευτεροπαθή τα οποία είναι μεταστάσεις από άλλους καρκίνους οι οποίοι δημιουργήθηκαν αλλού στον οργανισμό και εξαπλώθηκαν στον εγκέφαλο δημιουργώντας εκεί νέες εστίες. Το γλοίωμα είναι ένας γενικός όρος ο οποίος περιγράφει οποιαδήποτε μορφή όγκου η οποία ομοιάζει ιστολογικά με τα κύτταρα της γλοίας του εγκεφάλου. Η ονομασία τους δόθηκε σύμφωνα με τα νευρογλοιακά κύτταρα του φυσιολογικού ιστού με τα οποία προσομοιάζουν περισσότερο και έχουν κοινά χαρακτηριστικά διαφοροποίησης. Έτσι, διακρίνονται παραδοσιακά σε αστροκυττώματα, ολιγοδενδρογλοιώματα και επενδυμώματα. Υπάρχουν τέλος και μεικτές μορφές γλοιωμάτων όπως τα ολιγοαστροκυττώματα (Schneider et al. 2010). 80

Α.4.3. Ταξινόμηση των νεοπλασμάτων του κεντρικού νευρικού συστήματος O Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization, WHO) έχει καθιερώσει, σύμφωνα με τις νέες επιστημονικές ανακαλύψεις, μια ταξινόμηση και βαθμονόμηση των νεοπλασμάτων του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η ταξινόμηση των γλοιωμάτων, η οποία αναφέρθηκε και νωρίτερα, βασίζεται στην παραδοχή ότι κάθε τύπος όγκου προκύπτει από αφύσικη ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό ενός συγκεκριμένου κυτταρικού τύπου, ενώ η βαθμονόμησή τους βασίζεται στα ιστολογικά χαρακτηριστικά κάθε όγκου. Οι βαθμοί από I έως IV, σύμφωνα με τον WHO, αντικατοπτρίζουν τον βαθμό κακοήθειας και επιθετικότητας του όγκου και βασίζονται σε ιστολογικά χαρακτηριστικά των νεοπλασμάτων όπως η πυρηνική ατυπία, η κυτταροβρίθεια, ο αριθμός μιτώσεων, ο κυτταρικός πλειομορφισμός, ο μικροαγγειακός πολλαπλασιασμός, η ενδοθηλιακή υπερπλασία και η νέκρωση (Kleihues, Burger, and Scheithauer 1993). Πιο συγκεκριμένα, τα πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα αναπτύσσονται αργά και χαρακτηρίζονται ως καλοήθη, τα διάχυτα αστροκυττώματα παρουσιάζουν χαμηλή κυτταροβρίθεια αλλά μεγαλύτερη πυρηνική ατυπία, τα αναπλαστικά αστροκυττώματα εκτός από την εντονότερη κυτταροβρίθεια και πυρηνική ατυπία εμφανίζουν και αυξημένο αριθμό μιτώσεων ενώ τέλος στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα βαθμού κακοήθειας ΙV παρατηρείται επιπλέον και νέκρωση (Πίνακας Α.4.1.). Πίνακας Α.4.1. Ταξινόμηση αστροκυττωμάτων με βάση τα ιστολογικά τους χαρακτηριστικά κατά τον WHO. Grade WHO Ορολογία Χαρακτηριστικά Ι Πιλοκυτταρικό αστροκύττωμα Καλοήθες, αργά αναπτυσσόμενο ΙΙ Διάχυτο αστροκύττωμα Πυρηνική ατυπία ΙΙΙ Αναπλαστικό αστροκύττωμα Πυρηνική ατυπία, μιτώσεις IV Πολύμορφο γλοιοβλάστωμα Πυρηνική ατυπία, ενδοθηλιακή υπερπλασία, μιτώσεις, νέκρωση Τα γλοιώματα μπορούν να διακριθούν επίσης σε δύο μεγάλες κατηγορίες με βάση το βαθμό διείσδυσής τους στον περιβάλλοντα ιστό του εγκεφάλου. Τα γλοιώματα τα οποία επιδεικνύουν διάχυτη διείσδυση του 81

εγκεφαλικού παρεγχύματος αναφέρονται ως «διάχυτα γλοιώματα» (diffuse gliomas) και αντιπαραβάλλονται με τα γλοιώματα με πιο «περιορισμένη» (circumscribed) συμπεριφορά ανάπτυξης. Στα διάχυτα γλοιώματα συμπεριλαμβάνονται τα αστροκυττώματα και ολιγοδενδρογλοιώματα βαθμού II και III, όπως επίσης και του βαθμού IV γλοιοβλάστωμα (Louis et al. 2016). Τα τελευταία, έχουν την ικανότητα να διεισδύουν στον περιβάλλοντα υγιή ιστό του εγκεφάλου και επανέρχονται αναπόφευκτα ακόμη και μετά την ολική εκτομή του όγκου (Aldape et al. 2015). Α.4.4. Επιδημιολογικά στοιχεία των γλοιωμάτων Τα γλοιώματα και τα μηνιγγιώματα αποτελούν τους δύο πιο συχνά εμφανιζόμενους τύπους πρωτογενών εγκεφαλικών όγκων (Σχήμα Α.4.2). Η κατηγορία των γλοιωμάτων αντιπροσωπεύει σχεδόν το 30% των όγκων οι οποίοι εμφανίζονται στον εγκέφαλο απαρτίζοντας συγχρόνως το 80% των κακοήθων νεοπλασιών αυτών. Σχήμα Α.4.2. Επιδημιολογικά στοιχεία των πρωτογενών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (Weller et al. 2015). 82

Τα επιδημιολογικά στοιχεία δείχνουν ότι η ετήσια συχνότητα εμφάνισης των πρωτοπαθών όγκων του εγκεφάλου στις Η.Π.Α. για το διάστημα μεταξύ 2007 μέχρι το 2011 ήταν 21,4 περιστατικά ανά 100.000 πληθυσμού με τα γλοιώματα να αντιπροσωπεύουν τις 6,6 περιπτώσεις, από τις οποίες περίπου οι μισές ήταν γλοιοβλαστώματα (Weller et al. 2015). Ενδιαφέρον αποτελεί ότι υπάρχει διαφοροποίηση των περιστατικών των ασθενών με γλοιώματα στην περίπτωση της Ιαπωνίας στην οποία η συχνότητα εμφάνισης είναι η μισή σε σύγκριση με την Βόρεια Ευρώπη και τις Η.Π.Α., χωρίς ακόμα να είναι γνωστή η αιτία αυτής της τοπικής διαφοροποίησης (Ostrom et al. 2014). Η συχνότητα εμφάνισης των γλοιωμάτων έχει μια μικρή τάση να αυξάνει με την ηλικία, με την πιο έντονη αύξηση να παρατηρείται στην περίπτωση του γλοιοβλαστώματος (Σχήμα Α.4.3). Πολλοί περιβαλλοντικοί παράγοντες έχουν μελετηθεί για τη συσχέτισή τους με την εμφάνιση των γλοιωμάτων αλλά ο μόνος αιτιολογικός παράγοντας ο οποίος αναγνωρίζεται, είναι η μεγάλη έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία. Έχει μελετηθεί αρκετά επίσης η χρήση του κινητού τηλεφώνου χωρίς όμως να έχει αναφερθεί μια σαφής αύξηση της συχνότητας εμφάνισης. Σχήμα Α.4.3. Περιπτωσιολογία των γλοιωμάτων με βάση τα ιστολογικά χαρακτηριστικά και την ηλικία (Weller et al. 2015). 83

Α.5. Γλοιοβλάστωμα Α.5.1. Γενικά Ο όρος πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (glioblastoma multiforme, GBM) δόθηκε από τον Mallory το 1914 και συμπεριλήφθηκε για πρώτη φορά σε ιατρικό λεξικό από τους Bailey και Cushing το 1926 ενώ σήμερα πλέον χρησιμοποιείται ο όρος γλοιοβλάστωμα. Όπως υποδηλώνει και ο αρχικός χαρακτηρισμός «πολύμορφο», το GBM αποτελεί ένα μορφολογικά ιδιαίτερα ετερογενή καρκίνο (Miller and Perry 2007). Το GBM είναι ο πιο συχνά εμφανιζόμενος και επιθετικός κακοήθης καρκίνος των πρωτογενών εγκεφαλικών όγκων με μέσο όρο ηλικίας διάγνωσης των ασθενών τα 64 έτη και το ποσοστό επιβίωσης για διάστημα δύο ετών από τη διάγνωση να είναι το 14,8% ενώ για διάστημα 10 ετών μόλις το 2,6% (Weller et al. 2015). Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, έχει βαθμό κακοήθειας IV με βάση την ταξινόμηση των όγκων το κεντρικού νευρικού συστήματος από τον WHO. Σύμφωνα με κλινικές και γενετικές παραμέτρους, το GBM κατηγοριοποιείται σε πρωτογενές και δευτερογενές. Το πρωτογενές GBM αναπτύσσεται de novo, εκδηλώνεται πολύ γρήγορα και συναντάται στο 90-95% των περιπτώσεων. Το δευτερογενές GBM αναπτύσσεται αργά από ένα προϋπάρχον, χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας αστροκύττωμα (βαθμού II ή III) το οποίο εξελίσσεται σε GBM βαθμού κακοήθειας ΙV μετά από αρκετά έτη (Aldape et al. 2015). Α.5.2. Ιστοπαθολογικά στοιχεία Διαγνωστικά ιστολογικά κριτήρια του GBM, τα οποία το διακρίνουν από τα υπόλοιπα αστροκυττώματα, αποτελούν η υψηλή μιτωτική δραστηριότητα, ο παθολογικός μικροαγγειακός πολλαπλασιασμός και οι νεκρωτικές περιοχές δηλαδή περιοχές με νεκρά κύτταρα στο κέντρο του όγκου (Weller et al. 2015). Τα κριτήρια αυτά πληρούνται όμως τόσο από τα πρωτογενή όσο και από τα δευτερογενή GBMs, γεγονός το οποίο τα καθιστά αδιάκριτα μόνο από τα ιστολογικά ευρήματα (Sturm et al. 2014). 84

Α.5.3. Συμπτώματα Οι ενδοκρανιακοί όγκοι πρακτικά μπορούν να προκαλέσουν κάθε φύσης νευρολογική διαταραχή, το είδος της οποίας σχετίζεται άμεσα με την εντόπιση του όγκου. Τα πιο κοινά συμπτώματα της νόσου είναι η κεφαλαλγία, η ναυτία, ο εμετός και η υπνηλία, τα οποία οφείλονται στην ενδοκρανιακή πίεση η οποία ασκεί ο όγκος στον εγκέφαλο. Το 30% των ασθενών ως πρώτο σύμπτωμα εμφανίζει μια επιληπτική κρίση. Επίσης η επιδείνωση της μνήμης, οι αλλαγές προσωπικότητας και τα νευρολογικά ελλείμματα είναι συχνά συμπτώματα στους ασθενείς με GBM (Alifieris and Trafalis 2015). Α.5.4. Κυτταρική προέλευση Παρόλο που τα γενετικά μονοπάτια τα οποία εμπλέκονται στη ανάπτυξη των κακοήθων γλοιωμάτων είναι ικανοποιητικά χαρακτηρισμένα, η κυτταρική προέλευση αυτών των όγκων δεν έχει κατανοηθεί επαρκώς. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν αναφερθεί στη θεωρία των βλαστικών καρκινικών κυττάρων. Το GBM είναι ένας ετερογενής όγκος ο οποίος συνίσταται από ποικίλα διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα αλλά περιέχει και ένα κλάσμα κυττάρων τα οποία μοιάζουν στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης και τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά με τα ενήλικα νευρικά βλαστικά κύτταρα (neural stem cells-nscs). Τα κύτταρα αυτά έχουν βλαστικές ιδιότητες όπως η αυτοανανέωση και η πολλαπλή δυνατότητα διαφοροποίησης, ο υψηλός βαθμός ανάπτυξης και η αντίσταση στην ακτινοθεραπεία. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα, σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, αποτελούν τη βάση για την προέλευση του όγκου και είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη και επικράτησή του (Facchino, Abdouh, and Bernier 2011). Α.5.5. Γενετικές μεταλλάξεις Τις περισσότερες πληροφορίες για τις γενετικές μεταλλάξεις στο GBM τις αντλούμε από έρευνες μοριακών προφίλ μεγάλης κλίμακας οι οποίες έλαβαν χώρα σε διάφορα εργαστήρια υπό την αιγίδα του Γενωμικού Άτλαντα του Καρκίνου (The Cancer Genome Atlas-TCGA). Ο TCGA είναι μια συνεργασία εθνικών ινστιτούτων στις Η.Π.Α. ο οποίος στοχεύει στην καταγραφή και την ανακάλυψη σημαντικών μεταβολών του γονιδιώματος οι οποίες προκαλούν 85

καρκίνο σε μεγάλες ομάδες ανθρωπίνων όγκων μέσω ολοκληρωμένων πολυδιάστατων αναλύσεων. Το GBM ήταν ένας από τους πρώτους τύπους καρκίνου ο οποίος ερευνήθηκε το γονιδίωμα και το μεταγράφημά του από τον TCGA, δίνοντας μια λεπτομερή εικόνα για τις μείζονες μοριακές αλλοιώσεις οι οποίες μπορεί να συνεισφέρουν στην παθοβιολογία της νόσου και την πρόοδο της. Αυτές οι αναλύσεις μεγάλης κλίμακας και σε επίπεδο επιγενετικής έδειξαν ότι το GBM, όπως ορίζεται και ιστολογικά, είναι ένας ετερογενής τύπος καρκίνου και ότι μπορεί να κατηγοριοποιηθεί σε έξι επιμέρους υποομάδες με κοινό μοριακό προφίλ μεταλλάξεων και μεθυλίωσης του DNA, όπως φαίνεται στο Σχήμα Α.5.1 (Aldape et al. 2015). Σχήμα Α.5.1. Οι υποομάδες στις οποίες κατηγοριοποιείται το γλοιοβλάστωμα με βάση γενετικά και επιγενετικά χαρακτηριστικά. Επιγραμματικά αυτές είναι οι IDH-μεταλλαγμένη, H3F3A K27, H3F3A G34, RTK I (PDGFRA), RTK II (Classic) και η μεσεγχυματική (Weller et al. 2015). Τα γλοιοβλαστώματα τα οποία συναντώνται σε ασθενείς >50 χρόνων (η πλειοψηφία των ασθενών δηλαδή), ανήκουν σε δύο επιγενετικά διακριτές υποομάδες με διαφορετικά προφίλ έκφρασης mrna οι οποίες χαρακτηρίζονται ως «κλασική» (ή RTK II) και «μεσεγχυματική». Η RTK II (Receptor Tyrosine Kinase IΙ) κατηγορία επιδεικνύει συχνότερα ενίσχυση του γονιδίου του EGFR συγκριτικά με τις άλλες κατηγορίες ενώ εκφράζεται και η μεταλλαγμένη μορφή 86

του EGFR, EGFRvIIΙ, η οποία παρουσιάζει έλλειψη σε ένα εξωκυττάριο τμήμα του, το οποίο τον καθιστά συνεχώς ενεργό, χωρίς να απαιτείται η παρουσία του προσδέτη. Άλλες χρωμοσωμικές και γενετικές μεταβολές οι οποίες συναντώνται συχνά στα γλοιοβλαστώματα ενηλίκων είναι η προσθήκες στο χρωμόσωμα 7, οι οποίες συνοδεύονται και με απώλειες στο χρωμόσωμα 10, μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο PTEN (phosphatase and tensin homolog), απώλεια των γενετικών τόπων των γονιδίων CDKN2A CDKN2B, όπως επίσης και μεταλλάξεις στον εκκινητή της τελομεράσης TERT (Sturm et al. 2012; Weller et al. 2015). Παρόλη την μικρή συχνότητά τους, τα γλοιοβλαστώματα εμφανίζονται και σε μικρότερες ηλικίες, σε παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες, όμως οι όγκοι αυτοί είναι γενετικά διακριτοί από αυτούς οι οποίοι εκδηλώνονται σε γηραιότερους ασθενείς. Διακρίνονται σε δύο υποομάδες παιδιατρικών γλοιοβλαστωμάτων οι οποίες χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις στο γονίδιο H3F3A το οποίο κωδικοποιεί την ιστόνη H3.3 και επηρεάζουν είτε την λυσίνη K27 του H3F3A είτε την γλυκίνη G34 του H3F3A. Οι όγκοι της υποομάδας G34 δείχνουν εκτεταμένη υπομεθυλίωση σε όλο το γονιδίωμα. Η πέμπτη υποομάδα στην οποία κατηγοριοποιείται το γλοιοβλάστωμα χαρακτηρίζεται από μεταλλάξεις του γονιδίου της ισοκιτρικής δεϋδρογονάσης 1 και 2 (isocitrate dehydrogenase-idh1/2) και σχετίζεται με υπερμεθυλίωση του γονιδιώματος. Αυτή η ομάδα εμφανίζει χαμηλότερη κακοήθεια, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα καλύτερη πρόγνωση. Η μεταλλαγμένη ισοκιτρική δεϋδρογονάση παράγει λιγότερο α-κετογλουταρικό και NADPH, με αποτέλεσμα να προκαλείται οξειδωτικό στρες και ανωμαλίες στη μεθυλίωση των γονιδίων τα οποία είναι χαρακτηριστικά των γλοιωμάτων και αναφέρονται ως φαινότυπος μεθυλίωσης νησίδων CpG (glioma-cpg island methylator, G- CIMP). Οι IDH μεταλλαγμένοι όγκοι τείνουν να εμφανίζονται σε νεότερες ηλικίες και συνήθως δεν φέρουν το μοριακό προφίλ της μονοσωμίας του χρωμοσώματος 10 και τις τρισωμίας του χρωμοσώματος 7 αλλά ούτε την ενίσχυση του γονιδίου του EGFR. Επίσης, η υποομάδα αυτή με τις μεταλλάξεις στα μεταβολικά αυτά ένζυμα περιλαμβάνει σχεδόν όλα τα γλοιοβλαστώματα τα οποία χαρακτηρίζονται ως δευτερογενή τα οποία προέρχονται από εξέλιξη προϋπαρχόντων γλοιωμάτων βαθμού κακοήθειας II και III.Οι τρείς υποομάδες 87

(IDH-μεταλλαγμένη, H3F3A K27 και H3F3A G34) φέρνουν συχνά και μεταλλάξεις των γονιδίων TP53 και ATRX. Η έκτη κατηγορία προσδιορίζεται μοριακά από την ενίσχυση του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων (Platelet-Derived Growth Factor Receptor, PDGFR) και εμφανίζεται πιο συχνά σε εφήβους και νεαρούς ενήλικες. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ως κατηγορία του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης I (RTK1) και χαρακτηρίζεται από νευρωνικό προφιλ έκφρασης όπως και η κατηγορία της μεταλλαγμένης IDH. Ακόμα, συναντάται σε διάφορους τύπους γλοιοβλαστώματος και η ενίσχυση ορισμένων πρωτοογκογονιδίων όπως οι κινάσες εξαρτώμενες από τις κυκλίνες CDK4 και CDK6, των γονιδίων MDM2 και MDM4 όπως και του γονιδίου του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των ηπατοκυττάρων (MET) (Sturm et al. 2012; Weller et al. 2015). Τέλος, ένας πολύ σημαντικός βιομάρτυρας του γλοιοβλαστώματος είναι η κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου του προαγωγέα της Ο-6- μεθυλγουανίνο-dna-μεθυλοτρανσφεράσης (MGMT). Αυτή η επιγενετική τροποποίηση εμφανίζεται στο 45% των ασθενών και καθορίζει την ευαισθησία των όγκων αυτών στους αλκυλιωτικούς παράγοντες (περαιτέρω ανάλυση στην παράγραφο της θεραπείας). Α.5.6. Σηματοδοτικά μονοπάτια στο γλοιοβλάστωμα Δύο δεκαετίες μοριακών μελετών έχουν αναδείξει τα σημαντικότερα σηματοδοτικά μονοπάτια, τα οποία μεταβάλλονται σε ανθρώπινα GBMs, εξαρτώμενα από τις πιο συχνά εμφανιζόμενες γενετικές μεταλλάξεις, ελλείψεις και ενισχύσεις γονιδίων. Αυτά είναι η ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών, τα οποία προάγουν την εξέλιξη του όγκου όπως των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης (Receptor Tyrosine Kinases-RTKs) καθώς και η καταστολή των ογκοκατασταλτικών μονοπατιών p53 και του ρετινοβλαστώματος 1 (Rb1) (McLendon et al. 2008). Μονοπάτι RTK/PI3K/Akt Αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι έχει αναφερθεί ότι λειτουργεί μη φυσιολογικά περίπου στο 88% των γλοιοβλαστωμάτων (Σχήμα Α.5.2). Το μονοπάτι 88

ρυθμίζει κυτταρικές λειτουργίες όπως η διαίρεση, η μετανάστευση και η επιβίωση. Το γονίδιο του EGFR εμφανίζεται ενισχυμένο στο 45% των πρωτογενών γλοιοβλαστωμάτων. Επίσης, εκφράζεται η μεταλλαγμένη μορφή του, EGFRvIIΙ, η οποία παρουσιάζει έλλειψη σε ένα εξωκυττάριο τμήμα του το οποίο τον καθιστά συνεχώς ενεργό χωρίς να απαιτείται η παρουσία προσδέτη. Σε μικρότερο ποσοστό (13%) συναντάται και η ενίσχυση του γονιδίου του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης PDGFRA (platelet-derived growth factor receptor alpha). Επιπρόσθετα, λόγω της απώλειας μιας περιοχής του χρωμοσώματος 10q, υπάρχει έλλειψη του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN (φωσφατάση ομόλογη της τενσίνης) στο 36% των περιπτώσεων ασθενών με GBM. Η πρωτεΐνη η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο PTEN αποτελεί καταστολέα της PI3K (McLendon et al. 2008). Επίσης συναντάται και στο 18% αδρανοποίηση του γονιδίου της νευροϊνωμάτωσης τύπου 1 (NF1) το οποίο αποτελεί αναστολέα του RAS/MAPK μονοπατιού (Aldape et al. 2015). Σχήμα Α.5.2. Συχνότερες γενετικές αλλοιώσεις του σηματοδοτικού μονοπατιού RTK / RAS / PI-3K. Αποχρώσεις του κόκκινου υποδεικνύουν γονιδιακές αλλαγές οι οποίες επιφέρουν ενεργοποίηση ενώ αποχρώσεις του μπλε υποδεικνύουν αδρανοποίηση με τις εντάσεις των χρωμάτων να είναι ανάλογες της συχνότητας εμφάνισης (McLendon et al. 2008). Με την ενεργοποίηση του EGFR στρατολογείται η PI3K (3-κινάση της φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης) και δεσμεύεται στις φωσφορυλιωμένες τυροσίνες του υποδοχέα μέσω των SH2 περιοχών της ρυθμιστικής υπομονάδας της. Η επακόλουθη ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ οδηγεί στην φωσφορυλίωση του φωσφολιπιδίου της διφωσφορικής ινοσιτόλης (ΡΙΡ2) σε φωσφολιπίδιο της τριφωσφορικής ινοσιτόλης (ΡΙΡ3). Ο ρόλος του ΡΤΕΝ (φωσφατάση ομόλογη 89

της τενσίνης) στο σηματοδοτικό μονοπάτι συνίσταται στην ικανότητά του να αποφωσφορυλιώνει τα φωσφολιπίδια τριφωσφορικής ινοσιτόλης (ΡΙΡ3) αντιστρέφοντας τα αποτελέσματα της κινάσης ΡΙ3Κ. Τα παραγόμενα λιπίδια δεσμεύονται και στρατολογούν την ανενεργή κυτταροπλασματική κινάση Akt στην πλασματική μεμβράνη. Η κινάση πλέον έχει υιοθετήσει μία πλήρως ενεργή μορφή και αφού αποσυνδεθεί από την πλασματική μεμβράνη, μπορεί να δράσει επί των κυτταροπλασματικών ή πυρηνικών της υποστρωμάτων της, τα οποία σχετίζονται με σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό, απόπτωση και μετανάστευση (Σχήμα Α.5.3). Έτσι λοιπόν η υπερέκφραση του EGFR και της μεταλλαγμένης μορφής του σε συνδυασμό με την απενεργοποίηση του γονιδίου PTEN οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα της Akt και επακόλουθη ανθεκτικότητα στην απόπτωση και την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (McLendon et al. 2008). Σχήμα Α.5.3. Το PI3K/Akt σηματοδοτικό μονοπάτι στο γλοιοβλάστωμα (Mellinghoff et al. 2005). 90

Μονοπάτι p53 To γονίδιο TP53 είναι ανενεργό σε πάνω από το 35% των GBM και το μονοπάτι μεταβάλλεται στο 87% των περιπτώσεων (Σχήμα Α.5.4). Σε περίπτωση βλάβης του DNA σε φυσιολογικά κύτταρα, το p53 μπλοκάρει τον κυτταρικό κύκλο δίνοντας τη δυνατότητα επιδιόρθωσής της βλάβης ή οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση εξουδετερώνοντας έτσι το γενετικά αλλοιωμένο κύτταρο. Το μονοπάτι αυτό διακόπτεται λόγω μετάλλαξης ή έλλειψης του γονιδίου TP53 (εμφανίζεται κυρίως στα δευτερογενή γλοιώματα) ή λόγω υπερέκφρασης των αναστολέων του οι οποίοι είναι οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες MDM2 και MDM4. Συνήθης μετάλλαξη στα γλοιώματα είναι και η έλλειψη του γονιδίου της πρωτεΐνης CDKN2A (αναστολέας της κυκλινοεξαρτώμενης κινάσης 2Α) η οποία αναστέλλει τη δράση της MDM2 (Belden et al. 2011). Σχήμα Α.5.4. Συχνότερες γενετικές αλλοιώσεις του σηματοδοτικού μονοπατιού p53. Αποχρώσεις του κόκκινου υποδεικνύουν γονιδιακές αλλαγές οι οποίες επιφέρουν ενεργοποίηση ενώ αποχρώσεις του μπλε υποδεικνύουν αδρανοποίηση με τις εντάσεις των χρωμάτων να είναι ανάλογες της συχνότητας εμφάνισης (McLendon et al. 2008). Μονοπάτι Rb1 (ρετινοβλάστωμα 1) Σε εφησυχασμένα κύτταρα, η πρωτεΐνη Rb1 εμποδίζει τη μεταγραφή γονιδίων τα οποία είναι σημαντικά για την μίτωση σταματώντας έτσι τον κυτταρικό κύκλο. Η διατάραξη του μονοπατιού μπορεί να προκαλέσει ανεξέλεγκτη λειτουργία του κυτταρικού κύκλου. Στο γλοιοβλάστωμα το μονοπάτι αυτό 91

