ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 3 Η ΜΚΡΟΒΙΟΛΟΠΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΕΡΟΥ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η μικροβιακή καταλληλότητα του νερού ελέγχεται με την καταμέτρηση των μικροβιακών δεικτών. Οι δείκτες αυτοί είναι μικροοργανισμοί, οι οποίοι περνούν παροδικά μέσα στο υδάτινο οικοσύστημα, προερχόμενοι συνήθως από το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου και των ζώων. Οι συχνότερα χρησιμοποιούμενοι, σήμερα, μικροβιακοί δείκτες είναι: Α) τα ολικά κολοβακτηριοειδή (total coliforms), μια ομάδα μικροοργανισμών στην οποία ανήκουν όλα τα αερόβια και προαιρετικά αναερόβια μη σπορογόνα κατά Gram-αρνητικά βακτήρια. Πολλαπλασιάζονται στους 36±1 C Β) τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή (faecal coliforms) τα οποία έχουν τις ίδιες ιδιότητες με τα κολοβακτηριοειδή. Αυτά μπορούν να πολλαπλασιαστούν στους 44.5±0.20C. Η Escherichia coli είναι το πιο τυπικό είδος της ομάδας των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Τόσο τα κολοβακτηριοειδή κοπράνων όσο και οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι βρίσκονται στον γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου και των άλλων θερμόαιμων ζώων και η παρουσία τους στο νερό υποδεικνύει ρύπανση κοπρανώδους προέλευσης και πιθανή παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών. Γ) οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι (faecal streptococci) οι οποίοι είναι κατά Gram-θετικά βακτήρια. Η ομάδα αυτή αποτελείται κυρίως από ορισμένα είδη του γένους Streptococous (S. faecalis, S. faecium, S. avium, S. bovis, S. equinous). Τα είδη S.faecalis, S. faecium απαντώνται συχνότερα στα κόπρανα του ανθρώπου ενώ άλλα είδη στα κόπρανα των ζώων. Η ομάδα των εντεροκόκκων (enterococci) είναι υποομάδα των κοπρανωδών στρεπτόκοκκων και περιλαμβάνει τα είδη S. faecalis, S. faecium και S. avium. Παρόλο που οι υγειονομικές διατάξεις αναφέρονται στην καταμέτρηση των κοπρανωδών στρεπτόκοκκων υπάρχουν ενδείξεις ότι στα υπάρχοντα θρεπτικά υποστρώματα αναπτύσσονται μόνο τα είδη που περιλαμβάνονται στην υποομάδα των εντεροκόκκων. Για τον έλεγχο ρουτίνας των μικροοργανισμών - δεικτών χρησιμοποιούνται δύο μέθοδοι. Η μέθοδος των πολλαπλών σωλήνων και η μέθοδος της διήθησης δια μεμβράνης, οι οποίες αναλύονται παρακάτω. Ιδιαίτερη προσοχή όμως πρέπει να δίνεται κατά τη δειγματοληψία του προς ανάλυση
νερού, η οποία θα πρέπει να γίνεται από κατάλληλο εκπαιδευμένο προσωπικό και κάτω από άσηπτες συνθήκες.
Α. Δειγματοληψία πόσιμου νερού: Κατά τη δειγματοληψία, το στόμιο της βρύσης αποστειρώνεται με τη φλόγα του λύχνου. Το νερό ρέει πρώτα επί περίπου 5 λεπτά και στη συνέπεια συλλέγεται σε αποστειρωμένη φιάλη. Στην περίπτωση δειγματοληψίας πόσιμου νερού από το δίκτυο ύδρευσης, η φιάλη θα πρέπει να περιέχει αναγωγική ουσία (Na2S2O3), η οποία προστίθεται πριν την αποστείρωση της φιάλης για να εξουδετερώνει οποιοδήποτε απολυμαντικό και να προφυλάσσει από τη συνεχιζόμενη αντιμικροβιακή δράση κατά τη διάρκεια μεταφοράς του δείγματος. Β. Δειγματοληψία από επιφανειακά ύδατα: Η δειγματοληψία από επιφανειακά νερά γίνεται σε βάθος 25-35 cm κάτω από την επιφάνεια και μακριά από την όχθη, αφού προηγουμένως απομακρυνθεί ο τυχόν επιφανειακός κονιορτός. Η δειγματοληψία για μικροβιολογική εξέταση του νερού από επιθυμητό βάθος, για ερευνητικούς συνήθως σκοπούς, γίνεται με ειδικές συσκευές δειγματοληψίας, όπως είναι η συσκευή Dunbar και του Miquel. Η συσκευή του Miquel αποτελείται από γυάλινη, με κενό αέρος, φύσιγγα περιεκτικότητας 250 ml, το ένα άκρο της οποίας είναι επίμηκες και στενό. Το άκρο αυτό σπάει στο συγκεκριμένο βάθος με το απότομο τράβηγμα σχοινιού και η φιάλη γεμίζει με