ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ. Γ. Καραμπουρνιώτης, Γ. Λιακόπουλος, Δ. Νικολόπουλος

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ & ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΤΩΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ Γ. Καραμπουρνιώτης, Γ. Λιακόπουλος, Δ. Νικολόπουλος Αθήνα 2008

2 Πριν από την είσοδό σας στο εργαστήριο διαβάστε τις οδηγίες ασφάλειας στο τέλος του φυλλαδίου

Περιεχόμενα Άσκηση Ι. Η επίδραση του NaCl στη βλάστηση των σπερμάτων... 4 Ασκηση II. α. Παρατήρηση συνθηκών καταπόνησης αλατότητας και υποξίας στο πεδίο.... 7 β. Αλατότητα εδάφους και παχυμορφισμός των φύλλων... 8 Ασκηση ΙΙΙ. Σχηματισμός αερεγχύματος στις ρίζες του καλαμποκιού και δραστηριότητα αλκοολικής αφυδρογονάσης σε συνθήκες ανεπάρκειας οξυγόνου.... 10 Ασκηση ΙV. Ποιοτική ανίχνευση της έκλυσης υδροκυανίου από το τραυματισμένο ενδοσπέρμιο των πικραμυγδάλων... 15 Άσκηση V. Μελέτη φωτοσυνθετικών και υδατικών παραμέτρων των φύλλων του φυτού Vicia faba υπό την επίδραση έλλειψης νερού... 18 Ασκηση VI. α. Παρατήρηση αλληλεπιδράσεων και των συνεπειών μιας πυρκαγιάς σε ένα αντιπροσωπευτικό μεσογειακό οικοσύστημα... 24 β. Ανατομικά και Φυσιολογικά χαρακτηριστικά φύλλων σκιάς και φύλλων φωτός... 25 Ασκηση VΙI. Δενδροχρονολογία και δενδροκλιματολογία... 27

4 Άσκηση Ι. Η επίδραση του NaCl στη βλάστηση των σπερμάτων Εισαγωγή Ο όρος αλατότητα αναφέρεται στην ύπαρξη υψηλών συγκεντρώσεων ιόντων (κατά κανόνα Na + και Cl - ), κυρίως στο περιβάλλον της ρίζας. Ως παράγων καταπόνησης παρουσιάζεται σε εκτεταμένες περιοχές του πλανήτη στις οποίες για διαφορετικούς λόγους παρουσιάζονται υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων στο έδαφος. Η καταπόνηση λόγω αλατότητας επιδρά δυσμενώς σε τρία διαφορετικά επίπεδα: Ι. Αλλοιώνονται τα χαρακτηριστικά του εδάφους. Επηρεάζεται δυσμενώς το πορώδες και κατά συνέπεια ο αερισμός και η ηλεκτρική αγωγιμότητα. ΙΙ. Οι υψηλές συγκεντρώσεις ιόντων δημιουργούν χαμηλά δυναμικά νερού στο έδαφος, και ως εκ τούτου εμφανίζεται μια μορφή υδατικής καταπόνησης (οσμωτική καταπόνηση). ΙΙΙ. Τα ιόντα Na + και Cl -, αυτά καθαυτά, παρουσιάζουν τοξικότητα. Παρουσία υπερβολικής συγκέντρωσης Na + παρουσιάζονται ανωμαλίες στη περατότητα των μεμβρανών και παρεμπόδιση ενζύμων. Τα φυτά τα οποία αναπτύσσονται σε εδάφη με υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων ονομάζονται αλόφυτα. Οι αντίξοες συνθήκες τις οποίες δημιουργεί το περιβάλλον υψηλής αλατότητας αντιμετωπίζονται μέσω κυρίως δύο στρατηγικών: Ι. Αποφυγή. Τα φυτά τα οποία έχουν επιλέξει τη στρατηγική αυτή (ρυθμιστές αλατότητας), δεν επιτρέπουν την είσοδο των ιόντων στο εσωτερικό των ευαίσθητων κυττάρων. Η στρατηγική αυτή παρουσιάζεται με δύο παραλλαγές. II. Ανθεκτικότητα. Ο μεταβολισμός των φυτών τα οποία έχουν επιλέξει τη στρατηγική αυτή είναι κατάλληλα προσαρμοσμένος ώστε να μη παρουσιάζονται δυσλειτουργίες παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων ιόντων. Τα φυτά αυτά αναφέρονται και ως συσσωρευτές άλατος. Πολυάριθμα φυτικά είδη (τα οποία εξ ορισμού επιλέγουν τη στρατηγική της διαφυγής), παρουσιάζουν ευαισθησία έναντι της παρουσίας αλατιού στο περιβάλλον τους, και ακόμη και σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις άλατος

5 (χαμηλότερες των 50 mm) επιφέρουν συνήθως ανεπανόρθωτες φυσιολογικές βλάβες. Υλικά και Μέθοδοι Στη σημερινή άσκηση επιλέγονται ως πειραματόφυτα δύο αντιπροσωπευτικά καλλιεργούμενα είδη που παρουσιάζουν διαφορετική ευαισθησία στην αλατότητα, το μαρούλι (Lactuca sativa) και το κριθάρι (Hordeum vulgare). Στόχος είναι να διερευνηθεί η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων χλωριούχου νατρίου στη βλάστηση των σπερμάτων τους. Σε πλαστικά δοχεία μιας χρήσης τοποθετείται περλίτης ο οποίος διαβρέχεται με το αντίστοιχο διάλυμα συγκεκριμένης συγκέντρωσης NaCl. Σε κάθε δοχείο τοποθετούνται 10 σπέρματα του αντίστοιχου πειραματόφυτου Στη συνέχεια τα δοχεία καλύπτονται με τα διαφανή τους καπάκια ώστε να μην υπάρξουν απώλειες νερού. Συνολικά χρησιμοποιούνται έξι δοχεία για κάθε φυτικό είδος (σύνολο 12), τα οποία διαβρέχονται με τα εξής διαλύματα: Σπέρματα πειραματόφυτου Ι Σπέρματα πειραματόφυτου ΙΙ Συγκέντρωση ΝaCl Συγκέντρωση ΝaCl (%) (mm) (%) (mm) 0 (απεστ. νερό) 0 (απεστ. νερό) 0 (απεστ. νερό) 0 (απεστ. νερό) 0.5 86 0.5 86 1 171 1.0 171 2.0 342 2.0 342 3.0 513 3.0 513 4.0 684 4.0 684

6 Τα πλαστικά δοχεία παραμένουν κλειστά επί μία εβδομάδα, ενώ κάθε δύο μέρες καταγράφεται η πορεία βλάστησης των σπερμάτων καθενός από αυτά. Αποτελέσματα Στην παρουσίαση των αποτελεσμάτων θα περιλαμβάνονται οι παρακάτω γραφικές παραστάσεις: 1. Η βλάστηση των σπερμάτων κάθε πειραματικού χειρισμού συναρτήσει του χρόνου. 2. Η βλαστικότητα των σπερμάτων έναντι της συγκέντρωσης NaCl στο μέσο. 3. Η παρεμπόδιση της βλάστησης έναντι της συγκέντρωσης NaCl στο μέσο. 4. Σύγκριση της ευαισθησίας που παρουσιάζουν τα δύο πειραματόφυτα έναντι του NaCl.

7 Ασκηση II. α. Παρατήρηση συνθηκών καταπόνησης αλατότητας και υποξίας στο πεδίο. Συλλογή και μετρήσεις στο πεδίο και στο εργαστήριο Πρόγραμμα εκδρομής Χρόνος: Ένα Σάββατο του Οκτωβρίου (η ακριβής ημερομηνία θα καθοριστεί μετά την έναρξη των μαθημάτων) Τοποθεσία: Μουστό Αρκαδίας Αναλυτικό πρόγραμμα 8:00 π.μ. Αναχώρηση από ΓΠΑ 11:00 π.μ. Άφιξη σε Μουστό 11: 00 π.μ.-12:00 π.μ. Πεζοπορία, παρατήρηση αλιπέδων και ελών 12:00 14:00 Συλλογή δειγμάτων υπαίθρου, επιτόπιες διαλέξεις σχετικές με τα αντικείμενα των μαθημάτων 14:00 15:00 Γεύμα 15:00 Αναχώρηση με το πούλμαν 19:00 Άφιξη στο ΓΠΑ τέλος εκδρομής Φύλαξη δειγμάτων στο ψυγείο Απαραίτητος εξοπλισμός φοιτητών Αθλητικά παπούτσια ή ορειβατικές μπότες μικρό σακίδιο σουγιάς, ψαλίδι ένα σάντουϊτς, ένα μπουκάλι νερό μπουφάν, αδιάβροχο μπλοκ σημειώσεων και μολύβι Εργαστηριακός εξοπλισμός ραδιόμετρο-χλωροφυλλόμετρο-αγωγιμόμετρο παχύμετρο αεροστεγή σακουλάκια συλλογής δειγμάτων φορητό ψυγείο φαρμακείο

