Αναλυτική μεθοδολογία Οπτικές και Ανοσοχημικές Μέθοδοι. Διδακτικές διαφάνειες επιπλέον συγγράμματος. Κλινική Χημεία ΣΤ Εξάμηνο - Παραδόσεις

Transcript

1 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήματα Βιολογίας Σ.Θ.Ε. Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας Αναλυτική μεθοδολογία Οπτικές και Ανοσοχημικές Μέθοδοι Διδακτικές διαφάνειες επιπλέον συγγράμματος Κλινική Χημεία ΣΤ Εξάμηνο - Παραδόσεις Μαργαρίτης Αυγέρης

2 Βασικές έννοιες και ορισμοί Ο κύριος στόχος στην Κλινική Χημεία είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός ουσιών, στοιχείων, ιχνοστοιχείων και βιομορίων Οπτικές τεχνικές ανάλυσης Αποτελούν μια σειρά μεθοδολογιών για την ικανοποίηση του ανώτερου στόχου, οι οποίες εκμεταλλεύονται την αλληλεπίδραση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και ύλης Το μετρούμενο μέγεθος είναι η ένταση της: α. απορροφώμενης ακτινοβολίας β. σκεδαζόμενης ακτινοβολίας γ. εκπεμπόμενης ακτινοβολίας Περιλαμβάνονται: 1. Φασματοφωτομετρία 2. Φθορισμομετρία 3. Νεφελομετρία 4. Θολερομετρία 5. Φλογοφασματομετρία κ.α.

3 Βασικές έννοιες και ορισμοί Ηλεκτρομαγνητικά κύματα Η ταυτόχρονη διάδοση συζευγμένων ηλεκτρικών και μαγνητικών πεδίων, τα οποία στο κενό διαδίδονται με την ταχύτητα του φωτός και εμφανίζουν τυπική κυματική συμπεριφορά Β Ε οι ηλεκτρικές και μαγνητικές συνιστώσες είναι: α. κάθετες η μία στην άλλη και β. κάθετες προς τη διεύθυνση διάδοσης Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία αποτελείται από κβαντισμένα πακέτα ενέργειας γνωστά ως φωτόνια (quanta), με ενέργεια E: E= h x v h, σταθερά Plank & v, συχνότητα ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας v = c/λ c, ταχύτητα του φωτός και λ, μήκος κύματος

4 Βασικές έννοιες και ορισμοί Ακτίνες γ (Gamma-rays): παράγονται από πυρηνικές αντιδράσεις, διάσπαση ραδιενεργών πυρήνων ή στοιχειωδών σωματιδίων Ακτίνες Χ (X-rays): υποσύνολο των ακτινών γ και παράγονται από την πρόσκρουση ταχέως κινούμενων ηλεκτρονίων σε μεταλλικό στόχο μεγάλου ατομικού αριθμού, όπως βολφράμιο ή μολυβδένιο

5 Ένταση (J/sec. m 2 ή W/m 2 ) Φυσικό μέγεθος που ορίζει τη ροή ενέργειας μέσα από συγκεκριμένη επιφάνεια και σε συγκεκριμένο χρόνο Βασικές έννοιες και ορισμοί Όταν ένα φωτόνιο συναντήσει (προσπέσει) σε ένα μόριο, τότε ανάλογα από την φύση/ιδιότητες του τελευταίου, μπορεί να: α. να απορροφηθεί ή β. να αλλάξει κατεύθυνση (σκέδαση) Κατά την απορρόφηση, η ενεργειακή κατάσταση του μορίου αυξάνεται και το μόριο μεταβαίνει στην διεγερμένη μορφή του. Χρωμοφόρα: Μόρια ή τμήματα αυτών με ικανότητα διέγερσης Διεγερμένη κατάσταση α. μεταφορά e - σε ανώτερο ενεργειακό επίπεδο (υπεριώδης ακτιν. ακτίνες Χ) β. μεταβολή ταλάντωσης γύρω από ομοιοπολικούς δεσμούς (εγγύς υπέρυθ. ορατό) γ. μεταβολή περιστροφής γύρω από ομοιοπολικούς δεσμούς (μικροκύματα) Τα διεγερμένα μόρια, σε συνέχεια σύγκρουσής τους με άλλα μόρια, επανέρχονται στο αρχικό ενεργειακό επίπεδο με ταυτόχρονη αποβολή ενέργειας (ακτινοβολίας). Η ένταση Ι της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας είναι μικρότερη της έντασης Ι ο της απορροφούμενης ακτινοβολίας, λόγω μετατροπής σε θερμότητα/κινητική ενέργεια

