مجله علوم تغذيه و صنايع غذايي ايران سال چهارم شماره 4 زمستان 1388 صفحات 1-8 بررسي مقاومت به استرس در سويههاي صنعتي ساكارومايسس سرويزيه به منظور طراحي محيطهاي غربالگر 4 3 2 1 محسن گلابي ايرج نحوي منوچهر توسلي محسن مبيني دهكردي 1- نويسنده مسي ول: دانش آموخته كارشناسي ارشد ميكروبيولوژي دانشكده علوم دانشگاه اصفهان پست الكترونيكي: mohsen.golabi@gmail.com 2- استاد گروه زيست شناسي دانشكده علوم دانشگاه اصفهان 3- استاديار گروه زيست شناسي دانشكده علوم دانشگاه اصفهان 4- استاديار گروه ژنتيك دانشكده علوم دانشگاه شهركرد تاريخ دريافت: 88/5/28 چكيده تاريخ پذيرش: 88/9/9 سابقه و هدف: براي دستيابي به سويههاي ميكروبي با صفات ويژه صنعتي دو روش عمده وجود دارد: جداسازي سويه مورد نظر از محيط يا القاي جهش در سويههاي صنعتي و جداسازي سويهاي با صفات مورد نظر. اما بررسي خصوصيات مطلوب مورد نظر در همه سويههاي جداسازي شده بسيار پرهزينه و زمانبر است. هدف از اين تحقيق بررسي ميزان مقاومت به عوامل استرسزا در سويههاي ساكارومايسس سرويزيه و بررسي ارتباط آن با ويژگيهاي مطلوب صنعتي مانند مقاومت به فشار اسمزي و توليد بالاتر ميزان درون سلولي ترهالوز در جهت طراحي محيطهاي غربالگر به منظور هدفمند كردن جداسازي سلولهايي با ويژگيهاي ذكر شده از يك جمعيت ميكروبي است. مواد و روشها: ميزان مقاومت سويههاي مختلف ساكارومايسس سرويزيه با روش تعيين درصد بقاي سلولي در مواجه با استرسهاي ناشي از %40 Sorbitol 3M شوك سرما در دماي - 20 C و شوك حرارتي 52 C تعيين شد. ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز با معرف آنترون اندازهگيري شد و ارتباط اين عوامل با استفاده از آناليز دادههاي آماري بررسي شد. يافتهها: همبستگي شديدي بين ميزان مقاومت به شوك حاصل از و شوك حاصل از سوربيتول در ميان سويههاي ساكارومايسس سرويزيه مشاهده شد. اين ارتباط در سطح %99 معنيدار بود (0.01 >p). همچنين ارتباط ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز با قدرت بقاي سلولي در هنگام بروز استرس شوك حرارتي در سطح %99 معنيداري قرار داشت. نتيجهگيري: با توجه به ناكارآمد بودن عوامل قندي در جداسازي سويههاي مقاوم به فشار اسمزي با استفاده از بهعنوان عامل غربالگر ميتوان سويههاي مقاومتر به فشار اسمزي را از ميان يك سوسپانسيون سلولي به طور هدفمند جداسازي كرد همچنين عامل غربالگر شوك حرارتي براي جداسازي هدفمند سويههايي كه ميزان تجمع ترهالوز درون سلولي بالاتري دارند بسيار كارآمد است. واژگان كليدي: محيطهاي غربالگر ساكارومايسس سرويزيه استرس ترهالوز فشار اسمزي مقدمه يكي از روشهاي دستيابي به سويههاي ساكارومايسس سرويزيه با خصوصيات صنعتي مطلوب جداسازي سويههاي وحشي از محيط و مواد غذايي گوناگون (1) يا جهشزايي تصادفي با بهكارگيري مواد و تابشهاي جهشزا و متعاقب آن جداسازي سويههايي با صفات مورد نظر است (3 2). در اين دو روش مرحله غربالگري و جداسازي برترين سلولها از ميان يك جمعيت ميكروبي كه حاوي ميليونها سلول با صفات متنوع است اهميت بالايي دارد. طراحي روشها و محيطهاي غربالگر كارآمد در اين مرحله به تسهيل و تسريع در جداسازي هدفمند سلولهاي مورد نظر منجر ميشود (4). پاسخ سلولي به استرس بسيار پيچيده است و ژنهاي دخيل در مقاومت به استرس در همه ژنوم پراكنده هستند. بيان ژنهاي متعددي با استفاده از روش هاي نوين زيست شناسي ملكولي در هنگام استرس شناسايي شده
