ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ιαδερµική χορήγηση φαρµάκων: I] Σύγκριση διαφόρων τύπων ελαστικών λιποσωµάτων και µελέτη µηχανισµού αύξησης διαπερατότητας υδατοδιαλυτών φαρµάκων µε τη χρήση τους. ΙΙ] Αύξηση διαπερατότητας αντιϋπερτασικών φαρµάκων µε συστήµατα ενισχυτών διαπέρασης. ΒΑΣΙΛΙΚΗ Π. ΝΤΥΜΕΝΟΥ Φαρµακοποιός ΠΑΤΡΑ 2012

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιµησιάρη, Καθηγήτρια Τµήµατος Φαρµακευτικής Κωνσταντίνος Αυγουστάκης, Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Φαρµακευτικής Παύλος Κλεπετσάνης, Επίκουρος Καθηγητής Τµήµατος Φαρµακευτικής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ. Αντιµησιάρη, Καθηγήτρια Τµήµατος Φαρµακευτικής Κ. Αυγουστάκης, Αναπλ. Καθηγητής Φαρµακευτικής Π. Κλεπετσάνης, Επικ. Καθηγητής Φαρµακευτικής Ε. Παπαδηµητρίου, Αναπλ. Καθηγήτρια Φαρµακευτικής Γ. Σωτηροπούλου, Αναπλ. Καθηγήτρια Φαρµακευτικής Σ. Τοπούζης, Επικ. Καθηγητής Φαρµακευτικής Ν. Τσοπάνογλου, Αναπλ. Καθηγητής Φαρµακολογίας, τµήµα Ιατρικής

Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια µεταπτυχιακού προγράµµατος σπουδών του Πανεπιστηµίου Πατρών σε συνεργασία µε το εργαστήριο Φαρµακευτικής Τεχνολογίας, του τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Friedrich Schiller της Jena, Γερµανία. Η ανάθεση του θέµατος και η επίβλεψη της διδακτορικής διατριβής πραγµατοποιήθηκε από την κα Σοφία Αντιµησιάρη, καθηγήτρια του τµήµατος Φαρµακευτικής. Με την ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στους ανθρώπους που συνέβαλαν ουσιαστικά σε αυτό. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την καθηγήτρια κα Σοφία Αντιµησιάρη, επιβλέπουσα της διατριβής, για την πολύτιµη αρωγή της κατά τη διάρκεια εκπόνησης της µελέτης και κατά τη διάρκεια συγγραφής της. Επιπλέον, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου για την ευκαιρία που µου έδωσε να πραγµατοποιήσω µέρος της διατριβής µου σε πανεπιστήµιο του εξωτερικού και να αποκοµίσω πολλά οφέλη από την εµπειρία αυτή. Ευχαριστώ τον καθηγητή Alfred Fahr, του πανεπιστηµίου Friedrich Schiller, Jena και την οµάδα του που µε δέχτηκε ως µεταπτυχιακή φοιτήτρια στο τµήµα του και µου έδωσε τη δυνατότητα να αναπτύξω τις τεχνικές που χρησιµοποίησα στη διατριβή µου. Ευχαριστίες προς τα µέλη της τριµελούς και επταµελούς επιτροπής για τις καίριες παρατηρήσεις ως προς τη συγγραφή. Eυχαριστίες στο Galenos Network, µέσω του οποίου µου δόθηκε η ευκαιρία να πραγµατοποιήσω µέρος της διατριβής µου σε πανεπιστήµιο του εξωτερικού και για τη δυνατότητα χρηµατοδότησης της εργασίας αυτής µε υποτροφία Marie Curie. Ευχαριστώ τον F.Steiniger για την πολύτιµη βοήθειά του µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο cryo-tem και την Dr. Jana Thamn για τη βοήθειά της µε το οπτικό µικροσκόπιο και την κρυο-µικροτόµο. Θερµές ευχαριστίες στους πλαστικούς ιατρούς Dr Gruhl, (Kassell, Germany) και ήµητρα Τσιλιµπότη (νοσοκοµείο Άγιος Ανδρέας, Πάτρα) για την ευγενική χορηγία του ανθρώπινου δέρµατος µετά από πλαστική επέµβαση κοιλιάς. Ευχαριστώ τον κ. Ταραβήρα, επίκουρο καθηγητή του τµήµατος Ιατρικής του πανεπιστηµίου Πατρών για την ευγενική παραχώρηση και βοήθεια µε την κρυοτόµο. Ευχαριστώ την εταιρία ELDRUG για την παροχή της πειραµατικής ουσίας. 2

Ευχαριστώ τους γονείς και τα αδέρφια µου για την αγάπη και την πολύπλευρη στήριξη που πάντα.µου προσφέρουν. Ευχαριστώ ιδαίτερα τo Γιώργο για την παρότρυνσή του ώστε να ολοκληρωθεί η παρούσα διατριβή και τη σηµαντική πρακτική βοήθειά του στη συγγραφή και ολοκλήρωσή της. Τέλος, θα ήθελα να πω ευχαριστώ στο Θοδωρή µου. Χωρίς πολλά λόγια.για όλα. 3

Αφιερώνεται στο Θοδωρή και στο γιο µας, Ορέστη 4

5

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 6 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 10 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 13 ABSTRACT 16 1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 18 1.1 Λιποσώµατα - Γενικά Στοιχεία 18 1.1.1 οµικά στοιχεία Χαρακτηριστικά λιποσωµάτων 20 1.1.1.1 Λιπίδια 20 1.1.2 Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (Phase transition -Tm) 24 1.1.3 Η χοληστερόλη και ο ρόλος της 25 1.1.4 Ταξινόµηση των λιποσωµάτων 26 1.1.4.1 Ταξινόµηση µε βάση το µέγεθος 26 1.1.4.2 Κατάταξη λιποσωµάτων µε βάση τη σύσταση και τις εφαρµογές 28 1.1.5 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων 33 1.1.5.1 Γενικά 33 1.1.5.2 Μηχανική διασπορά 34 1.1.5.3 Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) 34 1.1.5.4 Εξώθηση µέσω φίλτρων 35 1.1.5.5 Χρήση Μικρογαλακτωµατοποιητή 35 1.1.5.6 Εξώθηση σε θάλαµο εφαρµογής µεγάλης πίεσης 36 1.1.5.7 Ένεση λιπιδίων 36 1.1.5.8 ηµιουργία µικτών µικκυλίων µε απορρυπαντικά 39 1.1.6 Άλλες ειδικές µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων 39 1.1.6.1 Αφυδατωµένα Ενυδατωµένα Σωµατίδια (DRV) 39 1.1.6.2 Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση (Freeze thaw sonication method, FTS) 40 1.1.6.3 Τεχνική ενός βήµατος (one step method) 41 1.2 Μέθοδοι καθαρισµού λιποσωµάτων (από µη-ενσωµατωµένες ουσίες) 42 1.2.1 Χρωµατογραφία στήλης (Gel filtration - Column Chromatography) 42 1.2.2 ιαπίδυση Ισορροπίας (Dialysis) 43 1.2.3 Φυγοκέντρηση (Centrifugation) 43 1.3 υναµικό επιφάνειας λιποσωµάτων (ζ-δυναµικό) 44 1.4 Μεταβολική πορεία των λιποσωµάτων στον οργανισµό 45 1.4.1 Παρεντερική χορήγηση 45 1.4.2 Τοπική χορήγηση λιποσωµάτων 47 1.4.3 Per os χορήγηση 48 1.5 Λιποσώµατα: Εφαρµογές Χορήγηση φαρµάκων 49 1.5.1 Ως φορείς αντιµικροβιακών φαρµάκων 51 1.5.2 Λιποσώµατα ως φορείς αντικαρκινικών φαρµάκων 52 1.6 έρµα Γενικά στοιχεία 53 1.7 έρµα οµή 54 6

