ΜΕΛEΤΗ ΤΗΣ EΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΕΡΓΛΥΚIΝΗΣ ΣΕ OΓΚΟΥΣ OΡΧΕΩΝ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΑΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΈΝΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ: ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ - ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΛEΤΗ ΤΗΣ EΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΕΡΓΛΥΚIΝΗΣ ΣΕ OΓΚΟΥΣ OΡΧΕΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΡOΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΡYΘΜΙΣΗ ΤΗΣ EΚΦΡΑΣΗΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡIΩΝ ΠΕΠΕ ΑΓΓΕΛΙΚΗ ΕΙΡΗΝΗ ΠΑΤΡΑ 2011 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΕΟΧΑΡΗΣ ΑΧΙΛΛΕΑΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

2

UNIVERSITY OF PATRAS FACULTY OF SIENCE DEPARTMENT OF CHEMISTRY ORGANIC CHEMISTRY, BIOCHEMISTRY AND NATURAL PRODUCTS POSTGRADUATE THESIS APPLIED CHEMISTRY : CLINICAL CHEMISTRY- BIOTECHNOLOGY- EVALUATION OF MEDICAL PRODUCTS STUDY OF THE EXPRESSION OF SEGLYCIN IN TESTICULAR TUMORS AND ITS ROLE IN THE REGULATION OF EXPRESSION OF BIOACTIVE MOLECULES PEPE AGELIKI EIRINI PATRA 2012 SUPERVISOR PROFESSOR THEOCHARIS ACHILLEAS ASSISTANT PROFESSOR OF BIOCHEMISTRY DEPARTMENT OF CHEMISTRY 3

4

Η παρούσα µεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµατος σπουδών του Τµήµατος Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών µε τίτλο Εφαρµοσµένη Βιοχηµεία: κλινική χηµεία- βιοτεχνολογία- αξιολόγηση φαρµακευτικών προϊόντων. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1.ΘΕΟΧΑΡΗΣ ΑΧΙΛΛΕΑΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) 2.ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ 3.ΒΥΝΙΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ 5

6

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1.THEOCHARIS ACHILLEAS, ASSISTANT PROFESSOR OF BIOCHEMISTRY, DEPARTMENT OF CHEMISTRY, UNIVERSITY OF PATRAS, GREECE (SUPERVISOR PROFESSOR) 2.KARAMANOS NIKOS, PROFESSOR OF BIOCHEMISTRY, DEPARTMENT OF CHEMISTRY, UNIVERSITY OF PATRAS, GREECE 3.VYNIOS DEMITRIOS, PROFESSOR OF BIOCHEMISTRY, DEPARTMENT OF CHEMISTRY, UNIVERSITY OF PATRAS, GREECE 7

8

Ευχαριστίες Η παρούσα µεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο βιοχηµείας του τοµέα οργανικής χηµείας, βιοχηµείας και φυσικών προϊόντων του τµήµατος χηµείας στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµ ατος Εφαρµοσµένη Βιοχηµεία : Κλινική χηµεία-βιοτεχνολογία- Αξιολόγηση φαρµακευτικών προϊόντων του Πανεπιστηµίου Πατρών. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους ανθρώπους που µου έδωσαν την δυνατότητα να πραγµατοποιήσω την παρούσα ερευνητική εργασία, µε στήριξαν κατά τη διάρκειά της και µε βοήθησαν να τη φέρω εις πέρας. Ευχαριστώ θερµά τον επιβλέποντα καθηγητή µου κύριο Αχιλλέα Θεοχάρη, Επίκουρο Καθηγητή του Τµήµατος Χηµείας Πατρών, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε και την καθοδήγηση του, τις συµβουλές και την υποστήριξη του. Τα µέλη της εξεταστικής επιτροπής, καθηγητές Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας κύριο Νικόλαο Καραµάνο και κύριο Δηµήτριο Βύνιο για τη βοήθεια τους και τις πολύτιµες συµβουλές. Τις υποψήφιες διδάκτορες του τµήµατος χηµείας κυρία Μήλια Ελένη και κυρία Κορπεντίνου Αγγελική για την συνεργασία τους, την προσφορά τους και τη βοήθεια τους καθόλη τη διάρκεια της µεταπτυχιακής διατριβής, καθώς και τα όλα τα µέλη του εργαστηρίου. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια µου. Τους γονείς µου, Σταύρο και Ελένη, γιατί χάρη στην συµπαράσταση, την στήριξη και την παρότρυνση τους κατάφερα να φτάσω σε αυτό εδώ το σηµείο. Την αδερφή µου και καλύτερη φίλη µου, Ειρήνη, γιατί ήταν πάντα στο πλευρό µου να µε στηρίζει και να µε βοηθά. Η παρουσία τους ήταν πάντα πολύτιµη, τόσο στις χαρές όσο και στις δυσκολίες. 9

10

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 11

12

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 15 ABSTRACT... 19 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ - ΕΠΕΞΗΓΗΣΕΙΣ... 23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 29 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ... 31 ΔΙΗΘΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ...33 ΚΑΛΟΗΘΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΕΙΣ ΟΓΚΟΙ... 34 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΟΡΧΕΩΝ... 35 ΝΕΟΠΛΑΣΙΑ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ... 38 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ...39 ΑΙΤΙΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ - ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ...41 ΙΣΤΟΓΕΝΕΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ...43 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ...44 ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ...49 ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΑ...51 ΟΓΚΟΙ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ...52 ΟΓΚΟΙ ΤΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΓΟΝΑΔΩΝ.... 54 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ- ΕΞΕΛΙΞΗ...55 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ - ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ...55 ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΣ ΧΩΡΟΣ... 56 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΥ ΧΩΡΟΥ (ECM)... 57 ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΕΣ...58 Θειϊκη χονδροϊτινη και θειϊκη δερματανη (CS/DS)... 58 Θειϊκη ηπαρανη και ηπαρινη (HS/HP)... 59 Θειϊκη κερατανη (KS)... 61 Υαλουρονικό οξύ... 62 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΗΑ... 71 ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΗΑ ΣΤΗΝ ΟΓΚΟΓΕΝΕΣΗ...73 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ...76 ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ...78 Εξωκυτταριες πρωτεογλυκανες... 78 PGs της βασικής μεμβράνης... 79 PGs της κυτταρικής μεμβράνης... 79 Ενδοκυτταριες πρωτεογλυκανες... 79 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ...79 PGS ΠΟΥ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΥΝ ΜΕ ΤΟ ΗΑ ΚΑΙ ΠΡΟΣΟΜΟΙΑΖΟΥΝ ΜΕ ΛΕΚΤΙΝΕΣ (HYALECTANS)... 80 13

Πρωτεογλυκανες της βασικης μεμβρανης... 81 Μεμβρανικες PGs... 82 Η οικογενεια των Syndecans... 83 ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΟΥ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ, CD44... 87 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ CD44 ΣΤΗΝ ΟΓΚΟΓΕΝΕΣΗ...96 ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΕΣ PGS...99 ΣΚΟΠΟΣ... 107 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 111 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ...113 ΤΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ Η ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ...113 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ...113 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΑΣΗ ABC... 114 ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ...114 ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ...114 ΠΑΡΟΔΙΚΗ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ (TRANSIENT TRANSFECTION) ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΕΙΡΩΝ ΜΕ ΜΕ ΛΙΠΟΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ (LIPOFECTION)... 115 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA... 116 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ C DNA... 117 ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ...118 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ...121 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ...121 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ SDS (SDS- PAGE)... 122 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ...123 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ WESTERN BLOTTING...123 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ...124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 125 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ SG ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΟΓΚΩΝ ΟΡΧΕΩΝ...129 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ SG ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΣΕ ΣΕΙΡΕΣ ΟΓΚΟΥΣ ΟΡΧΕΩΝ...130 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ SG ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΟΓΚΩΝ ΟΡΧΕΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ...130 Μελετη της εκφρασης του CD44s... 131 Μελετη της εκφρασης των συνθασων του ΗΑ... 133 Μελετη της εκφρασης των υαλουρονιδασων... 136 Μελετη της εκφρασης των Syndecans... 139 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 145 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 153 14

