Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών. Αρχές Βιοτεχνολογίας. Χαράλαμπος Σταμάτης Καθηγητής

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών Αρχές Βιοτεχνολογίας Χαράλαμπος Σταμάτης Καθηγητής Ιωάννινα 2015 i

2 ii

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η χρήση βιολογικών συστημάτων για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων και υπηρεσιών καλύπτει σήμερα μεγάλο αριθμό διαδικασιών και αφορά σε τομείς, όπως η βιομηχανία φαρμάκων, τροφίμων, χημικών προϊόντων, βιοκαυσίμων, η γεωργία, το περιβάλλον αλλά και σε τομείς που σχετίζονται με την αντιμετώπιση ασθενειών και την ανάπτυξη θεραπειών. Η επιλογή των κεφαλαίων στο σύγγραμμα αυτό έγινε με γνώμονα τις διδακτικές ανάγκες των φοιτητών του Τμήματος, που αφορούν κυρίως στην εξοικείωσή τους με τις βασικές αρχές της Βιοτεχνολογίας. Στη διαμόρφωση του συγγράμματος σημαντικό ρόλο έπαιξαν οι φοιτητές του Τμήματος ΒΕΤ, οι μεταπτυχιακοί φοιτητές, καθώς και το επιστημονικό προσωπικό του εργαστηρίου Βιοτεχνολογίας, οι οποίοι με τις παρατηρήσεις, τις υποδείξεις και τις απορίες τους βοήθησαν στη βελτίωση του περιεχομένου. Ενθαρρύνω τους αναγνώστες του συγγράμματος αυτού να συμβάλλουν με τις παρατηρήσεις και τις υποδείξεις τους στην περαιτέρω βελτίωση του περιεχομένου του, ώστε να επιτελέσει το στόχο του. Χ. Σταμάτης Ιωάννινα, Ιανουάριος 2014 iii

4 iv

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ AΠΟ 1 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 2. ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΕΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΑΠΟ ΓΕΝΕΤΙΚΑ 57 ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 4. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΖΩΙΚΩΝ KAI ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 109 ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΖΩΑ ΚΑΙ ΦΥΤΑ 5. ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ 131 DNA -ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ 6. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ 161 ΜΗΧΑΝΙΚΗ 8. ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ ΚΑΙ 229 ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΕΣ 11. ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ 289 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ 13. ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 345 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 362 v

6 vi

7 Η Βιοτεχνολογία είναι ο διεπιστημονικός κλάδος που αφορά στην τεχνολογική αξιοποίηση των κυττάρων (μικροβιακών, ζωϊκών, φυτικών) ή συστατικών τους ή/και ολόκληρων οργανισμών ή συστημάτων στην παραγωγή προϊόντων, αγαθών ή προσφορά υπηρεσιών. Oι δραστηριότητες της βιοτεχνολογίας χωρίζονται σε 3 κύριες κατηγορίες: 1. Στη λευκή ή βιομηχανική βιοτεχνολογία, η οποία μεταξύ άλλων αφορά στην παραγωγή βιοχημικών (βιοδραστικά μόρια, διατροφικά πρόσθετα, εξειδικευμένα χημικά, μεταβολικά προϊόντα κλπ), βιοϋλικών και βιοκαυσίμων από ανανεώσιμες πηγές ή ακόμη και την αποδόμηση ρύπων και τοξικών ενώσεων με τη χρήση κυττάρων ή και ενζύμων. 2. Στην κόκκινη Βιοτεχνολογία, η οποία αφορά στην εφαρμογή βιολογικών συστημάτων για τη βελτίωση ιατρικών διαδικασιών. Περιλαμβάνει το σχεδιασμό οργανισμών για τη βελτίωση και την παραγωγή φαρμάκων (αντιβιοτικά,εμβόλια κ.ά.), την ανάπτυξη θεραπειών μέσω της μηχανικής των γονιδίων (γονιδιακή και κυτταρική θεραπεία), καθώς και την ανάπτυξη υπηρεσιών στην ιατροδικαστική μέσω της ανάλυσης του DNA. 3. Στην πράσινη Βιοτεχνολογία, η οποία αφορά στις εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στη γεωργία και γενικότερα την αγροτική ανάπτυξη. Περιλαμβάνει το σχεδιασμό διαγονιδιακών φυτών, με στόχο τη βελτίωση των ιδιοτήτων τους ή των προϊόντων τους. Στοχεύει στην ανάπτυξη περισσότερο περιβαλλοντικά φιλικών λύσεων σε σχέση με την παραδοσιακή βιομηχανοποιημένη γεωργία (π.χ. μείωση της χρήσης εντομοκτόνων). Βιοτεχνολογική διεργασία για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας vii

8 0

9 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ AΠΟ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 1.1 Γενικά Τα βιοτεχνολογικά προϊόντα είναι είτε προϊόντα απλών ή πιο πολύπλοκων αντιδράσεων που καταλύονται από απομονωμένα ένζυμα ή κύτταρα, τα οποία μπορεί να πολλαπλασιάζονται ή να είναι νεκρά, ή ακόμη και από εφησυχάζοντα κύτταρα (βιομετατροπές), είτε προϊόντα ενζυμικών αντιδράσεων του μεταβολισμού ζωικών και φυτικών κυττάρων και κυρίως των μικροοργανισμών. Οι μεταβολικές αντιδράσεις που συμμετέχουν στην παραγωγή βιο-χημικών ενώσεων είναι α) οι αναβολικές αντιδράσεις, στις οποίες απλά υποστρώματα, όπως η γλυκόζη, μετατρέπονται σε πολύπλοκα μεταβολικά προϊόντα, όπως αντιβιοτικά, βιοπολυμερή, τερπένια, καροτενοειδή και βιταμίνες και β) οι καταβολικές αντιδράσεις, κατά τις οποίες μεγάλου μοριακού βάρους μόρια μετατρέπονται σε απλά μεταβολικά προϊόντα, όπως η αιθανόλη, η ακετόνη, τα οργανικά οξέα, κ.ά (βλ. Σχήμα 1.1). Στον πίνακα 1.1 παρουσιάζονται χαρακτηριστικές κατηγορίες βιοτεχνολογικών προϊόντων. Υποστρώματα Οργανικές ενώσεις μικρού ή μεγάλου μοριακού βάρους Κύτταρα ζωντανά εφησυχάζοντα νεκρά ή Απομονωμένα ένζυμα Βιομετατροπές/Βιομετασχηματισμοί Προϊόντα μικρού ή μεγάλου μοριακού βάρους Κύτταρα ζωντανά Προϊόντα μεταβολισμού πρωτογενείς μεταβολίτες δευτερογενείς μεταβολίτες 1