1.7.1 Η Επιδερµίδα 54 1.7.1.1 Κύτταρα της επιδερµίδας 58 1.7.2 Το χόριο ή κυρίως δέρµα 59 1.7.2.1 Η χοριο-επιδερµική ένωση 59 1.7.3 Αγγεία και νεύρα του δέρµατος 60 1.7.4 Κεράτινα όργανα του δέρµατος 60 1.7.5 Αδένες του δέρµατος (σµηγµατογόνοι, ιδρωτοποιοί και οσµηγόνοι) 61 1.7.6 Λειτουργίες του δέρµατος 61 1.7.7 Οργάνωση των λιπιδίων στην κεράτινη στοιβάδα 63 1.7.8 Ανοσολογικές αποκρίσεις του δέρµατος 64 1.7.9 ιαπέραση φαρµάκων δια του δέρµατος-το δέρµα ως φραγµός 64 1.7.10 Τοπική χορήγηση φαρµάκων 66 1.8 Τοπική ή διαδερµική χορήγηση φαρµάκων 67 1.8.1 Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα τοπικής ή διαδερµικής χορήγησης φαρµάκων. 67 1.8.2 Μηχανισµοί διείσδυσης φαρµάκων µέσω του ανθρώπινου δέρµατος 68 1.8.3 Πρόβλεψη της διαπέρασης µέσω του δέρµατος 69 1.8.4 Ex-vivo διείσδυση φαρµάκων στο δέρµα 70 1.8.5 Τρόποι παράκαµψης του φραγµού της κεράτινης στοιβάδας του δέρµατος 72 1.8.5.1 Tape stripping 72 1.8.5.2 Κάλυψη-ή Απόφραξη (Occlusion) 73 1.8.5.3 Ιοντοφόρεση και ηλεκτροδιάτρηση 73 1.8.5.4 Μικροβελόνες 73 1.8.6 Ενισχυτικά διαπέρασης 74 1.8.6.1 Τερπένια 76 1.8.6.2 Αζόνη 76 1.8.7 Μικρο- και νανογαλακτώµατα 77 1.9 Λιποσώµατα και τοπική χορήγηση φαρµάκων 78 1.9.1 Τροποποιήσεις στη λιποσωµική επιφάνεια για ενίσχυση διείσδυσης µέσω του δέρµατος 80 1.9.2 Ελαστικά λιποσώµατα ως συστήµατα τοπικής χορήγησης φαρµάκων 81 1.9.2.1 Transfersomes 82 1.9.2.2 Νιοσώµατα (Niosomes) 83 1.9.2.3 Ethosomes 84 1.9.2.4 Invasomes 85 1.9.3 Περιορισµοί στη χρήση των λιποσωµικών συστηµάτων χορήγησης φαρµάκου 86 1.10 Τοπική χορήγηση αντιϋπερτασικών φαρµάκων 86 1.10.1 Παράδειγµα φαρµακευτικού διαδερµικού patch ως αντιϋπερτασική θεραπεία 88 1.11 Σκοπός της παρούσας διατριβήs 89 2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 92 2.1 Όργανα και υλικά 92 2.1.1 Όργανα (µη ειδικά) που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα (τα ειδικά όργανα και συσκευές, περιγράφονται στις πειραµατικές διαδικασίες των επιµέρους µελετών) 92 2.1.2 Υλικά: 92 2.1.2.1 Παρασκευή διαλυµάτων 93 2.2 Μέθοδοι 94 2.2.1 Προσδιορισµός λιπιδίου-μέθοδος Stewart (Anal. Biochemica, 1980) 94 2.2.1.1 Υλικά 94 2.2.1.2 Μεθοδολογία 94 2.2.2 Μελέτη φυσιολογίας και χαρακτηριστικών δέρµατος 96 2.2.2.1 Υλικά 96 2.2.2.2 Προετοιµασία του δέρµατος για λήψη κρυο-τοµών. 97 2.2.2.3 Τοµές δέρµατος σε κρυοτόµο. 97 2.2.2.4 Χρώση µε κυανούν του µεθυλενίου (MethyleneBlue). 97 7

2.2.2.5 Χρώση µε CongoRed και Mayer s Haemalaun (οξύ) 98 2.2.3 Μετρήσεις απώλειας ύδατος µέσω της επιδερµίδας TEWL (Transepidermal water loss) 99 2.2.4 Παρασκευή Μορφών Ελαστικών λιποσωµάτων για τα πειράµατα ΙΙ 100 2.2.4.1 Παρασκευή Συµβατικών λιποσωµάτων και Ελαστικών λιποσωµάτων τύπου ΤR: 101 2.2.4.2 Παρασκευή Ελαστικών λιποσωµάτων τύπου ΙΝV: 102 2.2.5 Χαρακτηρισµός λιποσωµικών Μορφών 103 2.2.5.1 Μέτρηση κατανοµής µεγέθους και ζ-δυναµικού 103 2.2.5.2 Μελέτες σταθερότητας µορφών (σταθερότητα ως προς το µέγεθος) σε διάφορες θερµοκρασίες 104 2.2.5.3 Μελέτες ικανότητας εγκλωβισµού υδατοδιαλυτών µορίων στις λιποσωµικές µορφές που παρασκευάστηκαν (µέτρηση εγκλωβισµένης υδατοδιαλυτής χρωστικής ανά ποσότητα λιπιδίου) 105 2.2.5.4 Μελέτες Ελαστικότητας µορφών Εξώθηση µέσω φίλτρων 106 2.2.5.5 Μορφολογική Μελέτη των δοµικών χαρακτηριστικων των λιποσωµικών µορφών µε Κρυο-ηλεκτρονική µικροσκοπία διαπέρασης (Cryo-TEM) 108 2.2.5.6 Μικροσκοπία φθορισµού για µελέτη της µεταφοράς υδρόφιλης ή λιπόφιλης φθορίζουσας ουσίας (καρβοξυφλουορεσκεΐνης [CF] ή RHO-PE) µέσω λιποσωµάτων σε ανθρώπινο δέρµα 108 2.3 Πειράµατα µελετών ιαπέρασης (Permeation ή Τransport) διαµέσου δέρµατος (µε ανθρώπινο έρµα) 110 2.3.1 Εισαγωγή 110 2.3.2 Όργανα- Υλικά 111 2.3.3 Περιγραφή τεχνικής 112 2.3.4 Υπολογισµοί 112 2.4 In-vitro µελέτες διείσδυσης υδατοδιαλυτού και λιποδιαλυτού µορίου σε ανθρώπινο δέρµα Μηχανισµός ενίσχυσης διαπέρασης υδατοδιαλυτών µορίων µε χρήση ελαστικών λιποσωµικών µορφών. 113 2.4.1 Εισαγωγή 113 2.4.2 Υλικά-Όργανα 113 2.4.3 Περιγραφή πειραµάτων διείσδυσης 113 2.5 Αύξηση διαδερµικής διαπερατότητας µοντέλων αντιϋπερτασικών φαρµάκων µε συστήµατα ενισχυτών διαπέρασης. In vitro µελέτες διαπέρασης 116 2.5.1 Προσδιορισµός φυσικοχηµικών ιδιοτήτων του πειραµατικού φαρµάκου (ΠΦ) 117 2.5.1.1 Προσδιορισµός διαλυτότητας του πειραµατικού φαρµάκου σε διάφορα µέσα 117 2.5.1.2 Προσδιορισµός συντελεστή µερισµού-λιποφιλικότητας του πειραµατικού φαρµάκου 117 2.5.1.3 Σύνδεση σε πρωτεΐνες 118 2.5.2 Πειράµατα µελετών ιαπέρασης (Permeation ή Τransport) διαµέσου δέρµατος (µε ανθρώπινο έρµα) 118 2.5.2.1 Περιγραφή πειραµάτων διάχυσης 118 2.5.2.2 Ποσοτικός προσδιορισµός πειραµατικού φαρµάκου µέσω HPLC 119 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 121 3.1 Μελέτη φυσιολογίας και χαρακτηριστικών δέρµατος 121 3.1.1 Μετρήσεις απώλειας ύδατος µέσω της επιδερµίδας (TEWL-Transepidermal water loss) 121 3.1.2 Μορφολογία δέρµατος Μελέτη µε Οπτική µικροσκοπία 123 3.2 Σύγκριση διαφόρων τύπων ελαστικών λιποσωµάτων και µελέτη µηχανισµού αύξησης της διαπερατότητας υδατοδιαλυτών φαρµάκων (µε τη χρήση τους). 131 3.2.1 Μέτρηση κατανοµής µεγέθους και ζ-δυναµικού - Επίδραση συγκέντρωσης ενισχυτικού διαπέρασης στο µέγεθος και την οµοιοµορφία µεγέθους 131 3.2.2 Σταθερότητα λιποσωµάτων ως προς το µέγεθος και την οµοιοµορφία µεγέθους κατά την αποθήκευση 135 8

3.2.3 Μελέτες ακεραιότητας µορφών (συγκράτηση εγκλωβισµένης υδατοδιαλυτής χρωστικής) 144 3.2.4 Μελέτες ικανότητας εγκλωβισµού υδατοδιαλυτών µορίων στις λιποσωµικές µορφές που παρασκευάστηκαν (µέτρηση εγκλωβισµένης υδατοδιαλυτής χρωστικής ανά ποσότητα λιπιδίου) 146 3.2.5 Μελέτες Ελαστικότητας µορφών Εξώθηση µέσω φίλτρων 147 3.2.6 Μορφολογικές Μελέτες (Κρυο-µικροσκοπία) 151 3.2.7 Μικροσκοπία φθορισµού για µελέτη της µεταφοράς υδρόφιλης ή λιπόφιλης φθορίζουσας ουσίας (καρβοξυφλουορεσκεΐνης CF ή RHO-PE) µέσω λιποσωµάτων σε ανθρώπινο δέρµα 156 3.3 Μελέτες ιαπέρασης υδατοδιαλυτής χρωστικής διαµέσου έρµατος (µε ανθρώπινο δέρµα) 157 3.4 In-vitro µελέτες διείσδυσης ελαστικών λιποσωµικών µορφών στο δέρµα 160 3.5 Αύξηση διαπερατότητας αντιϋπερτασικών φαρµάκων µε συστήµατα ενισχυτών διαπέρασης 170 3.5.1 Εισαγωγή 170 3.5.2 Προσδιορισµός φυσικοχηµικών ιδιοτήτων 171 3.5.3 Πειράµατα διαδερµικής διαπέρασης ΠΦ 173 3.5.4 Συγκριτικά πειράµατα διαδερµικής διαπέρασης των ουσιών ΠΦ και λοσαρτάνης στην υδρόφιλη µορφή τους (µετά καλίου αλάτων). 180 4 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 186 5 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι: ΠΙΝΑΚΕΣ 191 6 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ: ΙΑΓΡΑΜΜΑΤΑ 193 7 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΙ: ΕΙΚΟΝΕΣ 194 8 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 196 9