بررسي مقاومت به استرس.../ محسن گلابي و همكاران 2 است. مطالعات نشان داده كه در حدود %15 از ژنوم ساكارومايسس سرويزيه كد كنندهي عوامل دخيل در مقاومت به استرس است (5). مخمرها در هنگام بروز هر نوع استرس پاسخ هاي جداگانهاي را بيان ميكنند اما اين پاسخها در برخي موارد مشترك هستند كه به ايجاد مقاومت به يك عامل استرسزا در اثر مواجه با يك عامل استرسي ديگر منجر ميشود. به طور مثال ا عمال شوك حرارتي ملايم سبب بروز پاسخهايي ميشود كه علاوه بر محافظت سلولها در برابر شوك حرارتي شديدتر سلولها را در برابر اتانل نيز مقاوم ميكند يا شوك اسمزي سبب بيان فاكتورهايي ميشود كه سلولهاي مخمري را در برابر شوك حرارتي هم مقاوم ميسازد اين پديده cross-protection ناميده ميشود (6). سلولهاي ساكارومايسس سرويزيه در كاربردهاي صنعتي با استرسهاي متفاوتي مواجه هستند. توليد بيواتانل و توليد مخمر نانوايي دو صنعت مهم مرتبط با ساكارومايسس سرويزيه است و در هر دو صنعت سويههاي مقاوم به استرس فشار اسمزي راندمان توليدي بيشتري دارند (7-9). به دليل قابليت رشد ساكارومايسس سرويزيه در محيطهاي حاوي غلظتهاي بالاي قندي غربالگري سويههاي مقاوم به فشار اسمزي توسط عامل غربالگر قندي امكانپذير نيست بنابراين براي دستيابي به سويههاي مقاوم در ميان يك جمعيت ميكروبي نياز به بررسي تك تك سلولهاي موجود بررسي شوند (12-10). اما جايگزيني عوامل استرسزايي كه با عامل فشار اسمزي ناشي از قندها داراي cross-protection باشد ميتواند منجر به جداسازي هدفمند سلول مورد نظر شود. اين روش پيشنهادي در جداسازي سويههايي با صفات مطلوب صنعتي (مانند سويههاي توليد كننده متابوليتهاي ثانويه)كه به طور مستقيم قابل غربالگري نيستند كاربردهاي وسيعي دارد. ترهالوز يك دي ساكاريد غير احيا كننده است و مطالعات متعدد نشان داده است كه در هنگام استرسهاي مختلف ميزان تجمع درون سلولي اين ماده افزايش مييابد و تا ثير آن در ايجاد مقاومت به استرسهاي متعدد به اثبات رسيده است (13). سويههايي كه مقادير بالايي ترهالوز درون سلولي دارند از نظر صنعتي مورد توجه هستند (15 14). جداسازي اين سويهها در ميان يك جمعيت سلولي به طور مستقيم و هدفمند امكانپذير نيست. هدف از اين تحقيق تعيين ميزان مقاومت به استرسهاي متعدد و بررسي ارتباط ميزان مقاومت به استرس در سويههاي ساكارومايسس سرويزيه با صفات ويژه صنعتي به منظور طراحي محيطهاي غربالگري است كه به طور هدفمند بتواند به جداسازي سويههاي مقاوم به فشار اسمزي و جداسازي سويههايي با مقدار درون سلولي ترهالوز بالاتر در يك جمعيت سلولي بيانجامد. مواد و روشها ميكروارگانيسمها و محيطهاي كشت: سويههاي صنعتي ساكارومايسس سرويزيه از نمونههاي مخمر نانوايي تجاري جداسازي و با حروف R I F M K و نام گذاري S شدند همچنين سويه استاندارد ساكارومايسس سرويزيه از كلكسيون ميكروبي ايران (PTCC) با كد 5080 با نام سويه P مورد آزمايش قرار گرفت. از محيط (%2 YPD گلوكز %2 پپتون و %1 عصاره مخمر) براي كشت سويهها استفاده شد. در ساخت محيط جامد ميزان g/l 18 آگار به محيط مايع اضافه شد. اين محيط در دماي 121 C به مدت 15 دقيقه استريل شد. تعيين ميزان مقاومت در برابر شوك : سويهها در محيط YPD تلقيح شدند و گرمخانهگذاري و (30 C (150rpm به مدت 48 ساعت انجام شد. 1ml از اين سوسپانسيون سانتريفوژ دور ريخته شد سپس (3000g 5min) 5 محلول ml و مايع رويي ( 3 مولار) به توده زيستي موجود در لوله اضافه شد و پس از يكنواخت شدن (ورتكس به مدت 15 ثانيه) سري رقت در آب پپتونه تهيه شد. كشت به روش استاندارد پليت كانت در پليت YPD از اين سوسپانسيون انجام گرفت تا تعداد سلول اوليه تعيين شود. اين محيط در شرايط گرمخانه (30 C به مدت 60 دقيقه) قرار داده شد. پس از اين زمان دوباره سري رقت وكشت انجام شد. تعداد كلنيها پس از 4 روز انكوبهگذاري در دماي 30 C شمارش شد. ميزان مقاومت سويههاي مختلف در برابر شوك بر ٢
