Μεθοδολογία Ασκήσεων ΚΕΦ. 2ο 1. Ασκήσεις με βάση το μηχανισμό αντιγραφής του DΝΑ. Το DΝΑ αντιγράφεται με ημισυντηρητικό τρόπο. Η κατεύθυνση της αντιγραφής είναι πάντα 5 3. Στο αρχικό μόριο δεν περιέχονται ραδιενεργά στοιχεία, όπως φώσφορος ή άζωτο. Όταν το DΝΑ αντιγράφεται σε περιβάλλον με ραδιενεργό 32 Ρ ή 15 Ν η κάθε θυγατρική αλυσίδα που σχηματίζεται αποτελείται από νουκλεοτίδια που περιέχουν ραδιενεργό 32 Ρ ή 15 Ν. Από ένα (1) μόριο DΝΑ μετά από κ αντιγραφές σε περιβάλλον με ραδιενεργό 32 Ρ ή 15 Ν θα έχουν σχηματιστεί 2 κ μόρια που θα αποτελούνται από 2 2 κ =2 κ+1 πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες από τις οποίες οι 2 2 κ - 2=2 κ+1-2 πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες φέρουν ραδιενεργό 32 Ρ ή 15 Ν, ενώ 2 πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες (οι αρχικές) δε θα περιέχουν ραδιενεργό 32 Ρ ή 15 Ν. Όταν το DΝΑ αντιγράφεται σε περιβάλλον με ραδιενεργό 35 S η κάθε θυγατρική αλυσίδα που σχηματίζεται αποτελείται από νουκλεοτίδια που δεν περιέχουν ραδιενεργό 35 S. (Το ραδιενεργό 35 S ενσωματώνεται μόνο στις πρωτεΐνες.) Χρήσιμα στην επίλυση αυτών των ασκήσεων είναι σχήματα που υποδεικνύουν τον ημισυντηρητικό τρόπο αντιγραφής, όπως το ακόλουθο (οι αλυσίδες με το κόκκινο χρώμα αντιπροσωπεύουν τις αλυσίδες των οποίων τα νουκλεοτίδια περιέχουν ραδιενεργό 32 Ρ ή 15 Ν). 2. Ασκήσεις στις οποίες ζητούνται τα άκρα ενός τμήματος DΝΑ, η μη κωδική αλυσίδα, το mrna, το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης στο μόριο του mrna, τα αντικωδικόνια των trna και ο αριθμός των αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Το DΝΑ αποτελείται από δύο (2) αλυσίδες, την κωδική που δεν μεταγράφεται και τη μη κωδική που μεταγράφεται. Η μεταγραφή γίνεται πάντα με κατεύθυνση 5 3. Η μη κωδική αλυσίδα του DΝΑ και το mrna είναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες. Η κωδική αλυσίδα του DΝΑ και το mrna είναι παράλληλες και σχεδόν πανομοιότυπες με εξαίρεση ότι στο mrna υπάρχει ουρακίλη αντί θυμίνης. Τα κωδικόνια έναρξης και λήξης της μετάφρασης του mrna και τα αντίστοιχά τους στην κωδική και στη μη κωδική αλυσίδα του DΝΑ φαίνονται στον παρακάτω πίνακα: Κωστανίκος Δημήτρης 1 Βιολόγος
mrna Μη κωδική αλυσίδα του DΝΑ Κωδική αλυσίδα του DΝΑ Κωδικόνιο έναρξης. 5 AUG 3 3 TAC 5 5 ATG 3 5 UAG 3 3 ATC 5 5 TAG 3 Κωδικόνια λήξης. 5 UGA 3 3 ACT 5 5 TGA 3 5 UAA 3 3 ATT 5 5 TAA 3 Για να εντοπίσουμε τα άκρα ενός τμήματος DΝΑ και ποια από τις δύο αλυσίδες είναι η μη κωδική «εργαζόμαστε» ως εξής: Αποφασίζουμε εάν θα αναζητήσουμε την κωδική ή τη μη κωδική αλυσίδα του DΝΑ. Αρχίζουμε να «διαβάζουμε» τη μία (1) από τις δύο (2) αλυσίδες του DΝΑ βάση-βάση από τα αριστερά προς τα δεξιά αναζητώντας το κωδικόνιο έναρξης. Εάν βρεθεί κωδικόνιο έναρξης τότε, από εκεί και κάτω, «διαβάζουμε» την αλυσίδα ανά τριπλέτα βάσεων αναζητώντας οπωσδήποτε ένα από τα κωδικόνια λήξης. Εάν δε βρεθεί κωδικόνιο έναρξης και κωδικόνιο λήξης τότε αρχίζουμε να διαβάζουμε με τον ίδιο τρόπο την αλυσίδα από τα δεξιά προς τα αριστερά. Εάν δε βρεθεί και πάλι κωδικόνιο έναρξης και κωδικόνιο λήξης τότε εξετάζουμε με τον ίδιο τρόπο την άλλη αλυσίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ακόμη και αν βρεθεί κωδικόνιο έναρξης και κωδικόνιο λήξης καθώς «διαβάζουμε» τη μια από τις δύο αλυσίδες προς μια κατεύθυνση (π.