Εργαλεία γονιδιωματικής τροποποίησης Genome editing tools

Εργαλεία γονιδιωματικής τροποποίησης Genome editing tools Βασίλης Δουρής Μάθημα: Ανάλυση και αξιοποίηση νέων τεχνολογιών σε βιολογικά συστήματα 11 / 5 / 2015 Zheng Lab

Forward vs Reverse genetics Forward genetics: Από την παρατήρηση ενός φαινοτύπου στη μελέτη της γενετικής του βάσης (γονοτύπου) Reverse genetics: Η τροποποίηση ενός γονοτύπου (π.χ. γονιδιακής αλληλουχίας) και η ακόλουθη διερεύνηση της επίδρασης της αλλαγής αυτής στο φαινότυπο.

Προσεγγίσεις «αντίστροφης» γενετικής Η τροποποίηση της γενετικής / γενωμικής πληροφορίας μπορεί να πραγματοποιηθεί με διάφορους «συμβατικούς» τρόπους όπως: Τυχαία ή κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση και επιλογή Γενετικό ανασυνδυασμό / τροποποίηση Πλην όμως: Η μεθοδολογία είναι σχετικά επιτυχής σε μερικούς μόνο οργανισμούς «μοντέλα» μ (π.χ. χ ζύμη, δροσόφιλα,, ποντίκι) ) όπου η καθιερωμένη τεχνολογία το επιτρέπει. Απαιτούνται πολλαπλά στάδια επιλογής και η αποτελεσματικότητα συχνά δεν είναι υψηλή Η στόχευση είναι προβληματική ή και εντελώς τυχαία

Γονιδιωματική τροποποίηση Genome editing / engineering: μια ταχέως αναπτυσσόμενη και πολλά υποσχόμενη νέα τεχνολογία Είναι ένα είδος γενετικής τροποποίησης στο οποίο ένα τμήμα DNA εισάγεται, αντικαθίσταται ή απομακρύνεται από ένα γονιδίωμα με χρήση τεχνητά τροποποιημένων νουκλεασών που λειτουργούν ως «μοριακά ψαλίδια». Διαφέρει από την παραδοσιακή μεταλλαξιγένεση ή τη συμβατική γενετική Διαφέρει από την παραδοσιακή μεταλλαξιγένεση ή τη συμβατική γενετική τροποποίηση καθώς αποτελεί αληθινά «στοχευμένη» παρέμβαση στο γονιδίωμα in vivo.

Χρονολόγιο

Μοριακή βάση λειτουργίας Οι νουκλεάσες λά δημιουργούν δίκλωνες θραύσεις (DSBs double stranded d breaks) σε επιθυμητές θέσεις στο γονιδίωμα Οι ενδογενείς επισκευαστικοί μηχανισμοί του κυττάρου επάγονται ώστε να επισκευάσουν τη θραύση μέσω φυσικών διαδικασιών ομόλογου ανασυνδυασμού (homologous recombination - HR) και μη ομόλογης συγκόλλησης των άκρων (non homologous end-joining - NHEJ).

Τύποι γονιδιωματικής τροποποίησης Τροποποιημένες μεγανουκλεάσες λά Zinc-finger νουκλεάσες (ZFNs) TALENs (transcription-activator like effector nucleases) CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)???

Οι λιγότερο πρόσφατες εκδοχές...

...και η τελευταία μόδα (και βλέπουμε) CRISPR/Cas9 σύμπλοκο RNA-πρωτεΐνης

Περιεχόμενο μαθήματος Μηχανισμοί επιδιόρθωσης δό δίκλωνων θραύσεων Γονιδιωματική τροποποίηση η μέσω τροποποιημένων νουκλεασων CRISPR/Cas9 Πλεονεκτήματα, προβλήματα και προοπτικές Κάποιοι βιοηθικοί προβληματισμοί

Μηχανισμοί επιδιόρθωσης δίκλωνων θραύσεων Non homologous end-joining i (NHEJ) Χρησιμοποιεί μικρο-ομολογίες ήδη παρούσες στις εκτεθειμένες περιοχές εκατέρωθεν της θραύσης, χωρίς να απαιτεί την παρουσία αλληλουχίας «οδηγού» Είναι επιρρεπής σε σφάλματα επιδιόρθωσης, οδηγώντας συχνά σε μεταλλαγές, μικρο-ελλείψεις ή μικρο-εισδοχές. Ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) Λαμβάνει χώρα όταν είναι παρόν ένα ομόλογο τμήμα DNA (κυρίως στις φάσεις G2 και S του κυτταρικού κύκλου) Επιτρέπει την «σωστή» επιδιόρθωση χωρίς σφάλματα, με βάση την αλληλουχία «οδηγό».