διαταράσσεται είτε λόγω μετάλλαξης του γονιδίου του Rb1, είτε μέσω φωσφορυλίωσης και απενεργοποίησής του από την CDK4 (κυκλινοεξαρτώμενη κινάση 4), η οποία υπερεκφράζεται (Σχήμα Α.5.5). Ως αναστολέας της CDK4 δρα η CDKN2A, το γονίδιο της οποίας όπως ήδη αναφέρθηκε, στο 52% των περιπτώσεων, απουσιάζει (Nørøxe, Poulsen, and Lassen 2016). Σχήμα Α.5.5. Συχνότερες γενετικές αλλοιώσεις του σηματοδοτικού μονοπατιού Rb1. Αποχρώσεις του κόκκινου υποδεικνύουν γονιδιακές αλλαγές οι οποίες επιφέρουν ενεργοποίηση ενώ αποχρώσεις του μπλε υποδεικνύουν αδρανοποίηση με τις εντάσεις των χρωμάτων να είναι ανάλογες της συχνότητας εμφάνισης (McLendon et al. 2008). Α.5.7. Θεραπεία Επί του παρόντος, η συνήθης θεραπευτική πρακτική των ασθενών με γλοιοβλάστωμα περιλαμβάνει την μέγιστη δυνατή αφαίρεση του όγκου. Η καθολική αφαίρεσή του δεν υφίσταται, λαμβάνοντας υπόψιν ότι το σύνολο του όγκου δεν μπορεί να αφαιρεθεί καθώς το GBM διεισδύει στο γειτονικό υγιή ιστό. Ο στόχος της πλήρους μακροσκοπικής εκτομής μπορεί να επιτευχθεί ευκολότερα με τη βοήθεια νέων τεχνικών, όπως η απεικόνιση με καθοδήγηση με φθορισμό του όγκου με ενδοχειρουργική χρήση της ουσίας 5- αμινολεβουλινικού οξέος. Το 2017, εγκρίθηκε από την αρμόδια αμερικανική αρχή για την επίβλεψη τροφίμων και φαρμάκων (Federal Food and Drug Administration-FDA) η χρήση της τελευταίας. Μετεγχειρητικά ακολουθεί 92

ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία (Alifieris and Trafalis 2015). Η χειρουργική θεραπεία κατέχει διττό ρόλο στην αντιμετώπιση των περιστατικών αυτών: πρώτον αποσυμφορίζει τον εγκέφαλο από τα πιεστικά φαινόμενα τα οποία προκαλεί η μάζα του όγκου βελτιώνοντας έτσι τη νευρολογική εικόνα του ασθενούς και δεύτερον η μακροσκοπικά πλήρης αφαίρεση του όγκου καθιστά αποτελεσματικότερες την ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία (Buckner et al. 2007). Παράλληλα με την ακτινοθεραπεία χορηγούνται και χημειοθεραπευτικά σκευάσματα. Ένα εμπόδιο στη χρήση της χημειοθεραπείας στους όγκους του εγκεφάλου, όπως βέβαια και των υπόλοιπων ασθενειών του κεντρικού νευρικού συστήματος, είναι η περιορισμένη δυνατότητα μεταφορά των φαρμάκων στον εγκέφαλο λόγω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Το 2005, η τεμοζολομίδη προστέθηκε ως βασική θεραπεία στην αντιμετώπιση των ασθενών με πρόσφατα διαγνωσμένο GBM σε συνδυασμό με τη μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία (Σχήμα Α.5.6). cisplatin temozolomide Σχήμα Α.5.6. Χημειοθεραπευτικά απέναντι στο γλοιβλάστωμα. Η τεμοζολομίδη ανήκει στην κατηγορία αντικαρκινικών φαρμάκων των αλκυλιωτικών παραγόντων, οι οποίοι μπλοκάρουν τη διαδικασία αντιγραφής του DNA, αλκυλιώνοντας τις βάσεις της γουανίνης, κατά κύριο λόγο, και σε μικρότερη έκταση της κυτοσίνης. Το μικρό μοριακό βάρος της τεμοζολομίδης την καθιστά ικανή να διαπερνά αποτελεσματικά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Για το λόγο αυτό, θεωρείται ως ένας πολλά υποσχόμενος παράγοντας έναντι των πρωτοπαθών εγκεφαλικών όγκων καθώς και των δευτεροπαθών κακοηθειών του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η ιρινοτεκάνη, το ετοποσίδιο και η cis-πλατίνη έχουν χρησιμοποιούνταν στη θεραπεία του GBM έχοντας μέτρια αποτελεσματικότητα και σήμερα χρησιμοποιούνται ως θεραπεία κυρίως μετά την επανεμφάνιση της νόσου (Alifieris and Trafalis 2015). 93

H υπερμεθυλίωση του προαγωγού του γονιδίου της Ο-6- μεθυλογουανίνο-dna-μεθυλοτρανσφεράσης (MGMT) εμφανίζεται στο 45% των ασθενών με γλοιοβλάστωμα και έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό προγνωστικό παράγοντα για την απόκριση στη θεραπεία. Το MGMT είναι ένα ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA και προστατεύει τα κύτταρα από βλάβες οι οποίες προκαλούνται από την ιονίζουσα ακτινοβολία ή από παράγοντες αλκυλίωσης. Κύτταρα όγκου γλοιοβλαστώματος τα οποία φέρουν μεθυλιωμένο (και συνεπώς λειτουργικά ανενεργό) τον προαγωγό του MGMT, δεν εκφράζουν το αντίστοιχο ένζυμο και συνεπώς μειώνεται η ικανότητά τους να επιδιορθώνουν το DNA από βλάβες. Αυτή η έλλειψη του ενζύμου μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών όγκων στους αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως η τεμοζολομίδη και συνεπώς, ασθενείς με μεθυλιωμένο τον προαγωγό του MGMT έχουν καλύτερες αποκρίσεις σε ραδιο-/χημειο-θεραπεία και καλύτερο συνολικό χρόνο επιβίωσης από ασθενείς με μη μεθυλιωμένο προαγωγό MGMT (Schneider et al. 2010). Η έρευνα την τελευταία δεκαετία για τον καρκίνο, οδήγησε στην έννοια της «στοχευμένης μοριακής θεραπείας» η οποία βασίζεται στην ολοένα και μεγαλύτερη κατανόηση της μοριακής και γενετικής βάσης της κάθε μορφής καρκίνου. Η πλειονότητα των φαρμάκων τα οποία στοχεύουν στις κύριες οδούς σηματοδότησης και τους μηχανισμούς της γλοιοματογένεσης, όπως τους υποδοχείς κινάσης τυροσίνης RTK (erlotinib, gefitinib, cetuximab και imatinib) ή την αγγειογένεση (bevacizumab και cediranib), δεν αύξησαν σημαντικά τον χρόνο επιβίωσης, όταν χορηγήθηκαν μόνοι τους ή σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες σε τυχαίους ασθενείς με GBM. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι προσπάθειες για τον προσδιορισμό μοριακά καθορισμένων υποομάδων συνδράμει στην ανάπτυξη καινοτόμων πρωτόκολλων θεραπείας ειδικά προσαρμοσμένα στον κάθε ασθενή (Sturm et al. 2014). Ένα παράδειγμα στοχευμένης μοριακής θεραπείας στο GBM αφορά τους μεμβρανικούς υποδοχείς με δράση κινάσης τυροσίνης (RTK s). Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης της υπερέκφρασης του EGFR και της μεταλλαγμένης (συνεχώς ενεργοποιημένης) μορφής του, EGFRvIII, στο GBM, τον καθιστά κατάλληλο στόχο. Η στρατηγική της θεραπείας με βάση τον EGFR στοχεύει είτε στην παρεμπόδιση σύνδεσης των προσδετών στον υποδοχέα, είτε στη 94

μείωση της δράσης τους, είτε στην παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης με καθοριστικούς ρυθμιστές στα καθοδικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος (Taylor, Furnari, and Cavenee 2012). 95

Β ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Υλικά B.1.1. Χημικά αντιδραστήρια, αναλώσιμα και υλικά χρωματογραφίας Όλα τα χημικά αντιδραστήρια τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τους οίκους MERCK (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, MI, USA), Serva (Heidelberg, Germany) και Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Η cis-πλατίνη, το 5-FU, το Η2Ο2, η φορμαλδεΰδη και η σορβιτόλη τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στις κυτταροκαλλιέργειες ήταν της εταιρείας Sigma- Aldrich. Τo ισότοπo γ- 32 Ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 5000 Ci/mmol ήταν της εταιρείας Hartmann Analytic GmbH (Braunschweig, Germany). Τα ακτινογραφικά φιλμ τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες ήταν του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ ήταν αντίστοιχα τα X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρίας. Η παραφορμαλδεΰδη για την μονιμοποίηση των κυττάρων στην διάρκεια των ανοσοφθορισμών ήταν της εταιρίας MERCK. Οι καλυπτρίδες για τις δοκιμές του έμμεσου ανοσοφθορισμού ήταν της εταιρίας Thermo Scientific Shandon (Thermo Fisher Scientific Inc. NYSE: TMO). Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) χρησιμοποιήθηκε στήλη αγχιστείας γλουταθειόνηςσεφαρόζης της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd (Buckinghamshire, UK). 96

B.1.2. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Tα ένζυμα μοριακής βιολογίας τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ήταν των εταιριών New England BioLabs Inc. (Beverly, MA, USA) και Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan) Η DNA πολυμεράση (Taq DNA polymerase) η οποία χρησιμοποιήθηκε στις αντιδράσεις PCR ήταν της εταιρείας Finnzymes OY (Espoo, Finland). Οι αντιδράσεις της RT-PCR έγιναν με βάση τις οδηγίες του kit της αντίστροφης τρανσκριπτάσης M-MLV RT της εταιρείας Invitrogen. Για τις ανάγκες των σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της SRPK1 χρησιμοποιήθηκε η DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας (AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity) της εταιρίας Invitrogen. H ριβονουκλεάση Α (20 mg/ml) η οποία χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα έμμεσου ανοσοφθορισμού ήταν της εταιρείας Invitrogen Life Technologies. Τα μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ήταν: το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-srpk1 της εταιρείας BD Biosciences (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY), το anti-flag M5 της εταιρείας Sigma-Aldrich και το anti-gapdh της εταιρίας Acris. Στην ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα MIB-1 απέναντι στην Ki-67 (Dako S.A., Glostrup, Denmark). Επίσης, έγινε χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-h2ax απέναντι στη φωσφορυλιωμένη ιστόνη H2AX της εταιρίας Minipore, MERCK. Το δεύτερο αντίσωμα το οποίο χρησιμοποιήθηκε για Western blot ανάλυση ήταν goat-anti-mouse της εταιρείας Chemicon International Inc. (Temecula, CA USA). Το αντίσωμα αυτό ήταν συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση, ώστε να δίνει τη χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση. Για την ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε το ειδικό σύστημα του δεύτερου αντισώματος Dako REAL EnVision Detection System (DAKO, EnVision, code K5007). Για δοκιμές ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε ως δεύτερο αντίσωμα το Αlexa 488 donkey anti-mouse, της εταιρείας, Invitrogen. 97

Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Το θρεπτικό υγρό DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium), ο ορός εμβρύου μοσχαριού (fetal bovine serum, FBS) και το μίγμα αντιβιοτικών τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στις κυτταροκαλλιέργειες ήταν προϊόντα της GIBCO, Life Technologies Inc. (Scotland). Για την έκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) σε βακτήρια χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech. Ο κλώνος του LBR παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Howard Worman και Günter Blobel (Worman, Evans, and Blobel 1990) ενώ η έκφραση ενός μικρού τμήματος του άμινο-τελικού του άκρου το οποίο περιέχει την επαναλαμβανόμενη ακολουθία των διπεπτιδίων σερίνης/αργινίνης (αα 62-92) ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST, έγινε από την αναπληρώτρια καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη και τη διδάκτορα Βικτωρία Δρόσου. Η κλωνοποίηση ολόκληρης της SRPK1 στον προκαρυωτικό φορέα έκφρασης pgex-2t έγινε επίσης παλαιότερα από την αναπληρώτρια καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη. Η παρασκευή της SRPK1 Δspacer όπου λείπει η συνδετική αλληλουχία (αμινοξέα 256-475) έγινε παλαιότερα στο εργαστήριό μας από την Ελένη Νικολακάκη όπως και η κλωνοποίησή της στον πλασμιδιακό φορέα pflag- CMV-2. Η έκφραση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα έγινε με τη χρησιμοποίηση του φορέα κλωνοποίησης pflag-cmv-2 (Eastman Kodak Company). Η κλωνοποίηση ολόκληρης της SRPK1 στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pflag-cmv-2 έγινε παλαιότερα από την Ελένη Νικολακάκη ενώ η SRPK1 η οποία φέρει σημειακές μεταλλάξεις στη θρεονίνης 326 ή/και τη σερίνη 408 σε αλανίνη ή ασπαραγινικό οξύ έγιναν από τη διδάκτορα Μαρία Κουτρουμάνη στα πλαίσια της διδακτορικής της διατριβής (Κουτρουμάνη Μαρία 2016). Οι πλασμιδιακοί φορείς αναφοράς μίνι-γονιδίων, ο psrp20 και ο psmn2 οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες in vivo εναλλακτικού ματίσματος μας παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Stefan Stamm (Department of Molecular & Cellular Biochemistry, University of Kentucky). Ο πλασμιδιακός φορέας psvirb του μίνι γονιδίου της προ-ινσουλίνης μας παραχωρήθηκε 98

ευγενικά από την Dr. A. Andreadis (Department of Cell Biology, University of Massachusetts, Medical School). B.1.3. Κυτταρικές σειρές Στη διάρκεια των πειραμάτων της παρούσας εργασίας χρησιμοποιήθηκαν πέντε διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές καρκινικές σειρές, τα HeLa, τα U87MG, τα T98G, τα U251MG και τα A549. Tα HeLa κύτταρα έχουν απομονωθεί από αδενοκαρκίνωμα τραχήλου μήτρας και πλέον αποτελούν την πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη καρκινική κυτταρική σειρά καθώς είναι πολύ ανθεκτικά κύτταρα και πολλαπλασιάζονται με πολύ ταχύ ρυθμό (Rahbari et al. 2009). Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές U87MG, T98G και U251MG προέρχονται από πρωτογενή όγκο γλοιοβλαστώματος ενώ η καρκινική σειρά Α549 προέρχεται από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Όλα τα καρκινικά κύτταρα τα οποία προαναφέρθηκαν αναπτύσσονται προσκολλημένα στο τριβλίο σχηματίζοντας μονοστοιβάδες. Για τον πολλαπλασιασμό του πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη E. coli TOP-10F (Invitrogen Life Technologies) και JM109 (Promega Corporation, Madison, WI, USA) ενώ για τον πολλαπλασιασμό μεταλλαγμένου πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη ES 1301 mut S και JM109 (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Για την υπερέκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν τα E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies). Β.2. Μέθοδοι Β.2.1. Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Για την ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών E. coli BL21(DE3), TOP-10, TOP-10F, ES 1301 mut S και JM109 χρησιμοποιείται το θρεπτικό υπόστρωμα L.B., (Luria-Bertani) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis 1989), του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: 99

Πίνακας Β.2.1. Συστατικά του θρεπτικού υποστρώματος L.B. Θρεπτικό υλικό L.B. Συστατικά Συγκέντρωση Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl 0,5 % w/v 1,0 % w/v 1,0 % w/v Η ανάπτυξη των κυττάρων TOP-10 και TOP-10F, με σκοπό την παρασκευή επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων (competent cells), γίνεται σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση είναι: Πίνακας Β.2.2. Συστατικά του θρεπτικού υποστρώματος TYM. Θρεπτικό υλικό TYM Συστατικά Συγκέντρωση Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl MgSO4 0,5 % w/v 2,0 % w/v 0,1 M 10 mm Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων ES 1301 mut S γίνεται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό M-9, του οποίου η σύσταση είναι: Πίνακας Β.2.3. Συστατικά του θρεπτικού υποστρώματος M-9. Θρεπτικό υλικό M-9 Συστατικά Συγκέντρωση Na2HPO4 KH2PO4 NaCl NH4Cl Άγαρ MgSO4 CaCl2 γλυκόζη θειαμίνη-hcl 0,6 % w/v 0,3 % w/v 0,05 % w/v 0,1 % w/v 1,5 % w/v 2 mm 0,1 mm 0,2 % v/v 1 mm Η ρύθμιση της οξύτητας γίνεται με τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση 2 atm, για 45 λεπτά. Το διάλυμα στη συνέχεια ψύχεται στους 50 ο C και προστίθενται το MgSO4, το CaCl2, η γλυκόζη και η θειαμίνη-hcl. Μετά την παρασκευή όλων των μέσων ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων ακολουθεί η αποστείρωσή τους στους 120 ο C, υπό πίεση 2 atm, για 45 λεπτά. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, υπό έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. 100

Β.2.2. Παρασκευή επιδεκτικών για μετασχηματισμό κυττάρων (competent cells) Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων ώστε να προσλάβουν τον εκάστοτε πλασμιδιακό φορέα. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασμένα με διαλύματα CaCl2 στους 4 ο C και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές (Sambrook et al. 1989). Συγκεκριμένα, 2 ml θρεπτικού υλικού LB εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (15 μg/ml τετρακυκλίνη ή 20 μg/ml στρεπτομυκίνη). Η καλλιέργεια αναπτύσσεται για 12-16 ώρες στους 37 C, υπό συνεχή ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml θρεπτικού μέσου, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. Ένα ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή 0,35-0,4. Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 10 λεπτά στους 4 C και στη συνέχεια αιωρούνται σε 25 ml (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της τελευταίας καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaCl2, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικό κάλιο ph 7,5. Τα κύτταρα παραμένουν στον πάγο για 10 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 3000 x g. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 2 ml διαλύματος το οποίο αποτελείται από 10 mm MOPS, 75 mm CaCl2, 10 mm KCl και 20% γλυκερόλη (1/25 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρημα το οποίο προκύπτει μοιράζεται σε κλάσματα των 200 μl και εμβαπτίζεται σε λουτρό το οποίο αποτελείται από ξηρό πάγο και αιθανόλη (επιτυγχανόμενη ελάχιστη θερμοκρασία: 80 C) για μικρό χρονικό διάστημα. Με την τεχνική αυτή, τα κύτταρα είναι επιδεκτικά στο μετασχηματισμό και μπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα. B.2.3. Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (transformation) Ο μετασχηματισμός επιτυγχάνεται με την προσθήκη λίγων μl από το πλασμιδιακό DNA το οποίο θέλουμε να εισάγουμε σε 200 μl αιωρήματος των επιδεκτικών βακτηρίων και παραμονή τους στον πάγο για 30 min. Στη 101

συνέχεια, τα κύτταρα υπόκεινται σε θερμικό σοκ για 2 λεπτά στους 42 C. Ακολουθεί η προσθήκη 500 μl υγρού θρεπτικού υλικού LB (ή SOC στην περίπτωση των στελεχών JM109) και επώαση στους 37 C για 20 min. Μετά από φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 5000 x g, αφαιρείται το μεγαλύτερο μέρος του υπερκειμένου και γίνεται αιώρηση του ιζήματος των κυττάρων με το υπερκείμενο το οποίο εναπομένει. Στη συνέχεια ακολουθεί στερεή καλλιέργεια των μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων με επίστρωσή τους στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ, το οποίο περιέχει και το αντίστοιχο αντιβιοτικό (στο οποίο φέρει αντίσταση το πλασμιδιακό DNA το οποίο έχουμε εισαγάγει). Με τον τρόπο αυτό γίνεται η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έναντι των βακτηρίων τα οποία δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο (Sambrook et al. 1989) Τα τρυβλία επωάζονται στους 37 C για 12-16 ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Οι διακριτές αποικίες οι οποίες αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τρυβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και εμβολιάζονται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αντιβιοτικού για να αναπτυχθούν, ώστε είτε να απομονωθεί το πλασμιδιακό DNA είτε να γίνει έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. B.2.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση Μία αποικία των μετασχηματισμένων βακτηρίων χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3 ml θρεπτικού υλικού παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού και αναπτύσσεται για περίπου 12 ώρες στους 37 ο C υπό συνεχή ανακίνηση. Στη συνέχεια, 1,5 ml της καλλιέργειας μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 1 λεπτό. Μετά την απόρριψη του υπερκείμενου, στο ίζημα αρχικά προστίθενται 50 μl διαλύματος GTE (50 mm Tris-Cl ph 8,0, 10 mm EDTA, 20% γλυκόζη) και τα κύτταρα αναδεύονται έντονα ώστε να αιωρηθεί πλήρως το ίζημα. Στην συνέχεια, προστίθεται διπλάσιος όγκος διαλύματος 0,2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά αυστηρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 80 μl ψυχρού διαλύματος 3 Μ CH3COOK και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε 12000 x g. Στο υπερκείμενο το οποίο παραλαμβάνεται, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 0,8 όγκων 102

ισοπροπανόλης και παραμονή στους -20 C για 30 λεπτά. Το ίζημα το οποίο προκύπτει μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g για 5 λεπτά, αιωρείται σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8,0) παρουσία RNase A (20 μg/ml) και το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 20 λεπτά. Το DNA εκχυλίζεται με την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορμίου. Στην υδατική στοιβάδα η οποία απομονώνεται μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε 12000 x g, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 2,5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αμμωνίου. Το DNA διαλυτοποιείται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου ddh2o και φυλάσσεται στους -20 C. B.2.5. Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το kit Hipure Plasmid Midiprep της εταιρείας Invitrogen Για τις ανάγκες της απομόνωσης και του καθαρισμού πλασμιδιακού DNA με αποκλειστικό σκοπό την μετέπειτα επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το kit Hipure Plasmid Midiprep της εταιρείας Invitrogen. Το πρωτόκολλο το οποίο ακολουθήθηκε είναι το εξής: Βακτηριακή καλλιέργεια 250 ml LB αναπτύσσεται στο κατάλληλο αντιβιοτικό για 16 ώρες στους 37 C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 5000 x g για 10 λεπτά. Το ίζημα το οποίο απομένει μετά από την απόχυση του υπερκειμένου αιωρείται σε 4 ml διαλύματος R3 (50 mm Tris-Cl, 10 mm EDTA, ph 8,0) το οποίο περιέχει 20 mg/ml RNase A και στη συνέχεια προστίθενται 4 ml διαλύματος L7 (200 mm NaOH, 1% SDS) με ήπια ανάδευση ώστε να καταστεί ομογενές. Μετά από παραμονή 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος προστίθενται 4 ml ψυχρού διαλύματος N3 (3 M KCH3COOH ph 5,5) και μετά από απαλή ανακίνηση αφήνεται για 20 λεπτά στους 4 C. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα 10000 x g, ενώ συγχρόνως γίνεται και η εξισορρόπηση της στήλης HiPure Midi Column με 10 ml διαλύματος EQ1 (0,1 M NaCH3COOH, 0,6 M NaCl, 0,15% Triton X-100, ph 5,0). Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης αφού απομακρυνθεί με προσοχή από το σωλήνα φυγοκέντρησης, ώστε να μην παραληφθεί συγχρόνως και το κολλώδες ίζημα, διαβιβάζεται από τη στήλη HiPure Midi Column. Μετά τη διέλευση του υπερκειμένου από τη στήλη, γίνεται πλύση της στήλης, δύο φορές, με 10 ml διαλύματος W8 (0,1 M NaCH3COOH, 825 mm NaCl, ph 5,0), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν προσμίξεις από την προηγούμενη κατεργασία. Η 103

έκλουση του DNA γίνεται με τη διέλευση 5 ml διαλύματος E4 (1,25 Μ NaCl, 100 mm Tris-Cl, ph 8,5). Αφού συλλεχθεί το σύνολο του παραπάνω εκλουσματος γίνεται κατακρήμνιση του DNA προσθέτοντας 0,8 όγκους ισοπροπανόλης και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 10000 x g για 30 λεπτά. Μετά από προσεκτική απόχυση του υπερκειμένου γίνεται μια σύντομη πλύση με 5 ml 70% αιθανόλη και το ίζημα το οποίο παραλαμβάνεται μετά από νέα φυγοκέντρηση στα 10000 x g διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (10 mm Tris- Cl, 0,1 mm EDTA, ph 8,0). Η περιεκτικότητα του διαλύματος σε DNA προσδιορίζεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm και το παρασκεύασμα φυλάσσεται στους -20 C. B.2.6. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) είναι μια τεχνική η οποία χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό ενός αρχικού τμήματος DNA σε πολλά αντίγραφα. Η εφαρμογή της τεχνικής στην παρούσα εργασία ήταν κυρίως για την ενίσχυση πλασμιδίων, για την εισαγωγή κατάλληλων θέσεων για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού ενός τμήματος DNA προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς και η εισαγωγή μεταλλάξεων στο DNA. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης, με βασική ιδιότητα να παραμένει δραστική σε υψηλές θερμοκρασίες, η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία επιπρόσθετα καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας την οποία επιθυμούμε να πολλαπλασιάσουμε. Η DNA πολυμεράση ξεκινά τον πολυμερισμό από το 3 υδροξύλιο του εκκινητή, πολυμερίζοντας πάντα προς 5 3 κατεύθυνση. Η αντίδραση της PCR πραγματοποιείται σε τρία στάδια, τα οποία επαναλαμβάνονται διαδοχικά: 104

Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 90-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα το οποίο πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, είναι πλέον διαθέσιμο για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας λόγω της υψηλής θερμοκρασίας. Στάδιο 2 ο : Υβριδισμός Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους 50-75 ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 ο : Επιμήκυνση Στο στάδιο αυτό η DNA πολυμεράση, χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας διαδοχικά νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DNA. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Ο κύκλος των τριών σταδίων επαναλαμβάνεται 20-30 φορές και παράγονται 2 n μόρια DNA, όπου n είναι ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 C για 5 min, ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός (Innis et al. 1990). Το τέλος της αντίδρασης πραγματοποιείται με την παραμονή του μίγματος της PCR στους 4 C. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως σε τελικό όγκο μίγματος 50 μl, τα συστατικά του οποίου φαίνονται στον Πίνακα B.1. 105

Πίνακας Β.2.4. Συστατικά του μίγματος αντίδρασης PCR, συνολικού όγκου 50 μl. Συστατικά DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (sense) Εκκινητής αντινοηματικός (antisense) Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10 x Πολυμεράση (Taq) H2Ο Συγκέντρωση 10-20 ng 20 pmol 20 pmol 200 μm 5 μl 1 μl Έως 50 μl B.2.7. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Ως φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιούνται τα πλασμίδια, τα οποία είναι μικρά, κυκλικά, δίκλωνα μόρια DNA τα οποία μπορούν να αναπτύσσονται ημιαυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε αντιβιοτικά. Η κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς βασίζεται κυρίως στην ικανότητα των περιοριστικών ενζύμων να αναγνωρίζουν και να κόβουν ειδικές αλληλουχίες συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο μόριο του DNA δημιουργώντας μονόκλωνα άκρα. Η κατεργασία με την ίδια ενδονουκλεάση περιορισμού του φορέα κλωνοποίησης (πλασμιδιακό DNA) και του ξένου τμήματος DNA το οποίο θέλουμε να εισάγουμε οδηγεί υβριδισμό τους λόγω της συμπληρωματικότητας των άκρων τους. Στη συνέχεια, μπορούν να επανακυκλοποιηθούν συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού τον οποίο καταλύει το ένζυμο λιγάση. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μπορεί να μεταφερθεί σε κύτταρα και να αναπτυχθεί παρουσία αντιβιοτικών επιτρέποντας έτσι την επιλογή τους σε σχέση με τα κύτταρα τα οποία δεν περιέχουν το πλασμίδιο (Sambrook et al. 1989).Οι πλασμιδιακοί φορείς οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι pflag-cmv-2 και pgex-2t. B.2.8. Πέψη με ένζυμα περιορισμού Οι αντιδράσεις πέψης με ένζυμα περιορισμού πραγματοποιήθηκαν στους 37 C για 1 ώρα και σε τελικό όγκο 30 μl. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 4 μg DNA (πλασμιδιακός φορέας, ή το κομμάτι του DNA το οποίο πρόκειται να κλωνοποιηθεί), 1 μl του ενζύμου περιορισμού (10 Units/μl) και 3 μl από το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (10x), όπου παρουσιάζεται η βέλτιστη δράση 106