6 Διαπερατότητα - Απορρόφηση Διαπερατότητα Τ (transmittance) μιας ουσίας ορίζεται το κλάσμα της εισερχόμενης ακτινοβολίας το οποίο διαπερνά ένα διάλυμα της ουσίας συγκέντρωσης c T = I / Ι ο, (1>T>0) Η διαπερατότητα εκφράζεται συχνά και ως σχετικό % μέγεθος %Τ = (I / Ι ο ) x 100% Απορρόφηση Α (absorbance) ορίζεται από την εξίσωση: A = -log 10 T = log 10 (Ι ο / I) ή Α = log100 log%t = 2 log%t

7 Φασματοφωτομετρία UV-Vis Φασματοφωτομετρία υπεριώδους ορατού (UV Vis) Φασματοφωτομετρία απορροφήσεως Μια από τις χρησιμότερες αναλυτικές τεχνικές στην Κλινική Χημεία Χρησιμοποιείται κυρίως για την ποσοτική ανάλυση (ποσοτική φασματοφωτομετρία) Συσχέτιση ποσοστού απορρόφησης με τη συγκέντρωση μιας ουσίας Αρχή φασματοφωτομετρίας Κατά τη δίοδο μονοχρωματικής ακτινοβολίας από διάλυμα της ουσίας, η ένταση της ακτινοβολίας ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής Η μείωση της έντασης (Ι<Ιο) εξαρτάται από: 1. Συγκέντρωση της ουσίας στο διάλυμα 2. Απόσταση που διένυσε στο διάλυμα

8 Νόμος Lambert-Beer Στηρίζεται στις βασικές αρχές αλληλεπίδρασης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και ύλης που περιγράφονται στον νόμο των Lambert-Beer A = -log 10 T = log 10 (Ι ο / I) = abc g/l = εbc mol/l = kbc ppm Α= απορρόφηση (absorbance) Τ = διαπερατότητα (transmittance) = I/Io Io = ένταση προσπίπτουσας ακτινοβολίας Ι = ένταση εξερχόμενης από το διάλυμα ακτινοβολίας C= συγκέντρωση της ουσίας τα μόρια της οποίας διεγείρονται με απορρόφηση φωτός α = απορροφητικότητα (absorptivity) = σταθερά αναλογίας όταν C εκφράζεται σε g/l ε = μοριακή απορροφητικότητα (molar absorptivity), όταν C εκφράζεται σε mol/l b = μήκος διαδρομής (πάχος στιβάδας ή εσωτερικό πάχος κυψελίδας) σε cm

9 Ειδικός Συντελεστής Απορρόφησης Όταν η C εκφράζεται σε %w/v, η σταθερά αναλογίας καλείται «Ειδική Απορρόφηση» (Specific Absorbance) Ειδική Απορρόφηση Ισούται με τη (θεωρητική) απορρόφηση διαλύματος 1% w/v της ουσίας σε κυψελίδα μήκους 1cm Χρησιμοποιείται όταν το ΜΒ της ουσίας δεν είναι γνωστό ή όταν πρόκειται για μείγμα ουσιών

10 Σταθερές Απορροφητικότητας Οι σταθερές απορροφητικότητας α, ε, k, εξαρτώνται: α. από το μήκος κύματος λ β. από τον διαλύτη γ. από τη μοριακή δομή της ουσίας δ. από τη θερμοκρασία Η απορρόφηση και η διαπερατότητα του διαλύματος της ουσίας εξαρτάται από: 1. Από την συγκέντρωση του διαλύματος 2. Από το μήκος της διαδρομής (εσωτερικό πάχος κυψελίδας)

11 Μέτρηση Απορρόφησης - Συγκέντρωση Πρακτικά αδύνατη η μέτρηση Ιo και Ι Στην πραγματικότητα μετράμε το σύνολο των απορροφήσεων της υπό έλεγχο ουσίας, του διαλύτη, των υπολοίπων στοιχείων του διαλύματος, των αντιδραστηρίων και της κυψελίδας Στην εργαστηριακή πράξη πραγματοποιείται σύγκριση της έντασης της ακτινοβολίας που διέρχεται από το διάλυμα του προς ανάλυση δείγματος (Ι δείγμα ) με την ένταση που διέρχεται από «τυφλό» δείγμα (Ι τυφλό ) Α = abc g/l = εbc mol/l = log 10 (Ι ο / I) = ~ log 10 (Ι τυφλό / I δείγμα ) Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης πραγματοποιείται από: 1. C = A / (εb) = A / (ab), χρήση σταθερών από βιβλιογραφία, ή 2. Κατασκευή καμπύλης αναφοράς με χρήση προτύπων διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης της ουσίας εb = ab = κλίση της καμπύλης αναφοράς

12 Καμπύλη Αναφοράς

13 Προσδιορισμός συγκέντρωσης στην εργαστηριακή ρουτίνα Σε εξετάσεις ρουτίνας, όπου δεν απαιτείται πολύ μεγάλη ακρίβεια μέτρησης Η κατασκευή καμπύλης αναφοράς είναι χρονοβόρα και κοστοβόρα Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της υπό ελέγχου ουσίας σε ένα δείγμα ελέγχου πραγματοποιείται με την τεχνική του ενός σημείου, με προϋπόθεση η συγκέντρωση να εμπίπτει στην περιοχή ισχύος του Νόμου των Lambert-Beer C δείγμα = (Α δείγμα / Α πρότυπο ) x C πρότυπο x αραίωση