Non-homologous end joining: NHEJ https://youtu.be/31stiofjjyw

Homologous recombination: HR https://youtu.be/86jcmm5kb2a

Από την «φυσική» επιδιόρθωση στην κατευθυνόμενη γονιδωματική τροποποίηση Η ύπαρξη DSB αυξάνει τη συχνότητα ανασυνδυασμού ~10 6 φορές

Είδη γονιδωματικής τροποποίησης που επιτυγχάνονται Γονιδιακή διάρρηξη (gene disruption) μέσω μικρο-εισδοχών ή μικρο-ελλείψεων (NHEJ) Εισδοχή (insertion) Εκτομή (deletion) Αναστροφή (inversion) Προσθήκη διαγονιδίου (gene addition) Τροποποίηση / επιδιόρθωση γονιδίου (gene modification / correction)

Αλλά με τι «μοριακά ψαλίδια» φτιάχνουμε DSBs;

1. Τροποποιημένες μεγανουκλεάσες Από το πλήθος των περιοριστικών ενδονουκλεασών που εντοπίζονται στη φύση (σε βακτήρια, αρχαία, μύκητες κλπ.) ) ορισμένες έχουν ιδιαίτερα μεγάλες αλληλουχίες αναγνώρισης (π.χ. 12 40 bp) και ενδεχομένως μπορούν να τροποποιηθούν κατάλληλα τεχνητά, έτσι ώστε η αλληλουχία αναγνώρισης να ταιριάζει σε επιθυμητές εφαρμογές

Αν και ορισμένες τροποποιημένες μεγανουκλεάσες έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη στόχευση περιοχών για γονιδιακή αντικατάσταση και άλλες εφαρμογές, γενικά αποτελούν μια δύσχρηστη επιλογή, καθώς: ο αριθμός των αλληλουχιών που μπορούν να στοχεύσουν είναι μικρός το κόστος κατασκευής τροποποίησης ης είναι υψηλό Πολύ λίγα εργαστήρια τις χρησιμοποιούν αποτελεσματικά

2. Zinc-finger νουκλεάσες (ZFNs) Αποτελούνται από DNA-προσδεόμενα στοιχεία (DNA-binding modules) που προέρχονται από φυσικούς μεταγραφικούς παράγοντες (transcription factors - TFs) τα οποία διασυνδέονται με την επικράτεια νουκλεάσης (nuclease domain) του περιοριστικού ρ ενζύμου τύπου IIS, FokI. Κάθε στοιχείο αναγνωρίζει μια τριπλέτα βάσεων DNA. Η επικράτεια νουκλεάσης πρέπει να διμεριστεί ώστε να δράσει και να κόψει το DNA, οπότε απαιτούνται δύο μόρια ZFN για να στοχεύσουν μία μοναδική θέση.

Η επικράτεια αποκοπής (cleavage domain) της Fok I Η Fok I είναι ένα περιοριστικού ενζύμου τύπου IIS, δηλαδή μιας κατηγορίας ενζύμων που κόβουν σε μια ορισμένη απόσταση από την αλληλουχία αναγνώρισης. Μετά από πειράματα πρωτεόλυσης αποδείχθηκε ότι η ενεργότητα αναγνώρισης της αλληλουχίας του DNA και η ενεργότητα αποκοπής του βρίσκονται σε διαφορετικά πρωτεϊνικά θραύσματα, δηλαδή σε διαφορετικές επικράτειες (domains) της Fok I. Αποδείχθηκε ακόμα ότι αν στην επικράτεια αποκοπής της Fok I προσδεθεί μια διαφορετική επικράτεια αναγνώρισης DNA, η νέα «ανασυνδυασμένη» πρωτεΐνη έχει πλέον την νέα ειδικότητα αναγνώρισης. Μ ό ό θέ ά ή F k I Μ αυτό τον τρόπο, προσθέτοντας στην επικράτεια αποκοπής της Fok I την κατάλληλη επικράτεια αναγνώρισης, μπορούμε να κατασκευάσουμε νέες πρωτεΐνες που κόβουν θεωρητικά όποια αλληλουχία DNA επιθυμούμε.

