ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΩΣΗ ΓΛΥΚΙΝΗΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΚΡΥΣΤΑΛΛΩΣΗ ΓΛΥΚΙΝΗΣ Ν. Δημητρίογλου Noέμβριος 2016

2 Κρυστάλλωση Γλυκίνης Σκοπός Να κατανοήσουν οι σπουδαστές τις βασικές αρχές της κρυστάλλωσης, πρωταρχικής διεργασίας διαχωρισμού και κάθαρσης, για παρασκευή και σταθερότητα Φαρμακευτικών Ενεργά Ουσιών (Active Pharmaceutical Ingredient) από την παρασκευή ως την άφιξή τους στον υπό θεραπεία ιστό. Για το σκοπό αυτό, χρειάζεται να μελετηθούν τα ακόλουθα: 1. Θερμοδυναμική της Κρυστάλλωσης από διάλυμα, δηλ., προσδιορισμός διαλυτότητας και αντίστοιχης κατάστασης σε μετασταθή ισορροπία. 2. Πολυμορφισμός, δηλ., αναγνώριση πως η ίδια ουσία κρυσταλλώνεται σε διαφορετικές κρυσταλλικές μορφές που έχουν διαφορετικές φυσικές και θεραπευτικές ή όχι ιδιότητες, ανάλογα με τίς συνθήκες κρυστάλλωσης, δηλ., θερμοκρασία, διαλύτης, τρόπος κορεσμού διαλύματος, και 3. Κινητική της Κρυστάλλωσης, δηλ., προσδιορισμός ρυθμού γέννησης πυρήνων και αύξησης σε μέγεθος κρυστάλλων, για το σχεδιασμό κρυσταλλωτηρίων. Γενικά Οι Φαρμακευτικά Ενεργές Ουσίες από την παρασκευή τους, στη διάρκεια της αποθήκευσης τους και ως τη λήψη τους από τον/την ασθενή και τη μετάβασή τους στο σημείο του σώματος που τις χρειάζεται, πρέπει να είναι χημικά και φυσικά σταθερές, πράγμα που εξασφαλίζεται με συγκεκριμένη κρυσταλλική δομή και μορφή. Η κρυστάλλωση γι αυτές τiς ουσίες, που είναι θερμικά ευαίσθητες, γίνεται σχεδόν αποκλειστικά από διάλυμα και όχι τήγμα. Η κρυστάλλωση από διάλυμα γίνεται από υπερκορεσμένο (supersaturated) διάλυμα είτε με μείωση της θερμοκρασίας ή με προσθήκη αντιδιαλύτη, δηλ.,

3 ουσίας πιο διαλυτής στον κύριο διαλύτη από την αρχική διαλυτή ουσία. Η διαλυτότητα της ουσίας, δηλ., η μέγιστη συγκέντρωσή της σε διάλυμα με τον συγκεκριμένο διαλύτη και σε ορισμένη θερμοκρασία, προσδιορίζεται με θολομετρία (turbidity measurement). Η κινητήρια δύναμη (driving force) για την κρυστάλλωση ουσίας είναι η διαφορά χημικού δυναμικού για τη συγκεκριμένη ουσία μεταξύ αδιάλυτης και διαλυμένης μορφής, κάτω από τίς ίδιες συνθήκες (θερμοκρασία, κλπ.), που μεταφράζεται σε διαφορά συγκέντρωσης της ουσίας, δηλ., διαφοράς συγκέντρωσης στο υπερκορεσμένο διάλυμα από την συγκέντρωση στο κορεσμένο διάλυμα ή αλλιώς τη διαλυτότητα. Κρυστάλλωση δεν παρατηρείται ώσπου η συγκέντρωση του υπερκορεσμένου διαλύματος να φτάσει σε επίπεδο λίγο πιο πάνω από τη διαλυτότητα, όπου το διάλυμα βρίσκεται σε μετασταθή ισορροπία (θερμοδυναμική). Πάνω από 90% των Φαρμακευτικών Ενεργά Ουσιών σήμερα είναι μικρά οργανικά μόρια, ενώ ένα μικρό ποσοστό είναι πολυπεπτίδια και πρωτεΐνες. Χαρακτηριστικό των οργανικών ουσιών είναι η ίδια ουσία, κάτω από διαφορετικές συνθήκες κρυστάλλωσης, να κρυσταλλώνονται σε διαφορετικά κρυσταλλικά συστήματα, όπως ορισμένα χημικά στοιχεία, π.χ., θείο. Αυτή η ιδιότητα για χημικά στοιχεία λέγεται αλλοτροπισμός, και για χημικές ενώσεις πολυμορφισμός. Οι τύποι της φαρμακευτικής ουσίας με διαφορετική κρυσταλλική μορφή, που αντανακλά τη μοριακή δομή, έχουν διαφορετικές βασικές ιδιότητες, π.χ., διαφορετική διαλυτότητα (στον ίδιο διαλύτη), διαφορετικό ρυθμό διάλυσης, διαφορετική διαπερατότητα σε μεμβράνες, και το πιο σπουδαίο, διαφορετικές ή όχι θεραπευτικές ιδιότητες. Οι βασικές ιδιότητες των φαρμακευτικών ουσιών που αναφέραμε παραπάνω, εκτός από την κρυσταλλική μορφή, επηρεάζονται και από το μέγεθος ή καλύτερα την κατανομή μεγέθους των κρυστάλλων. Η μέτρηση (της κατανομής) μεγέθους των κρυστάλλων γίνεται με πολλούς τρόπους, π.χ., οπτικό μικροσκόπιο, κόσκινα, μετρητή ηλεκτρικής αγωγιμότητας Coulter, μετρητή σκέδασης Λέιζερ, μετρητή φασματοσκοπίας ανάκλασης (Focused Βeam

