Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 1 πλακέτα - 96 δοκιµές 72556 5 πλακέτες - 480 δοκιµές 72558

Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 1 πλακέτα - 96 δοκιµές 72556 5 πλακέτες - 480 δοκιµές 72558 ΚΙΤ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟΝ HCV ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ / ΠΛΑΣΜΑ ΜΕΣΩ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ Για χρήση in-vitro Έλεγχος ποιότητας εκ µέρους του κατασκευαστή Όλα τα προϊόντα που κατασκευάζονται και διατίθενται στο εµπόριο από την εταιρία Bio-Rad υποβάλλονται σε όλες τις διαδικασίες του συστήµατος διασφάλισης ποιότητας, από την παραλαβή των πρώτων υλών έως την εµπορευµατοποίηση των τελικών προϊόντων. Κάθε παρτίδα τελικού προϊόντος υποβάλλεται σε έλεγχο ποιότητας και διατίθεται στο εµπόριο µόνον όταν συµµορφώνεται µε τα κριτήρια αποδοχής. Η τεκµηρίωση σχετικά µε την παραγωγή και τον έλεγχο της κάθε παρτίδας τηρείται εντός της εταιρίας. 1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 - ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 2 - ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3 - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΚΙΤ 4 - ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ 5 - ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΓΙΕΙΝΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑ 6 - ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 7 - ΔΕΙΓΜΑΤΑ 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΧΡΟΝΟΣ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗΣ - ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ 9 - ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ 10 - ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 11 - ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 12 - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ 13 - ΕΠΙΔΟΣΕΙΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 14 - ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 15 - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2

1 -ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ Το Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA είναι µια ανοσοενζυµική δοκιµή για τη διαπίστωση της µόλυνσης από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) και βασίζεται στον ταυτόχρονο εντοπισµό αντισωµάτων και του καψιδικού αντιγόνου του ιού HCV στον ορό ή το πλάσµα του ανθρώπου. 2 - ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ (ΤΕΣΤ) Η µικροπλακέτα ευαισθητοποιείται µε : Μονοκλωνικό αντίσωµα κατά του καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C. 2 ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες που αντιστοιχούν στην περιοχή NS3 : γονότυπος 1 και 3a. Μία ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη που αντιστοιχεί στην περιοχή NS4. Ένα µεταλλαγµένο πεπτίδιο που αντιστοιχεί στην περιοχή του καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C. Τα χρησιµοποιούµενα συζυγή είναι : Συζυγές 1 (R6): Ένα βιοτινυλικό µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικιού κατά του καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C. Το συγκεκριµένο µονοκλωνικό αντίσωµα δεν αντιδρά κατά του µεταλλαγµένου πεπτιδίου (αντιστοιχεί στην περιοχή του καψιδίου) που χρησιµοποιείται στη στερεά φάση. Συζυγές 2 (R7): Το συζυγές 2 είναι µίγµα αντιανθρώπινων αντισωµάτων IgG ποντικιού σηµασµένων µε υπεροξειδάση και στρεπταβιδίνης σηµασµένης µε υπεροξειδάση. Η διαδικασία του τεστ περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια αντιδράσεων : 1) Το συζυγές 1 και, ακολούθως, τα προς µελέτη δείγµατα και οι οροί µάρτυρες κατανέµονται στις κοιλότητες της µικροπλακέτας. Εάν υπάρχουν αντισώµατα αντι- HCV, αυτά ενώνονται µε τα αντιγόνα που συνελήφθησαν κατά τη στερεά φάση. Εάν υπάρχουν αντιγόνα καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C, τα αντιγόνα αυτά επικολλούνται στα µονοκλωνικά αντισώµατα της στερεάς φάσης και στα βιοτινυλικά µονοκλωνικά αντισώµατα του συζυγούς 1. 2) Μετά από επώαση 90 λεπτών στους 37 C και µια πλύση, στις κοιλότητες της µικροπλακέτας προστίθενται το συζυγές 2 που περιέχει τα σηµασµένα µε υπεροξειδάση αντιανθρώπινα αντισώµατα IgG και η σηµασµένη µε υπεροξειδάση στρεπταβιδίνη. Εάν υπάρχουν ανθρώπινα IgG που αντέδρασαν κατά τη στερεά φάση, τότε το συζυγές αντιανθρώπινων IgG επικολλάται στα ανθρώπινα αντισώµατα. Εάν στο δείγµα υπάρχουν αντιγόνα του καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C, τότε το συζυγές υπεροξειδάση / στρεπταβιδίνη επικολλάται στη βιοτίνη του συζυγούς 1. 3) Μετά από επώαση διάρκειας 30 λεπτών στους 37 C και απόρριψη µέσω πλύσης των µη δεσµευµένων ενζυµικών συζυγών, η παρουσία συµπλόκων αντιγόνου αντισώµατος-υπεροξειδάσης καταδεικνύεται µέσω της προσθήκης του υποστρώµατος. 4) Μετά από επώαση διάρκειας 30 λεπτών σε θερµοκρασία εργαστηριακού περιβάλλοντος και διακοπή της αντίδρασης, διεξάγεται ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας µε φασµατοφωτοµετρική συσκευή στα 450/620-700 nm. Η µετρούµενη απορροφητικότητα ενός δείγµατος επιτρέπει την εξαγωγή συµπεράσµατος ως προς την παρουσία ή απουσία αντισωµάτων anti-hcv και/ή αντιγόνου του καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C στο υπό έλεγχο δείγµα. Η ένταση του χρωµατισµού είναι ανάλογη της ποσότητας των αντισωµάτων anti- 3

HCV και/ή των αντιγόνων του καψιδίου του ιού της ηπατίτιδας C που δεσµεύτηκαν στη στερεά φάση. 3 - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΚΙΤ ΣΗΜΑΝ- ΣΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ R1 ΜIΚΡΟΠΛΑΚΕΤΑ: 12 ταινίες ευαισθητοποιηµένες µε ένα µονοκλωνικό αντίσωµα αντικαψιδικό του HCV, µε κεκαθαρµένα ανασυνδυασµένα αντιγόνα (NS3, NS4) καθώς και µε ένα µεταλλαγµένο πεπτίδιο της περιοχής του καψιδίου του HCV. R2 ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΠΛΥΣΗΣ : (συγκέντρωση 20 φορές) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris, NaCl ph 7,4 που περιέχει 1 % Tween 20 Συντηρητικό : Προκλίνη 0,04% R3 ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ : Ρυθµιστικό διάλυµα Tris HCl που περιέχει BSA. Συντηρητικό : Proclin 300 (0,1 %) R4 ΘΕΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ : Ανθρώπινος ορός που περιέχει αντισώµατα αντι- HCV, αρνητικός στο αντιγόνο HBs και στα αντισώµατα αντι- HIV1 και αντι- HIV2, αραιωµένος µε ρυθµιστικό διάλυµα Tris HCl, το οποίο περιέχει BSA, και ο οποίος ορός κατέστη ανενεργός µέσω φωτοχηµικής διαδικασίας. Συντηρητικό : Proclin 300 (0,1 %) R5α ΘΕΤΙΚΟΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ Θετικό συνθετικό αντιγόνο µάρτυρας που περιέχει ένα λυοφιλιωµένο πεπτίδιο του καψιδίου. R5β ΑΡΑΙΩΤΙΚΟ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΑΡΤΥΡΑ Αραιωτικό του R5α. Νερό που περιέχει συντηρητικό : Proclin 300 (0,5 %) R6 ΣΥΖΥΓΕΣ 1: Μονοκλωνικό αντίσωµα ποντικιού κατά του καψιδίου του HCV σηµασµένο µε βιοτίνη. Ιώδους χρώµατος. Συντηρητικό : Αζίδιο του νατρίου (< 0,1%), Cosmocil 0,025%. ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ 1 πλακέτα 5 πλακέτες 1 5 75 ml 1 ml 1,5 ml qsp 1 ml 1 ml 15 ml 1 x 235 ml 1 ml 3 ml qsp 1 ml 1 ml 2 φιαλίδια 2 x 30 ml 4

