ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ. Κ.Ε. Κεραµάρης ρ. Βιολόγος Κλινικός Βιοχηµικός

Transcript

1 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Κ.Ε. Κεραµάρης ρ. Βιολόγος Κλινικός Βιοχηµικός

2 Τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA

3 ΠΛΑΣΜΙ ΙΑ Αποτελούν δίκλωνα κυκλικά µόρια DNA µε διάφορα µεγέθη. Περιέχουν το 1-2 % του βακτηριακού DNA και αντιγράφονται ανεξάρτητα από το κύριο µόριο DNA του βακτηρίου. Στο πλασµίδιο εντοπίζονται γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά και γονίδια µεταφοράς γενετικού υλικού. Ανταλλάσουν γενετικό υλικό µεταξύ τους και µε το χρωµοσωµικό βακτηριακό DNA.

4 Τα πλασµίδια διαθέτουν είναι κατάλληλοι φορείς ανασυνδυασµένου DNA γιατί έχουν τις εξής ιδιότητες: α) µικρό µέγεθος, β) γονίδιο-θέση oric, γ) γονίδια-δείκτες (ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά), δ) περιοριστικές θέσεις

5

6 ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝ ΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ Aac65 I G GTACC Alu I AG CT Bam HI G GATCC Bgl II A GATCT Cla I AT CGAT Eco RI G AATTC Eco RII CC(A/T)GG Hae III GG CC Hin dii GTPy PuAC Hin diii A AGCTT Hpa II C CGG Kpn I GGTAC C Mbo I GATC Not I GC GGCCGC Nst I ATGCA T Pst I CTGCA G Pvu I CGAT CG Sac I GAGCT C Sal I G TCGAC Sma I CCC GGG Xma I C CCGGG Οι ενδονουκλεάσες είναι ένζυµα που απατούνται φυσιολογικά στα βακτηριακά κύτταρα και ο προορισµός τους είναι να προφυλάσσουν τα κύτταρα από την καταστροφή τους λόγω µόλυνσης από ξένο DNA (πχ φαγικό). Οι σειρές των βάσεων που αναγνωρίζονται από τις ενδονουκλεάσες ονοµάζονται περιοριστικές θέσεις. Επειδή, οι ίδιες περιοριστικές θέσεις υπάρχουν και στο DNA του ξενιστή, αυτές προστατεύονται µε µεθυλίωση. Αν η περιοριστική θέση είναι µεθυλιωµένη και στις δύο αλυσίδες δεν αναγνωρίζεται από το ένζυµο. Αν είναι µεθυλιωµένη η µία αλυσίδα το ένζυµο δρα ως µεθυλάση και µεθυλιώνει και τη δεύτερη αλυσίδα. Στην κατηγορία αυτή των ενζύµων τύπου Ι (ενδονουκλεάσες υπεύθυνες γαι τον περιορισµό του DNA φάγων) ανήκουν η EcoK και EcoB που αποµονώθηκαν από το E. coli. Η κατηγορία τύπου ΙΙ των ενζύµων, όπου ανήκουν όλες οι υπόλοιπες ενδονουκλεάσες, δεν εµφανίζουν δράση ΑΤΡάσης ή µεθυλάσης.

7 ράση περιοριστικού ενζύµου EcoRI

8 Μια θέση περιορισµού µε 6 νουκλεοτίδια µπορεί να υπάρχει µε πιθανότητα 1/4096 (1/4Χ1/4Χ1/4Χ1/4Χ1/4Χ1/4), ενώ µια θέση µε 4 νουκλεοτίδια µπορεί να υπάρχει µε πιθανότητα 1/256.

9 ράση DNA δεσµάσης

10

11 Γενετικοί δείκτες

12

13

14

15 Aλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR)

16 Αρχές και µεθοδολογία της Βιοτεχνολογίας

17 Ο όρος βιοτεχνολογία χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Ούγγρο Kark Ereky το 1919, για να περιγράψει τη «διαδικασία παραγωγής προϊόντων από ακατέργαστα υλικά µε τη βοήθεια ζωντανών οργανισµών».

18 Βιοτεχνολογία: αποτελεί συνδυασµό Επιστήµης και Τεχνολογίας µε στόχο την εφαρµογή των γνώσεων που έχουν αποκτηθεί από µελέτη των ζωντανών οργανισµών για την παραγωγή σε ευρεία κλίµακα χρήσιµων προϊόντων. Βιοτεχνολογία: είναι η χρήση ζωντανών οργανισµών προς όφελος του ανθρώπου. Η Βιοτεχνολογία στηρίζεται κυρίως σε τεχνικές καλλιέργειας και ανάπτυξης των µικροοργανισµών και σε τεχνικές ανασυνδυασµένου DNA.

19

20 Βιοτεχνολογία περιλαµβάνει την χρήση ζωντανών οργανισµών (ή προϊόντων τους) ή βιολογικών συστηµάτων-αντιδράσεων για την παραγωγή αγαθών, την εφαρµογή τεχνικώνin vitro χειρισµού ή ανασυνδυασµού νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA), τεχνικών σύντηξης, κλωνοποίησης κυττάρων εκτός της ταξινοµικής οικογένειας που ξεπερνά τα φυσικά, φυσιολογικά ή αναπαραγωγικά όρια και δεν είναι τεχνικές που χρησιµοποιήθηκαν στην κλασική βελτίωση και επιλογή.