νερό. Η μεταφορά των δειγμάτων για μικροβιολογική εξέταση είναι άμεση. Τα δείγματα τοποθετούνται υποχρεωτικά μέσα σε φορητό ψυγείο και μεταφέρονται αμέσως στο Εργαστήριο. Μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα 'μαρκάρονται' και συντάσσεται πρωτόκολλο στο οποίο σημειώνονται ημερομηνία δειγματοληψίας, πηγή προέλευσης, καθώς και οποιαδήποτε άλλα στοιχεία που θα φανούν χρήσιμα κατά τον έλεγχο των δειγμάτων. Η τεχνική της μεθόδου των πολλαπλών σωληναρίων Με αριθμημένα και αποστειρωμένα σιφώνια τοποθετούνται οι απαραίτητες ποσότητες ύδατος σε σωληνάρια τα οποία περιέχουν κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα (ζωμός Mac Conkey συνήθως) καθώς και σε ανεστραμμένο, τυφλό σωληνάριο όμι^άολ, με τον ακόλουθο τρόπο: α) σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν 10ml θρεπτικού υλικού τοποθετούνται 10ml του υπό εξέταση ύδατος, β) σε άλλους 5 δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν 5ml ζωμού τοποθετείται 1ml του προς εξέταση δείγματος νερού και γ) τέλος σε άλλους 5 δοκιμαστικούς σωλήνες με 5mlζωμού τοποθετείται 0,1 ml του δείγματος του νερού. Στους σωλήνες που υπάρχει μολυσμένο νερό με κολοβακτηριοειδή (coliforms), τα μικρόβια θα αναπτυχθούν και θα πολλαπλασιαστούν. Τα σωληνάρια, στα οποία δεν παρουσιάζεται μικροβιακή ανάπτυξη, τοποθετούνται στο κλίβανο για περαιτέρω επώαση ενός ακόμη 24 ώρου.
Εάν και μετά την συνολική παρέλευση 48 ωρών δεν εμφανιστούν στοιχεία μικροβιακής ανάπτυξης (αλλαγή χρώματος του θρεπτικού υλικού και παραγωγή αερίου), τα δείγματα αυτά θεωρούνται ως 'καθαρά'. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του πιο πιθανού αριθμού κολοβακτηριοειδών, που περιέχονται σε 100 ml του δείγματος νερού, επιτυγχάνεται με την βοήθεια ειδικών πινάκων που επινόησε ο μac Crady. Στους πίνακες αυτούς αναγράφονται όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί θετικών και αρνητικών αποτελεσμάτων. Έτσι εάν από τους 5 σωλήνες με περιεκτικότητα 10 ml νερού έδωσαν θετικό αποτέλεσμα 3, από τους 5 με 1 ml οι 2 και από τους 5 σωλήνες με 0,1 ml έδωσαν θετικό αποτέλεσμα επίσης οι 2, η απάντηση αντιστοιχεί στον πιο πιθανό αριθμό κολοβακτηριοειδών που αναγράφεται στην στήλη με τον συνδυασμό 3,2,2 και είναι 20 κολοβακτηριοειδή /100 ml νερού. Η μέθοδος των διηθητικών μεμβρανών Η μέθοδος των διηθητικών μεμβρανών είναι ευρέως διαδεδομένη και στηρίζεται στη χρήση ειδικών ηθμών - μεμβρανών (με διάμετρο πόρων 0,45μm) που επωάζονται, μετά τη διήθηση, σε εμπλουτισμένα ειδικά θρεπτικά υποστρώματα. Συγκεκριμένη ποσότητα νερού, π.χ, ΙΟΟml, διηθείται μέσω αποστειρωμένης μεμβράνης η οποία κατακρατεί όλα τα μικρόβια. Η μεμβράνη στη συνέχεια τοποθετείται σε τρυβλίο petri το οποίο περιέχει το ειδικό καλλιεργητικό υπόστρωμα και επωάζεται σε κλίβανο. Για την ανεύρεση του δείκτη των κολοβακτηριοειδών (total coliforms) χρησιμοποιείται συνήθως το εκλεκτικό υλικό m-endo agar Les (Difco) μετά από επώαση του τρυβλίου με τη μεμβράνη στους 36±1 C. Για την ανεύρεση των κολοβακτηριοειδών κοπρανώδους προέλευσης (faecal coliforms), χρησιμοποιείται το υλικό Μ-FC agar μετά από επώαση 24 ωρών στους 44.5 ±0,2 C ενώ για την ανεύρεση των κοπρανωδών στρεπτόκοκκων (faecal streptococci), χρησιμοποιείται το υλικό Slanetz and Bartley agar που επωάζεται στους 36±1 0 για 48 ώρες. Ακολουθεί επιβεβαιωτική δοκιμή με μεταφορά της μεμβράνης σε Αesculin Iron agar και επώαση για 60 λεπτά στους 44 C. Ο προσδιορισμός στηρίζεται στην ικανότητα κάθε μικροβίου να σχηματίζει μία αποικία όταν βρεθεί πάνω ή μέσα σε στερεό θρεπτικό υλικό. Επομένως μετράμε τις αποικίες που αναπτύσσονται στις μεμβράνες και εκφράζουμε τα αποτελέσματα σε αποικίες /ΙΟΟ ml νερού ( colony forming units ή cfu/100 ml) για κάθε μικροβιακό δείκτη.