ΠΕΡΙΛΗΨΗ 15

16

Η νεοπλασία των όρχεων αναπτύσσεται σε άνδρες ηλικίας 15-35 ετών και ενώ είναι µια σπάνια µορφή νεοπλασίας (1-2% όλων των νεοπλασµάτων του άνδρα) αποτελεί τον πιο συχνό όγκο στις ηλικίες 20-40 ετών και είναι η τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Οι πρωτεογλυκάνες είναι βιοδραστικά µόρια και η έκφραση τους τροποποιείται σηµαντικά στο µικροπεριβάλλον του όγκου. Μελέτες του εργαστηρίου µας έδειξαν ότι η πρωτεογλυκάνη σεργλυκίνη (SG) υπερεκφράζεται σε πολλές κακοήθειες όπως στον καρκίνο του µαστού, του πνεύµονα και σε γλοιώµατα, ενώ σε πιο επιθετικές µορφές καρκινικών κυττάρων η SG υπερεκφράζεται και εκκρίνεται σε υψηλά ποσά στο µέσο καλλιέργειας. Στην παρούσα µεταπτυχιακή εργασία µελετήθηκε η έκφραση της σεργλυκίνης σε όγκους όρχεων. Δείγµατα ασθενών µελετήθηκαν µε ανοσοαποτύπωση και βρέθηκε ότι η SG εκφράζεται τόσο στον φυσιολογικό ορχικό ιστό όσο και στους όγκους όρχεων όπου εµφανίζει πιο έντονη έκφραση. Ανοσοϊστοχηµική µελέτη έδειξε ότι η SG εκφράζεται από τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα ενώ η έκφραση της αυξάνεται στους όγκους όρχεων. Η έκφραση της SG µελετήθηκε σε τρεις σειρές όγκων όρχεων (JKT-1, σεµίνωµα; NT2/D1, εµβρυϊκό καρκίνωµα; NCCIT, τεράτοκαρκίνωµα) και βρέθηκε ότι εκφράζεται και στις τρεις κυτταρικές σειρές, µε µεγαλύτερη έκφραση στην πιο επιθετική σειρά, NT2/D1. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε υπερέκφραση της SG στις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων µε διαµόλυνση των κυττάρων µε πλασµίδιο που φέρει το γονίδιο της SG. Ακολούθως µελετήθηκε ο ρόλος της SG στην έκφραση βιοδραστικών µορίων, όπως είναι τα ένζυµα βιοσύνθεσης και καταβολισµού καθώς και ο υποδοχέας CD44 του ΗΑ και οι πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής µεµβράνης syndecans. Ο CD44 είναι µια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυµα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισοµορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α και HAS-3β. Μελέτες υποστηρίζουν ότι ο µεµβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισοµορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει µε το ΗΑ. Η σηµατοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα µέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήµα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Επίσης µελέτες έχουν δείξει πως υπάρχει συσχέτιση µεταξύ των HYALs και του διεισδυτικού και µεταστατικού φαινότυπου των όγκων. Αυξηµένα επίπεδα τους έχουν βρεθεί σε όγκους της 17

ουροδόχου κύστεως, του προστάτη, κεφαλής και τραχήλου, µαστού αλλά σε µεταστατικούς όγκους. Η ισοµορφή CD44s εκφράζεται και στις τρεις κυτταρικές σειρές, αλλά η υπερέκφραση της SG µειώνει την έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινωµάτος, ενώ δεν επηρεάζει σε µεγάλο βαθµό την έκφραση του στο σεµίνωµα και το εµβρυϊκό καρκίνωµα. Στην κυτταρική σειρά σεµινώµατος, έχει βρεθεί, ότι εκφράζεται µόνο η ισοµορφή HAS-3α, ενώ στις κυτταρικές σειρές του εµβρυικού καρκινώµατος και του τερατοκαρκινώµατος εµφανίζεται ισχυρή έκφραση της ισοµ ορφής HAS-3α και µικρή έκφραση της HAS-2. Μετά την υπερέκφραση της SG παρατηρείται αύξηση της HAS-3a στην κυτταρική σειρά του σεµινώµατος. Στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώµατος παρατηρείται αύξηση της HAS-2, ενώ στην κυτταρική σειρά του εµβρυϊκού καρκινώµατος παρατηρείται αύξηση και των δυο συνθασών που µελετήθηκαν. Μελετήθηκε, επιπλέον, η έκφραση των HYAL-1, -2,-3 και PH-20 στο σεµίνωµα και το τερατοκαρκίνωµα, µετά την υπερέκφραση της SG στις σειρές αυτές. Στην κυτταρική σειρά του σεµινώµατος παρατηρήθηκε αύξηση στις HYAL-2 και HYAL-3, µείωση της PH-20, ενώ δεν παρατηρήθηκε µεταβολή της HYAL-1. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώµατος παρατηρήθηκε αύξηση και στα τέσσερα µόρια των HYALs, µε τη µεγαλύτερη αύξηση να παρουσιάζεται στην HYAL-2. Οι syndecans έχoυν σηµαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων, την προσκόλληση, την µετανάστευση, την διαφοροποίηση και την αγγειογένεση. Η µελέτη στις κυτταρικές σειρές των όγκων των όρχεων έδειξε ότι οι syndecan-1 και 4 εκφράζονται στα κύτταρα του σεµινώµατος και παρουσιάζουν αύξηση έπειτα από την υπερέκφραση της σεργλυκίνης, ενώ η syndecan-2 δεν εκφράζεται. Στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώµατος έπειτα από διαµόλυνση µε το γονίδιο της σεργλυκίνης παρατηρήθηκε αύξηση της syndecan-2 και µείωση της syndecan-4, ενώ η syndecan-1 δεν εκφράζεται σε αυτή την κυτταρική σειρά. Οι µεταβολές αυτές µας οδηγούν στο συµπέρασµα ότι η SG, επηρεάζει τον φαινότυπο και την συµπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. Λέξεις Κλειδιά : CD44s, syndecans, εµβρυϊκό καρκίνωµα, όγκοι των όρχεων, πρωτεογλυκάνες, σεµίνωµα, σεργλυκίνη, συνθάσες του υαλουρονικού οξέος, τερατοκαρκίνωµα, υαλουρονιδάσες, υαλουρονικό οξύ, υποδοχέας του υαλουρονικού οξέος. 18

ABSTRACT 19

20

Testicular tumors are present in men between the age of 15-35 and while it is a rare type of tumor (it adds up to 1-2% of the tumors that affect men) it is the most frequent tumor at the aged between 20-40 and is the third leading cause of death in this age group range. Approximately 95% of testicular tumors originate from germ cells. The PGs are bioactive molecules and their expression is significantly modified at the microenvironment of the tumor. Our recent data showed that proteglycan serglysin (SG) is over expressed in many malignancies such as breast cancer, lung cancer and in gliomas, while in more aggressive forms of cancer cells SG is over expressed and secreted in the culture medium. In this thesis we studied the role of SG in testicular tumors. Patient samples were studied by immunoblotting and the results showed that SG is expressed both in normal testicular tissue and testicular tumor where there is greater expression. Ιmmunohistochemical study showed that SG is expressed by normal germ cells while its expression is increasing in testicular tumor. The expression of SG was studied in three cell lines of testicular cancer (JKT-1, seminoma; NT2/D1, embryonic carcinoma; NCCT, teratocarcinoma) and showed that it is expressed in all three cell lines, with higher expression in the most aggressive line, NT2/D1. Then, we achieved over expression of the testicular tumor cell lines with transfection of the cells with the plasmid which contains the gene of SG. Subsequently, we examine the role of SG in the expression of some biosynthetic and catabolic enzymes as well as HA receptor CD44 and the cell-surface PG, syndecans. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and exist in three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. Numerous studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger various cellular events in tumour cells, which leds to the disease progression. The major isoform of CD44 is the CD44s, which is expressed widely in tissues, and is over expressed in several types of tumors, coexisting with HA. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. It was shown that there is association between HYALs and the invasive and metastatic phenotype of tumors. High levels of HYALs were found at head and neck tumors, breast cancer and metastatic tumors. The isoform CD44s is expressed in all 3 cell lines, but the over expression of SG reduces the expression of CD44 in the teratocarcinoma cell line, while it does not affect to a large extent its expression in seminoma and embryonic carcinoma. In the seminoma cell line, it has been found that only HAS-3a isoform is expressed, while in the embryonic carcinoma and 21

teratocarcinoma cell lines showed high expression of isoform HAS-3a and low expression of HAS-2. After the overexpression of SG we detect increased levels of HAS-3a in seminoma and HAS-2 in teratocarcinoma, while at embryonic carcinoma both synthases were increased. SG over-expression in the teratocarcinoma cell line induced the expression of HAS-2 while in the embryonic carcinoma cell line triggered the expression of both synthases HAS-3a and HAS-2. The expression of HYAL-1, -2, -3 and PH-20 in the seminoma and the teratocarcinoma were also studied after the over-expression of SG in these lines. In the cell line of seminoma we noticed an increase of HYAL-2 and HYAL-3, a decrease of PH-20, while there was no variation in HYAL-1. Unlike this, in the teratocarcinoma cell line we noticed increase in all HYALs, with the greater increase shown in HYAL-2. Syndecans have an important role in the growth of tumor cells, the attachment, migration, differentiation and angiogenesis. The study of testicular tumor cell lines showed that syndecan-1 and syndecan-4 are expressed in the seminoma cells and showed to be increased after the overexpression of SG, while syndecan-2 is not expressed. In the teratocarcinoma cell line after transfection with the gene of SG we detected an increase of syndecan-2 and decrease of syndecan-4, while syndecan -1 is not expressed in this cell line. Those variations lead us to the conclusion that SG affects the phenotype and the biological behavior of testicular tumor cells. Key words: CD44s, embryonic carcinoma, hyaluronic acid, hyaluronidases, proteoglycans, receptor of hyaluronic acid, seminoma, serglycin, syndecans, synthases of hyaluronic acid, teratocarcinoma, testicular tumours 22