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑMPs BSA CF CHOL CL CMC Cryo-TEM D/L DLS DMSO DOPE DRV DSPC EPC ER ΕtOH HPLC INV IUV IV ή ΕΦ Jss LIM LCL (Antimicrobial peptides) Αντιµικροβιακά πεπτίδια (Bovine serum albumin) αλβουµίνη βόειου ορού (Carboxyfluorescein) καρβοξυφλουορεσκεΐνη (Cholesterol) χοληστερόλη (Conventional liposome) συµβατικό λιπόσωµα (critical micelle concentration) κρίσιµη µικυλλιακή συγκέντρωση (Cryo-Transmission electron microscopy) κρυο- µικροσκοπία ηλεκτρονικής εκποµπής (Drug/lipid) φάρµακο ανά λιπίδιο (Dynamic Light Scattering) υναµική σκέδαση φωτός (Dimethylsulfoxide) διµεθυλοσουλφοξείδιο (dioleoylphosphatidylethanolamine) διολεϋλφωσφατιδυλαιθανολαµίνη (Dehydrated-rehydrated vesicle) Αφυδατωµένοεπανενυδατωµένο σωµατίδιο (distearoylglycerophosphatidylcholine) διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλχολίνη (egg L-α-phosphatidylcholine) φωσφατιδυλχολίνη αυγού (Enhancement ratio) λόγος προσαύξησης (Ethanol) αιθανόλη (High pressure liquid chromatography) υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης invasome (Intermediate unilamellar vesicle) ενδιάµεσου µεγέθους µονοστοιβαδιακό λιπόσωµα (Intravenous) Ενδοφλέβιος (Steady state permeation rate) ρυθµός διαπέρασης σταθερής κατάστασης (Limonene) λεµονένιο (Long circulating liposome) λιπόσωµα µακράς κυκλοφορίας 10

LT Los LUV MEL MeOH MLV MVV PBS PCS PDI PE PE PEG PG PI PS RES ή ΕΣ REV RHO-PE RT SC Schol SPLV SUV TBS TDDS (Lagtime) χρόνος υστέρησης (Losartan) Λοσαρτάνη (Large unilamellar vesicle) µεγάλο µονοστοιβαδιακό λιπόσωµα (Micro-emulsification liposome) λιπόσωµα µικρογαλακτωµατοποίησης (Methanol) Μεθανόλη (Multilamellar vesicle) πολυστοιβαδιακό λιπόσωµα (Multivesicular vesicle) πολυσωµατιδιακό λιπόσωµα (Phosphate Buffer Saline) ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (photon correlation spectroscopy) Φασµατοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (Polydispersity index) είκτης πολυδιασποράς (L-α-Phosphatidylethanolamine) φωσφατιδυλαιθανολαµίνη (Penetration enhancer) ενισχυτής διαπέρασης. Αναφέρεται στο µίγµα τερπενίων (polyethylenglycol) πολυαιθυλενογλυκόλη (Propylene glycol) προπυλενογλυκόλη (L-α-phosphatidylinositol) φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (L-a-phosphatidylserine) φωσφατιδυλοσερίνη (Reticuloendothelial system) ικτυοενδοθηλιακό σύστηµα (Reverse phase evaporation vesicle) αντίστροφης φάσης εξατµιζόµενο σωµατίδιο (Rhodamine-PE) Ροδαµίνη- φωσφατιδυλαιθανολαµίνη (Room temperature) θερµοκρασία δωµατίου (Stratum corneum) κεράτινη στοιβάδα (Sodium cholate) χολικό νάτριο (stable plurilamellar vesicle) σταθερό πολυστοιβαδιακό λιπόσωµα (Small unilamellar vesicle) µικρό µονοστοιβαδιακό λιπόσωµα (Tris buffer saline) ρυθµιστικό διάλυµα Tris (Transdermal drug delivery systems) ιαδερµικά συστήµατα µεταφοράς φαρµάκου 11

TEWL TFA T m TR ULV UV/VIS ΕΠ ΠΦ Y (Transepidermal water loss) απώλεια ύδατος από την επιδερµίδα (Trifluoroacetic acid) τριφθοροξικό οξύ (Transition temperature) θερµοκρασία µετάπτωσης Transfersome (Unilamellar vesicle) µονοστοιβαδιακό λιπόσωµα (Ultraviolet/visible) υπεριώδες/ορατό Ενδοπεριτοναϊκός Πειραµατικό Φάρµακο Υποδόριος 12

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα διατριβή, µελετήθηκε η χρήση ελαστικών λιποσωµάτων στη διαδερµική χορήγηση υδατοδιαλυτών ουσιών και πραγµατοποιήθηκαν επίσης µελέτες προ-µορφοποίησης αντιϋπερτασικών βιοδραστικών ενώσεων για διαδερµική χορήγηση. Αρχικά, πραγµατοποιήθηκαν µελέτες της φυσιολογίας του δέρµατος µε τεχνικές µικροσκοπίας και µέτρησης της απώλειας ύδατος µέσω της επιδερµίδας (TEWL) µε σκοπό να διαπιστωθεί η λειτουργία του φραγµού της κεράτινης στοιβάδας, καθώς και η ορθότητα χρήσης των σχετικών τεχνικών προετοιµασίας των δειγµάτων δέρµατος που χρησιµοποιήθηκαν. Η οπτική µικροσκοπία ειδικά µας έδωσε πληροφορίες ως προς τη δοµή της επιδερµίδας και ως προς τον πιθανό µηχανισµό µεταφοράς ουσιών µέσω της χρήσης λιποσωµάτων. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε µελέτη και σύγκριση των διαφόρων φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών ελαστικών λιποσωµάτων που µπορεί να χρησιµοποιηθούν ως πρώτοι δείκτες για πρόγνωση της διαδερµικής απορρόφησης (in vivo) των υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων. Ως µοντέλα υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων χρησιµοποιήθηκαν οι φθορίζουσες χρωστικές καλσεΐνη και καρβοξυφλουορεσκεΐνη. Όλες οι λιποσωµικές διασπορές (τόσο τα συµβατικά λιποσώµατα-cls, όσο και τα ελαστικά λιποσώµατα τύπου transfersome-trs και τύπου invasomes-invs) χαρακτηρίστηκαν ως προς τα εξής φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά: Την κατανοµή µεγέθους, το ζ-δυναµικό, το σφαιρικό σχήµα και τη µορφολογία τους, την ικανότητα εγκλωβισµού υδρόφιλων ουσιών, τη σταθερότητά τους (ως προς τα µορφολογικά χαρακτηριστικά, τη διασπορά µεγέθους και το φορτίο επιφανείας, και τη συγκράτηση της εγκλωβισµένης σε αυτά ουσίας) σε σχέση µε το χρόνο, την ελαστικότητα και τέλος ως προς τη δυνατότητα διαπέρασης εγκλωβισµένων σε αυτές υδρόφιλων ουσιών µέσω ανθρώπινου δέρµατος in vitro. Το µέγεθος των λιποσωµάτων ήταν παρόµοιο και αρκετά οµοιογενές, ενώ η προσθήκη διαφορετικών τύπων ενισχυτικών διαπέρασης στα ελαστικά λιποσώµατα, στα συνήθη εύρη συγκεντρώσεων που χρησιµοποιούνται, δεν επηρεάζει καθόλου το επιφανειακό φορτίο των παραχθέντων λιποσωµάτων. Αύξηση του µεγέθους και αστάθεια ως προς τη συγκράτηση της εγκλωβισµένης ουσίας παρατηρήθηκε στην περίπτωση προσθήκης µεγαλύτερης ποσότητας ενισχυτικού διαπέρασης, η οποία αλλάζει και τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά των λιποσωµάτων. Τα TRs που περιείχαν χολικό νάτριο ήταν πιο 13