10 Σχήμα 1.1 Το κύτταρο μπορεί να θεωρηθεί ένας μικρός αντιδραστήρας μεταβαλλόμενου μεγέθους καθώς αναπτύσσεται και πολλαπλασιάζεται. Α,Β,C υποστρώματα & D,E,F,G μεταβολικά προϊόντα, r μεταβολικές ροές Πίνακας1.1. Χαρακτηριστικές κατηγορίες βιοτεχνολογικών προϊόντων Χαρακτηριστικά Βιοτεχνολογικά Προϊόντα Ένζυμα Βιομάζα (μικροβιακή πρωτεΐνη) Μικροβιακά έλαια Θεραπευτικές πρωτεΐνες Μονοκλωνικά αντισώματα Καταλυτικά αντισώματα Εξειδικευμένα χημικά (Fine chemicals) Βιοκαύσιμα (βιοαιθανόλη, βιοντήζελ, υδρογόνο) Βιταμίνες-Αμινοξέα Ορμόνες Βιοπολυμερή Αντιβιοτικά Εμβόλια- Φάρμακα Πρόσθετα τροφίμων Στην περίπτωση όπου τα προϊόντα της βιοτεχνολογικής βιομηχανίας είναι μεταβολίτες που παράγονται κατά την ανάπτυξη των βιομηχανικών μικροοργανισμών 2

11 ή φυσικών και ζωικών κυττάρων, τότε αυτά μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε: α) πρωτογενείς μεταβολίτες, οι οποίοι είναι ουσιώδεις για την ανάπτυξη και αναπαραγωγή των κυττάρων και η παραγωγή τους σχετίζεται με την ανάπτυξη των κυττάρων και β) δευτερογενείς μεταβολίτες, οι οποίοι δεν είναι απαραίτητοι για την ανάπτυξη και αναπαραγωγή των κυττάρων και παράγονται συνήθως κατά την τελευταία φάση του κύκλου ανάπτυξης των κυττάρων. Στον πίνακα 1.2 εμφανίζονται χαρακτηριστικές κατηγορίες πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών. Η διαφοροποίηση των μεταβολικών προϊόντων μπορεί να γίνει και με τον εξής τρόπο: Προϊόντα Τύπου 1: Παραπροϊόντα των διεργασιών του κυττάρου που αποσκοπούν στην παραγωγή ενέργειας (αιθανόλη, γαλακτικό οξύ, κιτρικό οξύ) Προϊόντα Τύπου 2: Εξωκυτταρικά προϊόντα εκβαλλόμενα από τα κύτταρα, όπως εξωκυτταρικά ένζυμα που εκλύονται για να διασπάσουν κάποια ουσίαυπόστρωμα του κυτταρικού περιβάλλοντος, πολυσακχαρίτες για συσσωμάτωση κυττάρων και άλλα προϊόντα, όπως αντιβιοτικά που μπορεί να στοχεύουν στον αποτελεσματικότερο ανταγωνισμό με άλλα είδη Προϊόντα Τύπου 3: Ενώσεις αποθήκευσης ενέργειας, όπως λίπη, γλυκογόνο Προϊόντα Τύπου 4: Συστατικά του κυττάρου Πίνακας 1.2. Χαρακτηριστικά πρωτογενή και δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα.. Αιθανόλη, Ακετόνη, Βουτανόλη, Γαλακτικό οξύ, Αμινοξέα, Βιταμίνες, Πρωτογενείς μεταβολίτες Νουκλεοτίδια, Ενδιάμεσα προϊόντα της γλυκόλυσης του κύκλου του κιτρικού οξέος, της φωσφορικής πεντόζης, κ.ά Αντιβιοτικά, Μυκοτοξίνες, Χρωστικές, Δευτερογενείς μεταβολίτες Aλκαλοειδή, Ενώσεις με φαρμακευτική δράση Προϊόντα πρωτογενούς μεταβολισμού Για τον πρωτογενή μεταβολισμό, στα κύτταρα παρέχονται όλα τα απαραίτητα για την ανάπτυξη θρεπτικά υλικά (σε περίσσεια στο μέσο ανάπτυξης). Κάτω από αυτές τις συνθήκες, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων γίνεται με εκθετικό ρυθμό, 3