21

22

23 Τα βακτήρια είναι µονοκύτταροι οργανισµοί 1 βακτήριο = 1 κύτταρο = 1 αυτόνοµος οργανισµός

24

25 Μικροβιακές καλλιέργειες Ο ρυθµός ανάπτυξης ενός πληθυσµού µικροοργανισµών καθορίζεται από το χρόνο διπλασιασµού. Οι παράγοντες που επηρεάζουν το χρόνο διπλασιασµού είναι η διαθεσιµότητα θρεπτικών συστατικών, το ph, το O 2 και η θερµοκρασία.

26

27

28 Η καλλιέργεια σε βιοµηχανική κλίµακα γίνεται στους ζυµωτήρες ή βιοαντιδραστήρες. Με απόλυτο έλεγχο των συνθηκών, σε φτηνές πηγές άνθρακα, όπως η µελάσα (παραπροϊόν επεξεργασίας καλαµοσάκχαρου ή σακχαρότευτλων), η καλλιέργεια ξεκινά µε εµβολιασµό. Με τον όρο ζύµωση εννοούµε τη διαδικασία ανάπτυξης µικροοργανισµών σε υγρό θρεπτικό υλικό κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες. Τα προϊόντα της ζύµωσης είναι είτε τα ίδια τα κύτταρα που ονοµάζονται βιοµάζα είτε προϊόντα των κυττάρων όπως πρωτεΐνες και αντιβιοτικά.

29 Ζύµωση στερεάς φάσης στο εργαστήριο

30 Τι είναι Βιοαντιδραστήρες Βιοαντιδραστήρες είναι κατασκευές στις οποίες επιτελούνται βιοµηχανικές διεργασίες υλικών µε τη δράση ζωντανών κυττάρων (π.χ. µικροοργανισµών) ή ενζύµων. Οι βιοαντιδραστήρες διακρίνονται σε: σε εκείνους όπου γίνονται ζυµώσεις µε ζωντανά κύτταρα και σε αυτούς που επιτελούνται διεργασίες µε χρήση βιολογικών συστηµάτων, π.χ. ένζυµα

31 Ζυµωτήρας Paddle Mixer (Αναµίκτης πτερυγίων)

32

33

34 Σχεδιασµός Βιοαντιδραστήρα Να αποκλείεται η µόλυνση Ο όγκος της καλλιέργειας να παραµένει σταθερός. Στις αερόβιες διαδικασίες η συγκέντρωση του διαλυµένου οξυγόνου πρέπει να είναι ανώτερη από το κρίσιµο επίπεδο αερισµού και ανάδευσης των καλλιεργειών. Οι περιβαλλοντικές παράµετροι (θερµοκρασία, ph, κλπ) πρέπει να ελέγχονται µε ειδικά όργανα. Η καλλιέργεια πρέπει να αναµιγνύεται πλήρως και οµοιογενώς.

35

36 Χρήση Μικροοργανισµών στη Βιοτεχνολογία Βιοαντιδραστήρες για παραγωγή προϊόντων Παρασκευή εµβολίων και αντιβιοτικών Παραγωγή γενετικά τροποποιηµένων φυτών και ζώων Βιο-αποικοδόµηση και αποκατάσταση περιβάλλοντος

37

38 Παραγωγή αλκαλοειδών, νουκλεοτιδίων και στεροειδών Φαρµακολογικώς ενεργά αλκαλοειδή παράγονται από µύκητες Claviceps σε βιοαντιδραστήρες. Αν και ο χηµικός τρόπος σύνθεσης τους είναι πολύπλοκος, η παραγωγή τους από µικροοργανισµούς σε βιοαντιδραστήρες είναι εύκολη και υψηλών αποδόσεων, 5g / λίτρο. Νουκλεοτίδια και νουκλεοζίτες (GMP, IMP (inosine 5'- monophosphate), XMP (xanthosine 5'-monophosphate)) παράγονται βιοµηχανικά από µικροοργανισµούς, χρησιµοποιούνται κυρίως ως πρόσθετα τροφών, π.χ. 300 τόνοι GMP, IMP παράγονται στην Ιαπωνία. ιάφορα στεροειδή παράγονται κατά ανάλογο τρόπο, τα περισσότερα από αυτά χρησιµοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς, π.χ. οιστρογόνα, προγεστερόνη, ανδρογόνα, αντισυλληπτικά, κορτιζόνη, καταπραϋντικά, αντικαρκινικά, αντιφλεγµονώδη, κά

39 Καθαρισµός και παραλαβή προϊόντων Ο καθαρισµός του προϊόντος που παραλαµβάνεται από το βιοαντιδραστήρα. Αρχικά γίνεται διαχωρισµός των υγρών από τα στερεά συστατικά και τα κύτταρα, συνήθως µε διήθηση ή φυγοκέντρηση. Το επιθυµητό προϊόν µπορεί να βρίσκεται στα υγρά ή στα στερεά συστατικά, από όπου παραλαµβάνεται µε κατάλληλες µεθόδους.

40 Βιοτεχνολογικές εφαρµογές των µικροοργανισµών 1. Παραγωγή κυττάρων παραγωγή πρωτεϊνών, εµβολίων. 2. Παραγωγή ενώσεων χαµηλού µοριακού βάρους, πρωτογενείς µεταβολίτες, δευτερογενείς µεταβολίτες, µετατροπή οργανικών ενώσεων. 3. Παραγωγή ενώσεων υψηλού µοριακού βάρους, πολυσακχαρίτες, λιπίδια, πρωτεΐνες. 4. ιαδικασίες εξαρτώµενες από το µεταβολισµό του µικροοργανισµού, βιοαποικοδόµηση / οξείδωση αποβλήτων και απορριµµάτων, εκχύλιση µετάλλων.

41 Παραδείγµατα εφαρµογών µικροοργανισµών Bacillus thuringiensis: Μικροβιακά εντοµοκτόνα Lactobacillus sp: Αρχικές καλλιέργειες για τη ζύµωση γαλακτοκοµικών προϊόντων. Streptococcus cremoris: βιοµηχανοποίηση γαλακτοκοµικών προϊόντων Penicillium roqueforti: Εµβολιάσµατα για την παραγωγή τυριών Rhizobium sp.: Εµβολιάσµατα που προάγουν την καθήλωση του αζώτου Pseudomonas syrigae: ηµιουργία τεχνητού χιονιού. Μεταλλαγµένα στελέχη για προστασία των φυτών από τους παγετούς

42

43 Στελέχη τα οποία έχουν επιλεγεί για την υψηλή απόδοσή τους, καλλιεργούνται αρχικά στο εργαστήριο σε στερεό θρεπτικό µέσο. Στη συνέχεια, τα στελέχη αυτά χρησιµοποιούνται ως αρχική καλλιέργεια για ανάπτυξη σε βιοαντιδραστήρα. Το θρεπτικό υλικό περιέχει γλυκόζη ως πηγή άνθρακα, πρωτεΐνη σόδα ως πηγή αζώτου, καθώς και ιόντα όπως φωσφορικά και ασβέστιο. Στα αρχικά στάδια της καλλιέργειας (λανθάνουσα, εκθετική), που διαρκούν ώρες αυξάνεται η βιοµάζα του µύκητα. Στη συνέχεια προστίθεται γλυκόζη σε χαµηλή συγκέντρωση, σταµατάει η ανάπτυξη του µύκητα (στατική φάση) και αρχίζει η παραγωγή της πενικιλίνης. Η καλλιέργεια διαρκεί έως 15 ηµέρες.

44 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΤΑΜΙΝΩΝ

45 Παραγωγή Αρωµατικών Ουσιών Αρωµατικές ουσίες είναι τα συστατικά που είναι πτητικές ενώσεις και απαντώνται στις τροφές και στα αρώµατα δίνοντας χαρακτηριστική οσµή. Οι αρωµατικές ουσίες είναι φυσικές αν προέρχονται από φυσικά προϊόντα. Σήµερα αρωµατικές ουσίες παράγονται από µικροοργανισµούς. Βανιλλίνη: Φυσική, από τον καρπό της βανίλλιας (~ $4,000/kg) Παρασκευή µε ζύµωση φυσικών προϊόντων (π.χ. στιλβένιο, ευγενόλη) (~ $1,000/kg) Παρόµοια µε τη φυσική, παράγεται όµως από µικροοργανισµούς (~ $12/kg)

46 Αρωµατικές ύλες και παραγωγή τυριών Κατά την ωρίµανση τυριών χρησιµοποιούνται καθαρές καλλιέργειες βακτηρίων π.χ. Brevibacterium, Microbacterium µε πλήθος οσµηρών συστατικών, όπως λιπαρά οξέα, αλκοόλες, µεθυλοκετόνες και κυκλικές ενώσεις. Η εµφάνιση του χρώµατος συνδέεται συχνά µε τη δράση ενζύµων όπως λιπάσες και πρωτεάσες. Οι συγκεντρώσεις των προϊόντων αποικοδόµησης των ενζύµων αυτών καθορίζουν το άρωµα της κάθε ποικιλίας τυριού Π.χ. Penicillium roqueforti προσδίδει χαρακτηριστικό άρωµα τυριού τύπου ροκφόρ.

47

48

49

50

51

52 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ

53 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ

54 Ποια είναι τα βλαβερά Συστατικά των αστικών λυµάτων; Τα ογκώδη στερεά αντικείµενα Η άµµος Τα µικρού µεγέθους στερεά που αιωρούνται τα παραπάνω προκαλούν αισθητική δυσαρέσκεια παρά ουσιαστική ρύπανση του υδάτινου φορέα Τα οργανικά-φυσικά συστατικά (π.χ. υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, λίπη. Οι ουσίες αυτές είναι οι περισσότερο υπεύθυνες για τις δυσάρεστες καταστάσεις ρύπανσης) Οι παθογόνοι µικροοργανισµοί (ευθύνονται για τη µετάδοση ασθενειών στον άνθρωπο και σε άλλους οργανισµούς) Τα θρεπτικά στοιχεία (φωσφόρος, άζωτο που προκαλούν ευτροφισµό).