14 Προϋποθέσεις ισχύος νόμου Lambert-Beer Η απορρόφηση να είναι ο μόνος (ή ο κυρίαρχος) μηχανισμός αλληλεπίδρασης ακτινοβολίας και ύλης Το φως που χρησιμοποιείται να είναι μονοχρωματικό. Όσο στενότερο το εύρος φάσματος του φωτός που διέρχεται από την έξοδο του μονοχρωμάτορα, τόσο πιο ακριβής η μέτρηση Η συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας να βρίσκεται μέσα στα όρια (LOQ LOL) στα οποία ισχύει η γραμμικότητα του νόμου Lambert-Beer. Η συγκέντρωση δεν πρέπει να υπερβαίνει τα mol/l To περιβάλλον να είναι ισότροπο, δηλ. να έχει τον ίδιο δείκτη διάθλασης σε όλες τις κατευθύνσεις, καθώς και να μην αντιδρά με τα μόρια της ουσίας Τα μόρια της ουσίας δεν πρέπει να διαστέλλονται ή να συμπυκνώνονται, καθώς και ανεξάρτητα το ένα από το άλλο, τον αριθμό και το είδος τους.

15 Αποκλίσεις Οργάνων μπορεί να υπάρξουν 1. Γραμμικότητα μετρητή σταθερή αναλογία έντασης ακτινοβολίας και ένδειξης 2. Ακρίβεια επιλογής μήκους κύματος 3. Ακρίβεια μέτρησης Ελέγχεται με διαλύματα βαθμονόμησης 4. Παράσιτη ακτινοβολία (stray light) Απαιτούνται μικρές τιμές 5. Πολυχρωματική ακτινοβολ. δίνει αρνητικές αποκλίσεις 6. Μέτρηση στο λ μεγ Αποκλίσεις από νόμο Lambert-Beer γραμμική σχέση Α και b για δεδομένη C αποτελεί κανόνα χωρίς εξαίρεση η γραμμική σχέση A και C εμφανίζει αρνητικές αποκλίσεις στις υψηλές συγκεντρώσεις Σε πυκνά διαλύματα: α. οι αποστάσεις των σωματιδίων γίνονται μικρές και επηρεάζεται η κατανομή φορτίου και η ικανότητα απορρόφησης ακτινοβολίας β. η μοριακή απορροφητικότητα ε δεν παραμένει σταθερή

16 Φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης Η φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης (atomic absorption spectroscopy-aas) στηρίζεται στην μέτρηση της απορρόφησης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος από ελεύθερα ουδέτερα άτομα των στοιχείων σε θεμελιώδη κατάσταση που βρίσκονται σε κατάσταση ατμού (Ατομικός ατμός). Εφαρμογή στην Κλινική Χημεία Ευαίσθητος και εξειδικευμένος ποσοτικός προσδιορισμός στοιχείων και ιχνοστοιχείων Στάδια Ατμοποίηση και ατομοποίηση δείγματος μέσω θέρμανσης Διέγερση των ατόμων του προς προσδιορισμού στοιχείου σε θεμελιώδη κατάσταση από εξωτερική πηγή γραμμικής ακτινοβολίας Προσδιορισμός της ακτινοβολίας που απορροφήθηκε μέσω μονοχρωμάτορα, ανιχνευτή, ενισχυτή και καταγραφικού συστήματος

17 Ατομοποίηση με φλόγα Στον θάλαμο ανάμειξης, σταγονίδια του δείγματος, το οξειδωτικό και το καύσιμο αναμειγνύονται πριν την φλόγα. Η επιλογή καυσίμου και οξειδωτικού για την παραγωγή φλόγας στον καυστήρα εξαρτάται από την απαιτούμενη θερμοκρασία για την ατομοποίηση του δείγματος. Εκνεφωτής, πραγματοποιεί την εισαγωγή σταγονιδίων του δείγματος (<10 μm) στη φλόγα με σταθερό και ομοιόμορφο τρόπο επαναληψιμότητα Διεργασίες που λαμβάνουν χώρα 1. Εξάτμιση διαλύτη Σχηματισμός αερολύματος (ατμοποίηση) 2. Διάσταση μορίων σε άτομα (ατομοποίηση) 3. Διέγερση ατόμων του δείγματος από εξωτερική πηγή γραμμικής ακτινοβολίας λυχνία κοίλης καθόδου 4. Ιονισμός - Ανεπιθύμητο φαινόμενο. Τα ιοντικά φάσματα που διαφέρουν από τα ατομικά. 5. Δημιουργία οξειδίων Παρεμποδίσεις