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ - ΕΠΕΞΗΓΗΣΕΙΣ 23

24

A Αδενίνη ABC Κασέττα δέσµευσης µε ATP AFP Άλφα εµβρυϊκή πρωτεΐνη Aggrecan Αγκρικάνη AT-III Αντιθροµβίνη ΙΙΙ Betaglycan Βηταγλυκάνη Biglycan Διγλυκάνη C Κυτοσίνη CD 44 Παράγοντας διαφοροποίησης 44 cdna Συµπληρωµατικό δεοξυριβονουκλεϊκό οξυ cdna Συµπληρωµατικό δεοξυ-ριβονουκλεϊνικό οξύ ClcA Γλυκουρονικό οξύ CS Θειϊκή χονδροϊτίνη CS/DSPGs Πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης / θειϊκής δερµατάνης D-GlcA D-Γλυκουρονικό οξυ Decorin Διακοσµητίνη DNA Δεοξυ-ριβονουκλεϊνικό οξύ dntps Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια DS Θειϊκή δερµατάνη EBP Δεσµευτική πρωτεΐνη της ελαστίνης ECM Εξωκυττάριος χώρος EDTA Αιθυλενο- διαμινο- τετραοξικό οξυ EGF Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας EGFR Υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα FGF Αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών Fibrillin Φιµπριλίνη Fibromodulin Ινοµοντουλίνη Fibronectin Ινοσυνδετίνη FSH Θυλακιότροπος ορμόνη G Γουανίνη GAG Γλυκοζαµινογλυκάνη Gal Γαλακτόζη GalAG Γαλακτοζαµινογλυκάνη GalNAc Ν-ακετυλο-γαλακτοζαµίνη GAPDH Αφυδρογονάση της 3 φωσφορικής γλυκεραλδεϋδης GdnHCl Υδροχλωρική γουανιδίνη GFP green fluorescent protein 25

GlcNAc Glypican HA HAS hgc HP HS HSPGs HYAL IdoA Ν-ακετυλο-γλυκοζαµίνη Γλυπικάνη Υαλουρονικό οξύ Συνθάσες του υαλουρονικού οξέος χοριακή γοναδοτροπίνη Ηπαρίνη Θειϊκή ηπαράνη Πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης Υαλουρονιδάση Ιδουρονικό οξύ IFN-γ Ιντερφερόνη -γ IGF IL-1β Αυξητικός παράγοντας ινσουλίνης Ιντερλευκίνη 1β IL-6 Ιντερλευκίνη 6 kda KS KSPGs L-IdoA Laminin LDH LH Lumican mrna Osteopondin 10 3 x 1/12 της µάζας του ατόµου του ισοτόπου 12 C Θειϊκή κερατάνη Πρωτεογλυκάνες θειϊκής κερατάνης L- Ιδουρονικό οξυ Λαµινίνη Γαλακτική αφυδρογονάση Ωχρινότροπος ορμόνη Λουµικάνη Αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊνικό οξύ Οστεοποντίνη PAPS 3 φωσφοαδενοσινο- 5 - φωσφοθειϊκο PBS 80 mm Na2HPO4-20 mm NaH2PO4-0.15 M NaCl, ph 7.4 PDGF Perlecan PG PLAP PVDF RHAMM RNA RT-PCR SDS SDS-PAGE SG Syndecan Αυξητικός παράγοντας αιµοπεταλίων Περλεκάνη Πρωτεογλυκάνη Πλακουντιακή αλκαλική φωσφατάση Φθοριούχο πολυβινυλιδένιο Υποδοχέας της κίνησης µέσω ΗΑ Ριβονουκλεϊνικό οξύ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης - αντίστροφης µεταγραφάσης Θειϊκό δωδεκυλίκο νάτριο Ηλεκτροφόρηση σε πηήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS Σεργλυκίνη Συνδεκάνη 26

T t-pa TBE TGF-β TNF-α Tris Tris-HCl Triton X-100 Tween-20 u-pa VEGF VEGFR- 2 Versican WHO β-hcg Θυµίνη Ενεργοποιητής πλασµινογόνου του ιστού Διάλυµα Tris-Βορικό-EDTA Αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού Παράγοντας νέκρωσης όγκου-α Τρις-υδοξυ-µεθυλο-αµινο-µεθάνιο Υδροχλωρικό τρις- υδροξυ- μεθυλο- αμινο- μεθάνιο Ισοοκτυλ-φαινοξυ-πολυαιθοξυ-αιθανόλη Πολυοξυαιθυλενο-σορβιταν-µονολεϊκό Ενεργοποιητής πλασµινογόνου της ουροκινάσης Αυξητικός παράγοντας αγγειακού ενδοθηλίου Υποδοχέας τύπου- 2 του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου Βερσικάνη Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας β-χοριακής γοναδοτροπίνης Τ1/2 Ημιπερίοδος ζωής PI3-K 3 φωσφατίδυλο-ινοσιτόλη 27

28

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 29

30

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Οι κακοήθεις νόσοι συµπεριλαµβάνονται στις κυριότερες αιτίες νοσηρότητας και θνητότητας στις ανεπτυγµένες χώρες και για το λόγο αυτό, η έρευνα για την παθογένεια και τη θεραπεία τους ελκύει παγκοσµίως το ενδιαφέρον των ερευνητών. Η κυτταρική διαίρεση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός είναι φυσιολογικές λειτουργίες που λαµβάνουν χώρα σε όλους σχεδόν τους ιστούς. Προκειµένου να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα των οργάνων και των ιστών απαιτείται αυστηρή ρύθµιση µεταξύ πολλαπλασιασµού και προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση). Ο όρος καρκίνος συµπεριλαµβάνει µεγάλη ποικιλία κακοηθών νόσων που προκύπτουν, εξαιτίας της απώλειας στην ικανότητα ρύθµισης της ανάπτυξης και διαίρεσης των κυττάρων ενός ιστού και έχουν ως αποτέλεσµα τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό αυτών των κυττάρων. Η παθογένεια του καρκίνου αποδίδεται σε γενετικές αλλαγές στο DNA των σωµατικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζωής του ατόµου που προκαλούνται, υπό την επίδραση ποικίλων παραγόντων (περιβαλλοντικών, διατροφικών, χηµικών, φαρµακευτικών). Στην περίπτωση που οι βλάβες αφορούν το γονδίωµα των γενετικών κυττάρων, το γενετικό σφάλµα µεταβιβάζεται στους απογόνους. Οι γενετικές αλλαγές θα προκαλέσουν ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων, µε αποτέλεσµα αρχικά τη δηµιουργία µορφώµατος και αργότερα ενός συµπαγούς όγκου ή νεοπλάσµατος. Η καρκινογένεση είναι µια διαδικασία κατά την οποία ο ρυθµός κυτταρικής διαίρεσης έχει διαταραχθεί λόγω βλάβης του DNA. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η ταχεία κυτταρική ανάπτυξη δεν είναι συνώνυµη της κακοήθειας και παρατηρείται σε φυσιολογικές καταστάσεις, όπως η επούλωση τραύµατος ή κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης. Όταν µια φυσιολογική ταχεία κυτταρική ανάπτυξη ολοκληρωθεί, µια οµάδα γονιδίων δίνει εντολή στο κύτταρο να σταµατήσει την διαδικασία πολλαπλασιασµού. Το καρκινικό κύτταρο όµως δεν υπακούει σε αυτή την εντολή εξαιτίας αλλαγών στο γενετικό του υλικό, µε αποτέλεσµα ο πολλαπλασιασµός να συνεχίζεται και τα καρκινικά κύτταρα να εξακολουθούν να διαιρούνται ανεξέλεγκτα. Τρεις κατηγορίες γονιδίων συµµετέχουν στην καρκινογένεση, σε περίπτωση που µεταλλαχθούν. Οι κατηγορίες αυτές είναι: τα ογκογονίδια ή πρωτο-ογκογονίδια, τα ογκοκατασταλτικά γονίδια και τα επιδιορθωτικά γονίδια. Τα πρωτο-ογκογονίδια είναι γονίδια που προάγουν την κυτταρική ανάπτυξη µε ποικίλους τρόπους. Ένας τρόπος είναι µέσω της παραγωγής ορµονών ή µιτογόνων µεταξύ των κυττάρων, οι οποίες επάγουν τη µίτωση. Ένας άλλος τρόπος είναι µέσω της εµπλοκής τους στην πρωτεϊνοσύνθεση και στη µεταγραφή του DNΑ ρυθµίζοντας µονοπάτια µεταγωγής σήµατος και 31