8 β. Αλατότητα εδάφους και παχυμορφισμός των φύλλων Εισαγωγή Η εκδήλωση παχυμορφισμού στα φύλλα αποτελεί σύνηθες χαρακτηριστικό εγκλιματισμού ή προσαρμογής φυτών τα οποία αναπτύσσονται σε αλατούχα εδάφη. Ο παχυμορφισμός χαρακτηρίζεται από αύξηση του πάχους των φύλλων και αύξηση του περιεχόμενου νερού ανά μονάδα επιφάνειας φύλλου. Παχυμορφισμός των φύλλων, κυρίως ως προσαρμογή, εκδηλώνεται και σε ξηρόφυτα ως απάντηση στην ξηρασία και αποσκοπεί στη διαφύλαξη αποθεμάτων νερού. Στην περίπτωση της αλατότητας ο παχυμορφισμός των φύλλων σχετίζεται με την αντιμετώπιση των υπερβολικών ποσοτήτων αλάτων που συσσωρεύονται στα φύλλα. Αποτελεί έναν μηχανισμό «αραίωσης» των αλάτων, αφού η αύξηση του όγκου των παρεγχυματικών κυττάρων εξισορροπεί την σταδιακή είσοδο νέων ιόντων στα κύτταρα, με τελικό αποτέλεσμα η συγκέντρωση των αλάτων να παραμένει σχετικά σταθερή, παρά το γεγονός ότι η συνολική ποσότητά τους αυξάνεται. Ο μηχανισμός αυτός έχει ως τελικό αποτέλεσμα τη διατήρηση του δυναμικού του νερού των κυττάρων σε ανεκτά επίπεδα. Σκοπός της άσκησης είναι η εύρεση συσχέτισης μεταξύ της αλατότητας στο έδαφος και του βαθμού παχυμορφισμού των φύλλων σε φυτά τα οποία αναπτύσσονται σε διαφορετικά επίπεδα αλατότητας στο πεδίο. Υλικά και Μέθοδοι Φύλλα αντιπροσωπευτικών ειδών συλλέγονται στο Μουστό Αρκαδίας σε θέσεις με διαφορετική γειτνίαση με την ακτή και με τη λίμνη. Παράλληλα στις ίδιες θέσεις πραγματοποιούνται δειγματοληψίες εδάφους με κατάλληλο δειγματολήπτη. Τα φύλλα μεταφέρονται αμέσως σε αεροστεγή σακουλάκια τα οποία κλείνονται αμέσως και φυλάσσονται στο φορητό ψυγείο. Δείγματα εδάφους τοποθετούνται επίσης σε αεροστεγή σακουλάκια. Τα δείγματα μεταφέρονται στο εργαστήριο και φυλάσσονται στο ψυγείο μέχρι την ημέρα της άσκησης. Ο παχυμορφισμός των φύλλων (ΠΦ) μετράται ως εξής: ΠΦ=περιεχόμενο σε νερό/μονάδα επιφάνειας φύλλου

9 Το περιεχόμενο σε νερό (ΠΝ) εκφράζεται ως ΠΝ=ΝΒ-ΞΒ, όπου ΝΒ είναι το νωπό βάρος και ΞΒ είναι το βάρος των φύλλων μετά από ξήρανσή τους στους 70 0 C για 48 h. Η συγκέντρωση των υδατοδιαλυτών αλάτων του εδάφους προσδιορίζεται έμμεσα από την ηλεκτρική αγωγιμότητα του εκχυλίσματος κορεσμού (ECe). Το εκχύλισμα κορεσμού προκύπτει με τον υδατοκορεσμό συγκεκριμένης ποσότητας ξηρού εδάφους. Ο υδατοκορεσμός επιτυγχάνεται με το σχηματισμό παχύρρευστης πάστας η οποία ολισθαίνει ελεύθερα από τη σπάτουλα χωρίς να αφήνει υπολείμματα. Μετά από τέσσερεις ώρες η πάστα κορεσμού μεταφέρεται σε χωνί Buchner και το διάλυμα κορεσμού συλλέγεται μετά από τη διήθηση σε κενό. Η αγωγιμότητα (EC, μετράται σε ds m -1 ) του εκχυλίσματος μετράται με αγωγιμόμετρο και η μέτρηση ανάγεται σε θερμοκρασία 25 ο C. Με βάση τη μετρούμενη αγωγιμότητα μπορούν να υπολογιστούν κατά προσέγγιση οι εξής παράμετροι: Συγκέντρωση αλάτων, mg L -1 = 640 EC Οσμωτικό Δυναμικό (Ψ s ) = -0.4 EC Ένα έδαφος χαρακτηρίζεται ως αλατούχο όταν η Hλεκτρική Αγωγιμότητα του εκχυλίσματος κορεσμού του εδάφους είναι υψηλότερη των 4 ds m -1

10 Ασκηση ΙΙΙ. Σχηματισμός αερεγχύματος στις ρίζες του καλαμποκιού και δραστηριότητα αλκοολικής αφυδρογονάσης σε συνθήκες ανεπάρκειας οξυγόνου. Εισαγωγή Σε καλώς αεριζόμενα εδάφη οι ρίζες των φυτών τροφοδοτούνται με επαρκείς συγκεντρώσεις οξυγόνου ώστε η αερόβια αναπνοή να διεξάγεται χωρίς προβλήματα. Οι αέριοι χώροι οι οποίοι παρεμβάλλονται μεταξύ των σωματιδίων σε καλά αποστραγγιζόμενα εδάφη επιτρέπουν τη διάχυση του οξυγόνου σε σημαντικό βάθος από την επιφάνεια, ώστε τελικά η συγκέντρωση Ο 2 να πλησιάζει ή φθάνει εκείνη του αέρα. Εάν ωστόσο η ποσότητα του νερού της βροχής ή της άρδευσης είναι υπερβολική, το έδαφος πλημμυρίζει ή κατακλύζεται Ο αέρας ο οποίος υπάρχει μεταξύ των εδαφικών σωματιδίων αντικαθίσταται σχεδόν πλήρως από το νερό με συνέπεια η διάχυση του Ο 2 μέσω της αέριας φάσης του εδάφους να παρεμποδίζεται. Η ανεπάρκεια ή πλήρης έλλειψη οξυγόνου προκαλεί σημαντικές μεταβολικές δυσλειτουργίες, αφού η παραγωγή ΑΤΡ στις συνθήκες αυτές περιορίζεται δραματικά ενώ η οξίνιση του κυτταροπλάσματος αποτελεί μια σημαντική μεταβολική παρενέργεια. Ρίζες οι οποίες βρίσκονται σε συνθήκες υποξίας ή ανοξίας αδυνατούν να ανταποκριθούν στις ανάγκες του υπέργειου τμήματος. Από την άλλη πλευρά δημιουργούνται αντίξοες συνθήκες στο έδαφος λόγω της αύξησης της δραστηριότητας αναερόβιων μικροοργανισμών. Τα φυτά αντιμετωπίζουν την ανεπάρκεια οξυγόνου στο έδαφος μέσω τριών στρατηγικών: Τη στρατηγική της διαφυγής την έχουν επιλέξει είδη φυτών τα οποία διαβιούν σε συνθήκες περιβάλλοντος όπου σπάνια παρατηρείται κατάκλιση ή πλημμύρα των εδαφών. Τα σπέρματα των περισσοτέρων από τα φυτικά είδη της κατηγορίας αυτής δεν βλαστάνουν σε συνθήκες ανοξίας ή υποξίας.

11 Τη στρατηγική της ανθεκτικότητας ακολουθούν φυτά τα οποία διαθέτουν ορισμένους τουλάχιστον ιστούς ή κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διατηρούν στοιχειώδη μεταβολική δραστηριότητα ακόμη και αν βρίσκονται σε περιβάλλον υποξίας ή ανοξίας για παρατεταμένη χρονική περίοδο. Η στρατηγική της αποφυγής, η οποία είναι και το αντικείμενο της παρούσας άσκησης προσδίδει την ικανότητα στα φυτά που τη διαθέτουν να εφοδιάζουν τους ιστούς τους με επαρκείς συγκεντρώσεις οξυγόνου, παρά την επικράτηση αναερόβιων συνθηκών στον περιβάλλοντα χώρο. Επομένως τα κύτταρα των ιστών τους δεν έχουν την εμπειρία της υποξίας ή ανοξίας και κατά κανόνα παρουσιάζονται ευαίσθητοι έναντι της έλλειψης οξυγόνου. Η στρατηγική αυτή απαιτεί κατάλληλες μορφολογικές και ανατομικές τροποποιήσεις του βλαστού, των μίσχων των φύλλων και της ρίζας ούτως ώστε να γίνεται απρόσκοπτα η τροφοδοσία των κυττάρων τους με οξυγόνο. Οι τροποιήσεις αυτές μπορεί να είναι προϊόντα προσαρμογής ή εγκλιματισμού. Κύριοι εκπρόσωποι της κατηγορίας αυτής είναι φυτά τα οποία διαβιούν σε υγροβιοτόπους, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνεται και το ρύζι ως καλλιεργούμενο, και τα οποία έχουν προσαρμοστεί να αναπτύσσονται για παρατεταμένες χρονικές περιόδους σε εδάφη κορεσμένα σε νερό. Τα φυτά αυτά, ακόμη και αν ο βλαστός βρίσκεται μερικώς βυθισμένος στο νερό, αναπτύσσονται κανονικά χωρίς να εμφανίζουν συμπτώματα καταπόνησης. Ορισμένες ανατομικές διαφοροποιήσεις ιστών και οργάνων παίζουν καθοριστικό ρόλο στην επιτυχία της στρατηγικής της αποφυγής. Σε αυτές περιλαμβάνεται και ο σχηματισμός αερεγχύματος. Στα περισσότερα υδρόφυτα, αλλά και στα περισσότερα φυτά που διαθέτουν την ικανότητα εγκλιματισμού σε συνθήκες κατάκλισης του εδάφους, ο βλαστός και οι ρίζες διαθέτουν ή δημιουργούν ένα δίκτυο αεραγωγών οι οποίοι επικοινωνούν μεταξύ τους με επιμήκεις συνδέσεις.