18 Επίδραση θερμοκρασίας φλόγας Η φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης (AAS) στηρίζεται στην μέτρηση της απορρόφησης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος από ελεύθερα ουδέτερα άτομα σε θεμελιώδη κατάσταση Η θερμοκρασία φλόγας πρέπει να είναι τέτοια ώστε να έχουμε ικανοποιητική ατομοποίηση του προς προσδιορισμού στοιχείου του δείγματος σε ελεύθερα άτομα σε θεμελιώδη κατάσταση (Νο) και όχι σημαντικό αριθμό διεγερμένων ατόμων (Nj). Αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού διεγερμένων ατόμων του στοιχείου Μειονεκτήματα Ελάχιστος ο χρόνος παραμονής του δείγματος στην οπτική δέσμη με αποτέλεσμα μικρή ευαισθησία Μη δυνατότητα ανάλυσης στερεών δειγμάτων Αδυναμία ανάλυσης μικρών δειγμάτων καθώς μεγάλο ποσοστό του δείγματος δεν ατομοποιείται

19 Ατομοποίηση με φούρνο γραφίτη Η ατομοποίηση μπορεί να λάβει χώρα και σε φούρνο γραφίτη θερμαινόμενο ηλεκτρικά σε ατμόσφαιρα αδρανούς αερίου. Πλεονεκτήματα Δυνατότητα ανάλυσης μικρού όγκου Ελάχιστη προετοιμασία Μεγάλη ευαισθησία ( ) φορές μεγαλύτερη της φλόγας Δυνατότητα ανάλυση στερεών δειγμάτων Μειονεκτήματα Ένα μέρος του δείγματος μπορεί να χαθεί στο στάδιο της απανθράκωσης ( Χαμηλή επαναληψιμότητα σε σχέση με φλόγα

20 Λυχνία κοίλης καθόδου Η συνηθέστερη πηγή μονοχρωματικής ακτινοβολίας στην AAS είναι η λυχνία κοίλης καθόδου Υάλινος σωλήνας με ευγενές αέριο (Ar ή Νe) σε χαμηλή πίεση (1-5torr) Κοίλη κάθοδος υπό μορφή κυπέλλου κατασκευασμένη από το προσδιοριζόμενο στοιχείο Με εφαρμογή τάσεως μεταξύ ανόδου καθόδου: α. Ιονισμός ευγενούς αερίου β. Τα θετικά ιόντα του προσπίπτουν στην κάθοδο γ. Προκαλούν εξάχνωση και ατομοποίηση μέρους της καθόδου δ. Τα άτομα του στοιχείου στην κοίλη κάθοδο διεγείρονται από την εκκένωση και εκπέμπουν του επιθυμητού μήκους κύματος ακτινοβολία που απορροφούν τα άτομα του προς προσδιορισμού στοιχείου στην φλόγα

21 Προσδιορισμός Συγκέντρωσης Ισχύει ο νόμος του Beer: A = log (Io/I) = Κ bno = K C K = συντελεστής ατομικής απορρόφησης b = μήκος διαδρομής μέσα στη φλόγα No = αριθμός ατόμων στην θεμελιώδη κατάσταση / cm 3 C = συγκέντρωση στοιχείου στο διάλυμα που ψεκάζεται Χρήση εξισώσεως με τη βοήθεια καμπύλης αναφοράς Διόρθωση Υποβάθρου 1. Ρύθμιση μηδενός με τυφλό διάλυμα 2. Τεχνική Συνεχούς Ακτινοβολίας με λάμπα δευτερίου - Η απορρόφηση της συνεχούς ακτινοβολίας (απορρόφηση υποβάθρου) αφαιρείται από την απορρόφηση της φασματικής γραμμής 3. Τεχνική Zeeman To νέφος των ατόμων τοποθετείται εντός μαγνητικού πεδίου

22 Φθορισμομετρία - Ορισμοί Κατά τη φωτοδιέγερση ενός μορίου με απορρόφηση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (φωτονίων), η ενέργεια διέγερσης δε διατηρείται στο διεγερμένο μόριο αλλά αποβάλλεται με διάφορους τρόπους: α. με τη μορφή θερμότητας, λόγω συγκρούσεων με γειτονικά μόρια β. με εκπομπή δευτερεύουσας ακτινοβολίας η οποία χαρακτηρίζεται ως φωταύγεια. Η φωταύγεια χαρακτηρίζεται ως: α. φθορισμός όταν η εκπομπή γίνεται σε χρόνο sec μετά τη διέγερση και β. φωσφορισμός όταν μεσολαβεί καθυστέρηση sec. Διακρίνονται 2 τύποι φασμάτων: 1. φάσμα διέγερσης: Το σύνολο των μηκών κύματος που μπορούν να διεγείρουν το μόριό μας από τη θεμελιώδη στη διεγερμένη κατάσταση. 2. φάσμα εκπομπής: Το σύνολο των μηκών κύματος των φωτονίων όταν αυτά εκπέμπουν, δηλαδή αποδιεγείρονται. Κάθε φθορισμογόνο έχει χαρακτηριστικά φάσματα απορρόφησης/εκπομπής

