فصلنامه علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی لرستان مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی CHO و MCF7 - -2 2 2* حسام میرشهابی حوریه سلیمان جاهی زهرا مشکات الهام احمدي کارشناسی ارشد گروه ویروس شناسی دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس تهران ایران. دکتري تخصصی گروه ویروس شناسی دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس تهران ایران. دریافت مقاله: یافته / دوره شانزدهم / شماره / 2 تابستان / 93 مسلسل 60 93/2/6 پذیرش مقاله: 93/4/0 مقدمه: هدف ازمطالعهي حاضر مشخص نمودن رده سلولی مناسبتر جهت مطالعات تولید پروتي ین در سیستمه يا میباشد. پس چکیده از ترانسفکشن تغییرات ایجاد شده در سطوح بیانی RNA و پروتي ین نوترکیب هدف ارزیابی شد. یوکاریو یت مواد و روشها: به منظور بررسی بیان ژن مورد نظر و تولید پروتي ین نوترکیب E6 پاپیلوما ویروس انسانی تیپ 6 در سلولهاي مورد آزمایش از پلاسمید نوترکیب pcdna3-e6 و نیز دو رده سلولی متفاوت MCF7 و CHO استفاده گردید. به این منظور به دنبال ترانفکشن بیان RNA و پروتي ین هدف بوسیله واکنش زنجیرهاي پلیمراز معکوس لکهگذاري وسترن با استفاده از ژل SDS-PAGE و مونوکلونال آنتی بادي Anti-E6 ارزیا یب گردید. (RT-PCR) و آزمایش یافتهها: در این مطالعه به دلیل غلظت بسیار پایین پروتي ین تولیدي در سلولهاي MCF7 آزمایش RT-PCR مثبت و آزمایش وسترن بلاتینگ آن منفی شد این در حالی است که در رده سلولی CHO هر دو آزمایش ذکر شده مثبت شدند. بحث و نتیجهگیري: با توجه به نتایج بدست آمده توصیه میشود از سلول CHO به منظور ترانسفکشن و تولید پروتي ین نوترکیب در سیستمهایی که تولید بالاي پروتي ین امکان پذیر نیست استفاده گردد. واژههاي کلیدي: ترانسفکشن RT-PCR CHO MCF7 وسترن بلاتینگ. *آدرس مکاتبه نویسنده مسي ول: تهران دانشگاه تربیت مدرس دانشکده علوم پزشکی گروه ویروس شناسی. پست الکترونیک: soleim_h@modares.ac.ir 99
و MCF7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی با استفاده از لیپیدهاي کاتیونی وزیکولهاي غشایی مصنوعی به نام لیپوزوم و با بار مثبت ایجاد میشود. ترکیب کاتیونی حاصل قادر به اتصال به مولکول DNA بوده و توانایی اتصال به غشاء با بار منفی را دارد و با آندوسیتوز یا فیوژن با غشاء وارد سلول میشود (8 9). از مزایاي لیپوزوم ها می توان بازده نسبتا بالا و توانایی ترانسفکت ردههاي سلولی که به دکستران و کلسیم فسفات سازش ناپذیر هستند نام برد (0 ). در ضمن لیپوزوم این توانایی را دارد که DNA را در اندازه هاي مختلف از الیگو نوکلیوتید گرفته تا کروموزوم مصنوعی مخمر انتقال دهد (8). سلولها معمولا 72-48 ساعت بعد از ترانسفکشن جهت مطالعات بیان گذرا جمعآوري میشوند. بهترین زمان بسته به نوع سلول زمان تقسیم سلول و خصوصیات خاص بیانی ژن ترانسفکت شده فرق میکند. در این مطالعه از وکتور بیا ین یوکاریو یت pcdna3 استفاده شده است. سپس با مقایسه روشهاي موجود ترانسفکشن روش مناسب انتخاب میگردد. به دلیل اینکه تولید پروتي ین E6 با مشکلات ویژه همراه بوده و در مقیاس محدود انجام میگیرد در این مطالعه سعی شده است از بین سلوله