3 مجله علوم تغذيه و صنايع غذايي ايران سال چهارم شماره 4 زمستان 1388 حسب درصد بقاي هر سويه پس از اعمال شوك محاسبه و گزارش شد. تعيين ميزان مقاومت در برابر فشار اسمزي: مراحل انجام آزمايش دقيقا مطابق با اعمال شوك ناشي از انجام شد ولي به جاي استفاده از محلول از محلول 40 درصد سوربيتول (وزني/حجمي) استفاده شد. مدت زمان اعمال استرس 24 ساعت بود (16). تعيين ميزان مقاومت به شوك حرارتي: سويههاي مخمر در شرايط 30 C و 150rpm كشت شد. پس از 48 ساعت به منظور تعيين تعداد سلولهاي اوليه از اين محيط سري رقت تهيه شد و كشت به روش استاندارد پليت كانت انجام گرفت. 1ml از سوسپانسيون سلولي در يك لوله آزمايش استريل ريخته شد و در حمام آب گرم با درجه حرارت 52 C به مدت 20 دقيقه قرار داده شد. پس از ا عمال اين استرس سري رقت تهيه شد و كشت در پليت YPD انجام شد. پس از گرمخانهگذاري تعداد كلني ها شمارش شد و درصد بقاي سلولي محاسبه و گزارش شد (17). تعيين درصد بقاي سلولي در اثر ذخيرهسازي در سرما: سويههاي مخمر در شرايط 30 C و 150rpm كشت شد. پس از 48 ساعت به منظور تعيين تعداد سلولهاي اوليه از اين محيط سري رقت تهيه شد و كشت با روش استاندارد پليت كانت انجام گرفت. نمونههاي 1 ميليليتري از سوسپانسيون سلولي در لولههاي آزمايش استريل ريخته شد. لولههاي آزمايش در دماي - 20 C ذخيرهسازي شد. سپس در زمانهاي معين از فريزر خارج و در دماي محيط قرار داده شد تا ذوب شود. سري رقت تهيه شد و كشت به روش استاندارد پليت كانت انجام گرفت. تعداد كلنيها پس از 4 روز انكوبهگذاري در دماي 30 C شمارش شد و درصد بقاي سلولي محاسبه و گزارش شد. اندازه گيري ميزان ترهالوز درون سلولي: مقدار ترهالوز درون سلولي سويههاي مخمر براساس روش هاريسون و تروليان انجام شد (18). سلولهاي مخمر در محيط مايع YPD كشت شد تا به فاز سكون رشد برسد. سپس نمونههاي 5 ميلي ليتري از محيط كشت تهيه شد و پس از سانتريفوژ و دور ريختن محلول رويي توده زيستي باقيمانده با آب مقطر سرد دو بار شست و شو داده شد. در همه مراحل بعدي لولههاي حاوي توده زيستي مخمر در مخلوط آب و يخ نگهداري شد. پس از شست و شو و دور ريختن مايع رويي به لوله آزمايش حاوي توده زيستي مخمري 4ml محلول تري كلرواستيك اسيد 0/5 مولار سرد اضافه شد. محتويات لوله هر 10 دقيقه يك بار به مدت 30 ثانيه ورتكس شد. پس از گذشت 30 دقيقه نمونهها سانتريفوژ شد (5000g,10min) و مايع رويي به بالن ژوژه 50 ميلي ليتري تميز انتقال يافت. به توده زيستي باقي مانده دوباره 4ml محلول تري كلرواستيك اسيد اضافه و مراحل قبلي تكرار شد. پس از 3 مرتبه تكرار اين مراحل و جمع آوري محلول رويي محلول به دست آمده توسط آب مقطر سرد به حجم 50ml رسانده شد. 1ml از اين محلول به يك لوله آزمايش تميز انتقال داده شد و 5ml محلول معرف آنترون ( 0/8grآنترون در ml 500 اسيد سولفوريك با غلظت 27/4 نرمال) به آن اضافه شد. اين نمونه پس از ورتكس شديد به مدت 15 دقيقه در حمام آب جوش قرار گرفت. در خاتمه ميزان جذب نوري محلول سبزرنگ حاصل در طول موج ) 620nm در برابر نمونه شاهد حاوي 5ml محلول آنترون و 1ml آب مقطر) توسط دستگاه اسپكتروفتومتر تعيين شد. با انتقال عدد حاصل به منحني استاندارد مقدار ترهالوز برحسب ميليگرم در نمونه 5 ميليليتري سلولهاي مخمر محاسبه شد. به منظور محاسبه ميزان وزن خشك سلولي از محيط كشت اوليه نمونههاي 5 ميليليتري تهيه و وزن خشك اين ميزان سوسپانسيون محاسبه شد. در نهايت ميزان ترهالوز درون سلولي هر سويه بر حسب درصد ترهالوز موجود در وزن خشك سلولي محاسبه و گزارش شد. آناليز دادههاي آماري: به منظور انجام آناليزهاي آماري از روشهاي آزمون t و آناليز واريانس استفاده شد و ميزان معنيداري توسط آزمون دانكن تعيين شد. عمليات آماري با استفاده از نرم افزار SPSS 13 انجام شد.