12 Οι αεραγωγοί αυτοί αποτελούν μία ευφυή οδό μετακίνησης του οξυγόνου χωρίς να παρεμβάλονται ισχυρές αντιστάσεις. Στις περιπτώσεις αυτές τα κύτταρα των ιστών διαχωρίζονται μεταξύ τους, σχηματίζοντας το αερέγχυμα, δηλ. έναν ιστό ο οποίος διαθέτει κενούς χώρους οι οποίοι πληρώνονται από αέρα. Το αερέγχυμα σχηματίζεται είτε λυσιγενώς, δηλ. με λύση των κυττάρων του φλοιού, είτε σχιζογενώς, δηλ. με αμοιβαία απομάκρυνση των κυττάρων του φλοιού. Το οξυγόνο, εισέρχεται είτε μέσω των στοματίων των φύλλων, είτε μέσω ειδικών ανατομικών κατασκευών, μεταξύ των οποίων συμπεριλαμβάνονται τα φακίδια των αποξυλωμένων βλαστών, τα πνευματοφόρα (επιφανειακές ρίζες που χαρακτηρίζονται από αρνητικό γεωτροπισμό) των μανγκροβίων ειδών (δένδρα τα οποία εποικίζουν εκτάσεις οι οποίες καλύπτονται από υφάλμυρο νερό) και οι εναέριες ρίζες (knee roots) του είδους Taxodium distichum. Στη συνέχεια το οξυγόνο μέσω του αερεγχύματος μετακινείται προς τα σημεία κατανάλωσης. Η μετακίνηση του οξυγόνου συμβαίνει είτε μέσω διάχυσης είτε μέσω μαζικής ροής. Η διάχυση συμβαίνει λόγω της διαφοράς των μερικών πιέσεων Ο 2 που δημιουργείται κατά μήκος του αερεγχύματος. Η μετακίνηση μέσω μαζικής ροής προϋποθέτει μια διαφορά στην ατμοσφαιρική πίεση μεταξύ των φύλλων και των ριζών. Η διαφορά ατμοσφαιρικών πιέσεων δημιουργείται λόγω της διαφοράς θερμοκρασίας στη διάρκεια της ημέρας μεταξύ φύλλων (θερμότερα, λόγω απορρόφησης υπερύθρου ακτινοβολίας) και ατμόσφαιρας. Η ρίζα επίσης είναι ελαφρά ψυχρότερη των φύλλων, λόγω της παραμονής της στη σχετικά σταθερή θερμοκρασία του εδάφους ή του νερού. Η ελαφρά υψηλότερη ατμοσφαιρική πίεση που επικρατεί στα φύλλα ωθεί τον αέρα (ο οποίος είναι εμπλουτισμένος με Ο 2 λόγω της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας) προς τις ρίζες. Στα περισσότερα ελόβια υδρόφυτα το αερέγχυμα σχηματίζεται στις ρίζες ανεξάρτητα από την ύπαρξη ανοξίας ή υποξίας στο εξωτερικό περιβάλλον.

13 Ωστόσο σε ορισμένα μη υδρόφυτα (όπως π.χ. στο καλαμπόκι) ο κατάλληλος εγκλιματισμός με την εφαρμογή συνθηκών υποξίας αποτελεί το έναυσμα για μια σειρά ανατομικές και φυσιολογικές μεταβολές οι οποίες καθιστούν τα φυτά ικανά τα φυτά να αντεπεξέλθουν στην καταπόνηση. Υλικά και Μέθοδοι Στην παρούσα άσκηση θα χρησιμοποιήθούν, σπέρματα καλαμποκιού (Zea mays), πλαστικές γλάστρες, περλίτης, θρεπτικό διάλυμα. Τα σπέρματα καλαμποκιού προβλαστάνουν σε τρυβλία Petri στα οποία έχουν επιστρωθεί στρώματα διηθητικού χαρτιού διαβρεγμένα με νερό. Στη συνέχεια, τα νεαρά αρτίβλαστα, μεταφέρονται, ανά δύο, σε 4 πλαστικές γλάστρες που περιέχουν περλίτη. Τα νεαρά αρτίβλαστα ποτίζονται ανά διήμερο με αραιό θρεπτικό διάλυμα για μια εβδομάδα. Οι δύο από τις γλάστρες συνεχίζουν να ποτίζονται για 15 ημέρες με το θρεπτικό διάλυμα, ενώ οι άλλες δύο κατακλύζονται με θρεπτικό διάλυμα βυθιζόμενες σε μεγαλύτερες γλάστρες και παραμένουν πλημμυρισμένες επίσης για 15 ημέρες. Στο τέλος του πειράματος απομακρύνεται ο περλίτης με προσεκτική έκπλυση με νερό και γίνονται μορφολογικές μετρήσεις στα φυτά. Αποτελέσματα Στην παρουσίαση των αποτελεσμάτων θα περιλαμβάνονται οι παρακάτω μετρήσεις: 1. Ύψος υπέργειου τμήματος και ο αριθμός των φύλλων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των φυτών. 2. Το τελικό ύψος, ο αριθμός φύλλων και το μήκος ρίζας των φυτών στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας. 3. Εγκάρσιες τομές στις ρίζες και παρατήρηση στο μικροσκόπιο του αερεγχύματος που έχει σχηματιστεί στα φυτά που παρέμειναν σε περιβάλλον υποξίας. Σύγκριση με τομές ριζών από τα φυτά μάρτυρες.

14 Ενζυμική δοκιμή αλκοολικής αφυδρογονάσης Η ενζυμική δοκιμή βασίζεται στη συνεχή καταγραφή της αύξησης της απορρόφησης στα 340 nm λόγω της αναγωγής του NAD σε NADH σύμφωνα με την αντίδραση που καταλύει το ένζυμο αιθανόλη + NAD ακεταλδεϋδη + NADH Αντιδραστήρια 0,1 Μ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών ph 9.2 (αντίδρασης) 2 Μ αιθανόλη [12.12 ml 95% αιθανόλης σε 100 ml νερό] 0.025 Μ NAD 0,1 Μ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών ph 7.5 (εκχύλισης) εκχύλιση 1 gr ριζών εκχυλίζονται σε γουδί με άμμο με 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης. Το εκχύλισμα φυγοκεντρείται και το υπερκείμενο φυλάσσεται σε πάγο. Ενζυμική δοκιμή Ετοιμάζονται τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες ως εξής: σωλήνας 1 υποξικά φυτά σωλήνας 2 φυτά μάρτυρες σωλήνας 3 τυφλό ρυθμιστικό 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml διάλυμα αντίδρασης 2 Μ αιθανόλης 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.025 Μ NAD 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml εκχύλισμα 0.5 ml 0.5 ml (0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος) Η αντίδραση ξεκινά με την προσθήκη του εκχυλίσματος. Καταγράφεται η απορρόφηση στα 340 nm

15 Ασκηση ΙV. Ποιοτική ανίχνευση της έκλυσης υδροκυανίου από το τραυματισμένο ενδοσπέρμιο των πικραμυγδάλων Εισαγωγή Τα κυανογόνα γλυκοσίδια Τα κυανογόνα γλυκοσίδια αφορούν δευτερογενείς μεταβολίτες οι οποίοι ενισχύουν το αμυντικό οπλοστάσιο ορισμένων φυτών. Απαντώνται κυρίως σε ψυχανθή, καθώς και μέλη των οικογενειών Rosaceae, Gramineae, Araceae. Πρόκειται για αζωτούχες ενώσεις των οποίων το μόριο συνδέεται με ένα σάκχαρο. Υπό κανονικές συνθήκες δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη τοξικότητα. Ωστόσο σε περίπτωση τραυματισμού του ιστού που τα περιέχει, διασπώνται από κατάλληλα υδρολυτικά ένζυμα τα οποία στον άθικτο ιστό εντοπίζονται σε διαφορετικά υποκυτταρικά διαμερίσματα ή κυτταρα, παράγοντας προιόντα διάσπασης ορισμένα από τα οποία είναι εξαιρετικά τοξικά (π.χ. ρίζα κυανίου). R Η 2 Ο Σάκχαρο R R Ο C R Σάκχαρο Ο C κυανογόνο γλυκοσίδιο C R N HΟ C R HCN γλυκοζιδάση λυάση του C N υδροξυνιτριλίου κυανοϋδρίνη υδροκυάνιο Σχήμα 1. Η απελευθέρωση υδροκυανίου από κυανογόνο γλυκοσίδιο Το παραγόμενο υδροκυάνιο αποτελεί ως γνωστόν ισχυρότατο παρεμποδιστή της κυτταρικής αναπνοής, αφού παρεμποδίζει τη δράση των κυτοχρωμικών οξειδασών της αναπνευστικής αλυσίδας ροής ηλεκτρονίων. Η αμυγδαλιά Η αμυγδαλιά (Amygdalus communis L. ή Prunus amygdalus Stokes) εμφανίζεται αυτοφυόμενη στις θερμές και ξηρές περιοχές της Δ. Ασίας και