55 Βαθµός Στάδια Καθαρισµού Πρωτοβάθµιος Καθαρισµός Αποµακρύνει: Τα ογκώδη στερεά, την άµµο και τα αιωρούµενα στερεά ευτεροβάθµιος (βιολογικός) Καθαρισµός Αποµακρύνει: Τα οργανικά συστατικά και τους παθογόνους µικροοργανισµούς Τριτοβάθµιος Καθαρισµός Αποµακρύνει: Τα θρεπτικά συστατικά (φωσφόρος,άζωτο)

56

57 Απολύµανση Αποβλήτων Για ποιο λόγο γίνεται; Για την καταστροφή των παθογόνων µικροοργανισµών, ώστε η διάθεση των λυµάτων σε υδάτινους αποδέκτες, να είναι ακίνδυνη για τη δηµόσια υγεία. Ποιοι είναι οι σηµαντικότεροι τρόποι απολύµανσης; α) Χλωρίωση (αέριο χλώριο, NaClO, διοξείδιο του χλωρίου) β) Έκθεση σε Υπεριώδη Ακτινοβολία (U.V.) γ) Οζόνωση (παραγωγή όζοντος από ατµοσφαιρικό αέρα ή οξυγόνο)

58 ιάσπαση πετρελαιοκηλίδων

59 Human Genome Project - Πρόγραµµα ανθρώπινου γονιδιώµατος ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΛΕΠΤΟΜΕΡΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΧΑΡΤΩΝ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ ΑΛΛΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΗΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ

60

61

62 Αξίζει να σηµειωθεί ότι 233 ανθρώπινα γονίδια εµφανίζουν ισχυρές οµοιότητες µε αντίστοιχα βακτηριακά, χωρίς να συναντώνται σε άλλους οργανισµούς (οριζόντια µεταφορά γονιδίων).

63

64 To πρόγραµµα του ανθρώπινου γονιδιώµατος Προσδιορισµός γονιδίων που σχετίζονται µε ασθένειες Σύγκριση γονιδιωµάτων διαφορετικών οργανισµών Σύγκριση γονιδιωµάτων διαφορετικών οµάδων πληθυσµών Οργάνωση του γονιδιώµατος, ποσοστό δοµικών και ρυθµιστικών γονιδίων, ποσοστό επαναλαµβανόµενων αλληλουχιών Προσδιορισµός λειτουργίας γονιδίων Παραγωγή προϊόντων

65 Εφαρµογές της Βιοτεχνολογίας στη γεωργία και την κτηνοτροφία

66 Σήµερα είναι επιτακτική η ανάγκη για την βελτίωση της φυτικής και ζωικής παραγωγής Για το σκοπό αυτό γίνεται: Επιλογή φυτών και ζώων που έχουν συγκεκριµένα χαρακτηριστικά, όπως φυτά µε µεγάλο µέγεθος καρπών, µε ανθεκτικότητα σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες ή ζώα που παράγουν µεγάλη ποσότητα κρέατος. ιασταύρωση των οργανισµών αυτών µε σκοπό τη δηµιουργία απογόνων µε επιθυµητά χαρακτηριστικά. Αυτός ο τρόπος βελτίωσης της παραγωγής είναι χρονοβόρος και επίπονος και οι απόγονοι που προκύπτουν φέρουν ορισµένους από τους επιθυµητούς χαρακτήρες µαζί µε άλλες µη επιθυµητές ιδιότητες.

67 Γενετική µηχανική ηµιουργία διαγονιδιακών ή γενετικά τροποποιηµένων οργανισµών, φυτών και ζώων.

68

69 Οργανισµός Ιδιότητα Οργανισµός Ιδιότητα µηλιά α φράουλα β, θ λάχανο β σακχαρότευτλο β, δ, ε βαµβάκι α, β καπνός α, β, γ, δ, ε, στ, θ αγγούρι δ τοµάτα α, β, δ, ε, στ, θ, ι κουνουπίδι δ αγελάδα ζ, ια καλαµπόκι α, β, δ, ε, στ αίγα ζ ελαιοκράµβη α, β, γ, ζ γουρούνι ζ, ια, ιβ πατάτα β, δ, ε, ζ, η σολωµός ια, ιγ ρύζι α, γ, ε πρόβατο ζ σόγια β, ε πέστροφα ια Πίνακας 3. Φυτικοί και ζωικοί οργανισµοί που έχουν τροποποιηθεί γενετικά για κάποιες ιδιότητες. Όπου α: τοξίνη που σκοτώνει τα έντοµα, β: αντοχή στα ζιζανιοκτόνα, γ. αντοχή σε αντιβιοτικά, δ: αντοχή σε ιούς, ε: διαφοροποίηση, στ: αντίσταση στους µύκητες, ζ: παραγωγή φαρµακευτικών πρωτεΐνών, η: αντοχή σε βακτήρια, θ: αντοχή στον παγετό, ι: καθυστέρηση ωρίµανσης, ια: ταχύτερη ανάπτυξη, ιβ: γονίδια για ασθένειες και ιγ: αντοχή στις χαµηλές θερµοκρασίες.