بررسي مقاومت به استرس.../ محسن گلابي و همكاران 4 يافتهها ميزان مقاومت سويههاي صنعتي به شوك اسمزي ناشي از قند سوربيتول و : براساس نتايج به دست آمده كه حاصل سه تكرار در هر آزمايش است سويهي K بالاترين مقاومت را در برابر شوك ناشي از و بالاترين درصد بقا را پس از ا عمال استرس فشار اسمزي ناشي از قند سوربيتول نشان داد. با توجه به نتايج حاصل (شكل 1) درصد بقاي سلولي سويه K پس از 24 ساعت قرار گرفتن در سوسپانسيون حاوي %40 سوربيتول برابر با %94 است. همچنين بقاي سلولي اين سويه در مواجه با شوك 3 مولار برابر با % 64 است. با توجه به ميزان ضريب همبستگي كه از آناليز دادههاي آماري مربوط به همه سويهها به دست آمد ارتباط بين ميزان مقاومت به شوك حاصل از و شوك حاصل از سوربيتول در ميان سويههاي ساكارومايسس سرويزيه در سطح %99 معنيدار بود (0/01>p). 100 80 60 40 20 0 K R S M F I P sorbitol سويه هاي ساكارومايسس سرويزيه درصد بقاي سلولي نيز با مقدار 128 ميليگرم در هر گرم وزن خشك حاوي مقادير بالايي از ترهالوز درون سلولي است. ميزان مقاومت سويههاي ساكارومايسس سرويزيه در برابر شوك حرارتي در شكل 3 نشان داده شده است. طبق نتايج به دست آمده بالاترين درصد بقاي سلولي پس از ا عمال شوك حرارتي به سويه F با درصد بقاي 65 مربوط است اين ميزان براي سويهي K به %40 ميرسد. نتايج حاصل از آناليزهاي آماري نشان داد كه ارتباط ميزان مقاومت به شوك حرارتي و ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز در سويههاي مخمر ساكارومايسس سرويزيه مورد آزمايش در سطح %99 معنيدار است 240 200 160 120.(p<0.01) 80 40 0 K R S M F I P سويه هاي ساكارومايسس سرويزيه ميلي گرم ترهالوز بر گرم وزن خشك سلولي شكل 2- ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز در سويههاي ساكارومايسس سرويزيه برحسب ميليگرم ترهالوز در گرم وزن خشك سلولي. ميانگين و انحراف معيار حاصل سه تكرار غير وابسته است. 100 80 60 40 20 0 شكل 1- درصد بقاي سلولي سويههاي صنعتي ساكارومايسس سرويزيه در مواجه با استرس شوك اسمزي ناشي از 3 مولار به مدت يك ساعت و شوك اسمزي ناشي از %40 سوربيتول به مدت 24 ساعت. ارتباط ميزان مقاومت سويههاي مخمري به استرس ناشي از و قند سوربيتول در سطح معيار حاصل سه تكرار غير وابسته است. %99 معنيدار است. ميانگين و انحراف درصد بقاي سلولي K R S M F I P ميزان مقاومت سويههاي صنعتي به شوك حرارتي و ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز: طبق نتايج حاصل كه در شكل 2 اراي ه شده است بالاترين ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز به سويه F با ميزان 186 ميليگرم در هر گرم وزن خشك سلولي مربوط ميشود. سويه K سويه هاي ساكارومايسس سرويزيه شكل 3 - درصد بقاي سلولي سويههاي ساكارومايسس سرويزيه در مواجه با شوك حرارتي 52 C به مدت 20 دقيقه. ميانگين و انحراف معيار حاصل سه تكرار غير وابسته است. ٤
5 مجله علوم تغذيه و صنايع غذايي ايران سال چهارم شماره 4 زمستان 1388 تعيين ميزان مقاومت به سرما: نتايج حاصل از قدرت بقاي سويههاي مختلف ساكارومايسس سرويزيه در اثر ذخيرهسازي در سرما - ( در شكل 4 نشانداده 20 C) شده است. طبق نتايج آماري ارتباط معنيداري بين ميزان محتواي درون سلولي ترهالوز يا ميزان مقاومت به استرس اسمزي با ميزان مقاومت به سرما در اين سويهها مشاهده نشد. 100 80 60 40 20 0 0 1 4 8 12 K R S M F I P زمان ذخيره سازي در سرما (روز) درصد بقاي سلولي شكل 4 - درصد بقاي سلولي سويههاي ساكارومايسس سرويزيه در اثر ذخيرهسازي به مدت 12 روز در - 20 C. ميانگين و انحراف معيار حاصل سه تكرار غيروابسته است. بحث بررسي نتايج آزمايش بقاي سلولي سويههاي مخمري در هنگام مواجه با شوك نشان داد كه ميزان مقاومت سويههاي صنعتي متفاوت است اما سويههاي صنعتي در مقايسه با سويه P كه يك سويه استاندارد آزمايشگاهي است مقاومت نسبي بالاتري