16 στις παραμεσόγειες της Ευρώπης και της Αφρικής. Υπάρχουν δύο φυσιολογικές ομάδες ή ποικιλίες, από τις οποίες η μία έχει γλυκά σπέρματα και η άλλη πικρά. Χαρακτηριστικό γνώρισμα των πικραμυγδάλων είναι η παρουσία στα σπέρματά τους, και μάλιστα στα παρεγχυματικά κύτταρα του εμβρύου, της αμυγδαλίνης. Σχήμα 2. Ο χημικός τύπος της αμυγδαλίνης Πρόκειται για κυανογόνο γλυκοσίδιο με εξαιρετικά πικρή γεύση, το οποίο απαντάται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις σε όλα τα πικροπύρηνα Prunus (Δαμασκηνιά, ροδακινιά, βερυκοκιά κ.ά.). Υπολογίζεται ότι κατά μέσο όρο στο ενδοσπέρμιο ενός πικραμυγδάλου περιέχεται αμυγδαλίνη ικανή να παράγει κατά τη διάσπασή της 1 mg HCN. Η θανατηφόρος δόση υδροκυανίου φθάνει τα 60 mg για τους ενήλικες και 5-10 mg για τα παιδιά. Η ανίχνευση του παραγομένου HCN βασίζεται στη μεταβολή του χρώματος κορεσμένου ουδέτερου διαλύματος πικρικού οξέος* (2,4,6 δινιτροφαινόλη) από λαμπερό κίτρινο σε καστανό. Το καστανό χρώμα οφείλεται στο σχηματισμό άλατος του ισοπουρπουρικού οξέος (4,6-δινιτρο-2-αμινο-3,5- δικυανοφαινόλη) με Να ή Κ. Η ένταση της χρωματικής αλλαγής σχετίζεται με τη συγκέντρωση του υπό εξέταση κυανογόνου. Υλικά και Μέθοδοι Σπέρματα γλυκών και πικρών αμυγδάλων Ορθογώνια τεμάχια χαρτιού χρωματογραφίας (3Χ4 cm) εμποτισμένα σε διάλυμα πικρικού οξέος* 0.05 Μ. (0.145 gr πικρικού οξέος σε 100 ml απιονισμένο νερό. Το ph ρυθμίζεται σε 7.0 με σταδιακή προσθήκη NaHCO3). Τέσσερεις διαφανής σωλήνες με καπάκι Κεραμικό πλακίδιο

17 Μαχαίρι Τα εμποτισμένα τεμάχια χάρτου στερεώνονται στην εσωτερική πλευρά από το καπάκι του πλαστικού σωλήνα Τρία σπέρματα γλυκών αμυγδάλων τεμαχίζονται σε μικρά κομμάτια στο κεραμικό πλακίδιο με το μαχαίρι. Τα τεμαχισμένα αμύγδαλα μεταφέρονται ταχέως στο πλαστικό σωλήνα ο οποίος, μετά την προσθήκη μικρής ποσότητας νερού, σφραγίζεται με το καπάκι το οποίο φέρει το εμποτισμένο χαρτί. Σημειώνεται ο χρόνος έναρξης της μεταβολής του χρώματος του χαρτιού. Ξεπλένεται με νερό το μαχαίρι και το πλακίδιο και επαναλαμβάνεται η διαδικασία με τα σπέρματα των πικραμυγδάλων Στους υπόλοιπους σωνλήνες τοποθετούμαι αντίστοιχα στον πρώτο νερό, ενώ στο δεύτερο τοποθετούνται δύο άθικτα πικραμύγδαλα. Αποτελέσματα Να συσχετιστούν τα αποτελέσματα με την αναμενόμενη αμυντική θωράκιση των δύο ποικιλιών έναντι εχθρών και παθογόνων. Να εκτιμηθεί η δυνατότητα χρήσης της μεθόδου για ταξινόμηση φυτικών ειδών αλλά και τον ποιοτικό έλεγχο γεωργικών προϊόντων τα οποία πρόκειται να αξιοποιηθούν ως τροφές. *Το πικρικό οξύ είναι εκρηκτικό αντιδραστήριο και οι χειρισμοί ζύγισης πρέπει να γίνονται με προφυλάξεις

18 Άσκηση V. Μελέτη φωτοσυνθετικών και υδατικών παραμέτρων των φύλλων του φυτού Vicia faba υπό την επίδραση έλλειψης νερού. Εισαγωγή Η ξηρασία, ως κλιματικός παράγων, είναι το αποτέλεσμα του συνδυασμού της περιορισμένης διαθεσιμότητας νερού (από την ατμόσφαιρα ή/και από το έδαφος) και της απώλειάς του (μέσω της εξατμισοδιαπνοής). Η ξηρασία αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες καταπόνησης οι οποίοι περιορίζουν τη γεωργική παραγωγή σε παγκόσμιο επίπεδο. Η έλλειψη νερού στο περιβάλλον της ρίζας έχει σημαντικές επιπτώσεις σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης ενός φυτικού οργανισμού. Τα πρώτα συμπτώματα έλλειψης νερού γίνονται εμφανή σε σύντομο χρονικό διάστημα και οφείλονται σε διαταραχές ορισμένων λειτουργιών. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα συμπτώματα αυτά είναι κοινά σε όλα τα φυτά και αποτελούν ταυτόχρονα και τους στοιχειώδεις μηχανισμούς εγκλιματισμού με τους οποίους αντιμετωπίζουν τον κίνδυνο πλήρους αφυδάτωσης. Η υδατική καταπόνηση που προκαλείται από τις παραπάνω συνθήκες έχει άμεσο αντίκτυπο στη φωτοσυνθετική λειτουργία. Αυτό γίνεται κατανοητό αν σκεφτούμε πως η υδατική καταπόνηση προκαλεί κλείσιμο των στοματίων και συνεπώς περιορισμό του ρυθμού εισόδου του CO 2 από την ατμόσφαιρα, το οποίο αποτελεί το υπόστρωμα του φωτοσυνθετικού αναβολισμού. Εάν ταυτόχρονα η ένταση της φωτεινής ακτινοβολίας είναι υψηλή, τότε, επειδή η συλλεγόμενη ενέργεια από τους χλωροπλάστες δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή φωτοχημικού έργου, αναπτύσσεται ένα δυνητικά επιζήμιο ενεργειακό περίσσευμα στα φωτοσυστήματα. Η παράταση αυτής της κατάστασης μπορεί να προκαλέσει συσσωρευμένες οξειδωτικές βλάβες στους χλωροπλάστες οι οποίες με τη σειρά τους οδηγούν σε μείωση της φωτοσυνθετικής ικανότητας. Η κατάσταση αυτή ονομάζεται φωτοαναστολή. Η έκταση της βλάβης που προκαλεί την φωτοαναστολή εξαρτάται από το παραπάνω ενεργειακό περίσσευμα σε συνδυασμό με τους βιοχημικούς μηχανισμούς φωτοπροστασίας. Τόσο η ικανότητα των χλωροπλαστών να χρησιμοποιούν την συλλεγόμενη ενέργεια (η οποία καθορίζει το ενεργειακό περίσσευμα σε δεδομένες συνθήκες έντασης ακτινοβολίας) όσο και η

19 ικανότητα των φωτοπροστατευτικών μηχανισμών εξαρτώνται, μεταξύ άλλων, από τις συνθήκες φωτισμού κάτω από τις οποίες έχουν εγκλιματιστεί τα φύλλα ενός φυτού. Έτσι, φύλλα σκιάς εμφανίζονται πιο επιρρεπή στην φωτοαναστολή συγκριτικά με φύλλα φωτός. Στόχος της παρούσας άσκησης είναι η διερεύνηση της επίδρασης της υδατικής καταπόνησης και της έντασης της ακτινοβολίας στις υδατικές και φωτοσυνθετικές παραμέτρους φύλλων κουκιού (Vicia faba) τα οποία έχουν εγκλιματιστεί σε διαφορετικά επίπεδα φωτεινής ακτινοβολίας κατά την ανάπτυξή τους. Υλικά και Μέθοδοι Σπέρματα κουκιού, πλαστικές γλάστρες, μίγμα περλίτη τύρφης, μικροσκόπια, θάλαμος ξήρανσης, ζυγός ακριβείας, υλικά για την κατασκευή του εκμαγείου των φύλλων, φορητό φθορισμόμετρο χλωροφύλλης, φορητό όργανο μέτρησης φωτοσύνθεσης. Τα σπέρματα κουκιού βλαστάνουν σε πλαστικές γλάστρες που περιέχουν μίγμα περλίτη τύρφης 1:1. Τα νεαρά φυτά και των δύο ομάδων ποτίζονται ανά διήμερο με νερό για δύο εβδομάδες. Μετά από την πάροδο δύο εβδομάδων, τα φυτά χωρίζονται σε δύο ομάδες, εκ των οποίων η πρώτη συνεχίζει να ποτίζεται κανονικά, ενώ η δεύτερη δεν ποτίζεται. Με την εμφάνιση ορατών συμπτωμάτων υδατικής καταπόνησης προσδιορίζονται και στις δύο ομάδες φυτών οι εξής παράμετροι 1. Σχετικό περιεχόμενο σε νερό 2. Άνοιγμα στοματίων 3. Φωτοσυνθετικός ρυθμός, ρυθμός διαπνοής και αντίσταση διαχύσεως των στοματίων 4. Φωτοχημική ικανότητα του φωτοσυστήματος ΙΙ υπό διαφορετικές εντάσεις φωτός Προσδιορισμός του σχετικού περιεχόμενου σε νερό (RWC) Το σχετικό περιεχόμενο σε νερό δίδει χρήσιμες πληροφορίες, σε συνδυασμό με το δυναμικό του νερού, για την υδατική κατάσταση των ιστών. Δίδεται από τον τύπο:

