Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των. μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία

Transcript

1 Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία της Δημόσιας Υγείας Α. Βανταράκης Εργαστήριο Υγιεινής, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πάτρας Εισαγωγή Η ανάπτυξη των μοριακών τεχνικών όπως της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης στα μέσα της δεκαετίας του 80, παρείχε σημαντικά εργαλεία για την ανίχνευση και ταυτοποίηση παθογόνων μικροοργανισμών. Αν και αρχικά, οι τεχνικές αυτές ήταν κυρίως ποιοτικές, η περαιτέρω ανάπτυξη των τεχνολογιών αυτών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, έχει αυξήσει σημαντικά την ικανότητα για την ταχεία ταυτοποίηση και τυποποίησή τους, τον καθορισμό της ανθεκτικότητάς τους σε αντιβιοτικά και την ποσοτικοποίηση τους σε κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα. Αυτή η σημαντική πρόοδος, έχει βοηθήσει ουσιαστικά στην αντιμετώπιση των λοιμωδών νοσημάτων, καθώς και στον έλεγχο των επιδημιών. Οι μοριακές τεχνικές παρέχουν μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση, αν σχεδιαστούν προσεκτικά. Έχουν τη δυνατότητα να ανιχνεύσουν πολύ μικρό αριθμό μικροοργανισμών (βακτηρίων, ιών και παρασίτων) σε μεγάλη ποικιλία δειγμάτων. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η απομόνωση του DNA με διάφορες μεθόδους, δεν το επηρεάζει και συνεπώς με προσεκτικό σχεδιασμό των μοριακών αντιδράσεων, δίνεται η δυνατότητα για την ακριβή ταυτοποίηση και τυποποίηση μεγάλης ποικιλίας διαφορετικών μικροοργανισμών σε διαφορετικής προέλευσης δείγματα. 1

2 Εκτός από τη δυνατότητα ανίχνευσης, η ταχύτητα (<24 ώρες) και η εξειδίκευση των μοριακών τεχνικών έχει σαν αποτέλεσμα τη σημαντική πρόοδο στην αντιμετώπιση θεμάτων Δημόσιας Υγείας. Επιπλέον, η ανάπτυξη και η καθημερινή χρήση νέων διαγνωστικών δοκιμασιών για πολλούς σημαντικούς παθογόνους μικροοργανισμούς όπως οι ιοί της Ηπατίτιδας και του AIDS έχουν βελτιώσει σημαντικά τα επίπεδα της υγείας του πληθυσμού. Επιπρόσθετα, οι μοριακές τεχνικές παρέχουν σημαντικά εργαλεία στην αντιμετώπιση τροφιμογενών και υδατογενών επιδημιών και στη δυνατότητα ταυτοποίησης της αιτίας της επιδημίας. Τέλος, οι κλινικοί επιδημιολόγοι βασίζονται σε αυτές τις τεχνικές για την άμεση αντιμετώπιση των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων. Παρόλα όμως τα πλεονεκτήματα τους, οι μοριακές τεχνικές έχουν μεγαλύτερο κόστος από τις παραδοσιακές καλλιεργητικές μεθόδους ανίχνευσης μικροβίων. Η διαφορά στο κόστος όμως δεν είναι ιδιαίτερα σημαντική. Στην περίπτωση των περισσότερων βακτηριακών παθογόνων, η ανάπτυξη των μικροοργανισμών γίνεται σε υγρό ή στερεό θρεπτικό μέσο σε σχετικά σύντομο χρόνο. Με τη βοήθεια των αυτοματοποιημένων μεθόδων ταυτοποίησης, οι απαραίτητες διαγνωστικές πληροφορίες που χρειάζονται οι κλινικοί μικροβιολόγοι για την κατάλληλη φαρμακευτική αντιμετώπιση του ασθενούς, μπορούν να αποκτηθούν σε σύντομο χρόνο. Στην περίπτωση, όμως, των βραδέως αναπτυσσόμενων μικροβίων, οι μεγάλοι χρόνοι επώασης, που χρειάζονται για την ταυτοποίηση του παθογόνου, μπορούν να καθυστερήσουν σημαντικά την κατάλληλη αντιμικροβιακή θεραπεία. Οι κλινικοί γιατροί είναι αναγκασμένοι να ξεκινούν θεραπεία βασιζόμενοι μόνο στην 2