دارند. نكته قابل توجه در اين آزمايش ارتباط بسيار نزديك ميزان مقاومت سويههاي مخمر به شوك ناشي از قند سوربيتول و شوك حاصل از استرس نمك است. با توجه به دادههاي آماري ميتوان اظهار كرد سويههاي مخمري كه قدرت بقاي بالاتري در مواجه با استرس فشار اسمزي ناشي از قند سوربيتول دارند به طور حتم قدرت بقاي بالاتري در هنگام مواجه با استرس ناشي از دارند. با اينكه مكانيسمهاي پاسخ به استرس در مخمر بسيار پيچيده است اما به نظر ميرسد كه مكانيسمهاي پاسخ به استرس فشار اسمزي ناشي از قند سوربيتول و استرس حاصل از وجوه اشتراك فراوني داشته باشند. هنگام مواجه سلولهاي مخمر با استرس ناشي از غلظت داخل سلولي Na + K + گليسرول و ترهالوز افزايش مييابد و هنگام بروز استرس فشار اسمزي ناشي از سوربيتول ميزان درون سلولي گليسرول و ترهالوز افزايش مييابد كه نشانه ارتباط مكانيسمهاي مقاومت در برابر اين دو عامل استرسزا در اين گونه است (19-21). يافتههاي آزمايشگاهي اين مطالعه نشان داد كه همه سويههاي صنعتي ساكارومايسس سرويزيه با وجود متفاوت بودن در ميزان مقاومت به فشار اسمزي قابليت رشد در پليتهاي حاوي % 50 قند را دارند. در حقيقت همه سويههاي اين گونه ميكروبي توانايي رشد در محيطهايي با غلظتهاي بيشتر از %50 قند را دارند (22). بنابراين براي جداسازي سويههاي مقاوم به فشار اسمزي محيطهاي حاوي غلظتهاي بالاي قند عملا ناكارآمد هستند. نتايج ديگر نشان داد كه غلظت 0/5 مولار در پليت YPD از رشد برخي سويهها جلوگيري ميكند (23). با توجه به اثبات ارتباط بسيار نزديك مكانيسم- هاي مقاومت به فشار اسمزي ناشي از قندها و به نظر ميرسد كه به عنوان يك عامل غربالگر قابليت بالايي در جداسازي سويههاي مقاوم به فشار اسمزي دارد. بنابراين در جداسازي سويههاي مقاوم به فشار اسمزي از نمونههاي طبيعي يا از سوسپانسيوني كه در معرض جهشزايي تصادفي قرار گرفته استفاده از محيطهاي حاوي بسيار كارآمد است (23). Nishida و همكاران در سال 2004 موفق به جداسازي يك سويه ساكارومايسس سرويزيه مقاوم به فشار اسمزي از يك غذاي محلي ژاپني شدند (24) همچنين Osho چندين سويه مقاوم به فشار اسمزي ساكارومايسس سرويزيه را از ميوه يك گياه استوايي جداسازي كرد (25) به طور كلي در روشهاي كلاسيك ميكروبيولوژي پيشنهاد ميشود كه براي جداسازي يك سويه ساكارومايسس سرويزيه مقاوم به فشار اسمزي نمونه برداري از موادغذايي مثل ميوها و غذاهايي انجام گيرد
بررسي مقاومت به استرس.../ محسن گلابي و همكاران 6 كه حاوي مقادير بالاي قند ميباشند (26 22) در صورتي كه با توجه به نتايج حاضر به نظر ميرسد در مواد غذايي كه غلظت بالايي از نمك دارند شانس جداسازي سويههاي فوق مقاوم به فشار اسمزي بيشتر است و سويههاي مقاوم به نمك در مقايسه با سويههايي كه در حضور مواد قندي زياد رشد ميكنند به مراتب مقاومت بالاتري نسبت به فشار اسمزي دارند. ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز به عنوان يك عامل مهم در مقاومت به استرس در سويههاي مورد آزمايش بررسي شد. ترهالوز يك دي ساكاريد غيراحياء كننده (α-d-glucopyranosyl-1,1-α-d-glucopyranoside) است كه به عنوان يك منبع ذخيرهكننده كربوهيدرات در سلول است. افزايش ميزان ترهالوز درون سلولهاي مخمر در بسياري از شرايط نامساعد رشد (از قبيل دماي بالا سرما خشك شدن گرسنگي استرس اسمزي استرس اتانل استرس اكسيداتيو) و در فاز سكون رشد گزارش شده است (28 27). تحقيقات متعدد در مورد نقش ترهالوز در افزايش مقاومت سلولهاي مخمري در شرايط بروز استرس انجام گرفته است (30 29). نقش محافظتي اين متابوليت در محافظت سلولي در برابر استرس سرما و حرارت در ساكارومايسس پومبي نيز مشاهده شده است (31). نقش ترهالوز در افزايش مقاومت سلول در شرايط استرس به اثر تثبيت كنندگي پروتي ينها و تا ثير اين ملكول در يكپارچه نگه داشتن غشاي سلولي نسبت داده ميشود (32). در نتايج حاصل از آزمايشهاي