R7 ΣΥΖΥΓΕΣ 2 : Αντιανθρώπινα αντισώµατα IgG ποντικιού σηµασµένα µε υπεροξειδάση και στρεπταβιδίνη σηµασµένη µε υπεροξειδάση. Πράσινου χρώµατος. Συντηρητικό : Proclin 300 (0,5 %) R8 ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΜΕ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗ Διάλυµα κιτρικού οξέως και ανθρακικού νατρίου ph 4,0 που περιέχει 0,015% H2O2 και 4% διµεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) R9 ΧΡΩΜΟΓΟΝΟ : Διάλυµα τετραµεθυλικής βενζιδίνης (TMB) 15 ml 60 ml 5 ml 2 φιαλίδια 2 x 30 ml 2 φιαλίδια 2 x 60 ml 2 φιαλίδια 2 x 5 ml R10 ΔΙΑΛΥΜΑ ΔΙΑΚΟΠΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ: Διάλυµα θειικού οξέως 1 Ν 28 ml 3 φιαλίδια 3 x 28 ml 4 - ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ Απεσταγµένο ή πλήρως απιονισµένο νερό. Λευκαντικό και διτανθρακικό νάτριο. Απορροφητικό χαρτί. Γάντια µιας χρήσης. Γυαλιά προστασίας. Σωλήνες µιας χρήσης. Αυτόµατες ή ηµιαυτόµατες πιπέτες ρυθµιζόµενης ή σταθερής αναρρόφησης, χωρητικότητας 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl και 1 ml. Βαθµονοµηµένοι κύλινδροι χωρητικότητας 10 ml, 200 ml και 1000 ml. Αναδευτήρας τύπου περιδίνησης. Σύστηµα πλύσης µικροπλακετών, αυτόµατο*, ηµιαυτόµατο* ή χειροκίνητο. Υδατόλουτρο, ή ξηρός επωαστήρας*, µε δυνατότητα ρύθµισης της θερµοκρασίας στους 37 C ± 1 C. Δοχείο µολυσµατικών απορριµµάτων. Συσκευή ανάγνωσης* µικροπλακετών (εξοπλισµένων µε φίλτρα 490, 620 και 450/620-700 nm). (*) Για εµπεριστατωµένη πληροφόρηση σχετικά µε τις εγκεκριµένες από τις τεχνικές µας υπηρεσίες συσκευές, επικοινωνήστε µαζί µας. 5 - ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΓΙΕΙΝΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑ Όλα τα αντιδραστήρια του κιτ προορίζονται για διαγνωστική χρήση "in vitro" και για επαγγελµατική χρήση. Αυτό το κιτ εξέτασης θα πρέπει να γίνεται µόνο από εξειδικευµένο προσωπικό εκπαιδευµένο σε εργαστηριακές διαδικασίες και εξοικειωµένο µε τους πιθανούς κινδύνους. Φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ιµατισµό, συµπεριλαµβανοµένων εργαστήριακό παλτό, προστασία µατιών / προσώπου και γάντια µίας χρήσεως (συνιστώνται συνθετικά µη-latex γάντια) και ο χειρισµός των αντιδραστηρίων και των δειγµάτων των ασθενών να βασίζεται στην απαιτούµενη Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. Πλύνετε καλά τα χέρια µετά την εκτέλεση της δοκιµής. Μην αναρροφάτε µε το στόµα. 5

Ο θετικός µάρτυρας κατέστη ανενεργός µέσω φωτοχηµικής τεχνικής. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιείται στην παρασκευή του θετικού µάρτυρα (R4), υποβλήθηκε σε δοκιµή και βρέθηκε µη αντιδρών στο επιφανειακό αντιγόνο του ιού της ηπατίτιδας Β (Ag HBs) και στα αντισώµατα κατά του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (αντι-hiv-1 και αντι-hiv-2). Δεδοµένου ότι καµία γνωστή µέθοδος δοκιµής δεν µπορεί να εγγυηθεί µε απόλυτη βεβαιότητα την απουσία µολυσµατικών παραγόντων, τα εν λόγω αντιδραστήρια καθώς και τα δείγµατα των ασθενών πρέπει να θεωρούνται ως δυνητικά λοιµογόνα και κατά τη χρήση τους να λαµβάνονται οι δέουσες προφυλάξεις. Το υλικό που έρχεται σε απευθείας επαφή µε τα δείγµατα και τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης καθώς και τα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης, πρέπει να θεωρούνται ως µολυσµένα προϊόντα. Αποφεύγετε την εκτίναξη δειγµάτων ή διαλυµάτων που περιέχουν δείγµατα. Οι µολυσµένες επιφάνειες πρέπει να καθαρίζονται µε λευκαντικό αραιωµένο κατά 10 %. Εάν το µολυσµατικό ρευστό είναι οξύ, οι µολυσµένες επιφάνειες πρέπει αρχικά να αδρανοποιούνται µε διτανθρακικό νάτριο και στη συνέχεια να καθαρίζονται µε λευκαντικό και να στεγνώνονται µε απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιµοποιείται για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται σε ειδικό δοχείο για µολυσµατικά απορρίµµατα. Τα δείγµατα, τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης καθώς και το µολυσµατικό υλικό και προϊόντα πρέπει να απορρίπτονται µετά από απολύµανση. είτε µέσω διαβροχής σε λευκαντικό τελικής συγκέντρωσης υποχλωριώδους νατρίου 5% επί 30 λεπτά, - είτε µέσω αποστείρωσης σε αυτόκλειστο κλίβανο στους 121 C επί τουλάχιστον 2 ώρες. ΠΡΟΣΟΧΗ : µην εισάγετε στον κλίβανο αποστείρωσης διαλύµατα τα οποία περιέχουν υποχλωριώδες νάτριο. Αποφεύγετε οιαδήποτε επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, το χρωµογόνο και το διάλυµα διακοπής της αντίδρασης. Τα δελτία δεδοµένων ασφαλείας διατίθενται κατόπιν παραγγελίας. Πριν να τα απορρίψετε στον νιπτήρα, µην ξεχνάτε να αδρανοποιείτε και/ή να αποστειρώνετε σε κλίβανο τα διαλύµατα ή τα υπολείµµατα της πλύσης ή οποιοδήποτε ρευστό το οποίο περιέχει βιολογικά δείγµατα. Μερικά αντιδραστήρια περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Η ένωση αυτή µπορεί να δηµιουργήσει στις µολυβδούχες ή χάλκινες σωληνώσεις µεταλλικά αζίδια τα οποία είναι άκρως εκρηκτικά. Για την αποφυγή συσσώρευσης τέτοιων αζιδίων στις σωληνώσεις κατά την απόρριψη των αντιδραστηρίων στο νιπτήρα, αδρανοποιήστε τα και πλύνετε το νιπτήρα µε άφθονο νερό. - Ορισµένα αντιδραστήρια περιέχουν : - ProClin 300 : 0,5% : ΕΡΕΘΙΣΤΙΚΟ R43 : επαφή µε το δέρµα µπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση S28/37 :µετά από επαφή µε το δέρµα, πλένετε αµέσως µε άφθονο νερό και σαπούνι. Φοράτε κατάλληλα γάντια. Το δελτίο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται κατόπιν παραγγελίας 6 - ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 6

Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από την ορθή τήρηση της ακόλουθης ορθής εργαστηριακής πρακτικής : Η ονοµασία της εξέτασης, καθώς επίσης ενας ειδικός κωδικός αναγνώρισης της εξέτασης, είναι γραµµένα στο πλάι κάθε µικροπλάκας. Ο ειδικός κωδικός αναγνώρισης είναι επίσης τυπωµένος σε κάθε ταινία. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA : Ειδικός ID αριθµός = 55 Πιστοποιήστε τον ειδικό κωδικό αναγνώρισης πρίν την πραγµατοποίηση της εξέτασης. Εάν ο ειδικός κωδικός αναγνώρισης απουσιάζει ή είναι διαφορετικός σε σχέση µε τον προαναφερθείσα αριθµό, η ταινία δέν πρέπει να χρησιµοποιηθεί. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια των οποίων η ηµεροµηνία λήξης έχει παρέλθει. Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες κατά τη διάρκεια της ίδιας δοκιµής. Παρατήρηση : Η χρήση άλλων παρτίδων ρυθµιστικού διαλύµατος ( R2, µε την σήµανση στην ετικέτα 20Χ, πράσινου χρώµατος), ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος (R8 µε τη σήµανση στην ετικέτα TMB buf., µπλε χρώµατος), χρωµογόνου (R9 µε τη σήµανση στην ετικέτα TMB 11x., ιώδους χρώµατος) και διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης (R10, µε τη σήµανση στην ετικέτα 1N, κόκκινου χρώµατος) διαφορετικών από αυτές που παρέχονται στο κιτ είναι εφικτή, υπό την προϋπόθεση να χρησιµοποιείται µόνο η ίδια παρτίδα κατά τη διάρκεια της ίδιας δοκιµής. Αυτά τα αντιδραστήρια µπορούν να χρησιµοποιούνται µε άλλα προϊόντα της εταιρείας µας και, για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστε µε τις τεχνικές µας υπηρεσίες. Επιπλέον, το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (R2 µε την σήµανση στην ετικέτα 20Χ, πράσινου χρώµατος) µπορεί να παρασκευασθεί µε ανάµιξη µε τα άλλα 2 ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης που περιέχονται στις συσκευασίες διαφορετικών αντιδραστηρίων της εταιρείας Bio-Rad (R2 µε την σήµανση στην ετικέτα 10Χ, µπλέ χρώµατος ή 10Χ, πορτοκαλί χρώµατος) όταν πραγµατοποιείται σωστή ανασύσταση, παρέχοντας όµοια συγκέντρωση του υλικού σε κάθε κύκλο αναλύσεων. Πριν από τη χρήση, περιµένετε 30 λεπτά έως ότου τα αντιδραστήρια σταθεροποιηθούν στη θερµοκρασία δωµατίου. Προβείτε σε προσεκτική ανασύσταση των αντιδραστηρίων, αποφεύγοντας κάθε µόλυνση. Μην διεξάγετε τη δοκιµή παρουσία αντιδρώντων υδρατµών (οξέα, αλκαλικά, αλδεΰδες) ή κόνεων που θα µπορούσαν να αλλοιώσουν την ενζυµική δραστικότητα του συζυγούς. Χρησιµοποιείτε γυάλινα είδη καλά πλυµένα και ξεπλυµένα µε απεσταγµένο νερό ή, κατά προτίµηση, υλικά µιας χρήσης. Μην αφήνετε τη µικροπλακέτα να στεγνώσει κατά το διάστηµα µεταξύ της ολοκλήρωσης της έκπλυσης και της έναρξης κατανοµής των αντιδραστηρίων. Η ενζυµική αντίδραση είναι εξαιρετικά ευαίσθητη σε όλα τα µέταλλα ή στα ιόντα µετάλλων. Κατά συνέπεια, κανένα µεταλλικό στοιχείο δεν πρέπει να έρχεται σε επαφή µε τα διάφορα διαλύµατα που περιέχουν συζυγή ή υπόστρωµα. Το διάλυµα ανάπτυξης (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος + χρωµογόνο) πρέπει να λαµβάνει ροζ χρώµα. Η εµφάνιση άλλου χρώµατος λίγα λεπτά µετά από την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν είναι χρησιµοποιήσιµο και πρέπει να αντικατασταθεί. 7

Για το παρασκεύασµα αυτό, χρησιµοποιείτε κατά προτίµηση τα πλαστικά δοχεία και το υλικό κατανοµής µίας χρήσης ή γυαλικά που έχουν πλυθεί προηγουµένως µε υδροχλωρικό οξύ 1 Ν, ξεπλυθεί µε απεσταγµένο νερό και είναι στεγνά. Φυλάξτε το διάλυµα αυτό µακριά από το φως. Χρησιµοποιείτε νέο ακροστόµιο κατανοµής για κάθε ορό. Η πλύση των κοιλοτήτων αποτελεί βασικό στάδιο της διαδικασίας: τηρείτε τον αριθµό κύκλων έκπλυσης που προδιαγράφεται και βεβαιωθείτε ότι όλες οι κοιλότητες γεµίζουν πλήρως και, στη συνέχεια, εκκενώνονται πλήρως. Μια ανεπαρκής πλύση µπορεί να αποφέρει εσφαλµένα αποτελέσµατα. Ποτέ µην χρησιµοποιείτε το ίδιο δοχείο για να κατανείµετε το συζυγές και το διάλυµα ανάπτυξης χρώµατος. 7 - ΔΕΙΓΜΑΤΑ Συλλέξτε δείγµα αίµατος σύµφωνα µε τη συνήθη πρακτική. Οι δοκιµές πραγµατοποιούνται επί µη αραιωµένων δειγµάτων ορού ή πλάσµατος (τα οποία έχουν συλλεχθεί µε αντιπηκτικά όπως τα EDTA, ηπαρίνη, κιτρικό οξύ, ACD). Δείγµατα τα οποία περιέχουν συσσωµατώµατα πρέπει να καθαρίζονται µε φυγοκέντρηση πριν από τη διεξαγωγή της δοκιµής. Τα αιωρούµενα σωµατίδια ή ινώδη σωµατίδια είναι πιθανόν να προκαλέσουν πλασµατικά θετικά αποτελέσµατα. Τα δείγµατα µπορούν να διατηρηθούν στους +2 έως 8 C εάν η δοκιµή προσδιορισµού διεξάγεται εντός 7 ηµερών, ή µπορούν να διατηρούνται στην κατάψυξη στους -20 C. Αποφεύγετε διαδοχικές καταψύξεις/αποψύξεις. Εάν τα δείγµατα πρόκειται να µεταφερθούν, συσκευάστε τα σύµφωνα µε τους κανονισµούς σχετικά µε τη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων και, κατά προτίµηση, µεταφέρετέ τα κατεψυγµένα. ΜΗΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΜΟΛΥΣΜΕΝΟΥΣ, ΥΠΕΡΛΙΠΑΙΜΙΚΟΥΣ ΟΡΟΥΣ Ή ΟΡΟΥΣ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΥΠΕΡΑΙΜΟΛΥΣΗ. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ : Δείγµατα τα οποία περιέχουν έως 90 g/l αλµπουµίνης, 50µg/ml βιοτίνης και 100 mg/l χολυρεθρίνης, λιπαιµικά δείγµατα τα οποία περιέχουν έως και 36 g/l τριγλυκεριδίων, και δείγµατα τα οποία έχουν υποστεί αιµόλυση και τα οποία περιέχουν έως και 87 g/l αιµοσφαιρίνης, δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα της δοκιµής. Αρνητικά και θετικά δείγµατα υποβλήθηκαν σε δοκιµή για τον προσδιορισµό αντισωµάτων anti HCV ή αντιγόνου του HCV πριν και µετά από επώαση στους 56 C διάρκειας 30 λεπτών καθώς και µετά από 3 κύκλους κατάψυξης και απόψυξης. Ουδεµία από τις προαναφερθείσες κατεργασίες επηρέασε την ανίχνευση των αντισωµάτων. Παρ όλα αυτά, η υποβολή των δειγµάτων σε υψηλή θερµοκρασία µειώνει σηµαντικά την απόκριση στην ανίχνευση του αντιγόνου του HCV µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab Ultra. 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΧΡΟΝΟΣ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗΣ - ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Πριν από τη χρήση των αντιδραστηρίων του κιτ Monolisa HCV Ag-Ab Ultra, αφήστε τα να σταθεροποιηθούν σε θερµοκρασία δωµατίου επί 30 λεπτά. 8