70

71

72

73

74

75

76

77 Τα φυτικά κύτταρα δεν µπορούν να χρησιµοποιήσουν τις οπίνες. Εκτός από την δηµιουργία όγκων, αλλάζει και ο µεταβολισµός του φυτού. Το Ti πλασµίδιο είναι υπεύθυνο και για την παραγωγή αυξινών και κυτοκινινών.

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87 Κυριότερα διαγονιδιακά φυτά Σόγια Καλαµπόκι (για ζωοτροφές;) Βαµβάκι Ελαιοκράµβη Καπνός

88 Καταπολέµηση παρασίτων και εντόµων Αποτελεσµατική προστασία καλλιεργειών από έντοµα και ζιζάνια. Προϊόντα µε µεγαλύτερη διάρκεια ζωής από το χωράφι έως τον καταναλωτή

89 Bacillus thuringiensis

90 Bacillus thuringiensis Ζει στο έδαφος Παράγει µια τοξίνη φορές ισχυρότερη από πολλά εντοµοκτόνα, που σκοτώνει έντοµα και σκουλήκια Ψεκασµός φυτών µε το βακτήριο

91

92

93 Η άλλη άποψη Σε µελέτη ανεξάρτητης οµάδας Γάλλων επιστηµόνων (CRIIGEN), αποδείχνεται ότι το γενετικά τροποποιηµένο καλαµπόκι της εταιρείας Monsanto ΜΟΝ863 προκάλεσε σε ποντίκια που τραφήκανε µε αυτό συµπτώµατα δηλητηρίασης και τοξικότητα στο συκώτι και τα νεφρά. Το ΜΟΝ863 καλλιεργείται νόµιµα στις ΗΠΑ και Καναδά. Έχει πάρει έγκριση για ανθρώπινη κατανάλωση και για ζωοτροφή στην Ε.Ε, Αυστραλία, Κίνα, Ιαπωνία, Κορέα, Μεξικό, Φιλιππίνες και Ταϊβάν. Το γ.τ. καλαµπόκι παράγει µία τοξίνη ενάντια στο σκουλήκι της ρίζας του καλαµποκιού και περιέχει επίσης ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά

94 Στην ανατολική ακτή των ΗΠΑ παρατηρείται µέχρι και 70% µείωση του πληθυσµού των µελισσών ενώ στη δυτική µέχρι και το 60%. Οι µελισσοκόµοι µιλάνε για εθνική καταστροφή και οι New York Times υπολόγισαν στα οικονοµικά τους φύλλα, στο τέλος Φεβρουαρίου, ότι οι ζηµιές στην γεωργία θα ανέλθουν στο ύψος των 14 δις δολαρίων εξαιτίας αυτής της µείωσης (λόγω της µη επικονίασης στα φυτά από τις εξαφανισµένες µέλισσες). Oµάδα επιστηµόνων, υπό την εποπτεία του καθηγητή Hans- Hinrich Kaatz, πειραµατίσθηκε µε το γ.τ. καλαµπόκι Βt. εν παρατηρήθηκε άµεση τοξική επίδραση στις µέλισσες, όµως διαπιστώθηκε ότι άλλαξε η επιφάνεια του εντέρου τους και µειώθηκε τόσο πολύ η αντίσταση του ανοσοποιητικού τους συστήµατος, ώστε άρχισαν να προσβάλλονται πολύ εύκολα από διάφορα παράσιτα και να µειώνεται δραµατικά ο πληθυσµός τους (Der Spiegel Nr 12/ ).

95 ιαγονιδιακά ζώα

96

97 Μικροέγχυση DNA

98 Πλεονεκτήµατα έναντι κλασικής µεθόδου διασταυρώσεων: Α) Επιλογή και προσθήκη µόνο επιθυµητών ιδιοτήτων µε ταυτόχρονη διατήρηση των παλαιών επιθυµητών χαρακτηριστικών Β) Ταχύτατη παραγωγή βελτιωµένων φυτών και ζώων σε σχέση µε παραδοσιακές µεθόδους

99

100 Πρωτεΐνη Ασθένεια στην οποία χρησιµοποιείται ινσουλίνη παράγοντες VIII και IX ενεργοποιητής πλασµινογόνου (tpa) ιντερφερόνες διαµεµβρανικός ρυθµιστής α1-αντιθρυψίνη (ΑΤΤ) παράγοντας CD4 αυξητική ορµόνη σακχαρώδης διαβήτης αιµορροφιλία Α και Β θρόµβωσηαγγείων, έµφραγµα καρκίνος κυστική ίνωση πνευµονικό εµφύσηµα AIDS αχονδροπλασία

101 Εφαρµογέςτης ΒιοτεχνολογίαςστηνΙατρική

102 Βιοτεχνολογία Έχει συµβάλλει: α) στην έγκαιρη διάγνωση µιας ασθένειας β) Την πρόληψη σοβαρών ασθενειών (εµβόλια) γ) Στην αποτελεσµατική θεραπεία (φαρµακευτική αγωγή, «γενετική διόρθωση», γονιδιακή θεραπεία)

103 Σήµερα: Έχουν κλωνοποιηθεί περισσότερες από 300 φαρµακευτικές πρωτεΐνες, που έχουν παραχθεί µε την τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA. Μεταξύ των πρώτων µορίων που παρασκευάστηκαν είναι η ινσουλίνη, οι ιντερφερόνες και η αυξητική ορµόνη.