του κάθε ενζύμου. Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα ένζυμα περιορισμού BamHI και EcoRI της εταιρείας Takara. B.2.9. Ηλεκτροφόρηση μορίων DNA σε πηκτές αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση συγκεκριμένων τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης αποτελεί έναν απλό τρόπο διαχωρισμού μορίων DNA. Η μέθοδος βασίζεται στον διαχωρισμό των φορτισμένων μορίων DNA ανάλογα με το μέγεθός τους κατά μήκος ενός στερεού πορώδους υποστρώματος στα άκρα του οποίου εφαρμόζεται ηλεκτρική τάση. H παρασκευή πηκτών αγαρόζης γίνεται με τήξη της αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα έως ότου σχηματιστεί ένα διαυγές διάλυμα. Με τη ψύξη του διαλύματος σχηματίζεται ένα πλέγμα του οποίου η πυκνότητα εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τα τμήματα του DNA, τα οποία είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο ph, μετακινούνται προς την άνοδο (Sambrook et al. 1989; Sharp, Sugden, and Sambrook 1973). Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από ορισμένους παράγοντες: Το μέγεθος του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. Έτσι, τα μικρότερα μόρια DNA κινούνται ταχύτερα, καθώς συναντούν μικρότερη αντίσταση στους πόρους του πηκτώματος. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. Τη διαμόρφωση DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA, ίδιου μοριακού βάρους, κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου. Το δυναμικό το οποίο εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. Τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης. Το ρυθμιστικό διάλυμα διατηρεί σταθερό το ph και περιέχει τα απαραίτητα ιόντα για την αύξηση της ηλεκτρικής αγωγιμότητας. 107

Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται πηκτές με συγκέντρωση 1% και 2% αγαρόζης (ανάλογα του μεγέθους του DNA), σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE (0,04 M Tris-CH3COOH, 0,001 M EDTA ph 8,0), παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου σε συγκέντρωση 0,5 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA. Η ιδιότητα του να απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία και να την επανεκπέμπει στο κόκκινο ορατό φάσμα χρησιμοποιείται για να ανιχνευθούν τα τμήματα του DNA πάνω στην πηκτή. Το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων αποτελείται από 5% γλυκερόλη, 0,42% μπλε της βρωμοφαινόλης και 0,42% κυανούν του ξυλενίου, ενώ η χρησιμοποιούμενη συσκευή ηλεκτροφόρησης είναι της εταιρείας International Biotechnologies, Inc. B.2.10. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της συγκέντρωσης νουκλεϊνικών οξέων Η αρχή του φωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος. Έτσι, τα διαλύματα νουκλεϊνικών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA μια μικρή ποσότητα του προς ανάλυση δείγματος (3 μl) αραιώνεται (σε 600 μl), μεταφέρεται σε ειδική κυψελίδα και στην συνέχεια μετριέται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Με βάση το γεγονός ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm αντιστοιχεί με 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίζεται η ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊνικού οξέος στο άγνωστο δείγμα (Sambrook et al. 1989). B.2.11. Σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο της SRPK1 Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκαν δύο σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο της SRPK1 με σκοπό την αντικατάσταση των λυσινών 329 και 377 από αργινίνες. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pflag-cmv-2-srpk1 και pgex-2t-srpk1 για την εισαγωγή των μεταλλάξεων στο γονίδιο της SRPK1.H μέθοδος η οποία ακολουθήθηκε αποτελεί ένα συνδυασμό των in vitro mutagenesis kit 108

QuickChange Lightning της εταιρείας Stratagene και Altered Sites II της εταιρείας Promega. Συγκεκριμένα σχεδιάστηκαν δύο διαφορετικά σετ εκκινητών, ένας νοηματικός (s) και ένας αντινοηματικός (a), για κάθε μετάλλαξη: Πίνακας Β.2.5. Νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τις σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο της SRPK1. Ονομασία εκκινητή Αλληλουχία 329 K R (s) 5 -CCTAATAAAATGACCCAAGAAAGACTTGAAGAGTCAAGTACCATT-3 329 K R (a) 5 -AATGGTACTTGACTCTTCAAGTCTTTCTTGGGTCATTTTATTAGG-3 377 K R (s) 5 -GTAATAATGAAACATTGAGACATAGAGAGGATCTACATAATGCTAATGAC-3 377 K R (a) 5 -GTCATTAGCATTATGTAGATCCTCTCTATGTCTCAATGTTTCATTATTAC-3 Ακολούθησε PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του mutagenesis kit της εταιρείας Stratagene. Πραγματοποιήθηκαν συνολικά 20 κύκλοι για κάθε μετάλλαξη. H θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών κυμαίνεται από τους 61 ο C έως τους 65 ο C ανάλογα με το σετ των εκκινητών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πέψη των προϊόντων της PCR με 2 μl DpnI, σύμφωνα με τις οδηγίες του kit της Stratagene για 1 ώρα στους 37 ο C. Κατά τη διάρκεια της πέψης αυτής η ενδονουκλεάση DpnI διασπά όλα τα μεθυλιωμένα και ημιμεθυλιωμένα παράγωγα του αρχικού DNA και αφήνει μόνο τα νέα μεταλλαγμένα προϊόντα της PCR (τα οποία δεν φέρουν μεθυλιώσεις). Ακολούθησε κατακρήμνιση και επαναδιαλυτοποίηση των προϊόντων της PCR σε 20 μl Η2Ο. Το DNA αυτό χρησιμοποιήθηκε για μετασχηματισμό των ES 1301 mut S βακτηριακών κυττάρων της εταιρείας Promega από τα οποία λείπουν τα γονιδιακά εκείνα στοιχεία τα οποία προκαλούν την in vivo επιδιόρθωση των μεταλλάξεων. Από τις αποικίες των βακτηριακών κυττάρων οι οποίες εμφανίστηκαν στο στάδιο αυτό, απομονώθηκε DNA για κάθε ένα μετάλλαγμα και ακολούθησε και πάλι μετασχηματισμός των JM 109 βακτηριακών κυττάρων της εταιρείας Promega. Από το τελικό DNA το οποίο απομονώθηκε από τα JM 109 κύτταρα έγινε επιβεβαίωση της εισαγωγής των μεταλλάξεων μετά από αλληλούχιση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων στο CeMIA SA (spinoff εταιρεία από το Εργαστήριο Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας). 109

B.2.12. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα με υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα με στήλη αγχιστείας. Τα γονίδια των πρωτεϊνών τα οποία πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους, αφ ενός κατάλληλους προαγωγούς οι οποίοι επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και αφ ετέρου το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), έτσι ώστε η πρωτεΐνη η οποία θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης μ αυτήν. Η σύντηξη της πρωτεΐνης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης επιτρέπει τον καθαρισμό της με στήλη αγχιστείας η οποία περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το εκχύλισμα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST με τη γλουταθειόνη, με αποτέλεσμα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται με την προσθήκη περίσσειας διαλύματος γλουταθειόνης. Αυτή η διαδικασία έκλουσης εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτημα να γίνεται σε πολύ ήπιες συνθήκες εξασφαλίζοντας έτσι την ακεραιότητα της δομής και της δράση της πρωτεΐνης σύντηξης (Sambrook et al. 1989). Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες οι οποίες εκφράστηκαν με αυτή την μέθοδο είναι ένα τμήμα του αμινο-τελικού άκρου του LBR, το οποίο περιέχει την RS περιοχή και αποτελείται από τα αμινοξέα 62 έως 92 [GST-LBRNt(62-92)] καθώς και ολόκληρο το μόριο της SRPK1 (GST-SRPK1). Ο πλασμιδιακός φορέας, στον οποίο είχαν κλωνοποιηθεί όλα τα παραπάνω cdna είναι ο pgex-2t. Αναλυτικά η διαδικασία έχει ως εξής: Βακτηριακά κύτταρα BL21 (DE3) τα οποία έχουν μεταμορφωθεί με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό LB/άγαρ το οποίο περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας διακριτής αποικίας από το τρυβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα των κυττάρων επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Από την καλλιέργεια η οποία 110

προκύπτει αφαιρούνται 10 ml με τα οποία εμβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού LB που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων γίνει ίση με Α590= 0,6-0,7. Τη δεδομένη χρονική στιγμή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG το οποίο ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες, καθώς και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις πρωτεολυτικών ενζύμων. Η επώαση συνεχίζεται για 3 επιπλέον ώρες και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στις 4000 στροφές για 15 min. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου, το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 6 ml διαλύματος PBST (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na2HPO4, 0,2 gr/l KH2PO4, 1% Triton X-100, 0,1% β-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρημα σε υπέρηχους (UP5OH sonicator) για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά, μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά στα 8500 x g σε θερμοκρασία 4 C και λαμβάνεται το υπερκείμενο πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Το εκχύλισμα αυτό αναμιγνύεται με το αιώρημα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C, με σκοπό να δεσμευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στα 3000 x g και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 λεπτά στους 4 C υπό ανάδευση. Στους κόκκους της στήλης οι οποίοι λαμβάνονται μετά από φυγοκέντρηση στα 3000 x g για 2 λεπτά, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 λεπτών η κάθε μία με διάλυμα το οποίο περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris-Cl ph 8,0. Τα εκλούσματα τα οποία περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης λαμβάνονται με φυγοκέντρηση στα 3000 x g για 2 λεπτά και στη συνέχεια φυλάσσονται στους -20 C. Για το καθαρισμό της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBRNt(62-92) χρησιμοποιήθηκε τόσο για τη λύση των κυττάρων όσο και για τις πλύσεις οι οποίες ακολούθησαν διάλυμα PBST το οποίο περιείχε και 1 Μ NaCl. Απουσία NaCl παρατηρήθηκε ότι το μεγαλύτερο μέρος της ανασυνδυασμένης αυτής πρωτεΐνης κατακρημνίζεται και 111

ένα πολύ μικρό μέρος παραμένει διαλυτό, καθώς έχει πολύ υψηλό ισοηλεκτρικό σημείο (θεωρητικά pi: 12,48-12,90). Για την αναγέννηση της στήλης γλουταθειόνης-σεφαρόζης μετά από κάθε χρήση ακολουθεί διαδικασία με τρείς διαδοχικές πλύσεις (30 min η κάθε πλύση) σε όξινο (0,1 M CH3COONa, 0,5 M NaCl, ph 4,5) και βασικό (0,1 M NaCl, 0,1 M Tris-Cl, ph 8,5) διάλυμα, στους 4 C. Στη συνέχεια η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυμα PBST. B.2.13. Ανίχνευση δράσης κινάσης πρωτεϊνών με in vitro φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων τους Η ανίχνευση δραστικότητας μιας κινάσης πρωτεϊνών στηρίζεται στην επώαση της καθαρής ανασυνδυασμένης κινάσης, με ένα κατάλληλο υπόστρωμα. Το υπόστρωμα όπως και η κινάση ήταν εκφρασμένα, ως πρωτεΐνες σύντηξης με GST, στα Ε. coli και ως δότης φωσφορικών χρησιμοποιήθηκε το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Στα πειράματά μας μελετήθηκε η δραστικότητα της αγρίου τύπου SRPK1 χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το τμήμα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) το οποίο περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 62 και 92 (LBRNt(62-92)) και αποτελεί γνωστό υπόστρωμα της SRPK1 (Koutroumani et al. 2017). Στο τμήμα αυτό υπάρχουν πέντε επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια, οι σερίνες των οποίων φωσφορυλιώνονται από τις SRPK1. Στα πειράματα αυτά ελέγχθηκε η δράση της SRPK1 παρουσία διαφόρων ενώσεων. Σε όλες τις περιπτώσεις το μίγμα επώασης περιλαμβάνει 12,5 mm Hepes ph 7,5, 10 mm MgCl2, 0,6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ και 25 μμ ψυχρό ΑΤΡ όπως επίσης και την εκάστοτε ουσία η οποία πρόκειται να μελετηθεί στην επιθυμητή συγκέντρωση. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 μl και ρυθμίζεται με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη2ο. Τα δείγματα επωάζονται για 30 min σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 100 mm DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων το οποίο χρησιμοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται. Για την εμφάνιση των ζωνών ακολουθεί χρώση της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και αποχρωματισμός της για την αφαίρεση της περίσσειας της βαφής. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής, 112

αυτοραδιογραφία και κοπή των ζωνών της πηκτής οι οποίες αντιστοιχούν στο μοριακό βάρος του υποστρώματος σε συμφωνία και με τις ζώνες οι οποίες εμφανίζονται στο film της αυτοραδιογραφίας. Ακολουθεί η μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή 1500 TR (Packard) κατά Cherenkov. Κατ αυτό τον τρόπο ανιχνεύεται η δραστικότητα της SRPK1 καθώς και η έκταση της ενσωμάτωσης της ραδιενέργειας από το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ στο αντίστοιχο υπόστρωμα του LBRNt(62-92). B.2.14. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250 Η οπτικοποίηση των πρωτεϊνικών ζωνών μετά από την ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου γίνεται με B.2.23. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250. Η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα το οποίο περιέχει 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% μεθανόλη και ανακινείται για διάστημα 30 λεπτών. Στο διάλυμα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται με ανακίνηση σε διάλυμα 10% οξικό οξύ, 10% μεθανόλη με σκοπό την απομάκρυνση της περίσσειας της βαφής. B.2.15. Αυτοραδιογραφία Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την β-ακτινοβολία την οποία εκπέμπει το ισοτόπο 32 Ρ. Το ισότοπο αυτό του φωσφόρου χρησιμοποιείται για την επισήμανση διάφορων πρωτεϊνικών μορίων και στα συγκεκριμένα πειράματα ενσωματώνονταν στο υπόστρωμα της SRPK1 μέσω της φωσφορυλίωσης με ραδιενεργό ATP (Garrison 1983) Στην περίπτωση των πηκτωμάτων τα οποία έχουν βαφεί και στερεωθεί, το πήκτωμα ανακινείται για 2 ώρες σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3 mm (Whatman International Ltd. Kent, England) υπό συνθήκες κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους. Μία πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης ο οποίος απαιτείται μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger series 900 (Mini Instruments, Essex, UK).Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα. 113

B.2.16. Κλινικά και παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών Τα δείγματα υγιών ιστών παραχωρήθηκαν από το εργαστήριο ιατροδικαστικής και τοξικολογίας, της Ιατρικής Σχολής, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου των Αθηνών. Προέρχονταν από πέντε διαφορετικά περιστατικά, ανθρώπων (3 άνδρες και 2 γυναίκες με εύρος ηλικιών από 51 μέχρι 86 χρόνια) οι οποίοι απεβίωσαν είτε από έμφραγμα του μυοκαρδίου είτε από πνευμονία. Τα δείγματα ιστών όπως και τα κλινικά και παθολογοανατομικά δεδομένα προέρχονται από ασθενείς με γλοιωματικούς όγκους, οι οποίοι εγχειρίστηκαν στο ινστιτούτο νευροχειρουργικής, της Ιατρικής Σχολής, του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Μελετήθηκαν 38 ασθενείς εκ των οποίων 27 ήταν άνδρες και 11 ήταν γυναίκες με μέσο όρο ηλικίας τα 50 χρόνια και εύρος από 30 μέχρι 71 χρονών. Δύο ασθενείς σταμάτησαν την παρακολούθηση και ένας ασθενής πέθανε στην άμεση μετεγχειρητική περίοδο. Οι ασθενείς αυτοί εξαιρέθηκαν από τη μελέτη επιβίωσης. Μετά από μια μέση περίοδο παρακολούθησης 16 μηνών (εύρος 6-36 μηνών), 6 ασθενείς ζούσαν. Συνολικά, 22 ασθενείς(75%) στους 6 μήνες και 11 ασθενείς (37%) στους 12 μήνες, ήταν ζωντανοί χωρίς εξέλιξη της νόσου. Η ιστολογική διάγνωση έδειξε ότι οι από το σύνολο των 38 περιπτώσεων, οι 33 αφορούσαν γλοιοβλάστωμα ενώ υπόλοιπες 5 αφορούσαν γλοιώματα βαθμού II κατά WHO (δύο διάχυτα αστροκυττώματα και τρία ολιγοδενδρογλοιώματα). Σε ιστολογικές τομές του καρκινικού όγκου των παραπάνω ασθενών ελέγχθηκε η έκφραση της SRPK1 και του δείκτη Ki-67 όπως θα περιγραφεί παρακάτω. Η έκταση της εκτομής του όγκου προσδιορίστηκε συγκρίνοντας την απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) πριν την εγχείρηση με αυτήν η οποία λήφθηκε ένα μήνα μετά την εγχείρηση. Σε 24 περιπτώσεις επιτυγχάνθηκε ολική αφαίρεση του όγκου ενώ σε 14 περιπτώσεις πραγματοποιήθηκε μερική αφαίρεσή του. Σε όλους τους ασθενείς με γλοιοβλάστωμα χορηγήθηκε μετεγχειριτικά ακτινοθεραπέια με τεμοζολομίδη ακολουθούμενη από χημειοθεραπέια με τεμοζολομίδη για διάστημα ενός έτους ή μέχρι την υποτροπή της νόσου. Η μελέτη έχει εγκριθεί από το Επιστημονικό Συμβούλιο Εγκρίσεων (ΕΣΕ). 114

B.2.17. Ανοσοϊστοχημεία Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε με την έμμεση μέθοδο στρεπταβιδίνηςβιοτίνης-υπεροξειδάσης. Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα της στρεπταβιδίνης να δεσμεύεται μη ανοσολογικά με τη βιοτίνη. Καλείται έμμεση, καθώς πέραν της σύνδεσης του πρώτου αντισώματος με το προς μελέτη αντιγόνο, προστίθεται και δεύτερο αντίσωμα, το οποίο συνδέεται με το πρώτο με σκοπό να γίνει ορατό το αποτέλεσμα. Το δεύτερο αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με βιοτίνη και με την προσθήκη του αντιδραστηρίου στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης, επιτυγχάνεται η ομοιοπολική σύνδεση της στρεπταβιδίνης του αντιδραστηρίου με τη βιοτίνη του δεύτερου αντισώματος. Με τον τρόπο αυτό έχουμε την έμμεση οπτικοποίηση του αντιγόνου μετά την αντίδραση της υπεροξειδάσης με το εξωγενές προστιθέμενο χρωμογόνο διαμινοβενζιδίνη και το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η διαδικασία η οποία ακολουθήθηκε είναι η εξής: Τα δείγματα των ιστών αφού μοννιμοποιήθηκαν σε φορμόλη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη στη συνέχεια κόπηκαν σε τομές 4 mm ή 8 mm και τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Στην αρχή της διαδικασίας της ανοσοιστοχημικής χρώσης, οι τομές εμβαπτίστηκαν σε πλαστικό δοχείο με διάλυμα 0,1 Μ κιτρικού οξέος ph 6,0, καλυμένο με μεμβράνη για την ελαχιστοποίηση της εξάτμισης και θερμάνθηκαν δύο φορές σε φούρνο μυκροκυμμάτων για 5 min στα 600 W με σκοπό την ανάκτηση της αντιγονικότητας (Shi et al. 1993). Στη συνέχεια, οι τομές εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα 0,3% Η2Ο2 σε μεθανόλη για 5 min με σκοπό να καταναλωθεί η δραστικότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης των ιστών. Μετά την επώαση των τομών με το πρώτο αντίσωμα για όλη τη νύχτα στους 4 o C, ακολούθησε προσθήκη του ειδικού πολυμερούς του δεύτερου αντισώματος με το σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για 30 min (DAKO, EnVision, code K5007) σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι τομές επωάστηκαν με για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου με χρωμογόνο διαμινοβενζιδίνη (DAB) για την οπτικοποίηση της αντίδρασης και ακολούθησε σύντομη έκπλυσή τους με απεσταγμένο νερό, μετάχρωση των πυρήνων με αιματοξυλίνη για 1 min σε θερμοκρασία δωματίου, αφυδάτωση και κάλυψή τους. Ως πρώτα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν το μονοκλωνικό ποντικίσιο αντίσωμα απέναντι στην SRPK1 (Clone 12/SRPK1, BD Biosciences) σε 115

αραίωση 1:50 και το μονοκλωνικό murine αντίσωμα MIB-1 απέναντι στην Ki-67 (Dako S.A., Glostrup, Denmark) σε αραίωση 1:20. Τα αντισώματα αραιώνονται σε ειδικό διάλυμα TBS (0,1 M TBS ph 7,4). Η αξιολόγηση και φωτογράφηση των δειγμάτων έγινε με μικροσκοπία φωτεινού πεδίου σε μικροσκόπιο Axiostar Zeiss με προσαρμοσμένη φωτογραφική μηχανή FujiFilm FinePix S9500. Για την διάκριση μεταξύ των γλοιακών κυττάρων και των νευρώνων όπως και των διαφορετικών νευρωνικών υποπληθυσμών χρησιμοποιήθηκαν μορφολογικά κριτήρια. Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης για την εκτίμηση της έκφρασης των πρωτεϊνών SRPK1 και Ki-67, πραγματοποιήθηκε από νευροπαθολόγους (οι οποίοι δεν είχαν λάβει γνώση της κλινικοπαθολογικής κατάστασης των ασθενών) εκτιμώντας ποσοτικά το ποσοστό των θετικών στη χρώση κυττάρων ανεξάρτητα από την ένταση του χρώματος. B.2.18. Στατιστική ανάλυση Με τον έλεγχο Kolmogorov-Smirnov ελέγχθηκε η κανονικότητα της κατανομής των πειραματικών παρατηρήσεων και τα δεδομένα δεν βρέθηκαν να ακολουθούν κανονική κατανομή. Οι συσχετίσεις μεταξύ των διαφορετικών μεταβλητών πραγματοποιήθηκε με τη μη-παραμετρική μέθοδο Spearman. Ο χρόνος επιβίωσης ορίστηκε ως το διάστημα μεταξύ της μέρας διάγνωσης μέχρι την μέρα θανάτου για τους θανόντες, ενώ για τους επιζήσαντες ασθενείς μέχρι την τελευταία παρακολούθηση. Η επιβίωση υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και συσχετίστηκε με τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Η πολυπαραγοντική ανάλυση μοντέλων παλινδρόμησης κατά Cox χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της προγνωστικής αξίας των παραγόντων. Για τον καθορισμό του τελικού μοντέλου, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της σταδιακής ένταξης των μεταβλητών (σε όλες τις περιπτώσεις τιμή του p μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική ενώ μεγαλύτερη του 0,10 εξαιρούνταν). Καταχωρήθηκαν οι ακόλουθες μεταβλητές: φύλο, ηλικία διάγνωσης, κατάσταση λειτουργικότητας δραστηριότητας σύμφωνα με την κλίμακα Karnofsky (KPS), η έκφραση της SRPK, ο δείκτης Ki-67 και η έκταση της εγχειρητικής εκτομής. Οι ROC (Receiver Operating Characteristic) καμπύλες (ή καμπύλες λειτουργικού 116

χαρακτηριστικού δέκτη) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του σημείου αποκοπής μεταξύ της έκφρασης της SRPK1 και της επιβίωσης των ασθενών. Οι δοκιμασίες ήταν αμφίπλευρες ενώ στατιστικά σημαντική θεωρήθηκε η τιμή p<0,05. B.2.19. Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Οι κυτταρικές σειρές HeLa, U87MG, T98G, U251MG και A549 διατηρούνται στην αναπτυξιακή τους φάση σε θρεπτικό υγρό DMEM, το οποίο περιέχει 10% ορό εμβρύου μοσχαριού (FΒS) και μίγμα αντιβιοτικών το οποίο αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Τα κύτταρα αυτά αναπτύσσονται σε τρυβλία πολυστυρενίου ως μονοστιβάδα (monolayer cultures), σε επωαστήρα στους 37 ο C, με ατμόσφαιρα 5% CO2 και σε κορεσμένη υγρασία (95%). Τα τρυβλία τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, τα χαρακτηριστικά τους και οι απαιτήσεις τους σε υγρό θρεπτικό υλικό καταγράφονται στον πίνακα Β.2.6. Πίνακας Β.2.6. Χαρακτηριστικά τρυβλίων. Τρυβλίο Επιφάνεια οπής Όγκος θρεπτικού υγρού 10 cm 60 cm 2 10 ml 12 οπών 4 cm 2 2 ml 24 οπών 2 cm 2 1 ml 96 οπών 0,32 cm 2 100 μl Οι κυτταροκαλλιέργειες αραιώνονταν σε τακτά χρονικά διαστήματα 3-4 ημερών, υπό ασηπτικές συνθήκες, έτσι ώστε να διατηρούνται οι πληθυσμοί σε εκθετική φάση ανάπτυξης. Πριν από τη διαδικασία της αραίωσης των κυττάρων, οι καλλιέργειες επωάζονται για περίπου 5 λεπτά με 0,5% τρυψίνη και 0,02% (τετρανατριούχο) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) έως ότου επιτευχθεί η αποκόλλησή τους από το τρυβλίο. Στη συνέχεια αραιώνονται έτσι ώστε η συγκέντρωσή τους να διατηρείται μεταξύ 5x10 4-8x10 5 κύτταρα/ml θρεπτικού υγρού. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη μέθοδο του αιματοκυτταρόμετρου (Neübauer) κάτω από μικροσκόπιο (10x) (American Optical Corp., USA) και έτσι προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. 117

B.2.20. Απομόνωση συνολικού RNA από κύτταρα Η διαδικασία ξεκινά με την συλλογή των κυττάρων η οποία πραγματοποιείται μετά από αφαίρεση του θρεπτικού υγρού από τα τρυβλία (12 οπών), αιώρηση των κυττάρων σε 1 ml διαλύματος PBS, με τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter) και φυγοκέντρηση στις 1200 rpm/min, για 2 λεπτά. Το ίζημα των κυττάρων, αφού πλυθεί μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα PBS, αναμιγνύεται με ένα διάλυμα το οποίο περιέχει 4 Μ θειοκυανική γουανιδίνη, 25 mm κιτρικό νάτριο ph 7,0, 0,5 % N-lauryl-sarcosine και 0,1 M 2-μερκαπτοαιθανόλη σε αναλογία όγκου 1:5. Στη συνέχεια, στον όγκο του εκχυλίσματος προστίθενται 1/10 του όγκου διαλύματος 2 Μ οξικού νατρίου ph 4. Ακολουθεί προσθήκη ίσου όγκου όξινης φαινόλης και 1/5 του όγκου χλωροφόρμιο. Ακολουθεί έντονη ανάδευση και παραμονή στον πάγο για 15 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση σε 8500 x g για 10 λεπτά, παραλαμβάνεται η υδατική φάση και το RNA κατακρημνίζεται με προσθήκη ίσου όγκου ισοπροπανόλης, ανάδευση και παραμονή στους -20 C. Το ίζημα το οποίο προκύπτει μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g, ξεπλένεται με 70% αιθανόλη και επαναιωρείται σε 50 μl ddh2o-ελεύθερου από ριβονουκλεάσες. Το δείγμα, αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωση του RNA η οποία περιέχει, φυλάσσεται στους -70 C. B.2.21. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) Η τεχνική της PCR χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, με συνέπεια αυτή να γίνεται ανιχνεύσιμη και έμμεσα να διαπιστώνεται η ύπαρξη ή μη ενός γονιδίου. Κατά τον ίδιο τρόπο μπορούμε να ανιχνεύσουμε την ύπαρξη όχι του ίδιου του γονιδίου αλλά του μεταγράφου το οποίο προκύπτει από αυτό, δηλαδή του αντίστοιχου mrna. Αυτό επιτυγχάνεται με την τεχνική της RT-PCR, η οποία είναι στην ουσία μία PCR με ένα προγενέστερο επιπλέον βήμα, αυτό της αντίστροφης μεταγραφής του mrna σε cdna. Πιο συγκεκριμένα, αφού απομονωθεί το συνολικό RNA από το προς μελέτη βιολογικό υλικό, αντιγράφεται παλίνδρομα το mrna με τη βοήθεια του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης (τρανσκριπτάσης), και έτσι δημιουργείται το συμπληρωματικό προς αυτό cdna. Το τμήμα αυτό του DNA μπορεί στη συνέχεια να πολλαπλασιαστεί με PCR, το προϊόν της οποίας 118