23 Φθορισμομετρία Η ακτινοβολία εκπομπής είναι χαμηλότερης ενέργειας και κατ επέκταση μεγαλύτερου μήκους κύματος από την ακτινοβολία διέγερσης, με αποτέλεσμα το χρώμα του φωτός που εκπέμπεται να είναι διαφορετικό από το χρώμα του φωτός που απορρίφθηκε. Μετά το φθορισμό το φθορισμογόνο μόριο επανέρχεται στην χαμηλή αρχική ενεργειακή του κατάσταση. Το μόριο μπορεί να διεγερθεί ξανά και να περάσει από την διαδικασία του φθορισμού πολλαπλές φορές. Ικανότητα φθορισμού εμφανίζουν συνήθως οργανικές ενώσεις με κυκλικούς αρωματικούς πυρήνες ή/και πολλαπλούς συζυγιακούς διπλούς δεσμούς.

24 Διαλύτης δεν πρέπει να απορροφά ακτινοβολία διέγερσης ή φθορισμού Παράγοντες που επηρεάζουν τον φθορισμό Συγκέντρωση του προς ανάλυση δείγματος. τα διεγερμένα μόρια συγκρούονται με γειτονικά και χάνουν μέρος της ενέργειάς τους ως θερμότητα. Σε διαλύματα μεγάλης συγκέντρωσης, οι συγκρούσεις είναι τόσες με αποτέλεσμα να υπάρχει απόσβεση (quencing) και σημαντική μείωση του φθορισμού (μείωση ευαισθησίας) Ηλεκτρονιοδότες, όπως οι ομάδες NH 2, -OH, αυξάνουν το φθορισμό, ενώ Ηλεκτρονιόφιλες ομάδες, όπως COOH, -NO 2, μειώνουν ή και τον εξαλείφουν Θερμοκρασία. Αύξηση της θερμοκρασίας συνεπάγεται μείωση της έντασης φθορισμού, λόγω της αυξανόμενης τυχαία κίνηση των μορίων και της αυξημένης πιθανότητα συγκρούσεων. Οξυγόνο. Προκαλεί οξείδωση και μετατροπή της ουσίας σε μη φθορίζον προϊόν. Ξένα μόρια. αλλοιώνουν της ένταση του φθορισμού, όταν αυτά απορροφούν ακτινοβολία διέγερσης ή φθορισμού ή φθορίζουν από μόνα τους. Φωτοδιάσπαση του φθορισμογόνου από ακτινοβολία διέγερσης μεγάλης ισχύος

25 Πλεονεκτήματα σε σχέση με φασματομωτομετρία 1. Σημαντικά μεγαλύτερη ευαισθησία ( φορές) 2. Μεγαλύτερη εξειδίκευση/εκλεκτικότητας, αφού μικρό ποσοστό ουσιών που απορροφούν στο υπεριώδες ή το ορατό φθορίζει 3. Μεγάλο όριο ανίχνευσης Φθορισμομετρία 4. Μεγαλύτερη ευελιξία, αφού έχουμε 2 είδη φασμάτων (διέγερσης/φθορισμού) Μειονεκτήματα σε σχέση με φασματομωτομετρία 1. Σχετικά μικρότερη ακρίβεια 2. Μικρός αριθμός ουσιών που μπορούν να προσδιοριστούν (λίγες φθορίζουν) 3. Ανεπιθύμητες αλληλεπιδράσεις των διεγερμένων μορίων

26 Εφαρμογές Ικανότητα φθορισμού εμφανίζουν συνήθως οργανικές ενώσεις με κυκλικούς αρωματικούς πυρήνες ή/και πολλαπλούς συζυγιακούς διπλούς δεσμούς Ενώσεις/ουσίες που δεν φθορίζουν από μόνες τους μπορούν να προσδιοριστούν φθορισμομετρικά αν: Συμμετέχουν σε αντιδράσεις/χημικές ισορροπίες τα προϊόντα της οποίας μπορεί να φθορίσει Προσδεθούν σταθερά και ανάλογα με την συγκέντρωσή τους με φθορισμογόνα μόρια Στην Κλινική Χημεία-Κλινική Βιοχημεία ο φθορισμός χρησιμοποιείται με αντίστοιχο τρόπο ως σύστημα ανίχνευσης σε: 1. Ανοσοχημικές μεθόδους (Ανοσοαναλύσεις φθορισμού / FIA) 2. Κυτταρομετρία ροής 3. Μικροσκοπία φθορισμού 4. Real-Time quantitative PCR (Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου) 5. Time Resolved Fluorescence, επιτυγχάνεται με χρήση συγκεκριμένων φθορισμογόνων, που καλούνται λανθανίδες, με ικανότητα εκπομπής σε μεγάλα χρονικά διαστήματα (μs) Μείωση υποβάθρου και αυξημένη ευαισθησία.