104 Πρωτεΐνη α1-αντιθρυψίνη καλσιτονίνη χοριονική γοναδοτροπίνη ενδορφίνες και εγκεφαλίνες επιδερµικός αυξητικός παράγοντας ερυθροποιητίνη παράγοντας VIII παράγοντας IX αυξητική ορµόνη ινσουλίνη ιντερφερόνες (α, β, γ) ιντερλευκίνες παράγοντας νέκρωσης όγκων θεραπεία τραυµάτων θεραπεία αναιµίας Χρήση θεραπεία εµφυσήµατος θεραπεία οστεοπόρωσης θεραπεία γυναικείας στειρότητας αναλγητικοί παράγοντες θεραπεία αιµορροφιλίας α θεραπεία αιµορροφιλίας β θεραπεία αχονδροπλασίας θεραπεία του διαβήτη αντιικοί και αντικαρκινικοί παράγοντες θεραπεία καρκίνου και ασθενειών του ανοσοποιητικού συστήµατος αντικαρκινικός παράγοντας

105

106

107

108

109 Εµβόλια 1. Συµβατά = Κλασικά νεκρά στελέχη ιών ή βακτηρίων εξασθενηµένα στελέχη ιών 2. Ανασυνδυασµένα, νέας τεχνολογίας κλωνοποίηση γονιδίων (π.χ. πρωτεϊνες καλύµµατος ιού) µεταλλαξογένεση γονιδίων «κλειδιά» παραγωγή φορέων µε ανασυνδυασµένο DNA

110 Παραγωγή ανασυνδυασµένων εµβολίων Ωφέλη: 1. Πιο ασφαλή από τα κλασικά εµβόλια που περιέχουν εξασθενηµένα στελέχη µολυσµατικού µικροοργανισµού. 2. Σταθερή αναπαραγωγή και έλεγχος σε κάθε στάδιο της κατασκευή τους. 3. Χορήγηση σε µεγάλες δόσεις χωρίς παρενέργειες. 4. Γρήγορη παρασκευή 2-3 µήνες, σε αντίθεση µε 6-9 µήνες για τα συµβατά. 5. Χαµηλό κόστος παραγωγής. 6. Πολλαπλές χρήσεις, εµβολιασµός αποµονωµένων πληθυσµών εµβολιασµός ζώων µε δολώµατα, προστασία αγρίων ζώων από επιδηµίες (πχ. λύσσα, ιλαρά) εµβολιασµός κτηνοτροφικών και πτηνοτροφικών µονάδων

111 ηµιουργία εµβολίων Εµβόλιο εναντίον της διάρροιας επετεύχθη σε γενετικά τροποποιηµένες πατάτες και επεδείχθη λειτουργικό µε την κατάναλωση g πατάτας (φαγώσιµο εµβόλιο). Επίσης παρασκευάστηκαν εµβόλια µε γενετικά τροποποιηµένα βακτήρια που παρεµποδίζουν την εγκυµοσύνη της γάτας.

112 Άλλες εφαρµογές Ψάρια βιοαντιδραστήρες. Κλωνοποίηση του γονιδίου της ασταξανθίνης (ροζ χρώµα γαρίδας) και προσθήκη στην τροφή σολοµού και πέστροφας. Η χρωστική έχει αντιοξειδωτικές ιδιότητες και αυξάνει την εµπορική αξία των ψαριών. Προστασία περιβάλλοντος: Γονίδιο νιτρορεδουκτάσης από τα βακτήρια στον καπνό. Το ριζικό τους σύστηµα χρησιµοποιείται για την αποκατάσταση ρυπασµένων περιοχών από τρινιτροτολουένη (TNT). ιαγονιδικά ζώα δείκτες περιβαλλοντικής ρύπανσης.

113 ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΑΝΑΦΕΡΕΤΑΙ ΣΕ ΕΝΑ ΣΥΝΟΛΟ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΣΑΝ ΣΚΟΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙ ΙΟΡΘΩΣΗ ΕΛΛΑΤΩΜΑΤΙΚΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ ΥΠΕΥΘΥΝΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ

114 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΕΛΛΑΤΩΜΑΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΜΕ ΕΝΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΓΟΝΙ ΙΟ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΝΟΣ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ IN SITU ΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΓΟΝΙ ΙΟ ΜΕΤΑΦΕΡΕΤΑΙ ΑΠΟ ΕΝΑΝ ΦΟΡΕΑ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΧΟΥΣ ΤΟΥ ΑΣΘΕΝΗ ΠΙΟ ΣΥΝΗΘΙΣΜΕΝΟΣ ΦΟΡΕΑΣ: ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΕΝΟΣ ΙΟΣ Ιϊκοί φορείς: ρετρο-ιϊκοί, αδενο-ιϊκοί, adeno-associated Μη ιϊκοί φορείς (επίσωµα): Φυσικές µέθοδοι (ηλεκτροδιάτρηση, genegun, microinjection) Χηµικές µέθοδοι (κατιονικά λιπίδια, κατιονικά πεπτίδια, κατιονικά πολυµερή).