Πώς κατασκευάζουμε μια de novo επικράτεια αναγνώρισης DNA; Μέσω δαχτύλων ψευδαργύρου (zinc-finger) τύπου C 2 H 2 Κάθε δάχτυλο αποτελείται από ~30 α/α κι έχει μια χαρακτηριστική δομή με μία α-έλικα και δύο μικρά β-πτυχωτά φύλλα Τα κατάλοιπα στις θέσεις -1, 3 και 6 (και λιγότερο 2) ως προς την αρχή της έλικας είναι κυρίως υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση με το DNA. Κάθε δάχτυλο αναγνωρίζει (περίπου...) 3 βάσεις DNA

Πώς κατασκευάζουμε μια de novo επικράτεια αναγνώρισης DNA; Απαιτούνται τουλάχιστον τρία δάχτυλα για επαρκή ικανότητα πρόσδεσης Τα δάχτυλα ψευδαργύρου αφθονούν σε ευκαρυωτικούς μεταγραφικούς παράγοντες με συγκεκριμένη ρμ ειδικότητα αναγνώρισης αλληλουχίας DNA, και αρκετά νέα έχουν συντεθεί με πρωτεϊνικό σχεδιασμό. Συνδυάζοντας δάχτυλα με ειδικότητα για διαφορετικές τριπλέτες μπορεί κανείς να κατασκευάσει συνθετικές ZFNs με επιθυμητή αλληλουχία αναγνώρισης (9-12 bp DNA ανά μοναδική ZFN, 18-24 bp συνολικά). Ειδικές εταιρίες αναλαμβάνουν το σχεδιασμό και την κατασκευή ZFNs με σχετικά προσιτό κόστος (~6.000 $ / πρωτεΐνη)

Γονιδιωματική τροποποίηση με ZFNs Ιδιαίτερα επιτυχής σε πληθώρα γονιδίων και οργανισμών (κυρίως ί την περασμένη δεκαετία) )

Γονιδιωματική τροποποίηση με ZFNs ναι μεν, αλλά... Οι ZFNs δεν είναι πάντα ενεργές (unreliable) Και όταν είναι ενεργές, δεν είναι πάντα ειδικές (off-target effects) Και δεν είναι όλο το γονιδίωμα προσβάσιμο, διότι υπάρχουν αλληλουχίες για τις οποίες δεν μπορεί να συντεθεί ZFN Άρα υπάρχει πρόβλημα «ευκρίνειας» (resolution) στη μεθοδολογία Καμμιά καλύτερη ιδέα;

3. Transcription-activator activator like effector nucleases (TALENs) Αποτελούνται από DNA-προσδεόμενα στοιχεία (DNA-binding modules) που προέρχονται από πρωτεΐνες TALE (transcription-activator like effectors) που έχουν βρεθεί σε βακτήρια του γένους Xanthomonas. Όπως στις ZFNs, τα στοιχεία διασυνδέονται με την επικράτεια νουκλεάσης (nuclease domain) της Fok I. Κάθε στοιχείο αναγνωρίζει μια μοναδική βάση DNA. Η επικράτεια νουκλεάσης πρέπει να διμεριστεί ώστε να δράσει και να κόψει Η επικράτεια νουκλεάσης πρέπει να διμεριστεί ώστε να δράσει και να κόψει το DNA, οπότε όπως και στις ZFN απαιτούνται δύο μόρια TALEN για να στοχεύσουν μία μοναδική θέση.