20 RWC = πραγματικό περιεχόμενο σε νερό/περιεχόμενο σε νερό σε πλήρη σπαργή Δηλ. RWC = νωπό βάρος-ξηρό βάρος / κορεσμένο βάρος-ξηρό βάρος Στη πράξη για να μετρηθεί το RWC υπολογίζεται το νωπό βάρος δύο ομάδων δίσκων που έχουν αποκοπεί από φύλλα: Στην πρώτη ομάδα λαμβάνεται γρήγορα το νωπό βάρος, ενώ στη δεύτερη λαμβάνεται το κορεσμένο βάρος, αφού προηγουμένως οι δίσκοι έχουν επιπλέυσει σε απιονισμένο νερό για 24 ώρες. Στη συνέχεια και οι δύο ομάδες τοποθετούνται σε κλίβανο (στους 80 ο C) ώστε να υπολογιστεί και το ξηρό τους βάρος. Μέτρηση του εύρους του στοματικού πόρου κατασκευή εκμαγείων φύλλου Περίπου 1 cm 3 σιλικονούχου υλικού απλώνεται σε τρυβλίο Petri και αναμειγνύεται με τη βοήθεια σπάτουλας με 1-2 σταγόνες στερεωτικού. Ένα λεπτό στρώμα μίγματος απλώνεται επάνω στο υπό εξέταση φύλλο. Η επάλειψη του φύλλου δεν πρέπει να διαρκέσει πάνω από 1 min, γιατί το μίγμα αρχίζει να σκληραίνει. Μετά από 10 min το στερεοποιημένο πλέον στρώμα της σιλικόνης (που αποτελεί το εκμαγείο της επιφάνειας του φύλλου) απομακρύνεται από το φύλλο προσεκτικά με τη βοήθεια λαβίδας με λεπτά άκρα. Στο εκμαγείο απλώνουμε άχρωμο στιλβωτικό νυχιών. Μετά από 2-3 min ξεφλουδίζουμε το στρώμα του στιλβωτικού από τη σιλικόνη με τη βοήθεια λαβίδας, το απλώνουμε σε αντικειμενοφόρο, προσθέτουμε μια σταγόνα νερού, καλύπτουμε με καλυπτρίδα και παρατηρούμε στο μικροσκόπιο το αποτύπωμα της επιδερμίδας. Μέτρηση φωτοσυνθετικού ρυθμού, ρυθμού διαπνοής και αντίστασης διαχύσεως των στοματίων με χρήση φορητού οργάνου μέτρησης φωτοσύνθεσης Το όργανο αποτελείται από ένα θάλαμο στον οποίο τοποθετείται το φύλλο και μια κονσόλα η οποία φιλοξενεί τα κύρια ηλεκτρονικά και μηχανικά εξαρτήματα. Ο θάλαμος διαθέτει θερμοζεύγος για τη μέτρηση της θερμοκρασίας και αισθητήρα για τη μέτρηση της έντασης της φωτεινής

21 ακτινοβολίας και είναι κατασκευασμένος έτσι, ώστε να είναι δυνατός ο εγκλεισμός ενός φύλλου μέσα σε αυτόν αεροστεγώς. Ακολούθως διαβιβάζεται στο θάλαμο αέρας με γνωστή συγκέντρωση CO 2 και υδρατμών. Λόγω, αφενός της φωτοσυνθετικής αφομοίωσης του CO 2 και αφετέρου λόγω της διαπνοής, ο αέρας που εξέρχεται του θαλάμου έχει μικρότερη συγκέντρωση CO 2 και υψηλότερη συγκέντρωση υδρατμών σε σχέση με τις αρχικές τιμές. Μέσω αναλυτών αερίων που διαθέτει η κονσόλα του οργάνου, είναι δυνατός ο υπολογισμός των αλλαγών αυτών, δηλ. ο υπολογισμός του Δ[CO 2 ] και Δ[Η 2 Ο] στη μονάδα του χρόνου. Μέσω αυτών των παραμέτρων, το όργανο παρέχει τις τελικές τιμές του φωτοσυνθετικού ρυθμού, του ρυθμού διαπνοής και της αντίστασης διαχύσεως των στοματίων. Σχήμα 3. Τα βασικά μέρη ενός φορητού οργάνου μέτρησης φωτοσύνθεσης.

22 Μέτρηση φωτοχημικής ικανότητας του φωτοσυστήματος ΙΙ α. Αρχή λειτουργίας Η φωτοχημική ικανότητα του φωτοσυστήματος ΙΙ (Φ PSII ) αντιπροσωπεύει την ικανότητα του φύλλου για τη διεξαγωγή των φωτεινών αντιδράσεων της φωτοσύνθεσης. Η παράμετρος Φ PSII αποτελεί έναν πολύ ευαίσθητο δείκτη τόσο για τη φωτοσυνθετική ταχύτητα όσο και για τους παράγοντες καταπόνησης που την περιορίζουν. Η μέτρησης της παραπάνω παραμέτρου πραγματοποιείται μέσω του φθορισμού της χλωροφύλλης. Κάθε φωτόνιο που απορροφάται από τις χλωροφύλλες αντιπροσωπεύει την ενέργεια η οποία θα χρησιμοποιηθεί για τη φωτοσύνθεση. Ωστόσο, για διάφορους λόγους δεν χρησιμοποιείται το σύνολο αυτής της ενέργειας με αποτέλεσμα να δημιουργείται μια περίσσεια ενέργειας. Η περίσσεια της ενέργειας διοχετεύεται μέσω δύο εναλλακτικών δρόμων: ο πρώτος είναι αυτός της θερμικής απόσβεσης, κυρίως μέσω του κύκλου των ξανθοφυλλών, και ο δεύτερος είναι αυτός του φθορισμού της χλωροφύλλης. Επειδή η συμβολή των παραπάνω τρόπων διοχέτευσης της ενέργειας αλλάζει ανάλογα με τις συνθήκες, η μελέτη των αλλαγών στην ένταση του φθορισμού της χλωροφύλλης παρέχει πληροφορίες για τη σχετική συνεισφορά των άλλων δύο δρόμων διοχέτευσης της ενέργειας δηλαδή αυτών του φωτοχημικού έργου και της θερμικής απόσβεσης. Η πρώτη διαδικασία σχετίζεται άμεσα με τη φωτοσύνθεση ενώ η δεύτερη έχει σημαντικό φωτοπροστατευτικό ρόλο για τα φυτά. β. Διαδικασία μέτρησης Το όργανο μέτρησης του φθορισμού της χλωροφύλλης αποτελείται από μια κονσόλα και μια οπτική ίνα. Στην κονσόλα βρίσκεται το ηλεκτρονικό μέρος, η φωτεινή πηγή και ο ανιχνευτής. Η φωτεινή πηγή διαμορφώνει τις συνθήκες φωτισμού του δείγματος ενώ ο ανιχνευτής καταγράφει τον εκπεμπόμενο φθορισμό. Στην άσκηση καταγράφουμε τον φθορισμό της χλωροφύλλης των φύλλων και συνεπώς την παράμετρο Φ PSII κάτω από διάφορες εντάσεις φωτός, ξεκινώντας από σκοτάδι και φτάνοντας έως την μέγιστη ένταση του ηλιακού φωτός.

23 Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι με την αύξηση της έντασης του φωτός παρατηρείται μείωση της παραμέτρου Φ PSII. Το φαινόμενο αυτό είναι φυσιολογικό και δεν σημαίνει πως η φωτοσυνθετική συσκευή δεν λειτουργεί σωστά. Ωστόσο, μεγάλη πτώση της παραμέτρου Φ PSII υποδηλώνει μικρή ικανότητα του φωτοσυστήματος ΙΙ να αξιοποιήσει την συλλεγόμενη ενέργεια. Όσο μεγαλύτερη η καταπόνηση (εδώ από την έλλειψη νερού) τόσο μεγαλύτερη η πτώση της παραμέτρου Φ PSII.