12 ενώ το περιεχόμενο των κυττάρων σε μακρομόρια (DNA, RNA, πρωτεΐνες, λιπίδια, κ.ά) είναι βέλτιστο. Οι πρωτογενείς μεταβολίτες (πίνακας 1.2) είναι μόρια που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και αποτελούν παραδοσιακά προϊόντα των βιομηχανιών ζύμωσης, τα οποία σχηματίζονται κατά τον αναερόβιο μεταβολισμό υδατανθράκων, όπως η γλυκόζη. Προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού Τα προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού συντίθενται από τα κύτταρα κατά την τελευταία φάση ανάπτυξής τους. Δεν είναι ξεκάθαρη η εικόνα που αφορά τους μεταβολικούς δρόμους που ενεργοποιούνται για την παραγωγή των προϊόντων αυτών (πίνακας 1.2). Οι δευτερογενείς μεταβολίτες δεν είναι απαραίτητοι για την αύξηση και αναπαραγωγή των κυττάρων, ενώ ο µηχανισµός ρύθµισης διαφέρει από εκείνον του πρωτογενούς µεταβολισµού. Κάθε δευτερογενής µεταβολίτης προέρχεται µόνο από µικρό αριθµό οργανισµών. Πολλοί παράγονται ως συγγενικές δοµές της ίδιας οµάδας µικροοργανισµών π.χ. από ένα στρεπτοµύκητα παράγονται 32 διαφορετικές ανθρακυκλίνες. Μερικοί οργανισµοί παράγουν πολλές διαφορετικές ουσίες δευτερογενούς µεταβολισµού. Ο έλεγχος της παραγωγής τους από τον άνθρωπο βασίστηκε σε δύο κυρίως προσεγγίσεις. Η πρώτη αφορά στην εισαγωγή τυχαίων μεταλλάξεων και στη διαδικασία της επιλογής των βελτιωμένων στελεχών. Η δεύτερη προσέγγιση αφορά στον έλεγχο της θρέψης και του περιβάλλοντος ανάπτυξης και στον έλεγχο εκατοντάδων συστατικών του θρεπτικού υλικού, που μπορεί να δράσουν ως πρόδρομες ενώσεις ή ενώσεις που αυξάνουν την παραγωγή του επιθυμητού προϊόντος. Αλλαγές στο γονότυπο των µικροοργανισµών μπορεί να οδηγήσει στη σύνθεση νέων µεταβολιτών ή σε υψηλότερη παραγωγή του ήδη υπάρχοντος προϊόντος. Σήμερα, ο κλάδος της Μεταβολικής Μηχανικής, που αφορά στην εφαρμογή των τεχνικών της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA για τον ορθολογικό σχεδιασμό και ανακατεύθυνση μεταβολικών δρόμων, συνιστά μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση προς την κατεύθυνση της παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών (Σχήμα 1.1). 4

13 1.2 Παραγωγή Μικροβιακών Προϊόντων Οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε ποικίλες φυσικές, χημικές και διατροφικές συνθήκες. Ένα μέρος των θρεπτικών συστατικών χρησιμοποιείται για την κάλυψη των ενεργειακών αναγκών του κυττάρου, ενώ κάποιο άλλο μέρος χρησιμοποιείται για βιοσύνθεση και παραγωγή προϊόντων. Ως αποτέλεσμα της μετατροπής του θρεπτικού μέσου, προκύπτει η αύξηση της μικροβιακής μάζας με το χρόνο σύμφωνα με το παρακάτω σχήμα: Υποστρώματα (Πηγή C, N, και Ο2) + Κύτταρα Εξωκυτταρικά προϊόντα + Περισσότερα κύτταρα (βιομάζα) Σχήμα 1.1β Η χειραγώγηση του μεταβολισμού των κυττάρων για την παραγωγή μεταβολικών προϊόντων Οι κυριότερες βιοτεχνολογικές εφαρμογές των μικροοργανισμών σχετίζονται με: Την παραγωγή βιομάζας (μονοκύτταρη πρωτεΐνη) Την παραγωγή πρωτογενών ή δευτερογενών μεταβολιτών χαμηλού μοριακού βάρους Την παραγωγή βιομορίων και βιοπολυμερών (πολυσακχαρίτες, λιπίδια, πρωτεΐνες) 5

14 Την εφαρμογή τους για την τροποποίηση οργανικών υποστρωμάτων (βιομετατροπές) Την εφαρμογή τους σε διαδικασίες που εξαρτώνται από το γενικότερο μεταβολισμό τους (όπως η βιοαποικοδόμηση, η βιοαποκατάσταση, η εκχύλιση μετάλλων κ.ά.) Στον πίνακα 1.3 παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγματα και εφαρμογές μικροβιακών προϊόντων. Πίνακας 1.3. Βιοτεχνολογικά προϊόντα από ζύμες και νηματοειδείς μύκητες Προϊόν Χρήση Ζύμη Νηματοειδής μύκητας Βιομάζα Τρόφιμα Saccharomyces cerevisiae Agaricus bisporus Fusarium venenatum Aιθανόλη Μπύρα, κρασί Saccharomyces cerevisiae CO2 Μπύρα, κρασί Saccharomyces cerevisiae Ενώσεις με αρωματικές ιδιότητες Τρόφιμα, ροφήματα Saccharomyces cerevisiae Pichia guilliermondii Sporobolomyces odorus Trichoderma viride Gibberella fujikuroi Phycomyces blakesleeanus Πολυακόρεστα λιπαρά οξέα Tρόφιμα Cryptococcus curvatus Motrierella alpine Mucorcircinelloides (PUFA) Oργανικά οξέα Συντηρητικά, συστατικά Yarrowia lipolytica Aspergillus niger Aspergillus terreus τροφίμων, χημική σύνθεση Aντιβιοτικά Υγεία Penicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum Penicillium griseofulvum Ομόλογα ένζυμα (αμυλάσες, Διεργασίες τροφίμων, παραγωγή Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Pichia pastoris Aspergillus spp. Rhizopus spp Trichoderma spp κυτταρινάσες και πρωτεάσες) χαρτιού, απορρυπαντικά Pichia angusta Yarrowia lipolytica Ετερόλογες πρωτεΐνες Τρόφιμα και φαρμακευτικά προϊόντα Kluyveromyces lactis Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus nidulans Trichoderma reesi 6

