Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΣΤΕΜΦΥΛΩΝ ΣΕ ΔΕΙΚΤΕΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΜΥΙΚΑ ΚΑΙ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ ΚΑΙ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ Ν. Γκουτζουρέλας 1, Χ. Καρτερολιώτη 1, Σ. Γεωργαδάκης 1, Ν. Δεμερτζής 1, Π. Μαυρίδου 1, Δ. Στάγκος 1, Ν. Αληγιάννης 2, Λ. Σκαλτσούνης 2, Δ. Κουρέτας 1 1 Τμήμα Βιοχημείας-Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Λάρισα 41221 2 Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ, Πανεπιστημιούπολη Ζωγράφου, Αθήνα 15771

Ελεύθερες ρίζες Χημικά μόρια με ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στις ανώτερες ενεργειακές στάθμες που μπορούν να υπάρξουν ανεξάρτητα. Πηγές παραγωγής ελευθέρων ριζών στον οργανισμό: Φλεγμονή Αερόβιος Μεταβολισμός Υπεριώδης Ακτινοβολία Ιονίζουσα Ακτινοβολία Κάπνισμα Ατμοσφαιρική Ρύπανση

Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Καταλάση (CAT) Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) Αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR) Φλαβονοειδή Πρωτεϊνες θερμικού σοκ (HSP) Μελατονίνη Συνένζυμο Q1 (ουβικινόνη) Βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) Ουρικό οξύ Βιταμίνη Α Βιταμίνη Ε (α-τοκοφερόλη) Γλουταθειόνη (GSH)

Φυτικά εκχυλίσματα και Οξειδωτικό στρες Αρκετές εργασίες μελέτησαν την επίδραση διαφόρων φυτικών εκχυλισμάτων στους δείκτες οξειδωτικού στρες. Η επίδρασή τους σχετίζεται με την σύστασή τους σε αντιοξειδωτικά μόρια και κυρίως σε πολυφαινόλες. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε η επίδραση ενός εκχυλίσματος στεμφύλων της ποικιλίας Μπατίκι Τυρνάβου, πλούσιο σε βιοδραστικά συστατικά (Veskoukis et al., 212), σε καλλιέργεια μυϊκών κυττάρων της σειράς C2C12 και ενδοθηλιακων κυττάρων της σειράς EA.HY 926.

Φυτικές Πολυφαινόλες Μεγάλη και ετερογενής κατηγορία χημικών ενώσεων που παράγονται ως δευτερογενείς μεταβολίτες από τα φυτά. Αποτελούν σημαντική κατηγορία φυτοχημικών ενώσεων. Σταφύλια και κόκκινο (κυρίως) κρασί, φρούτα και λαχανικά, δημητριακά και ψυχανθή καθώς και το τσάι, η μέντα και το φασκόμηλο είναι σημαντικές πηγές πολυφαινολών των οποίων οι παραπάνω δράσεις έχουν έως τώρα μελετηθεί στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών.

Κατηγορίες Πολυφαινολών Ταξινόμηση με βάση: τον αριθμό των αρωματικών δακτυλίων που φέρουν, καθώς και τα δομικά στοιχεία που συνδέουν τους δακτυλίους μεταξύ τους. Διακρίνονται σε: φλαβονοειδή μη φλαβονοειδή COOH φαινολικά οξέα COOH στιλβένια λιγνάνια R R R R R Υδροξυκινναμικά οξέα Υδροξυβενζοϊκά οξέα OCH 3 H 3 CO CH 2 OH OH Στιλβένια HO HOH 2 C Λιγνάνια

Βιοδραστικές φυτοχημικές ενώσεις Ο όρος βιοδραστικές φυτοχημικές ενώσεις αναφέρεται σε ουσίες φυτικής προέλευσης που βρίσκονται στα τρόφιμα και έχουν ιδιότητες που τους προσδίδουν την ικανότητα να δρουν προστατευτικά σε χρόνιες παθήσεις Οι πολυφαινολικές ενώσεις αποτελούν από τις κυριότερες βιοδραστικές / φυτοχημικές ενώσεις των τροφίμων και είναι εκείνες οι οποίες έχουν μελετηθεί εκτενέστερα για τις βιολογικές τους ιδιότητες Βιολογικές δράσεις πολυφαινολών Αντιφλεγμονώδης Αντιαλλεργική Καρδιοπροστατευτική Αντικαρκινική Αντιμεταλλαξιγόνος Αντιοξειδωτική

ΣΚΟΠΟΣ Η μελέτη της επίδρασης ενός εκχυλίσματος στεμφύλων πλούσιο σε πολυφαινόλες, από την ποικιλία Vitis vinifera, Μπατίκι Τυρνάβου στην οξειδοαναγωγική κατάσταση των μυϊκών κυττάρων ποντικού C2C12 και των ενδοθηλιακών κυττάρων Εa.hy 926.