χ. από αριστερά προς τα δεξιά) η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται και προς την άλλη κατεύθυνση (από δεξιά προς τα αριστερά), αλλά και για τη δεύτερη αλυσίδα. Αυτό συμβαίνει γιατί υπάρχει πιθανότητα από το συγκεκριμένο τμήμα DNA να προκύπτουν περισσότερες από μία πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Παράδειγμα: Έστω το γονίδιο με την παρακάτω αλληλουχία βάσεων: TT CCGTATGCCC TTTGGC TACTAGCCC TCC AAGGCATACGGGAAACCGATGATCGGGAGG Να βρεθούν τα άκρα του γονιδίου. Απάντηση. Θα αναζητήσουμε τη μη κωδική αλυσίδα. Αρχίζουμε να «διαβάζουμε» την 1 η αλυσίδα από τα αριστερά προς τα δεξιά αναζητώντας κωδικόνιο έναρξης (3 TAC 5 ) και ένα από τα κωδικόνια λήξης (3 ATC 5, 3 ACT 5, 3 ATT 5 ) : TTCCGTATGCCCTTTGGC TAC TAG CCC TCC Βρέθηκε μόνο κωδικόνιο έναρξης. Αρχίζουμε να διαβάζουμε την 1 η αλυσίδα από τα δεξιά προς τα αριστερά. CCTCCCGATCATCGGTTTCCCGTATGCCTT. Δεν υπάρχει κωδικόνιο έναρξης. Αρχίζουμε να «διαβάζουμε» τη 2 η αλυσίδα από τα αριστερά προς τα δεξιά. AAGGCA TAC GGG AAA CCG ATG ATC GGGAGG Υπάρχει κωδικόνιο έναρξης και κωδικόνιο λήξης. Αν «διαβάζουμε» την ίδια αλυσίδα από τα δεξιά προς τα αριστερά τότε: GGAGGGCTAGTAGCCAAAGGGCA TAC GGA A Διαπιστώνουμε ότι υπάρχει μόνο κωδικόνιο έναρξης. Κατά συνέπεια μη κωδική είναι η 2 η αλυσίδα από τα αριστερά προς τα δεξιά, οπότε τα άκρα του γονιδίου έχουν ως εξής: 5 TT CCGT ATG CCC TTT GGC TAC TAG CCC TCC 3 3 AAGGCA TAC GGG AAA CCG ATG ATC GGGAGG 5 Αν ζητείται το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης στο μόριο του mrνα (δηλαδή το τμήμα του mrna που θα εκφραστεί σε αμινοξέα) τότε αυτό αρχίζει με το κωδικόνιο έναρξης και σταματά στο κωδικόνιο πριν από το κωδικόνιο λήξης. Αν ζητούνται τα αντικωδικόνια των trνα που συμμετέχουν στη μετάφραση, γράφουμε τριπλέτες βάσεων ριβονουκλεοτιδίων (δηλαδή ουρακίλη αντί θυμίνης) Κωστανίκος Δημήτρης 2 Βιολόγος
συμπληρωματικών των βάσεων των κωδικονίων, τις οποίες και χωρίζουμε με κόμματα ή κάθετες γραμμές, για να δείξουμε ότι είναι ανεξάρτητες μεταξύ τους. Δε γράφουμε αντικωδικόνιο για το κωδικόνιο λήξης. Ένα αμινοξύ κωδικοποιείται από ένα κωδικόνιο. Στο κωδικόνιο λήξης δεν αντιστοιχεί αμινοξύ. Το πρώτο αμινοξύ κάθε πολυπεπτιδικής αλυσίδας έχει ελεύθερο αμινικό άκρο και το τελευταίο έχει ελεύθερο καρβοξυλικό άκρο. Παράδειγμα: Έστω το γονίδιο με την παρακάτω αλληλουχία βάσεων: 5 TT CCGTATGCCC TTT GGCTACTAGCCCT CC 3 3 AAGGCATACGGGAAACCGATGATCGGGAGG 5 Να βρεθεί το mrna, το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης, τα αντικωδικόνια, τα αμινοξέα και τα άκρα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Απάντηση. Η μη κωδική αλυσίδα είναι η 2 η, οπότε το mrna που προκύπτει είναι το εξής: 5 UUCCGU AUG CCC UUU GGC UAC UAG CCCUCC 3 Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης είναι το εξής: 5 AUG CCC UUU GGC UAC 3 Τα αντικώδικόνια είναι τα εξής: 3 UAC 5, 3 GGG 5, 3 AAA 5, 3 CCG 5, 3 AUG 5 Η πολυπεπτιδική αλυσίδα που σχηματίζεται αποτελείται από 5 αμινοξέα και με βάση το γενετικό κώδικα είναι η εξής: NH 2 -met-pro-phe-gly-tyr-cooh 3. Ασκήσεις στις οποίες δίνεται ο αριθμός βάσεων ενός γονιδίου και ζητείται ο αριθμός των αζωτούχων