4 Reflectance Μode; Mettler), κλπ. Από ανάλυση μεγέθους με κόσκινα για κρυσταλλωτήριο Αναμιγμένου Αιωρήματος και Απομάκρυνσης Αναμειγμένου Προϊόντος (Mixed Suspension Mixed Product Removal), και εφαρμογή του ισοζυγίου πληθυσμού (population balance) κρυστάλλων, προσδιορίζονται οι ρυθμοί παραγωγής πυρήνων και αύξησης σε μέγεθος των κρυστάλλων. H γλυκίνη, CΗ2(NH2)COOH, ένα από τα 20 αμινοξέα που συνθέτουν όλες τις γνωστές πρωτεΐνες, λόγω της απλής δομής και του μικρού μεγέθους του μορίου του, χρησιμοποιείται σαν πρότυπο για τη μελέτη πεπτιδίων και πρωτεϊνών. Άλλοι λόγοι που συνηγορούν στη χρησιμοποίησή της σαν πρότυπο για μελέτη είναι: Έχει καλή σχετικά διαλυτότητα στο νερό, Κρυσταλλώνεται σχετικά γρήγορα για μικρό οργανικό μόριο, και Υπάρχει πληθώρα μελετών της για σύγκριση Κρυσταλλώνεται σε τρείς πολυμορφικούς τύπους: τύπος α, που δημιουργείται από υδατικά διαλύματα και ευνοείται από την κινητική, τύπος β, που δημιουργείται από διαλύματα με μικτό διαλύτη, αιθανόλη και νερό, και είναι ασταθής, και τύπος γ, που είναι ο θερμοδυναμικά σταθερός τύπος και δημιουργείται από υδατικά διαλύματα με επιπρόσθετες ουσίες σε ελάχιστη συγκέντρωση (εξαφθοροβαλίνη, θειικό οξύ, οξικό οξύ ή αμμωνία). Συσκευές και όργανα Κρυσταλλωτήρι (τετράλαιμη σφαιρική φιάλη χωρητικότητας 2 L) περιέχει 1 lt κεκορεσμένο υδατικό διάλυμα γλυκίνης και λειτουργεί σε steady state με σύστημα μηχανικής ανάδευσης. 2 περισταλτικές αντλίες έχουν ρυθμιστή ροής και με αυτόν τον τρόπο ελέγχεται η εισροή του αντιδιαλύτη στο κρυσταλλωτήρι και η εκροή του μάγματος από αυτό. Ποτήρι ζέσεως χωρητικότητας 1 L Φίλτρο μm