115 ΙΟΙ - ΦΟΡΕΙΣ ΡΕΤΡΟΙΟΙ ΤΥΠΟΥ A : ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΙΚΛΩΝΟΥ DNA ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ RNA-ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ ΤΟΥΣ: ΤΑ ΑΝΤΙΓΡΑΦΑ ΑΥΤΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΕΝΣΩΜΑΤΩΘΟΥΝ ΣΤΑ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΞΕΝΙΣΤΗ A ΕΝΟΙΟΙ ΤΥΠΟΥ A ΜΕ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ ΙΚΛΩΝΟΥ DNA: ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Α ΕΝΟΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΙ ΙΟΙ ΤΥΠΟΥ Α ΜΕ ΜΟΝΟΚΛΩΝΟ DNA: ΕΙΣΑΓΕΙ ΤΟ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ ΤΟΥ ΣΕ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΗ ΘΕΣΗ ΣΤΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ 19 ΙΟΣ ΤΟΥ ΕΡΠΗ ΜΕ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ ΙΚΛΩΝΟΥ DNA: Ο ΟΠΟΙΟΣ ΠΡΟΣΒΑΛΛΕΙ ΤΑ ΝΕΥΡΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

116 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΣΕ ΤΥΧΑΙΑ ΘΕΣΗ ΣΤΟ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΕΛΑΤΤΩΜΑΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΜΕ ΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΜΕ ΟΜΟΛΟΓΟ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΟ ΕΠΙ ΙΟΡΘΩΣΗ ΤΟΥ ΕΛΑΤΤΩΜΑΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΜΕ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΠΟΥ ΕΧΕΙ ΣΑΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΝ ΕΠΑΝΑΦΟΡΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΑΛΛΑΓΗ ΤΟΥ ΤΡΟΠΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ

117 Γονιδιακή θεραπεία Περισσότερες από 4000 ασθένειες οφείλονται σε γονιδιακές µεταλλάξεις. Όλες σχεδόν προκαλούν δυσµορφίες, το 80% όλων διανοητική καθυστέρηση και το 1/5 από αυτές θάνατο σε παιδική ηλικία. 1990: θεραπεία της ασθένειας που οφείλεται στην έλλειψη της απαµινάσης της αδενοσίνης (ex-vivo). 1993: Θεραπεία της κυστικής ίνωσης (in vivo)

118 Απαµινάση της αδενοσίνης (ADA)

119

120

121

122 Θεραπεία κυστικής ίνωσης Σύστηµα που εφαρµόστηκε από τον Anderson και συν µε την ανάπτυξη «έξυπνων» φορέων.

123

124 ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΠΟΥ ΒΡΙΣΚΟΜΑΣΤΕ ΣΗΜΕΡΑ; ΕΝ ΥΠΑΡΧΕΙ ΕΠΙΣΗΜΗ ΕΓΚΡΙΣΗ ΠΩΛΗΣΗΣ ΠΡΟΙΟΝΤΟΣ ΓΙΑ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ. ΟΛΕΣ ΟΙ ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΕΣ ΠΑΡΑΜΕΝΟΥΝ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΚΑΙ Η ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΤΩΝ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ ΕΙΝΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΗ

125 ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΥΡΕΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΜΙΚΡΟΣ ΧΡΟΝΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ ΟΠΟΙΑ ΕΧΕΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΘΕΙ ΤΟ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟ ΜΟΡΙΟ DNA ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΙΩΝ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΤΟΥ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟΥ DNA ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΟΥ ΑΣΘΕΝΗ 1999, ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ: 18-ΕΤΗΣ ΠΕΘΑΝΕ ΑΠΟ ΠΟΛΥΟΡΓΑΝΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ 4 ΗΜΕΡΕΣ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΓΙΑ ΕΛΛΕΙΨΗ OTCD (ORNITHINE TRANSCARBAMYLASE) 2002 & 2003, ΓΑΛΛΙΑ: ΠΑΙ ΙΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΙΧΑΝ ΣΕ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΕΠΤΥΞΑΝ ΛΕΥΚΑΙΜΙΑ Gene therapy for treating children with X-SCID (sever combined immunodeficiency) or the "bubble boy" disease is stopped in France when the treatment causes leukemia in one of the patients. See 'Miracle' gene therapy trial halted at NewScientist.com (October 3, 2002). ΥΣΚΟΛΙΑ ΣΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΣΤΑ ΠΟΛΥΠΑΡΑΓΟΝΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ (ΚΑΡ ΙΑΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ, ΑΡΘΡΙΤΙΣ, ΙΑΒΗΤΗΣ, ΝΟΣΟΣ ALZHEIMER)

126 ΠΡΟΣΦΑΤΑ ΕΠΙΤΕΥΓΜΑΤΑ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΣΤΑ ΝΕΥΡΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΕΠΕΝ ΥΜΕΝΩΝ ΜΕ PEG ΠΟΥ ΙΑΠΕΡΝΟΥΝ ΤΟΝ ΑΙΜΟΤΟΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟ ΦΡΑΓΜΟ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΒΗΜΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ PARKINSON NewScientist.com (March 20, 2003). ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ Ι ΙΟΤΗΤΑΣ ΜΙΚΡΩΝ ΙΚΛΩΝΩΝ ΤΜΗΜAΤΩΝ RNA (short interfering RNAs:siRNAs) NA ΕΜΠΟ ΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΕΛΑΤΤΩΜΑΤΙΚΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΝΟΣΟΣ Huntington's at NewScientist.com (March 13, 2003). ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΑ ΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΕΝΟΣ ΤΕΧΝΗΤΟΥ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΟΣ 47ου (artificial human)στα ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΧΟΥΣ.