15 Γενικά, οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για τη βιομηχανική παραγωγή προϊόντων περιλαμβάνουν τις ζύμες (yeasts), τα βακτήρια, τους ευρωτομύκητες και τους ακτινομύκητες (νηματοειδή). Tα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί μονοκύτταροι οργανισμοί με μέγεθος ένα ή μερικά μm. Oι ζύμες, ως ευκαρυωτικοί οργανισμοί είναι επίσης μονοκύτταροι οργανισμοί, αλλά μεγαλύτεροι από τα βακτήρια, καθώς το μέγεθος τους κυμαίνεται από 6-12 μm. Οι ευρωτομύκητες είναι πολυκύτταροι ευκαρυωτικοί οργανισμοί, των οποίων το μέγεθος ξεπερνά τα 25μm. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ελάχιστες διαδικασίες εµπορικής ζύµωσης (στη βιοµηχανία τροφίµων) χρησιµοποιούν στελέχη φυσικού τύπου. Συνήθως χρησιµοποιούνται µεταλλαγµένα ή γενετικά τροποποιηµένα στελέχη ειδικά προσαρµοσµένα στις διαδικασίες των ζυµώσεων. Α Β Γ Δ Μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων Α) βακτήρια, Β) φύκη, Γ) μύκητες, Δ) ζύμες 7

16 Στον Πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται βασικά χαρακτηριστικά της μικροβιακής ποικιλότητας. Ποικιλία στις συνθήκες διαβίωσης Θερμοκρασία: από -20 ο C έως 110 ο C ph: από 1.5 έως και 9 Οξυγόνο: από αερόβια έως πλήρως αναερόβια Νερό: από υδατικά διαλύματα μέχρι σε έδαφος με πολύ χαμηλή υγρασία Οι μικροοργανισμοί ανάλογα με τις απαιτήσεις τους σε οξυγόνο ταξινομούνται σε αερόβιους, αναερόβιους, προαιρετικά αερόβιους, μικροαερόφιλους και αεροανεκτικούς. Τα κύρια χαρακτηριστικά τους περιγράφονται στον πίνακα που ακολουθεί. ΑΕΡΟΒΙΟΙ Υποχρεωτικά αερόβιοι Απαιτείται Ο2 Αναερόβια αναπνοή Προαιρετικά αερόβιοι Δεν απαιτείται Ο2 αλλά η ανάπτυξη ευνοείται παρουσία Ο2 Αερόβια αναπνοή Αναερόβια αναπνοή Μικροαερόφιλοι Απαιτείται Ο2 αλλά σε Αερόβια αναπνοή πολύ χαμηλά επίπεδα ΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ Υποχρεωτικά αναερόβιοι Το Ο2 είναι τοξικό Αναερόβια αναπνοή Αεροανεκτικοί Δεν απαιτείται Ο2 - δεν είναι τοξικό Τα κύτταρα των αερόβιων οργανισμών απαιτούν οξυγόνο για την ανάπτυξη και τον μεταβολισμό τους, ενώ οι αναερόβιοι οργανισμοί αναστέλλονται από την παρουσία οξυγόνου και αναπτύσσονται αναερόβια. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αερόβιων οργανισμών είναι τα βακτήρια του οξικού οξέος. Στους αναερόβιους οργανισμούς υπάγονται οι στρεπτομύκητες, που παράγουν αντιβιοτικά και οι πιο πολλοί νηματοειδείς ευρωτομύκητες. Οι δυνητικοί οργανισμοί μπορούν να μεταστρέψουν τα μεταβολικά τους μονοπάτια ώστε να μπορούν να αναπτυχθούν και στις δύο περιπτώσεις, όπως οι ζύμες που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία. Κάτω από αναερόβιες συνθήκες ο μεταβολικός δρόμος της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης δεν είναι ενεργός και παύει ο κύριος μηχανισμός του κυττάρου για 8

17 παραγωγή ενέργειας (βλ. σχήμα 1.2). Η ενέργεια που απαιτείται για το κύτταρο κατά την αναερόβια ανάπτυξη προέρχεται από τον καταβολισμό του υποστρώματος (π.χ γλυκόζη). Η διαδικασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μόλις του 8% της ενέργειας που παράγεται κάτω από αερόβιες συνθήκες. Αυτό σημαίνει ότι για την παραγωγή ίδιας ποσότητας κυττάρων, πολύ μεγαλύτερη ποσότητα υποστρώματος θα πρέπει να αποδομηθεί σε σχέση με την αερόβια ανάπτυξη. Η παραγωγή ενέργειας κάτω από αναερόβιες συνθήκες ονομάζεται ζύμωση. Ο ορισμός αυτός είναι η ακριβής έννοια της ζύμωσης, αν και σήμερα χρησιμοποιείται ευρύτερα. Κάτω από αναερόβιες συνθήκες, το κύτταρο καταφεύγει σε άλλους μηχανισμούς για την αναγέννηση του NAD + και όχι από την αερόβια αναπνοή (βλ. σχήμα 1.2). Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αναγωγής ενδιάμεσων μεταβολιτών σύμφωνα με την αντίδραση: Χ + ΝΑDH XH2 + NAD + Για παράδειγμα, η μετατροπή της γλυκόζης σε πυροσταφυλικό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή 2 μορίων NADΗ, τα οποία επανοξειδώνονται κατά την οξείδωση του ίδιου οξέος σε άλλα προϊόντα. Στους μικροοργανισμούς που αναπτύσσονται αναερόβια μπορούμε να παρατηρήσουμε μια σειρά ανηγμένων μεταβολικών προϊόντων που παράγονται κατά τη διαδικασία της ανάπτυξης (βλ. σχήμα 1.3). Τα κυριότερα από αυτά τα προϊόντα είναι: Η γλυκερόλη, η οποία παράγεται από ζύμες όταν η μετατροπή του πυροσταφυλικού σε αιθανόλη παρεμποδίζεται. Το γαλακτικό οξύ, το οποίο παράγεται από βακτήρια του γαλακτικού Το φορμικό οξύ, που παράγεται από εντεροβακτήρια Η αιθανόλη, η οποία παράγεται από ζύμες (S. cerevisiae), βακτήρια (Z. mobilis) και μύκητες Η βουτανόλη, μαζί με την ακετόνη, την προπανόλη και την ισοπροπανόλη που παράγεται από το Clostridium spp. H 2,3 βουτανοδιόλη, που παράγεται από διάφορα βακτήρια Το προπιονικό οξύ, που παράγεται από το Propioni bacterium 9