ελαστικά από τα αντίστοιχα µε Tween 80, τα οποία είχαν συγκριτικά χαµηλές τιµές ελαστικότητας (<40mg/s cm 2 ). Οι υψηλότερες τιµές ελαστικότητας από όλους τους τύπους ελαστικών λιποσωµάτων που παρασκευάστηκαν στα πλαίσια αυτής της διατριβής, παρατηρήθηκε στην περίπτωση των INVs µε 1% w/w PE και 1% w/w LIM. Επιπλέον, τα περισσότερα λιποσώµατα τύπου INVs είχαν υψηλότερες τιµές ελαστικότητας σε σχέση µε τα αντίστοιχα χωρίς τερπένια (INVs αναφοράς), εκτός από την περίπτωση των INVs µε citral και cineol, όπου η ελαστικότητα σηµείωσε µείωση σε σχέση µε τα INVs χωρίς τερπένια. Οι διάφοροι τύποι λιποσωµάτων φαίνεται να µεταβάλλουν τη διαπέραση της χρωστικής µε την εξής σειρά: ιάλυµα<cls<trs<<invs. H διαπερατότητα (permeability), η ροή (flux) και ο λόγος προσαύξησης (ER) δείχνουν ότι τα συµβατικά λιποσώµατα αύξησαν ελάχιστα τη ροή της καλσεΐνης, ενώ τα TRs και INVs κατά 1.8 και 7.2 φορές, αντίστοιχα. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώνουν το γεγονός ότι τα συµβατικά λιποσώµατα είναι ανεπαρκή συστήµατα µεταφοράς υδρόφιλων µορίων µέσω του δέρµατος, ενώ παράλληλα δείχνουν ότι τα ελαστικά λιποσώµατα µε τη µεγαλύτερη τιµή ελαστικότητας είναι πιο αποτελεσµατικά στη µεταφορά της ουσίας µέσω του δέρµατος. Σε επόµενα πειράµατα µελετήθηκε η δυνατότητα διείσδυσης τόσο υδρόφιλων όσο και λιπόφιλων µορίων στις στοιβάδες του δέρµατος, σε µια προσπάθεια να διερευνηθεί ο µηχανισµός αύξησης της διαδερµικής διαπέρασης των υδρόφιλων χρωστικών από τους διάφορους τύπους ελαστικών λιποσωµάτων. Ως µοντέλο υδρόφιλης ουσίας χρησιµοποιήθηκε η φθορίζουσα χρωστική καλσεΐνη, ενώ η λιπιδική ροδαµίνη χρησιµοποιήθηκε ως µοντέλο λιπόφιλης ουσίας (που δεν φεύγει από τα λιποσώµατα και ουσιαστικά µας δείχνει το βάθος εις το οποίο εισχωρούν µέσα στο δέρµα τα αντίστοιχα είδη λιποσωµάτων). Τα λιποσώµατα τύπου TR φαίνεται ότι επάγουν τη διαπέραση µε το να βοηθούν τη χρωστική να προχωρά (υπό µορφή λιποσωµάτων που την εγκλωβίζουν) σε βαθύτερα στρώµατα της κεράτινης στιβάδας σε σχέση µε τα συµβατικά λιποσώµατα όπου σε µεγάλο ποσοστό διαρρηγνύονται και απελευθερώνουν την υδρόφιλη ουσία η οποία στη συνέχεια διέρχεται µόνη της, ως ελεύθερο µόριο, στις στιβάδες του χορίου. Αντίθετα, τα λιποσώµατα τύπου INV αποδείχτηκε ότι εισδύουν σε βαθύτερες στιβάδες της επιδερµίδας, φθάνοντας σε αρκετά υψηλά ποσοστά σε στιβάδες του 14

χορίου, παρασύροντας µαζί τους και τα µόρια του εγκλωβισµένου σε αυτά υδρόφιλου φαρµάκου. Τέλος, µελετήθηκε η δυνατότητα µορφοποίησης ενός πειραµατικού φαρµάκου µε ανάλογη δοµή γνωστού φαρµάκου προκειµένου για διαδερµική αντιϋπερτασική θεραπεία. Αρχικά, µελετήσαµε το πειραµατικό φάρµακο ως προς τις φυσικοχηµικές του ιδιότητες (διαλυτότητα σε διάφορα µέσα, σύνδεση µε πρωτεΐνες) και στη συνέχεια µελετήσαµε τη δυνατότητα χορήγησης µιας φαρµακοτεχνικής µορφής µέσω του δέρµατος σε κατάλληλο σύστηµα διαλυτών. Αφού βρέθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες, χρησιµοποιήθηκαν ενισχυτικά διαπέρασης στη φαρµακοτεχνική µορφή για να επιταχυνθεί η διαδερµική απορρόφηση του φαρµάκου, όσο είναι δυνατόν, και να ευρεθεί η βέλτιστη φαρµακοτεχνική µορφή. Τέλος, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα σύγκρισης µεταξύ του πειραµατικού φαρµάκου και γνωστού αντιϋπερτασικού (Los) ως προς τις φυσικοχηµικές ιδιότητες και την ικανότητα µεταφοράς τους διαδερµικά. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το ΠΦ παρουσίασε µεγαλύτερη διαπέραση υπό µορφή ουδέτερου µορίου (σε σχέση µε την αντίστοιχη του άλατος µε TFA (όπως φάνηκε από τα αρχικά πειράµατα αυτής της σειράς) ή του µετά Καλίου άλατος (όπως προκύπτει µετά από σύγκριση των σχετικών τιµών Ροής και Συντελεστή ιαπερατότητας (P). Συγκρίνοντας λοιπόν τις τιµές διαπερατότητα και ροής διαµέσου ανθρώπινης επιδερµίδας µε τις αντίστοιχες τιµές του φαρµάκου Los θα πρέπει να λάβουµε υπ όψη και τις τιµές για το ουδέτερο µόριο. Η διαπέραση του ουδέτερου µορίου του ΠΦ είναι σηµαντικά χαµηλότερη από την αντίστοιχη του µετά καλίου άλατος της los. 15

ABSTRACT In this study, we investigated the use of elastic liposomes in transdermal delivery of hydrophilic substances and we studied the possibility of formulating a new antihypertensive drug for transdermal delivery. Primarily, morphological studies of human skin were conducted by the use of optical microscopy and transepidermal water loss measurements (TEWL), in order to assess the barrier function of stratum corneum (SC), and the integrity of the techniques used in this study. By optical microscopy, in particular, data concerning the skin structure and the possible mechanism by which substances can be delivered through / into the skin, were obtained. Secondly, we studied and compared various physicochemical characteristics of two different types of elastic liposomes, which could help us predict the transdermal absorption (in vivo) of hydrophilic molecules. Fluorescent markers calcein and carboxyfluorescein were used as hydrophilic model drugs. All liposomal dispersions (conventional liposomes CLs, and elastic liposomes i.e. transfersomes TRs and invasomes INVs) were evaluated in means the following physicochemical properties: size distribution, z-potential, stability upon storage, morphology by cryo-electron microscopy and membrane elasticity. Moreover, their ability to encapsulate and also to retain aqueous soluble markers, was investigated. Finally, the permeation of calcein through human skin was tested and compared by use of elastic and conventional rigid liposomes. The mean diameter was found relatively homogenous, similar for most liposomal dispersions, while the addition of different penetration enhancers during the preparation did not influence z-potential. Increase of size average and instability as far as the retention of the encapsulated substance is concerned was observed at higher concentrations of penetration enhancers used. Sodium cholate containing TRs were found more elastic compared to Tween 80 containing TRs, which showed relatively low elasticity values (<40mg/s cm 2 ). The highest elasticity values among all types of elastic liposomes prepared, were found in the case of INVs with 1%w/w PE and 1% w/w LIM. Furthermore, most INVs showed higher elasticity values compared to the ones without terpenes (control INVs), except from citral and cineol INVs, where elasticity decreased compared to the control ones. It appears that different types of liposomes can alter fluorescent permeation in the following order: Solution<CLs<TRs<<INVs. Permeability, flux and enhancement 16

ratio (ER) show that conventional liposomes increased slightly calcein flux, while TRs and INVs 1.8 and 7.2 times respectively. These findings confirm the fact that CLs are inefficient drug delivery systems for water soluble molecules through human skin, and show that elastic liposomes having the highest elasticity value are more efficient in delivering CF transdermally. In further experiments, the penetration of both hydrophilic and lipophilic molecules in human skin was studied, in order to investigate the mechanism of action by which liposomes could enhance the drug delivery in skin. Fluorescent marker calcein was used as a hydrophilic drug model, while lipid rhodamine-pe was used as a lipophilic model (it shows us how deeply the liposomes penetrate into the skin). Liposomes TRs seem to enhance skin permeation by helping the marker to penetrate (through liposomes) in deeper stratum corneum layers while conventional liposomes the hydrophilic substance which penetrates the skin layers as a free molecule. In contrast, INV liposomes were proved to be able to penetrate in deeper skin layers, and deliver relatively high amounts of the encapsulated substance. In the end, experiments with a new molecule with similar structure to losartan were conducted. This study aimed at discovering a new formulation for this experimental drug in order to be used as a transdermal antihypertensive. First, we studied the physicochemical properties (solubility in PBS, BSA etc, and protein binding). Secondly, we investigated the possibility of preparing a formulation to be used transdermally. After establishing the techniques and drug properties we used penetration enhancers in order to increase the transdermal absorption as possible and help find the right skin formulation. Last, we compared the experimental drug and losartan in terms of physicochemical properties and their ability to be transported through human skin. The results showed that the experimental drug had better permeation rate as a neutral molecule compared to TFA salt, (as shown in preliminary experiments) or K + (as shown after comparing P and flux values). Therefore, the values given for the neutral molecule should be taken into consideration when comparing the two drugs. (losartan and experimental drug). The permeation of the neutral molecule nevertheless is significantly lower than the one for losartan. 17