τους υποδοχείς τους στα κύτταρα. Σε περίπτωση µετάλλαξης σε κάποιο πρωτο-ογκογονίδιο, µπορεί να προκληθεί τροποποίηση στην έκφραση και στη λειτουργία αυτής της πρωτεΐνης, µε αποτέλεσµα την αύξηση της δραστικότητάς της ή του ποσού της. Τα ογκογονίδια συµµετέχουν στην ανεξέλεγκτη κυτταρική αύξηση και στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Σε περίπτωση που µεταλλαχθούν, ενισχυθούν ή υπερεκφραστούν είναι δυνατόν να δηµιουργηθεί νεόπλασµα. Τα ογκογονίδια ανάλογα µε τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης που κωδικοποιούν και τη θέση τους στο κύτταρο, χωρίζονται σε έξι κατηγορίες, οι οποίες είναι οι αυξητικοί παράγοντες (ογκογονίδιο sis), οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων (erbb, c-erbb2), οι υποδοχείς κινάσης τυροσίνης (abl, src), τα κυττα-ροπλασµατικά ογκογονίδια (raf), τα πυρηνικά ογκογονίδια (fos, jun, erba) και τα αποπτωτικά ογκογονίδια (bcl-2). Η µετατροπή των πρωτο-ογκογονιδίων σε ογκογονίδια µπορεί να γίνει είτε µέσω της παρουσία τους σε υψηλά µεταγραφικό περιβάλλον (µεταλλάξεις promoter), είτε εξαιτίας της απώλειας µέρους της αλληλουχίας τους, µε αποτέλεσµα την απορρύθµιση της λειτουργίας τους, είτε τέλος εξαιτίας µιας σηµειακής ή άλλης µετάλλαξης. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι γονίδια που αναστέλλουν προσωρινά την κυτταρική διαίρεση προκειµένου να επιτευχθεί η επιδιόρθωση του DNA. Συνήθως είναι µεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από το κυτταρικό στρες ή από βλάβες του DNA. Κωδικοποιούν αντι-πολλαπλασιαστικά σήµατα και πρωτεΐνες που καταστέλλουν τη µίτωση και την κυτταρική ανάπτυξη. Απενεργοποίηση των γονιδίων αυτών προκαλείται λόγω έλλειψης τµήµατος ή και ολόκληρου χρωµοσώµατος. Σε περίπτωση που τα χρωµοσώµατα που βρίσκονται τα συγκεκριµένα γονίδια παρουσιάζουν κάποιο έλλειµµα, µε αποτέλεσµα τη µη φυσιολογική έκφραση αυτών, µπορεί να πυροδοτηθεί ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασµός. Τέλος, τα επιδιορθωτικά γονίδια είναι γονίδια που κωδικοποιούν ένζυµα τα οποία ελέγχουν το DNA για τυχόν λάθη που έγιναν κατά τη διάρκεια της αντιγραφής ή για βλάβες από περιβαλλοντολογικούς παράγοντες. Η απενεργοποίηση τους οδηγεί σε συσσώρευση γενετικών βλαβών και αστάθεια του γονιδιώµατος µε αποτέλεσµα την αύξηση του κινδύνου κακοήθους εξαλλαγής του κυττάρου. Διαφαίνεται ότι η καρκινογένεση είναι συνήθως αθροιστικό αποτέλεσµα πολλαπλών παραγόντων που έχουν ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση ογκογονιδίων, την απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και την ελλειµµατική επιδιόρθωση του DNA. 32

ΔΙΉΘΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΆΣΤΑΣΗ Το καρκινικό κύτταρο έχει ιδιαίτερες βιολογικές ιδιότητες που του επιτρέπουν την τοπική διήθηση καθώς και την αποµακρυσµένη µετάσταση. Ως διήθηση ορίζεται η απευθείας διείσδυση των καρκινικών κυττάρων σε γειτονικούς ιστούς, ενώ ως µετάσταση η διαδικασία κατά την οποία κύτταρα αποσπώνται από τον όγκο και µεταφέρονται µέσω της κυκλοφορίας του αίµατος ή και της λέµφου, σε άλλους ιστούς και όργανα, όπου συνεχίζουν την ανεξέλεγκτη διαίρεσή τους, σχηµατίζοντας θυγατρικούς όγκους. Η µετάσταση χαρακτηρίζει αποκλειστικά τους κακοήθεις όγκους. Προκειµένου να µεταναστεύσουν τα νεοπλασµατικά κύτταρα πρέπει να είναι ικανά να επιτύχουν µια σειρά διαδικασιών που θα τους επιτρέψει να επιβιώσουν και να κυκλοφορήσουν µέσα στον ανθρώπινο οργανισµό, µε σκοπό να εγκατασταθούν και να πολλαπλασιαστούν σε άλλο σηµείο του σώµατος. Πρώτο βήµα είναι η αποκόλληση του καρκινικού κυττάρου από τον πρωτογενή όγκο και η διήθηση παρακείµενου ιστού. Ακολουθεί η εισχώρηση σε αγγεία ή λεµφαγγεία όπου το κύτταρο πρέπει να επιβιώσει, να προσκολληθεί σε νέα αποµακρυσµένη θέση και εν συνεχεία να εισχωρήσει από τα αγγεία ή τα λεµφαγγεία στον παρακείµενο ιστό και να γίνει η ανάπτυξη του σε νέα ιστική θέση. Όσα κύτταρα καταφέρουν να προσαρµοστούν στο νέο περιβάλλον και να ενεργοποιήσουν το στρώµα, θα ενεργοποιήσουν τη διαδικασία της µετάστασης (σχήµα 1). 33

Σχήµα 1. Σηµαντικά βήµατα κατά τη διαδικασία της µετάστασης. Τα κύτταρα αποκολλώνται από τον πρωτογενή όγκο και διηθούν παρακείµενους ιστούς ενώ µέσω της εισόδου τους στην κυκλοφορία δηµιουργούν µεταστάσεις σε άλλους ιστούς και όργανα. ΚΑΛΟΗΘΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΕΙΣ ΟΓΚΟΙ Οι όγκοι διακρίνονται ανάλογα µε την ικανότητα τους για διήθηση ή µετάσταση, σε καλοήθεις και κακοήθεις. Οι καλοήθεις όγκοι µπορούν να εµφανιστούν οπουδήποτε στο σώµα, παραµένουν εντοπισµένοι στην περιοχή από την οποία προέρχονται χωρίς να διαθέτουν την ικανότητα διήθησης ή να µεταναστεύουν σε άλλα όργανα. Ως κύρια χαρακτηριστικά έχουν την αργή ανάπτυξη, την σαφή οριοθέτηση και διαφοροποίηση από παρακείµενους ιστούς µέσω του ινώδους περιβλήµατος ενώ µπορούν να αφαιρεθούν µε χειρουργική επέµβαση. Οι κακοήθεις όγκοι χαρακτηρίζονται συνήθως από ραγδαία ανάπτυξη µε υψηλό ρυθµό κυτταρικής διαίρεσης και είναι συνήθως θανατηφόροι αν δε γίνει έγκαιρα η διάγνωση και η θεραπεία. Η ανάπτυξη των κακοηθών όγκων συνοδεύεται από προοδευτική διήθηση και αποδιοργάνωση του περιβάλλοντος ιστού. Κύρια χαρακτηριστικά τους είναι τα ατελώς καθορισµένα ανατοµικά όρια, η ταχεία ανάπτυξη και η ικανότητα εξάπλωσης µε διήθηση ή µετάσταση. Για τα περισσότερα είδη καρκίνων δεν υπάρχουν σαφώς καθορισµένα αίτια. Στους φυσιολογικούς ιστούς ο ρυθµός κυτταρικής ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου βρίσκονται σε ισορροπία, ενώ στον καρκίνο η ισορροπία αυτή έχει διαταραχθεί. Αιτία της διατάραξης αυτής µπορεί να είναι είτε η ανεξέλεγκτη κυτταρική αύξηση είτε η απώλεια ικανότητας του κυττάρου 34

για απόπτωση. Συνεπώς τα κύτταρα γίνονται µη φυσιολογικά, αρχίζουν να διαιρούνται χωρίς έλεγχο και χάνουν το διακριτό τους σχήµα. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΟΡΧΕΩΝ Οι όρχεις είναι δύο σύνθετοι σωληνοειδείς αδένες περιβαλλόµενοι από πτυχή του δέρµατος που ονοµάζεται όσχεον, όπου και διατηρούνται σε θερµοκρασία 1 έως 2 κάτω από την θερµοκρασία του εσωτερικού του σώµατος, γεγονός που διευκολύνει την παραγωγή σπερµατοζωαρίων. Ο κάθε όρχις του ενήλικου ατόµου έχει βάρος 40 gr, µήκος 4-5 cm, πάχος 2-3 cm και όγκο 15-25 ml. Αποτελούν µέρος του αναπαραγωγικού συστήµατος αφού παράγουν τα σπερµατοζωάρια καθώς και του ενδοκρινικού συστήµατος παράγοντας ανδρικές ορ µόνες, όπως η τεστοστερόνη. Και οι δύο λειτουργίες τους, βρίσκονται υπό τον έλεγχο των γοναδοτρόπων ορ µονών που εκκρίνονται από το πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Εξωτερικά περιβάλλονται από ινώδη χιτώνα, που αποτελείται από πυκνό συνδετικό ιστό ο οποίος συνήθως προς τα βαθύτερα στρώµατα, αντικαθίσταται από χαλαρό συνδετικό ιστό (σχήµα 2). Οι όρχεις αποτελούνται κατά 80% από τα σπερµατικά σωληνάρια και το υπόλοιπο 20% αποτελείται από συνδετικό ιστό που περιέχει κύτταρα Leydig. Από την εσωτερική επιφάνεια του ινώδους χιτώνα ξεκινούν λεπτά ορχικά διαφράγµατα που διαχωρίζουν τον όρχι σε 250-300 ορχικά λοβία. Σε κάθε ορχικό λόβιο υπάρχουν 3-4 σπερµατικά σωληνάρια τα οποία σχηµατίζουν µια εσπειραµένη µάζα από αγκύλες, µήκους 60-70 cm, που εκβάλουν σε ένα σύστηµα πόρων το οποίο τελικά αποχετεύει στην επιδιδυµίδα, όπου ωριµάζουν και αποθηκεύονται τα σπερµατοζωάρια. Από εκεί, τα σπερµατοζωάρια µεταφέρονται µέσω του σπερµατικού και του εκσπερµατικού πόρου στο πέος, προκειµένου να εκπεµφθούν (σχήµα 2). 35