18 Σχήμα 1.2 Αερόβιος και αναερόβιος μεταβολισμός CO 2 Γλυκερόλη Φορμικό Γλυκόζη Τριόζη Ρ Γαλακτικό CO 2 Ακεταλδεϋδη Αιθανόλη Η 2 Πυροσταφυλικό 2,3-βουτανοδιόλη Ηλεκτρικό οξύ Προπιονικό οξύ Προπανόλη Οξαλοξικό Ηλεκτρυλο-CoA Προπιονυλο-CoA Βουτυρικό οξύ Ακετυλο- CoA x2 Aκετοακέτυλο-CoA Βουτυρυλο-CoA Βουτανόλη CoA, CO 2 Aκετόνη Προπανόλη Ισοπροπανόλη Σχήμα 1.3. Προϊόντα αναερόβιου μεταβολισμού σε διάφορους μικροοργανισμούς Άλλα προϊόντα προέρχονται από τον αναερόβιο μεταβολισμό ενώσεων διαφορετικών από τη γλυκόζη, όπως για παράδειγμα οργανικά οξέα ή αμινοξέα. Το μεθάνιο (CH4) παράγεται από αρχαιοβακτήρια μέσω της διάσπασης του οξικού σε CO2 και CH4 ή σε ορισμένες περιπτώσεις μέσω της αναγωγής του CO2 της μεθανόλης 10

19 (CH3OH), της αιθανόλης (CH3CH2OH) ή του φορμικού οξέος (HCOOH) παρουσία αέριου Η Aνάπτυξη βιομηχανικών μικροοργανισμών Καθώς η παραγωγή των μεταβολικών-βιοτεχνολογικών προϊόντων των μικροοργανισμών συνδέεται σε μικρό ή μεγάλο βαθμό με την ανάπτυξη των μικροβιακών πληθυσμών, ιδιαίτερη σημασία για τους βιοτεχνολόγους έχει η μελέτη των φαινομένων της μικροβιακής ανάπτυξης. Οι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτυχθούν σε εντελώς διαφορετικές συνθήκες: π.χ. θερμοκρασίες άνω του σημείου βρασμού και χαμηλότερες του σημείου πήξης του νερού, σε υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων, σε υψηλές πιέσεις (>1000 atm) και σε χαμηλές και υψηλές τιμές pη (περίπου 1 έως 10). Με τον όρο ζύμωση (fermentation) αναφερόμαστε στη διαδικασία ανάπτυξης μικροοργανισμών (αν και με την αυστηρή έννοια του όρου αναφερόμαστε αποκλειστικά στην αναερόβια ανάπτυξη). Η ανάπτυξη των κυττάρων λαμβάνει χώρα στο εσωτερικό ενός κατάλληλου δοχείου που εξασφαλίζει τις απαραίτητες συνθήκες ανάπτυξης. Τα δοχεία αυτά είναι γνωστά ως ζυμωτήρες ή βιοαντιδραστήρες. Για τη βιομηχανική παραγωγή προϊόντων μέσω μικροβιακών ζυμώσεων χρησιμοποιούνται βιοαντιδραστήρες (ή και συστοιχία βιοαντιδραστήρων) όγκου από 20 L έως 250 m 3, ενώ σε μονάδες βιολογικού καθαρισμού οι βιοαντιδραστήρες φτάνουν σε όγκο και τα m 3. Γενικά, για τη βιομηχανική ανάπτυξη των μικροοργανισμών χρησιμοποιούνται δύο τεχνικές: α) αυτή της στερεάς κατάστασης (solid state), όπου η ανάπτυξη των μικροοργανισμών γίνεται σε στερεά υλικά χωρίς την παρουσία υγρής φάσης και β) αυτή της καταβύθισης, η οποία γίνεται σε υγρή φάση με ανάδευση σε ζυμωτήρα. Για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε στερεή κατάσταση, χρησιμοποιούνται μεγάλοι δίσκοι, όπου εναποτίθεται το στερεό θρεπτικό υλικό, στο οποίο διοχετεύεται αποστειρωμένος υγρός αέρας. Η ανάπτυξη με τη μέθοδο της καταβύθισης περιλαμβάνει τη χρήση ζυμωτήρων χωρητικότητας έως 250 m 3, στους οποίους τοποθετείται το υγρό ανάπτυξης. Η υγρή φάση αναδεύεται μηχανικά, ενώ διοχετεύονται όλα τα απαραίτητα συστατικά (θρεπτικό υλικό, αέρας) και διατηρούνται όλοι οι παράγοντες (ph, θερμοκρασία) που εξασφαλίζουν την ανάπτυξη της καλλιέργειας. Για καλλιέργειες σε μεγάλη κλίμακα, ο εμβολιασμός του 11

20 βιοαντιδραστήρα γίνεται από κύτταρα που έχουν αναπτυχθεί σε κωνική φιάλη (βλ. σχήμα 1.4). Ο όγκος του εμβολίου είναι περίπου 5-10% του τελικού όγκου του αντιδραστήρα. Σχήμα 1.4 Στάδια για την ανάπτυξη μικροοργανισμών σε βιοαντιδραστήρα. Τα κύτταρα αναπτύσσονται πρώτα σε κωνική φιάλη από την αρχική καλλιέργεια. Η καλλιέργεια προστίθεται σε ζυμωτήρα, που περιέχει αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό και στον οποίο ελέγχεται το ph, η θερμοκρασία, η παροχή οξυγόνου, η ανάδευση. Σταδιακά, ο όγκος της καλλιέργειας μπορεί να αυξηθεί χρησιμοποιώντας κάθε φορά ως εμβόλιο περίπου το 5-10% του τελικού όγκου του βιοαντιδραστήρα. 1.4 Μικροβιακές Ζυμώσεις Οι ζυμώσεις διακρίνονται σε α) διαλείποντος έργου ή στατικές, β) ημιδιαλείπoντος έργου ή ημιστατικές και γ) συνεχείς. Οι ζυμώσεις διαλείποντος έργου (batch fermentations) αποτελούν κλειστά συστήματα. Η ανάπτυξη κυττάρων γίνεται σε βιοαντιδραστήρα που περιέχει ένα αρχικό θρεπτικό υλικό, το οποίο δε μεταβάλλεται από περαιτέρω προσθήκη ή αφαίρεση θρεπτικού υλικού. Ο συγκεκριμένος τύπος καλλιέργειας είναι απλός και αρκετά διαδεδομένος, τόσο σε εργαστηριακό, όσο και σε βιομηχανικό επίπεδο. 12