1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Λιποσώµατα - Γενικά Στοιχεία Τα λιποσώµατα (µικρο- ή νανοτεµαχιδιακά λιπιδικά σωµατίδια) είναι υπό εκτεταµένη έρευνα για περισσότερα από 20 χρόνια για χρήση ως φορείς βελτιωµένης µεταφοράς για ένα ευρύ φάσµα παραγόντων (Chavhan et al. 2011; Todorova et al, 2011; Shanmugam et al, 2011). Σε αυτούς περιλαµβάνονται χηµειοθεραπευτικοί παράγοντες, αντιγόνα, ανοσοτροποποιητές, χηλικές ενώσεις, αιµογλοβίνη και συµπαράγοντες, λιπίδια και γενετικό υλικό. Στόχος οποιουδήποτε συστήµατος διάθεσης φαρµάκου είναι να διαµορφώσει τη φαρµακοκινητική και την ιστική κατανοµή του φαρµάκου µε ωφέλιµο τρόπο. Στα ποικίλα συστήµατα µεταφοράς που έχουν προταθεί όλα αυτά τα χρόνια ανήκουν πολλά συστήµατα-φορείς τεµαχιδίων. Για παράδειγµα, µικροσφαίρες, νανοτεµαχίδια, λιποπρωτεΐνες, µικυλλιακά συστήµατα και λιποσώµατα. Tα λιποσώµατα (New 1990; Gregoriadis 2002; Antimisiaris et al. 2008; Antimisiaris 2010) είναι ενυδατωµένες λιπιδικές διασπορές, αποτελούµενες κυρίως από φωσφολιπίδια, τα οποία σχηµατίζουν διπλοστoιβάδες συγκροτώντας µακροµοριακές δοµές γνωστές ως πολυστoιβαδιακά σωµατίδια (MLV). Τα φωσφολιπίδια, όταν διασπαρούν σε θερµοκρασία πάνω από την θερµοκρασία µετάπτωσής τους (Τm) σε πλούσιο υδατικό περιβάλλον, σχηµατίζουν αυθόρµητα σωµατίδια που εγκλωβίζουν υδατικό πυρήνα. Μια σχηµατική απεικόνιση ενός λιποσώµατος παρουσιάζεται στην εικόνα 1.1. Τα λιποσωµικά συστήµατα µεταφοράς φαρµάκων έχουν γνωρίσει ευρεία ανάπτυξη µε διάφορα λιποσωµικά φάρµακα να βρίσκονται σε κλινικές δοκιµές ή να κυκλοφορούν ήδη στην αγορά (Antimisiaris et al. 2008). Είναι γνωστό από πολυάριθµες προκλινικές και κλινικές µελέτες ότι φάρµακα, όπως τα αντικαρκινικά φάρµακα, εγκλωβισµένα σε λιποσώµατα επιδεικνύουν µειωµένη τοξικότητα, ενώ διατηρούν ή εµφανίζουν ακόµα κι αυξηµένη αποτελεσµατικότητα. Αυτό συµβαίνει, εν µέρει, λόγω µεταβολής της φαρµακοκινητικής του φαρµάκου, η οποία οδηγεί σε συσσώρευσή του στις πάσχουσες περιοχές όπως όγκοι- και µειωµένη διάθεση σε άλλους ευαίσθητους ιστούς. 18

Υπό ανάπτυξη βρίσκονται και λιποσωµικά συστήµατα προάγοντα τη σύντηξη µε κυτταρικές µεµβράνες (fusogenic), τα οποία έχουν την ικανότητα να µεταφέρουν φάρµακα ενδοκυττάρια, γεγονός το οποίο αναµένεται να ενισχύει σηµαντικά τη θεραπευτική ικανότητα των εγκλωβισµένων σε αυτά φαρµάκων (El-Sayed et al. 2009; Kasuya et al. 2009). Οι εξελίξεις στο σχεδιασµό των λιποσωµάτων οδηγούν σε νέες πιθανές υποψηφιότητες για µεταφορά βιοτεχνολογικών προϊόντων, όπως είναι ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες, αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια και κλωνοποιηµένα γονίδια. Εικόνα 1.1: Σχηµατική απεικόνιση ενός λιποσώµατος σε διατοµή (Avanti polar lipids) 19

1.1.1 οµικά στοιχεία Χαρακτηριστικά λιποσωµάτων 1.1.1.1 Λιπίδια Τα λιποσώµατα µπορούν να παρασκευαστούν από ποικιλία λιπιδίων και µιγµάτων λιπιδίων. Ένα από τα βασικά είδη µεµβρανικών λιπιδίων περιλαµβάνουν τα φωσφολιπίδια. Αυτά έχουν µια πολική κεφαλή και δύο υδρογονανθρακικές αλυσίδες. Υπάρχουν δύο είδη φωσφολιπιδίων: τα φωσφοδιγλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια, µαζί µε τα αντίστοιχα προϊόντα υδρόλυσής τους (New, 2000; Antimisiaris et al 2008). Ένα παράδειγµα φωσφολιπιδίου παρουσιάζεται στην εικόνα 1.2. Οι υδρόφοβες ουρές έλκονται µεταξύ τους, ενώ οι υδρόφιλες κεφαλές συνδέονται µε το υδατικό µέσο (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβη επίδραση) εξωτερικά και εσωτερικά της λιποσωµικής επιφάνειας. Με τον τρόπο αυτό σχηµατίζονται διπλές λιπιδικές στοιβάδες οι οποίες σφραγίζουν και δηµιουργούν µικρά σωµατίδια παρόµοια µε τα σωµατικά κύτταρα και τα οργανίδιά τους. Οι δυνάµεις που αναπτύσσονται και σταθεροποιούν τα λιποσώµατα είναι οι εξής: 1. Μεταξύ των λιπιδίων αλληλεπιδράσεις, όπως: υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στις πολικές οµάδες και αλληλεπιδράσεις Van der Waals ανάµεσα στις υδρογονανθρακικές αλυσίδες και 2. Τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ λιπιδίων και νερού (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, (υδρόφοβη επίδραση). Το ακραίο τµήµα των λιπιδίων που ξεκινά µε NH 3 είναι η πολική οµάδα (ή πολική κεφαλή). Συνδέεται µέσω της γλυκερόλης µε δύο λιπαρές αλυσίδες. Μια από τις αλυσίδες είναι ευθεία λιπαρή αλυσίδα (κορεσµένη), ενώ η άλλη παρουσιάζει κυρτότητα λόγω cis διπλού δεσµού (µη κορεσµένη). Αυτό επηρεάζει το πακετάρισµα και την κίνηση στο πλευρικό επίπεδο της µεµβράνης. Τα πιο κοινά φωσφολιπίδια είναι τα µόρια φωσφατιδυλχολίνης (PC), αµφίφιλα µόρια στα οποία µια γέφυρα γλυκερόλης συνδέει ένα ζεύγος υδρόφοβων υδρογονανθρακικών αλυσίδων µε µια υδρόφιλη πολική κεφαλή, τη φωσφοχολίνη (εικόνα1.3). Τα µόρια αυτά είναι αδιάλυτα στο νερό και σε υδατικό µέσο, διατάσσονται ευθύγραµµα σε διπλοστοιβάδες µε µορφή επίπεδων φύλλων ώστε να µειωθούν οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ της λιπαρής αλυσίδας των υδρογονανθράκων και του υδατικού περιβάλλοντος. Αναπαράσταση της δοµής ενός φωσφολιπιδίου µε τις πολικές και µη πολικές περιοχές του φαίνεται στην εικόνα 1.2 20

Εικόνα 1.2: Αναπαράσταση δοµής φωσφολιπιδίου (Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.) 21