θα είναι στο τέλος ανιχνεύσιμο και θα μας πληροφορεί έμμεσα αν υπάρχει ή όχι έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου, στο προς εξέταση βιολογικό υλικό. Στη συγκεκριμένη εργασία, οι αντιδράσεις της RT έγιναν με βάση τις οδηγίες του kit της αντίστροφης μεταγραφάσης M-MLV RT της εταιρείας Invitrogen, ενώ ακολούθησε PCR χρησιμοποιώντας την Taq DNA πολυμεράση της εταιρείας Finnzymes OY. Η διαδικασία η οποία ακολουθήθηκε περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Αποδιάταξη του RNA Σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου (ελεύθερου νουκλεασών) προστέθηκαν τα εξής συστατικά: Πίνακας Β.2.7. Συστατικά μίγματος για την αποδιάταξη του RNA. Συστατικά τυχαίοι εκκινητές (random primers) συνολικό RNA μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) ddh2o Συγκέντρωση 100 ng 1 μg 1 μl (10 mm το καθένα) έως 12 μl Ακολούθησε αποδιάταξη του RNA στους 65 o C για 5 λεπτά και άμεση μεταφορά του στους 4 o C. Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης Το στάδιο αυτό, περιλαμβάνει την προσθήκη στο μίγμα του πρώτου σταδίου των παρακάτω συστατικών: Πίνακας Β.2.8. Συστατικά μίγματος για την αντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης. Συστατικά ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφάσης Συγκέντρωση 4 μl DTT 2 μl (0,1 M) RNase OUT (αναστολέας ριβονουκλεασών) αντίστροφη τρανσκριπτάση M-MLV 1 μl 1 μl (200 units) Μετά την προσθήκη της αντίστροφης μεταγραφάσης M-MLV, ακολουθεί επώαση για 10 λεπτά στους 25 o C, για 50 λεπτά στους 37 o C και απενεργοποίηση της αντίδρασης με θέρμανση στους 70 o C για 15 λεπτά. 119

Ενίσχυση με PCR Το ολικό cdna το οποίο προέκυψε χρησιμοποιήθηκε για τον πολλαπλασιασμό του τμήματος το οποίο μας ενδιαφέρει, με χρήση ειδικών εκκινητών. Συγκεκριμένα, στην παρούσα εργασία εφαρμόστηκε η μέθοδος RT-PCR για τον ποιοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του mrna του μινιγονιδίου της ινσουλίνης, το οποίο ήταν κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα psvirb όπως επίσης και τα τους πλασμιδιακούς φορείς των μίνι γονιδίων αναφοράς psrp20 και psmn2. Επίσης η RT-PCR εφαρμόστηκε για τον ποιοτικό προσδιορισμό της έκφρασης της ενδογενούς SRPK1 και της ακτίνης κάτω από διάφορες συνθήκες. Για την ενίσχυση των προαναφερθέντων γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές: Πίνακας Β.2.9. Νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών για την ενίσχυση των γονιδίων της ινσουλίνης, του SRp20, του SMN2, της SRPK1 και της ακτίνης. Ονομασία εκκινητή INS1 (sense) INS3 (antisense) psrp20 (sense) psrp20 (antisense) psmn2 (sense) psmn2 (antisense) SRPK1 (sense) SRPK1 (antisense) actin (sense) actin (antisense Αλληλουχία 5 -CAGCTACAGTCGGAAACCATCAGCAAGCAG-3 5 -CACCTCCAGTGCCAAGGTCTGAAGGTCACC-3 5 -TAATACGACTCACTATAGGG-3 5 -CCTGGTCGACACTCTAGATTTCCTTTCATTTGACC-3 5 -GGTGTCCACTCCCAGTTCAA-3 5 -GCCTCACCACCGTGCTGG-3 5 -CGGGAATTCTATGGAGCGGAAAGTGCTTGCG-3 5 -GAATAATTTTTTTGACACCAGGCAGTGGAAGCCCCTG-3 5 -GTGGGGCGCCCCAGGCACCAG-3 5 -CTCCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3 Τα συστατικά του μίγματος καθώς και οι συνθήκες της PCR η οποία ακολούθησε παρατίθενται στους πίνακες: 120

Πίνακας Β.2.10. Συστατικά μίγματος της αντίδρασης PCR. Συστατικά Συγκέντρωση cdna εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (sense) Εκκινητής αντινοηματικός (antisense) Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10 x Πολυμεράση (Taq) H20 1 μl 20 pmol 20 pmol 200 μμ 5 μl 0,65 μl Έως 50 μl Πίνακας Β.2.11. Συνθήκες της αντίδρασης PCR για την ενίσχυση της SRPK1 και της ακτίνης. # Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος Αριθμός κύκλων 1 Αρχική αποδιάταξη 95 o C 2 min 1 2 Αποδιάταξη 95 o C 40 s 3 Υβριδισμός 66 o C (SRPK1) 40 s 27 60 o C (ακτίνη) 4 Επιμήκυνση 72 o C 60 s 5 Τελική επιμήκυνση 72 o C 5 min 1 Πίνακας Β.2.12. Συνθήκες της αντίδρασης PCR για την ενίσχυση των μίνι γονιδίων. # Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος Αριθμός κύκλων 1 Αρχική αποδιάταξη 94 o C 2 min 1 2 Αποδιάταξη 94 o C 40 s 60 o C (psvirb) 3 Υβριδισμός 60 o C (psmn2) 55 o C (SRp20) 40 s 30 4 Επιμήκυνση 72 o C 60 s 5 Τελική επιμήκυνση 72 o C 5 min 1 B.2.22. Αναστολή της έκφρασης της SRPK1 με shrnas Για την επίτευξη των σκοπών της παρούσας εργασίας, οι γλοιωματικές κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν παροδικά, χρησιμοποιώντας το kit XfectTM Transfection Reagent, με τέσσερις πλασμιδιακούς φορείς (shrnas), οι οποίοι στοχεύουν στο μόριο της SRPK1. Τα πλασμίδια αυτά προμηθεύτηκαν από την 121

εταιρία GeneCopoeia και είναι τα εξής: HSH017724-1-CU6 (OS214865), HSH017724-2-CU6 (OS214866), HSH017724-3-CU6 (OS214867), and HSH017724-4-CU6 (OS214868). Οι ονομασίες καταλόγου αντικαθίστανται στο εξής από τις ονομασίες copo-1, copo-2, copo-3, και copo-4 αντίστοιχα. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε ως πλασμίδιο ελέγχου το scramble shrna (scr), το οποίο δε στοχεύει στην SRPK1. Μετά την προμήθεια των πλασμιδίων από την εταιρία και τον πολλαπλασιασμό, την απομόνωση και τον καθαρισμό τους, ακολούθησε αναλυτικός έλεγχος της αποτελεσματικότητάς τους απέναντι στην SRPK1 σε διάφορες συνθήκες. Το πλασμίδιο copo-4 ήταν αυτό το οποίο έδινε τα υψηλότερα επίπεδα αναστολής της έκφρασης της κινάσης στις τέσσερις γλοιωματικές σειρές και για αυτόν τον λόγο επιλέχθηκε το συγκεκριμένο στη συνέχεια όλων των πειραμάτων (Σχήμα Β.2.1). Σχήμα Β.2.1. Πληροφορίες πλασμιδιακού φορέα HSH017724-4-CU6 (copo-4) της εταιρίας GeneCopoeia. Η αλληλουχία στόχος στο μόριο της SRPK1 είναι η - gaagcgaatgcaggaaatt- Ο συγκεκριμένος πλασμιδιακός φορέας προσφέρει αντίσταση στο αντιβιοτικό πουρομυκίνη. Έτσι, η επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο πραγματοποιούνταν κάθε φορά 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, με προσθήκη 0,8 μg / ml πουρομυκίνης (κύτταρα U87MG και U251MG) ή 0,6 μg / ml (κύτταρα Τ98G) σε φρέσκο μέσο ανάπτυξης. 122

B.2.23. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη χρήση του kit Xfect TM Transfection Reagent της εταιρείας Clontech Για την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa, U87MG, T98G και U251MG χρησιμοποιήθηκε το kit XfectTM Transfection Reagent της εταιρείας Clontech (Clontech Laboratories, Inc. A takara Bio Company, CA, USA). Το kit αυτό είναι λιπιδικής φύσεως και επάγει υψηλά επίπεδα επιμόλυνσης στους συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους. Με σκοπό την αναστολή της έκφρασης της SRPK1, οι τρείς γλοιωματικές σειρές U87MG, T98G και U251MG επιμολύνθηκαν παροδικά με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 και το αντίστοιχο πλασμίδιο αναφοράς scr. Για την υπερέκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με το επίτοπο FLAG της SRPK1 αλλά και των μεταλλαγμάτων της, HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2-srpk1, pflag- CMV-2-SRPK1-Δspacer, pflag-cmv-2-srpk1-326a, pflag-cmv-2- SRPK1-408A, pflag-cmv-2-srpk1-326/408a, pflag-cmv-2-srpk1-326d, pflag-cmv-2-srpk1-408d, pflag-cmv-2-srpk1-326/408d, pflag-cmv-2-srpk1-329r και pflag-cmv-2-srpk1-377d με το kit XfectTM Transfection Reagent με σκοπό είτε τον έλεγχο έκφρασής τους, είτε διάφορες δοκιμές ανοσοφθορισμού. Για τις δοκιμές in vivo ιδιοσύστατου και του εναλλακτικού ματίσματος, HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το kit με τους πλασμιδιακούς φορείς των μίνι γονιδίων αναφοράς psvirb, psrp20 και psmn2. Μια ημέρα πριν την παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα τοποθετούνται σε οπές τρυβλίου 12, 24 ή 96 οπών σε αντίστοιχες συγκεντρώσεις, έτσι ώστε την ημέρα της επιμόλυνσης να καταλαμβάνουν περίπου το 50-60% της επιφάνειας της οπής. Την ημέρα της επιμόλυνσης τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με διάλυμα PBS και στη συνέχεια προστέθηκε ανάλογα με το μέγεθος της οπής του τρυβλίου και ο αντίστοιχος όγκος θρεπτικού υγρού DMEM απουσία FBS όπως φαίνεται αναλυτικά στον πίνακα Β.2.13. 123

Πίνακας Β.2.13. Συνθήκες παροδικής επιμόλυνσης ευκαρυωτικών κυττάρων με το kit Xfect TM Transfection Reagent* Κυτταρική σειρά Πειραματικός στόχος Αριθμός κυττάρων/ οπή Οπές τρυβλίου Πλασμίδιο DMEM χωρίς ορό Ποσότητα πλασμιδίου Τελικός όγκος συμπλόκου DNAλιπιδίου U87 πρωτεϊνικά εκχυλίσματα 10 5 12 scr/copo-4 500 μl 1 μg 100 μl T98 πρωτεϊνικά εκχυλίσματα 10 5 12 scr/copo-4 500 μl 1 μg 100 μl U251 πρωτεϊνικά εκχυλίσματα 10 5 12 scr/copo-4 500 μl 1 μg 100 μl U87 ΜΤΤ 7 x 10 3 96 scr/copo-4 30 μl 7 ng 7 μl T98 ΜΤΤ 7 x 10 3 96 scr/copo-4 30 μl 7 ng 7 μl U251 ΜΤΤ 7 x 10 3 96 scr/copo-4 30 μl 7 ng 7 μl HeLa πρωτεϊνικά 2 x 10 εκχυλίσματα 0,5 μg ή 1 μg 12 SRPK1* 500 μl ή 1,5 μg 100 μl HeLa in vivo μάτισμα 2 x 10 4 12 psvirb 500 μl 1 μg 100 μl HeLa in vivo μάτισμα 2 x 10 4 12 psrp20 500 μl 0,5 μg 100 μl HeLa in vivo μάτισμα 2 x 10 4 12 psmn2 500 μl 0,5 μg 100 μl HeLa in vivo μάτισμα 2 x 10 4 12 HeLa in vivo μάτισμα 2 x 10 4 12 HeLa in vivo μάτισμα 2 x 10 4 12 psvirb + SRPK1 psrp20 + SRPK1 psmn2 + SRPK1 500 μl 500 μl 500 μl 1 μg + 0,5 ή 1 ή 1,5 μg 0,5 μg + 0,5 ή 1 ή 1,5 μg 0,5 μg + 0,5 ή 1 ή 1,5 μg HeLa IF 4 x 10 4 24 SRPK1 250 μl 1 μg 50 μl HeLa IF 4 x 10 4 24 SRPK1-Δspacer 250 μl 1 μg 50 μl 100 μl 100 μl 100 μl HeLa IF 4 x 10 4 24 SRPK1-326A SRPK1-408A SRPK1-326/408Α 250 μl 1 μg 50 μl HeLa IF 4 x 10 4 24 SRPK1-326D SRPK1-408D SRPK1-326/408D 250 μl 1 μg 50 μl HeLa IF 4 x 10 4 24 SRPK1-329R SRPK1-377R 250 μl 1 μg 50 μl HeLa πρωτεϊνικά εκχυλίσματα 7 x 10 4 12 SRPK1-329R SRPK1-377R 500 μl 2,5 μg 100 μl *Κάποια πλασμίδια αναγράφονται ελλειπτικά. Η SRPK1 και τα μεταλλάγματά της είναι κλωνοποιημένα στον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2. 124

Σε όλες τις περιπτώσεις επιμόλυνσης, τα κύτταρα επωάζονται στους 37 C με 5% CO2, όσο προετοιμάζεται το σύμπλοκο DNA-λιπιδίου. Η διαδικασία ορίζει ότι στον μισό όγκο της αντίδρασης διαλύεται το πλασμιδιακό DNA στο ειδικό διάλυμα της Clontech (Xfect reaction buffer) ενώ στον άλλο μισό όγκο αναμιγνύεται το λιπίδιο (Xfect polymer) με το διάλυμα Xfect reaction buffer και στη συνέχεια ενώνονται τα δύο διαλύματα για να δημιουργηθεί το σύμπλοκο DNA-λιπιδίου. Στον πίνακα B.1.2 αναγράφονται οι προστιθέμενες ποσότητες του λιπιδίου για κάθε περίπτωση όπως και ο τελικός όγκος της αντίδρασης. Η γενική αρχή η οποία ακολουθήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις είναι ότι χρησιμοποιούνται 0,3 μl λιπιδίου για κάθε 1 μg DNA το οποίο εμπεριέχεται στον τελικό όγκο της αντίδρασης. Ακολουθεί ήπια ανάδευση ίσου όγκου των δύο διαλυμάτων DNA και λιπιδίου και επώαση για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου προς σχηματισμό του συμπλόκου DNA-λιπιδίου. Με το πέρας των 10 min προστίθεται σε κάθε οπή ο αντίστοιχος όγκος του συμπλόκου. Ύστερα από 4 ώρες αφαιρείται το αρχικό θρεπτικό υλικό το οποίο περιέχει το σύμπλοκο DNA-λιπιδίου και προστίθεται φρέσκο θρεπτικό υγρό DMEM (με 10% FBS) όγκου ανάλογου των απαιτήσεων του κάθε τρυβλίου. Τα κύτταρα επωάζονται για διάφορα χρονικά διαστήματα ανάλογα με το σκοπό του κάθε πειράματος. B.2.24. Παρασκευή εκχυλισμάτων από ευκαρυωτικά καρκινικά κύτταρα Tα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αφαίρεση του θρεπτικού υγρού από τα τρυβλία των 12 οπών και πλύση τους με διάλυμα PBS, ph 7,4 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na2HPO4, 0,2 gr/l KH2PO4, σε ddh2o).στη συνέχεια ακολούθησε η λύση τους με προσθήκη 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7,5, 150 mm NaCl και 1 mm PMSF) και με τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter). Ο όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης είναι τόσος ώστε να είναι ικανός να λύσει ικανοποιητικά τα κύτταρα αλλά δεν είναι αυστηρά προσδιορισμένος καθώς ακολουθούν πάντα διαδικασίες προσδιορισμού της συνολικής πρωτεΐνης στο διάλυμα. Τα αιωρημένα κύτταρα παρέμειναν για 10 λεπτά στον πάγο, στο διάλυμα λύσης και κατόπιν διαβιβάστηκαν μέσα από σύριγγα ινσουλίνης (1 ml), ώστε να σπάσει κατά το δυνατόν το μακρομοριακό DNA. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 12000 x g, για 125

15 λεπτά στους 4 C και συλλογή του υπερκείμενου. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυλάσσεται στους -80 C. B.2.25. Φωτομετρικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με την μέθοδο Bradford Η χρωστική Coomassie brilliant blue G-250 σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 495nm. Έχει την ικανότητα να δεσμεύεται με πρωτεΐνες σε αραιά όξινα διαλύματα όπου το σύμπλοκο δείκτη πρωτεΐνης απορροφά στα 595nm. Το αντιδραστήριο το οποίο χρησιμοποιείται παρασκευάζεται διαλύοντας 100mg της χρωστικής σε 50ml αιθανόλης 95%. Στη συνέχεια προστίθενται 100ml πυκνού φωσφορικού οξέος και συμπληρώνεται με απιονισμένο νερό μέχρι τον όγκο των 200ml. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της συνολικής πρωτεΐνης ενός διαλύματος αραιώνεται το πυκνό διάλυμα της βαφής με απιονισμένο νερό σε αναλογία 1:4, προστίθενται 2μl από το δείγμα και μετριέται η απορρόφηση του διαλύματος στα 595nm. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, προσδιορίζεται από την πρότυπη καμπύλη αναφοράς η οποία έχει υπολογιστεί με τη χρήση αλβουμίνης ορού βοδινού (BSA). B.2.26. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Η μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών ενός δείγματος με ηλεκτροφόρηση στηρίζεται στο γεγονός ότι οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα (v) των πρωτεϊνών στο πήκτωμα εξαρτάται από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο (q) της πρωτεΐνης σύμφωνα με την εξίσωση: v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από την μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH2=CH-CO-NH2) και του Ν,Ν 126

μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bis-ακρυλαμιδίου (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO- CH-CH2) το οποίο συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα το οποίο διαθέτει πόρους, το μέγεθος των οποίων εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού. Ο τελευταίος είναι ανάλογος με την συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών. Για την έναρξη του μηχανισμού προστίθεται στο διάλυμα υπερθειϊκό αμμώνιο (NH4)2S2O8 ενώ για την διάδοσή του προστίθεται ο φωτοχημικός καταλύτης τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED). Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στην συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, το πήκτωμα επιστοίβαξης το οποίο είναι υπεύθυνο για την συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωμα διαχωρισμού το οποίο είναι υπεύθυνο για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώματα είναι διαφορετικά ως προς το ph και την σύσταση τους. Επίσης το ρυθμιστικό διάλυμα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούμενα (Andrews 1981). Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS. Απουσία τέτοιων παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Στην παρούσα εργασία ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών έγινε με ασυνεχή ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες έτσι ώστε οι πρωτεΐνες να αναλύονται μόνο με βάση το μοριακό τους βάρος. Ως αποδιατακτικό μέσο χρησιμοποιείται το μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS) το οποίο έχει την ιδιότητα να αποδιατάσει τις πρωτεΐνες και να δεσμεύεται πάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, ανεξάρτητα της ιοντικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1,4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα τα οποία σχηματίζονται είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν 127

καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους τους (Laemmli 1970). Για τον διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων κατά την διάρκεια της εργασίας κατασκευάζεται διάταξη η οποία αποτελείται από το πήκτωμα διαχωρισμού, ύψους 7,5 cm και πάχους 1,5 mm και το πήκτωμα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωμα διαχωρισμού. Οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με την βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος επιστοίβαξης δημιουργώντας τα ανάλογα κενά. Η σύσταση των επιμέρους στοιχείων του συστήματος καταγράφονται στον πίνακα Β.2.14. Πίνακας Β.2.14. Συστατικά των επιμέρους στοιχείων ηλεκτροφόρησης. Διάλυμα δοχείων ηλεκτροφόρησης Πήκτωμα επιστοίβαξης Για τον πολυμερισμό Πήκτωμα διαχωρισμού Για τον πολυμερισμό Συστατικά Συγκέντρωση Tris-Cl ph 8,9 25 mm γλυκίνη 0,19 M SDS 0,1% ακρυλαμίδιο 5% bis-ακρυλαμίδιο 0,25% SDS 0,5% Tris-Cl ph 6,8 0,125 Μ APS 0,08% TEMED 0,04% ακρυλαμίδιο 12% bis-ακρυλαμίδιο 0,62% SDS 0,5% Tris-Cl ph 8,9 0,375 Μ APS 0,08% TEMED 0,04% Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων τα συστατικά του οποίου καταγράφονται στον πίνακα Β.2.15. 128

Πίνακας Β.2.15. Συστατικά διαλύματος διαλυτοποίησης δειγμάτων. Διάλυμα διαλυτοποίησης δειγμάτων Συστατικά Συγκέντρωση γλυκερόλη 10% DTT SDS 2% Tris-Cl ph 6,8 100 mm 0,0625 Μ κυανού της βρωμοφαινόλης 0,02% Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 μl του διαλύματος αυτού σε 25 μl του μίγματος επώασης. Τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDS-πρωτεΐνης. To DTT (διθειοθρειτόλη) το οποίο χρησιμοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς οι οποίοι υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υπομονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος 30 ma έως τη στιγμή την οποία ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. B.2.27. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western blot) Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, οι οποίες βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, λόγω της εφαρμογής διαφοράς δυναμικού και στην καθήλωσή τους στο πλέγμα της μεμβράνης (Gershoni and Palade 1983). Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η μεμβράνη και η πηκτή μεταφέρονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) του οποίου η σύνθεση εξαρτάται από τη συσκευή και τις συνθήκες της ηλεκτρομεταφοράς. Η τοποθέτηση τους στην συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε έξι χαρτιά Whatman 3 mm με την μεμβράνη προσανατολισμένη στον θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων οι οποίες παρεμποδίζουν την διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Η συσκευή η οποία χρησιμοποιήθηκε ήταν το Semi-Dry Blotter της εταιρίας Scie-Plas. Το 129

Transfer Buffer αποτελείται από 12,5 mm Tris-Βορικό ph 8,5, 0,02% SDS και 0,5 mm DTT. Η μεταφορά γίνεται για 1 ώρα κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος (30-120 ma, ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής και το μοριακό βάρος της υπό ανίχνευση πρωτεΐνης). B.2.28. Ανοσοανίχνευση Την διαδικασία της ηλεκτρομεταφοράς ακολουθεί η ανοσοανίχνευση η οποία είναι μια τεχνική εντόπισης μιας καθηλωμένης σε μεμβράνη πρωτεΐνης με την βοήθεια αντισώματος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσμευθεί με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση, καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου (Harlow and Lane 1988). Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρμόσθηκε για την εντόπιση της ενδογενούς SRPK1 και της GAPDH με τα αντίστοιχα μονοκλωνικά αντισώματα anti-srpk1 (σε αραίωση 1:1500) και anti-gapdh (σε αραίωση 1:2000) σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των γλοιωματικών κυτταρικών σειρών και κυττάρων HeLa. Επίσης έγινε ανοσοανίχνευση της υπερεκφρασμένης FLAG- SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της σε εκχυλίσματα κυττάρων HeLa τα οποία είχαν επιμολυνθεί με τους αντίστοιχους πλασμιδιακούς φορείς με μονοκλωνικό αντίσωμα anti-flag (M5) απέναντι στο επίτοπο FLAG (σε αραίωση 1:15000). Σε όλες τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε ως δεύτερο αντίσωμα το goat-antimouse (σε αραίωση 1:2000) το οποίο είναι συζευγμένο με την αλκαλική φωσφατάση. Η διαδικασία η οποία εφαρμόζεται έχει ως εξής: Μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης εμβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 ώρα σε διάλυμα κορεσμού το οποίο αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na2HPO4, 0,2 gr/l KH2PO4), με σκοπό να κορεστεί από την ζελατίνη και να αποφευχθούν μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις της μεμβράνης με το εκάστοτε αντίσωμα. Κατόπιν η 130

μεμβράνη επωάζεται με το αντίστοιχο αντίσωμα αραιωμένο κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις της μεμβράνης των 10 λεπτών με διάλυμα PBS το οποίο περιέχει 0,04% Tween-20 και επώασή της για 1 ώρα, υπό ανάδευση, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το δεύτερο αντίσωμα αραιωμένο κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού. Αφού γίνουν δύο πλύσεις της μεμβράνης των 10 λεπτών με PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση, έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromo-chloro-indolyl phosphate) και 30 μl NBT (Nitro blue tetrazolium) σε 10 ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-Cl ph 9,5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl2) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddh2o φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddh2o το οποίο περιέχει και NaN3. B.2.29. Έμμεσος ανοσοφθορισμός Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός έγινε σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα (Maison, Horstmann, and Georgatos 1993; Meier and Georgatos 1994). Τα κύτταρα τοποθετούνται σε καλυπτρίδες μέσα σε τρυβλίο 24 οπών με σκοπό να προσκολληθούν πάνω σε αυτές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους και ακολουθεί η εκάστοτε πειραματική διαδικασία σε αυτά όπως παροδική επιμόλυνση ή επίδραση διαφόρων ουσιών. Η πειραματική διαδικασία έχει ως εξής: Τα κύτταρα πλένονται δύο φορές με PBS και μονιμοποιούνται με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 20 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. σε ειδικές περιπτώσεις δοκιμάστηκε μονιμοποίηση με συγκεντρώσεις φορμαλδεΰδης 1%, 2% και 3% σε PBS για 5 min. Η εξουδετέρωση των καταλοίπων της παραφορμαλδεΰδης ή της φορμαλδεΰδης γίνεται με 100 mm Tris-Cl ph 7,5 σε PBS. Η διαπερατότητα των κυττάρων επιτυγχάνεται με επώασή τους σε permeabilization buffer (150 mm NaCl, 100 mm Tris-Cl ph 7,5, 2 mm MgCl2, 0,2% Triton X-100, 0,5% FSG και 0,5 mm PMSF), για 12 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η FSG (fish skin gelatin) χρησιμοποιείται για να αποτραπεί η μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων. Ακολουθεί επώαση με το πρώτο αντίσωμα για 1 h σε 131