21 Ζύμωση δειαλείποντος έργου Στις ζυμώσεις ημιδιαλείποντος έργου (fed-batch fermentations), τα απαραίτητα υποστρώματα προστίθενται στην αρχή της ζύμωσης. Όταν η συγκέντρωση ενός υποστρώματος είναι ανασταλτική για την παραγωγή ενός επιθυμητού προϊόντος, τότε το υπόστρωμα αυτό προστίθεται αρχικά σε πολύ μικρή συγκέντρωση. Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης προστίθεται συνεχώς μικρή ποσότητα του υποστρώματος αυτού, έτσι ώστε κάθε στιγμή η συγκέντρωση του να είναι κάτω από το ανασταλτικό όριο. Μια τέτοια ζύμωση αφορά στην παραγωγή της πενικιλλίνης, όπου το υπόστρωμα (γλυκόζη) δρα ανασταλτικά στην παραγωγή της. Το πλεονέκτημα της διεργασίας αυτής σχετίζεται με την αύξηση της παραγωγής βιομάζας και στην εξουδετέρωση της καταβολικής καταστολής. Ζύμωση ημιδειαλείποντος έργου Στις συνεχείς ζυμώσεις (continuous fermentation), το σύστημα είναι ανοικτό. Στις ζυμώσεις του τύπου αυτού, αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό προστίθεται συνεχώς στην αυξανόμενη καλλιέργεια, ενώ ταυτόχρονα αφαιρείται ίση ποσότητα κυτταρικής 13

22 καλλιέργειας. Οι συνεχείς ζυμώσεις διακρίνονται α) σε ομοιογενείς ζυμώσεις, όπου το θρεπτικό υλικό που εισρέει αναμιγνύεται ομοιόμορφα με την αναπτυσσόμενη καλλιέργεια και β) σε ζυμώσεις συνεχούς ροής, όπου το θρεπτικό υλικό εισρέει και εκρέει, δίχως να αναμιγνύεται. Ανάλογα με την παράμετρο ελέγχου διακρίνουμε τους: - χημοστάτες (chemostats), όπου τα κύτταρα βρίσκονται σε συνθήκες ισορροπίας και ο έλεγχος της αύξησης γίνεται μέσω του ελέγχου ροής του θρεπτικού υλικού -τους θολοστάτες, όπου η αύξηση ελέγχεται μέσω της συγκέντρωσης της βιομάζας, η οποία συνέχεια ελέγχεται μέσω της θολότητάς της. Ανάπτυξη σε ανοικτό σύστημα συνεχούς λειτουργίας Ανάπτυξη διαλείποντος έργου Με τον όρο ζύμωση διαλείποντος έργου αναφερόμαστε στην ανάπτυξη κυττάρων σε κάποιο δοχείο που περιέχει ένα αρχικό θρεπτικό υλικό, το οποίο δε μεταβάλλεται από περαιτέρω προσθήκη ή αφαίρεση θρεπτικού υλικού. Κατά την ανάπτυξη αυτού του τύπου, οι συνθήκες ανάπτυξης μεταβάλλονται διαρκώς. Ο συγκεκριμένος τύπος καλλιέργειας είναι απλός και αρκετά διαδεδομένος, τόσο σε εργαστηριακό, όσο και σε βιομηχανικό επίπεδο. Όταν τα κύτταρα αναπτύσσονται σε υγρή καλλιέργεια σε κλειστό σύστημα (βιοαντιδραστήρας διαλείποντος έργου), τότε η ανάπτυξή τους περνά από διάφορες φάσεις, όπως αυτό φαίνεται στο σχήμα

23 Μια τυπική καμπύλη ανάπτυξης σε διεργασία διαλείποντος έργου περιλαμβάνει τις ακόλουθες φάσεις: (1) λανθάνουσα φάση (φάση επώασης), (2) φάση επιτάχυνσης, (3) λογαριθμική ή εκθετική φάση, (4) φάση επιβράδυνσης, (5) φάση στασιμότητας και (6) φάση θανάτου.. Σχήμα 1.5 Καμπύλη κυτταρικής ανάπτυξης, μεταβολή της συγκέντρωσης της βιομάζας Χ και μεταβολή του ειδικού ρυθμού αύξησης σε κλειστό σύστημα. Η λανθάνουσα φάση ξεκινά αμέσως μετά τον εμβολιασμό και είναι μια περίοδος προσαρμογής των κυττάρων στο νέο περιβάλλον. Στη φάση αυτή, η μάζα των κυττάρων μπορεί να αυξηθεί ελάχιστα, χωρίς όμως να αυξηθεί ο αριθμός των κυττάρων (dx/dt=0). H διάρκεια αυτής της φάσης δεν μπορεί εύκολα να προβλεφθεί και εξαρτάται από την ποσότητα του εμβολίου, αλλά και από ιδιαίτερα μεταβολικά χαρακτηριστικά του μικροοργανισμού ή και από την παρουσία τοξικών ουσιών στο μέσο ανάπτυξης, κ.ά. 15