1) Αντιδραστήρια έτοιµα για χρήση Μικροπλακέτα (R1) Κάθε µικροπλάκα που περιέχει 12 ταινίες είναι πακεταρισµένη σε µία συσκευασία αεροστεγώς κλεισµένη. Ανοίξτε την συσκευασία µε ψαλίδι κόβωντας 0,5 εώς 1 εκατοστό πιο πάνω απο τον µηχανισµό zip της συσκευασίας. Ανοίξτε την συσκευασία και αφαιρέστε την µικροπλάκα. Επανατοποθετήστε τις µη χρησιµοποιηµένες ταινίες µέσα στην συσκευασία. Κλείστε προσεκτικά την συσκευασία και τοποθετήστε την στο ψυγείο στους +2-8 C. Συζυγές 1 έτοιµο προς χρήση (R6) Ανακινήστε πριν από τη χρήση για να οµοιογενοποιήσετε. Συζυγές 2 έτοιµο προς χρήση (R7) Ανακινήστε πριν από τη χρήση για να οµοιογενοποιήσετε. 2) Αντιδραστήρια προς ανασύσταση Διάλυµα πλύσης (R2) Αραιώστε το διάλυµα πλύσης σε αναλογία 1:20 σε απεσταγµένο νερό για να έχετε έτοιµο πρός χρήση ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. Ετοιµάστε 800 ml για µία µικροπλάκα των 12 ταινιών. Διάλυµα ενζυµικής ανάπτυξης (R8 + R9) Αραιώστε το αντιδραστήριο R9 στο αντιδραστήριο R8 κατά 1/11 (παράδειγµα: 1 ml αντιδραστηρίου R9 σε 10 ml αντιδραστηρίου R8) λαµβάνοντας υπόψη ότι τα 10 ml είναι αναγκαία και επαρκή για την επεξεργασία 12 ταινιών. Οµοιογενοποιήστε. Θετικό αντιγόνο µάρτυρας (R5a + R5b) : Διάλυµα εργασίας. Μεταγγίστε όλο το περιεχόµενο του φιαλιδίου R5β στο φιαλίδιο R5α. Κλείστε το φιαλίδιο και περιµένετε 10 λεπτά σε θερµοκρασία εργαστηρίου ανακινώντάς το κατά διαστήµατα. 3) Χρόνος διατήρησης Αποθηκεύστε το κιτ στους + 2 έως 8 C. Μετά την παρασκευή τους, η σταθερότητα των προς ανασύσταση αντιδραστηρίων έχει ως εξής: ΣΗΜΑΝΣΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΧΡΟΝΟΣ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗΣ R1 Μικροπλακέτα σε σακουλάκι επιµελώς κλειστή 1 µήνα στους +2 έως 8 C R2 Αραιωµένο διάλυµα πλύσης 2 εβδοµάδες στους +2 έως 30 C R5α + R5β Διάλυµα εργασίας του θετικού αντιγόνου µάρτυρα 1 µήνα στους +2 έως 8 C 2 µήνες στους 20 C και, µετά από κατάψυξη στους 20 C, δυνατότητα 5 κύκλων κατάψυξης/ 9

απόψυξης. R8 + R9 Διάλυµα ανάπτυξης χρώµατος 6 ώρες στους +18-30 C (στο σκοτάδι) Μετά το άνοιγµα, όλα τα άλλα αντιδραστήρια παραµένουν σταθερά έως την ηµεροµηνία λήξης τους που αναγράφεται στη συσκευασία, υπό την προϋπόθεση να φυλάσσονται στους +2-8 C. 9 - ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ Ακολουθήστε αυστηρά το προτεινόµενο πρωτόκολλο. Χρησιµοποιήστε αρνητικούς και θετικούς ορούς µάρτυρες σε κάθε δοκιµή προκειµένου να επικυρώσετε την ποιότητά της. Ακολουθήστε την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Ανάλογα µε τον αναλυτή που χρησιµοποιείται, είναι εφικτό να αλλαχθούν οι θέσεις των ορών ελέγχου ή ο τρόπος διανοµής των αντιδραστηρίων. 1) Σχεδιάστε µε επιµέλεια την κατανοµή και αναγνώριση των δειγµάτων. 2) Ετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα πλύσης R2 και το διάλυµα εργασίας του θετικού αντιγόνου µάρτυρα (R5a + R5b ). 3) Βγάλτε το πλαίσιο στήριξης και τις ταινίες (R1) από την προστατευτική συσκευασία. 4) Τοποθετήστε γρήγορα και απευθείας, χωρίς προέκπλυση της πλακέτας, διαδοχικά: 4.1) 100 µl του συζυγούς 1 (R6) µέσα σε κάθε κοιλότητα 4.2) 50 µl αρνητικού µάρτυρα (R3) στην Α1, 50 µl θετικού µάρτυρα (R4) στην B1,C1, D1, 50 µl του διαλύµατος εργασίας του θετικού αντιγόνου µάρτυρα (R5α + R5β ) στην E1, 50 µl του πρώτου δείγµατος στην F1, 50 µl του δεύτερου δείγµατος στην G1, κτλ Οµοιογενοποιήστε το µίγµα προβαίνοντας σε τουλάχιστον 3 αναρροφήσεις ή µέσω ενός αναδευτήρα µικροπλακέτας επί 5 δευτερόλεπτα. Εάν η διαδικασία κατανοµής των δειγµάτων υπερβαίνει τα 10 mn, τότε συνιστάται η προσθήκη του αρνητικού και θετικού µάρτυρα να γίνεται µετά από την κατανοµή των υπό δοκιµή δειγµάτων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Μετά από την προσθήκη του δείγµατος, η κοιλότητα που περιέχει το δείγµα (ή τους µάρτυρες) + το συζυγές 1 λαµβάνει απόχρωση ιώδη προς κυανούν. Η παρουσία δειγµάτων στις κοιλότητες µπορεί να επιβεβαιωθεί µε φασµατοφωτοµετρική ανάγνωση στα 620 nm (βλέπε κεφάλαιο 12: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ) 5) Όταν είναι εφικτό, καλύψτε µε αυτοκόλλητη ταινία πιέζοντας καλά σε όλη την επιφάνεια προκειµένου να εξασφαλισθεί η στεγανότητα. 6) Επωάστε την µικροπλακέτα σε υδατόλουτρο ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας ή σε ξηρό επωαστήρα µικροπλακετών επί: 90 ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 7) Αφαιρέστε την κολλητική ταινία. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των κοιλοτήτων σε ένα δοχείο για µολυσµένα απορρίµµατα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο) και προσθέστε αµέσως σε κάθε µια κοιλότητα τουλάχιστον 0,370 ml διαλύµατος έκπλυσης. Αναρροφήστε εκ νέου. Επαναλάβετε την έκπλυση 4 φορές ακόµη (ελάχιστο 5 πλυσίµατα). Ο υπολειπόµενος όγκος πρέπει να µην 10