θερμοκρασία περιβάλλοντος, 3 διαδοχικές πλύσεις με blocking buffer (150 mm NaCl, 100 mm Tris-Cl ph 7,5, 2 mm MgCl2, 0,5% FSG και 0,5 mm PMSF) και επώαση με το δεύτερο αντίσωμα για 45 min, επίσης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Χρώση του DNA γίνεται με 1 mg/ml ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodide), αφού έχει προηγηθεί επώαση με 0,2 u/μl RNase ή με DAPI 1:20000. Στην περιπτωση της χρώσης με DAPI δεν απαιτείται επώαση με RNase και το στάδιο αυτό παραλείπεται. Οι καλυπτρίδες πλένονται στο τέλος 3 φορές με PBS και τοποθετούνται πάνω σε αντικειμενοφόρους πλάκες με 90% γλυκερόλη. Τέλος, η μελέτη των δειγμάτων, καθώς και η λήψη φωτογραφιών, έγινε στο συνεστιακό μικροσκόπιο Nikon, με χρήση του λογισμικού EZ-C1 3.20, στο εργαστήριο Ανατομίας και Ιστολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. ή στο συνεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM 780, με χρήση του λογισμικού Zen 2011 στον Τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ. Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αραιωμένα σε blocking buffer. Χρησιμοποιήθηκαν ως πρώτα αντισώματα το μονοκλωνικό anti-srpk1 σε αραίωση 1:150, το anti-flag σε αραίωση 1:1500 και το μονοκλωνικό antiγh2ax σε αραίωση 1:200 ενώ ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Αlexa 48 anti-mouse, σε αραίωση 1:400 (πράσινο χρώμα). B.2.30. Χρωματομετρική μέθοδος ΜΤΤ Η χρωματομετρική μέθοδος ΜΤΤ αποτελεί μια μέθοδο μέτρησης της ικανότητας ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η μέθοδος στηρίζεται στην αναγωγή των υδατοδιαλυτών αλάτων τετραζολίου MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) σε αδιάλυτους πορφυρούς κρυστάλλους φορμαζάνης, από τα μεταβολικώς ενεργά κύτταρα (Mosmann 1983). Υπεύθυνο για την αναγωγή είναι το μιτοχονδριακό ένζυμο, ηλεκτρική αφυδρογονάση. Μετά την διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορμαζάνης με προσθήκη απορρυπαντικού προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά (οπτική απορρόφηση) η έκταση της αντίδρασης. Η παραγωγή κρυστάλλων φορμαζάνης είναι απευθείας ανάλογη του αριθμού ζωντανών κυττάρων. 132

Τα προς εξέταση κύτταρα τοποθετούνται σε οπές τρυβλίου 96 οπών και επωάζονται υπό διάφορες συνθήκες, στους 37 o C και σε ατμόσφαιρα 5% σε CO2. Την ημέρα της μέτρησης αντικαθιστούμε το θρεπτικό υλικό με φρέσκο (100µl) στο οποίο έχουν προστεθεί 10µl από ΜΤΤ συγκέντρωσης 12 mm. Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 C για 4 ώρες και στη συνέχεια προστίθενται σε κάθε οπή 100 µl από διάλυμα απορρυπαντικού 10% SDS 0,01Ν HCl (detergend). Στη συνέχεια το τρυβλίο τοποθετείται στον επωαστήρα για 4-16 ώρες σε σκοτεινό μέρος και μετά το πέρας αυτών των ωρών μετριέται η οπτική απορρόφηση στα 570nm χρησιμοποιώντας φωτόμετρο για ELISA (micro ELISA reader, Biotek Instruments Inc., USA). Η βιωσιμότητα των εκάστοτε κυττάρων δίνεται ως λόγος (%) της μεταβολικής δράσης των κυττάρων υπό την επήρεια διαφόρων συνθηκών σε σχέση με τη μεταβολική δράση της αντίστοιχης καλλιέργειας ελέγχου. Ακόμη, ως τυφλό διάλυμα θεωρείται αυτό το οποίο περιέχει όλα τα άλλα συστατικά πλην των κυττάρων. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Για το συγκεκριμένο πείραμα τα Τ98G, U251MG, U87MG, A549 και HeLa κύτταρα τοποθετήθηκαν σε οπές τρυβλίου 96 οπών έτσι ώστε σε κάθε οπή να υπάρχουν 10.000 κύτταρα και επωάστηκαν, στους 37 o C και σε ατμόσφαιρα 5% σε CO2 για 24 ώρες. Στη συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα η προς εξέταση ουσία και συνεχίστηκε η επώασή τους για το εκάστοτε επιθυμητό διάστημα μέχρι τη στιγμή της μέτρησης. Στην περίπτωση των γλοιωματικών σειρών θελήσαμε να διερευνήσουμε την επίπτωση της συνδυαστικής επίδρασης κυτταροτοξικών ουσιών με την αναστολή της έκφρασης της SRPK1. Για το σκοπό αυτό τα κύτταρα πρώτα επιμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 ή το scr όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. και 24 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες με πουρομυκίνη σε συγκέντρωση 0,8 μg / ml για τα U87MG και U251MG κύτταρα και 0,6 μg / ml για τα Τ98G κύτταρα. Μετα την επιλογή των κυττάρων τα οποία έχουν λάβει τον πλασμιδιακό φορέα με το αντιβιοτικό ακολούθησε περαιτέρω επώαση για 48 ώρες με τις κυτταροτοξικές ουσίες και μέτρηση των αποτελεσμάτων με ΜΤΤ. 133

B.2.31. Δοκιμή in vivo ματίσματος (In vivo splicing assay) Οι δοκιμές in vivo ματίσματος οι οποίες πραγματοποιήθηκαν, βασίζονται στην επίδραση της προσθήκης αυξανόμενων ποσοτήτων ενός πλασμιδιακού φορέα ο οποίος εκφράζει κάποιον παράγοντα σχετικό με το μάτισμα (SRPK1) ή μίας ουσίας (λυναμικίνη D), στο μάτισμα μιας συγκεκριμένης ποσότητας ενός μίνιγονιδίου αναφοράς. Η δοκιμή in vivo ματίσματος πραγματοποιήθηκε στην κυτταρική σειρά HeLa ως εξής: Μια ημέρα πριν την παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα μετρήθηκαν ώστε να έχουν συγκέντρωση 2x10 4 κύτταρα/οπή σε πιάτο 12 οπών. Την επόμενη ημέρα τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς psvirb ή psrp20 ή psmn2 με χρήση του kit Xfect Transfection Reagent (Clontech Laboratories Inc.) όπως περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.23. και 4 ώρες μετά προστέθηκαν αυξανόμενες ποσότητες λυναμικίνης D (0-30 μμ) σε 2 ml φρέσκου θρεπτικού υλικού DMEM. Για τον έλεγχο της επίδρασης της SRPK1 στο in vivo μάτισμα, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τους πλασμιδιακούς φορείς psvirb ή psrp20 ή psmn2 μαζί με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδιακού φορέα pflag-cmv-2-srpk1 (0,5, 1, και 1,5 μg) ο οποίος υπερεκφράζει την FLAG-SRPK1. Ως δείγμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το κενό πλασμίδιο pflag-cmv-2. Στην περίπτωση προσθήκης του SRPIN340, αυτή πραγματοποιήθηκε συγχρόνως με την προσθήκη της λυναμικίνης D κατά την προσθήκη του φρέσκου θρεπτικού υλικού DMEM 4 ώρες μετά την επιμόλυνση. Σε κάθε περίπτωση, μετά από 24 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση, συλλέχθηκε το συνολικό RNA και ακολούθησε RT-PCR σύμφωνα με τις παραγράφους Β.2.20 και Β.2.21 αντίστοιχα με κατάλληλους εκκινητές σχεδιασμένους να ενισχύουν τα δύο διαφορετικά προϊόντα ματίσματος. B.2.32. Λογισμικά Τα λογισμικά τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν τα εξής: Η πυκνομετρία των ζωνών έγινε με το πρόγραμμα Image J. Η επεξεργασία των εικόνων και ο τελικός τους σχεδιασμός και διευθέτηση, 134

πραγματοποιήθηκαν με τα πρόγραμμα Adobe Photoshop και Adobe Illustrator, αντίστοιχα. Η επεξεργασία κειμένου και η ανάλυση δεδομένων έγιναν με τα προγράμματα του Office, Microsoft Word και Microsoft Excel, αντίστοιχα. Τέλος, η μελέτη των δειγμάτων και η λήψη φωτογραφιών, μετά τη διαδικασία του έμμεσου ανοσοφθορισμού, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού EZ-C1 3.20 και Zen 2011. 135

136

Γ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Μελέτη της κατανομής της SRPK1 στο φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο και σε ιστούς με γλοιοβλάστωμα. Συσχέτιση των επιπέδων έκφρασής της με τη βιωσιμότητα γλοιωματικών κυτταρικών σειρών και με την ευαισθησία τους σε χημειοθεραπευτικά Η έκφραση της SRPK1 ποικίλει στα διάφορα είδη καρκίνου. Σκοπό της παρούσας ενότητας πειραμάτων αποτέλεσε η μελέτη του ρόλου της SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα. Αρχικά ελέγχθηκε η έκφρασή της στο επίπεδο του ιστού αλλά και σε καρκινικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος ενώ στη συνέχεια εξετάστηκε η επιρροή της στην ανταπόκριση των κυττάρων αυτών σε διάφορα χημειοθεραπευτικά. Γ.1.1. Ανοσοϊστοχημική μελέτη της κατανομής της SRPK1 στο φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο Για τη μελέτη της έκφρασης της SRPK1 στο φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο, εξετάστηκαν δείγματα από πέντε διαφορετικά περιστατικά, ανθρώπων (3 άνδρες και 2 γυναίκες με εύρος ηλικιών από 51 μέχρι 86 χρόνια) οι οποίοι απεβίωσαν είτε από έμφραγμα του μυοκαρδίου είτε από πνευμονία (βλ. παράγραφο Β.2.16). Το υλικό το οποίο χρησιμοποιήθηκε προέρχεται από το εργαστήριο Ιατροδικαστικής του Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Συλλέχθηκαν ιστοτεμάχια σε στεφανιαίες τομές προερχόμενα από περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού, το νεοραβδωτό, τον υποθάλαμο, τον ιππόκαμπο και τα παρεγκεφαλιδικά ημισφαίρια. Η έκφραση της SRPK1 αξιολογήθηκε ανοσοϊστοχημικά χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην ανθρώπινη SRPK1 (BD Biosciences) σε αραίωση 1:50 όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.17. Το μοτίβο της ανοσοαντίδρασης στην SRPK1 ήταν παρόμοιο και στις πέντε εξεταζόμενες περιπτώσεις εγκεφάλου. Η ένταση της ανοσοϊστοχημικής 137

απόκρισης έδειξε ήπια διαφοροποίηση, με έναν από τους πέντε εγκέφαλους να επιδεικνύει μια ασθενέστερη ανοσοδραστικότητα σε όλες τις περιοχές του εγκεφάλου. Όπως είναι εμφανές σε όλες τις επιμέρους εικόνες του Σχήματος Γ.1, η SRPK1 εκφράζεται στα νευρωνικά κύτταρα χωρίς να εκφράζεται στη γλοία, ενώ είναι πλήρως απούσα από τη λευκή ύλη. Όσον αφορά στην υποκυτταρική κατανομή της κινάσης, αυτή εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των νευρώνων στις διάφορες εξεταζόμενες περιοχές του εγκεφάλου, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρείται επίσης πυρηνική κατανομή της. 138

Σχήμα Γ.1. Ανοσοϊστοχημική εντόπιση της SRPK1 στον φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο. Α-C) Ανοσοθετικοί νευρώνες στο φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων( στιβάδες Ι, ΙΙ ) της περιοχής ΒΑ4. Κλίμακα 100 μm. D) Πυραμιδικοί νευρώνες της στιβάδας V σε μεγαλύτερη μεγέθυνση. Με βέλος δείχνεται ένας ανοσοαρνητικός πυραμιδικός νευρώνας. Ε, F) Φλοιός παρεγκεφαλίδας. Οι νευρώνες Purkinje είναι πάντα έντονα ανοσοθετικοί, με μέρος του δενδριτικού κλάδους τους επίσης. Οι νευρώνες στη μοριώδη στιβάδα σπάνια είναι ανοσοθετικοί (βέλος στο Ε), ενώ στην κοκκώδη στοιβάδα, μόνο οι νευρώνες Golgi είναι ανοσοθετικοί (βέλος στο F). G, H) Ιππόκαμπος, CA3 και CA4 περιοχές αντίστοιχα. I, J) Νεοραβδωτό σώμα. K, L) Υποθάλαμος, υπεροπτικός πυρήνας και πλάγια υποθαλάμια περιοχή. Κλίμακα D-L: 50 μm (Mytilinaios et al. 2012). 139

Γ.1.2. Ανοσοϊστοχημική μελέτη της κατανομής της SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα Με βάση τις προηγούμενες παρατηρήσεις της ανοσοϊστοχημικής μελέτης στο φυσιολογικό ανθρώπινο εγκέφαλο οι οποίες έδειξαν ότι τα νευρογλοιακά κύτταρα ουσιαστικά στερούνται SRPK1, σε αντίθεση με τους νευρώνες, αλλά και την πληθώρα των δημοσιεύσεων οι οποίες εμφανίζουν ανώμαλη έκφραση της κινάσης σε πολυάριθμους όγκους, προχωρήσαμε στη μελέτη της έκφρασής της στο γλοιοβλάστωμα ανθρώπινου εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό, 38 δείγματα ασθενών με γλοιωματικούς όγκους, οι οποίοι εγχειρίστηκαν στο Ινστιτούτο Νευροχειρουργικής, της Ιατρικής Σχολής, του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων (βλ. παράγραφο Β.2.16), μελετήθηκαν ανοσοϊστοχημικά με την έμμεση μέθοδο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.17, χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην ανθρώπινη SRPK1 σε αραίωση 1:50. Η μελέτη της εντόπισης της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα ανθρώπινου εγκεφάλου έδειξε ότι πολλά από τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν την κινάση σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα της γλοίας σε φυσιολογικό εγκέφαλο. Στα αποτελέσματα παρατηρείται ανομοιογένεια στον κυτταρικό πληθυσμό, καθώς υπάρχουν κύτταρα τα οποία είναι έντονα χρωματισμένα, άλλα με μέτριας έντασης χρώση και άλλα αρνητικά. Επίσης, υπάρχουν διαφορές και ως προς την υποκυτταρική εντόπιση, καθώς στην πλειονότητα των ανοσοθετικών στην κινάση κυττάρων παρατηρείται κυτταροπλασματική χρώση, ενώ υπάρχουν και κύτταρα τόσο με κυτταροπλασματική όσο και με πυρηνική εντόπιση της SRPK1 (Σχήμα Γ.2). 140

Σχήμα Γ.2. Ανοσοϊστοχημική εντόπιση της SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα. Α, B) Υψηλή ανοσοϊστοχημική έκφραση κυττάρων του όγκου με ενδιάμεση και υψηλή ένταση χρώσης. C, D) Χαμηλή ανοσοϊστοχημική έκφραση κυττάρων του όγκου με ενδιάμεση ένταση χρώσης. E, F) Υψηλή ανοσοϊστοχημική έκφραση κυττάρων του όγκου με χαμηλή ένταση χρώσης. G, H) Ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων εντός του όγκου με έντονη ανοσοδραστικότητα απέναντι στην SRPK1. Η κλίμακα στο G είναι 50 μm (ισχύει επίσης για Α, C, και Ε) και στο Η είναι 10 μm (ισχύει και για B, D και F). 141

Γ.1.3. Συσχέτιση ανάμεσα στην επιβίωση των ασθενών με γλοιοβλάστωμα και στα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 και τον βαθμό εκτομής του όγκου Στους 38 ασθενείς με γλοιωματικούς όγκους πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των κλινικών και ανοσοϊστοχημικών δεδομένων με σκοπό να εξεταστεί αν υπάρχει κάποιος βαθμός συσχέτισης αυτών με το χρόνο επιβίωσης. Ο πολλαπλασιασμός του όγκου, όπως αυτός εκφράζεται από τον δείκτη Ki-67, μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα MIB-1 απέναντι στην πρωτεΐνη Ki-67 (Dako S.A.) σε αραίωση 1:20 όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.17. Ο τρόπος στατιστικής ανάλυσης των δεδομένων περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.18. Χρησιμοποιώντας τους συντελεστές συσχέτισης Spearman, βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης SRPK1 και του δείκτη Ki-67 (r = 0,462, p = 0,0078). Καθορίζοντας την τιμή αποκοπής του δείκτη Ki-67 στο 30%, οι ασθενείς με δείκτη K-67 χαμηλότερο του 30% είχαν καλύτερη επιβίωση (15 έναντι 11 μηνών, αντίστοιχα, p = 0,0082, Σχήμα Γ.3.Α). Για τον προσδιορισμό του σημείου αποκοπής μεταξύ της έκφρασης της SRPK1 και της επιβίωσης των ασθενών χρησιμοποιήθηκαν οι καμπύλες ROC δίνοντας τιμή αποκοπής για την SRPK1 65% ως καλύτερη πρόβλεψη επιβίωσης. Οι ασθενείς με SRPK1 η οποία υπερβαίνει το 65% διέφεραν σημαντικά από εκείνους με δείκτη SRPK1 65% και σχετίζονταν με χειρότερη επιβίωση (10 έναντι 15 μηνών, αντίστοιχα, p = 0,03, Σχήμα Γ.3.Β). Οι ασθενείς με ολική αφαίρεση του όγκου (gross total resection-gtr) είχαν μέση επιβίωση 16 μηνών, ενώ σε ασθενείς οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε μερική αφαίρεση του όγκου (subtotal resection-str), ο μέσος χρόνος επιβίωσης ήταν 12 μήνες. Η διαφορά, όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.3.Β, ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,02). Για τις υπόλοιπες μεταβλητές οι οποίες ελέγχθηκαν [φύλο, ηλικία διάγνωσης, κατάσταση λειτουργικότητας δραστηριότητας σύμφωνα με την κλίμακα Karnofsky (KPS)] δεν παρατηρήθηκε σημαντική στατιστική διαφορά μεταξύ αυτών και της επιβίωσης των ασθενών. Στην ανάλυση πολλών μεταβλητών, ο δείκτης Ki-67 και η SRPK1 αναγνωρίστηκαν ως παράγοντες με ανεξάρτητη προγνωστική αξία. 142

Σχήμα Γ.3. A. Διάγραμμα της σχέσης μεταξύ της πρωτεΐνης Ki-67 (δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού) (σημείο αποκοπής = 30%) και της επιβίωσης ασθενών με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. Β. Διάγραμμα της σχέσης μεταξύ της έκφρασης της SRPK1 (σημείο αποκοπής = 65%) και της επιβίωσης σε ασθενείς με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. C. Διάγραμμα το οποίο δείχνει την αντιπροσωπευτική καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier των ασθενών, ομαδοποιημένων σύμφωνα με την έκταση της εκτομής του όγκου (ολική αφαίρεση του όγκου (gross total resection-gtr)/μερική αφαίρεση του όγκου (subtotal resection-str). Γ.1.4. Μελέτη της έκφρασης και της υποκυτταρικής κατανομής της SRPK1 σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος Μετά από αυτές τις παρατηρήσεις στα πειράματα ανοσοϊστοχημείας, θελήσαμε να μελετήσουμε περαιτέρω την έκφραση της SRPK1 στο γλοιοβλάστωμα. Για 143

το λόγο αυτό, αναπτύχθηκαν κυτταροκαλλιέργειες των γλοιωματικών κυτταρικών σειρών U87MG, T98G, και U251MG. Για τον έλεγχο της έκφρασης του γονιδίου της SRPK1 σε αυτές τις τρείς γλοιωματικές σειρές, συλλέχθηκε το συνολικό RNA από τα κύτταρα όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.20 και ακολούθησε η αντίστροφη μεταγραφή του με τη μέθοδο της RT-PCR ενισχύοντας το cdna της SRPK1 με κατάλληλους εκκινητές όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.21. Στο Σχήμα Γ.4.Α, φαίνονται τα προϊόντα της αντίδρασης μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης (βλ. παράγραφο Β.2.26) με το κομμάτι της SRPK1 να εμφανίζεται και στις τρείς κυτταρικές σειρές στο αναμενόμενο μέγεθος των 150 bp. Στη συνέχεια ελέγχθηκε αν η SRPK1 εκφράζεται τελικά ως πρωτεΐνη στις κυτταρικές σειρές U87MG, T98G, και U251MG και για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων (βλ. παράγραφο Β.2.24). Εκατό μg από το κάθε κυτταρικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (βλ. παραγράφους Β.2.25 και Β.2.26), ακολούθησε ανοσοαποτύπωσή τους σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση της SRPK1 χρησιμοποιώντας το κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντί της (βλ. παραγράφους Β.2.28 και Β.2.29). Όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.4.Β, η κινάση είναι παρούσα σε όλες της κυτταρικές σειρές καθώς εμφανίζεται μια ζώνη με αναμενόμενη μάζα (~100 kda), το οποίο αντιστοιχεί στην SRPK1. Μετά από την επιβεβαίωση της έκφρασης της SRPK1 στις γλοιωματικές καρκινικές σειρές, θελήσαμε να μελετήσουμε την υποκυτταρική κατανομή της κινάσης. Για το σκοπό αυτό, ακολούθησε δοκιμασία έμμεσου ανοσοφθορισμού και ανίχνευση της ενδογενούς SRPK1 με τη χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-srpk1 σε αραίωση 1:150. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε Alexa-488 anti-mouse, σε αραίωση 1:400, το οποίο δίνει πράσινο φθορισμό. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI), το οποίο δίνει κόκκινο φθορισμό. Η μέθοδος η οποία ακολουθήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.29. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα Γ.4.C η κινάση εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων, 144

ένα μοτίβο έκφρασης το οποίο είναι συνακόλουθο με τα ευρήματα της ανοσοϊστοχημείας τα οποία προηγήθηκαν. Σχήμα Γ.4. Έκφραση της SRPK1 σε κυτταρικές σειρές πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. A. RT-PCR για τον έλεγχο της έκφρασης του γονιδίου της SRPK1 στις κυτταρικές σειρές U87MG, T98G και U251MG. Τα ενισχυμένα μετάγραφα της SRPK1 βρίσκονται στο αναμενόμενο μέγεθος των 150bp. B. Western blot ανάλυση των ολικών εκχυλισμάτων των κυτταρικών σειρών U87MG, T98G και U251MG με χρήση μονοκλωνικού αντισώματος a- SRPK1. C. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της ενδογενούς SRPK1 στις κυτταρικές σειρές U87MG, T98G και U251MG με τη χρήση μονοκλωνικού anti-srpk1 αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10 μμ. Έτσι, όλες οι ενδείξεις των πειραμάτων οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η SRPK1 εκφράζεται και σε αυτά τα κύτταρα τα οποία προέρχονται από γλοιοβλάστωμα σε επίπεδο mrna αλλά και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Στα τρία πειράματα διαπιστώνονται κάποιες επαναλήψιμες μικρές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης της SRPK1 με μεγαλύτερη έκφραση να εμφανίζουν τα κύτταρα T98G και μικρότερη τα U87MG. Οι διαφορές αυτές πιθανώς αντικατοπτρίζουν και τις μεταβολές στην έκφραση της κινάσης στα πειράματα ανοσοϊστοχημείας τα οποία έγιναν στα δείγματα βιοψίας όγκων γλοιοβλαστώματος και τα οποία περιγράφηκαν νωρίτερα. 145

Γ.1.5. Μελέτη της μείωσης των επιπέδων έκφρασης της SRPK1 στη βιωσιμότητα κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος Για την διερεύνηση του ρόλου της SRPK1 στη βιωσιμότητα των κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος, χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία της RNA παρεμβολής με σκοπό να μειώσουμε τα επίπεδα έκφρασης της κινάσης. Για το λόγο αυτό προμηθευτήκαμε τους εμπορικά διαθέσιμους πλασμιδιακούς φορείς (short hairpin RNA-shRNA) copo-1, copo-2, copo-3, και copo-4, οι οποίοι στοχεύουν στο μόριο της SRPK1 της εταιρείας GeneCopoeia. Όπως περιγράφεται στη παράγραφο Β.2.22, ακολούθησε αναλυτικός έλεγχος της αποτελεσματικότητάς τους στην αναστολή της έκφρασης της κινάσης σε διάφορες συνθήκες (τα δεδομένα αυτά δεν παρουσιάζονται). Το πλασμίδιο copo-4 ήταν αυτό το οποίο έδινε τα υψηλότερα επίπεδα αναστολής της έκφρασης της κινάσης στις τέσσερις γλοιωματικές σειρές και για αυτόν τον λόγο επιλέχθηκε το συγκεκριμένο στη συνέχεια όλων των πειραμάτων. Για την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων U87MG, T98G και U251MG σε τρυβλίο 12 οπών με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 και με το πλασμίδιο ελέγχου scramble shrna (scr), το οποίο δεν αναστέλλει την έκφραση της SRPK1, χρησιμοποιήθηκε το kit Xfect TM Transfection Reagent ενώ η επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο έγινε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με την προσθήκη πουρομυκίνης (βλ. παράγραφο Β.2.23). Μετά από 4 μέρες επιπλέον επώασης, συλλέχθηκαν τα ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων (βλ. παράγραφο Β.2.24) και αναλύθηκε ποσότητα 100 μg σε SDS ηλεκτροφόρηση (βλ. παραγράφους Β.2.25 και Β.2.26). Ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση των επιπέδων των ενδογενών SRPK1 και GAPDH χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα μονοκλωνικά αντισώματα απέναντί τους (βλ. παραγράφους Β.2.27 και Β.2.28). 146

Σχήμα Γ.5. Η μείωση των επιπέδων έκφρασης της SRPK1 σε κυτταρικές σειρές πολύμορφου γλοιοβλαστώματος αναστέλλει μερικώς τη βιωσιμότητά τους. A. U87MG, T98G και U251MG κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 είτε με το scr-srpk1. Η επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο έγινε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, με προσθήκη 0,8 μg/ml πουρομυκίνης (κύτταρα U87MG και U251MG) ή 0,6 μg/ml (κύτταρα Τ98G) σε φρέσκο μέσο ανάπτυξης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 4 ημέρες, συλλέχθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SRPK1 και GAPDH προσδιορίστηκαν με ανάλυση Western blot με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. B.Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 είτε με το scr-srpk1 όπως παραπάνω. Τέσσερις ημέρες μετά την προσθήκη της πουρομυκίνης, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤΤ. Όπως παρατηρούμε στα αποτελέσματα του Western blot στο Σχήμα Γ.5.Α, η παροδική επιμόλυνση με το copo-4 των γλοιωματικών κυττάρων επέφερε ουσιαστική μείωση του επιπέδου έκφρασης της SRPK1 συγκρινόμενη με τα επίπεδα της κινάσης η οποία ανιχνεύτηκε σε κύτταρα τα οποία είχαν επιμολυνθεί με τον πλασμιδιακό φορέα ελέγχου scr-srpk1. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη αναφοράς για την συγκρισιμότητα των δειγμάτων. 147