Πώς γίνεται η αναγνώριση DNA μέσω στοιχείων TALE; Οι πρωτεΐνες TALE είναι μεταγραφικοί ενεργοποιητές που έχουν βρεθεί μοναδικά σε φυτοπαθογόνα βακτήρια του γένους Xanthomonas και που αναγνωρίζουν το DNA μέσω διαδοχικών επαναλήψεων μιας συντηρημένης δομής ~34 α/α με αντιπαράλληλες α-έλικες. Τα κατάλοιπα στις θέσεις 12, 13 ως προς την αρχή της έλικας βρίσκονται ανάμεσα στις έλικες, δεν είναι συντηρημένα και είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση με το DNA (γίνεται μέσω του 13).

Πώς γίνεται η αναγνώριση DNA μέσω στοιχείων TALE; Τα κατάλοιπα στις θέσεις 12, 13 (repeat variable diresidues) διαφέρουν φρ ανάλογα με τη βάση DNA που αναγνωρίζει το συγκεκριμένο TALE Από τη στιγμή που καθιρίστηκε ο παραπάνω «κώδικας», η κατασκευή νουκλεασών αντίστοιχων με τις ZFNs αλλά με επιθυμητή αλληλουχία αναγνώρισης που να καθορίζεται ρζ από TALEs κατέστη ήταν πλέον ένα βήμα μακριά.

Πώς κατασκευάζεται ένα TALEΝ; Συνδυάζοντας ~15-18 επαναλήψεις TALEs με συγκεκριμένη ειδικότητα αλληλουχίας DNA, μπορεί κανείς να κατασκευάσει συνθετικές TALENs με επιθυμητή αλληλουχία αναγνώρισης (15-18 bp DNA ανά μοναδικό TALEN, 30-36 bp συνολικά). Απαιτείται λίγο περισσότερη αλληλουχία (9-12 bp) μεταξύ του πρώτου TALE αναγνώρισης (που πρέπει να αντιστοιχεί σε Τ) ) και της επικράτειας αποκοπής της Fok I. Αν και η κατασκευή τους δεν είναι ιδιαίτερα εύκολη, ειδικές εταιρίες και ακαδημαϊκές εγκαταστάσεις αναλαμβάνουν το σχεδιασμό και την κατασκευή TALENs με προσιτό κόστος (~1500-5000 $ / πρωτεΐνη)

Γονιδιωματική τροποποίηση με TALENs ναι μεν... Οι TALENs είναι σχεδόν πάντα ενεργές (reliable) Έχουν μεγαλύτερη εξειδίκευση από τις ZFNs δεδομένου ότι αναγνωρίζουν μεγαλύτερη περιοχή (λιγότερα offtarget effects) Η ευκρίνεια της μεθόδου είναι κατά πολύ ανώτερη των ZFN, καθώς οι TALENs μπορούν να στοχεύσουν σχεδόν παντού με ακρίβεια. Έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε πολλές περιπτώσεις μετά το 2010 Είναι πολύ περισσότερο προσβάσιμες (λόγω χαμηλότερου κόστους και έλλειψης πατέντας)

...αλλά στο μεταξύ κάτι συνέβη

CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats Ένας μηχανισμός επίκτητης ανοσίας που βρίσκεται σε βακτήρια και αρχαία

Το (αρχαι-)βακτήριο «αναγνωρίζει» τμήματα ξένου (ιικού) DNA μέσω ειδικών μικρών RNA που μεταγράφονται από επαναλήψεις CRISPR και τα απενεργοποιεί μέσω της έκφρασης ειδικών πρωτεϊνών Cas (CRISPR-associated proteins)

Το απλοποιημένο σύστημα CRISPR/Cas9 τύπου ΙΙ στο Streptococcus pyogenes Απαιτούνται μόνο τρία συστατικά: δύο μικρά RNA (tracrrna & crrna) και μια πρωτεΐνη, η νουκλεάση Cas9, που λειτουργούν σαν σύμπλοκο RNA-πρωτεΐνης