24 Οι μικροοργανισμοί αναδιοργανώνουν τη μοριακή τους σύσταση όταν μεταφέρονται σε νέο θρεπτικό μέσο. Με βάση τη σύσταση των θρεπτικών συστατικών, νέα ένζυμα συντίθενται, η βιοσύνθεση κάποιων άλλων καταστέλλεται και γενικά ο εσωτερικός μηχανισμός των κυττάρων προσαρμόζεται στις νέες περιβαλλοντικές συνθήκες. Όταν το εμβόλιο είναι μικρό και περιέχει μικρό ποσοστό ζωντανών κυττάρων, μπορεί να παρατηρηθεί μια ψευδο-λανθάνουσα φάση, η οποία είναι αποτέλεσμα όχι της προσαρμογής, αλλά της μικρής ποσότητας εμβολίου ή της κακής κατάστασής του. Όταν το θρεπτικό υλικό ανάπτυξης περιέχει πάνω από μία πηγές άνθρακα, είναι δυνατό να παρατηρηθούν περισσότερες από μία λανθάνουσες φάσεις. Το φαινόμενο αυτό, γνωστό ως διαύξιμη ανάπτυξη (diauxic growth), οφείλεται στην αλλαγή των μεταβολικών μονοπατιών στο μέσο κάποιου κύκλου ανάπτυξης. Στην περίπτωση αυτή, τα κύτταρα εξαντλούν πρώτα τη μία από τις πηγές άνθρακα του θρεπτικού υλικού και στη συνέχεια προσαρμόζουν τις μεταβολικές τους δραστηριότητες, έτσι ώστε να αξιοποιήσουν μία δεύτερη πηγή άνθρακα. Η πρώτη πηγή άνθρακα είναι πιο εύκολα αποικοδομήσιμη από τη δεύτερη και η παρουσία της καταστέλλει τη σύνθεση των ενζύμων που απαιτούνται για το μεταβολισμό του δεύτερου υποστρώματος. Η εκθετική φάση ανάπτυξης είναι επίσης γνωστή και ως λογαριθμική φάση, καθώς ο αριθμός των κυττάρων αυξάνει λογαριθμικά. Κατά τη φάση αυτή, τα κύτταρα έχουν ήδη προσαρμοστεί στο νέο τους περιβάλλον. Μετά τη φάση προσαρμογής, τα κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιαστούν γρήγορα, με αποτέλεσμα τόσο η μάζα, όσο και ο αριθμός των κυττάρων να αυξάνεται εκθετικά με το χρόνο. Κατά τη διάρκεια της φάσης αυτής,όλα τα συστατικά μέρη του κυττάρου αυξάνονται με τον ίδιο ρυθμό. Για το λόγο αυτό, η μέση σύσταση ενός κυττάρου παραμένει σχεδόν σταθερή κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης ανάπτυξης. Στην εκθετική φάση ανάπτυξης, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης είναι ανεξάρτητος της συγκέντρωσης των θρεπτικών συστατικών, καθώς οι συγκεντρώσεις τους στη φάση αυτή είναι μεγάλες. Ο χρόνος διπλασιασμού της κυτταρικής μάζας συχνά είναι μικρός, καθώς ανέρχεται σε min μόνο. Σε ένα περιβάλλον χωρίς περιορισμούς, ο ρυθμός αύξησης ενός μικροβιακού πληθυσμού είναι ανάλογος της κυτταρικής συγκέντρωσης: dx net X (1.1) dt 16

25 όπου Χ είναι η συγκέντρωση των κυττάρων (g/1), t ο χρόνος (h) και μnet ονομάζεται ο καθαρός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) 1. Με ολοκλήρωση της εξίσωσης 1.1 για Χ=Χο όταν t=0, προκύπτει ότι ln( X X o ) net t ή X X o e net t (1.2) όπου Χ και Χο είναι οι κυτταρικές συγκεντρώσεις σε χρόνο t και t=0, αντίστοιχα. Η εξίσωση 1.2 δίνει τη μεταβολή της κυτταρικής συγκέντρωσης συναρτήσει του χρόνου. Η εκθετική ανάπτυξη χαρακτηρίζεται από την ευθεία γραμμή που παρατηρείται σε ημιλογαριθμικό διάγραμμα του lnx ως προς το χρόνο, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.6: ln [Χ] Κλίση= μnet Χρόνος Σχήμα 1.6 Εξάρτηση συγκέντρωσης βιομάζας από το χρόνο στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Θεωρώντας ότι ο χρόνος για τον διπλασιασμό της συγκέντρωσης της βιομάζας X σε 2Χ είναι ίσος με td, από την εξίσωση 1.2 προκύπτει ότι και 2X ln t net D (1.3) X ln2=μnettd t D ln = net net (1.4) 1 Ο καθαρός ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μ netορίζεται ως η διαφορά μεταξύ του συνολικού ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ g(h -1 )και του ρυθμού μείωσης της κυτταρικής μάζας λόγω του θανάτου των κυττάρων ή του ενδογενούς μεταβολισμού k d(h -1 ). 17

26 Με τον ίδιο τρόπο, μπορεί να υπολογιστεί ο χρόνος διπλασιασμού με βάση τον αριθμό των κυττάρων (td / ) και τον καθαρό ρυθμό αναπαραγωγής μr, όπως δίνεται από τη σχέση 1.5 / t D ln2 (1.5) R όπου: R 1 N dn dt και Ν o αριθμός των κυττάρων Στον Πίνακα 1.4 δίνονται ενδεικτικές τιμές του χρόνου διπλασιασμού με βάση τον αριθμό των κυττάρων (td / ) Πίνακας 1.4 Ενδεικτικές τιμές του χρόνου διπλασιασμού (td / ) Οργανισμός td / (h 1 ) Ζύμες Βακτήρια Μύκητες Στη φάση επιβράδυνσης που ακολουθεί την εκθετική φάση, η ανάπτυξη επιβραδύνεται είτε λόγω της εξάντλησης ενός ή περισσότερων σημαντικών θρεπτικών υλικών, είτε από τη συσσώρευση τοξικών παραπροϊόντων της ανάπτυξης. Σε μια τυπική καλλιέργεια βακτηρίου, οι αλλαγές αυτές πραγματοποιούνται σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Κατά τη διάρκεια της φάσης αυτής η σύσταση και το μέγεθος του κυττάρου μεταβάλλονται. Η φάση στασιμότητας ξεκινά στο τέλος της φάσης επιβράδυνσης, όταν ο καθαρός ρυθμός ανάπτυξης μηδενίζεται (απουσία διαίρεσης του κυττάρου) ή όταν ο ρυθμός ανάπτυξης ισούται με το ρυθμό θανάτου των κυττάρων. Αν και ο καθαρός ρυθμός ανάπτυξης ισούται με μηδέν στη φάση στασιμότητας, τα κύτταρα είναι μεταβολικά ενεργά και παράγουν δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα. Κατά τη διάρκεια της φάσης στασιμότητας μπορεί να λάβουν χώρα ένα ή περισσότερα από τα ακόλουθα φαινόμενα: 18