βάσεων του πρόδρομου mrna, του ώριμου mrna, των εξωνίων, των κωδικονίων του ώριμου mrna, ο αριθμός των κωδικονίων και ο αριθμός των αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (μπορεί να δίνεται ο αριθμός των αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και να ζητείται ο αριθμός των βάσεων του γονιδίου που την κωδικοποιούν). Βάσεις πρόδρομου mrna= βάσεις μη κωδικής αλυσίδας DNA= βάσεις γονιδίου/2. Βάσεις ώριμου mrna = Βάσεις πρόδρομου mrna- βάσεις εσωνίων. Βάσεις κωδικονίων ώριμου mrna = Βάσεις ώριμου mrna - βάσεις 5 και 3 αμετάφραστων περιοχών (Δεν αφαιρούμε τις 3 βάσεις από το κωδικόνιο λήξης παρόλο που ανήκουν στην 3 αμετάφραστη περιοχή). Αριθμός κωδικονίων ώριμου mrna= Βάσεις κωδικονίων ώριμου mrna/3 (3 βάσεις δίνουν 1 κωδικόνιο). Αριθμός αμινοξέων πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας= Αριθμός κωδικονίων ώριμου mrna - κωδικόνιο λήξης (στο κωδικόνιο λήξης δεν αντιστοιχεί αμινοξύ). Ο αριθμός των αμινοξέων της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας που προκύπτει μπορεί να μειωθεί με την απομάκρυνση αμινοξέων (μεταμεταφραστική τροποποίηση) προκειμένου η αλυσίδα να γίνει λειτουργική πρωτεΐνη. Εάν δε δίνεται κάποιο δεδομένο π.χ. ο αριθμός των βάσεων των 5 και 3 αμετάφραστων περιοχών, κατά τους υπολογισμούς δεν το λαμβάνουμε υπόψη. Στην επίλυση των ασκήσεων μπορεί να βοηθήσει το παρακάτω σχήμα: Κωστανίκος Δημήτρης 3 Βιολόγος
Παράδειγμα: Δίνονται: βάσεις γονιδίου=140, βάσεις εσωνίων= 22. Να βρεθεί ο αριθμός των αμινοξέων της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας που προκύπτει. Απάντηση: Βάσεις πρόδρομου mrna= βάσεις μη κωδικής αλυσίδας DNA= βάσεις γονιδίου/2=140/2=70. Βάσεις ώριμου mrna = Βάσεις πρόδρομου mrna - βάσεις εσωνίων=70-22=48 Βάσεις κωδικονίων ώριμου mrna = Βάσεις ώριμου mrna - βάσεις 5 και 3 αμετάφραστων περιοχών=48 (επειδή οι βάσεις των 5 και 3 αμετάφραστων περιοχών δε δίνονται δεν τις λαμβάνουμε υπόψη). Αριθμός κωδικονίων ώριμου mrna= βάσεις κωδικονίων ώριμου mrna/3=48/3=16 Αριθμός αμινοξέων πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας= Αριθμός κωδικονίων ώριμου mrna - κωδικόνιο λήξης=16-1=15 Εάν δίνεται ο αριθμός των αμινοξέων μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας π.χ 4 αμινοξέα τότε ο ελάχιστος αριθμός κωδικονίων που είναι απαραίτητος για την κωδικοποίησή της είναι κατά ένα (1) μεγαλύτερος δηλαδή 5 κωδικόνια (συμπεριλαμβάνεται και το κωδικόνιο λήξης, αφού είναι απαραίτητο για τη λήξη της μετάφρασης). 4. Ασκήσεις στις οποίες ζητείται ο αριθμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών που σπάνε και σχηματίζονται κατά την ωρίμανση του mrνα. Τα εσώνια είναι ενδιάμεσες αλληλουχίες των γονιδίων και ως εκ τούτου ενδιάμεσες αλληλουχίες στο πρόδρομο mrνα. Αν ένα γονίδιο έχει x εσώνια, τότε έχει x + 1 εξώνια. Για την απομάκρυνση των x εσωνίων σπάνε 2x φωσφοδιεστερικοί δεσμοί. Για τη συρραφή x εξωνίων δημιουργούνται x-1 φωσφοδιεστερικοί δεσμοί. Παράδειγμα: Κωστανίκος Δημήτρης 4 Βιολόγος
Κατά την ωρίμανση ενός πρόδρομου mrνα που περιέχει 4 εσώνια (δηλαδή έχει 5 εξώνια) σπάνε 8 φωσφοδιεστερικοί δεσμοί για την απομάκρυνσή τους και δημιουργούνται 4 φωσφοδιεστερικοί δεσμοί για τη συρραφή των εξωνίων του. Κωστανίκος Δημήτρης 5 Βιολόγος