Σχήµα 2. Ο όρχις εξωτερικά περιβάλλεται από τον ινώδη χιτώνα, ενώ εσωτερικά βρίσκονται τα σπερµατοφόρα σωληνάρια και η επιδιδυµίδα. Τα σπερµατικά σωληνάρια φαίνονται στο µικροσκόπιο ως κυκλικές ή ελλειψοειδείς τοµές Κάθε σωληνάριο αφορίζεται από ένα βασικό υµένα που το διαχωρίζει από τα παρακείµενα τριχοειδή αγγεία, από τα περισωληναριακά (µυοειδή) κύτταρα και από τα κύτταρα Leydig. Τα κύτταρα Leydig είναι σωµατικά κύτταρα που βρίσκονται µεταξύ των σπερµατοφόρων σωληνίσκων, παράγουν τη βασική ανδρογόνο ορµόνη, την τεστοστερόνη, η οποία διοχετεύεται µέσα στους σπερµατοφόρους σωληνίσκους και προάγει την σπερµατογένεση. Η παραγωγή της τεστοστερόνης ρυθµίζεται από την ωχρινοτρόπο ορµόνη (LH) που εκκρίνεται από την υπόφυση και δρα στα κύτταρα Leydig. Στο εσωτερικό του υµένα βρίσκονται τα κύτταρα Sertoli και τα άωρα γεννητικά κύτταρα, τα σπερµατογόνια. Καθώς τα σπερµατογόνια διαιρούνται και αναπτύσσονται γύρω από την περιφέρεια των σωληναρίων, σχηµατίζουν κάτω από αυτά στήλες από ωριµάζοντα σπερµατικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της σπερµατογένεσης τα σπερµατικά κύτταρα διέρχονται από 4 διαφορετικά στάδια ωρίµανσης. Αρχικά αναγνωρίζονται τα σπερµατογόνια, µε υποστρόγγυλο σχήµα και σφαιρικό πυρήνα, που βρίσκονται πολύ κοντά ή σχεδόν σε επαφή µε το βασικό υµένα, που εντοπίζεται ακριβώς µέσα από τον ινώδη χιτώνα. Ενώ µερικά σπερµατογόνια παραµένουν προγονικά, άλλα µετά από µιτωτικές διαιρέσεις γίνονται πρωτογενή σπερµατοκύτταρα ή σπερµατοκύτταρα α τάξης, τα οποία είναι ογκωδέστερα των σπερµατογονίων και βρίσκονται σε µεγαλύτερο βάθος στο σπερµατικό τοίχωµα. Με την πρώτη διαίρεση της µείωσης, τα σπερµατοκύτταρα α τάξης παράγουν δευτερογενή σπερµατοκύτταρα ή σπερµατοκύτταρα β τάξης που είναι πολύ µικρότερα των πρωτογενών, η χρονική διάρκεια της 36

ζωής τους είναι πολύ περιορισµένη και τα οποία µε τη δεύτερη διαίρεση της µείωσης παράγουν τις σπερµατίδες. Οι σπερµατίδες είναι µικρά στρογγυλά κύτταρα µε στρογγυλό πυρήνα, που διατάσσονται σε 3-4 σειρές κοντά στον αυλό του σωληναρίου και µέσω δεσµοσωµάτων βρίσκονται σε επαφή µε τα κύτταρα Sertoli. Τέλος, µε µια διεργασία µεταµόρφωσης των απλοειδών σπερµατίδων που ονοµάζεται σπερµιογένεση ή σπερµιοτελείωση παράγονται τα σπερµατοζωάρια. Τα σπερµατοζωάρια εντοπίζονται πολύ κοντά στον αυλό ή µέσα σε αυτόν ως πολύ επιµηκυµένα κύτταρα στα οποία αρχίζει να διακρίνεται η ουρά. Οι στήλες αυτές µε τα ωριµάζοντα σπερµατικά κύτταρα βρίσκονται µεταξύ δύο παρακείµενων κυττάρων Sertoli, καθένα από τα οποία εκτείνεται από τον βασικό υµένα µέχρι τον αυλό. Τα κύτταρα Sertoli είναι σωµατικά κύτταρα που εκτείνονται από τα τοιχώµατα προς το κέντρο των σπερµατοφόρων σωληνίσκων (σχήµα 3). Προσδιορίζουν το ρυθµό της σπερµατογένεσης ελέγχοντας το ρυθµό µετατόπισης των σπερµατοκυττάρων από τη βασική µεµβράνη προς το κέντρο του σπερµατοφόρου σωληνίσκου. Τα σπερµατοκύτταρα είναι βυθισµένα µέσα στις κοιλότητες που σχηµατίζονται από τις αναδιπλώσεις της κυτταρικής µεµβράνης των κυττάρων Sertoli σε καθορισµένη αλληλουχία και µετατοπίζονται κατά µήκος των κυττάρων Sertoli µε αποικοδόµηση και ανοικοδόµηση των συνδέσεών τους µε αυτά τα κύτταρα και µε αλλαγή της µορφολογίας των κυττάρων Sertoli. Τα κύτταρα Sertoli παράγουν την ορµόνη κατά των πόρων του Muller (AMH) έχοντας έτσι σηµαντικό ρόλο στο σχηµατισµό του αναπαραγωγικού συστήµατος του άρρενος. Επίσης, τα κύτταρα Sertoli απελευθερώνουν την πρωτεΐνη ενωµένη µε ανδρογόνα (ABP) υπό την επίδραση της θυλακιοτρόπου ορµόνης (FSH). Λόγω της ΑΒP τα κύτταρα Sertoli δεσµεύουν την τεστοστερόνη και εν συνεχεία η δεσµευµένη τεστοστερόνη συντηρεί την σπερµατογένεση (Ζάγκρης, 2005). 37

!!!!!!!!! Σχήµα!"#! 3. Α. Κάθετη τοµή του όρχεος, όπου διακρίνονται τα σπερµατικά σωληνάρια, κύτταρα Sertoli και τα $%&'()*! +%,-*./!! κύτταρα Leydig. Β. Πορεία ωρίµανσης των σπερµατικών κυττάρων.!! ΝΕΟΠΛΑΣΙΑ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ!! Η νεοπλασία των όρχεων, αν και σχετικά αποτελεί µια σπάνια µορφή νεοπλασίας (1-2% όλων! των νεοπλασµάτων του άνδρα), είναι ο πιο συχνός όγκος στις ηλικίες 20-40 ετών, αποτελώντας! την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Τα τελευταία 30 χρόνια, η αντιµετώπιση 0! του καρκίνου των όρχεων έχει σηµειώσει θεαµατική πρόοδο λόγω της εισαγωγής αποτελεσµατικών χηµειοθεραπευτικών σχηµάτων µε βάση τον λευκόχρυσο, της βελτίωσης των µεθόδων σταδιοποίησης και των χειρουργικών τεχνικών, καθώς επίσης και της καλύτερης! κατανόησης της φυσικής ιστορίας της νόσου. Σήµερα θεωρείται η πλέον θεραπεύσιµη µορφή!! ουρολογικού καρκίνου και η συνολική επιβίωση στα πρώιµα στάδια πλησιάζει το 100%, ενώ σε προχωρηµένη νόσο ξεπερνά το 80%. /!! Επιδηµιολογία: Στις Η.Π.Α και το Ηνωµένο Βασίλειο υπολογίζονται 7.000 και 1.600 νέα!! περιστατικά κάθε! χρόνο, 1#2! αντίστοιχα. Η πιθανότητα νόσησης είναι 1:500 άνδρες (0,2%) µε αυξανόµενη! τάση. Τα τελευταία 100 χρόνια, για άγνωστους λόγους, η επίπτωση της νόσου αυξάνεται!34(5'(6*! κατά 15-20%, ανά 5ετία ή κατά 2% ανά έτος. 78!9!$%5'%&:%;;!<=!>##?@/!! Ηλικία: Στο 78% των περιπτώσεων ο καρκίνος εµφανίζεται σε άνδρες 20-40 ετών, στο 20% σε! άνδρες > 40 ετών, ενώ στο 2% των περιπτώσεων εµφανίζεται σε αγόρια < 15 ετών.! Φυλή: Οι λευκοί νέοι άνδρες προσβάλλονται σε τετραπλάσια συχνότητα σε σύγκριση µε! τους έγχρωµους. "#! 38

Γεωγραφική κατανοµή: Υπάρχει σηµαντική διακύµανση στη συχνότητα εµφάνισης στις διάφορες χώρες µε υψηλότερη εκείνη των Σκανδιναβικών χωρών και χαµηλότερη στις χώρες της Αφρικής και της Ασίας. Εντόπιση: Ο καρκίνος εντοπίζεται, για άγνωστους λόγους, συχνότερα στο δεξιό όρχι (όπως και η κρυψορχία ) ενώ αµ φοτερόπλευρη εντόπιση παρατηρείται στο 1-2% των περιπτώσεων. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Οι περισσότεροι από αυτούς του όγκους είναι αρκετά επιθετικοί και ικανοί για γρήγορη και ευρεία διασπορά. Παρόλα αυτά, η θνησιµότητα των ασθενών µε κακοήθεις όγκους όρχεων έχει µειωθεί εντυπωσιακά λόγω της αποτελεσµατικότητας της χηµειοθεραπείας που περιλαµβάνει cisplatin. Αντίθετα, οι όγκοι που δεν προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα είναι σε γενικές γραµµές καλοήθεις. Η ταξινόµηση των όγκων των όρχεων δυστυχώς ποικίλει σε µεγάλο βαθµό λόγω της διαφορετικής αντίληψης σχετικά µε την ιστογένεση των όγκων, της ποικιλίας στη µορφολογία ενός ιστολογικού τύπου καθώς και της παρουσίας περισσοτέρων του ενός ιστολογικών τύπων εντός ενός όγκου. Η ταξινόµηση των όγκων όρχεων µε βάση τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας (WHO) αναγράφεται παρακάτω: Ταξινόµηση των όγκων των όρχεων κατά WHO Όγκοι προερχόµενοι από βλαστικά κύτταρα Όγκοι αποτελούµενοι από ένα ιστολογικό τύπο (αµιγείς µορφές) Σεµίνωµα Σεµίνωµα µε συγκυτιοτροφοβλαστικά κύτταρα Σπερµατοκυτταρικό σεµίνωµα Σπερµατοκυτταρικό σεµίνωµα µε σάρκωµα Εµβρυϊκό Καρκίνωµα Όγκος του λεκιθικού ασκού Τροφοβλαστικοί όγκοι Χοριοκαρκίνωµα Τροφοβλαστικά νεοπλάσµατα εκτός χοριοκαρκινώµατος Μονοφασικό χοριοκαρκίνωµα 39