يا موجود و با قدرت بالا به منظور ترانسفکشن دو سلول CHO و MCF7 براي تولید و بررسی میزان پروتي ین مورد نظر استفاده گردد. مقدمه انتقال ژن زمینهاي مهم در درمان بیماریهاي ژنتیکی و اکتسابی است و به این منظور ورود DNA خارجی به درون سلول (ترانسفکشن) به عنوان ابزاري مهم در زیست شناسی ساختمانی و عملکردي سلول مطرح میباشد ( 2). معمولا ترانسفکشن ژنه يا انجام میگیرد از این ویروسی با بکارگیري سلولهاي مختلف ردهه يا میان سلولی CHO و MCF7 به طور جداگانه در مطالعات زیادي استفاده شده است که با توجه به ویژگیه يا ذاتی سلول و نوع مطالعه سلولها انتخاب میشوند. روشهاي مرسوم ترانسفکشن سلولها عبارتند از: DEAE- الف) روشهاي شیمیایی: کلسیم فسفات DNA و انتقال dextran ب) روشهاي فیزیکی: 5 انتقال توسط ذرات بیولیستیک. 2 بوسیله لیپوزمهاي مصنوعی. 4 3 الکتروپوریشن میکروانجکشن و ج) استفاده از ناقلهاي نوترکیب ویروسی (). صرف نظر از روش انتقال ژن به سلولهاي یوکاریوتی براي بیان ژن سه مرحله باید انجام پذیرد. در ابتدا مواد ژنتیکی باید از غشاء سلولی عبور کرده و وارد سلول شوند. سپس باید این مواد در سلول رها شده تا بتوانند به محل اثر خود که میتواند سیتوپلاسم یا هسته باشد منتقل شوند. جهت بیان پروتي ین و در مرحله آخر انتقال ژن DNA آزاد شده باید فعال شود (3 4). کاربرد روشه يا ١ شیمیایی از جمله لیپیدهاي کاتیونی براي اولین بار در سال 987 گزارش شد (5-7). در این روش مواد و روشها تهیه پلاسمید به منظور بررسی بیان ژن مورد نظر و تولید پروتي ین نوترکیب E6 پاپیلوما ویروس انسانی تیپ 6 در سلولهاي مورد آزمایش از پلاسمید نوترکیب pcdna3-e6 استفاده شد. پروتي ین E6 پاپیلوما ویروس تقریبا از 50 اسید آمینه تشکیل شده است (3) و وزن تقریبی آن 8 KDa میباشد. Transfection 2. Liposomes 3. Electroporation 4. Microinjection 5. Biolistic particles 00
و MCF7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی (4). پلاسمید مورد استفاده در این پژوهش pcdna3 (Invitrogen) بود. این پلاسمید حاوي پروموتر ژنهاي اولیه SV40 CMV و باکتریوفاژ T7 و توالیهاي پلی A مربوط به BGH و SV40 میباشد. همچن ین من شا همانندسازي آن مربوط به ColE است. پلاسمید نوترکیب ذکر شده تهیه و ژن مورد نظر با تعیین توالی تا یید گردید. کشت سلول و ترانسفکشن در این مطالعه از دو رده سلولی متفاوت سلولهاي با منشا اپی تلیالی هامستر چینی و همچنین MCF7 CHO از منشا آدنوکارسینوماي پستان استفاده گردید. سلولها در انکوباتور 37 c با %5 2 Co کشت داده شدند. محیط کشت مورد استفاده RPMI 640 غنی شده با %0 سرم جنین گاو بود که با غلظت 00 g/mlμ آنتی بیوتیکهاي استرپتومایسن و پنی سیلین به آن افزوده شده بود. یک روز قبل از ترانسفکشن سلولها در پلیتهاي 6 خانه حاوي محیط بدون آنتی بیوتیک کشت داده شدند به طوریکه در هر خانه 2-0 5 0/5 سلول وجود داشته باشد. تعداد سلولها باید در حدي باشد که در زمان ترانسفکشن به اندازه 90-95 درصد پر شده باشد. به میزان 4 gμ از DNA پلاسمیدي به 250 lμ محیط کشت بدون سرم از لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen) به میزان 0 lμ به 250 lμ از محیط بدون سرم افزوده شد و به همراه رقت تهیه شده از DNA مورد نظر به مدت 5 دقیقه در دماي آزمایشگاه انکوبه شدند. رقتهاي DNA) و لیپوفکتامین) با هم ترکیب و سپس به مدت 20 دقیقه در دماي آزمایشگاه انکوبه شدند. در این مرحله کمپلکس -DNA لیپوفکتامین تشکیل میشود. پس از انکوباسیون 500 lμ از مخلوط فوق به هر خانه پلیت افزوده شد و از طریق حرکت جلو و عقب با محیط رویی سلولها مخلوط گردید. پلیت 6 خانه به مدت 4-5 ساعت در انکوباتور 37 c قرار داده شد و محیط کشت سلولها پس از گذشت زمان ذکر شده با محیط حاوي %0 سرم تعویض شد. البته به طور همزمان عمل ترانسفکشن براي سلولهاي کنترل منفی نیز انجام شد که در آنها از DNA استفاده نشد. ١ بررسی بیان ژن به وسیله واکنش زنجیرهاي پلیمراز معکوس (RT-PCR) اولین مرحله از بیان ژن نسخه برداري است. اگر RNA تولید شده باشد یعنی ژن بیان شده و اگر بیان نشود RNAاي نیز ساخته نمیشود. RT-PCR یک روش سریع و فوقالعاده حساس میباشد که میتواند بیان ژن مورد نظر را تا یید کند و قادر است یکسري اطلاعات نیمه کمی در مورد میزان بیان ژن نشان دهد. بررسی بیان ژن نیاز به شناسایی دقیق میزان mrna دارد. PCR بر پایه تکثیر زنجیرههاي DNA میباشد. بنابراین ابتدا RNA توسط فرایند شناخته شده رونویسی معکوس تبدیل به DNA میشود. سپس واکنش PCR بر روي DNA مکمل (cdna) انجام میشود (5). بر این اساس 48 ساعت پس از ترانسفکشن استخراج RNA صورت گرفت. براي استخراج RNA از سلولهاي ترانسفکت شده از کیت استخراج RNAي RNX-PLUS (سیناژن) استفاده شد. جهت حذف DNA از آنزیم DNase استفاده شد تا پلاسمیدهاي احتمالی موجود باعث ایجاد پاسخ مثبت کاذب نشوند. براي س اختن MO-MLV در این پ ژوهش از آنزیم cdna (Fermentase) استفاده شد. همچنین پرایمرهاي الیگوتایمیدین به کار گرفته شد تا فقط از روي mrna هاي موجود cdna ساخته شود. در ادامه بر روي cdna به. Complementary DNA 0
و 3 و MCF7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی بر روي سلولهاي CHO و MCF7 با استفاده از لیپوفکتامین ١ 2000 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت. دست آمده توسط پرایمرهاي اختصاصی ژن E6 پاپیلوما ویروس انسانی تیپ 6 PCR انجام شد. وسترن بلاتینگ هفتاد و دو ساعت پس از ترانسفکشن سلولها جمع آوري شدند و براي انجام آزمایش SDS-PAGE آماده سازي شدند. روش کار بدین صورت بود که سلولها پس از چندین بار شستشو با PBS در کمی بافر فسفات به همراه آنتی پروتي از PMSF (با غلظت 00) mm/ml به میزان 0/0 حجم نمونه مخلوط و در تیوب تمیز قرار داده شد. در مرحله بعد محتوي تیوب ها به مدت 5 دقیقه تحت امواج ماوراء صوت با فرکانس 60H قرار گرفتند. رسوب حاصل براي ارزیابی پروتي ین موجود در آن در 70- نگهداري شد. از سوسپانسیون سلولی تهیه شده جهت آزمایش SDS-PAGE استفاده شد که ژل 2 درصد براي قسمت جداکننده و ژل 5 درصد براي قسمت متراکم کننده استفاده شد. رنگ آمیزي ژل پلی آکریل آمید با کوماسی آبیR-250 صورت گرفت که با این روش میتوان 0/2 تا 0/5 میکروگرم پروتي ین را در هر باند تشخیص داد (6). در این مطالعه ابتدا با روش SDS-PAGE باندهاي پروتي ینهاي سلولی از