5 Τζιφάρι Ξηραντήρας κενού (κατά προτίμηση ρευστοποιημένης κλίνης) Στιβάδα κοσκίνων με ελαττούμενο μέγεθος οπών πλέγματος από πάνω πρός τα κάτω; πρώτο κόσκινο (μέτρηση από άνω) τυπικό νούμερο πλέγματος < 14 (αντιστοιχεί σε άνοιγμα οπών 1,199 mm), τελευταίο κόσκινο (μέτρηση από άνω) τυπικό νούμερο πλέγματος > 65 (αντιστοιχεί σε άνοιγμα οπών 0,149 mm) 1 EtOH Γλυκίνη Ξηροί κρύσταλλοι 5 H 2 O Σχήμα 1 Διάγραμμα ροής της πειραματικής διαδικασίας. 1. Εισαγωγή πρώτης ύλης, διαλύτη και μη διαλύτη σε κρυσταλλωτήρι. 2. Περισταλτική αντλία αναρρόφησης μάγματος. 3. Διήθηση υπό κενό 4. Ξήρανση υπό κενό 5. Κοκκομετρική ανάλυση των ξηρών κρυστάλλων. Πειραματική διαδικασία Σε κρυσταλλωτήρι χωρητικότητας 1 λίτρου εισάγεται 0,5 λίτρο απιονισμένου Η2Ο και 118,8 γραμμάρια γλυκίνης, ποσότητα η οποία απαιτείται για να παρασκευαστεί κορεσμένο υδατικό διάλυμα γλυκίνης και το σύστημα τίθεται υπό V ανάδευση. Ρυθμίζεται η παροχή στα 0,414 ml/min και βάση του τ ο χρόνος q παραμονής είναι 2,42 min ( 2 min 26 sec ). Μετά από την πάροδο του χρόνου παραμονής συλλέγεται το προϊόν και διηθείται υπό κενό. Το διήθημα συλλέγεται

6 και τοποθετείται σε ξηραντήρα κενού και αφήνεται για 2 ημέρες. Στη συνέχεια συλλέγεται και τοποθετείται σε στιβάδα κοσκίνων με ελαττούμενο μέγεθος οπών (άνω κόσκινο 800 μm και κάτω κόσκινο 125 μm) για 30 min όπου και αναλύεται η κατανομή μεγέθους των κρυστάλλων. Θεωρία Η διαλυτότητα της γλυκίνης σε ένα διαλύτη μπορεί να υπολογιστεί από την εξίσωση van t Hoff ln x ΔH R f 1 T m 1 T όπου x είναι το μοριακό κλάσμα της γλυκίνης, ΔΗ f είναι η θερμότητα τήξης και Τ m η θερμοκρασία τήξης. Τα δεδομένα από ανάλυση με κόσκινα μετατρέπονται σε δεδομένα για ισοζύγιο πληθυσμού με την ακόλουθη σχέση: Δm ρ L n 3 k v ΔL όπου Δm είναι η ποσότητα των κρυστάλλων γλυκίνης που κατακρατήθηκε στο συγκεκριμένο κόσκινο, k v είναι ο ογκομετρικός συντελεστής σχήματος (k v = 1 για σφαιρα), 3 L ο αριθμητικός μέσος των μεγεθών του κόσκινου που κατακράτησε τους κρυστάλλους συγκεκριμένου μεγέθους και του κόσκινου αμέσως πάνω από το υπό εξέταση κόσκινο, και ΔL η διαφορά μεγέθους των δύο αυτών κοσκίνων. Εδώ το n είναι ο αριθμός των κρυστάλλων ανά μονάδα όγκου (κρυσταλλωμένου προϊόντος) ανά μονάδα μεγέθους (κρυστάλλων). Αν τα δεδομένα της ανάλυσης με κόσκινα παρασταθούν σε διάγραμμα με άξονες, οριζόντιο για το μέγεθος L, και κάθετο για το lnn, για τα μεσαία μεγέθη έχουμε ευθεία γραμμή που δηλώνει γραμμική σχέση του lnn με το L. Η ευθεία τέμνει τον κάθετο άξονα σε ένα σημείο που προσδιορίζει τόν αριθμό των πυρήνων κρυστάλλωσης ή κρυστάλλων μηδενικού μεγέθους ανά μονάδα όγκου και

7 1 μονάδα μεγέθους, n0. Η κλίση της ευθείας αυτής είναι ίση με, όπου G G τ είναι ο ρυθμός αύξησης μεγέθους (σε μονάδες μήκους ανά μονάδα χρόνου, π.χ., mm/h), και τ είναι ο χρόνος παραμονής στο κρυσταλλωτήριο (ίσος με το λόγο του όγκου του διαλύματος, V, προς την ογκομετρική παροχή στο κρυσταλλωτήριο, Q). O ρυθμός παραγωγής πυρήνων κρυστάλλωσης, Β, είναι B n Μετράται σε αριθμό κρυστάλλων ανά μονάδα όγκου ανά μονάδα χρόνου. 0 G ln n Σχήμα 2 Γραφική παράσταση του ρυθμό αύξησης μεγέθους, G. ln n σε συνάρτηση με το L. Η κλίση της ευθείας μας δίνει τον L