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όργανα - Υλικά Συσκευή διήθησης Κλίβανοι επώασης Εκλεκτικά θρεπτικά υλικά για την ανεύρεση των δεικτών Αποστειρωμένες μεμβράνες με διάμετρο πόρων 0,45 μm Λαβίδες Καμινέτο για τη δημιουργία φλόγας Ποτηράκι ζέσεως με οινόπνευμα Πορεία Ι. Ετοιμάζουμε τα τρυβλία με τα θρεπτικά υποστρώματα που θα χρησιμοποιηθούν και σημειώνουμε στο κάτω μέρος του κάθε τρυβλίου την ημερομηνία, τον αριθμό του δείγματος και το δείκτη που ελέγχουμε στο αντίστοιχο θρεπτικό υλικό 2. Με τη βοήθεια του λύχνου αποστειρώνουμε την ανοξείδωτη χοάνη και τον υποδοχέα της μεμβράνης κατακράτησης μικροβίων. Περιμένουμε να κρυώσουν πριν χρησιμοποιηθούν. 3. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της λαβίδας, η οποία διαβρέχεται με οινόπνευμα και αποστειρώνεται στη φλόγα, ανοίγουμε τη συσκευασία της αποστειρωμένης μεμβράνης και την τοποθετούμε στον υποδοχέα. 4. Πάνω από τη φλόγα αφαιρούμε το πώμα του μπουκαλιού που περιέχει το προς ανάλυση δείγμα και ρίχνουμε στη συσκευή διήθησης 100 ml νερού. 5. Στο τέλος της διήθησης αφαιρούμε με τη χρήση πάλι αποστειρωμένης λαβίδας τη μεμβράνη και την τοποθετούμε στο τρυβλίο πάνω από το θρεπτικό υπόστρωμα. 6. Κλείνουμε το τρυβλίο και επωάζουμε στη θερμοκρασία που ενδείκνυται για το συγκεκριμένο δείκτη.
7. Η πιο πάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλες δύο φορές. Για κάθε δείγμα νερού ελέγχουμε συνήθως τρεις μικροβιακούς δείκτες (βλέπε παρακάτω) και συνεπώς χρησιμοποιούμε τρία τρυβλία με διαφορετικό εκλεκτικό υλικό. 8. Μετά την επώαση γίνεται καταμέτρηση των χαρακτηριστικών αποικιών: α) τα κολοβακτηριοειδή που αναπτύσσονται στο υλικό LES ENDO agar σχηματίζουν αποικίες σκούρου κόκκινου χρώματος με μεταλλική χροιά, β) τα κολοβακτηριοειδή κοπρανώδους προελεύσεως που αναπτύσσονται στο υλικό mfc agar σχηματίζουν αποικίες μπλε χρώματος και γ) οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι που αναπτύσσονται στο υλικό Slanetz & Bartley σχηματίζουν αποικίες κόκκινου χρώματος και στη συνέχεια πραγματοποιείται επιβεβαιωτική δοκιμή κατά την οποία η μεμβράνη μεταφέρεται σε ένα τρυβλίο Esculin Iron agar και επωάζεται στους 44 0C /1 ώρα. Η υδρόλυση της εσκουλίνης (esculin) υποδηλώνεται με την παρουσία μαύρου χρώματος στην επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος κάτω ακριβώς από τη μεμβράνη. 9. Μετά την καταμέτρηση το δείγμα αξιολογείται ως κατάλληλο ή ακατάλληλο σύμφωνα με τις κείμενες διατάξεις της Νομοθεσίας.