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Καλλιέργεια Κυττάρων: Κύτταρα της σειράς C2C12 και Ea.hy 926 καλλιεργήθηκαν σε φλάσκες επιφάνειας 75 και 25cm 2 σε θρεπτικό μέσο που αποτελούνταν από : 78% DMEM (περιέχει 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate) 2% FBS 1% L-Glutamine 1% Αντιβιοτικά (Στρεπτομυκίνη- Αμπικιλίνη) Συνθήκες Καλλιέργειας: Θερμοκρασία 37 o C Συγκέντρωση CO 2 5% Πειραματικός σχεδιασμός: Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τέσσερεις καταστάσεις για 24 ώρες: Α) Κατάσταση ελέγχου Β) Σε τρεις μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος (2.5, 5 και 1μg/ml για τα μυϊκά και.675,.125 και.25 για τα ενδοθηλιακά) Γ) Προσθήκη παράγοντα tert-butyl συγκέντρωσης.3mm Δ) Προσθήκη παράγοντα tert-butyl συγκέντρωσης.3mm έπειτα από χορήγηση εκχυλίσματος για 24 ώρες

Πειραματικός σχεδιασμός Εκχύλισμα συγκέντρωσης.675,,125 και,25μg/ml για Ea.hy 926 2.5,5 και 1μg/ml για C2C12 + t-booh (.3mM) Συλλογή κυττάρων DMEM 1% FBS DMEM % FBS 6 ή 3 min Επώαση του t- BOOH -24h 24h 25h

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες: Οι δείκτες οξειδωτικού στρες προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής και φασματοφωτομετρικά έπειτα από 24 ώρες καλλιέργειας. Φασματοφωτομετρικά στο κυτταρικό αιώρημα προσδιορίστηκαν οι δραστικές ουσίες του θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια (CARB). Με κυτταρομετρία ροής προσδιορίστηκαν οι ελεύθερες ρίζες (ROS) και η γλουταθειόνη (GSH).

Η κυτταρομετρία ροής (Flow Cytometry, FC) είναι μια τεχνική αυτοματοποιημένης κυτταρικής ανάλυσης που επιτρέπει τη μέτρηση μεμονωμένων σωματιδίων (κυττάρων, πυρήνων, χρωμοσωμάτων κ.λπ.) καθώς διέρχονται σε νηματική ροή από ένα σταθερό σημείο όπου προσπίπτει μία δέσμη φωτός

ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Με την κυτταρομετρία ροής μπορούμε να προσδιορίσουμε διάφορους δείκτες οξειδωτικού στρες σε κύτταρα.έτσι, μπορούμε να διαπιστώσουμε το οξειδωτικό στρες που προκαλεί ένας οξειδωτικός παράγοντας ή την αντιοξειδωτική δράση μιας ένωσης. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GSH) Για τον προσδιορισμό της GSH χρησιμοποιείται η φθορίζουσα χρωστική mercury orange (excitation 488nm, emission 58nm) η οποία συνδέεται με τη GSH. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ (ROS) Για τον προσδιορισμό του συνολικού επιπέδου των ROS στα κύτταρα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιούμε τη φθορίζουσα χρωστική 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA). Η DCFDA μετά την είσοδό της στα κύτταρα από-ακετυλιώνεταται από κυτταρικές εστεράσες σε ένα μη φθορίζον προϊόν το οποίο οξειδώνεται από τις ROS σε 2,7- dichlorofluorescin (DCF). Η DCF είναι μια φθορίζουσα χρωστική (excitation 495nm, emission 529nm) που μπορεί να προσδιοριστεί με κυτταρομετρία ροής. Άρα, από τα επίπεδα της DCF υπολογίζονται τα επίπεδα των ROS: όσο μεγαλύτερη η τιμή της DCF, τόσο περισσότερες οι ROS.