Το απλοποιημένο σύστημα CRISPR/Cas9 τύπου ΙΙ στο Streptococcus pyogenes Το σύμπλοκο RNA-πρωτεΐνης αναγνωρίζει ορισμένη αλληλουχία DNA που είναι συμπληρωματική με μια αλληλουχία ~20 bp στο crrna και βρίσκεται ανοδικά από την αλληλουχία PAM (protospacer adjacent motif, συνήθως NGG) Το σύμπλοκο δρώντας ως νουκλεάση, κόβει το DNA και στους δύο κλώνους, σε μια θέση 3 bp ανοδικά του PAM (RuvC ή HNH ανάλογα με τον κλώνο). Έτσι δημιουργείται μια δίκλωνη θραύση (DSB)

Βάζοντας το σύστημα CRISPR/Cas9 να δουλέψει για λογαριασμό ασ μας... Ένωση των δύο RNA σε ένα μοναδικό μόριο οδηγό (single guide RNA, sgrna)......του οποίου την αλληλουχία αναγνώρισης μπορούμε να τροποποιήσουμε κατά το δοκούν ώστε να ταιριάζει με οποιοδήποτε σημείο του γονιδιώματος θέλουμε να στοχεύσουμε.

...και να παράγει DSBs που θα χρησιμοποιηθούν για την ενεργοποίηση ερ οίηση των γνωστών σώ μηχανισμών ηα σώ επιδιόρθωσης και των γνωστών εφαρμογών... CRISPR/Cas9: https://www.youtube.com/embed/2pp17e4e-o8

Τροποποιημένες Cas9 με κάπως διαφορετικές ιδιότητες Nickase: Μεταλλαγές που κόβουν μόνο τον ένα κλώνο (δηλ. δημιουργούν nicks ) Fok I Ειδικές νουκλεάσες που προάγουν την επιδιόρθωση μέσω HR (ομόλογου ανασυνδυασμού) έχοντας λιγότερα off-target effects.

normal Cas9 nickase

normal Cas9 fused Cas9

Και γιατί να προτιμήσουμε CRISPR/Cas9; Κόστος: απαιτεί μόνο τη σύνθεση ενός μικρού sgrna για να έχεις την ιδεατή νουκλεάση. Αναλογικά, ένα τυπικό TALEN απαιτεί την κατασκευή δύο νέων κωδικών αλληλουχίών λ με επαναλήψεις περίπου 1,8001 bp για κάθε στόχο.το αντίστοιχο CRISPR απαιτεί μόνο 20 βάσεις με ελάχιστο κόστος. Απλότητα: Για το σχεδιασμό απαιτείται μόνο η γνώση του μοντέλου Watson-Crick (Α:Τ, C:G) και όχι αναγνώριση πρωτεΐνης-dna. Αρκεί η πληροφορία από τη γονιδιωματική αλληλουχία ώστε να στοχεύσουμε οπουδήποτε. Αποτελεσματικότητα: Αρκεί να εισάγει κανείς κάποια RNA σε αναπτυσσόμενα έμβρυα αποφεύγοντας τις χρονοβόρες και επίπονες διαδικασίες ελέγχου, και μπορεί να πετύχει γενετικό ανασυνδυασμό σε οποιοδήποτε είδος, μοντέλο ή όχι, καθώς το σύστημα είναι αυτόνομο και δεν απαιτεί παράγοντες του οργανισμού. Πολλαπλή στόχευση: Μπορεί κανείς να εισάγει μεταλλαγές σε πολλά γονίδια σε Πολλαπλή στόχευση: Μπορεί κανείς να εισάγει μεταλλαγές σε πολλά γονίδια σε ένα μόνο πείραμα χρησιμοποιώντας διαφορετικά grnas, επιτρέποντας την ταυτόχρονη σε βάθος ανάλυση πολύπλοκων μονοπατιών και διαδικασιών.

Ένα παράδειγμα από τη Δροσόφιλα (unpublished data) [ ] a minimal two-component system required for the sitespecific cleavage of DNA: Cas9 and a chimeric RNA (chirna) comprising the crrna and tracrrna from S. pyogenes (Jinek et al. 2012).