υπερβαίνει τα 10 µl (εάν είναι απαραίτητο, στεγνώστε την πλακέτα αναποδογυρίζοντάς την επάνω σε ένα φύλλο απορροφητικού χάρτου). Εάν διατίθεται αυτόµατη συσκευή πλύσης, τηρήστε τις ίδιες διαδικασίες. 8) Κατανείµετε αµέσως 100 µl διαλύµατος συζυγούς 2 (R7) µέσα σε όλες τις κοιλότητες. Το συζυγές πρέπει να αναδευτεί πριν από τη χρήση του. Καλύψτε, εάν είναι εφικτό, µε νέα κολλητική ταινία και επωάστε επί: 30 ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Το συζυγές είναι πράσινου χρώµατος. Ο έλεγχος της παρουσίας συζυγούς στις κοιλότητες µπορεί να γίνει µε φασµατοφωτοµετρική ανάγνωση στα 620 nm (βλέπε κεφάλαιο 12 : ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ) 9) Αφαιρέστε την κολλητική ταινία, αδειάστε όλες τις κοιλότητες µε αναρρόφηση και πλύνετε τουλάχιστον 5 φορές όπως και προηγουµένως. 10) Προετοιµασία του διαλύµατος ανάπτυξης (βλέπε κεφάλαιο 8, αντιδραστήριο R8 + R9). 11) Κατανείµετε γρήγορα σε όλες τις κοιλότητες 80 µl διαλύµατος ανάπτυξης της ενζυµικής δραστικότητας (R8 + R9) που ετοιµάσατε προηγουµένως. Αφήστε την αντίδραση να εξελιχθεί στο σκοτάδι επί 30 ± 5 λεπτά και σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (18 έως 30 C). Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης µη χρησιµοποιείτε συγκολλητική ταινία. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης, το οποίο γίνεται ροζ χρώµατος, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το στάδιο της διαδικασίας: Υπάρχει σαφής διαφορά χρωµατισµού µεταξύ µιας κενής κοιλότητας και µιας κοιλότητας που περιέχει διάλυµα ανάπτυξης ροζ χρώµατος. (βλέπε κεφάλαιο 12 για την αυτόµατη επιβεβαίωση ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ) 12) Προσθέστε 100 µl διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης (R10) ακολουθώντας την ίδια αλληλουχία και ρυθµό κατανοµής µε αυτήν του διαλύµατος ανάπτυξης. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η κατανοµή του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης, το οποίο είναι άχρωµο, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το στάδιο της διαδικασίας. Ο χρωµατισµός του υποστρώµατος, ροζ (για τα αρνητικά δείγµατα) ή µπλε (για τα θετικά δείγµατα), εξαφανίζεται από τις κοιλότητες οι οποίες γίνονται άχρωµες (για τα αρνητικά δείγµατα) ή κίτρινες (για τα θετικά δείγµατα) µετά από την προσθήκη διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης. 13) Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος των πλακετών. Περιµένετε τουλάχιστον 4 λεπτά µετά από την κατανοµή του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης και προβείτε στην ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας στα 450/620-700 nm µέσω της συσκευής ανάγνωσης πλακετών εντός των 30 λεπτών από την διακοπή της αντίδρασης. 14) Πριν από την καταγραφή των αποτελεσµάτων, βεβαιωθείτε για την συνάφεια µεταξύ ανάγνωσης και σχεδίου κατανοµής και αναγνώρισης των πλακετών των δειγµάτων. 10 - ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Πλύση: Για την επίτευξη των µέγιστων επιδόσεων του τεστ, η αυστηρή τήρηση των διαδικασιών πλυσίµατος είναι απαραίτητη. Σε ορισµένα όργανα, για την επίτευξη αποδεκτού επιπέδου αρνητικότητας ίσως να χρειασθεί µεγαλύτερος αριθµός κύκλων έκπλυσης. 11

11 - ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η παρουσία ή απουσία αντισωµάτων αντι-hiv1 και/ή αντιγόνου του καψιδίου του HCV προσδιορίζεται συγκρίνοντας την απορροφητικότητα που καταγράφηκε για κάθε δείγµα µε την υπολογισθείσα τιµή κατωφλίου. Υπολογισµός της µέσης τιµής απορροφητικότητας των θετικών µαρτύρων R4 Παράδειγµα : Θετικός µάρτυρας (R4) δείγµα Οπτική πυκνότητα (OD) B1 1,636 C1 1,704 D1 : 1,650 Σύνολο 4,990 Συνολική Οπτική Πυκνότητα 4,990 OD R4 = --------------------------------------------------- = ------------------ = 1,663 3 3 Υπολογισµός της τιµής κατωφλίου (Vs) Μέση τιµή OD R4 Vs = -------------------------------------- 4 Παράδειγµα : Μέση τιµή OD R4 = 1,663 1,663 Vs = --------------------------- = 0,415 4 Τα κριτήρια επικύρωσης είναι τα ακόλουθα: α) Για τον αρνητικό µάρτυρα R3 : η µετρούµενη απορροφητικότητα πρέπει να είναι µικρότερη από την OD της τιµής κατωφλίου κατά 0,6 φορές. β) Για τον θετικό µάρτυρα R4 : ο µέσος όρος των τιµών απορροφητικότητας που µετρώνται πρέπει να είναι µεγαλύτερος από ή ίσος µε 0,800 και µικρότερος από ή ίσος µε 2,400. εάν µία εκ των τιµών του θετικού µάρτυρα αποκλίνει περισσότερο του 30 % από τη µέση τιµή, ο υπολογισµός επαναλαµβάνεται µε τις δύο υπόλοιπες τιµές του θετικού µάρτυρα. γ) Για το διάλυµα εργασίας του θετικού αντιγόνου µάρτυρα (R5α +R5β). Η µετρούµενη οπτική πυκνότητα πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,500. 12