% of control % of control % of control % of control ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ C2C12 υπό την επίδραση εκχυλίσματος στεμφύλων για 24 ώρες ROS GSH 12 1 8 6 4 2 control 2,5 5 1 Extract concentrations (μg/ml) 35 3 25 2 15 1 5 control 2,5 5 1 Extract concentractions (μg/ml) TBARS Protein Carbonyls 12 1 8 6 4 2 control 2,5 5 1 Extract concentrations (μg/ml) 12 1 8 6 4 2 control 2,5 5 1 Extract concentrations (μg/ml)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μυικά κύτταρα υπό την επίδραση της χορήγησης εκχυλίσματος με κυτταρομετρία ροής GSH ROS

% of control % of control % of control % of control ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εa.hy 926 υπό την επίδραση εκχυλίσματος στεμφύλων για 24 ώρες 12 1 8 6 4 2 ROS control,675,125,25 Extract concentrations (μg/ml) 12 1 8 6 4 2 GSH control,675,125,25 Extract concentrations (μg/ml) TBARS Protein Carbonyls 12 1 8 6 4 2 control,675,125,25 Extract concentrations (μg/ml) 12 1 8 6 4 2 Control,675,125,25 Extract concentrations (μg/ml)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κύτταρα EA.hy 926 υπό την επίδραση της χορήγησης εκχυλίσματος με κυτταρομετρία ροής GSH ROS

% of control % of control % of control % of control ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ C2C12 υπό την επίδραση εκχυλίσματος στεμφύλων για 24 ώρες και την χορήγηση tert-butyl ROS GSH 12 1 8 6 4 2 14 12 1 8 6 4 2 # control tert 2,5 + tert 5 + tert 1 + tert control tert 2,5 + tert 5 + tert 1 + tert Extract concentrations (μg/ml) Extract concentrations (μg/ml) TBARS Protein Carbonyls 14 12 1 8 6 4 2 # 2 15 1 5 # control tert 2,5 + tert 5 + tert 1 + tert control tert 2,5 + tert 5 + tert 1 + tert Extract concentrations (μg/ml) Extract concentrations(μg/ml)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μυικά κύτταρα υπό την επίδραση της χορήγησης εκχυλίσματος με κυτταρομετρία ροής και την χορήγηση tert-butyl GSH ROS

% ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ea.hy 926 υπό την επίδραση εκχυλίσματος στεμφύλων για 24 ώρες και την χορήγηση tert-butyl ROS GSH 12 1 8 % 6 4 2 control tert (,3mM),675 + tert,125 + tert,25 + tert 12 1 8 % 6 4 2 # control tert (,3mM),675 + tert,125 + tert,25 + tert μg/ml μg/ml TBARS Carbonyls 14 12 1 8 % 6 4 2 # control tert,675 + tert,125 + tert,25 + tert 25 2 15 1 5 # control tert,675 + tert,125 + tert,25 + tert μg/ml μg/ml

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ea.hy 926 υπό την επίδραση της χορήγησης εκχυλίσματος με κυτταρομετρία ροής και την χορήγηση tert-butyl GSH ROS