24 Ασκηση VI. α. Παρατήρηση αλληλεπιδράσεων και των συνεπειών μιας πυρκαγιάς σε ένα αντιπροσωπευτικό μεσογειακό οικοσύστημα Συλλογή και μετρήσεις στο πεδίο και στο εργαστήριο Πρόγραμμα εκδρομής Χρόνος: Ένα Σάββατο του Νοεμβρίου (η ακριβής ημερομηνία θα καθοριστεί μετά την έναρξη των μαθημάτων) Τοποθεσία: Πάρνηθα Αναλυτικό πρόγραμμα 8:00 π.μ. Αναχώρηση από ΓΠΑ 8:45 π.μ. Άφιξη σε Θρακομακεδόνες 9: 00 π.μ.-12:00 π.μ. Πεζοπορία, άφιξη στο καταφύγιο Φλαμπούρι 12:00 14:00 Συλλογή δειγμάτων υπαίθρου, επιτόπιες διαλέξεις σχετικές με τα αντικείμενα των μαθημάτων 14:00 17:00 Κάθοδος σε Θρακομακεδόνες 17:00 Αναχώρηση με το πούλμαν 17:45 Άφιξη στο ΓΠΑ τέλος εκδρομής Φύλαξη δειγμάτων στο ψυγείο Απαραίτητος εξοπλισμός φοιτητών Αθλητικά παπούτσια ή ορειβατικές μπότες μικρό σακίδιο σουγιάς, ψαλίδι ένα σάντουϊτς, ένα μπουκάλι νερό μπουφάν, αδιάβροχο μπλοκ σημειώσεων και μολύβι Εργαστηριακός εξοπλισμός ραδιόμετρο-χλωροφυλλόμετρο παχύμετρο αεροστεγή σακουλάκια συλλογής δειγμάτων φορητό ψυγείο φαρμακείο

25 β. Ανατομικά και Φυσιολογικά χαρακτηριστικά φύλλων σκιάς και φύλλων φωτός Εισαγωγή Τα φύλλα εγκλιματίζονται στο φωτεινό καθεστώς στο οποίο αναπτύσσονται. Ο εγκλιματισμός εμφανίζεται τόσο σε ανατομικό μορφολογικό επίπεδο (πάχος φύλλου, επιφάνεια φύλλου, SLA, αναλογία φωτοσυνθετικών και σκληρεγχυματικών ιστών), όσο και σε βιοχημικό επίπεδο (φωτοσυνθετικές και βοηθητικές χρωστικές, βιοχημικός εξοπλισμός χλωροπλαστών, φωτοσυνθετική και αναπνευστική ταχύτητα κ.ά.). Έντονος εγκλιματισμό σε περιβάλλον σκιάς ή άπλετου φωτισμού στο πεδίο χαρακτηρίζει τα φύλλα ειδών της οικογένεια Fagaceae (π.χ. αριά Quercus ilex, πουρνάρι Quercus coccifera). Φύλλα των ειδών αυτών συλλέγονται στην Πάρνηθα σε θέσεις με διαφορετικό καθεστώς φωτισμού. Σε κάθε θέση καταγράφεται επί τόπου η ένταση φωτισμού σε μmole m -2 s -1. Τα φύλλα μεταφέρονται αμέσως σε αεροστεγή σακουλάκια τα οποία κλείνονται αμέσως και φυλάσσονται στο φορητό ψυγείο. Τα δείγματα μεταφέρονται στο εργαστήριο και φυλάσσονται στο ψυγείο μέχρι την ημέρα της άσκησης. Μετρήσεις Σε φύλλα σκιάς και φύλλα φωτός προσδιορίζεται η επιφάνειά τους και το πάχος τους. Στη συνέχεια τοποθετούνται στους 85 0 C για 24 ώρες και καταγράφεται το ξηρό τους βάρος. Στη συνέχεια υπολογίζεται το SLA. Εκχύλιση και φασματομετρικός προσδιορισμός φωτοσυνθετικών χρωστικών Προζυγισμένα τεμάχια φύλλων γνωστής επιφάνειας τοποθετούνται σε σωλήνες που περιέχουν διμεθυλσουλφοξείδιο (DMSO) στους 65 o C για 15 min. Κατόπιν το έγχρωμο εκχύλισμα μεταγγίζεται σε καθαρούς σωλήνες, γίνεται συμπλήρωση DMSO ώστε να έχουμε σταθερό, γνωστό όγκο σε όλα τα δείγματα και στη συνέχεια προσδιορίζεται η απορρόφηση στα 645 nm και 663 nm.

26 Συγκέντρωση Chla (mg L-1)= 12.21 x A 663-2.81 x A 645 Συγκέντρωση Chlb (mg L-1)= 20.13 x A 645-5.03 x A 663 Φύλλα σκιάς Πάχος φύλλου Μέση επιφάνεια φύλλου SLA Φύλλα φωτός Φύλλα σκιάς Συγκέντρωση Chla (mg L -1 ) Συγκέντρωση Chlb (mg L -1 ) Λόγος Chla/Chlb Φύλλα φωτός

27 Ασκηση VΙI. Δενδροχρονολογία και δενδροκλιματολογία Σκοπός της άσκησης είναι ο προσδιορισμός της ηλικίας των καμένων δένδρων ελάτης του εθνικού δρυμού της Πάρνηθας καθώς και η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης μεταξύ του πάχους των δακτυλίων με δυσμενείς κλιματικές συνθήκες που επικράτησαν κατά τα τελευταία 30 χρόνια. Εισαγωγή Η Δενδροχρονολογία είναι η επιστήμη χρονολόγησης (δενδροχρονολόγησης) και μελέτης των ετησίων δακτυλίων δειγμάτων ξύλου από ζωντανά δένδρα και αρχαιολογικά λείψανα. Η δενδροχρονολόγηση, αντίθετα με άλλες μεθόδους χρονολόγησης (π.χ. με τη χρήση ισοτόπων) παρέχει, υπό προϋποθέσεις, τη δυνατότητα απόλυτης και όχι κατά προσέγγισης χρονολόγησης των δειγμάτων. Τα δεδομένα των δακτυλίων των πολυετών δένδρων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανασύνθεση των ετήσιων διακυμάνσεων του κλίματος σε περιόδους για τις οποίες δεν υπάρχουν καταγεγραμμένες μετεωρολογικές μετρήσεις. Η μελέτη των δεδομένων αυτών αποτελούν αντικείμενο της δενδροκλιματολογίας. Η αρχή της δενδροκλιματολογίας στηρίζεται στην παραδοχή ότι το πάχος των ετήσιων δακτυλίων (και επομένως και η ανάπτυξη του φυτικού οργανισμού) μειώνεται σε περιόδους στις οποίες επικρατούν παράγοντες καταπόνησης στο περιβάλλον ανάπτυξης. Ωστόσο η συσχέτιση πάχους δακτυλίων και δυσμενών περιόδων απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή διότι πολυάριθμοι παράγοντες, ενδογενείς και περιβαλλοντικοί μπορούν να επηρεάσουν δυσμενώς την ανάπτυξη ενός δένδρου. Σε αυτούς περιλαμβάνονται η ανεπάρκεια νερού και θρεπτικών συστατικών, η σκίαση, οι ακραίες θερμοκρασίες, προσβολές κ.ά. Ορισμένοι επομένως παράγοντες δεν σχετίζονται άμεσα με το κλίμα που επικρατεί σε μια περιοχή. Μορφολογία των ετήσιων δακτυλίων Οι ετήσιοι δακτύλιοι των δένδρων που αποικίζουν εύκρατα κλίματα (στα οποία παρατηρούνται εποχιακές εναλλαγές των κλιματικών συνθηκών) απαρτίζονται συνήθως από δύο ευδιάκριτες ζώνες: Τη ζώνη του πρώιμου (εαρινού) ξύλου και τη ζώνη του όψιμου (θερινού) ξύλου, οι οποίες

28 διαφέρουν τόσο όσο προς τον χρωματισμό, όσο και ως προς την πυκνότητά τους (εικόνες 1 και 2). Το πρώιμο ξύλο απαρτίζεται από λεπτότοιχα ευμεγέθη κύτταρα, ενώ το περισσότερο συμπαγές όψιμο ξύλο απαρτίζεται από μικρότερου μεγέθους κύτταρα με παχιά κυτταρικά τοιχώματα. Εικόνα 1. Ετήσιοι δακτύλιοι κωνοφόρου σε μεγέθυνση. Διακρίνεται η ζώνη πρώιμου ξύλου (early wood) και η ζώνη όψιμου ξύλου (late wood). Οι λευκοί κυκλικοί σχηματισμοί είναι ρητινοφόροι αγωγοί. Τα όρια μεταξύ των δακτυλίων (η εναλλαγή μεταξύ πρώιμου και όψιμου ξύλου) είναι σαφή, ενώ στη περίπτωση των ψευδοδακτυλίων τα όρια εμφανίζονται ασαφή. Εικόνα 2. Ετήσιοι δακτύλιοι κομμένου κορμού ελάτης στην Πάρνηθα. Τα λευκά βέλη υποδεικνύουν πιθανούς ψευδοδακτυλίους. Ο εξωτερικός δακτύλιος αριστερά δείχνει την ημερομηνία κοπής ή δειγματοληψίας (στη συγκεκριμένη περίπτωση την ημερομηνία της πυρκαιάς), ενώ ο τελευταίος δακτύλιος στο κέντρο (δεν παρουσιάζεται στην εικόνα) την ημερομηνία κατά την οποία το δένδρο ήταν ένα νεαρό δενδρύλιο.