Στη συνέχεια ελέγχθηκε το αποτέλεσμα της αναστολής της έκφρασης της SRPK1 στη βιωσιμότητα των κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος με δοκιμασία MTT. Για τον σκοπό αυτό U87MG, T98G και U251MG κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως παραπάνω με τους πλασμιδιακούς φορείς copo-4 και scr-srpk1 σε τρυβλίο 96 οπών (βλ. παράγραφο Β.2.23.) και 4 μέρες μετά την προσθήκη της πουρομυκίνης εφαρμόστηκε η δοκιμασία ΜΤΤ για τον υπολογισμό του αριθμού των ζώντων κυττάρων (βλ. παράγραφο Β.2.30). Για τον υπολογισμό του ποσοστού επιβίωσης, ο αριθμός των επιμολυσμένων κυττάρων με το scr-srpk1 θεωρήθηκε ως 100% βιωσιμότητα. Βλέποντας το διάγραμμα του Σχήματος Γ.5.Β, παρατηρούμε ότι η αποσιώπηση της SRPK1 είχε μικρή επίδραση στη βιωσιμότητα των τριών κυτταρικών σειρών, αναστέλλοντάς την σε ποσοστό το οποίο κυμαίνεται από 14% μέχρι 20%. Γ.1.6. Επίδραση της μείωσης των επίπεδων έκφρασης της SRPK1 στην ευαισθησία κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος σε χημειοθεραπευτικές ουσίες Παρατηρώντας από τα παραπάνω πειράματα ότι η σίγαση της έκφρασης της SRPK1 επηρεάζει σε μικρό βαθμό τη βιωσιμότητα των γλοιωματικών κυττάρων, θελήσαμε να ερευνήσουμε την επίδρασή της στην κυτταρική απόκριση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αρχικά ελέγξαμε την αυτόνομη επίδραση των ουσιών cis-πλατίνη και 5- FU στις τρείς γλοιωματικές σειρές ξεκινώντας από την διερεύνηση της πιθανής επίπτωσής τους στην έκφραση της SRPK1. Για τον σκοπό αυτό, προστέθηκαν στα κύτταρα U87MG, T98G και U251MG 30 μm cis-πλατίνης ή 40 μg/ml 5-FU ή μόνο DMSO ως δείγμα αναφοράς και επωάστηκαν για 48 ώρες. Ακολούθησε συλλογή των κυτταρικών εκχυλισμάτων και ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (βλ. παραγράφους Β.2.24 και Β.2.26). Μετά την ανοσοαποτύπωση των ζωνών, ο προσδιορισμός των πρωτεϊνικών επιπέδων των SRPK1 και GAPDH έγινε με ανοσοανίχνευση χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα (βλ. παραγράφους Β.2.27 και Β.2.28). Στο Σχήμα Γ.6.Α, παρατηρούμε ότι ενώ η cis-πλατίνη δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1, η προσθήκη 5-FU είχε ως αποτέλεσμα τη δραματική μείωση των επιπέδων της κινάσης. 148

Στη συνέχεια, τα κύτταρα U87MG, T98G και U251MG κατεργάστηκαν με αυξανόμενες ποσότητες είτε cis-πλατίνης είτε 5-FU και μετά το πέρας 48 ωρών επώασης με αυτές πραγματοποιήθηκε o έλεγχος της βιωσιμότητας των κυττάρων με τη δοκιμή MTT, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.30. Στο διάγραμμα του Σχήματος Γ.6.B, αποτυπώνεται ο ποσοστιαίος αριθμός των ζώντων κυττάρων σε κάθε συνθήκη, θεωρώντας ως σύνολο (100%) τον αριθμό των κυττάρων στα οποία επιδράσαμε μόνο με DMSO. Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος τονίζουν πάλι την διαφοροποίηση αυτών των ουσιών με τη cis-πλατίνη να έχει ένα πιο περιορισμένο αντίκτυπο στη βιωσιμότητα των γλοιωματικών κυττάρων με μέγιστη βιωσιμότητα 60-80%, στη μεγαλύτερη συγκέντρωση των 40 μm, σε αντίθεση με το 5-FU το οποίο είχε εντονότερη επιρροή μειώνοντας την βιωσιμότητα των κυττάρων στο 40-60% στη μεγαλύτερη συγκέντρωση των 60 μg/ml. 149

Σχήμα Γ.6. Έλεγχος της επίδρασης των κυτταροτοξικών ουσιών cis-πλατίνης και 5-FU στην έκφραση της SRPK1 και στη βιωσιμότητα κυτταρικών σειρών πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Α. Στα κύτταρα U87MG, T98G και U251MG προστέθηκαν 30 μm cisπλατίνης ή 40 μg/ml 5-FU για 48 h. Μετά την επίδραση των ουσιών ακολούθησε συλλογή των κυτταρικών εκχυλισμάτων και ηλεκτροφόρησή τους σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ο προσδιορισμός των πρωτεϊνικών επιπέδων των SRPK1 και GAPDH έγινε με Western blot ανάλυση χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα. Β. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις cis-πλατίνης ή 5-FU προστέθηκαν στα κύτταρα και μετά από 48h επίδρασης μετρήθηκε η βιωσιμότητά τους με τη μέθοδο MTT. Σε ένα επόμενο βήμα θελήσαμε να ελέγξουμε αν παρουσιάζει κάποιο συνεργιστικό αποτέλεσμα η κατεργασία των κυττάρων με τα χημειοθεραπευτικά με τη σύγχρονη σίγαση της έκφρασης της SRPK1. Στο πλαίσιο αυτό, τα U87MG, T98G και U251MG κύτταρα επιμολύνθηκαν 150

παροδικά με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 ή με το πλασμίδιο ελέγχου scr- SRPK1 σε τρυβλίο 96 οπών, όπως περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο B.2.23. και την επόμενη ημέρα έγινε η επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο με την προσθήκη πουρομυκίνης. Μετά από επώαση για 48 ώρες με την πουρομυκίνη, στα κύτταρα προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις είτε cis-πλατίνης είτε 5-FU (σε φρέσκο θρεπτικό υλικό) και επωάστηκαν περαιτέρω για 48 ώρες. Για την μέτρηση των ζώντων κυττάρων σε κάθε συνθήκη πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.30. Τα αποτελέσματα, όπως αποτυπώνονται στα διαγράμματα του Σχήματος Γ.7.Α, μας έδειξαν ότι και στις τρεις κυτταρικές σειρές, η μείωση των επιπέδων της SRPK1 οδήγησε σε μικρή αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στην cis-πλατίνη (έως 20%). Με την επίδραση όμως του 5-FU (Σχήμα Γ.7.Β) δεν παρατηρείται ανάλογη μεταβολή στην ευαισθησία των κυττάρων. 151

Σχήμα Γ.7. Έλεγχος της βιωσιμότητας κυτταρικών σειρών πολύμορφου γλοιοβλαστώματος μετά τη σύγχρονη επίδραση των κυτταροτοξικών ουσιών cisπλατίνης και 5-FU και την μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνικών επιπέδων της SRPK1. U87MG, T98G και U251MG κύτταρα επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς copo-4 και scr-srpk1, αντίστοιχα. Η επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο έγινε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, με προσθήκη 0,8 μg/ml πουρομυκίνης (στα κύτταρα U87MG και U251MG) ή 0,6 μg/ml (στα κύτταρα Τ98G) σε φρέσκο μέσο ανάπτυξης, για 48 h. Στη συνέχεια, προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις cis-πλατίνης (Α) και 5-FU (B) και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 h. Στο τέλος, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤΤ. 152

Γ.1.7. Έλεγχος επίδρασης της μείωσης των επίπεδων έκφρασης της SRPK1 στην ευαισθησία κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος στην τεμοζολομίδη Σε ένα επόμενο βήμα πάνω στη διερεύνηση του ρόλου της SRPK1 σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος, μελετήσαμε την επίδρασης της μείωσης των επίπεδων έκφρασης της κινάσης στην ευαισθησία τους στην τεμοζολομίδη. Το αντικαρκινικό αυτό φάρμακο χορηγείται για τη θεραπεία των κακοήθων γλοιωμάτων. Σε πρώτο στάδιο όπως και στα προηγούμενα πειράματα, ελέγξαμε στις τρείς γλοιωματικές σειρές την πιθανή επίδραση της τεμοζολομίδης στην έκφραση της SRPK1. Για τον σκοπό αυτό, προστέθηκαν στα U87MG, T98G και U251MG κύτταρα δύο συγκεντρώσεις φαρμάκου (200 μμ ή 400 μμ) ή μόνο DMSO και επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά τη συλλογή των ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων τους, ακολούθησε ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου (βλ. παραγράφους Β.2.24 και Β.2.26) και Western blot ανάλυση (βλ. παράγραφο Β.2.27). Η ανοσοανίχνευση των SRPK1 και GAPDH έγινε χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα απέναντί τους (βλ. παράγραφο Β.2.28). Στο Σχήμα Γ.8.Α, παρατηρούμε ότι η τεμοζολομίδη προστιθέμενη ακόμα και στη μεγαλύτερη συγκέντρωση των 400 μμ δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1. Στη συνέχεια, στα κύτταρα U87MG, T98G και U251MG προστέθηκαν αυξανόμενες ποσότητες τεμοζολομίδης (100 μμ μέχρι 600 μμ) και μετά το πέρας 48 ωρών επώασης με την ουσία πραγματοποιήθηκε o έλεγχος της βιωσιμότητας των κυττάρων με τη δοκιμή MTT, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.30. Για τον υπολογισμό της βιωσιμότητας θεωρήθηκε ως σύνολο (100%), ο αριθμός των κυττάρων στα οποία επιδράσαμε μόνο με DMSO. Στο διάγραμμα του Σχήματος Γ.8.B, βλέπουμε ότι αυξάνοντας της συγκέντρωση της τεμοζολομίδης στα κύτταρα παρατηρείται μια σταδιακή μείωση της βιωσιμότητάς τους. Στη μέγιστη συγκέντρωση των 600 μμ η βιωσιμότητα των U87MG, και U251MG μειώνεται στο 40% ενώ αυτή των T98G στο 60%. 153

Σχήμα Γ.8. Έλεγχος της επίδρασης της κυτταροτοξικής ουσίας τεμοζολομίδης στην έκφραση της SRPK1 και στη βιωσιμότητα κυτταρικών σειρών πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Α. Στα κύτταρα U87MG, T98G και U251MG προστέθηκαν 200 μm και 400 μm τεμοζολομίδης για 48 h. Ακολούθησε συλλογή των κυτταρικών εκχυλισμάτων και ηλεκτροφόρησή τους σε 10% πηκτή SDS- πολυακρυλαμιδίου. Ο προσδιορισμός των πρωτεϊνικών επιπέδων των SRPK1 και GAPDH έγινε με Western blot ανάλυση χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα. Β. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις τεμοζολομίδης προστέθηκαν στα κύτταρα και μετά από 48 h επίδρασης μετρήθηκε η βιωσιμότητά τους με τη μέθοδο MTT. Τέλος ελέγξαμε την επίδραση της τεμοζολομίδης στη βιωσιμότητα των γλοιωματικών κυττάρων με τη σύγχρονη σίγαση της έκφρασης της SRPK1. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, τα U87MG, T98G και U251MG κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 ή με το πλασμίδιο ελέγχου scr-srpk1 σε τρυβλίο 96 οπών, όπως περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο B.2.23 και την επόμενη μέρα προστέθηκε πουρομυκίνη για την 154

επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο. Μετά την επώαση για 48 ώρες με το αντιβιοτικό, στα κύτταρα προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις τεμοζολομίδης (σε φρέσκο θρεπτικό υλικό) και συνεχίστηκε η επώασή τους για 48 ώρες. Για την μέτρηση των ζώντων κυττάρων σε κάθε συνθήκη πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.30. Τα αποτελέσματα του πειράματος φαίνονται στα διαγράμματα του Σχήματος Γ.9. Στις μικρότερες εξεταζόμενες συγκεντρώσεις τεμοζολομίδης, η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 αύξησε σε μικρό βαθμό την ευαισθησία των κυττάρων γλοιοβλαστώματος στην κυτταροτοξική αυτή ουσία ενώ όσο αυξάνονταν η συγκέντρωσή της μειωνόταν το συνδυαστικό αποτέλεσμα. Πιο συγκεκριμένα, η κυτταρική σειρά U87MG επέδειξε τη μικρότερη επίδραση της αναστολής της κινάσης στην ευαισθησία τους στην τεμοζολομίδη (12% στα 200 μμ), ενώ στις κυτταρικές σειρές Τ98G και U251MG η μείωση των επιπέδων της SRPK1 αύξησε την ευαισθησία τους στην τεμοζολομίδη κατά 22% στα 100 μμ και 29% στα 50 μμ αντίστοιχα. 155

Σχήμα Γ.9. Έλεγχος της βιωσιμότητας κυτταρικών σειρών πολύμορφου γλοιοβλαστώματος μετά τη σύγχρονη επίδραση της κυτταροτοξικής ουσίας τεμοζολομίδης και την μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνικών επιπέδων της SRPK1. 156

U87MG, T98G και U251MG κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με τον πλασμιδιακό φορέα copo-4 είτε με το scr-srpk1. Η επιλογή των κυττάρων τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο έγινε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, με προσθήκη 0,8 μg/ml πουρομυκίνης (στα κύτταρα U87MG και U251MG) ή 0,6 μg/ml (στα κύτταρα Τ98G) σε φρέσκο μέσο ανάπτυξης, για 48 h. Στη συνέχεια, προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις τεμοζολομίδης και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέων 48 h. Στο τέλος, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤΤ. 157

Γ.2. Έλεγχος νέων μικρομοριακών ενώσεων ως πιθανοί αναστολείς της δράσης της SRPK1 Μελέτη του βιολογικού ρόλου της λυναμικίνης D Το εναλλακτικό μάτισμα διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και την εξέλιξη του καρκίνου. Η παρουσία εναλλακτικών προϊόντων ματίσματος τα οποία ευνοούν την καρκινογένεση ή την περαιτέρω ανάπτυξη του όγκου, καθιστά τα ίδια, αλλά και τις κινάσες οι οποίες τα ρυθμίζουν, πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Στην παρούσα ενότητα θα αναλυθούν τα αποτελέσματα μιας σειράς πειραμάτων τα οποία προέκυψαν από τη συνεργασία της ερευνητικής μας ομάδας, με την ερευνητική ομάδα της επίκουρης καθηγήτρια Βασιλικής Σαρλή του Εργαστηρίου Οργανικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Η ομάδα της Οργανικής Χημείας είχε ως αντικείμενο το σχεδιασμό και την εργαστηριακή σύνθεση διαφόρων ενώσεων, των οποίων ο βιολογικός ρόλος μελετήθηκε στη συνέχεια από την ομάδα μας. Γ.2.1. Έλεγχος επίδρασης μικρομοριακών ενώσεων στη δραστικότητα της SRPK1 Το 2006, ερευνητές κατέληξαν σε μια ένωση του ισονικοτιναμιδίου, τον SRPIN340, ο οποίος αναστέλλει εκλεκτικά την SRPK1 (IC50 = 0,14 μμ) και την SRPK2 (IC50 = 1,8 μμ). Σύμφωνα με τη δομή αυτής της ένωσης, η εργαστηριακή ομάδα της Βασιλικής Σαρλή, σχεδίασε και συνέθεσε εργαστηριακά 17 νέες ενώσεις οι οποίες μας παραχωρήθηκαν για τον έλεγχό της πιθανής ανασταλτικής τους δράσης απέναντι στην SRPK1. Η πλήρης ονομασία των ενώσεων αναφέρεται στις συντμήσεις, ενώ στο υπόλοιπο κείμενο χρησιμοποιείται μόνο η εμπειρική ονομασία. Για το σκοπό αυτό, ανιχνεύσαμε τη δράση της ανασυνδυασμένης GST- SRPK1 παρουσία και απουσία των εξεταζόμενων ενώσεων, με in vitro φωσφορυλίωση του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) το οποίο περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 62 και 92 (LBRNt(62-92)) και αποτελεί γνωστό υπόστρωμα της κινάσης. Πιο συγκεκριμένα, το δείγμα το οποίο επωάστηκε περιείχε 1,5 μg GST/62-92, 12 mm Hepes, 10 mm MgCl2, 25 μμ 158

ψυχρό ATP, ραδιενεργό [γ- 32 Ρ] ATP και 1,5 μg από την ενεργή κινάση GST- SRPK1. Σε κάθε δείγμα προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις της κάθε ουσίας, ενώ στο δείγμα αναφοράς προστέθηκε ο διαλύτης DMSO στον οποίο είναι διαλυμένες όλες οι ουσίες (βλ. παράγραφο Β.2.13). Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (βλ. παράγραφο Β.2.26), η οποία στη συνέχεια βάφτηκε με Coomasie Brilliant Blue R- 250 και τέλος πραγματοποιήθηκε η αυτοραδιογραφία (βλ. παραγράφους Β.2.14 και Β.2.15). Στα Σχήματα Γ.10 και Γ.11, βλέπουμε τα αποτελέσματα της επίδρασης των μικρομοριακών ουσιών (με τους αντίστοιχους μοριακούς τους τύπους) στη δραστικότητα της SRPK1. Το τμήμα της εκάστοτε αυτοραδιογραφίας το οποίο εμφανίζεται στο Σχήμα, αποτελεί το τμήμα που αντιστοιχεί στην φωσφορυλίωση του υποστρώματος GST-LBRNt(62-92). Σε πρώτο στάδιο μπορούμε να εκτιμήσουμε ποιοτικά από την ένταση της προσβολής του φιλμ, πως συγκριτικά με τον SRPIN340, καμία ένωση δεν έδειξε να αναστέλλει την δραστικότητα της κινάσης. 159

Σχήμα Γ.10. Έλεγχος της δραστικότητας της SRPK1 in vitro υπό την επίδραση μικρομοριακών ενώσεων. In vitro φωσφορυλίωση 1,5 μg του υποστρώματος GST- LBRNt(62-92) από 1,5 μg της ανασυνδυασμένης GST-SRPK1 παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων Α) SRPIN 340, B) Sk-7d, C) Sk-8c, D) Sk-16a, E) Sk-18a, F) Sk-19a, G) Sk- 21a, H) Sk-22a και I) Sk-23a. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου, βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue R-250 και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Στο σχήμα, διακρίνεται μόνο το τμήμα της αυτοραδιογραφίας το οποίο αντιστοιχεί στην φωσφορυλίωση του GST-LBRNt(62-92). 160

Σχήμα Γ.11. Έλεγχος της δραστικότητας της SRPK1 in vitro υπό την επίδραση μικρομοριακών ενώσεων. In vitro φωσφορυλίωση 1,5 μg του υποστρώματος GST- LBRNt(62-92) από 1,5 μg της ανασυνδυασμένης GST-SRPK1 παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων Α) Sk-24a, B) Sk-25a, C) Sk-26c, D) Sk-27a, E) Sk-28a, F) Sk-31a, G) Sk- 32a, H) Sk-33a και I) Sk-34a. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου, βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue R-250 και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Στο σχήμα διακρίνεται μόνο το τμήμα της αυτοραδιογραφίας το οποίο αντιστοιχεί στην φωσφορυλίωση του GST-LBRNt(62-92). Οι ραδιενεργές ζώνες της πηκτής πολυακρυλαμιδίου, οι οποίες αντιστοιχούν στη GST-LBRNt(62-92), κόπηκαν και μετρήθηκαν σε υγρό σπινθηριστή με στόχο την ποσοτικοποίηση της έκτασης της φωσφορυλίωσης. 161

Στο διάγραμμα του Σχήματος Γ.12 αποτυπώνονται συγκεντρωμένα τα αποτελέσματα της μέτρησης όλων των παραπάνω αυτοραδιογραφιών. Δεδομένου ότι στις μικρότερες εξεταζόμενες συγκεντρώσεις (0,1 μμ, 1 μμ και 10 μμ), όλες οι ουσίες δεν ανέστειλαν καθόλου την SRPK1, στο διάγραμμα εμφανίζονται μόνο οι μετρήσεις οι οποίες αφορούν την ανώτατη συγκέντρωση των 50 μμ της κάθε ουσίας. Όπως φαίνεται και στο διάγραμμα, παρόλο που η επίδραση του SRPIN340 σε αυτήν τη συγκέντρωση περιορίζει τη δραστικότητα της SRPK1 στο 5%, οι υπόλοιπες εξεταζόμενες μικρομοριακές ενώσεις, δεν ήταν ικανές να αναστείλουν τη δράση της. Μεγαλύτερη ανασταλτική ικανότητα εμφάνισε η ουσία Sk-34α, η οποία στην συγκέντρωση των 50 μμ ανέστειλε τη δραστικότητα της SRPK1 στο 80%. Σχήμα Γ.12. Συγκεντρωτικό διάγραμμα ποσοτικοποίησης της επίδρασης μικρομοριακών ενώσεων στη δραστικότητα της SRPK1. Οι ραδιενεργές ζώνες (των πειραμάτων τα οποία περιγράφονται στα Σχήματα Γ.11 και Γ.12) της πηκτής πολυακρυλαμιδίου οι οποίες αντιστοιχούν στο υπόστρωμα GST-LBRNt(62-92) κόπηκαν και μετρήθηκαν σε υγρό σπινθηριστή. Ως 100% θεωρήθηκε η έκταση της φωσφορυλίωσης του GST-LBRNt(62-92) από την GST-SRPK1 παρουσία μόνο DMSO (δείγμα αναφοράς). Tο διάγραμμα απεικονίζει μόνο τις μετρήσεις οι οποίες αντιστοιχούν στην ανώτατη συγκέντρωση των 50 μμ από κάθε ουσία. Τα δεδομένα αναπαριστούν τον μέσο όρο ± SE τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Γ.2.2. Σύνθεση του αντιμικροβιακού φυσικού προϊόντος λυναμικίνη D Στη συνέχεια της συνεργασίας μας με την ομάδα της Βασιλικής Σαρλή, ασχοληθήκαμε με τον έλεγχο του βιολογικού ρόλου της λυναμικίνης D. Η ομάδα των αλκαλοειδών του ινδολίου αντιπροσωπεύουν μια μεγάλη οικογένεια φυσικών προϊόντων τα οποία εμφανίζουν ισχυρή και ποικίλη βιολογική δράση όπως αντιφλεγμονώδη, αντιμικροβιακή, αντιική και 162

αντιογκική. Πρόσφατα απομονώθηκαν για πρώτη φορά, νέα διινδολικά πυρρόλια από τον θαλάσσιο ακτινομύκητα NPS12745, τα οποία παρουσιάζονται στο Σχήμα Γ.13. Σχήμα Γ.13. Η οικογένεια των λυναμικινών (lynamicins). Το αντιμικροβιακό φυσικό προϊόν Lynamicin D, συντέθηκε για πρώτη φορά εργαστηριακά από την ομάδα της επίκουρης καθηγήτριας Βασιλικής Σαρλή. Κρίσιμη αντίδραση της μεθόδου η οποία χρησιμοποιήθηκε, αποτέλεσε μία σύζευξη Suzuki για την κατασκευή του διινδολικού πυρρολικού σκελετού (βλ. Σχήμα Γ.14). Η ένωση λυναμικίνη D έχει μοριακό τύπο C24H17Cl2N3O4 και μοριακό βάρος 480,0516. Σχήμα Γ.14. Πορεία σύνθεσης λυναμικίνης D. Η ένωση λυναμικίνη D παραχωρήθηκε στη συνέχεια στην ομάδα μας και μελετήθηκαν από μέρους οι τομείς της βιολογικής της δραστικότητας. 163

Γ.2.3. Έλεγχος επίδρασης λυναμικίνης D στη βιωσιμότητα διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών Σε πρώτο επίπεδο μελετήσαμε την επίδραση της λυναμικίνης D στη βιωσιμότητα τριών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών προερχόμενες από τρεις διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Τα HeLa (αδενοκαρκίνωμα τραχήλου της μήτρας), τα Α549 (καρκίνωμα πνεύμονα), και τα T98G (πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εγκεφάλου). Για τους σκοπούς αυτού του στόχου, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 96 οπών (10 4 κύτταρα/ οπή) και εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις την ουσίας λυναμικίνη D (0-20 μμ) για 48 ώρες. Μετά την επίδραση της ουσίας, ακολούθησε η μέτρηση των ζώντων κυττάρων με την χρωματογραφική μέθοδο ΜΤΤ, όπως περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.30. Σχήμα Γ.15. Έλεγχος της βιωσιμότητας κυττάρων HeLa, A549 και T98 μετά την επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων λυναμικίνης D. Σε HeLa, A549 και T98 κύτταρα προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις λυναμικίνης D και μετά από 48 h επίδρασης μετρήθηκε η βιωσιμότητά τους με τη μέθοδο MTT. Η βιωσιμότητα εκφράζεται ως ποσοστό (%) των ζώντων κυττάρων της κάθε συνθήκης ως προς τα κύτταρα στα οποία προστέθηκε μόνο DMSO. Τα δεδομένα αναπαριστούν τον μέσο όρο ± SE τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Στο Σχήμα Γ.15 βλέπουμε το συγκεντρωτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων και για τις τρείς κυτταρικές σειρές. Η βιωσιμότητα των κυττάρων σε κάθε συνθήκη υπολογίστηκε θεωρώντας ως 100% βιωσιμότητα την απορρόφηση των κυττάρων αναφοράς τα οποία είχαν εκτεθεί μόνο στο 164

DMSO (διαλύτης στον οποίο είναι διαλυμένη η λυναμικίνη D). Η δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε περιορισμένη επίδραση της ουσίας στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, η βιωσιμότητα των HeLa, A549 και T98G κυττάρων ήταν 82, 88 και 91%, αντίστοιχα, στη μέγιστη εξεταζόμενη συγκέντρωση των 30 μμ. Γ.2.4. Μελέτη της επίδρασης της λυναμικίνης D στο in vivo μάτισμα γονιδίων αναφοράς Ορμώμενοι από πολλές αναφορές εργαστηρίων στα τελευταία χρόνια ότι φυσικές ενώσεις μικρού μοριακού βάρους, μπορούν να μεταβάλλουν το εναλλακτικό και το ιδιοσύστατο μάτισμα του πρόδρομου mrna σε κύτταρα θηλαστικών, θελήσαμε στη συνέχεια να ελέγξουμε αν η λυναμικίνη D επηρεάζει αυτήν την διαδικασία. Για την πραγματοποίηση αυτής της μελέτης, εφαρμόστηκε μια μέθοδος κατάλληλη για πειράματα in vivo ματίσματος, χρησιμοποιώντας τρία μίνι γονίδια αναφοράς. Στο Σχήμα Γ.16, απεικονίζεται ο τρόπος ματίσματος των μίνι-γονιδίων της προ-ινσουλίνης, του SRp20 και του SMN2. Τα αντίστοιχα πλασμίδια μας παραχωρήθηκαν από συνεργάτες όπως αναφέρονται στην παράγραφο Β.1.2. Αναλυτικότερα, για την περίπτωση της μελέτης του ιδιοσύστατου ματίσματος χρησιμοποιήθηκε ο φορέας αναφοράς psvirb, ο οποίος εκφράζει το μετάγραφο της ινσουλίνης του αρουραίου, με το mrna αυτό να μπορεί να υποστεί μάτισμα υπό κατάλληλες συνθήκες, παράγοντας το ώριμο mrna της ινσουλίνης. Για τη μελέτη του εναλλακτικού ματίσματος χρησιμοποιήθηκαν τα μίνι-γονίδια SRp20 και SMN2, τα οποία μπορούν υπό κατάλληλες συνθήκες να δώσουν δύο διαφορετικά προϊόντα ματίσματος το καθένα, ανάλογα με το αν θα συμπεριλάβουν ή όχι ένα εξόνιο. 165