Πλακουντιακός τύπος τροφοβλαστικού όγκου Τεράτωµα Δερµοειδής κύστη Μονοδερµικό τεράτωµα Τεράτωµα µε σωµατικού τύπου κακοήθειες Όγκοι αποτελούµενοι από πολλούς ιστολογικούς τύπους (µικτοί όγκοι) Μικτό εµβρυϊκό καρκίνωµα µε τεράτωµα (τερατοκαρκίνωµα) Μικτό τεράτωµα µε σεµίνωµα Χοριοκαρκίνωµα µε τεράτωµα / εµβρυϊκό καρκίνωµα Άλλοι συνδυασµοί Όγκοι του στρώµατος των γονάδων/ Σπερµατικού τόνου Αµιγείς µορφές Όγκος των κυττάρων Leydig Κακοήθης όγκος των κυττάρων Leydig Όγκος των κυττάρων Sertoli Όγκος των κυττάρων Sertoli πλούσιος σε λιπίδια Σκληρυντικός όγκος των κυττάρων Sertoli Αποτιτανωµένος όγκος από µεγάλα κύτταρα Sertoli Κακοήθης όγκος των κυττάρων Sertoli Κοκκιωµατώδης όγκος Κοκκιωµατώδης όγκος ενηλίκων Νεανικός κοκκιωµατώδης όγκος Όγκοι που κατατάσσονται στην κατηγορία θήκωµα / ίνωµα Θήκωµα Ίνωµα Ατελώς διαφοροποιηµένοι όγκοι Μικτοί όγκοι του στρώµατος των γονάδων / σπερµατικού τόνου Κακοήθεις όγκοι του στρώµατος των γονάδων / σπερµατικού τόνου Μικτοί όγκοι που περιλαµβάνουν στοιχεία εκ βλαστικών κυττάρων, του στρώµατος των γονάδων και του σπερµατικού τόνου 40

Γοναδοβλάστωµα Αταξινόµητος όγκος εκ βλαστικών κυττάρων-σπερµατικού τόνου / στρώµατος των γονάδων Αιµοποιητικοί Όγκοι Όγκοι των εκφορητικών πόρων και ορχικού δικτύου Αδένωµα Καρκίνωµα Όγκοι παραορχικών δοµών Αδενωµατώδης όγκος Κακόηθες µεσοθηλίωµα Καλόηθες µεσοθηλίωµα Θηλώδες µεσοθηλίωµα καλά διαφοροποιηµένο Κυστικό µεσοθηλίωµα Αδενοκαρκίνωµα της επιδιδυµίδος Θηλώδες κυσταδένωµα της επιδιδυµίδος Μελανωµατώδης νευρο-εξωδερµατικός όγκος Δεσµοπλαστικός όγκος από µικρά στρογγυλά κύτταρα Μεσεγχυµατικοί όγκοι του σπερµατικού τόνου και των εξαρτηµάτων των όρχεων Δευτεροπαθείς όγκοι των όρχεων ΑΙΤΙΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ -ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Μολονότι για την αιτιοπαθογένεια της νόσου έχουν εκφραστεί πολλές απόψεις αυτή ουσιαστικά παραµ ένει άγνωστη. Ωστόσο κατά καιρούς έχουν ενοχοποιηθεί διάφοροι παράγοντες, συγγενείς και επίκτητοι όπως: Κρυψορχία: Αποτελεί τον µοναδικό ίσως παράγοντα για τον οποίο έχει αποδειχθεί σαφής συσχέτιση µε όγκους των όρχεων και ο σχετικός κίνδυνος είναι 3-14 φορές µεγαλύτερος από την 41

φυσιολογική συχνότητα. Περίπου το 10% των ασθενών µε νεοπλασίες των όρχεων έχουν ιστορικό κρυψορχίας. Αν και δεν υπάρχει απόδειξη ότι η ορχεοπηξία µειώνει τον κίνδυνο, η εκτέλεση της διευκολύνει την πρωιµότερη ανακάλυψη του όγκου µέσω της αυτοεξέτασης των όρχεων. Οι πιθανοί παράγοντες που έχουν αναφερθεί ότι οδηγούν στην ανάπτυξη του όγκου στον κρυψοόρχι είναι: α) Aνωµαλία στη µορφολογία των κυττάρων της γεννητικής σειράς, β) Αυξηµένη θερµοκρασία, γ) Οι ενδοκρινείς διαταραχές και δ) Δυσγενεσία των γονάδων. Τέλος η πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου στην κοιλιακή κρυψορχία είναι µεγαλύτερη από ότι στη βουβωνική. Επίδραση ουσιών µε οιστρογονική ή αντιανδρογονική δράση: Η χορήγηση συνθετικών οιστρογόνων στο πρώτο τρίµηνο της κύησης έχει ενοχοποιηθεί στο παρελθόν για την ανάπτυξη όγκου των όρχεων. Η σχέση µεταξύ οιστρογονικής έκθεσης στη ενδοµήτρια ζωή και ανάπτυξης όγκου υποστηρίζεται από πρόσφατα δεδοµένα που δείχνουν ότι η επίπτωση του όγκου των όρχεων είναι υψηλότερη σε διωογενείς δίδυµους (υψηλότερα επίπεδα οιστρογόνων στη µητέρα) σε σύγκριση µε τους µονοωογενείς. Επιπλέον έχει παρατηρηθεί ότι πολλές βιοµηχανικές τοξίνες έχουν παρόµοια χηµική δοµή και κατά συνέπεια δράση και επίδραση µε τα οιστρογόνα, γεγονός που σηµαίνει πως όταν οι γυναίκες εκτίθενται σε αυτές κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, υπάρχει δυνητικός κίνδυνος για τα έµβρυα. Τα τελευταία χρόνια, σύµφωνα µε επιδηµιολογικές µελέτες, υπάρχει µείωση της ποιότητας του σπέρµατος σε συνδυασµό µε συνυπάρχουσα αύξηση της επίπτωσης ουροποιογεννητικών ανωµαλιών, όπως η κρυψορχία, ο υποσπαδίας και οι διαταραχές διαφοροποίησης του φύλου. Η αύξηση της συχνότητας εµφάνισης όγκου των όρχεων σε ασθενείς µε υπογονιµότητα, κρυψορχία και γοναδική δυσγενεσία υποδηλώνει κοινή αιτιολογική συσχέτιση µεταξύ των γεννητικών αυτών διαταραχών και των ορχικών νεοπλασιών. Θεωρείται ότι η επίδραση παραγόντων µε οιστρογονική δράση στην ενδοµήτρια ζωή, ιδιαίτερα σε άτοµα µε γενετική προδιάθεση, προκαλεί ενδοκρινική δυσλειτουργία των όρχεων και προαγωγή της καρκινογένεσης. Ενδοσωληναριακή νεοπλασία από βλαστικά κύτταρα (νεοπλασία in situ): H παρουσία της πρόδροµης αυτής αλλοίωσης στα βλαστικά κύτταρα ανευρίσκεται στο 5% των ασθενών µε όγκο στον αντίπλευρο όρχι. Η συχνότητα του καρκινώµατος in situ είναι υψηλότερη σε άτοµα µε υπογονιµότητα, κρυψορχία, διαταραχές της διαφοροποίησης του φύλου και εξωγοναδικούς όγκους από βλαστικά κύτταρα. Περίπου το 50% των ασθενών µε νεοπλασία in situ θα εµφανίσουν όγκο µέσα σε 5 χρόνια από την διάγνωση. 42