3 κλινική εικόνα του ασθενούς. Αυτό σημαίνει ταυτόχρονα, τη χρήση αντιβιοτικών ευρέως φάσματος μέχρι να ταυτοποιηθεί ο παθογόνος μικροοργανισμός, καθώς και το πρότυπο ανθεκτικότητάς του. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η μοριακή ταυτοποίηση μειώνει σημαντικά το χρόνο που χρειάζεται για την ταυτοποίηση του μικροοργανισμού και συνεπώς τη κατάλληλη θεραπεία. Η μείωση του χρόνου, βοηθάει σημαντικά στη μείωση του κόστους από την αποφυγή χρήσης ακατάλληλων θεραπειών, μειώνοντας παράλληλα τη παραμονή των ασθενών στο νοσοκομείο. Κατά τον έλεγχο των επιδημιών, κυρίως των υδατογενών και τροφιμογενών, οι μοριακές τεχνικές παίζουν σημαντικό ρόλο με τη ταχεία δυνατότητα ανίχνευσης και ταυτοποίησης του υπεύθυνου μικροοργανισμού στα δείγματα τροφίμων ή νερών. Αυτό παρέχει τη δυνατότητα για τη λήψη άμεσων, κατάλληλων και αξιόπιστων μέτρων για την αντιμετώπιση της επιδημίας όπως η διακοπή της παραγωγής του τροφίμου ή την απολύμανση του νερού. Εξαιτίας της σημαντικής τους ευαισθησίας, οι μοριακές τεχνικές δίνουν εκτός από το ρόλο τους στην ανίχνευση βακτηρίων, παρέχεται η δυνατότητα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση μικρού αριθμού ιών και παρασίτων σε περιβαλλοντικά δείγματα, γεγονός που συμβάλλει σημαντικά στην προστασία της Δημόσιας Υγείας απέναντι σε μικροοργανισμούς για τους οποίους μέχρι σήμερα δεν υπήρχαν αξιόπιστοι τρόποι ανίχνευσης. Επίσης, πρόσφατα, οι μοριακές τεχνικές έχουν σημαντική συμβολή στην αντιμετώπιση των βιολογικών κινδύνων για την προστασία της Δημόσιας Υγείας. Με την ταχύτητα των συστημάτων real Time PCR, τα αποτελέσματα των αναλύσεων για μικροοργανισμούς (όπως λόγου χάρη ο βάκιλος του άνθρακα) είναι σχεδόν άμεσα μετά τη συλλογή του δείγματος. Αυτό παρέχει το χρόνο για την σχεδόν άμεση αντίδραση στην απειλή αλλά και την χορήγηση εμβολίων ή αντιβιοτικών στον 3

4 πληθυσμό που κινδυνεύει. Τέλος, οι μοριακές τεχνικές και κυρίως η τυποποίηση μέσω καθορισμού της αλληλουχίας (microbial sequence typing) έχουν δώσει μεγάλες δυνατότητες σε θέματα τυποποίησης (καθορισμό γονότυπου) και δημιουργίας των κατάλληλων φυλογενετικών δένδρων των μικροοργανισμών, βελτιώνοντας σημαντικά τις γνώσεις στο πεδίο της μοριακής τους επιδημιολογίας. Ορισμένες από τις μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιούνται πιο συχνά στον έλεγχο των επιδημιών είναι: η PCR και οι εφαρμογές της (όπως RT-PCR, nested- PCR, RFLP, AFLP), η υβριδοποίηση, η ηλεκτροφόρηση μεταβλητού πεδίου (PFGE), η Τυποποίηση μέσω αλληλούχισης (MST) και η Real Time PCR. Οι τεχνικές αυτές έχουν δείξει πολύ μεγάλη εξειδίκευση, ευαισθησία, εφαρμογή σε μεγάλη ομάδα μικροοργανισμών και ευκολία στην ανάγνωση των αποτελεσμάτων. Ειδικά με την ανάπτυξη της Real Time PCR και των κλειστών συστημάτων απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων, μειώθηκε σημαντικά και η σημασία του ανθρώπινου λάθους στα αποτελέσματα (συνήθως ψευδώς θετικά λόγω επιμολύνσεων) ενώ παράλληλα επιτεύχθηκε και η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. Σε περιβαλλοντικά δείγματα, οι τεχνικές που βασίζονται στην PCR, έχουν εφαρμοστεί εκτεταμένα για την ανίχνευση των ιών αλλά και βακτηρίων, έχοντας αντικαταστήσει τις χρονοβόρες διαδικασίες καλλιέργειάς και τυποποίησής τους. Επίσης έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για την απευθείας ανίχνευση βακτηρίων ή παρασίτων στο νερό ή στα τρόφιμα δίνοντας σημαντική βοήθεια στον έλεγχο των επιδημιών με τη σημαντική μείωση του χρόνου των αποτελεσμάτων. Το μεγαλύτερο μειονέκτημα των μοριακών τεχνικών είναι η εφαρμογή τους σε μικρούς όγκους, γεγονός που καθιστά απαραίτητο το συνδυασμό τους με στάδια συμπύκνωσης των μικροοργανισμών σε μικρότερους όγκους από αυτούς που απαντώνται στο 4

5 περιβάλλον. Η εξέλιξη στις τεχνικές συμπύκνωσης έχει δώσει σημαντική βοήθεια και λύσεις στο θέμα αυτό. Η σημασία της χρήσης των μοριακών τεχνικών φαίνεται και από το γεγονός ότι η Ευρωπαϊκή Ενωση μέσω του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Τυποποίησης (CEN), έχει ξεκινήσει τη διαδικασία τυποποίησης μοριακών τεχνικών για τον έλεγχο μικροοργανισμών στο περιβάλλον και στα τρόφιμα. Η χρήση μοριακών τεχνικών έχει ξεκάθαρα κυρίαρχο ρόλο στη Δημόσια Υγεία καθώς κινούμαστε στον 21ο αιώνα, δίνοντας σημαντική ώθηση στη βελτίωση της προστασίας του ανθρώπινου πληθυσμού από σημαντικά προβλήματα υγείας. 5