29 Δενδροχρονολόγηση Η απλή καταμέτρηση των δακτυλίων όχι μόνο δεν εξασφαλίζει την ακριβή χρονολόγηση των επί μέρους δακτυλίων, αλλά μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα συμπεράσματα. Η ανάγκη ακριβούς αντιστοίχησης ενός ημερολογιακού έτους σε έναν και μόνο δακτύλιο επέβαλε τη χρήση της διασταυρωμένης χρονολόγησης. Η διασταυρωμένη χρονολόγηση (crossdating) αποτελεί ζωτικής σημασίας τεχνική της δενδροχρονολόγησης. Με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται η σύμπτωση (ταίριασμα) των χαρακτηριστικών ανάπτυξης των δακτυλίων πολυάριθμων δειγμάτων μιας περιοχής στην οποία επικρατούν παρόμοιες κλιματικές συνθήκες. Η σωστή διασταυρωμένη χρονολόγηση επιτρέπει την ταυτοποίηση της ακριβούς ημερομηνίας σχηματισμού του κάθε δακτυλίου. Η τεχνική αυτή, εφόσον είναι δυνατό να εφαρμοστεί, δίδει τη δυνατότητα στους ερευνητές «να πάνε πίσω στο χρόνο» μέσω διαδοχικών, επάλληλων δενδροχρονολογήσεων διαφορετικών δειγμάτων και λειψάνων. Συνεπώς είναι εφικτή και η ανασύσταση των κλιματικών συνθηκών σε βάθος χρόνου (σε ορισμένες περιπτώσεις για χιλιάδες χρόνια). Ο σχεδιασμός του σκελετού (skeleton plotting) αποτελεί μία εύχρηστη μέθοδο διασταυρωμένης χρονολόγησης σε δακτυλίους. Με τη μέθοδο αυτή αποτυπώνονται οι διακυμάνσεις στο πάχος των δακτυλίων ενός δένδρου πάνω σε χαρτί μιλιμετρέ και επισημαίνονται παρόμοιες τάσεις μεταβολών σε διαφορετικά δένδρα.

Α Skeleton Plotting 10 9 8 7 6 5 b 4 3 2 1 Β 80 85 90 95 00 05 07 2.0 1.0 0.0 80 85 90 95 00 05 07

Στο διάγραμμα Α σημειώνονται οι δακτύλιοι ενός υποθετικού κορμού οι οποίοι παρουσιάζουν μικρότερο πάχος συγκριτικά με τους γειτονικούς τους και βαθμονομούνται με βάση την κλίμακα στον άξονα των ψ. Π.χ. ο δακτύλιος του 1991 ο οποίος παρουσιάζει πάχος ίσο με το μισό των γειτονικών του σχεδιάζεται ως μια μπάρα με μέγεθος 5 και ο δακτύλιος του 1982 ο οποίος παρουσιάζει ακόμη μικρότερο πάχος σχεδιάζεται ως μια μπάρα με μέγεθος 7. Επισημαίνονται επίσης δακτύλιοι οι οποίοι παρουσιάζουν εξαιρετικά μεγάλο πάχος με το γράμμα b (στο παράδειγμα ο δακτύλιος του 2000). Στη συνέχεια οι σκελετοί ελέγχονται για την ύπαρξη ψευδοδακτυλίων ή την απουσία ενός ή περισσοτέρων δακτυλίων οι οποίοι σημειώνονται και ο σκελετός σχεδιάζεται εκ νέου. Στο διάγραμμα Β σημειώνονται, στις αντίστοιχες χρονιές, τα πάχη των δακτυλίων ως εξής: 1.0, ο μέσος όρος πάχους όλων των δακτυλίων, κανονική ανάπτυξη. 0.0., μηδενικό πάχος δακτυλίου, μηδενική ανάπτυξη 2.0, μέγιστο καταγεγραμμένο πάχος δακτυλίου, μέγιστη ανάπτυξη. Οι ενδιάμεσες τιμές αποτυπώνουν ενδιάμεσα πάχη δακτυλίων. Δειγματοληψία δένδρων Προτιμώνται δένδρα με «ευαίσθητη» ανάπτυξη, δηλ. δένδρα που αναπτύσσονται σε οριακά περιβάλλοντα και είναι εκτεθειμένα σε παράγοντες καταπόνησης, όπως π.χ. υδατική καταπόνηση. Στα δένδρα αυτά η εμφάνιση διαταραχών στο πάχος των δακτυλίων παρουσιάζεται περισσότερο έντονη (οι διαφορές στο πάχος των δακτυλίων ενισχύονται). Αποφεύγονται δένδρα για τα οποία υπάρχουν ενδείξεις ότι για ένα χρονικό διάστημα σκιάζονταν ή μεταβλήθηκε η κλίση τους. Ανωμαλίες στην ανάπτυξη των δακτυλίων Η ανάπτυξη των δακτυλίων δεν ακολουθεί πάντα ετήσιο ρυθμό (επομένως δεν είναι όλοι οι δακτύλιοι ετήσιοι). Σε ορισμένες περιπτώσεις (π.χ. εξαιρετικά ακραίες τιμές κλιματικών παραμέτρων) δεν παρατηρείται ανάπτυξη δακτυλίου, τουλάχιστον σε τμήμα του εξεταζόμενου κορμού, και ο δακτύλιος χαρακτηρίζεται «τοπικά απών». Σε άλλες περιπτώσεις παρατηρείται ανάσχεση της ανάπτυξης του εαρινού ξύλου (λόγω π.χ. ενός επεισοδίου παγετού ή ξηρασίας) και επανέναρξή της μετά από ένα χρονικό διάστημα, δίνοντας την εντύπωση ενός πρόσθετου δακτυλίου. Οι δακτύλιοι αυτοί ονομάζονται ψευδοδακτύλιοι και ο εντοπισμός τους απαιτεί εμπειρία

32 και εξέταση των δειγμάτων σε στερεοσκόπιο ή μικροσκόπιο. Οι ψευδοδακτύλιοι διακρίνονται από τους κανονικούς διότι τα όριά τους είναι ασαφή. Μετρήσεις δενδροχρονολόγησης είναι πλέον διαθέσιμες για περισσότερα από 500 είδη φυτών, τα οποία κατατάσσονται σύμφωνα με τους δείκτες 0, 1, ή 2, ανάλογα με τη σημασία τους (χαμηλής, μέτριας, σημαντικής) σε σχετικές ερευνητικές εργασίες. Το Abies cephalonica χαρακτηρίζεται με το δείκτη 1 μέτριας σημασίας (υπάρχει δυνατότητα διασταυρωμένης χρονολόγησης μεταξύ του ίδιου δένδρου ή μεταξύ διαφορετικών δένδρων της ίδιας περιοχής-δεν υπάρχουν όμως δεδομένα διασταυρωμένης χρονολόγησης μεταξύ δένδρων διαφορετικών περιοχών). Τα στοιχεία αυτά έχουν δημοσιευτεί στο περιοδικό Tree-Ring Bulletin, Volume 53 και είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα Henri D. Grissino-Mayer s Ultimate Tree-Ring Web Pages (http://web.utk.edu/grissino/species.htm). Αντικείμενο της άσκησης 1. Επιτόπια εξέταση δακτυλίων Στη διάρκεια της εκδρομής στον εθνικό δρυμό της Πάρνηθας επιλέγονται κατάλληλοι κομμένοι κορμοί καμένων δένδρων ελάτης (Abies cephalonica) στους οποίους παρατηρούνται οι ετήσιοι δακτύλιοι, επισημαίνονται πιθανές διαταραχές στο πάχος τους και υπολογίζεται κατά προσέγγιση η ηλικία του δένδρου. Επιλέγονται επίσης κομμένοι κορμοί στους οποίους παρατηρείται η ανάπτυξη συμπιεσμένου ξύλου λόγω απόκτησης κλίσης του δένδρου και επισημαίνεται η πιθανή ηλικία κατά την οποία συνέβη η μεταβολή. Λαμβάνονται ψηφιακές φωτογραφίες υψηλής ανάλυσης με χρήση χάρακα (που χρησιμεύει ως κλίμακα) προσανατολισμένου κατά τη διεύθυνση Βορά- Νότου με τη χρήση πυξίδας. 2. Σχεδιασμός σκελετού στο εργαστήριο Κάθε ομάδα παραλαμβάνει φωτογραφίες από κορμούς τεσσάρων δένδρων και σχεδιάζει το σκελετό τους. Σε κάθε κορμό ο σκελετός σχεδιάζεται τρεις φορές, με διαφορετικό κατ ακτίνα προσανατολισμό κάθε φορά. 3. Διασταυρωμένη χρονολόγηση Κάθε ομάδα διασταυρώνει τις τρεις διαφορετικές σχεδιάσεις σκελετού του ίδιου κορμού. Επισημαίνει και συζητά πιθανές ανωμαλίες που δυσχεραίνουν