Οικογενειακό ιστορικό όγκου των όρχεων: Η γενετική βάση της παθογένεσης των νεοπλασιών του όρχεος παραµένει άγνωστη. Κληρονοµική προδιάθεση ανευρίσκεται µόνο στο 2% των ασθενών και σχετίζεται µε µια µετάλλαξη στο χρωµόσωµα Χq27. Ιστορικό νεοπλασιών του όρχεως: Ασθενείς µε ιστορικό νεοπλασίας του όρχι έχουν πιθανότητα 1-2% να εµφανίσουν ένα δεύτερο πρωτοπαθή όγκο στον αντίπλευρο όρχι. Μικρολιθίαση του όρχεος: Η συσχέτιση της νεοπλασίας του όρχεως µε την µικρολιθίαση του αδένα παρουσιάζει σηµ αντική διακύµ ανση (συχνότητα συνύπαρξης : 0.05%-9%). Οι περισσότεροι ερευνητές συστήνουν παρακολούθηση µε υπερηχογράφηµα οσχέου, ενώ µερικοί συστήνουν βιοψία του όρχεως, θεωρώντας τη µικρολιθίαση ως προκαρκινωµατώδη κατάσταση. Άλλοι παράγοντες κινδύνου: Μεταξύ άλλων πιθανών παραγόντων κινδύνου έχουν µελετηθεί η βουβωνοκήλη, η ναυτία κατά τη διάρκεια της κύησης (από την εξωγενή χορήγηση οιστρογόνων), τα τραύµατα, οι επανειληµµένες φλεγµονές και η συνεχής έκθεση σε διάφορες ουσίες (όπως οι φαινόλες, τα λιπάσµατα, την άσβεστοκαι τον καπνό). ΙΣΤΟΓΕΝΕΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Η ενδοσωληναριακή νεοπλασία θεωρείται η πρόδροµος αλλοίωση όλων των όγκων του σπερµατοκυτταρικού σεµινώµατος. Η αλλοίωση αυτή στα πρώιµα στάδια συνίσταται στην εµφάνιση άτυπων κυττάρων που µoιάζουν µε τα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα και τα κύτταρα του σεµινώµατος. Τα κύτταρα αυτά βρίσκονται µέσα στα σπερµατικά σωληνάρια, συνήθως σε µια σειρά κατά µήκος της βασικής µεµβράνης. Αργότερα τα άτυπα αυτά κύτταρα αντικαθιστούν τα φυσιολογικά κύτταρα των σωληναρίων, ενώ στα προχωρηµένα στάδια (διηθητικός όγκος) παρατηρείται διήθηση της βασικής µεµβράνης και επέκταση στον ενδιάµεσο ιστό. Πρέπει να σηµειωθεί, ότι οι γενετικές τροποποιήσεις των κυττάρων της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας είναι όµοιες µε αυτές των διηθητικών όγκων και αφορούν κυρίως τον διπλασιασµό του µικρού βραχίονα του χρωµοσώµατος 12 υπό τη µορφή ισοχρωµόσωµατος των µικρών βραχιόνων i (12p). Η γενετική αυτή τροποποίηση ανευρίσκεται στο 89% και 81% των σεµινωµάτων και µη σεµινωµατωδών όγκων, αντίστοιχα. Ο δείκτης i(12p) παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα σε όγκους από βλαστικά κύτταρα και αποτελεί χρήσιµη διαγνωστική µέθοδο σε όγκους άγνωστης προέλευσης. Πρόσφατες µελέτες του γενετικού υλικού των νεοπλασµατικών κυττάρων οδήγησαν στην κατάργηση της κλασικής θεωρίας ότι οι όγκοι των όρχεων προέρχονται από ένα πολυδύναµο κύτταρο, το οποίο υφίσταται νεοπλασµατική εξαλλαγή προς σεµίνωµα ή εµβρυϊκό καρκίνωµα. Τα κύτταρα του σεµινώµατος ο µοιάζουν µε αυτά της ενδο- σωληναριακής νεοπλασίας και 43

πολλαπλασιάζονται ως ο µοιογενής όγκος που διατηρεί τα χαρακτηριστικά του βλαστικού επιθηλίου. Έτσι προτάθηκε η άποψη ότι το σεµίνωµα αποτελεί τη διηθητική µορφή της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας, το οποίο στη συνέχεια υφίσταται εξαλλαγή προς εµβρυϊκό καρκίνωµα ή σπανιότερα προς άλλους τύπους όπως το χοριοκαρκίνωµα και τον όγκο του λεκιθικού ασκού. Το εµβρυϊκό καρκίνωµα µπορεί επίσης να υποστεί εξαλλαγή σε χοριοκαρκίνωµα ή σε όγκο του λεκιθικού ασκού. Σύµφωνα µε τις παραπάνω παρατηρήσεις ιστογένεση των όγκων από βλαστικά κύτταρα αρχίζει ως ενδοσωληναριακή νεοπλασία, η οποία µπορεί να ακολουθήσει την παρακάτω εξέλιξη: Έξωσωληναριακή διήθηση (αναγνωρίζεται ως σεµίνωµα, η οποία παραµένει σταθερή ή εξαλλάσσεται σε µη σεµινωµατώδεις όγκους και Ενδοσωληναριακή εξαλλαγή σε µη σεµινωµατώδεις όγκους, οι οποίοι στη συνέχεια διηθούν το διάµεσο ιστό. Έχουν προταθεί δύο θεωρίες για την προέλευση των κυττάρων της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας. Τα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα, τα οποία δεν ακολουθούν την φυσιολογική ανάπτυξη, υφίστανται ανώµαλη κυτταρική διαίρεση και πολλαπλασιασµό. Τα κύτταρα αυτά µπορεί να έχουν την ικανότατα διηθητικής ανάπτυξης, η οποία επάγεται από τις γοναδοτροπίνες (LH, FSH) στη νεογνική περίοδο και στην ήβη σε άτοµα µε γενετική προδιάθεση. Προαγωγή της καρκινογένεσης µέσω της αυξηµένης έκφρασης του ισοχρωµόσωµατος 12p, της κυκλίνης D2 και της φυσικής µορφής του ογκογονιδίου p53. Όταν τα κύτταρα έχουν υποστεί βλάβη στους µηχανισµούς επιδιόρθωσης του DNA, η υπερέκφραση της κυκλίνης (ρυθµιστική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου) µπορεί να αναστείλει την εξαρτώµενη από το p53 απόπτωση και να οδηγήσει σε επανέναρξη του κυτταρικού κύκλου και γενετική αστάθεια. Το p53 ογκογονίδιο υπάρχει στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος 17 και ρυθµίζει τη µεταγραφή του DNA, τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και την απόπτωση. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ Η επιδηµιολογία, η κλινική συµπεριφορά, η ιστολογία και οι χρωµοσωµικές ανωµαλίες οδηγούν στη διάκριση τριών οµάδων όγκων των όρχεων από βλαστικά κύτταρα (Looijenga LH and Oosterhuis JW 1999; Looijenga LH and Oosterhuis JW 2002; Oosterhuis JW et al. 1997). Στην πρώτη κατηγορία περιλαµβάνονται τα τερατώµατα και οι όγκοι του λεκιθικού ασκού των νεογέννητων και των παιδιών, στη δεύτερη τα σεµινώµατα και οι µη σεµινωµατώδεις όγκοι 44

στους έφηβους και τους ενήλικες (TGCTs) και στην τρίτη το σπερµατοκυτταρικό σεµίνωµα των ηλικιωµένων. Γενετική προδιάθεση (οικογενείς όγκοι): Οι οικογενείς όγκοι των όρχεων από βλαστικά κύτταρα στους ενήλικες αποτελούν το 1.5-2% του συνόλου των όγκων αυτής της κατηγορίας. Η συνήθως πρώιµη εµφάνιση της νόσου, η αυξηµένη συχνότητα εµφάνισης της νόσου και στους δύο όρχεις και η αυξηµένη βαρύτητά της αποδίδεται σε γενετικούς λόγους που είναι υπεύθυνοι για την εµφάνιση της νόσου σε ζευγάρια πατέρων- υιών (Han S and Peschel RE 2000). Περιβαλλοντικοί και κληρονοµικοί παράγοντες έχουν αναλυθεί και το εκτιµούµενο ποσοστό εµφάνισης κακοήθειας λόγω γενετικών βλαβών ανέρχεται στο 25% των TGCTs στους ενήλικες ενώ εξίσου σηµαντική κρίνεται η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων κατά τη παιδική ηλικία στην εµφάνιση όγκου στους όρχεις (17%). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στις χρωµοσωµικές ανωµαλίες µεταξύ των σποραδικών όγκων και των οικογενών όγκων που εµφανίζονται και στους δύο όρχεις (Skotheim RI et al. 2001). Ωστόσο, βρέθηκε ένα γονίδιο στο χρωµόσωµα Χq27 το οποίο εµπλέκεται στην ανάπτυξη όγκων των όρχεων από βλαστικά κύτταρα και το οποίο εµπλέκεται επίσης και στη µη φυσιολογική κάθοδο του όρχι στο όσχεο (Rapley EA et al. 2000). Αν και ο ρόλος των γενετικών παραγόντων στην αιτιολογία των όγκων των όρχεων φαίνεται ότι είναι σηµαντικός, η παρουσία ενός µόνο γονιδίου που εµπλέκεται στην εµφάνιση της νόσου είναι αµφισβητήσιµη θεωρία. Είναι πιο πιθανό ότι η γενετική προδιάθεση σε συνδυασµό µε την ενδοµήτρια έκθεση και την επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων κατά την παιδική ηλικία συνεισφέρουν στον µηχανισµό µοριακής παθογένεσης των όγκων. Ανωµαλίες γονάδων: Άτοµα µε 46,ΧΥ ή 45,Χ/46,ΧΥ δυσγενεσίες γονάδων εµφανίζουν ιδιαίτερα αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης όγκων των βλαστικών κυττάρων. Ο απόλυτος κίνδυνος κυµαίνεται µεταξύ 10-50% (Rutgers JL and Scully RE 1987; Mostofi FK and Sesterhenn IA 2004). Γενωµική αποτύπωση: Η γενωµική αποτύπωση αναφέρεται σε ένα µοναδικό φαινόµενο στα θηλαστικά που σχετίζεται µε διαφορετική λειτουργία ενός αριθµού γονιδίων αναλόγως από ποιο γονέα προέρχεται. Αυτή η διαφορά γεννάται και διεισδύει στους απογόνους µέσω των βλαστικών κυττάρων. Ο τύπος της γενωµικής αποτύπωσης έχει σηµαντική επίδραση στο δυναµικό ανάπτυξης των κυττάρων (Solter D 1988). Οι όγκοι των όρχεων εµφανίζουν σταθερή έκφραση αποτυπωµένων γονιδίων και στα δύο αλληλόµορφα (Gillis AJ et al. 1997; Looijenga LH et al. 1999; Looijenga LH et al. 1997; Mishina M et al. 1996; Nonomura N et al. 1997; Rachmilewitz J et al. 1996; van Gurp RJ et al. 1994). Υποστηρίζεται ότι στους TGCTs η 45