Σχεδιασμός sgrna στόχων S. Baijda, W. Dermauw

Πειραματική διαδικασία Μίγμα τριών πλασμιδίων [sgrna (100 ng/µl έκαστο), donor (500 ng/µl)]. Ένεση σε ~700 έμβρυα Δροσόφιλας (στέλεχος που εκφράζει ενδογενώς Cas9) ~220 προνύμφες μεταφέρονται σε τροφή ~105 ενηλικα επιβιώνουν, 100 διασταυρώνονται, 70/100 δίνουν απογόνους. ds DNA donor (σημαντική συμμετοχή: Γιάννης Λιβαδάρας IMBB/ΙΤΕ)

Έλεγχος προϊόντων PCR με διαγνωστική πέψη VASA A not cut M54 with HR M57 with HR plasmid GeneRuller 100 bp Plus Expected bands 343 216 Aris Ilias

Επιβεβαίωση παρουσίας νέου αλληλομόρφου σε mrna RNA extraction m 1 2 cdna synthesis PCR Digest with FspI (cuts mutant allele) m: marker 1: 57/FM7 2: FM7/FM7 Electra Vitsaki

Δημιουργία στελέχους με νέο αλληλόμορφο (=νέες ιδιότητες; ) 1 0 ] re l. complex I+II II activity [v v 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 wild type 57/FM7 0.0 11 10 9 8 7 log conc. fenpyroximate Peter Lumen, Bayer Cropscience

Τι έχει γίνει* με CRISPR/Cas9; * από το 2012 και μετά

Τι άλλο μπορεί να κάνει κανείς; Doudna: https://www.youtube.com/watch?t=919&v=suaxdvbt7kq

Είναι όλα εντάξει; Όλες οι τεχνολογίες γονιδιωματικής τροποποίησης (και ειδικότερα το CRISPR/Cas) παρέχουν εναλλακτικές μεθόδους για τη διερεύνηση ερωτημάτων «αντίστροφης» γενετικής σε σχέση με τις παραδοσιακές μεθόδους γονιδιακής στόχευσης, χωρίς ρς ωστόσο να είναι απαλλαγμένες από περιορισμούς όπως: Αστοχίες (Off-target effects). Οι μεταλλαγές που εισάγονται σε μη ειδικές θέσεις με παρόμοια (αλλά όχι ταυτόσημη) ) αλληλουχία λ με τις θέσεις στόχευσης είναι η πιο σημαντική επιπλοκή αυτών των τεχνολογιών. Συχνά μάλιστα είναι δύσκολο να ανιχνευτούν τυχόν αστοχίες και απαιτείται σάρωση όλου του γονιδιώματος. Μωσαϊκισμός. Είναι δυνατόν να παραχθούν οργανισμοί με το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε μερικά μόνο από τα κύτταρά τους, αν οι νουκλεάσες δεν έχουν δράσει από την αρχή της εμβρυικής ανάπτυξης (στάδιο ενός κυττάρου). Πολλαπλά αλληλόμορφα. Η επιδιόρθωση της θραύσης που προκαλείται από τη νουκλεάση με το μηχανισμό της μη ομόλογης συγκόλλησης των άκρων ενδέχεται να προκαλέσει απογόνους με διαφορετικές μεταλλαγές από τις ίδιες κατασκευές στόχευσης, και να απαιτήσει γονιδιωματική αλληλούχιση η ώστε να καθοριστεί το είδος της κάθε μεταλλαγής. Επίσης μπορεί να παραχθούν απόγονοι με μωσαϊκισμό διαφορετικών μεταλλαγών, πράγμα που μπορεί να περιπλέξει αρκετά την ανάλυση των φαινοτύπων..

Μέχρι πού μπορούμε να φτάσουμε με τη γονιδιωματική τροποποίηση; η???

Prudent: Συνετός, νουνεχής

Εσείς τι λέτε;

Για διάβασμα (όχι για εξετάσεις) Gaj T, Gersbach CA, Barbas III CF (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 31(7): 397-405 Segal DJ and Meckler JF (2013) Genome Engineering at the Dawn of the Golden Age. Annu. Rev. Genom. Human Genet. 14:135-158 Carrol D. (2014) Genome Engineering with Targetable Nucleases. Annu. Rev. Biochem. 83:409-439 Gersbach CA (2014) Genome engineering: the next genomic revolution Nature Methods 11(10): 1009-1011 Doudna JA and Charpentier E (2014) The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346, 1258096, DOI: 10.1126/science.12580961126/ 1258096