33 τη χρονολόγηση. Υπολογίζει την ηλικία του καμένου δένδρου. Στη συνέχεια προχωρά σε διασταυρωμένη χρονολόγηση των σκελετών των τεσσάρων διαφορετικών κορμών για τα τελευταία 30 χρόνια. Συσχετίζει πιθανές διαταραχές στο πάχος των δακτυλίων με τα μετεωρολογικά δεδομένα που έχει στη διάθεσή της (Σταθμός Τατοΐου της ΕΜΥ, στοιχεία μεταξύ των ετών 1955-2007). 4. Υπολογισμός του πάχους των δακτυλίων με επεξεργασία και ανάλυση εικόνας Πραγματοποιείται κατάλληλη επεξεργασία των ψηφιακών εικόνων και στη συνέχεια με ανάλυση των στοιχείων των εικόνων προσδιορίζονται τα πάχη των δακτυλίων.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 80 85 90 95 00 05 07 2.0 1.0 0.0 80 85 90 95 00 05 07

Οδηγίες ασφάλειας στο εργαστήριο

36 Το εργαστηριακό περιβάλλον μπορεί να αναδειχτεί σε έναν εξαιρετικά επικίνδυνο χώρο, ακόμη και για τη ζωή μας, εάν δεν τηρούνται με ευλάβεια οι σωστοί κανόνες εκτέλεσης των ασκήσεων. Οι κανόνες ασφάλειας σε ένα εργαστηριακό χώρο έχουν τους εξής στόχους: 1. την προσωπική ασφάλεια των φοιτητών και των εργαζόμενων 2. την ασφάλεια του εργαστηρίου (εγκαταστάσεις, συσκευές) 3. την προστασία του περιβάλλοντος. Οι σημαντικότερες εστίες κινδύνου σε ένα εργαστήριο σε συνθήκες εργαστηριακής άσκησης αφορούν σε: Ηλεκτροπληξία Πυρκαγιά Επικίνδυνα χημικά αντιδραστήρια. τα οποία μπορούν εν δυνάμει να προκαλέσουν Εγκαύματα Εκρήξεις-ενρήξεις πυρκαγιά Θα πρέπει επίσης να έχουμε υπ όψη μας ότι κίνδυνοι ατυχήματος υπάρχουν και σε πειράματα στα οποία χρησιμοποιούνται υγροποιημένα αέρια ή επικίνδυνες ακτινοβολίες. Τα θέματα αυτά δεν αναπτύσσονται. Ορισμένες Γενικές οδηγίες Δουλεύουμε πάντα σε καθαρό πάγκο Είμαστε σχολαστικοί με την καθαριότητα και την τήρηση της τάξης στον εξοπλισμό που χρησιμοποιούμε. Κρατάμε σχολαστικές σημειώσεις για την πρόοδο των πειραμάτων μας. Δεν καπνίζουμε και δεν τρώμε Εάν χειριζόμαστε διαβρωτικά ή άλλα επικίνδυνα αντιδραστήρια φοράμε ιατρική μπλούζα. Προσέχουμε κατά τη μεταφορά επικίνδυνων αντιδραστηρίων, ώστε να αποφεύγουμε τη διασπορά τους και την επαφή με αυτά. Πρέπει να έχουμε επίγνωση των κινδύνων που διατρέχουμε όταν χειριζόμαστε μια ουσία. Γι αυτό το λόγο, εάν δεν μας έχουν δοθεί οι απαραίτητες πληροφορίες, απευθυνόμαστε στον διδάσκοντα. Δεν συμπεριφερόμαστε ως μαθητευόμενοι μάγοι. Είμαστε υποχρεωμένοι να προστατεύουμε όχι μόνο τους εαυτούς μας, αλλά και τους συναδέλφους μας και το περιβάλλον. Μπουκάλια που περιέχουν ισχυρά οξέα πρέπει πάντοτε να φυλάγονται σε χαμηλά ράφια ή καλύτερα στο πάτωμα.

37 Μην αποθηκεύετε μεγάλες ποσότητες οργανικών διαλυτών στο ίδιο δωμάτιο. Μη χρησιμοποιείτε ποτέ τα σιφώνια (πιπέτες) με το στόμα για τη λήψη επικίνδυνων αντιδραστηρίων. Πτητικούς διαλύτες και άλλες επικίνδυνες ουσίες τις χειριζόμαστε μόνο στην απαγωγό εστία. Δεν χρησιμοποιούμε φλόγα για να ζεστάνουμε διαλύματα οργανικών διαλυτών, κίνδυνος ανάφλεξης. Γενικώς δεν ανάβουμε αναπτήρες ή σπίρτα στο εργαστήριο, εκτός αν υπάρξει συγκεκριμένη εντολή από πλευράς διδάσκοντος. Πρέπει πάντα να συμβουλευόμαστε τη βιβλιογραφία όταν πρόκειται να χρησιμοποιήσουμε ένα άγνωστο αντιδραστήριο Πρέπει να γνωρίζουμε τη συμβατότητα των χημικών αντιδραστηρίων που πρόκειται να αναμείξουμε Επικίνδυνα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε ειδικούς χώρους Όταν ζυγίζουμε χημικά αντιδραστήρια προσέχουμε η σπάτουλα να είναι σχολαστικά καθαρή. Η μόλυνση ενός αντιδραστηρίου από ένα άλλο είναι καταστροφική για το εργαστήριο και είναι εξαιρετικά δύσκολο να εντοπιστεί εκ των υστέρων. Σε ορισμένες ασκήσεις χρησιμοποιούνται επικίνδυνα αντιδραστήρια. Η επικινδυνότητα του κάθε αντιδραστηρίου αναγράφεται στη συσκευασία του, αλλά θα πρέπει ο φοιτητής ή ο εργαζόμενος να μπορεί να αντιληφθεί τον τρόπο γραφής και σήμανσης της επικινδυνότητας αυτής. Τα επικίνδυνα αντιδραστήρια διακρίνονται σε τοξικά, καρκινογόνα / αλλεργιογόνα και ραδιενεργά. Όλες οι χημικές ουσίες έχουν υποχρεωτικά στη συσκευασία τους την απαραίτητη σήμανση επικινδυνότητας η οποία απεικονίζεται. Η γνώση του κάθε συμβόλου επιβάλλεται, διότι μόνον τότε λαμβάνονται οι απαραίτητες προφυλάξεις. Explosive = εκρηκτικό Oxidizing = οξειδωτικό

38 Extremely flammable = πάρα πολύ εύφλεκτο Highly flammable = πολύ εύφλεκτο Very toxic = πολύ τοξικό Toxic = τοξικό Corrosive =διαβρωτικό Harmful = επιβλαβές Irritant = ερεθιστικό Dangerous for the environment = επικίνδυνο για το περιβάλλον Κάθε συσκευασία που περιέχει χημικό αντιδραστήριο συνοδεύεται από κωδικοποιημένες φράσεις (ουσιαστικά περιεκτικές οδηγίες) για τον ενδεχόμενο κίνδυνο (risk phrase, R) και για ενδεχόμενους χειρισμούς ασφάλειας (safety phrase, S). Π.χ. η οδηγία R1 σημαίνει ότι το αντιδραστήριο είναι εκρηκτικό όταν ξηρανθεί. Η οδηγία S3 σημαίνει ότι το αντιδραστήριο πρέπει να παραμείνει σε δροσερό μέρος. Αναφέρονται ορισμένοι κανόνες χρήσεις επικίνδυνων αντιδραστηρίων, παρόλο που δεν γίνεται χρήση σε εργαστηριακές ασκήσεις φοιτητών (α) Τοξικά Οι ουσίες αυτές πρέπει να χρησιμοποιούνται σε απαγωγό ή σε καλά αεριζόμενο χώρο. Πρέπει να αποφεύγεται η επαφή με το δέρμα καθώς επίσης και η εισπνοή των ατμών τους. Κατά τη χρήση τους απαγορεύεται η κατανάλωση τροφής και το κάπνισμα. (β) Καρκινογόνα - Αλλεργιογόνα Συνιστάται η χρήση γαντιών μιας χρήσης και να μη χρησιμοποιούνται οργανικοί διαλύτες για το καθαρισμό του δέρματος παρά μόνο καθαριστικές αλοιφές (Swarfega) ή ζεστό νερό και σαπούνι και τρίψιμο με βούρτσα. (γ) Ραδιενεργά Η χρήση ραδιενεργών ουσιών προϋποθέτει ειδικούς κανόνες ασφάλειας και εξοπλισμό. Δεν γίνεται χρήση τέτοιου είδους ουσιών στο εργαστήριο Φυσιολογίας. Χρήση γυαλικών Σπασμένα ή ραγισμένα γυαλικά δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για την αποφυγή τραυματισμών αλλά ακόμα επειδή αυτά μπορεί εύκολα να σπάσουν και έτσι να χάσουμε τα ίσως πολύτιμα παρασκευάσματά μας ή να χυθεί κάποια επικίνδυνη ουσία πάνω μας. Τα σπασμένα γυαλικά, ξυραφάκια κλπ αιχμηρά αντικείμενα πρέπει να πετάγονται σε ξεχωριστό κουτί για την αποφυγή τραυματισμού των

39 καθαριστριών αλλά και το σκίσιμο των σάκων των απορριμμάτων κατά τη μεταφορά τους. Ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή Κ. Φασσέα για τη συμβολή του στη συγγραφή των οδηγιών