Παρασκευή Λίντα ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ, ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΟΥΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΩΝ ΜΥΚΟΠΛΑΣΜΑΤΩΝ. Η διαδικασία χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση και διαφορική τιτλοποίηση των δύο ειδών των ουρογεννητικών μυκοπλασμάτων δηλαδή των Ureaplasma urealyticum και Mycplasma hminis. ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Η διαδικασία βασίζεται σε συγκεκριμένες μεταβολικές ιδιότητες και στην φυσική αντοχή των ειδών μυκοπλάσματος. U.u: Υδρόλυση της ουρίας και ανθεκτικότητα στη lincmycin M. h: Υδρόλυση της αργινίνης και ανθεκτικότητα στην erythrmycin Η ανάπτυξη των ειδών παρουσιάζεται με την αλλαγή χρώματος του δείκτη Ph από κίτρινο-πορτοκαλί σε κόκκινο ροζ. Περιεχόμενα συσκευασίας Θρεπτικός ζωμός μεταφοράς (T brth) : 2 ml υγρού αντιδραστηρίου για τη μεταφορά των ουρογεννητικών μυκοπλασμάτων. Θρεπτικό υλικό καλλιέργειας (C medium) Λυοφιλοποιημένο θρεπτικό υλικό που περιέχει θρεπτικό ζωμό ppl εκχύλισμα ζύμης-κυστεïνη υπόστρωμα (ουρία και αργινίνη), εμπλουτιστικά, ορός αλόγου, μίγμα επιλεγμένων αντιβιοτικών και ερυθρό της φαινόλης. Strips: σειρά πλαστικών ειδικών θέσεων (βυθισμάτων) σφραγισμένων σε σακουλάκια αλουμινίου με αφυγραντικό. (εικόνες 1-2) Φιαλίδιο παραφίνης στειλεοί. Εικόνα (1) Εικόνα (2)
Περιγραφή θέσεων των strips (εικόνα 3 ) 1. C : Μάρτυρας ανάπτυξης 2. U.u. Ταυτοποίηση του είδους U.u. από δείγμα συγκέντρωσης > 10 4 CCU/ml 3. M.h: Ταυτοποίηση του είδους M.h. από δείγμα συγκέντρωσης > 10 4 CCU/ml 4. L: Δοκιμασία ανθεκτικότητας στη Lincmycin (8μg/ml) Είναι επίσης δοκιμασία ανίχνευσης U.u. σε χαμηλή συγκέντρωση> 10 3 CCU/ml. 5. E: Δοκιμασία ανθεκτικότητας στη Erythrmycin (4μg/ml) Είναι επίσης δοκιμασία ανίχνευσης M.h. σε χαμηλή συγκέντρωση> 10 3 CCU/ml. Μέθοδος Προετοιμασία αντιδραστηρίων (εικόνα 3 ) Προετοιμάζονται τόσα θρεπτικά υλικά καλλιέργειας C-medium και strip αντιδραστηρίων όσα και τα εμβολιασμένα φιαλίδια μεταφοράς (T-brth) Τα αντιδραστήρια έρχονται σε θερμοκρασία δωματίου (απαιτούμενος χρόνος περίπου 20 λεπτά) Εμβολιασμός θρεπτικού υλικού Κάθε στειλεός με βιολογικό υλικό (στην προκειμένη περίπτωση: κολπικό επίχρισμα) τοποθετείται σε ένα φιαλίδιο μεταφοράς (T-brth). (εικόνα 4) Οι στειλεοί απομακρύνονται και γίνεται ανασύσταση κάθε φιαλιδίου θρεπτικού υλικού C medium αποχύνωντας σε αυτό το περιεχόμενο ενός φιαλιδίου μεταφοράς T-brth. (εικόνα 5 )
Το χρώμα του ανασυσταμένου θρεπτικού υλικού πρέπει να είναι κίτρινο-πορτοκαλί (ph 6.6+0.1) (εικόνα 4) (εικόνα 5) Εμβολιασμός και επώαση του strip Αρχικά γίνεται αρίθμηση των strips αντίστοιχη με αυτή των φιαλιδίων των θρεπτικών υλικών. Έπειτα χρησιμοποιώντας την προεξέχουσα άκρη γίνεται απομάκρυνση του αυτοκόλλητου καλύμματος του strip διατηρώντας όμως την άλλη άκρη κολλημένη. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη 100μL ανασυσταμένου θρεπτικού υλικού (C-medium) στις 5 θέσεις (βυθίσματα)του strip και προσθήκη μιας σταγόνας παραφίνης σε κάθε θέση πριν από το κλείσιμο του strip με το αυτοκόλλητο κάλυμμα. (εικόνα 6 ) (Εικόνα 6)
Το strip τοποθετείται στην ειδική βάση του και γίνεται επώαση στους 36 ο C + 1 για 48 ώρες. Η περίσσεια του θρεπτικού υλικού μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία +2/+8 ο C για 48 ώρες σε περίπτωση που χρειαστεί να γίνει επαλήθευση. (εικόνα 7) (εικόνα 7) ) Αποτελέσματα και αξιολόγηση Η όψη των διαλυμάτων στα strips πρέπει να είναι διαυγής. Θολερή όψη υποδηλώνει επιμόλυνση από βακτήρια ή ζυγομύκητες και απαιτείται επανάληψη της διαδικασίας.τα αποτελέσματα ελέγχονται από την αλλαγή του χρώματος στα βυθίσματα.η ανάπτυξη των ουρογεννητικών μυκοπλασμάτων υποδηλώνεται με αλλαγή του χρώματος σε κόκκινο-ροζ. Ταυτοποίηση και διαφορική τιτλοποίηση ουρογεννητικών μυκοπλασμάτων Ελέγξτε το μάρτυρα ανάπτυξης (θέση 1) πριν ελέγξετε τις υπόλοιπες θέσεις. Γίνεται έλεγχος χρώματος και των υπόλοιπων θέσεων και έκβαση συμπεράσματος σύμφωνα με τον βοηθητικό πίνακα. (εικόνα 8)
(εικόνα 8)