اين مطالعه بيشترين ميزان ترهالوز مربوط به سويه F بود. همچنين سويه K ميزان بالايي از تجمع درون سلولي ترهالوز را نشان داد. ميزان مقاومت سلولي در برابر استرس شوك حرارتي در سويهها نيز بررسي شد. ارتباط بسيار نزديكي بين ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز و درصد بقاي سلولي در هنگام بروز استرس شوك حرارتي مشاهده شد. طبق نتايج اين مطالعه نقش ترهالوز در محافظت سلولها در برابر شوك حرارتي تاييد ميشود كه با يافتههاي قبلي مطابقت دارد( 32 31). طبق نتايج مطالعه حاضر همبستگي ميزان درون سلولي ترهالوز و قدرت بقا در برابر شوك سرما معنيدار نبود. همچنين ارتباط معنيدار ضعيفي بين ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز و قدرت بقاي سلولي در هنگام بروز استرس اسمزي ناشي از سوربيتول و در بين سويههاي مورد آزمايش وجود داشت. هرچند افزايش سنتز و تجمع درون سلولي ترهالوز هنگام بروز اين استرسها در سلولهاي ساكارومايسس سرويزيه گزارش شده اما طبق جستجوهاي مطالعه حاضر هيچ گزارشي مبني بر ارتباط بين درصد بقاي سلولي در هنگام بروز استرس اسمزي و با ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز در بين سويههاي مختلف ساكارومايسس سرويزيه گزارش نشده است. با توجه به نتايج حاصل از آزمايشهاي اين تحقيق و مطالعات صورت گرفته در اين زمينه به طور صريح ميتوان اظهار داشت اگرچه افزايش ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز در يك سويه ساكارومايسس سرويزيه منجر به افزايش قدرت بقاي سلولي آن سويه در هنگام استرس ناشي از سوربيتول و ميشود اما عوامل متعدد ديگري در ميزان مقاومت به فشار اسمزي و شوك حاصل از تا ثيرگذار هستند كه عامل ترهالوز را تحت تا ثير قرار ميدهند. بنابراين به دليل نقش مهم عوامل مقاومتي ديگر در هنگام بروز استرس اسمزي تنها با استناد به بالاتر بودن ميزان تجمع درون سلولي ترهالوز در يك سويه ساكارومايسس سرويزيه نميتوان آن سويه را نسبت به فشار اسمزي مقاومتر از سويههاي ديگري دانست كه محتواي ترهالوز كمتري دارند. اما شواهد حاصل از آزمايشات مطالعه حاضر بيانگر اين نكته است كه اگر سويهاي از ساكارومايسس سرويزيه ميزان تجمع درون سلولي بالاتري نسبت به سويههاي ديگر داشته باشد بدون در نظر گرفتن ديگر خصوصيات آن سويه به طور قطع از ميزان مقاومت به شوك حرارتي بالاتري نيز برخوردار است. در واقع اگرچه عوامل متعددي در مقاومت سلولهاي مخمري به شوك حرارتي تا ثير گذار هستند اما نقش ترهالوز به اندازهاي مهم است كه بقيه عوامل ايجاد كننده مقاومت به شوك حرارتي را ٦
7 مجله علوم تغذيه و صنايع غذايي ايران سال چهارم شماره 4 زمستان 1388 تحتالشعاع قرار ميدهد. همبستگي شديد ميزان ترهالوز و مقاومت به شوك حرارتي از نظر كاربردي حاي ز اهميت است. جداسازي سلولهايي كه محتواي ترهالوز درون سلولي بالاتري دارند با تيمار حرارتي بسيار سادهتر از بررسي تك تك سلولهاي مورد آزمايش است. تيمار حرارتي به عنوان يك عامل غربالگر منجر به حذف سلولهايي ميشود كه محتواي ترهالوز پايينتري دارند. Jin و همكاران در سال 2005 با بهكارگيري عامل جهشزاي UV و متعاقب آن بهكارگيري عامل غربالگر حرارتي موفق به جهشزايي تصادفي و جداسازي يك سويه مقاوم به حرارت شدند. جالب اينكه اين روش به منظور جداسازي سويههاي توليد كنندهي بيواتانل بالاتر به كار گرفته شده بود (31). احتمالا Jin و همكاران در آزمايشات خود به رابطه مستقيم ميزان مقاومت به شوك حرارتي و توليد بيواتانول دست يافته بودند و از عامل غربالگر حرارتي به منظور جداسازي سويههاي بهينهي مولد بيواتانل استفاده كردند. در آزمايش Jin براي شناسايي سويههاي توليدكننده بيواتانل بالاتر نياز به بررسي تك تك سلولهاي جهشيافته است كه در اينصورت تعداد محدودي از سلولها قابل بررسي هستند در صورتي كه با اعمال شوك حرارتي چند سلول بهينه از ميان سوسپانسيون حاوي ميليونها