27 Χημειοφωταύγεια Χημειοφωταύγεια το φαινόμενο εκπομπής ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας κατά την αποδιέγερση μορίων, τα οποία αποτελούν προϊόν χημικής αντίδρασης. Στην χημειοφωταύγεια, η διέγερση των μορίων πραγματοποιείται κατά την χημική αντίδραση οξείδωσης ή υδρόλυσής τους. Φωταυγά Συστήματα α. οξείδωση αρωματικών εστέρων ακριδίνης με Η 2 Ο 2 β. ενζυμική υδρόλυση φωσφορικών εστέρων (1,2-διοξετανών) γ. Οξείδωση λουμινόλης με Η 2 Ο 2 Στην Κλινική Χημεία η χημειοφωταύγεια χρησιμοποιείται για την ακριβή ποσοτικοποίηση βιομορίων μέσω ανοσοχημικών προσδιορισμών. Το ένζυμο που καταλύει την χημική αντίδραση βρίσκεται δεσμευμένο στην στερεά φάση, σε ένα από τα συστατικά στοιχεία της μεθόδου (π.χ. αντίσωμα ή αντιγόνο).

28 Χημειοφωταύγεια Πλεονεκτήματα Μεγάλη ευαισθησία, λόγω της ενζυμικής κατάλυσης της χημικής αντίδρασης και κατ επέκταση της ενίσχυσης (πολλαπλασιασμού) του σήματος Μειονεκτήματα Το ένζυμο βρίσκεται συνδεδεμένο στην στερεά φάση μείωση απόδοσης σε σχέση με την ύπαρξή του στο διάλυμα σε ελεύθερη μορφή Ηλεκροχημειοφωταύγια Παραλλαγή της χημειοφωτάυγειας, όπου τα διεγερμένα μόρια για την εκπομπή ακτινοβολίας παράγονται ηλεκτροχημικά, από πρόδρομες ενώσεις στην επιφάνεια ηλεκτροδίων. Συνήθως χρησιμοποιούνται σύμπλοκα ρουθινίου, τα οποία από την εφαρμογή ηλεκτρικού δυναμικού διεγείρονται Μέθοδος συχνά χρησιμοποιούμενη σε μικροαναλυτες και αυτόματους αναλυτές νέας γενιάς.

29 Φλογοφασματοφωτομετρία Η φλογοφασματοφωτομετρία χρησιμοποιήθηκε ευρέως τα προηγούμενα χρόνια για τον ποσοτικό προσδιορισμό στοιχείων, όπως Να, Κ, Li σε βιολογικά υγρά. Στηρίζεται στην μέτρηση της εκπομπής ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος από διεγερμένα άτομα του στοιχείου κατά την επαναφορά τους στην θεμελιώδη κατάσταση. Η διέγερση των ατόμων πραγματοποιείται μέσω θέρμανσης σε φλόγα Όταν επανέλθουν σε θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση εκπέμπουν ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος, χαρακτηριστικό του κάθε στοιχείου. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ευθέως ανάλογη των ατόμων που έχουν διεγερθεί και κατ επέκταση της συγκέντρωσης του στοιχείου στο δείγμα Χαμηλή ευαισθησία, αφού μόνο το 1-5% των ατόμων διεγείρονται Το δείγμα ψεκάζεται με αέρα ή οξυγόνο και στην συνέχεια έρχεται σε επαφή με καύσιμο αέριο για την παραγωγή της φλόγας.

30 Ανοσοχημικοί Προσδιορισμοί Ανοσοχημικοί Προσδιορισμοί (Immunoassays) Στηρίζονται στην χρήση αντισωμάτων (Ab) για: 1. Απευθείας ανίχνευση ενός αντιγόνου (Ag) 2. Ανίχνευση άλλου αντισώματος Πλεονεκτήματα 1. Υψηλή εξειδίκευση - συγγένεια αντισώματος και προσδιοριζόμενων επιτόπων 2. Υψηλή ευαισθησία Δυνάμεις σύνδεσης - Διαμοριακές 1. Ηλεκτροστατικές 2. Δεσμοί υδρογόνου 3. Δυνάμεις Van der Waals 4. Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις

31 Ανίχνευση Ανοσοσυμπλόκου Μη ισοτοπικές μέθοδοι ανίχνευσης Χρήση ενζύμων (κυρίως) για: 1. Εκπομπή ακτινοβολίας 2. Παραγωγή έγχρωμου προϊόντος Ένζυμα με: α. χρωμογόνα β. φθορισμογόνα γ. χημειο- ή βιοφωταυγή υποστρώματα Ισοτοπικές μέθοδοι ανίχνευσης Μέτρηση ενεργότητας εκπεμπόμενης ραδιενέργειας των ραδιονουκλιδίων που συμμετέχουν στην ανάλυση