Εκτός από τη φωσφατιδυλχολίνη, λιπιδικές διπλοστοιβάδες µπορούν να σχηµατιστούν και µε σφιγγοµυελίνη ή µε ανάλογα αλκυλ-αιθέρων της λεκιθίνης. Στη σφιγγοµυελίνη, η παρουσία αµιδίου και υδροξυλοµάδων προκαλεί τη δηµιουργία δεσµών υδρογόνου οι οποίοι µπορεί να εξηγούν την καλύτερα διατεταγµένη φάση γέλης σε σχέση µε τη φωσφατιδυλχολίνη. Στη σφιγγοµυελίνη το υδρόφοβο τµήµα αποτελείται από µια µοναδική αλυσίδα λιπαρού οξέος που ενώνεται µε αµιδικό δεσµό µε το άζωτο της σφιγγοσύνης και η υδρόφιλη περιοχή είναι η οµάδα φωσφοχολίνης. Η λιπόφιλη ουρά είναι γνωστό ως κεραµίδιο. Ένα άλλο ουδέτερο φωσφολιπίδιο που απαντάται σε φυσικές µεµβράνες είναι η φωσφατιδυλαιθανολαµίνη (PE). Tο λιπίδιο αυτό διαφέρει από το PC στο ότι η χαρακτηριστική οµάδα είναι µικρότερη και επίσης µπορεί να σχηµατίσει δεσµούς υδρογόνου µε γειτονικά µόρια στη µεµβράνη. Στα αρνητικά φορτισµένα λιπίδια ανήκουν η φωσφατιδυλγλυκερόλη (PG), η φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI) και η φωσφατιδυλσερίνη (PS). Εικόνα 1.3: οµή φωσφολιπιδίου και χαρακτηριστικές οµάδες 22

Οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων στα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια συνήθως περιέχουν έναν άρτιο αριθµό ατόµων άνθρακα, συνήθως µεταξύ 14 και 24. Πιο συχνά βρίσκουµε τα λιπαρά οξέα µε 16 και 18 άτοµα άνθρακα. Τα λιπαρά οξέα µπορεί να είναι ακόρεστα ή κορεσµένα. Το ισοµερές που ανευρίσκεται στα ακόρεστα λιπαρά είναι σχεδόν πάντα στη cis µορφή. Ένα κεκορεσµένο λιπαρό οξύ περιέχει µόνο απλούς δεσµούς ενώ τα ακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν διπλούς δεσµούς στην υδρογονανθρακική αλυσίδα τους. Οι διπλοί δεσµοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων χωρίζονται από µια τουλάχιστον µεθυλενική οµάδα. Η διαµόρφωση και ο αριθµός αυτών των διπλών δεσµών καθώς και το µήκος της αλυσίδας επιδρά στο σηµείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της µεµβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είµαι «µίγµατα» επειδή τα λιπαρά οξέα που συνάπτονται στις θέσεις 1 και 2 του ίδιου µορίου συνήθως είναι διαφορετικά µεταξύ τους. Η αλυσίδα του λιπαρού οξέος στην εσωτερική θέση είναι ακόρεστη ενώ της εξωτερικής θέσης είναι κεκορεσµένη και µεγαλύτερου µήκους όσο αφορά τον αριθµό των ατόµων άνθρακα. Στον πίνακα 1.1 παρουσιάζονται οι χηµικές δοµές και ονοµασίες των βασικών κυτταρικών λιπαρών οξέων Πίνακας 1.1: Κυτταρικά λιπαρά οξέα Χηµική δοµή Ονοµασία Κορεσµένο λιπαρό οξύ CH 3 (CH 2 ) 10 COOH CH 3 (CH 2 ) 12 COOH CH 3 (CH 2 ) 14 COOH CH 3 (CH 2 ) 16 COOH CH 3 (CH 2 ) 18 COOH CH 3 (CH 2 ) 22 COOH Λαουρικό Μυριστικό Παλµιτικό Στεαρικό Αραχιδικό Λινοσερικό Ακόρεστο λιπαρό οξύ CH 3 (CH 2 ) 5 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH Παλµιτολεϊκό 23

CH 3 (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH Ολεϊκό CH 3 (CH 2 ) 4 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH Λινολεϊκό CH 3 (CH 2 ) 4 (CH=CHCH 2 ) 3 CH=CH(CH 2 ) 3 COOH Αραχιδονικό CH 3 CH 2 CH=CHCH 2 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH Λινολενικό 1.1.2 Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (Phase transition -Tm) Oι µεµβράνες από φωσφατιδυλχολίνες υφίστανται σε διαφορετικές φάσεις όταν ευρίσκονται σε διαφορετικές θερµοκρασίες. Η µετάβαση από τη µία φάση στην άλλη µπορεί να διαπιστωθεί µε φυσικές µεθόδους κατά την αύξηση της θερµοκρασίας. Η πλέον διαδεδοµένη τεχνική για τον προσδιορισµό της θερµοκρασίας µετάπτωσης είναι η θερµιδοµετρία (Huang C. et al., 1999; New 2000). Οι πιο συχνά παρατηρούµενες αλλαγές φάσης συµβαίνουν στην υψηλότερη θερµοκρασία, στην οποία η µεµβράνη αναδιατάσσεται από την οργανωµένη µορφή της γέλης (gel) ή του στερεού (solid) και µεταβαίνει σε υγρή κρυσταλλική δοµή κατά την οποία οι βαθµοί ελευθερίας των µορίων είναι περισσότεροι. Αυτό φαίνεται ευκρινώς στην εικόνα 1.4. Σε γενικές γραµµές, αύξηση του µήκους της λιπαρής αλυσίδας ή αύξηση του κορεσµού της αλυσίδας οδηγεί σε αύξηση της Tm. Η θερµοκρασία µετάπτωσης για τα φωσφολιπίδια που προέρχονται από κρόκο αυγού ποικίλλει µεταξύ -15 C ( υψηλός βαθµός ακορεστότητας) και πάνω από 50 C για πλήρη κεκορεσµένα φωσφολιπίδια όπως είναι η διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC). 24

Εικόνα 1.4: Σχέση ανάµεσα στη φάση της µεµβράνης και τη θερµοκρασία 1.1.3 Η χοληστερόλη και ο ρόλος της Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό συστατικό των βιολογικών µεµβρανών επιτελώντας σηµαντικές λειτουργίες (Senior and Gregoriadis, 1982; New 2000, Antimisiaris 2011). Η χηµική δοµή της απεικονίζεται στην εικόνα 1.5. Στα λιποσώµατα που χρησιµοποιούνται ως µοντέλα που προσοµοιάζουν κυτταρικές µεµβράνες συνήθως προστίθεται χοληστερόλη για διάφορους λόγους. Αρχικά, είναι γνωστό ότι προσδίδει σταθερότητα στις διπλοστοιβάδες των λιποσωµάτων, ιδίως όταν πρόκειται για ασταθή λιποσώµατα (PC). Συγκεκριµένα, η χοληστερόλη ενσωµατώνεται σε φωσφολιπιδικές µεµβράνες επιφέροντας αλλαγές στις ιδιότητές τους π.χ. στη ρευστότητα και διαπερατότητά τους. Αυτό οφείλεται στη µεταβολή της κάµψης της αλυσίδας του φωσφολιπιδίου µε αποτέλεσµα να σχηµατίζονται πιο συµπαγείς µεµβράνες σε σύγκριση µε λιποσώµατα των οποίων οι µεµβράνες δεν περιέχουν χοληστερόλη. Άλλοι λόγοι προσθήκης χοληστερόλης σε λιποσώµατα µπορεί να είναι οι εξής: Η παρουσία χοληστερόλης στη µεµβράνη των λιποσωµάτων οδηγεί σε σηµαντική αύξηση (ή µείωση) της σειράς προσανατολισµού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων πάνω (ή κάτω) από τη θερµοκρασία 25

µετάπτωσης φάσης και µείωση της γωνίας κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση. Η χοληστερόλη µεταβάλλει τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης των λιποσωµικών µεµβρανών, ανάλογα µε την κατάσταση του λιπιδίου. Συγκεκριµένα, όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερµοκρασίες υψηλότερες από την θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης, η χοληστερόλη συµβάλλει στη µείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συµπύκνωση τελικά της µεµβράνης και µείωση της ρευστότητάς της. Αντίθετα, χαµηλότερα από την θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης, η απόσταση µεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της µεµβράνης αυξάνει. Εικόνα 1.5: Χηµική δοµή της χοληστερόλης, όπου φαίνεται η πολική και η µη πολική περιοχή 1.1.4 Ταξινόµηση των λιποσωµάτων 1.1.4.1 Ταξινόµηση µε βάση το µέγεθος MLVs Multilamellar vesicles (µεγάλα πολυστοιβαδιακά σωµατίδια) Τα MLV λιποσώµατα αποτελούνται από έναν µεγάλο αριθµό παράλληλων, οµόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωµάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Η κυριότερη µέθοδος παρασκευής MLV λιποσωµάτων είναι η µέθοδος του Bangham (solvent 26