Η δοκιµή είναι άκυρη εάν ο αρνητικός µάρτυρας R3, το διάλυµα εργασίας του θετικού αντιγόνου µάρτυρα (R5α +R5β) και/ή εάν περισσότερες από µία τιµές του θετικού µάρτυρα R4 βρίσκονται εκτός του εύρους των ανωτέρω τιµών. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Σύµφωνα µε το Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA, τα δείγµατα των οποίων η οπτική πυκνότητα είναι µικρότερη από την τιµή κατωφλίου (οριακή τιµή) θεωρούνται αρνητικά. Ωστόσο, όταν τα αποτελέσµατα κυµαίνονται ακριβώς κάτω απο την τιµή κατωφλίου (C.O -10% < OD < C.O) τότε αυτά πρέπει να ερµηνεύονται µε προσοχή και συνίσταται η εις διπλούν επανάληψη της δοκιµής των αντίστοιχων δειγµάτων, εφόσον το επιτρέπουν οι εργαστηριακές διαδικασίες και τα χρησιµοποιούµενα συστήµατα. Τα δείγµατα των οποίων η οπτική πυκνότητα είναι µεγαλύτερη ή ίση µε την τιµή κατωφλίου, θεωρούνται αρχικά ως θετικά και πρέπει να υποβληθούν εκ νέου σε διπλή δοκιµή πριν από την τελική ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Μετά από την επανάληψη της δοκιµής, σύµφωνα µε το Monolisa HCV Ag - Ab ULTRA το δείγµα θεωρείται θετικό εάν η δεύτερη και/ή η τρίτη µέτρηση είναι θετική (- ές), δηλαδή µεγαλύτερη ή ίση µε την τιµή κατωφλίου. Το δείγµα θεωρείται αρνητικό εάν οι δύο αυτές τιµές είναι µικρότερες από την τιµή κατωφλίου. 12 - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ: (ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΟ) ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ 1 (R6) ΚΑΙ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΡΩΤΗ ΦΑΣΗ : Η ταυτόχρονη παρουσία του συζυγούς 1 (R6) και του δείγµατος (ή του µάρτυρα) µπορεί να επιβεβαιωθεί µέσω φασµατοφωτοµετρικής ανάγνωσης στα 620 nm. Κάθε κοιλότητα που περιέχει ταυτόχρονα το συζυγές 1 (R6) και ένα δείγµα (ή έναν µάρτυρα) πρέπει να εµφανίζει οπτική πυκνότητα µεγαλύτερη από 0,800. Παρατήρηση : µετά την προσθήκη του δείγµατος, το συζυγές 1 (R6) αλλάζει χρώµα, από ιώδες σε κυανούν. ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ 2 (R7) ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΕΥΤΕΡΗ ΦΑΣΗ. Παρατήρηση : το συζυγές 2 (R7) είναι πράσινου χρώµατος. Η ύπαρξη συζυγούς 2 (R7) εντός των κοιλοτήτων µπορεί να επαληθευθεί µε φασµατοφωτοµετρική ανάγνωση στα 620 nm: η τιµή οπτικής πυκνότητας που µετριέται σε κάθε κοιλότητα πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,300 (τιµή χαµηλότερη της παραπάνω προδιαγραφής υποδεικνύει ελλιπή κατανοµή του συζυγούς). ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ: Η παρουσία του ροζ διαλύµατος ανάπτυξης µπορεί να ελεγχθεί µε αυτόµατη ανάγνωση στα 490nm: µια κοιλότητα που περιέχει διάλυµα ανάπτυξης πρέπει να έχει οπτική πυκνότητα µεγαλύτερη από 0,100 (µικρότερη οπτική πυκνότητα (OD) υποδεικνύει ανεπαρκή κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης). 13

Υπάρχει σαφής διαφορά χρωµατισµού µεταξύ µιας κενής κοιλότητας και µιας κοιλότητας που περιέχει διάλυµα ανάπτυξης ροζ χρώµατος. 13 - ΕΠΙΔΟΣΕΙΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ A- ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑΣ Για τον προσδιορισµό της ειδικότητας της δοκιµής, υποβλήθηκαν σε δοκιµή µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA δείγµατα αιµοδοτών και ασθενών σε διάφορες τοποθεσίες, τα αποτελέσµατα της οποίας συγκρίθηκαν µε αυτά που προέκυψαν από κοινή δοκιµή. Ειδικότητα σε πληθυσµό αιµοδοτών Η µελέτη διεξήχθη σε τακτικούς ή σε νέους δότες από 3 διαφορετικές τοποθεσίες. Τοποθεσίες Αριθµός δειγµάτων που υποβλήθηκαν σε δοκιµή Αριθµός κατ επανάληψη θετικών δειγµάτων EFS Rungis Γαλλία EFS Bordeaux Γαλλία Δότες από το Montpellier Γαλλία Σύνολο 2410 2503 2248 7161 5 3 4 12 Επί 7161 δειγµάτων αιµοδοτών που υποβλήθηκαν σε δοκιµή, 12 δείγµατα εµφάνισαν κατ επανάληψη θετικό αποτέλεσµα µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA αλλά, µέσω γονιδιακής διάγνωσης (PCR) ή µέσω ανοσοαποτύπωσης HCV PLUS Deciscan δεν επιβεβαιώθηκαν ως θετικά. Η ειδικότητα του συγκεκριµένου πληθυσµού δοτών είναι 99,83%. Ειδικότητα σε πληθυσµό νοσηλευόµενων ασθενών Διεξήχθη µελέτη επιπολασµού σε 469 δείγµατα προερχόµενα από 2 διαφορετικές τοποθεσίες νοσηλευόµενων ασθενών. 440 επί 469 δειγµάτων που υποβλήθηκαν σε δοκιµή εµφάνισαν αρνητικό αποτέλεσµα µε το τεστ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA καθώς και µε το κοινό τεστ, 22 δείγµατα βρέθηκαν θετικά µε αµφότερα τα συγκεκριµένα τεστ, εκ των οποίων τα 21 επιβεβαιώθηκαν ως θετικά µε την ανοσοαποτύπωση HCV PLUS Deciscan ενώ ένα δείγµα θεωρήθηκε ως πιθανώς θετικό. Σε 7 δείγµατα, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, µε την Ανοσοαποτύπωση HCV PLUS Deciscan και µε τη γονιδιακή διάγνωση PCR δεν ήταν µεταξύ τους συναφή. Τα αποτελέσµατα αυτών των 7 δειγµάτων είναι τα ακόλουθα: 2 δείγµατα είναι θετικά µε το κοινό τεστ και αρνητικά µε το Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA όπως και µε τη γονιδιακή διάγνωση PCR και την ανοσοαποτύπωση HCV PLUS Deciscan. Τα συγκεκριµένα δείγµατα µπορούν να θεωρηθούν, για το κοινό τεστ, ως πιθανώς πλασµατικά θετικά. 14

