Θέμα project: Προσδιορισμός βακτηριακών ενδοτοξινών (Test LAL)

Transcript

1 Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου Θέμα project: Προσδιορισμός βακτηριακών ενδοτοξινών (Test LAL) Φοιτήτρια: Ρούμελη Αντωνία ΑΜ: ΑΘΗΝΑ 2015

2 Εισαγωγή Ο Frederick Bang παρατήρησε ότι τα βακτήρια προκαλούν ενδοαγγειακή πήξη σε ένα είδος αμερικάνικου καβουριού, που λέγεται Limulus polyphemus. Ο ίδιος σε συνεργασία με τον Levin βρήκαν ότι ο παράγοντας που ευθύνεται για τα φαινόμενα αυτά έγκειται στα αμοιβαδοκύτταρα του καβουριού, ή τα κυκλοφορούντα ερυθροκύτταρα, και ότι τα πυρετογόνα (βακτηριακές ενδοτοξίνες) ενεργοποιούν τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αλληλουχία αυτή της πήξης. Η δοκιμασία LAL είναι το πιο ευαίσθητο και ειδικό μέσο που μπορεί να ανιχνεύει και να μετράει βακτηριακές ενδοτοξίνες, υποπροϊόντα των gram αρνητικών βακτηρίων που προκαλούν πυρετό, κοινώς γνωστά ως πυρετογόνα. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι η ενδοτοξίνη παράγει αλλαγές στην εμφάνιση των LAL που μετριούνται εύκολα. Η απλότητα και η συνολική οικονομία της δοκιμασίας LAL ενθαρρύνει την εξέταση των διαλυμάτων που βρίσκονται σε εξέλιξη και των πρώτων υλών, καθώς και φαρμάκων τελικού προϊόντος, συσκευών και βιολογικών προϊόντων. Αρχή μεθόδου Σε αυτή τη δοκιμασία, οι βακτηριακές ενδοτοξίνες ξεκινούν την ενεργοποίηση διαδοχικών σειρών των πρωτεασών σερίνης σε LAL. Το τελευταίο ενεργοποιημένο ένζυμο σε αυτή τη σειρά, δηλαδή το ένζυμο πριν την πήξη, κόβει ένα πεπτίδιο από μια ενδογενή επιφάνεια, που καλείται πηκτογόνο. Το τροποποιημένο υπόστρωμα παράγει μια αδιαφάνεια και ζελατίνη στα LAL, που ανιχνεύεται εύκολα. Ένα συνθετικό ανάλογο του πηκτογόνου μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί στην ποσοτική μέτρηση της διαμεσολαβούμενης ενεργοποίησης της ενδοτοξίνης του ενζύμου LAL πριν την πήξη. Αυτό το συνθετικό υπόστρωμα υφίσταται διάσπαση, που έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του χρωμοφόρου π-νιτροανιλίνη (pna). Το pna είναι ένα κίτρινο χρώμα που υπολογίζεται φωτομετρικά στα nm. Με τη βοήθεια ενός σπεκτροφωτόμετρου μπορεί να εκτελεστεί μια κινητική χρωματογραφική μέθοδος, στην οποία η πρώιμη έναρξη του χρώματος μπορεί να ανιχνευτεί και να μετρηθεί με ακρίβεια. Ενδοτοξίνη Προένζυμο.... Υπόστρωμα... Ένζυμο Ένζυμο Πεπτίδιο + π-νιτροανιλίνη

3 Εξοπλισμός Endosafe PTS Portable Test System Reader Seiko DPU-414 Thermal Printer

4 Αντιδραστήρια Υλικά Endosafe PTS Cartridge με αποξηραμένα αντιδραστήρια LAL Reagent Water

5 Σωληνάρια ή φιαλίδια πλαστικά ή γυάλινα ελεύθερα πυρετογόνων για τη δειγματοληψία Πιπέττα και ρύγχη ελεύθερα πυρετογόνων Προετοιμασία οργάνου Endosafe PTS Portable Test System Reader 1. Πατάμε το κουμπί MENU στο πληκτρολόγιο του οργάνου ώστε να ανοίξει. Τότε, εμφανίζει στην οθόνη του την ένδειξη SYSΤEM SELF TEST καθώς θερμαίνεται, ώστε να φθάσει στους 37 C ο ενσωματωμένος επωαστήρας του. Αυτό διαρκεί περίπου 5 λεπτά. 2. Το όργανο εμφανίζει την ένδειξη SELF TEST OK και κατόπιν INSERT CARTRIDGE