evaporation method) (Bangham A.D. et al., 1965). Φάρµακα, καθώς και άλλες διαλυτές ενώσεις µπορούν να εγκλωβιστούν στα υδατικά µεσοδιαστήµατα ανάµεσα στις µεµβράνες, ενώ τα υδρόφοβα τµήµατά τους ή υδρόφοβα φάρµακα µπορούν να διαλυτοποιηθούν στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας. Τα λιποσώµατα αυτά έχουν µεγάλες και ετερογενείς διαµέτρους (1-10µm), χαµηλή ικανότητα εγκλωβισµού όγκου ανά µόριο λιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαµερίσµατα. Η απόσταση µεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάµεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάµεων άπωσης. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη χρήση τους ως φορείς φαρµάκων και µεµβρανικά µοντέλα αρκετά πολύπλοκη. Στην εικόνα 1.6 παρουσιάζεται ένα πολυστοιβαδιακό λιπόσωµα σε διατοµή. Εικόνα 1.6: Σχηµατική απεικόνιση πολυστοιβαδιακού λιποσώµατος σε διατοµή και µεγέθυνση των περιοχών του. LUVs & ΙUVs- Large unilamellar vesicles &Intermediate unilamellar vesicles (Μεγάλα & µεσαίου µεγέθους µονοστοιβαδιακά σωµατίδια) Τα λιποσώµατα αυτά έχουν διάµετρο της τάξης των 1000 nm και είναι µονοστοιβαδιακά. Ανάλογα µε το επιθυµητό µέγεθος, τα LUVs και IUVs µπορούν να παρασκευασθούν µε διάφορες µεθόδους, όπως είναι η αποµάκρυνση απορρυπαντικού, η µηχανική διασπορά και τα διφασικά συστήµατα. Τα λιποσώµατα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισµό υδατοδιαλυτών υλικών, αν και η παρουσία µιας µόνο λιπιδικής µεµβράνης έχει ως συνέπεια µικρότερη 27

µηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση µε τα MLVs. Ωστόσο, αυτός ο τύπος λιποσωµάτων κρίνεται αρκετά κατάλληλος για την ενεργή φόρτωση ιονιζόµενων µορίων. SUVs - Small unilamellar vesicles (Μικρά µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα ) Τα SUV λιποσώµατα αποτελούνται µόνο από µια διπλοστοιβάδα και έχουν διάµετρο 20-100nm. ιαθέτουν το µικρότερο δυνατό µέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο µπορεί να σχηµατίσει λιποσωµική µορφή (εικόνα1.7). Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύµατος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των µεµβρανών. Πρόκειται για θερµοδυναµικά ασταθή λιποσώµατα που είναι επιρρεπή σε συσσωµάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης. Οι µέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωµάτων είναι (i) η κατεργασία µε υπέρηχους και (ii) η µέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - απόψυξης (freeze - thaw). Εικόνα 1.7: ιατοµή ενός µονοστοιβαδιακού λιποσώµατος. Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις µπορούν να εγκλωβιστούν στον υδατικό πυρήνα (περιοχή 1) ή να συνδεθούν στην εξωτερική επιφάνεια (περιοχή 3). Τα υδροφοβικά µόρια µπορούν να εγκλωβιστούν στη διπλοστοιβάδα (περιοχή 2). 1.1.4.2 Κατάταξη λιποσωµάτων µε βάση τη σύσταση και τις εφαρµογές Το λιποσωµικό σύστηµα µεταφοράς φαρµάκων διαθέτει ένα µεγάλο πλεονέκτηµα έναντι άλλων κολλοειδών συστηµάτων µεταφοράς: Επιτρέπει σχεδόν άπειρες πιθανότητες µεταβολής των δοµικών και φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών. Αυτό το χαρακτηριστικό της ευελιξίας επιτρέπει στους επιστήµονες να τροποποιούν την in vivo συµπεριφορά των λιποσωµάτων και να σχεδιάζουν τις διάφορες 28

λιποσωµικές µορφές ανάλογα µε τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεση και την επιθυµητή in vivo εφαρµογή, τα λιποσώµατα διακρίνονται σε τέσσερις µεγάλες κατηγορίες (εικόνα1.8) (Storm and Crommelin, 1998) Εικόνα 1.8: Σχηµατική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωµάτων: Συµβατικά (Conventional) λιποσώµατα, Στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα (Stealth) λιποσώµατα, Στοχευµένα (Targeted), Κατιονικά (Cationic) λιποσώµατα. [από Storm and Crommelin 1998]. Συµβατικά λιποσώµατα (Conventional liposomes): Αυτά µπορούν να οριστούν ως λιποσώµατα που αποτελούνται µόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισµένα) ή/και χοληστερόλη. Πρόκειται για την πλέον χρησιµοποιούµενη κατηγορία λιποσωµάτων στη µεταφορά φαρµάκων. ιαφέρουν ως προς τις φυσικοχηµικές τους ιδιότητες, όπως το µέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθµό και ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστoιβάδων. Τα συµβατικά λιποσώµατα χαρακτηρίζονται από σχετικά µικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίµα. Όταν χορηγούνται in vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν την τάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του µονοπυρηνικού συστήµατος φαγοκυττάρων, γνωστό επίσης και ως δικτυοενδοθηλιακό σύστηµα (RES). Tα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. 29

Το γεγονός αυτό έχει αποτελέσει στόχο για διάθεση φαρµάκων µέσω λιποσωµάτων σε µολυσµένα µακροφάγα. Επιπλέον, τα συµβατικά λιποσώµατα έχουν χρησιµοποιηθεί για µεταφορά αντιγόνων. Λιποσωµικά εµβόλια έχουν αποδειχθεί αποτελεσµατικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών µολύνσεων καθώς επίσης και εναντίον όγκων. Λιποσώµατα µακράς κυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or sterically stabilized): Η ανάπτυξή τους αποτέλεσε ορόσηµο στην έρευνα των λιποσωµικών συστηµάτων µεταφοράς και αναζωπύρωσε το ενδιαφέρον γύρω από την έρευνα περί λιποσωµάτων. Στην πραγµατικότητα, τα λιποσώµατα µακράς κυκλοφορίας (Szoka and Papahadjopoulos 1980; Lasic 1997; Lasic and Papahadjopoulos 1998; Garbuzenko et al. 2005) άνοιξαν νέους δρόµους σε θεραπευτικές δυνατότητες που µέχρι τότε θεωρούνταν ανέφικτες για τα συµβατικά λιποσώµατα. Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα να βγαίνουν εκτός κυκλοφορίας σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώµατος είναι αυξηµένη (Lasic 1997; Antimisiaris 2011). Αυτό συµπίπτει µε το γεγονός ότι οι περιοχές αυξηµένης τριχοειδικής διαπερατότητας περιλαµβάνουν παθολογικές περιοχές, όπως στέρεους όγκους και περιοχές µολύνσεως και φλεγµονής. Προς το παρόν, ο πιο δηµοφιλής τρόπος παραγωγής τέτοιων λιποσωµάτων είναι η οµοιοπολική σύνδεση του πολυµερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) στην εξωτερική επιφάνεια. (εικόνα 1.9) Αυτά τα λιποσώµατα λέγονται επίσης stealth ή στερεοχηµικώς σταθεροποιηµένα. Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητά τους να διαφεύγουν των µακροφάγων και ο δεύτερος στο µηχανισµό στερεοχηµικής σταθεροποίησής τους, που είναι υπεύθυνος για την αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας. Το τελευταίο οφείλεται σε φραγµό που δηµιουργείται και αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις µε µόρια και κυτταρικά συστατικά του βιολογικού περιβάλλοντος, κυρίως πρωτεΐνες. 30

Εικόνα 1.9: Σχηµατική απεικόνιση ενός στερεοχηµικά σταθεροποιηµένου λιποσώµατος. Τα stealth λιποσώµατα εγκλωβίζουν το φάρµακο (1) σε µια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα (2).Η PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώµατα να αποφεύγουν το ανοσοποιητικό σύστηµα αυξάνοντας Ανοσολιποσώµατα (Immunoliposomes): ιαθέτουν ειδικά αντισώµατα ή κλάσµατα αντισωµάτων (Fab ή αντισώµατα µονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους προκειµένου να ενισχύσουν τη στοχευµένη πρόσδεση (Pasquetto et al. 2011; Al-Jamal et al. 2011; Markoutsa et al, 2011; Canovi et al. 2011). Αν και έχουν εξεταστεί για πληθώρα θεραπευτικών εφαρµογών, η εστίαση έχει γίνει στη µεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως και άλλα σωµατίδια στην κυκλοφορία του αίµατος, είναι δύσκολο στα ανοσολιποσώµατα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαµερίσµατα πλην του ήπατος και του σπλήνα. Γι αυτό, προκειµένου να εξασφαλιστεί δυνατότητα πρόσβασης των υποδοχέων, επιχειρείται τοπική χορήγηση των λιποσωµάτων στις σωµατικές κοιλότητες. Κατιονικά λιποσώµατα (Cationic liposomes): Αυτά εκπροσωπούν σχετικά νέα µέλη της οικογένειας των λιποσωµάτων. Βρίσκονται στην πρώτη γραµµή ως συστήµατα µεταφοράς γενετικού υλικού. Τα κατιονικά λιπιδικά συστατικά τους αλληλεπιδρούν µε και εξουδετερώνουν- το αρνητικά φορτισµένο DNA, συµπυκνώνοντας έτσι το DNA σε µια πιο συµπαγή δοµή. Τα σύµπλοκα λιπιδίου-dna παρέχουν προστασία και επάγουν την κυτταρική εσωτερίκευση και έκφραση του συµπυκνωµένου πλασµιδίου (Shim amd Kwon 2010). 31