Σχήμα Γ.16. Σχηματική απεικόνιση του τρόπου ματίσματος των μίνι-γονιδίων της προινσουλίνης, του SRp20 και του SMN2. Α) Ιδιοσύστατο μάτισμα του μίνι- γονιδίου της ινσουλίνης αρουραίου. Τα ορθογώνια αντιστοιχούν στα εξόνια 1, 2 και 3 ενώ οι γραμμές οι οποίες τα ενώνουν απεικονίζουν τα ιντρόνια. Κάτω εμφανίζεται το ματισμένο mrna Β) Εναλλακτικός τρόπος ματίσματος του μίνι-γονιδίου SRp20. Με άσπρα ορθογώνια εμφανίζονται τα εξόνια 3 και 5 ενώ το εναλλακτικό εξόνιο 4 με μαύρο ορθογώνιο. Πάνω και κάτω εμφανίζονται τα δύο εναλλακτικά προϊόντα ματίσματος. Γ) Εναλλακτικός τρόπος ματίσματος του μίνι-γονιδίου του SMN2 (survival motor neuron 2/πρωτεΐνη επιβίωσης των κινητικών νευρώνων 2). Με άσπρα ορθογώνια εμφανίζονται τα εξόνια 6 και 8 ενώ το εναλλακτικό εξόνιο 7 με μαύρο ορθογώνιο. Πάνω και κάτω εμφανίζονται τα δύο εναλλακτικά προϊόντα ματίσματος. Για τις δοκιμασίες in vivo ματίσματος, HeLa κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 12 οπών (2 x 10 4 κύτταρα/οπή) και επιμολύνθηκαν με τα τρία μίνι γονίδια (PSVIRB, SRp20 και Smn2) παρουσία αυξανόμενης ποσότητας λυναμικίνης D (10, 20 και 30 μμ) ή DMSO (ως συνθήκη αναφοράς), όπως ακριβώς περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.31. Μετά από 24 ώρες επώασης, 166

συλλέχθηκε το συνολικό RNA και ακολούθησε RT-PCR (βλ. παραγράφους Β.2.20 και Β.2.21) με κατάλληλους εκκινητές σχεδιασμένους να ενισχύουν και τα δύο διαφορετικά προϊόντα ματίσματος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.17, στην αριστερή στήλη, η λυναμικίνη D ήταν ικανή να ρυθμίζει το μάτισμα των εξεταζόμενων μίνι-γονιδίων αναφοράς. Μπορούμε να παρατηρήσουμε την σημαντική συγκράτηση ιντρονίων στο μίνιγονίδιο της ινσουλίνης (psvirb) όπως και την συμπερίληψη του εξονίου 4 στο μίνι-γονίδιο SRp20, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της λυναμικίνης. Το ποσοστό της συμπερίληψης του εξονίου 7 του μίνι-γονίδιο SMN2 ήταν επίσης υψηλότερο, υποδηλώνοντας έτσι ότι η λυναμικίνη D μπορεί να επηρεάσει και το ιδιοσύστατο αλλά και το εναλλακτικό μάτισμα διαφόρων στόχων πρόδρομου RNA. Καθώς η SRPK1 εμπλέκεται πολύ ενεργά στη διαδικασία του ματίσματος, θελήσαμε να ελέγξουμε με την ίδια δοκιμασία in vivo ματίσματος την επίδραση της κινάσης και να την συγκρίνουμε με αυτήν της λυναμικίνης D. Ειδικότερα, συνεπιμολύναμε HeLa κύτταρα όπως και προηγουμένως με τα ίδια πλασμίδια των μίνι γονιδίων και με 0,5 μg ή 1 μg ή 1,5 μg του πλασμιδιακού φορέα pflag-cmv-2-srpk1, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. Στη δεξιά στήλη του Σχήματος Γ.17, βλέπουμε ότι το μάτισμα και των τριών μίνι-γονιδίων με τη συνεπιμόλυνση με αυξανόμενες ποσότητες πλασμιδίου το οποίο υπερεκφράζει την SRPK1, ακολουθεί το ίδιο μοτίβο συγκράτησης των ιντρονίων (βλ. Γ.17.Α, αριστερή στήλη) και συμπερίληψης των εκάστοτε εξoνίων (βλ. Σχήμα Γ.17.Β και Γ.17.Γ, αριστερή στήλη) όπως με την προσθήκη της λυναμικίνης D. Έτσι, οδηγηθήκαμε στην υπόθεση ότι λυναμικίνη D είναι πιθανόν να ασκεί την επίδρασή της στο μάτισμα επηρεάζοντας τα επίπεδα έκφρασης ή/και δραστικότητας της SRPK1. 167

Σχήμα Γ.17. Έλεγχος της επίδρασης της λυναμικίνης D και της υπερεκφρασμένης SRPK1 στο μάτισμα των μίνι-γονιδίων της προ-ινσουλίνης, του SRp20 και του SMN2 in vivo. Αριστερή στήλη: HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με τον πλασμιδιακό φορέα Α) psvirb (1 μg) Β) είτε με τον psrp20 (0,5 μg) είτε με τον Γ) psmn2 (0,5 μg) και 4 ώρες μετά προστέθηκαν αυξανόμενες ποσότητες λυναμικίνης D (0-20 μμ). Δεξιά στήλη: HeLa κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν είτε με τον πλασμιδιακό φορέα Α) psvirb (1 μg) Β) είτε με τον psrp20 168

(0,5 μg) είτε με τον Γ) psmn2 (0,5 μg) μαζί με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2-srpk1 (0,5, 1, και 1,5 μg) ο οποίος υπερεκφράζει την FLAG-SRPK1. Στη διαδρομή αναφοράς (0) έγινε συνεπιμόλυνση του εκάστοτε πλασμιδίου του μίνι-γονιδίου μαζί με το κενό πλασμίδιο pflag-cmv-2. Σε κάθε περίπτωση, μετά από 24 ώρες επώασης από την επιμόλυνση, συλλέχθηκε το συνολικό RNA και ακολούθησε RT-PCR με κατάλληλους εκκινητές. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζης η οποία περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο. Η ποσοτικοποίηση της έντασης της πάνω και της κάτω ζώνης, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τα διαφορετικά προϊόντα ματίσματος, έγινε με το πρόγραμμα ImageJ και τα αποτελέσματα απεικονίζονται στα διαγράμματα. Αριστερά της κάθε ηλεκτροφόρησης απεικονίζονται σχηματικά τα μεταγραφήματα των εκάστοτε μίνι-γονιδίων. Τα δεδομένα αναπαριστούν τον μέσο όρο ± SE τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Στη συνέχεια επιβεβαιώσαμε ότι πράγματι η ποσότητα της FLAG- SRPK1 η οποία εκφράζεται στα HeLa κύτταρα αυξάνεται αναλογικά με την αύξηση των μικρογραμμαρίων του πλασμιδίου pflag-cmv-2-srpk1 με το οποίο είχαμε επιμολύνει τα κύτταρα. Στα πλαίσια αυτού του πειράματος, 2 x 10 4 κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 12 οπών και επιμολύνθηκαν με 0,5 μg ή 1 μg ή 1,5 μg του πλασμιδιακού φορέα pflag-cmv-2-srpk1 όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, συλλέχθηκαν ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και παρασκευάστηκαν δείγματα τα οποία περιείχαν 100 μg πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου (βλ. παράγραφο Β.2.26) και ακολούθησε Western blot ανάλυση (βλ. παράγραφο Β.2.27) και ανοσοανίχνευση (βλ. παράγραφο Β.2.28) της FLAG-SRPK1 και της GAPDH (ως εσωτερική πρωτεΐνη αναφοράς φόρτωσης των δειγμάτων), με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Στο Σχήμα Γ.18, φαίνεται ξεκάθαρα ότι αυξάνεται αναλογικά η έκφραση της FLAG-SRPK1 με την αύξηση των ποσοτήτων του πλασμιδιακού φορέα κατά την επιμόλυνση. Σχήμα Γ.18. Έλεγχος της έκφρασης της FLAG-SRPK1 μετά τη σταδιακή αύξηση της ποσότητας του πλασμιδιακού φορέα pflag-cmv-2-srpk1 κατά την επιμόλυνση. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδιακού φορέα pflag-cmv-2- SRPK1. Μετά από 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση συλλέχθηκαν τα ολικά πρωτεϊνικά 169

εκχυλίσματα και παρασκευάστηκαν δείγματα τα οποία ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε Western blot ανάλυση και ανοσοανίχνευση της υπερεκφρασμένης FLAG-SRPK1 πρωτεΐνης με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Η GAPDH χρησιμοποιείται ως εσωτερική πρωτεΐνη αναφοράς φόρτωσης των δειγμάτων. Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω την υπόθεση ότι η λυναμικίνη D ασκεί την επίδρασή της στο μάτισμα μέσω της SRPK1, πραγματοποιήσαμε τις ίδιες δοκιμές ματίσματος του μίνι-γονιδίου psvirb σε HeLa κύτταρα όπως και προηγουμένως με την παρουσία (ή μη) όμως του γνωστού αναστολέα της κινάσης SRPIN340. Η μεθοδολογία του πειράματος περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.31. Όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.19.Β, η επίδραση της υπερεκφρασμένης SRPK1 στο ιδιοσύστατο μάτισμα του psvirb έγκειται, όπως παρατηρήθηκε και στο προηγούμενο πείραμα, στη συγκράτηση των ιντρονίων στο τελικό ώριμο mrna. Το γεγονός αυτό μπορεί να αντιστραφεί σχεδόν πλήρως, με την προσθήκη στα κύτταρα του αναστολέα της SRPK1, SRPIN340. Ανάλογη αντιστροφή του φαινομένου, σε μικρότερη όμως έκταση, προκαλεί η προσθήκη του SRPIN340 και στην περίπτωση της λυναμικίνης D (βλ. Σχήμα Γ.19.Α). Είναι λοιπόν πιθανόν, εκτός από την παρατηρούμενη σημαντική συμμετοχή της SRPK1 στην επίδραση της λυναμικίνης D στη διαδικασία του ματίσματος, να εμπλέκονται και άλλοι μοριακοί μηχανισμοί. Σχήμα Γ.19. Έλεγχος της επίδρασης της λυναμικίνης D και της υπερεκφρασμένης SRPK1 στο μάτισμα του μίνι-γονιδίου της προ-ινσουλίνης παρουσία και απουσία του SRPIN 340. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1,5 μg του πλασμιδιακού φορέα psvirb Α) Τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση προστέθηκαν στα κύτταρα είτε 30 μμ λυναμικίνης D (δεύτερη διαδρομή) είτε 30 μμ λυναμικίνης D και 5 μμ SRPIN 340 (τρίτη διαδρομή) είτε 170

αφέθηκαν ως έχουν (πρώτη διαδρομή). Β) HeLa κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν είτε με 1,5 μg του πλασμιδιακoύ φορέα pflag-cmv-2-srpk1 η οποία υπερεκφράζει την FLAG-SRPK1 (δεύτερη και τρίτη διαδρομή) είτε με το κενό πλασμίδιο pflag-cmv-2 (πρώτη διαδρομή). Σε κάθε περίπτωση, μετά από 24 ώρες επώασης από την επιμόλυνση, συλλέχθηκε το συνολικό RNA και ακολούθησε RT-PCR με κατάλληλους εκκινητές. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζης η οποία περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο. Η ποσοτικοποίηση της έντασης της πάνω και της κάτω ζώνης, οι οποίες αντιπροσωπεύουν την πρόδρομη και την ώριμη μορφή του mrna αντίστοιχα, έγινε με το πρόγραμμα ImageJ και τα αποτελέσματα απεικονίζονται στα διαγράμματα. Αριστερά της κάθε ηλεκτροφόρησης απεικονίζεται σχηματικά το μεταγράφημα του μίνι-γονιδίου της προ-ινσουλίνης στην πρόδρομη και την ώριμη μορφή του. Τα δεδομένα αναπαριστούν τον μέσο όρο ± SE τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Γ.2.5. Έλεγχος επίδρασης της λυναμικίνης D στη δραστικότητα της SRPK1 Αμέσως επόμενο βήμα μας, αποτέλεσε ο έλεγχος της δραστικότητας της SRPK1 παρουσία της λυναμικίνης D. Έτσι, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ανίχνευσης της δραστικότητας της SRPK1 με in vitro φωσφορυλίωση του υποστρώματός της LBRNt(62-92) παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων (0-30 μμ) της ουσίας αλλά και παρουσία 5 μμ SRPIN340 για σύγκριση. Η μέθοδος περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.13. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου, βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue R-250 και ακολούθησε αυτοραδιογραφία (βλ. παραγράφους Β.2.26, Β.2.15 και Β.2.15). Οι ραδιενεργές ζώνες της πηκτής οι οποίες αντιστοιχούν στο υπόστρωμα GST-LBRNt(62-92) κόπηκαν και μετρήθηκαν σε υγρό σπινθηριστή και με τις μετρήσεις τις οποίες λάβαμε κατασκευάστηκαν τα αντίστοιχα διαγράμματα, θεωρώντας ως 100% την έκταση της φωσφορυλίωσης του GST-LBRNt(62-92) από την GST-SRPK1 παρουσία μόνο DMSO (δείγμα αναφοράς). 171

Σχήμα Γ.20. Έλεγχος της δραστικότητας της SRPK1 in vitro υπό την επίδραση της λυναμικίνης D και του γνωστού αναστολέα SRPIN 340. In vitro φωσφορυλίωση 1,5 μg του υποστρώματος GST-LBRNt(62-92) από 1,5 μg ανασυνδυασμένη GST-SRPK1 παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων Α) λυναμικίνης D και Β) 5 μμ SRPIN 340. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου, βάφτηκαν με Coomassie Brilliant Blue R-250 και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Στο σχήμα διακρίνεται μόνο το τμήμα της αυτοραδιογραφίας το οποίο αντιστοιχεί στην φωσφορυλίωση του GST-LBRNt(62-92). Οι ραδιενεργές ζώνες της πηκτής πολυακρυλαμιδίου οι οποίες αντιστοιχούν στο υπόστρωμα GST-LBRNt(62-92) κόπηκαν και μετρήθηκαν σε υγρό σπινθηριστή. Με τα αποτελέσματα κατασκευάστηκαν τα αντίστοιχα διαγράμματα θεωρώντας ως 100% την έκταση της φωσφορυλίωσης του GST-LBRNt(62-92) από την GST-SRPK1 παρουσία μόνο DMSO (δείγμα αναφοράς). Τα δεδομένα αναπαριστούν τον μέσο όρο ± SE τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Στο Σχήμα Γ.20.Α, παρατηρούμε ότι η δραστικότητα της SRPK1, παραμένει αμετάβλητη με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων λυναμικίνης D, σε αντίθεση με την μεγάλη αναστολή της δραστικότητας της κινάσης μετά από επίδραση 5 μμ SRPIN340, όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.20.Β. Γ.2.6. Μελέτη της επίδρασης της λυναμικίνης D στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές Ένας κρίσιμος παράγοντας ρύθμισης της δραστικότητας της SRPK1 είναι η κατανομή της μέσα στο κύτταρο. Για τον παραπάνω λόγο, προχωρήσαμε σε έλεγχο της υποκυτταρικής εντόπισης της κινάσης παρουσία της λυναμικίνης D στις κυτταρικές σειρές HeLa, A549 και T98G. Συγκεκριμένα, σε καλλιέργειες HeLa, A549 και T98G κυττάρων σε τρυβλίο 24 οπών (4 x 10 4 κύτταρα/οπή) πάνω σε καλυπτρίδες προστέθηκαν 30 μμ λυναμικίνης D ή μόνο DMSO (κύτταρα αναφοράς). Μετά την επώαση των 172

κυττάρων για 48 ώρες με την ουσία ακολούθησε δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό της ενδογενούς SRPK1, με τη χρήση μονοκλωνικού anti-srpk1 αντισώματος και του δεύτερου αντισώματος Alexa 488 το οποίο δίνει πράσινο φθορισμό, ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI το οποίο δίνει μπλε φθορισμό. Η διαδικασία περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.29. Στο Σχήμα Γ.21, βλέπουμε τις εικόνες των ανοσοφθορισμών απουσία (αριστερά) και παρουσία (δεξιά) της λυναμικίνης D και όπως μπορούμε να παρατηρήσουμε η τελευταία δεν επηρεάζει την υποκυτταρική κατανομή της SRPK1, με την κινάση να παραμένει στο κυτταρόπλασμα με ένα μικρό μόνο κλάσμα της στον πυρήνα και στις τρεις κυτταρικές σειρές οι οποίες ελέγχθηκαν. Σχήμα Γ.21. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της ενδογενούς SRPK1 σε HeLa, A549 και Τ98 κύτταρα, υπό την επίδραση λυναμικίνης D. Σε HeLa, A549 και Τ98 κύτταρα προστέθηκαν είτε DMSO (αριστερά) είτε 30 μμ λυναμικίνης (δεξιά) και επωάστηκαν για 48 ώρες. O εντοπισμός της ενδογενούς SRPK1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονοκλωνικού anti- SRPK1 αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το FITC-conjugated goat antimouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Κλίμακα:10 μμ. Γ.2.7. Έλεγχος επίδρασης λυναμικίνης D στην έκφραση της SRPK1 Αφού η λυναμικίνη D δεν επηρεάζει τη δραστικότητα και την υποκυτταρική κατανομή της SRPK1, θελήσαμε να ελέγξουμε αν η ουσία αυτή επάγει την αύξηση των επιπέδων της SRPK1 στα κύτταρα, επηρεάζοντας με αυτόν τον τρόπο τη διαδικασία του ματίσματος. 173

Σε πρώτη φάση, ελέγξαμε τη σχετική έκφραση του mrna της SRPK1 με RT-PCR παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της λυναμικίνης D. Για το σκοπό αυτό, επιδράσαμε σε καλλιέργεια HeLa κυττάρων σε τρυβλίο 12 οπών (10 5 κύτταρα/οπή) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της λυναμικίνης D (10, 20 και 30 μμ) και συλλέχθηκε το συνολικό RNA από τα κύτταρα μετά από 24 ώρες, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.20. Ακολούθησε η αντίστροφη μεταγραφή του με τη μέθοδο της RT-PCR ενισχύοντας το cdna της SRPK1 και της ακτίνης (ως γονίδιο αναφοράς) με κατάλληλους εκκινητές όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.21. Στο Σχήμα Γ.22.Α φαίνονται τα προϊόντα της αντίδρασης μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης (βλ. παράγραφο Β.2.9.) με το κομμάτι της SRPK1 να εμφανίζεται στο αναμενόμενο μέγεθος των 150 bp. Από την ποσοτικοποίηση των ζωνών μετά την κανονικοποίηση με την ακτίνη, κατασκευάστηκε διάγραμμα το οποίο αποτυπώνει την αύξηση των επιπέδων του mrna της SRPK1 κατά τουλάχιστον τρείς φορές. Σχήμα Γ.22. Έλεγχος της έκφρασης της SRPK1 σε HeLa κύτταρα υπό την επίδραση αυξανόμενων συγκεντρώσεων λυναμικίνης D. Α) Από HeLa κύτταρα, μετά από 24 ώρες επώασης με αυξανόμενες ποσότητες λυναμικίνης, συλλέχθηκε το συνολικό RNA και ακολούθησε RT-PCR με κατάλληλους εκκινητές σχεδιασμένους να ενισχύουν ένα κομμάτι 150 bp της SRPK1 και ένα κομμάτι 500 bp της ακτίνης. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε 1% πηκτή αγαρόζης το οποίο περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο. Η ποσοτικοποίηση της έντασης των ζωνών έγινε με το πρόγραμμα ImageJ και τα αποτελέσματα απεικονίζονται στα διαγράμματα μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς της ακτίνης. Β) Σε HeLa κύτταρα προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις λυναμικίνης D για 48 ώρες, συλλέχθηκαν τα ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και παρασκευάστηκαν δείγματα τα οποία ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε Western blot ανάλυση και ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνικών επιπέδων των SRPK1 και GAPDH με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η ένταση των ζωνών μετρήθηκε με το πρόγραμμα ImageJ. H έκφραση των 174

πρωτεϊνικών επιπέδων της SRPK1 εμφανίζεται στα διαγράμματα μετά από κανονικοποίηση με την πρωτεΐνη αναφοράς GAPDH. Τα δεδομένα αναπαριστούν τον μέσο όρο ± SE τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Στη συνέχεια, ελέγξαμε τα πρωτεϊνικά επίπεδα της SRPK1 παρουσία της λυναμικίνης D. Στην περίπτωση αυτή, σε καλλιέργεια HeLa κυττάρων σε τρυβλίο 12 οπών (10 5 κύτταρα/οπή) επιδράσαμε με αυξανόμενες ποσότητες λυναμικίνης D (5, 10, 20 και 30 μμ). Μετά το πέρας 48 ωρών επώασης των κυττάρων με την ουσία, συλλέχθηκαν ολικά πρωτεϊνικά κύτταρα, παρασκευάστηκαν δείγματα με 100 μg πρωτεΐνης και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες σε πηκτή ακρυλαμιδίου (βλ. παραγράφους Β.2.24, Β.2.25 και Β.2.26). Στη συνέχεια έγινε Western blot ανάλυση και η ανοσοανίχνευση της ενδογενούς SRPK1 και GAPDH πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα απέναντί τους (βλ. παραγράφους Β.2.27 και Β.2.28). Στο Σχήμα Γ.22.Β, βλέπουμε τα αποτελέσματα του πειράματος και μπορούμε να συμπεράνουμε και ποιοτικά από την εικόνα αλλά και ποσοτικά από το διάγραμμα το οποίο προκύπτει μετά από μέτρηση της έντασης των ζωνών της SRPK1 και κανονικοποίηση των τιμών με τις αντίστοιχες της GAPDH, ότι η λυναμικίνη D αυξάνει τα επίπεδα της κινάσης κατά περίπου 1,9 φορές. 175

Γ.3. Μελέτη των μοριακών μηχανισμών οι οποίοι ρυθμίζουν την υποκυτταρική κατανομή της SRPK1 Μέχρι και σήμερα παραμένει ασαφής ο τρόπος με τον οποίο κατανέμεται η SRPK1 μέσα στο κύτταρο αλλά και ο μηχανισμός ο οποίος τον καθορίζει. Ο σκοπός της παρούσας ενότητας πειραμάτων ήταν ο έλεγχος διαφόρων παραγόντων οι οποίοι μπορεί να επηρεάζουν την υποκυτταρική εντόπιση της κινάσης αλλά και η εξέταση δύο πιθανών μοριακών μηχανισμών οι οποίοι θα μπορούσαν να την καθορίζουν. Δεσπόζουσα θέση στις μεθόδους οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για την επίτευξη του στόχου της παρούσας ενότητας, κατέχει ο έμμεσος ανοσοφθορισμός. Αναλυτικά η μεθοδολογία η οποία ακολουθείται περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.29. Οποιεσδήποτε μεταβολές συναντώνται στο εκάστοτε πείραμα θα αναφέρονται στην περιγραφή του αλλά οι επαναλαμβανόμενες λεπτομέρειες της μεθοδολογίας παραλείπονται. Γ.3.1. Διερεύνηση της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1 υπό την επίδραση στρεσογόνων παραγόντων Δεδομένου, ότι έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι κάτω από συνθήκες στρες ένα σημαντικό ποσοστό της SRPK1 μετατοπίζεται στον πυρήνα (Zhong et al. 2009), θελήσαμε να ελέγξουμε την επίδραση στρεσογόνων παραγόντων στην υποκυτταρική κατανομή της κινάσης. Για το σκοπό αυτό, διεξήχθησαν πειράματα ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση της ενδογενούς αλλά και της υπερεκφρασμένης SRPK1 σε κύτταρα HeLa υπό την επίδραση οξειδωτικού στρες με προσθήκη H2O2 αλλά και υπό την επίδραση του γενοτοξικού παράγοντα 5-φθοροουρακίλης (5-FU). Αρχικά, σε καλλιέργεια HeLa κύτταρων σε τρυβλίο 24 οπών (4 x 10 4 κύτταρα/οπή) προστέθηκαν είτε 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν την μονιμοποίηση των κυττάρων με παραφορμαλδεΰδη. Ακολούθησε δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό της ενδογενούς SRPK1, με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος anti-srpk1 και του δεύτερου αντισώματος Alexa 488 το οποίο δίνει πράσινο φθορισμό ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο το οποίο δίνει κόκκινο φθορισμό. 176

Σχήμα Γ.23. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της ενδογενούς SRPK1 σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση 5-FU και H2O2. Σε HeLa κύτταρα προστέθηκαν είτε 50μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. O εντοπισμός της ενδογενούς SRPK1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονοκλωνικού anti-srpk1 αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10 μμ. Όπως παρατηρούμε στο Σχήμα Γ.23, στα κύτταρα αναφοράς όπου δεν έχουμε επιδράσει με καμία ουσία, η SRPK1 κατανέμεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα με ένα πολύ μικρό κλάσμα της να βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων. Αντίθετα, στα κύτταρα στα οποία έχουμε επιδράσει με τους στρεσογόνους παράγοντες βλέπουμε την μετακίνηση του μεγαλύτερου κλάσματος της κινάσης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Συνακόλουθα με τα προηγούμενα ήταν και τα αποτελέσματα των έμμεσων ανοσοφθορισμών για την υποκυτταρική εντόπιση της υπερεκφρασμένης FLAG-SRPK1 (Σχήμα Γ.24). Στα πλαίσια αυτού του πειράματος, καλλιέργεια HeLa κύτταρων σε τρυβλίο 24 οπών (4 x 10 4 κύτταρα/οπή) επιμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2- SRPK1 (βλ. παράγραφο Β.2.23.) και πριν ολοκληρωθούν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση στα κύτταρα προστέθηκαν είτε 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. Ακολούθησε έμμεσος ανοσοφθορισμός των 177

κυττάρων για τον εντοπισμό της υπερεκφρασμένης FLAG-SRPK1 χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό anti-flag αντίσωμα και ως δεύτερο αντίσωμα το Alexa 488. Σχήμα Γ.24. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της υπερεκφρασμένης FLAG- SRPK1 σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση 5-FU και H2O2. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2-srpk1. Πριν ολοκληρωθούν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση στα κύτταρα προστέθηκαν είτε 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. O εντοπισμός της FLAG-SRPK1 έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10 μμ. Από τα παραπάνω πειράματα γίνεται αντιληπτό ότι η ενδογενής αλλά και η υπερεκφρασμένη SRPK1 ακολουθούν το ίδιο μοτίβο υποκυτταρικής εντόπισης, με την κινάση να κατανέμεται στο κυτταρόπλασμα υπό φυσιολογικές συνθήκες ενώ σε στρεσογόνα ερεθίσματα να μετακινείται στον πυρήνα. Γ.3.2. Ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης ιστόνης γ-h2ax μετά από επίδραση στρεσογόνων παραγόντων Κατά καιρούς, η ερευνητική μας ομάδα έχει ελέγξει την επίδραση πολλών παραγόντων οι οποίοι προκαλούν στρες στα κύτταρα και μεταβάλουν την 178

υποκυτταρική κατανομή της SRPK1. Για να διερευνήσουμε όμως τι κοινό επιφέρει η προσθήκη αυτών των ουσιών σε HeLa κύτταρα, οδηγηθήκαμε στην ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης ιστόνης H2AX. Η ιστόνη αυτή φωσφορυλιώνεται στη σερίνη 139 αμέσως μετά την επαγωγή δίκλωνων θραύσεων στο μόριο του DNA ( DSBs: Double Strand Breaks) δημιουργώντας την γ-η2αχ. Η χρήση φθοριζόντων αντισωμάτων ειδικών για τη γ-η2αχ μας δίνει τη δυνατότητα ανίχνευσης των DSBs στον πυρήνα του κυττάρου μέσω των γ-h2ax εστιών φθορισμού (γh2ax foci). Σε καλλιέργεια HeLa κυττάρων σε τρυβλίο 24 οπών (3 x 10 4 κύτταρα/οπή) προστέθηκαν: 60 mm σορβιτόλη για 1 ώρα, 20 μμ cis-πλατίνης για 24 ώρες, 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, 50 mm H2O2 για 1 ώρα και 1%, 2% και 3% φορμαλδεΰδης για 5 λεπτά. Στην περίπτωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου είχε προηγηθεί στέρηση ορού πριν την προσθήκη του. Η προσθήκη τριών συγκεντρώσεων φορμαλδεΰδης πραγματοποιήθηκε ακριβώς πριν την έναρξη των φθορισμών σε αντικατάσταση της συνήθους μονιμοποίησης των κυττάρων με παραφορμαλδεΰδη. Ακολούθησε δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό της γ-η2αχ με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος anti-γ-η2αχ. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. 179