Για 2 δείγµατα η εξαγωγή συµπεράσµατος ήταν ανέφικτη και, ως εκ τούτου, τα αποτελέσµατα της γονιδιακής διάγνωσης δεν είναι ερµηνεύσιµα. Τα συγκεκριµένα δείγµατα αποκλείσθηκαν από τον υπολογισµό της ειδικότητας. Ένα δείγµα βρέθηκε θετικό µε το κοινό τεστ, αρνητικό µε το Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA, απροσδιόριστο µε την ανοσοαποτύπωση HCV PLUS Deciscan και αρνητικό µε το τεστ της γονιδιακής διάγνωσης PCR. Μόνο 2 δείγµατα, ελαφρώς θετικά µε το Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA (λόγος µικρότερος από 1,7) όπως και µε το κοινό τεστ που χρησιµοποίησε το εργαστήριο, απέφεραν αρνητικό αποτέλεσµα µε το τεστ γονιδιακής διάγνωσης PCR και απροσδιόριστα µε το τεστ ανοσοαποτύπωσης HCV PLUS Deciscan (ασθενής λωρίδα NS4). Εάν τα 2 τελευταία δείγµατα θεωρηθούν ως πλασµατικά θετικά, τότε η υπολογιζόµενη ειδικότητα βάσει της εν λόγω µελέτης είναι 99,5% (443/445) ενώ, εάν τα συγκεκριµένα δείγµατα (απροσδιόριστα µε την ανοσοαποτύπωση) θεωρηθούν ως πραγµατικά θετικά λόγω ύπαρξης υπολειµµατικών αντισωµάτων συνεπεία µιας προγενέστερης µόλυνσης, τότε η ειδικότητα είναι 100 %. Ειδικότητα σε δείγµατα µε πιθανή διασταυρούµενη αντίδραση 429 δείγµατα που θα µπορούσαν να προκαλέσουν διασταυρούµενες αντιδράσεις µε τη δοκιµή ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV υποβλήθηκαν σε δοκιµή µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Προέλευση των υπό δοκιµή δειγµάτων : Ασθενείς που πάσχουν από ηπατίτιδα B, ηπατίτιδα A, ερυθρά, τοξόπλασµα, παρωτίτιδα, ιλαρά, CMV, HSV, EBV, VZV, HTLV I, HIV, Chagas, Flavivirus, ασθενείς εµβολιασµένοι κατά της γρίπης. Ασθενείς θετικοί στον ρευµατοειδή παράγοντα. Ασθενείς που πάσχουν από αυτοάνοσες ασθένειες (τύπου SLE) µε εµφάνιση µυελώµατος, HAMA και ANA. Έγκυες γυναίκες, κιρρωτικοί ασθενείς, διαπιδυτικοί ασθενείς και ασθενείς που πάσχουν από νεφρική ανεπάρκεια : Από τα συγκεκριµένα 429 δείγµατα, µόνον ένα βρέθηκε θετικό µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA όπως και µε το κοινό, αλλά µε σήµανση CE, τεστ ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV. Συνεπώς, η ειδικότητα που προέκυψε σε αυτόν τον πληθυσµό είναι 100 %. Β ΜΕΛΕΤΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ Η ευαισθησία αξιολογήθηκε βάσει µεγάλου αριθµού θετικών δειγµάτων από ασθενείς µολυσµένους από HCV τα οποία προέρχονταν από πάνελ οροµετατροπής του εµπορίου, από ειδικά ιδρύµατα και από την Bio-Rad. Τα δείγµατα που υποβλήθηκαν σε δοκιµή απαριθµούνται ακολούθως. 15

Ευαισθησία σε δείγµατα επιβεβαιωµένα ως θετικά στη µόλυνση από τον HCV Υποβλήθηκαν σε δοκιµή 646 δείγµατα τα περισσότερα εκ των οποίων προέρχονταν από ασθενείς µε χρόνιες λοιµώξεις από HCV (παρουσία αντισώµατος anti HCV). Τα 405 δείγµατα ήταν γονοτυπικά. Το σύνολο των 646 δειγµάτων ήταν αντιδραστικό µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA. Συνεπώς, η ευαισθησία επί του συγκεκριµένου πληθυσµού είναι 100%. 25 επιπλέον, φρέσκα και θετικά δείγµατα (εντός 1 ηµέρας µετά τη συλλογή του αίµατος) ελέγχθηκαν και όλοι βρέθηκαν θετικά. Ευαισθησία σε γονοτυπικά θετικά στον HCV δείγµατα. Υποβλήθηκαν σε δοκιµή 405 γονοτυπικά δείγµατα εκ των οποίων τα 133 προέρχονταν από ποικίλες πηγές και τα 272 από νοσοκοµειακά εργαστήρια. Η κατανοµή των γονοτύπων που υποβλήθηκαν σε δοκιµή έχει ως ακολούθως: Όλα τα δείγµατα βρέθηκαν θετικά: ευαισθησία 100 %. Ευαισθησία σε δείγµατα που προέρχονται από ασθενείς µε οξείες λοιµώξεις: 1) Η αξιολόγηση της ευαισθησίας έγινε µε δείγµατα που προέρχονταν από την οξεία φάση της µόλυνσης από τον HCV (αρχική φάση της λοίµωξης). Υποβλήθηκαν σε δοκιµή µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab UTRA 53 πάνελ οροµετατροπής που αντιστοιχούσαν σε 421 δείγµατα και τα αποτελέσµατα συγκρίθηκαν µε αυτά που προέκυψαν µε το κιτ ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV το οποίο κιτ φέρει σήµανση CE. Το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab UTRA ανιχνεύει ταχύτερα τη λοίµωξη σε όλα σχεδόν τα πάνελ αλλά και 119 δείγµατα περισσότερα από αυτά που ανιχνεύει το κιτ ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV που φέρει σήµανση CE και που χρησιµοποιείται ως κιτ αναφοράς. Αριθµός θετικών δειγµάτων επί συνόλου 421 κιτ Ac Anti HCV Monolisa Ag-Ab HCV Ultra 152 271 2) Η σύγκριση των αποτελεσµάτων της µελέτης επί 14 πάνελ οροµετατροπής, των οποίων η πρώτη δειγµατοληψία δίδεται από τον προµηθευτή ως αρνητική στο RNA HCV, απέδειξε ότι: ο µέσος όρος των ηµερών καθυστέρησης του κιτ Monolisa HCV 16

Ag-Ab ULTRA σε σύγκριση µε το τεστ γονιδιακής διάγνωσης του ιού (N.A.T nucleic acid test) που διεξάγεται άπαξ είναι 3,4 ηµέρες. (Τα δεδοµένα της γονιδιακής διάγνωσης του ιού προέρχονται από τον προµηθευτή των πάνελ, όπως τα έχει καταγράψει στο πιστοποιητικό ανάλυσης.) κιτ Ac Anti HCV Monolisa Ag-Ab HCV Ultra Μέσος όρος ηµερών καθυστέρησης / PCR 28,7 3,4 Το Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA ανιχνεύει κατά µέσο όρο 25 ηµέρες νωρίτερα από ό,τι το κιτ ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV, που λαµβάνεται ως τεστ αναφοράς για τα συγκεκριµένα 14 πάνελ οροµετατροπής. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τα εν λόγω 14 πάνελ οροµετατροπής, παρατηρούµε ότι η χρήση του κιτ Monolisa HCV Ag-Ab Ultra επιτρέπει τη µείωση των ηµερών του ορολογικού ή αρνητικού «παραθύρου» του αντισώµατος κατά 88 % (δηλαδή της διάρκειας κατά την οποία, µε κιτ ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV του εµπορίου, το δείγµα είναι θετικό σε HCV RNA και αρνητικό σε αντισώµατα anti HCV). Το πλεονέκτηµα αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη δυνατότητα ανίχνευσης του αντιγόνου του καψιδίου του HCV µε το κιτ Monolisa HCV Ag-Ab Ultra. Αντιγονική ευαισθησία Η εκτίµηση της ευαισθησίας στο αντιγόνο µπορεί να γίνει µε δοκιµή στα πάνελ οροµετατροπής του εµπορίου, για παράδειγµα στο πάνελ BBI 917. Στην καµπύλη αυτή µπορεί να γίνει σύγκριση της ευαισθησίας του κιτ Monolisa HCV Ag-Ab Ultra µε την ευαισθησία που παρέχει ένα τεστ ανίχνευσης αντισωµάτων anti HCV. 17