32 Προσδιορισμός Ανοσοσυμπλόκου Άμεσος Προσδιορισμός Ανοσοσυμπλόκου Τα συγκεκριμένα συστήματα στηρίζονται στην απευθείας (άμεση) πρόσδεση του μορίου που παράγει το σήμα προσδιορισμού (ένζυμο, χρωμογόνο, φθορίζον, ραδιοϊσότοπο) του Ab ή του Ag που λαμβάνει μέρος στην αντίδραση του ανοσοσυμπλόκου. Έμμεσος Προσδιορισμός Ανοσοσυμπλόκου Στα συστήματα αυτά, το μόριο παραγωγής σήματος ΔΕΝ συνδέεται απευθείας στο Ab ή Ag, αλλά προσδένεται στην συνέχεια δημιουργίας του ανοσοσυμπλόκου

33 Προσδιορισμός Ανοσοσυμπλόκου Πλεονεκτήματα έμμεσου προσδιορισμού ανοσοσυμπλόκων 1.Το ίδιο μόριο σύστημα ιχνηθέτησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πολλές διαφορετικές ανοσοαναλύσεις, περιορίζοντας έτσι τις ανάγκες μας σε οργανολογία ή/και εξειδικευμένη ιχνηθέτηση 2.Συνολικά χαμηλότερο κόστος προσδιορισμού 3.Προσδιορισμός ανοσοσυμπλόκων όπου το Ab προσδιορισμού ΔΕΝ μπορεί να σημανθεί 4.Αυξημένη ευαισθησία αφού στα περισσότερα συστήματα έμμεσου προσδιορισμού, πολλαπλά μόρια του ιχνηθέτη προσδένονται στο σχηματιζόμενο ανοσοσύμπλοκο σε σχέση με τον άμεσο προσδιορισμό

34 Συστήματα Έμμεσου Προσδιορισμού Σύστημα Στρεπταβιδίνης Βιοτίνης (Streptavidin Biotin) Βασίζεται: 1.στην ιδιαίτερα υψηλή συγγένεια και ειδικότητα της γλυκοπρωτεΐνης στρεπταβιδίνη (ή αβιδίνη) με την βιταμίνη βιοτίνη (K=10 15 M -1 ) 2.Τέσσερεις θέσεις πρόσδεσης της βιοτίνης σε ένα μόριο αβιδίνης Πολλαπλασιασμός σήματος Σημαντική ευαισθησία 3.Μεγάλος αριθμός μορίων βιοτίνης μπορεί να προσδεθεί στα Ab που χρησιμοποιούνται στον ανοσοπροσδιορισμό χωρίς μείωση συγγένειας με το αντιγόνο - Πολλαπλασιασμός σήματος Σημαντική ευαισθησία

35 Σύστημα Στρεπταβιδίνης Βιοτίνης Προσδιορισμός μέσω σημασμένης βιοτίνης 1. Τα Ab προσδιορισμού ιχνηθετούνται με βιοτίνη 2. Μετά την δημιουργία ανοσοσυμπλόκου, ακολουθεί προσθήκη περίσσειας μη σημασμένης στρεπταβιδίνης 3. Έκπλυση και προσθήκη σημασμένης βιοτίνης και κατάλληλου υποστρώματος

36 Χρήση σημασμένου δευτερογενούς Ab 1. To Ab προσδιορισμού ΔΕΝ σημαίνεται 2. Μετά το σχηματισμό ανοσοσυμπλόκου προστίθεται σημασμένο 2 ο αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει επιτόπου εναντίον του 1 ου Ab (αντίσωμα προσδιορισμού) Πλεονεκτήματα 1.Χαμηλό κόστος 2.Μεγάλος αριθμός εμπορικά διαθέσιμων σημασμένων δευτερογενών Ab 3.Εκμετάλλευση όταν το 1 ο Ab ΔΕΝ μπορεί να σημανθεί 4.Πολλαπλασιασμός του σήματος Προϋπόθεση Αντισώματα επίστρωσης προσδιορισμού από διαφορετικά είδη ζώων ώστε το 2 ο Ab να μην προσδένεται σε Ab επίστρωσης.