180

Σχήμα Γ.25. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της ενδογενούς γ-h2ax ιστόνης σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση διαφόρων παραγόντων στρες. Σε HeLa κύτταρα προστέθηκαν με τη σειρά όπως εμφανίζονται στο σχήμα: 60 mm σορβιτόλη για 1 ώρα, 20 μμ cis-πλατίνης για 24 ώρες, 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, 50 mm H2O2 για 1 ώρα και 1%, 2% και 3% φορμαλδεΰδης για 5 λεπτά (σε αντικατάσταση της συνήθους μονιμοποίησης των κυττάρων). O εντοπισμός της ενδογενούς γ-η2αχ φωσφορυλιωμένης ιστόνης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονοκλωνικού anti- Η2ΑΧ αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10μΜ Στο Σχήμα Γ.25 βλέπουμε την ανίχνευση των εστιών γ-η2αχ σε κάθε συνθήκη, οι οποίες έμμεσα σχετίζονται με την παρουσία δίκλωνων θραύσεων στο DNA. Στα κύτταρα αναφοράς στην πρώτη σειρά του σχήματος δεν ανιχνεύτηκε γ-η2αχ. Η προσθήκη σορβιτόλης είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία μερικών εστιών γ-η2αχ ενώ μεγαλύτερη συγκέντρωση εστιών γ- Η2ΑΧ είχαμε στις περιπτώσεις προσθήκης cis-πλατίνης, 5-FU και Η2Ο2. Στη συνθήκη της μονιμοποίησης των κυττάρων με φορμαλδεΰδη, παρατηρούμε ότι όσο αυξάνεται η συγκέντρωση της φορμαλδεΰδης τόσο μειώνονται οι ανιχνεύσιμες εστίες γ-η2αχ, πιθανώς λόγω της αποτελεσματικότερης μονιμοποίησης των κυττάρων. Να σημειώσουμε ότι η εμφάνιση εστιών γ-η2αχ, οι οποίες προκαλούνται από την προσθήκη των παραπάνω παραγόντων, είναι ανάλογη της μετακίνησης της SRPK1 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα του κυττάρου. Τα δεδομένα αυτά δεν παρουσιάζονται καθώς έχουν συμπεριληφθεί στη διδακτορική διατριβή της Μαρίας Κουτρουμάνη. Γ.3.3. Μελέτη του ρόλου την συνδετικής περιοχής του μορίου της SRPK1 στην υποκυτταρική εντόπισή της Έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι η συνδετική αλληλουχία του μορίου της SRPK1 διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην υποκυτταρική κατανομή της κινάσης (Ding et al. 2006; Zhong et al. 2009). Θέλοντας να επιβεβαιώσουμε αυτά τα δεδομένα, ελέγξαμε την υποκυτταρική κατανομή της SRPK1 και του μεταλλάγματός της από το οποίο είχε αφαιρεθεί η ενδιάμεση συνδετική αλληλουχία (SRPK1 Δspacer, βλ. παράγραφο Β.1.2.). Κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν είτε με τον πλασμιδιακό φορέα pflag- CMV-2-SRPK1 είτε με τον pflag-cmv-2-srpk1-δspacer και επωάστηκαν για 48 ώρες, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. Ακολούθησε έμμεσος ανοσοφθορισμός για τον εντοπισμό της FLAG-SRPK1 με τη χρήση 181

μονοκλωνικού αντισώματος anti-flag. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. Σχήμα Γ.26. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της υπερεκφρασμένης FLAG- SRPK1 και του μεταλλάγματος FLAG-SRPK1-Δspacer σε HeLa κύτταρα. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2-srpk1 και pflag-cmv-2-srpk1-δspacer και επωάστηκαν για 48 ώρες. O εντοπισμός της FLAG-SRPK1 έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10μΜ Όπως φαίνεται και στο Σχήμα Γ.26, το μετάλλαγμα της SRPK1 από το οποίο απουσιάζει η συνδετική αλληλουχία, δεν συγκρατείται στο κυτταρόπλασμα αλλά μεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου. Γ.3.4. Έλεγχος της πρωτεϊνικής έκφρασης της SRPK1 υπό την επίδραση 5-FU και H2O2 Στην προηγούμενη ενότητα πειραμάτων είχαμε ενδείξεις ότι η επίδραση με 5- FU στις εξεταζόμενες γλοιωματικές σειρές επέφερε μείωση των επιπέδων έκφρασης της ενδογενούς SRPK1. Με αφορμή αυτήν την παρατήρηση, θελήσαμε να ελέγξουμε τα επίπεδα έκφρασης της ενδογενούς και υπερεκφρασμένης SRPK1 υπό την επίδραση 5-FU και H2O2 στην κυτταρική σειρά HeLa. Για τον έλεγχο της ενδογενούς SRPK1, 10 4 κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 12 οπών και προστέθηκαν σε αυτά είτε 50 μg/ml 5- FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. Για τις ανάγκες του ελέγχου της υπερεκφρασμένης SRPK1, 7 x 10 4 κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 12 οπών και επιμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2-182

SRPK1, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. Πριν ολοκληρωθούν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση, στα κύτταρα προστέθηκαν είτε 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. Για τον έλεγχο της έκφρασης των κινασών, ακολούθησε και στις δύο περιπτώσεις συλλογή ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων, υπολογίστηκε η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης σε κάθε εκχύλισμα με τη μέθοδο Bradford (βλ. παράγραφο Β.2.25.) και παρασκευάστηκαν δείγματα τα οποία περιείχαν 100 μg πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου (βλ. παράγραφο Β.2.26) και ακολούθησε Western blot ανάλυση (βλ. παράγραφο Β.2.27) και ανοσοανίχνευση (βλ. παράγραφο Β.2.28) της ενδογενούς SRPK1 και της FLAG-SRPK1, αντίστοιχα, με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Σχήμα Γ.27. Έλεγχος πρωτεϊνικής έκφρασης της ενδογενούς SRPK1 και της υπερεκφρασμένης FLAG-SRPK1 σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση 5-FU και H2O2. Αριστερά: Σε HeLa κύτταρα προστέθηκαν είτε 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. Δεξιά: HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2- SRPK1. Πριν ολοκληρωθούν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση στα κύτταρα προστέθηκαν είτε 50 μg/ml 5-FU για 36 ώρες, είτε 50 mm H2O2 για 1 ώρα. Και στις δύο περιπτώσεις, συλλέχθηκαν τα ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και παρασκευάστηκαν δείγματα τα οποία ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε Western blot ανάλυση και ανοσοανίχνευση της ενδογενούς SRPK1 και της FLAG-SRPK1, αντίστοιχα, με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Όπως παρατηρούμε στο Σχήμα Γ.27, η επίδραση του υπεροξειδίου του υδρογόνου, επέφερε μια μικρή μείωση των επιπέδων έκφρασης και της ενδογενούς SRPK1 και της υπερεκφρασμένης FLAG-SRPK1. Η επίδραση όμως του γενοτοξικού παράγοντα 5-FU, μείωσε δραματικά τα επίπεδα της κινάσης, είτε της ενδογενούς, είτε της υπερεκφρασμένης. Για τον λόγο αυτό, στις μελέτες της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1 προτιμήθηκε η χρήση του H2O2 ως παράγοντα στρες αντί του 5-FU. 183

Γ.3.5. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων SRPK1-326Α, SRPK1-408Α και SRPK1-326Α/408Α υπό την επίδραση Η2Ο2 Στα πλαίσια της διδακτορικής της διατριβής, η Μαρία Κουτρουμάνη, βρήκε ότι η θρεονίνη 326 και η σερίνη 408 της συνδετικής αλληλουχίας της SRPK1 αποτελούν πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης (Κουτρουμάνη Μαρία 2016). Η αντικατάσταση αυτών των δύο αμινοξέων με αλανίνη είχε ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της μετατόπισης της SRPK1 στον πυρήνα μετά από επίδραση του 5-FU. Σε συνέχεια αυτής της μελέτης και με δεδομένη πλέον την μεγάλη επίπτωση της επίδρασης του 5-FU στην έκφραση της SRPK1, θελήσαμε να επαναλάβουμε τα πειράματα με αυτά τα μεταλλάγματα χρησιμοποιώντας όμως αντί του 5-FU, το Η2Ο2. Για τον σκοπό αυτό, HeLa κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 24 οπών με ειδικές καλυπτρίδες (4 x 10 4 κύτταρα/οπή) και επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2-srpk1 ή pflag-cmv-2-srpk1-326a, pflag-cmv-2-srpk1-408a ή με το διπλό μετάλλαγμα pflag-cmv-2- SRPK1-326/408A με την μέθοδο η οποία αναλύεται στην παράγραφο Β.2.23. Ακολούθησαν 48 ώρες επώασης των κυττάρων μετά την επιμόλυνση και προσθήκη 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν την μονιμοποίηση. Για τον εντοπισμό της υπερεκφρασμένης SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της, πραγματοποιήθηκε έμμεσος ανοσοφθορισμός, χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό anti-flag ως πρώτο αντίσωμα και το Alexa 488 ως δεύτερο αντίσωμα. 184

Σχήμα Γ.28. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων SRPK1-326A, SRPΚ1-408A και SRPK1-326/408A σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση H2O2. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2-srpk1, pflag-cmv-2-srpk1-326a, pflag-cmv-2-srpk1-408a και pflag-cmv-2-srpk1-326/408a. Ακολούθησαν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση και στα κύτταρα προστέθηκαν 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν την μονιμοποίηση. O εντοπισμός της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10 μμ. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται στις εικόνες του Σχήματος Γ.28 και όπως παρατηρούμε, τα μεταλλάγματα, όπως και η αγρίου τύπου SRPK1 βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα υπό φυσιολογικές συνθήκες. Με την επίδραση όμως οξειδωτικού στρες (προσθήκη Η2Ο2), η κινάση εισέρχεται στον πυρήνα, ενώ τα μεταλλάγματα στις πιθανές αυτές θέσεις φωσφορυλίωσης, αδυνατούν να εισέλθουν. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι η φωσφορυλίωση της SRPK1 στη θρεονίνη 326 και στη σερίνη 408 είναι απαραίτητη για την είσοδό της στον πυρήνα κάτω από συνθήκες στρες. Γ.3.6. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων SRPK1-326D, SRPK1-408D και SRPK1-326D/408D υπό την επίδραση H2O2 Προκειμένου να ελεγχθεί αν η φωσφορυλίωση της θρεονίνης 326 και της σερίνης 408 είναι ικανή από μόνη της ως τροποποίηση να προκαλέσει τη μετατόπιση της SRPK1 στον πυρήνα κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα της SRPK1 στα οποία τα δύο αυτά αμινοξέα μεταλλάχθηκαν προς ασπαραγινικό 185

οξύ (Κουτρουμάνη Μαρία 2016). Η μετάλλαξη σε ασπαραγινικό οξύ θεωρείται μιμητική κατάσταση της φωσφορυλίωσης. Για το λόγο ο οποίος αναπτύχθηκε προηγουμένως, χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας στρες το Η2Ο2. HeLa κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 24 οπών με ειδικές καλυπτρίδες (4 x 10 4 κύτταρα/οπή) και επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2-srpk1 ή pflag-cmv-2-srpk1-326d, pflag-cmv-2- SRPK1-408D ή με το διπλό μετάλλαγμα pflag-cmv-2-srpk1-326/408d (βλ. παράγραφο Β.2.23). Μετά από 48 ώρες επώασης των κυττάρων προστέθηκαν 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν την μονιμοποίηση. Ακολούθησε έμμεσος ανοσοφθορισμός με την χρήση του μονοκλωνικού anti-flag ως πρώτο αντίσωμα και το Alexa 488 ως δεύτερο αντίσωμα. Στο Σχήμα Γ.29 παρατηρούμε ότι τα φωσφομιμητικά μεταλλάγματα ακολουθούν την συμπεριφορά της SRPK1 ως προς την υποκυτταρική κατανομή της, χωρίς όμως να εισέρχονται υπό φυσιολογικές συνθήκες από μόνα τους στον πυρήνα. Έτσι, η προσομοίωση της φωσφορυλίωσης η οποία έγινε δεν είναι ικανή από μόνη της να οδηγήσει την κινάση στον πυρήνα. Σχήμα Γ.29. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της FLAG-SRPK1 και των φωσφομιμητικών μεταλλαγμάτων SRPK1-326D, SRPΚ1-408D και SRPK1-326/408D σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση H2O2. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag- CMV-2-SRPK1, pflag-cmv-2-srpk1-326d, pflag-cmv-2-srpk1-408d και pflag-cmv- 2-SRPK1-326/408D. Ακολούθησαν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση και στα κύτταρα προστέθηκαν 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν την μονιμοποίηση. O εντοπισμός της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Ως 186

δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10 μμ. Γ.3.7. Εύρεση πιθανών θέσεων ουβικιτίνωσης στο μόριο της SRPK1 Μετά την αναγνώριση της φωσφορυλίωσης του μορίου της SRPK1 ως μια αναγκαία μετα-μεταφραστική τροποποίηση για την μετακίνηση της κινάσης στον πυρήνα, η οποία όμως δεν είναι ικανή από μόνη της να δώσει το κατάλληλο σήμα για αυτήν την μετατόπιση, οδηγηθήκαμε στην αναζήτηση κάποιας συμπληρωματικής τροποποίησης, η οποία απαιτείται μαζί με τη φωσφορυλίωση για τη μετατόπιση της SRPK1 στον πυρήνα παρουσία στρες. Υπάρχουν αρκετές αναφορές, με την ουβικιτίνωση να εμπλέκεται στη μετατόπιση πρωτεϊνών στον πυρήνα (Rodríguez 2014; Wang, Pernet, and Lee 2012). Επιπλέον, οι Ε3 λιγάσες, οι οποίες καταλύουν την ένωση της ουβικιτίνης με το υπόστρωμα, κατά την ουβικιτίνωση συγκεκριμένων λυσινών απαιτούν ένα όξινο μικροπεριβάλλον γύρω από τη λυσίνη στόχο, προϋπόθεση η οποία μπορεί να πληρείται από τη φωσφορυλίωση γειτονικών αμινοξέων. Σύμφωνα με τον αλγόριθμο UbPred (http://www.ubpred.org) πρόβλεψης θέσεων ουβικιτίνωσης (Radivojac et al. 2010) υπάρχουν τέσσερις τέτοιες θέσεις, οι οποίες πληρούν τα κριτήρια του αλγορίθμου για ουβικιτίνωση στο μόριο της SRPK1 και μάλιστα αυτές βρίσκονται όλες στη συνδετική αλληλουχία. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα Γ.30, οι Lys318, Lys324, Lys329 και Lys377 θέσεις, αποτελούν τις τέσσερις επικρατέστερες για ουβικιτίνωση λυσίνες, σύμφωνα με τον αλγόριθμο UbPred. Η γειτονία των θέσεων Lys318, Lys324, Lys329 με την Thr326, καθώς και το γεγονός ότι αντικατάσταση της Thr326 αλλά και της Ser408 στο UbPred με το φωσφομιμητικό αμινοξύ ασπαραγινικό, αυξάνει την πιθανότητα ουβικιτίνωσης, καθιστούν τις θέσεις αυτές πιθανούς στόχους ουβικιτίνωσης και την υπόθεσή μας άξια διερεύνησης. 187

MERKVLALQARKKRTKAKKDKAQRKSETQHRGSAPHSESDLPEQEEEILGSDDDEQ EDPNDYCKGGYHLVKIGDLFNGRYHVIRKLGWGHFSTVWLSWDIQGKKFVAMKVVK SAEHYTETALDEIRLLKSVRNSDPNDPNREMVVQLLDDFKISGVNGTHICMVFEVLG HHLLKWIIKSNYQGLPLPCVKKIIQQVLQGLDYLHTKCRIIHTDIKPENILLSVNEQYIRR LAAEATEWQRSGAPPPSGSAVSTAPQPKPADKMSKNKKKKLKKKQKRQAELLEKR MQEIEEMEKESGPGQKRPNKQEESESPVERPLKENPPNKMTQEKLEESSTIGQDQT LMERDTEGGAAEINCNGVIEVINYTQNSNNETLRHKEDLHNANDCDVQNLNQESSFL SSQNGDSSTSQETDSCTPITSEVSDTMVCQSSSTVGQSFSEQHISQLQESIRAEIPC EDEQEQEHNGPLDNKGKSTAGNFLVNPLEPKNAEKLKVKIADLGNACWVHKHFTEDI QTRQYRSLEVLIGSGYNTPADIWSTACMAFELATGDYLFEPHSGEEYTRDEDHIALIIE LLGKVPRKLIVAGKYSKEFFTKKGDLKHITKLKPWGLFEVLVEKYEWSQEEAAGFTDF LLPMLELIPEKRATAAECLRHPWLNS Output: Residue Score Ubiquitinated Residue Score Ubiquitinated 4 0.22 No 272 0.31 No 12 0.14 No 273 0.28 No 13 0.17 No 274 0.30 No 16 0.15 No 276 0.29 No 18 0.12 No 284 0.68 Yes Low confidence 19 0.14 No 294 0.68 Yes Low confidence 21 0.14 No 301 0.65 Yes Low confidence 25 0.24 No 305 0.67 Yes Low confidence 64 0.60 No 318 0.85 Yes High confidence 71 0.30 No 324 0.92 Yes High confidence 85 0.36 No 329 0.94 Yes High confidence 103 0.44 No 377 0.84 Yes High confidence 104 0.41 No 470 0.80 Yes Medium confidence 109 0.28 No 472 0.79 Yes Medium confidence 112 0.22 No 486 0.54 No 129 0.50 No 490 0.37 No 152 0.28 No 492 0.41 No 174 0.31 No 494 0.29 No 178 0.18 No 506 0.37 No 190 0.23 No 575 0.26 No 191 0.23 No 579 0.11 No 206 0.54 No 585 0.25 No 215 0.46 No 588 0.22 No 258 0.44 No 593 0.12 No 262 0.43 No 594 0.26 No 265 0.40 No 598 0.12 No 188

267 0.37 No 602 0.22 No 268 0.37 No 604 0.39 No 269 0.39 No 615 0.62 Yes Low confidence 270 0.36 No 640 0.37 No Σχήμα Γ.30. Πρόβλεψη των πιθανών θέσεων ουβικιτίνωσης στο μόριο της SRPK1 σύμφωνα με τον αλγόριθμο UbPred (http://www.ubpred.org). Στο πάνω μέρος αποτυπώνεται η αμινοξική αλληλουχία της SRPK1 με σκιασμένες όλες την λυσίνες. Στο κάτω μέρος βλέπουμε το κάθε αμινοξικό κατάλοιπο λυσίνης με την αντίστοιχη πιθανότητα να υποστεί ουβικιτίνωση σύμφωνα με τον αλγόριθμο UbPred. Με κόκκινη σκίαση διακρίνονται οι τέσσερις επικρατέστερες για ουβικιτίνωση λυσίνες, οι οποίες είναι οι 318, 324, 329 και 377. Οι λυσίνες λοιπόν, οι οποίες επιλέχθηκαν να μεταλλαχθούν ήταν η λυσίνη 329 και η λυσίνη 377, οι οποίες και εμφάνιζαν τη μεγαλύτερη πιθανότητα ουβικιτίνωσης στο UbPred, όταν οι Thr326 και Ser408 αντικατασταθούν με το φωσφομιμητικό αμινοξύ ασπαραγινικό. Η θέση τους μέσα στο μόριο της SRPK1 όπως φαίνεται στο Σχήμα Γ.31 βρίσκεται στο κέντρο περίπου της συνδετικής αλληλουχίας. Σχήμα Γ.31. Αμινοξική ακολουθία της SRPK1. Στο σχήμα απεικονίζεται με γκρι σκίαση η αλληλουχία των δύο καταλυτικών περιοχών της κινάσης στην οποία παρεμβάλλεται η ενδιάμεση συνδετική αλληλουχία (χωρίς σκίαση). Με κόκκινο χρώμα διακρίνονται στην συνδετική αλληλουχία οι λυσίνες οι οποίες επιλέχθηκαν να μεταλλαχθούν σε αργινίνες σύμφωνα με τον αλγόριθμο πρόβλεψης θέσεων ουβικιτίνωσης. 189

Γ.3.8. Σημειακή μετάλλαξη των λυσινών 329 και 377 του μορίου της SRPK1 σε αργινίνες και έλεγχος έκφρασης των μεταλλαγμάτων Προκειμένου να μελετήσουμε τον ρόλο της ουβικιτίνωσης στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1 μεταλλάξαμε το μόριό της σημειακά στις θέσεις 329 και 377, αντικαθιστώντας τις λυσίνες αυτών των θέσεων σε αργινίνες, δεδομένου ότι η ουβικιτίνωση είναι μια τροποποίηση η οποία λαμβάνει χώρα αποκλειστικά σε λυσίνες. Η επιλογή της αργινίνης έγινε καθώς ανήκει και αυτή, όπως και η λυσίνη, στα αλκαλικά αμινοξέα. Οι σημειακές μεταλλάξεις αυτές έγιναν με τη μέθοδο η οποία περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.11. Ο πλασμιδιακός φορέας έκφρασης ο οποίος χρησιμοποιήθηκε είναι ο pflag-cmv-2 δίνοντας τη δυνατότητα κατά την έκφραση των μεταλλαγμάτων, οι αντίστοιχες πρωτεΐνες να φέρουν στο αμινο-τελικό τους άκρο το επίτοπο FLAG. Μετά την επιβεβαίωση της εισαγωγής των μεταλλάξεων με αλληλούχιση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων, ακολούθησε έλεγχος της έκφρασής τους στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Έτσι, καλλιέργεια HeLa κυττάρων σε τρυβλίο 12 οπών (7 x 10 4 κύτταρα/οπή) επιμολύνθηκε παροδικά είτε με τον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2-srpk1, είτε με τον pflag-cmv-2-srpk1-329r είτε με τον pflag-cmv-2-srpk1-377r με την μέθοδο της παραγράφου Β.2.23. Μετά το πέρας 48 ωρών από την επιμόλυνση των κυττάρων, συλλέχθηκαν ολικά πρωτεϊνικά κύτταρα, παρασκευάστηκαν δείγματα και ακολούθησε ηλεκτροφόρησή τους κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες σε πηκτή ακρυλαμιδίου (βλ. παραγράφους Β.2.24, Β.2.25 και Β.2.26). Στη συνέχεια έγινε η ανοσοαποτύπωση των ζωνών και η ανοσοανίχνευση του επίτοπου FLAG χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντί του (βλ. παραγράφους Β.2.27 και Β.2.28). 190

Σχήμα Γ.32. Έλεγχος πρωτεϊνικής έκφρασης της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της FLAG-SRPK1-329R και FLAG-SRPK1-377R σε HeLa κύτταρα. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2-srpk1, pflag-cmv-2-srpk1-329r και pflag-cmv-2-srpk1-377r. Μετά από 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση συλλέχθηκαν τα ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και παρασκευάστηκαν δείγματα τα οποία ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε Western blot ανάλυση και ανοσοανίχνευση της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Όπως βλέπουμε στο Σχήμα Γ.32, τα μεταλλάγματα της SRPK1 στις πιθανές θέσεις ουβικιτίνωσης 329 και 377, εκφράζονται επιτυχώς στα καρκινικά κύτταρα HeLa. Γ.3.9. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων SRPK1-329R και SRPK1-377R υπό την επίδραση H2O2 Θέλοντας να ελέγξουμε αν ισχύει η αρχική υπόθεση της ουβικιτίνωσης ως συμπληρωματική τροποποίηση πέραν της φωσφορυλίωσης, για την είσοδο της SRPK1 στον πυρήνα, ανιχνεύσαμε τα μεταλλάγματα αυτά με έμμεσο ανοσοφθορισμό κάτω από την επίδραση στρες. Πιο συγκεκριμένα, HeLa κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλίο 24 οπών (4 x 10 4 κύτταρα/οπή) και επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag- CMV-2-SRPK1 ή pflag-cmv-2-srpk1-329r ή pflag-cmv-2-srpk1-377r με τη μέθοδο, η οποία αναλύεται στην παράγραφο Β.2.23. Ακολούθησαν 48 ώρες επώασης των κυττάρων μετά την επιμόλυνση και προσθήκη 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν την μονιμοποίηση. Για τον εντοπισμό της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της, πραγματοποιήθηκε έμμεσος ανοσοφθορισμός χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό anti-flag ως πρώτο αντίσωμα και το Alexa 488 ως δεύτερο αντίσωμα. 191

Σχήμα Γ.33. Έμμεσος ανοσοφθορισμός της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων FLAG-SRPK1-329R και FLAG-SRPK1-377R σε HeLa κύτταρα, υπό την επίδραση H2O2. HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τους πλασμιδιακούς φορείς pflag-cmv-2-srpk1, pflag- CMV-2-SRPK1-329R και pflag-cmv-2-srpk1-377r. Ακολούθησαν 48 ώρες επώασης μετά την επιμόλυνση και στα κύτταρα προστέθηκαν 50 mm H2O2 για 1 ώρα πριν τη δοκιμή. O εντοπισμός της FLAG-SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού anti-flag αντισώματος. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το Alexa 488 anti-mouse (πράσινο) ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI-κόκκινο). Κλίμακα:10 μμ. Στο Σχήμα Γ.33 βλέπουμε αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποτελεσμάτων της δοκιμής. Παρατηρούμε ότι τα μεταλλάγματα της SRPK1 FLAG-SRPK1-329R και FLAG-SRPK1-377R ακολουθούν το μοτίβο της υποκυτταρικής εντόπισης της αγρίου τύπου κινάσης. Δηλαδή, σε φυσιολογικές συνθήκες κατανέμονται στο κυτταρόπλασμα, ενώ υπό συνθήκες στρες με την προσθήκη του H2O2 μετατοπίζονται στον πυρήνα του κυττάρου. Λαμβάνοντας υπόψιν την αρχική υπόθεση ότι κάποια από τις θέσεις αυτές (Lys329 ή Lys377) ουβικιτινιλιώνεται ως προϋπόθεση για την είσοδο της κινάσης στον πυρήνα, κάτι τέτοιο δεν μπορεί να επιβεβαιωθεί από τα πειράματα των ανοσοφθορισμών καθώς η έλλειψη των λυσινών στις δύο πιθανές θέσεις ουβικιτίνωσης θα οδηγούσε την κινάση να απωλέσει έστω μερικώς την ικανότητα εισόδου της στον πυρήνα. Εφόσον λοιπόν τα μεταλλάγματα συνεχίζουν να εισέρχονται στον πυρήνα όπως ακριβώς και η αγρίου τύπου SRPK1, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι οι λυσίνες αυτές δεν είναι καθοριστικές για την είσοδο της SRPK1 στον πυρήνα. 192