Ακρίβεια Η ακρίβεια της δοκιµής µε το Monolisa HCV Ag-Ab Ultra προσδιορίσθηκε µε ανάλυση 7 δειγµάτων: 1 δείγµα αρνητικό στα αντισώµατα του HCV, 3 δείγµατα θετικά στα αντισώµατα anti HCV και 3 δείγµατα θετικά στο Ag του HCV. Η επαναληψιµότητα (εντός της ίδιας δοκιµής) αξιολογήθηκε µε την ανάλυση των 7 αυτών δειγµάτων που δοκιµάσθηκαν 30 φορές µε την ίδια δοκιµή. Η αναπαραγωγιµότητα (σειρά δοκιµών) αξιολογήθηκε µε την ανάλυση των 7 ίδιων δειγµάτων που δοκιµάσθηκαν εις διπλούν επί 20 ηµέρες, µε δύο ανεξάρτητες δοκιµές ηµερησίως (διαδικασία NCCLS EP5). Τα αποτελέσµατα απεικονίζονται στους ακόλουθους πίνακες: Πίνακας 1: Επαναληψιµότητα κατά την ίδια δοκιµή Δείγµα Μέσος Λόγος ΤΥΠΙΚΗ ΑΠΟΚΛΙΣΗ (DS) Συντ. Μεταβ. (CV%) Αρνητικό Ag-Ac HCV 0.14 0.01 6.1 Ελαφρώς θετικό Ac HCV 1.12 0.04 3.65 Μετρίως θετικό Ac HCV 2.39 0.08 3.39 Έντονα θετικό Ac HCV 4.88 0.18 3.7 Ελαφρώς θετικό Ag HCV 1.14 0.03 3.04 Μετρίως θετικό Ag HCV 1.97 0.06 3.02 Έντονα θετικό Ag HCV 5.86 0.14 2.38 Οι συντελεστές µεταβολής (CV) των 6 θετικών δειγµάτων είναι µικρότεροι του 10 %. 18

Πίνακας 2: Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ δοκιµών Δείγµα Μέσος Λόγος ΤΥΠΙΚΗ ΑΠΟΚΛΙΣΗ (DS) Συντ. Μεταβ. (CV%) Αρνητικό Ag-Ac HCV 0.16 0.02 12.4 Ελαφρώς θετικό Ac HCV 1.2 0.08 6.65 Μετρίως θετικό Ac HCV 2.39 0.13 5.38 Έντονα θετικό Ac HCV 4.77 0.17 3.58 Ελαφρώς θετικό Ag HCV 1.13 0.09 7.97 Μετρίως θετικό Ag HCV 2.0 0.15 7.73 Έντονα θετικό Ag HCV 5.99 0.37 6.2 Οι συντελεστές µεταβολής των 6 θετικών δειγµάτων είναι µικρότεροι του 15 %. 14 - ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ Ένεκα της ποικιλίας ανοσολογικών αποκρίσεων των ασθενών που είναι προσβεβληµένοι από τον ιό της ηπατίτιδας C (κυρίως κατά την οροµετατροπή), µεταξύ δοκιµών (τεστ) ενδέχεται να παρατηρηθούν διαφορές στην ανίχνευση ανάλογα µε τη φύση των χρησιµοποιούµενων αντιγονικών πρωτεϊνών. Ένα αρνητικό αποτέλεσµα κατά τη δοκιµή ανίχνευσης δεν αποκλείει την πιθανότητα έκθεσης στον ή µόλυνσης από τον ιό της ηπατίτιδας C. Η χρωµατοµετρική µέθοδος επαλήθευσης της απόθεσης δείγµατος και/ή συζυγών και/ή διαλύµατος ανάπτυξης, δεν επιτρέπει έλεγχο της ακρίβειας των κατανεµηθέντων όγκων αλλά µόνο την υπόδειξη της ύπαρξης δείγµατος και/ή συζυγούς και/ή διαλύµατος ανάπτυξης. Το ποσοστό πλασµατικών αποτελεσµάτων που προκύπτουν µέσω της παρούσας µεθόδου έχει σχέση µε την ακρίβεια µέτρησης του χρησιµοποιούµενου συστήµατος (συσσωρευµένοι συντελεστές µεταβολής στην κατανοµή των υλικών και στην ανάγνωση των αποτελεσµάτων µεγαλύτεροι από 10% µπορεί να υποβαθµίσουν σηµαντικά την ποιότητα της επαλήθευσης). 15- ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ STEVENS C.E., AACH R.D., HOLLINGER F.B. et al MOSLEY J.W., SZMUNESS W., KAHN R., WERCH J., EDWARDS V. Hepatitis B virus antibody in blood donors and the occurrence of Non A Non B hepatitis in transfusion recipients : an analysis of the transfusion transmitted virus study. Ann. Int. Med. 1984 ; 101 : 733-738. ALTER H.J., PRINCE A.M. Transfusion associated Non A Non B hepatitis : An assessment of the causative agent and its clinical impact. Transfusion Med. Rev. 1988 ; 2 : 288-293. 19

Post transfusion Non A Non B hepatitis : physiochemical properties of two distinct agents. J. Infect Dis. 1983 ; 148 : 254-265. CHOO K.L., WEINER A.J., OVERBY L.R., KUO G., HOUGHTON M., BRADLEY D. Hepatitis C virus : the major causative agent of viral Non A Non B hepatitis. In : viral Hepatitis. Editor : AJ. ZUCKERMAN. CHURCHILL LIVINSTONE British Medical Bulletin. 1990, vol. 46 : 423-441. KUO G., CHOO Q.L., ALTER H.J., et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human Non A Non B hepatitis. Science 1989 ; 244 : 362-364. TAKEUCHI K., KUBO Y., BOOMAR S., WATANABE Y., KATAYAMA T., CHOO Q.L., KUO G., HOUGHTON M., SAITO I., MIYAMURA T. Nucleotide sequence of core and envelope genes of the hepatitis C virus genome derived directly from humans healthy carriers. Nucleic acid research. 1990 ; vol.18, n 15 : 4626. VAN DER POEL C.L., REESINK H.W., LELIE P.N., LEENTVARR-KUYPERS A., CHOO Q.J., KUO G., HOUGHTON M. Anti-Hepatitis C antibodies and Non A, Non B post transfusion hepatitis in the Netherlands. Lancet, 1989, 297-299. CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C., GALLEGOS C., COIT D., MEDINA-SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991 ; vol. 88 : 2451-2455. KATO N., MAKOTO M., OOTSUYAMA Y., NAKAGAWA M., SUGIMARA T., SHIMOTOHNO K.. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-a, non-b hepatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Dec. 1990, vol. 87: 9524-9528 NASOFF M.S., ZEBEDEE S.L., INCHAUSPE G., PRINCE A1.M. Identification of an immudominant epitope within the capsid protein of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, June 1991, vol. 88 : 5462-5466. CHING W.M., WYCHOWSKY C., BEACH M.J., WANG M., DAVIES C.L., CARL M., BRADLEY D.W., ALTER M.S., FEINSTONE S.M., WAI-KUO SMIM J.. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1992, vol. 89 : 3190-3194. 20

21

22

23