Λιποσώµατα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic liposomes): Τα λιποσώµατα αυτά µπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυτταρική µεταφορά εγκλωβισµένων φαρµάκων µέσω σύντηξης µε τη µεµβράνη των κυττάρων στόχων (El-Sayed et al. 2009). Υπάρχουν διάφοροι τρόποι παρασκευής τους µεταξύ των οποίων είναι η χρήση λιπιδίων (όπως το DOPE) που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας και να προκαλούν φαινόµενα σύντηξης. Επίσης, πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη µπορούν να ενσωµατωθούν σε λιποσώµατα. ιάφορες µελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας σύντηξης των λιποσωµάτων µπορεί να εφαρµοστεί προκειµένου να ενισχυθεί η αποτελεσµατικότητα των λιποσωµικών συστηµάτων µεταφοράς γενετικού υλικού. Οι κύριες εφαρµογές των διαφόρων τύπων λιποσωµάτων που αναφέρθηκαν παραπάνω παρουσιάζονται συνοπτικά στον πίνακα 1.2 Πίνακας 1.2: Κύριες εφαρµογές των κύριων τύπων λιποσωµάτων ΤΥΠΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΚΥΡΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΜΑΚΡΟΦΑΓΩΝ ΣΥΜΒΑΤΙΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΤΟΠΙΚΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΜΑΚΡΑΣ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΣΕ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΜΙΚΡΟ ΕΞΑΜΕΝΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΑΝΟΣΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΤΙΟΝΙΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΕΙ ΙΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ Γενικά, ο µέγεθος, η ακαµψία των διπλοστοιβάδων, το φορτίο και οι τροποποιήσεις της επιφάνειας της διπλοστοιβάδας αποτελούν παραµέτρους που καθορίζουν την τύχη των λιποσωµάτων κατά την αποθήκευση και in vivo. 32

1.1.5 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων 1.1.5.1 Γενικά Στην πράξη, οι περισσότερες µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων (Gregoriadis 1993; Szoka and Papahadjopoulos 1980; Antimisiaris et al. 2008) οδηγούν σε αρκετά ετερογενείς πληθυσµούς σωµατιδίων µε ευρεία κατανοµή µεγέθους. εδοµένου ότι ο διαθέσιµος προς εγκλωβισµό, όγκος λιποσωµάτων ποικίλλει ανάλογα µε την κατανοµή µεγέθους, είναι πολύ σηµαντικό οι λιποσωµικές παρασκευές να χαρακτηρίζονται ως προς το µέγεθος, ώστε να προβλέπεται µε σχετική ακρίβεια η in vitro και in vivo συµπεριφορά τους. Ακόµη και λιποσώµατα µε το ίδιο µέγεθος και τον ίδιο αριθµό στοιβάδων είναι δυνατό να διαφέρουν στην εσωτερική κατανοµή της υδατικής φάσης και στην ποσότητα λιπιδίου που συµµετέχει στη δοµή των σωµατιδίων. [Andrew S. Janoff, Liposomes - Rational Design] Η επιλογή του τύπου λιποσωµάτων που θα χρησιµοποιηθεί για συγκεκριµένη εφαρµογή εξαρτάται εν µέρει από το είδος της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί αλλά και από την επιθυµητή συµπεριφορά του λιποσώµατος µετά την παρασκευή του. (εικόνα 1.10) Εικόνα 1.10: Συνήθεις µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων. MLV (πολυστοιβαδιακά), MVV (πολυκυστιαδιακά), REV (αντίστροφης φάσης), SPLV (σταθερά πολυστοιβαδιακά), SUV (µικρά µονοστοιβαδιακά), ULV (µονοστοιβαδιακά). 33

1.1.5.2 Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηµατισµό λεπτού υµενίου (film) κατά την εξάτµιση διαλυµάτων λιπιδίων σε οργανικό διαλύτη ή µίγµα διαλυτών. Για να αποµακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χηµική αποικοδόµηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηµατίζεται το λεπτό υµένιο, εκτίθεται σε ρεύµα αζώτου. Η ενυδάτωση (hydration) του υµενίου που ακολουθεί πραγµατοποιείται µε νερό ή µε ρυθµιστικό διάλυµα ή µε διάλυµα της προς εγκλωβισµό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτµισης των διαλυτών, πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασίες υψηλότερες της θερµοκρασίας µετάβασης φάσης του χρησιµοποιούµενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυµα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερµανθεί σε αυτή τη θερµοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με έντονη µηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υµένιο αποκολλάται από τα τοιχώµατά της, οπότε λαµβάνεται µία θολερή διασπορά µε πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα µεγάλου µεγέθους MLV. Η µείωση του µεγέθους των MLV λιποσωµάτων και η δηµιουργία οµογενούς σε αναφορά µε το µέγεθος πληθυσµού, υλοποιείται µε τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση µέσω φίλτρων ή µεµβρανών (extrusion), µικρoγαλακτωµατοποίηση (microemulcification) κ.ά. Στο τελευταίο στάδιο πραγµατοποιείται η διαδικασία του "annealing", κατά την οποία τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερµοκρασία υψηλότερη αυτής της µετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραµένουν για µία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να οµαλοποιηθεί η µορφοποίηση της δοµής τους. Η διάµετρος των λιποσωµάτων που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή κυµαίνεται από µερικά έως 5-6 µm (New 1990). 1.1.5.3 Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) Τα λιποσώµατα (SUV) που λαµβάνονται µε τη χρήση ακίδας υπερήχων έχουν διάµετρο της τάξης µερικών δεκάδων nm. Το σηµείο εκκίνησης είναι συνήθως µία διασπορά πολυστοιβαδιακών MLV λιποσωµάτων. εδοµένου ότι 34

αυτά τα σωµατίδια θα σπάσουν ολοκληρωτικά στην πορεία, δεν είναι απαραίτητο να ληφθεί προσοχή σχετικά µε το αρχικό µέγεθος των MLV λιποσωµάτων, το ποσοστό εγκλωβισµού και το πάχος του λιπιδικού υµενίου. Η ακίδα υπερήχων προτιµάται για διασπορές που απαιτούν υψηλή ενέργεια σε µικρό όγκο (π.χ. υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου, ή παχύρρευστη υδατική φάση), ενώ το λουτρό υπερήχων είναι περισσότερο κατάλληλο για µεγάλους όγκους διαλυµένου λιπιδίου και για περιπτώσεις που δεν είναι απαραίτητη η απόδοση οριακού µεγέθους σωµατιδίων. Την υπερήχηση µε ακίδα ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 15000 στροφές για πέντε λεπτά προκειµένου να αποµακρυνθούν αδιάσπαρτα κοµµάτια λιπιδίου και MLV λιποσώµατα ή συσσωµατώµατά τους καθώς και ρινίσµατα τιτανίου που αποδεσµεύονται λόγω της µεγάλης δύναµη τριβής που αναπτύσσεται µεταξύ της διασποράς και της ακίδας. 1.1.5.4 Εξώθηση µέσω φίλτρων Στα λιποσώµατα αυτού του τύπου η µείωση µεγέθους επιτυγχάνεται µε τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριµένη διάµετρο. Η µέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτηµα ότι παρέχει επαναλήψιµα αποτελέσµατα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σηµαντική µεταβολή. Επιπλέον µπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισµού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση µέσω φίλτρων διαµέτρου 0,2 µm οδηγεί σε εξαιρετικά οµοιογενείς πληθυσµούς λιποσωµάτων διαµέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979). 1.1.5.5 Χρήση Μικρογαλακτωµατοποιητή Για την παρασκευή λιποσωµάτων µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν γαλακτωµατοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι µικρογαλακτωµατοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειµένη περίπτωση τα λιποσώµατα, µε πολύ υψηλές πιέσεις µέχρι και (10000 p.s.i., 600 700 bar) µέσα από φίλτρα διαµέτρου 5µm. Στη συνέχεια διαπερνούν το µίγµα χωρισµένο σε δύο τµήµατα µε πολύ µεγάλη ταχύτητα, από µικρά κανάλια που αναµιγνύουν τα δύο ρεύµατα υπό ορθή γωνία παρέχοντας µε τον τρόπο αυτό πολύ µεγάλη ενέργεια. 35