یکدیگر جدا شدند. سپس در وسترن بلاتینگ با آنتی بادي منوکلونال (Abcam) Anti-E6 مجاور شد و نتایج بررسی گردید. یافتهها ترانسفکشن سلولهاي CHO و MCF7 با پلاسمید بیانی pcdna3-e6 براي ورود پلاسمید نوترکیب به داخل سلول یوکاریوتی و تا یید بیان پروتي ین تولید شده ترانسفکشن بررسی بیان ژن به وسیله RT-PCR پس از استخراج RNA از سلولهاي ترانسفکت شده و ساخت cdna آن بر روي cdna بدست آمده PCR انجام شد. پس از انجام PCR محصول آن بر روي ژل آگاروز /5 درصد در کنار مارکر DNA الکتروفورز گردید و قطعه حدود 600 جفت بازي مشخص گردید. در این بررسی آزمایش RT-PCR در هر دو رده سلولی CHO و MCF7 مثبت مشاهده شد (شکل ). شکل. نتایج.RT-PCR - کنترل منفی 2- نشانگر کیلو بازي -6 به ترتیب عبارتند از رده هاي سلولی CHO و MCF7 ترانسفکت شده با وکتور بیا ین با وکتور بیا ین حاوي ژن و 4 و 5- به ترتیب همان لیزات سلول ها هستند که فاقد ژن ترانسفکت شدهاند. نتایج بررسی بیان پروتي ین به روش SDS-PAGE براي بررسی بیان لیزات بدست آمده از سلولهاي ترانسفکت شده را پس از تیمار با بافر نمونه و قرار دادن آن به مدت 0-5 دقیقه در آب در حال جوش در ژل پلی آکریل آمید در حضور SDS الکتروفورز شد (شکل 2).. Sodium Dodecyl Sulfate- Poly Acrylamide Gel Electrophoresis proteins 02
و 2 و MCF7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی شکل 2. نتایج.SDS-PAGE سلوله يا - مارکر پروتي ینی و 2 و 3 - به ترتیب CHO و MCF7 ترانسفکت شده با وکتور بیا ین وسترن بلاتینگ حاوي ژن. ژل SDS-PAGE با استفاده از مونوکلونال آنتی بادي Anti-E6 ب راي آزمایش وسترن بلاتینگ (لکه گذاري وسترن) استفاده گردید. در این مطالعه به دلیل غلظت بسیار پایین پروتي ین تولیدي در سلولهاي MCF7 آزمایش وسترن بلاتینگ آن منفی شد این در حالی است که در رده سلولی CHO آزمایش ذکر شده مثبت گزارش شد (شکل 3). شکل 3. با وکتور بیا ین نتایج وسترن بلاتینگ. - رده سلولی MCF7 ترانسفکت شده حاوي ژن CHO ترانسفکت شده با وکتور بیا ین ترانسفکت شده با وکتور بیا ین 3- به ترتیب ردههاي سلولی MCF7 و فاقد ژن 4- رده سلولیCHO حاوي ژن 5 -مارکر پروتي ینی. بحث و نتیجهگیري تحت شرایط مناسب سلولهاي یوکاریوتی این توانایی را دارند که DNA خارجی را دریافت کنند که قسمتی از این DNA میتواند در هسته لوکالیزه شود (5). عواملی مانند سلامت سلول درصد پر شدگی سلول تعداد پاساژ سلول و آلودگی DNA) خالص شده باید عاري از پروتي ین RNA و آلودگیهاي شیمیایی باشد) تا ثیر مهمی در افزایش بازده ترانسفکشن (با هر روش و موادي) و در میزان بیان پروتي ین توسط یک سل لاین دارند. یوکاریو یت امروزه بیان پروتي ینهاي نوترکیب در سیستم بیا ین اهمیت بسیار زیادي دارد. از بین فاکتورهاي مختلف تا ثیر گذار انتخاب رده سلولی مناسب جهت انجام ترانسفکشن داراي اهمیت بوده میتواند باعث موفقیت در تولید و تشخیص پروتي ینه يا نوترکیب گردد. بنابراین در این مطالعه دو رده سلولی مختلف جهت ترانسفکشن انتخاب و تولید پروتي ین نوترکیب با دو روش RT-PCR و وسترن بلاتینگ مورد ارزیا یب قرار گرفت. به این منظور وکتور بیانی حاوي ژن مورد نظر به درون سلولهاي یوکاریوتی