سلول ناخواسته جداسازي ميشود. يكي از روشهاي كاربردي بهينهسازي سويههاي صنعتي جهشزايي و جداسازي سلولهاي جهشيافته بهينه است كه در اين روش كلاسيك مرحله غربالگري با آزمايش روي تك تك سلولها انجام ميشود. اين مرحله بسيار پرهزينه و زمانبر است و در صورتي كه بتوان ارتباطي ميان يك عامل استرسزا و صفت صنعتي مطلوب در گونه مورد مطالعه شناسايي كرد قابليت جداسازي سويههاي بهينه پس از جهشزايي تسهيل شده و هدفمند ميشود. سپاسگزاري از معاونت محترم تحقيقات و فناوري و مديريت تحصيلات تكميلي دانشگاه اصفهان به دليل حمايت از References اين تحقيق تشكر و قدرداني ميشود. 1. Maloney DH, Foy JJ. Yeast Fermentations. In: Klup K, Lorenz K, editors. Handbook of dough fermentations. New York: Marcel Dekker Inc; 2003: 41-60. 2. Mobini DM, Nahvi I, Zarkesh EH, Ghaedi K, Tavassoli M. Akada R. Isolation of a novel mutant strain of saccharomyces cerevisiae by and ethyl methane sulfonate-induced mutagenesis approach as a high producer of bioethanol. J Biosci Bioengin 2008; 105: 403-408. 3. Teunissen A, Dumortier F, Gorwa MF, Bauer J, Tanghe A, Loïez A, et al. Isolation and characterization of a freeze-tolerant diploid derivative of an industrial baker s yeast strain and its use in frozen doughs. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 4780-4787. 4. Colaco CALS, Smith CJS, Sen S, Roser DH, Newman Y, Ring S, et al. Chemistry of protein stabilization by trehalose. In: Cleland JL, Langer R, editors. Formulation and delivery of proteins and peptides. Washington DC: American Chemical Society; 1994: 222-240. 5. Higgins VJ, Alic N, Thorpe GW, Breitenbach M, Larsson V. Phenotypic analysis of gene deletant strains for sensitivity to oxidative stress. Yeast 2002; 19: 203-214. 6. Chen D, Toone WM, Mata J, Lyne R, Burns J, Kivinen K, et al. Global transcriptional responses of fission yeast to environmental stress. Molecular Biology of the Cell 2003; 14: 214-229. 7. Ando M, Nakamura S, Shinomiya Y. inventors. Sugar super tolerant yeast for confectionary and bakery. US patent; 6,521,272 B1. 2003. 8. Donalies UEB, Nauyen HTT, Stahl U, Nevogt E. Improvement of Saccharomyces yeast strains used in brewing, wine making and baking. In: Scheper T, editor. Food biotechnology. Berlin: Springer; 2008: 67-99. 9. Bell PJL, Higgins VJ, Attfield PV. Comparison of fermentative capacities of industrial baking and wildtype yeasts of the species Saccharomyces cerevisiae in different sugar media. Lett Appl Microbiolo. 2001; 32: 224-229. 10. Pataro C, Guerra JB, Gomes FC, Neves MJ, Pimentel PF, Rosa CA. Trehalose accumulation, invertase activity and physiological characteristics of yeasts
بررسي مقاومت به استرس.../ محسن گلابي و همكاران 8 isolated from 24 h fermentative cycles during production of artisanal brazilian cachaca. Brazilian J Microbiol 2002; 33: 202-208. 11. Sree KN, Sridhar M, Suresh K, Banat IM, Rao V. Isolation of thermotolerant, osmotolerant, flocculating saccharomyces cerevisiae for ethanol production. Bioresour technol 2000; 72: 43-46. 12. Bechem EET, Omoloko O, Nwaga D, Titanji VPK. Characterization of palm wine yeasts using osmotic, ethanol tolerance and the isozyme polymorphisms of alcohol dehydrogenase. Afr J biotechnolo 2007; 6(14): 1715-1719. 13. Ian WD. Stress responces. In: Diskson RJ, Schweizer M, editors. The metabolism and molecular physiology of saccharomyces cerevisiae. 