6 Προετοιμασία δείγματος 1. Ο αναλυτής θα πρέπει να ακολουθεί άσηπτη τεχνική. 2. Χρησιμοποιούμε σωληνάρια ή φιαλίδια ελεύθερα ανιχνεύσιμων ενδοτοξινών για τη δειγματοληψία. 3. Το δείγμα νερού συνήθως δεν απαιτεί αραίωση. Εάν η συγκέντρωση της ενδοτοξίνης στο δείγμα είναι μεγαλύτερη από το ανώτερο σημείο της καμπύλης που χρησιμοποιούμε, τότε θα πρέπει να αραιώσουμε το δείγμα με LAL Reagent Water (νερό ελεύθερο πυρετογόνων). Ακολουθούμε σχήμα αραιώσεων 2-fold. 4. Σημαίνουμε όλους τους περιέκτες δειγμάτων ή αραιώσεων με τον κωδικό του δείγματος, την παρτίδα του και την αραίωση, αν υπάρχει. Προετοιμασία του οργάνου για ανάλυση δείγματος 1. Όταν το όργανο εμφανίσει στην οθόνη του το μήνυμα: Insert Cartridge αφαιρούμε τη συσκευασία ενός cartridge και εισάγουμε το cartridge εντός του οργάνου με το άνοιγμα των τεσσάρων κελιών προς τα πάνω. Δεν αγγίζουμε με το χέρι μας το άνοιγμα των κελιών ή τα οπτικά κελιά στην άλλη άκρη του cartridge. 2. Εφαρμόζουμε το cartridge στην ειδική είσοδο του οργάνου. 3. Απαντούμε στην άμεση ζήτηση του οργάνου Enter OID πληκτρολογώντας τον κωδικό του χρήστη. 4. Απαντούμε στην επόμενη ζήτηση του οργάνου Enter Cartridge Lot # πληκτρολογώντας την παρτίδα του cartridge, όπως αυτή εμφανίζεται πάνω στη συσκευασία του ή στο πιστοποιητικό του. 5. Απαντούμε στις επόμενες απαιτήσεις του οργάνου Enter Sample Lot, Enter Sample ID και Enter Dilution Factor πληκτρολογώντας την παρτίδα του δείγματος, την ταυτότητα του δείγματος και τον παράγοντα αραίωσης του δείγματος, αντίστοιχα.

7 6. Κατόπιν όλων αυτών, περιμένουμε να εμφανιστεί στην οθόνη η ένδειξη ADD SAMPLE PRESS ENTER. 7. Πιπετάρουμε από 25 μl δείγματος, με ένα ρύγχος ελεύθερο ενδοτοξινών, και στα τέσσερα (4) κελιά του cartridge. 8. Πατάμε άμεσα το πλήκτρο Enter.

8 Επισκόπηση και καταγραφή αποτελεσμάτων Το όργανο ειδοποιεί ηχητικά για το τέλος του τεστ που αναμένεται σε 15 περίπου λεπτά από την εισαγωγή του δείγματος. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται στην οθόνη με εναλλαγή των κάτωθι: Sample EU/mL Sample %CV % Spike Recovery Remove Cartridge Εκτυπώνουμε τα αποτελέσματα στον εκτυπωτή Seiko DPU-414, πληκτρολογώντας 4 (PRINT MENU) και μετά 1 (PRINT LAST TEST). Το τεστ θεωρείται έγκυρο αν το CV για το δείγμα αλλά και για το θετικό control είναι 25% και το spike recovery είναι μεταξύ 50 και 200%. Το τεστ θεωρείται άκυρο αν έστω και μία από τις παραπάνω συνθήκες δεν τηρηθεί. Στην προκειμένη έχουμε: Sample CV= 0% Spike CV= 1,3% Spike Recovery= 92% Άρα το τεστ είναι έγκυρο.

9 Το τεστ για το δείγμα μας θεωρείται επιτυχές αν το Sample Value είναι <0,25 EU/mL. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα έχουμε Sample Value <0,01 EU/mL, άρα είναι επιτυχές.