CHO و MCF7 ترانسفکت شد و بیان پروتي ین در این سلولها مورد مطالعه قرار گرفت. در ترانسفکشن انتخاب روش ترانسفکشن بستگی به نوع سلول و نوع وکتور بیانی دارد. در حال حاضر لیپیدهاي کاتیونی مانند لیپوفکتامین 2000 ترانسفکشن پلاسمید در سلولهاي یوکاریوتی را تسهیل کردهاند. در هنگام استفاده از این روش ترانسفکشن وجود آنتی بیوتیک در محیط باعث مرگ سلولها میشود. بنابراین باید توجه داشت که روش کار کاملا منطبق بر توصیههاي شرکت سازنده باشد. تولید پروتي ین در سلولهاي ترانسفکت شده را میتوان 48 تا 72. Confluency 03
و MCF7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی ساعت پس از ترانسفکشن بررسی کرد. سنجش و ارزیابی نسخههاي mrna تولید شده از ژن هدف بوسیله آزمایش RT-PCR یک تست تا ییدي مناسب براي بررسی بیان پروتي ین میباشد. در این پژوهش از RT-PCR به عنوان یک مرحله میانی از تکثیر ژن تا تولید پروتي ین هدف مورد استفاده قرار گرفت. در سیستمهاي یوکاریوتی به دلیل مقدار کم پروتي ین نوترکیب تولید شده و نیز به دلیل وجود پروتي ینهاي سلولی در محیط تشخیص باند پروتي ینی نو ترکیب تولید شده در زمینه ژل SDS-PAGE مشکل و در بیشتر موارد غیر ممکن است. بنابراین پس از انجام SDS-PAGE باندهاي پروتي ینی مورد نظر به غشا (نیتروسلولز یا ( PVDF انتقال می یابد تا شناسایی آنها با استفاده از آنتی بادیهاي اختصاصی مورد نظر انجام گیرد (7-20). با این حال میزان پروتي ینی که توسط یک ژن در سلولهاي یوکاریوت تولید میشود تقریبا 000-00 برابر کمتر از میزان پروتي ین تولید شده توسط همان ژن در سلولهاي پروکاریوت (E.coli) یا حشرات میباشد. این در حالی است که در بالاترین میزان بیان ژن در سلولهاي یوکاریوت پروتي ین تولید شده فقط 2/5 درصد کل پروتي ین تولید شده در سلول را به خود اختصاص میدهد (22 2). در این پژوهش از رده هاي سلولی CHO و MCF7 جهت ترانسفکشن و بررسی تولید پروتي ین نوترکیب استفاده گردید. با توجه به غلظت بسیار پایین پروتي ین تولیدي در سلولهاي MCF7 آزمایش RT-PCR مثبت و آزمایش وسترن بلاتینگ آن منفی شد. این در حالی است که در رده سلولی CHO هر دو آزمایش ذکر شده مثبت شدند. با توجه به نتایج بدست آمده توصیه میشود از سلول CHO به منظور ترانسفکشن و تولید پروتي ین نو ترکیب استفاده گردد. تشکر و قدردانی این مطالعه با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشکده علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس انجام شده است. 04
و MCF 7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی References. Schwanhäusser B, Busse D, Li N, Dittmar G, Schuchhardt J, Wolf J, et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 20;473: 337-342. 2. Brunner S, Furtbauer E, Sauer T, Kursa M, Wagner E. Overcoming the Nuclear Barrier: Cell Cycle Independent Nonviral Gene Transfer with Linear Polyethylenimine or Electroporation. Mol Ther. 2002;5(): 80-86. 3. Twyman RM. Gene Transfer to Animal Cells. First ed, BIOS Scientific Publishers, 2005. 4. Xu Y, Szoka FC. Mechanism of DNA release from cationic/dna complex used in cell transfection. Biochemistry. 