έκφραση των αποτυπωµένων γονιδίων και στα δύο αλληλόµορφα δεν είναι αποτέλεσµα της απώλειας της αποτύπωσης αλλά είναι χαρακτηριστικό των κυττάρων από όπου προέρχονται οι όγκοι. Αυτό µπορεί επίσης να εξηγεί την παρουσία δραστικότητας τελοµεράσης στους όγκους των όρχεων εκτός των ωρίµων τερατωµάτων (Albanell J et al. 1999). Τα τερατώµατα και οι όγκοι του λεκιθικού ασκού των ανηλίκων εµφανίζουν µια ελαφρώς διαφορετική εικόνα γενωµικής αποτύπωσης που υποστηρίζει την άποψη της διαφορετικής προέλευσης αυτών των νεοπλασµάτων από ένα πιο πρώιµο στάδιο ανάπτυξης των βλαστικών κυττάρων (Ross JA et al. 1999; Schneider DT et al. 2001). Αν και λίγα είναι γνωστά για την γενωµική αποτύπωση στο σπερµατοκυτταρικό σεµίνωµα, τα δεδοµένα δείχνουν ότι αυτοί οι όγκοι έχουν ήδη υποστεί πατρική αποτύπωση (Verkerk AJ et al. 1997). Χρωµοσωµικές ανωµαλίες: Όλοι οι όγκοι των όρχεων από βλαστικά κύτταρα συµπεριλαµβανοµένων και των προδρόµων µορφών (αταξινόµητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία) είναι ανευπλοειδείς (Oosterhuis JW et al. 1989). Τα σεµινώµατα και η αταξινόµητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία είναι υπερτριπλοειδείς, ενώ τα κύτταρα των µη σεµινωµατωδών όγκων ανεξάρτητα του ιστολογικού τύπου είναι υποτριπλοειδή. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι ο πολυπλοειδισµός είναι το αρχικό γεγονός που οδηγεί στην τετραπλοειδή αταξινόµητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία, η οποία στη συνέχεια ακολουθείται από χρωµοσωµική ελάττωση (Oosterhuis JW et al. 1989). Η ανευπλοειδία στους όγκους των όρχεων έχει σχετιστεί µε την ενίσχυση των κεντροσωµάτων (Mayer F et al. 2003). Με διάφορες τεχνικές έχει δειχθεί ένα σύνθετο αλλά παρόµοιο πρότυπο υπερέκφρασης ή µείωσης της έκφρασης µέρους διαφόρων χρωµοσωµάτων στους σεµινωµ ατώδεις και µη-σεµινωµατώδεις όγκους. Μέρος των χρωµοσωµάτων 4, 5, 11, 13, 18 και Υ εµφανίζουν ελάττωση, ενώ µέρη των χρωµοσωµάτων 7, 8, 12, και Χ εµφανίζουν αύξηση της έκφρασής τους. Τα σεµινώµατα εµφανίζουν αύξηση του αριθµού των χρωµοσωµάτων 7, 15, 17, 19, και 22 αιτιολογώντας την πολυπλοειδική δοµή τους (Rosenberg C et al. 1999; van Echten J et al. 1995). Αυτό υποστηρίζει µια κοινή αρχή όλων των ιστολογικών µορφών αυτών των TGCTs γεγονός που υποστηρίζεται από την συνύπαρξη τόσο σεµινωµατωδών όσο και µη-σεµινωµατωδών όγκων σε κάποιες περιπτώσεις (Castedo SM et al. 1988; Gillis AJ et al. 1994; Rothe M et al. 1999). Αύξηση του χρωµοσώµατος 12p: Η µόνη σταθερή χρωµοσωµική ενίσχυση που παρατηρείται στους διηθητικούς όγκους των όρχεων είναι η ενίσχυση µέρους του χρωµοσώµατος 12p το οποίο αναφέρεται συχνά ως ισοχρωµόσωµα 12p [i(12p)] (Sandberg AA et al. 1996). Η µοριακή ανάλυση έχει δείξει ότι αυτό το ισοχρωµόσωµα προέρχεται από ένα 46

πατρικό χρωµόσωµα και δηµιουργείται από τον διπλασιασµό του p- µέρους ενός χρωµοσώµατος και την απώλεια του q-µέρους. Η πλειονότητα των TGCTs (περίπου το 80%) εµφανίζουν το i (12p) (van Echten J et al. 1995), ενώ στις υπόλοιπες περιπτώσεις εµφανίζονται επιπλέον αντίγραφα µέρους ή ολόκληρου του χρωµοσώµατος 12p (Rodriguez E et al. 1993; Suijkerbuijk RF et al. 1993). Αυτό οδηγεί στο συµπέρασµα ότι η ενίσχυση µέρους του χρωµοσώµατος 12p είναι κρίσιµη για την ανάπτυξη αυτής της κακοήθειας και σχετίζεται ιδιαίτερα µε την ικανότητα πολλαπλασιασµού και διήθησης (Rosenberg C et al. 2000). Διάφορα γονίδια του χρωµοσώµατος 12p έχει προταθεί ότι εµπλέκονται στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων. Μεταξύ αυτών είναι το γονίδιο K-ras, το οποίο εµφανίζει σπάνια µεταλλάξεις και µερικές φορές υπερεκφράζεται στους όγκους των όρχεων (Moul JW et al. 1992; Mulder MP et al. 1989; Olie RA et al. 1995; Ridanpää M et al. 1993; Skotheim RI et al. 2002) και η κυκλίνη D2 (Houldsworth J. et al. 1997; Schmidt BA et al. 2001; Sicinski P et al. 1996; Skotheim RI et al. 2002). Η κυκλίνη αυτή πιθανόν να εµπλέκεται προκαλώντας απορρύθµιση του σηµείου ελέγχου µεταξύ των φάσεων G1-S. Μια πιο εντοπισµένη προσέγγιση στην ταυτοποίηση γονιδίων που εµπλέκονται στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων ξεκίνησε έπειτα από την εύρεση ενός µεταστατικού σεµινώµατος µε ενίσχυση ενός περιορισµένου τµήµατος του χρωµοσώµατος 12p που ταυτοποιήθηκε κυτταρογενετικά ότι ήταν η περιοχή 12p11.2-p12.1 (Suijkerbuijk RF et al. 1994). Ακολούθως, πρωτογενείς όγκοι των όρχεων βρέθηκαν να περιέχουν τέτοιες ενισχύσεις (Zafarana G et al. 2002; Korn WM et al. 1996; Mostert MC et al. 1998; Mostert MM et al. 1996). Η ενίσχυση του 12p απαντάται στο 8-10% των περιπτώσεων του σεµινώµατος ιδιαίτερα σε εκείνα όπου δεν παρατηρείται το ισοχρωµόσωµα 12p και είναι σπανιότερα στους µη σεµινωµατώδεις όγκους (Zafarana G et al. 2002). Αυτό προτείνει την παρουσία δύο µονοπατιών που οδηγούν στην υπερέκφραση των γονιδίων στο τµήµα 12p, είτε µέσω της δηµιουργίας του ισοχρωµοσώµατος 12p ή µέσω εναλλακτικού µηχανισµού που οδηγεί σε υψηλή ενίσχυση της περιοχής αυτής του χρωµοσώµατος. Τα σεµινώµατα µε ενίσχυση της περιοχής αυτής του χρωµοσώµατος 12p εµφανίζουν ελαττωµένη ευαισθησία στην απόπτωση και ένα γονίδιο που πιθανόν να εµπλέκεται είναι το γονίδιο DAD-R (Zafarana G et al. 2002). Είναι επίσης πιθανό ότι περισσότερα γονίδια σε αυτή την περιοχή ενίσχυσης βοηθούν τα κύτταρα του όγκου να υπερισχύσουν της απόπτωσης και να πολλαπλασιαστούν (Frisch SM and Francis H 1994). Μοριακές γενετικές µεταβολές: Αρκετές µελέτες έχουν δηµοσιευτεί σχετικά µε το ρόλο της αδρανοποίησης ογκο-κατασταλτικών γονιδίων και την ενεργοποίηση πρωτο- ογκογονιδίων στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων. Μια σηµαντική διαφορά µεταξύ των σεµινωµάτων είναι η υποµεθυλίωσή τους, σε σχέση µε τους µη-σεµινωµατώδεις όγκους, όπου παρατηρείται 47