2 nd ed. Washington DC: CRC Press 2004. 376-421. 14. Hounsa C, Brandt EV, Thevelein JM, Hohman S, Prior BA. Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress. Microbiol 1998; 144: 671-680. 15. Attfield PV. Stress tolerance: The key to effective strains of industrial baker s yeast. Nature Biotechnol 1997; 15: 1351-1357. 16. Pratt PL, Bryce JH. Stewart GC. The effect of Osmotic pressure and ethanol on yeast Viability and morphology. J Institute of Brewing 2003; 109: 218-228. 17. Van-Dijck P, Colavizza D, Smet P, Thevelein JM. Differential Importance of trehalose in stress resistance in fermenting and nonfermenting saccharomyces cerevisiae cells. Appl Environ Microbiol 1995; 61: 109-115. 18. Trevelyan W E, Harrison JS. Studies on yeast metabolism: The trehalose content of baker yeast durin-g anaerobic fermentation. Biochem J 1956; 62: 177-183. 19. Jennings DH, editor. The physiology of fungal nutrition. Cambridge: Cambridge University Press 1995. p. 640. 20. Carvalheiro F, Roseiro CJ, Girio FM. Interactive effects of sodium chloride and heat shock on trehalose accumulation and glycerol production by Saccharomyces Cerevisiae. Food Microbiol 1999; 16: 543-550. 21. Modig T, Granath K, Adler L, Liden G. Anaerobic glycerol production by Saccharomyces cerevisiae strains under hyperosmotic stress. Appl Microbiol Biotechnol 2007; 75: 289-296. 22. Kurtzman CP, fell JW, editors. The yeasts A Taxonomic study. 4th ed. New York: Elsevier 2000. p. 1055. 23. Golabi M. Isolation and characterization of resistant strains of Saccharomyces cerevisiae to osmotic pressure and freezing [ dissertation ]. Esfahan: Esfahan University. Faculty of Science; 2008. [in Persian] 24. Nishida O, Kuwasaki S, Suzuki C, Shima J. Superior molasses assimilation, stress tolerance and trehalose accumulation of bakers yeast isolated from dried sweet potatoes. Bioscie Biotechnol Biochem 2004; 68: 1442-1448. 25. Osho A. Ethanol and sugar tolerance of wine yeasts isolated from fermenting cashew apple juice. Afr J Biotechnolo 2005; 4(7): 660-662. 26. Nwachukwa IN, Ibekwe VI, Nwabueze RN, Anyanwu BN. Characterization of palm wine yeast isolates for industrial utilization. Afr J Biotechnol 2006; 5(19): 1725-1728. 27. Lewis JG, Learmonth RP, Watson K. Role of growth phase and ethanol in freeze-thaw stress resistance of Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 1993; 59: 1065-1071. 28. Hounsa C, Brandt EV, Thevelein JM, Hohman S, Prior BA. Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress. Microbiol 1998; 144: 671-680. 29. Owobi LP, Durner S, Goma G, Francois J. Trehalose reserve in Saccharomyces cerevisiae: phenomenon of transport, accumulation and role in cell viability. International J Food Microbiol 2000; 55: 33-40. 30. Benaroudj N, Lee DH, Goldberg AL. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. J Biological Chem 2001; 29: 24261-24267. 31. Jin C, Hon NWX, Pan J, Zeng Y, Zhu M. Isolation and characterization of a highly thermotolerant mutant of Saccharomyces cerevisiae. Ann Microbiol 2005; 55: 57-61. 32. De Virgillio C, Hottiger T, Dominguez J, Boller T, Wiemkem A. The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast: genetic evidence trehalose is a thermo-protectant. Euro J Biochem. 1994; 219: 179-186. ٨