996; 35:566-5623. 5. Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, et al. Lipofection: a highly fficient, lipidmediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA. 987;84:743-747. 6. Felgner PL, Ringold GM. Cationic liposome-mediated transfection, Nature. 989; 337:387-388. 7. Daniels-McQueen S, Goessling LS, Thach RE. Inducible expression bovine papillomavirus shuttle vectors containing ferritin transitional regulatory elements. Gene. 992;22: 27-279. 8. Pines J. GFP in mammalian cells. Trends Genet. 995;:326-327. 9. Macdonald RC, Ashly GW, et al. Physical and biological properties of cationic trimesters of phosphatidylcholine. Biophysical J. 999;77:262-2629. 0. Wong FM, Reimer DL, Bally MB. Biochemistry. 996;35:5756-5763.. Bally MB, Harvie P, Wong FMP, Kong S, Wasan EK, Reimer DL. Biological barriers to cellular delivery of lipid-based DNA carriers. Adv Drug Deliv Rev. 999; 38:29-35. 2. Dunn KW, Maxfield FR. Delivery of ligands from sorting endosomes to late endosomes occurs by maturation of sorting endosomes. J Cell Biol. 992;7: 30-30. 3. Rapp L, Chen JJ. The papaillomavirus E6 proteins. Biochim Biophys Acta. 998; 378: F-F9. 4. Masson M, Hindelang C, Sibler AP, Schwalbach G, Trave G, Weiss E. Preferential nuclear localization of the human papillomavirus type 6 E6 oncoprotein in cervical carcinoma cells. J Gen Virol. 2003;84:2099-204. 5. McPherson MJ, Moller SG. The basis of PCR. Oxford BIOS Scientific Publishers Ltd, 2000. 6. Cao W, Hashibe M, Rao JY, Morgenstern H, Zang ZF. Comparision of methods for DNA extraction from paraffin- embedded tissues and buccal cells. Cancer Detect Prevent. 2003;27:397-404. 7. Mirshahabi H, Solimanjahi H, Meshkat Z, Bamdad T, Hassan ZM. Isolation of Iranian human Human papillomavirus Papilloma Virus type 6 gene and construction of its cloning vector. Pak J Biol Sci. 2006;9:2652-2656. 8. Muller K, Engesser R, Schulz S, Steinberg T, Tomakidi P, Weber C, et al. Multichromatic control of mammalian gene 05
و MCF 7 CHO مقایسه میزان تولید پروتي ین نوترکیب در دو رده سلولی expression and signaling. Nucleic Acids Res. 203;4(2):29-40. 9. Johnson A, Jurcisek JA. A method to monitor DNA transfer during trasfection. AAPS Pharmsci. 999;(3):-7. 20. Deans TL, Cantor CR, Collins JJ. A tunable genetic switch based on RNAi and repressor proteins for regulating gene expression in mammalian cells. Cell. 2007;30:363-372. 2. Tabor JJ, Levskaya A, Voigt CA. Multichromatic control of gene expression in Escherichia coli. J Mol Biol. 20;405: 35-324. 22. Kaufman RJ. Overview of vector design for mammalian gene expression. Molecul Biotechnology. 2000;6:5-60. 06