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το εξεταζόμενο εκχύλισμα χωρίς την παρουσία οξειδωτικού παράγοντα μείωσε τα TBARS κατά 29, 37 και 54% στα C2C12 κύτταρα σε συγκεντρώσεις 2,5, 5 και 1μg/ml αντίστοιχα σε σχέση με την καλλιέργεια ελέγχου ενώ στα EΑhy926 δεν παρουσιάστηκε κάποια σημαντική διαφορά. Στα C2C12 η GSH αυξήθηκε στις συγκεντρώσεις 2,5, 5 και 1μg/ml κατά 151, 119 και 168% αντίστοιχα, ενώ στα EΑhy926 αυξήθηκε στις συγκεντρώσεις.675 και.125μg/ml κατά 15%. Οι ROS στα C2C12 μειώθηκαν στις συγκεντρώσεις 5 και 1μg/ml κατά 39 και 48% ενώ στα EΑhy926 δεν παρατηρήθηκε κάποια διαφορά. Το εκχύλισμα μείωσε σημαντικά τα πρωτεινικά καρβονύλια στα C2C12 κατά 2 %, 24 % and 21.8% στις τρεις συγκεντρώσεις 2.5, 5 and 1 μg/ml αντιστοιχα. Επίσης μειώθηκαν σημαντικά και στα Ea.hy 926 κατά 16.8%, 11.7% και 16.% στις συγκεντρώσεις.125,.67 και.25 μg/ml.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όσον αφορά τον οξειδωτικό παράγοντα t-booh, το εκχύλισμα έδρασε προστατευτικά καθώς όταν χορηγήθηκε πριν από αυτόν για 24 ώρες στα C2C12 σε συγκεντρώσεις 2.5, 5 και 1μg/ml καθώς αύξησε τη GSH κατά 22, 54 και 17%. Αντίστοιχα και μείωσε τα TBARS κατά 51, 52 και 36% αντίστοιχα σε σχέση με την καλλιέργεια που χορηγήθηκε ο παράγοντας t-booh. Επίσης, το εκχύλισμα στα Ea.hy926 μείωσε τα TBARS κατά 23, 2 και 18% σε συγκεντρώσεις.675 και.125 και.25 μg/ml αντίστοιχα σε σχεση με την καλλιέργεια που χορηγήθηκε ο παράγοντας t- BOOH. Στα C2C12 τα επίπεδα των ROS μείωθηκαν σημαντικά κατά 28,5% και 44,9% στις συγκεντρώσεις 5 και 1μg/ml ενώ στα Ea.hy 926 δεν παρατηρήθηκε διαφορά. Τα πρωτεινικά καρβονύλια μείωθηκαν στα C2C12 κατά 32%, 31.2% και 24.9% στις συγκεντρώσεις εκχυλίσματος 2.5, 5 και 1 μg/ml σε σχέση με την καλλιέργεια που χορηγήθηκε ο παράγοντας t-booh. Στα Ea.hy 926 παρατηρήθηκε μείωση κατά 41.5%, 26.2 % and 28.3% στις συγκεντρώσεις.675 και.125 και.25 μg/ml αντίστοιχα σε σχεση με την καλλιέργεια που χορηγήθηκε ο παράγοντας t-booh.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρατηρούμε ότι το εκχύλισμα μόνο του προκαλεί μείωση των ROS όσο αυξάνεται η συγκέντρωσή του στα C2C12, ενώ αυξάνει την γλουταθειόνη και μειώνει τα πρωτεινικά καρβονύλια με παρόμοιο τρόπο και στις τρεις συγκεντρώσεις, ενώ στα TBARS παρατηρούμε δοσοεξαρτώμενη μείωση. Στα Ea.hy 926 παρατηρούμε ότι το εκχύλισμα μόνο του αυξάνει την γλουταθειόνη και μειώνει τα πρωτεινικά καρβονύλια. Στα C2C12 το εκχύλισμα ασκεί προστατευτική δράση έναντι του παράγοντα t-booh καθώς μειώνει τα επίπεδα των ROS, αυξάνει την γλουταθειόνη μειώνει τα TBARS και τα πρωτεινικά καρβονύλια. Στα Ea.hy 926 το εκχύλισμα ασκεί προστατευτική δράση έναντι του παράγοντα t-booh καθώς αυξάνει την γλουταθειόνη μειώνει τα TBARS και τα πρωτεινικά καρβονύλια. Συμπεραίνουμε ότι το εκχύλισμα δρα αντιοξειδωτικά και προστατευτικά στις 2 κυτταρικές σειρές αλλά με διαφορετικό τρόπο και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.

ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ Προσδιορισμός μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων το εκχύλισμα μπορεί να ασκεί αντιοξειδωτική δράση στα C2C12 και Ea.hy 926 με τη χρήση διαφόρων μοριακών τεχνικών. Προσδιορισμός επιπέδων έκφρασης ολικού mirna από κυττάρα C2C12, Ea.hy 926 και ιστούς επίμυων σε συνθήκες παρουσίας και απουσίας οξειδωτικού παράγοντα με σκοπό τη δημιουργία δεικτών οξειδωτικού στρες. Τελικός σκοπός είναι οι δείκτες οξειδωτικού στρες να χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης ανθρώπων.