37 ELISA Βασική τεχνική ανοσοπροσδιορισμών Χρήση ΕΝΖΥΜΟΥ ως ιχνηθέτη σε Ab ή Ag, το οποίο παρουσία κατάλληλου υποστρώματος οδηγεί στην παραγωγή: α. Χρώματος β. Φωτός Η ένταση των οποίων είναι ανάλογη της ποσότητας του ανοσοσυμπλόκου και κατ επέκταση της ποσότητας του προς προσδιορισμού μορίου Χαρακτηριστικά 1.Υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση 2.Απλή οργανολογία 3.Χαμηλό κόστος 4.Μικρή επικινδυνότητα Μειονεκτήματα: α. η απουσία ομοιοπολικών δεσμών απώλεια προσροφημένων Ab ή Ag από εκπλύσεις β. Μη ειδική σύνδεση Ab ή Ag me πολυμερές κατά την αντίδραση σχηματισμού συμπλόκου ηλεκτροστατικές δυνάμεις ανάμεσα σε μακρομόρια και αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια Αντιμετώπιση Χρήση ουδέτερων, μη ιοντικών απορρυπαντικών (Tween-20, Triton X-100)

38 ELISA

39 Ραδιοανοσοανάλυση & Ανοσοραδιομετρική Ανάλυση Ραδιοανοσοανάλυση (Radioimmunoassay / RIA) Ανοσοδοκιμασία Ανταγωνιστικού τύπου Χρήση ραδιονουκλιδίων ως ιχνηθέτη και μέτρηση σε μετρητές γ-ακτινοβολίας Στάδια 1.Το προς προσδιορισμό Ag του δείγματος αναμειγνύεται με γνωστή συγκέντρωση ραδιοσημασμένου Ag* 2.Ταυτόχρονος συναγωνισμός για περιορισμένη ποσότητα Ab 3.Διαχωρισμός μη συνδεδεμένων Ag και Ag* 4.Μέτρηση ακτινοβολίας Ανοσοραδιομετρική Ανάλυση (IRMA) Ανοσοδοκιμασία Μη Ανταγωνιστικού τύπου Σημασμένα με ραδιονουκλίδια είναι τα Ab τα οποία προστίθενται σε περίσσεια

40 RIA Η σήμανση γίνεται με: α. Ραδιονουκλίδιο 125 Ι, ή β. ταυτόχρονα με 125 Ι Ι ή 125 Ι + 57 Co για την ταυτόχρονη ανίχνευση 2 Ag γ. 3Η (τρίτιο) παλαιότερη χρήση Πλεονεκτήματα 1.Μικρό μέγεθος ραδιονουκλιδίων ελάχιστη παρεμπόδιση σχηματισμού ανοσοσυμπλόκου 2.Πολύ μεγάλη ευαισθησία (10-12 Μ) α. φύσης γ-ακτινοβολίας β. συναγωνιστικού τύπου 3. Δεν επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες (ph, θερμοκρασία, σύσταση δείγματος - Μικρά σφάλματα Μειονεκτήματα 1.Επικινδυνότητα 2.Δυσκολία αυτοματοποίησης 3.Έλλειψή δυνατότητας ενίσχυσης σήματος Εφαρμογές: Στεροειδείς ορμόνες, Πεπτιδικές ορμόνες, Ανοσοσφαιρίνες, Φάρμακα

41 Ανοσοϊστοχημεία (Immunohistochemistry / IHC) Βασική τεχνική ιστολογικής και κυτταρολογικής ανάλυσης Χρήση σημασμένων Ab εναντίων Ag σε τομές ιστών ή κυτταρικών πληθυσμών Σήμανση με: Εφαρμογές: 1.Φθορίζουσας ουσίας α. Ταυτοποίηση κυτταρικών υποπληθυσμών α. Φλουορεϊσκίνη β. Ταυτοποίηση βακτηρίων β. Ροδαμίνη γ. Ανίχνευση Ab σε αυτοάνοσα γ. Φυκοερυθρίνη δ. Ανίχνευση συστατικών συμπληρώματος ε. Εντοπισμό/χαρακτηρισμό όγκων 2. Χρωμογόνου στ. Προσδιορισμός ορμονών/πρωτεϊνών 3. Σύστημα στρεπταβιδίνης - βιοτίνης Η χρήση φθορίζουσας ένωσης επιτρέπει την ανίχνευση στην ίδια τομή περισσότερων του ενός Ag, εξαιτίας των διαφορετικών φασμάτων διέγερσης και απορρόφησης των φθορισμογόνων Η χρώση μπορεί να είναι άμεση ή έμμεση

42 Ανοσοστύπωμα Western (Western blot) Ευρύτατα χρησιμοποιούμενη μεθοδολογία ανάλυσης πρωτεϊνών για την ανίχνευση και ημι-ποσοτική ανάλυση συγκεκριμένων πρωτεϊνών Στάδια 1. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (PAGE) παρουσία αποδιατακτικού SDS (SDS-PAGE) 2. Μεταφορά πρωτεϊνών σε ειδικές μεμβράνες (νιτροκυτταρίνης, PVDF) με κάθετη ηλεκτροφόρηση 3. Επώαση μεμβράνης με Ab προσδιορισμού ειδικό προς την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος και 2 ου Ab* σημασμένου με ένζυμο ή ραδιονουκλίδιο ή χημειοφωταυγές μόριο 4. Προσδιορισμός σήματος με αυτοραδιογραφία ή χρωμογόνο υπόστρωμα ή χημειοφωταύγεια