127 Κλωνοποίηση ΚΛΩΝΟΣ(ΟΙ), µια οµάδα από δύο ή περισσότερα άτοµα που φέρουν πανοµοιότυπο γενετικό υλικό τα οποία προήλθαν µέσω µη φυλετικής αναπαραγωγής, από ένα κοινό γονέα ή πρόγονο.

128 Dolly: Ινστιτούτο Roselin 1997 Θα πρέπει να σηµειώσουµε ότι η Ντόλυ παρουσίασε µετά από κάποιο διάστηµα διάφορα προβλήµατα υγείας συνδεόµενα κυρίων µε πρώιµη γήρανση. Τα προβλήµατα αυτά οδήγησαν τους ερευνητές να προχωρήσουν σε ευθανασία του ζώου το Πρόσφατα κλωνοποιήθηκαν βοοειδή από γηρασµένα κύτταρα και δεν εµφάνισαν κανένα σύµπτωµα πρόωρης γήρανσης.

129 Όταν ένα κύτταρο εκφράζει όλη τη γενετική πληροφορία που είναι απαραίτητη για τον σχηµατισµό ενός πλήρους οργανισµού, τότε χαρακτηρίζεται ως ολοδύναµο. Κύτταρα, τα οποία κάτω από διαφορετικές πειραµατικές συνθήκες εκφράζουν αρκετούς κυτταρικούς φαινοτύπους χαρακτηρίζονται ως πολυδύναµα. Συνήθως τα εµβρυικά κύτταρα ενός αναπτυσσόµενου οργανισµού έχουν τη τάση να δίνουν ένα µόνον ιστικό τύπο, καλούνται δε µονοδύναµα.

130 Η βασική τεχνική είναι αυτή της µεταφοράς πυρήνα σωµατικών κυττάρων.

131 Στο ινστιτούτο Roselin οι προσπάθειες κλωνοποίησης ξεκίνησαν χρησιµοποιώντας κύτταρα βλαστοκύστης 9 ηµερών. Τα εµβρυικά κύτταρα, µε µορφολογία επιθηλιακών κυττάρων που προέκυπταν καλλιεργούνταν στο εργαστήριο. Οι πυρήνες των κυττάρων αυτών µεταφέρονταν σε ενεργοποιηµένα ωάρια. Ποτέ κανένα από τα έµβρυα που προέκυπταν δεν αναπτύσσονταν πλήρως. Τότε, ο Wilmut, αποφάσισε να καλλιεργήσει τα κύτταρα αυτά απουσία ορού. Στις συνθήκες αυτές τα κύτταρα µεταπίπτουν στη φάση Go. Οι πυρήνες των κυττάρων αυτών έδωσαν δύο αρνάκια την Μέγκαν και τη Μόραγκ, που αναπτύχθηκαν κανονικά και έδωσαν και απογόνους. Τη ίδια εποχή έγινε και το πείραµα µε τα επιθηλιακά κύτταρα µαστικού αδένα από µια εξάχρονη προβατίνα. Από Go κύτταρα του τύπου αυτού προέκυψε ο πρώτος κλώνος θηλαστικού από σωµατικά κύτταρα-δότες ενηλίκου ατόµου.

132

133 ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144 Βιβλιογραφία Ιατρική γενετική, Κλεονίκη Λαµνήσου, εκδόσεις Σταµούλη Α.Ε., 2004 Γενετική ανθρώπου, Τριανταφυλλίδης Κ, Κουβάτση Α., εκδόσεις Κυριακίδη Αφοι, Γενετική ανθρώπου, Αλεπόρου Β, εκδόσεις Συµµετρία, Βιολογία Κυττάρου, Μαργαρίτης Λ.Χ. και συν., 2004, Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας GENES VIII, Benjamin Lewin, 2004, Benjamin Cummings Molecular Biology of the Cell, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter, December 2007, Garland Science textbooks. Biochemistry, Lubert Stryer, 2009, published by W. H. Freeman and Company. Γονιδιακή θεραπεία, Μπατρινού Α.Μ., εκδόσεις Πασχαλίδη, 1998 Ειδικά θέµατα Γενετικής, Τύπας Μ., Κοµητοπούλου Α., Εκδόσεις Πανεπιστηµίου Αθηνών, 1992 Μαθήµατα εφαρµοσµένης Μικροβιολογίας, Μαράκης Σ., εκδόσεις Πανεπιστηµίου Αθηνών, 1990.