27 1. Η συνολική συγκέντρωση της μάζας των κυττάρων μπορεί να παραμένει σταθερή, αλλά ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων μειώνεται. 2. Είναι δυνατό να συμβεί λύση των κυττάρων και να μειωθεί ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων. Επίσης, μπορεί να εμφανιστεί μια δεύτερη φάση ανάπτυξης και κύτταρα μπορεί να αναπτυχθούν με υπόστρωμα τα προϊόντα της λύσης άλλων κυττάρων (κρυπτοανάπτυξη cryptic growth). 3. Τα κύτταρα μπορεί να μην αναπτύσσονται, αλλά να είναι μεταβολικά ενεργά και να παράγουν δευτερογενείς μεταβολίτες. Η ρύθμιση των λειτουργιών του κυττάρου μεταβάλλεται, όταν η συγκέντρωση ορισμένων μεταβολιτών (άνθρακας, άζωτο, φωσφορικά) είναι χαμηλή. Κατά τη διάρκεια της φάσης στασιμότητας, τα κύτταρα καταβολίζουν τα αποθέματά τους για το σχηματισμό νέων δομικών συστατικών και μονομερών ουσιών, που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ενέργειας. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται ενδογενής μεταβολισμός. Ο λόγος για τον τερματισμό της ανάπτυξης μπορεί να είναι είτε η εξάντληση βασικών θρεπτικών συστατικών, είτε η συσσώρευση τοξικών προϊόντων. Η παραγωγή της αιθανόλης από ζύμες αποτελεί παράδειγμα ζύμωσης, στην οποία το προϊόν αναστέλλει την ανάπτυξη. Στο τέλος της φάσης στασιμότητας, είτε λόγω εξάντλησης θρεπτικών συστατικών, είτε λόγω συγκέντρωσης τοξικών προϊόντων, ξεκινά η φάση θανάτου. Η φάση θανάτου ακολουθεί τη φάση στασιμότητας. Βέβαια, ο θάνατος των κυττάρων μπορεί να ξεκινήσει από τη φάση στασιμότητας και ο διαχωρισμός ανάμεσα στις δύο φάσεις δεν είναι πάντα εμφανής. Στο σχήμα 1.5 καθώς και στον πίνακα 1.5 αναφέρεται η τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ στις διάφορες φάσεις κυτταρικής ανάπτυξης σε διεργασία διαλείποντος έργου. 19

28 Πίνακας 1.5 Φάσεις κυτταρικής ανάπτυξης σε διεργασία διαλείποντος έργου Φάση ανάπτυξης Χαρακτηριστικά Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μ) Φάση επώασης Τα κύτταρα προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον, μηδενική ή πολύ μικρή μ 0 ανάπτυξη Εκθετική φάση Η ανάπτυξη έχει το μέγιστο δυνατό ρυθμό μ = μmax Στατική φάση Η ανάπτυξη σταματά μ = 0 Φάση θανάτου Τα κύτταρα αρχίζουν να πεθαίνουν και παρατηρείται αυτόλυση μ < 0 Για την καλύτερη περιγραφή της κινητικής της ανάπτυξης των κυττάρων ορίζονται κάποιες παράμετροι που σχετίζονται με τη στοιχειομετρία των βιολογικών αντιδράσεων. Οι συντελεστές μετατροπής ορίζονται με βάση το ποσό της κατανάλωσης κάποιου άλλου συστατικού. Για παράδειγμα, ο συντελεστής μετατροπής του υποστρώματος S σε μικροβιακή μάζα X δίνεται από τη σχέση: Y X / S S (1.6) Για μικροοργανισμούς που αναπτύσσονται αερόβια με υπόστρωμα τη γλυκόζη, το ΥΧ/S κυμαίνεται συνήθως ανάμεσα σε 0.4 έως 0.6 g/g για τα περισσότερα βακτήρια και ζύμες, ενώ το Y X / O 2 (η βιομάζα που παράγεται συναρτήσει του οξυγόνου που καταναλώνεται) κυμαίνεται συνήθως ανάμεσα σε 0.9 και 1.4 g/g. Η αναερόβια ανάπτυξη έχει μικρότερη απόδοση και ο συντελεστής μετατροπής του υποστρώματος σε μικροβιακή μάζα μειώνεται δραστικά. Με υποστρώματα διαφορετικά από τη γλυκόζη, η τιμή της απόδοσης της κυτταρικής ανάπτυξης μεταβάλλεται. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο συντελεστής μετατροπής κάποιου υποστρώματος σε μικροβιακή μάζα είναι 1.0 ± 0.4 g βιομάζας ανά g άνθρακα που καταναλώνεται. H παραγωγή μικροβιακών προϊόντων κατά την ανάπτυξη των μικροοργανισμών Ο σχηματισμός ενός μικροβιακού προϊόντος μπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως σχετιζόμενος με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (σχήμα 1.7α) και ως μη σχετιζόμενος με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (Σχήμα 1.7β). Στο σχετιζόμενο 20

29 με την ανάπτυξη σχηματισμό προϊόντος, ο ρυθμός παραγωγής του προϊόντος (rp) είναι ανάλογος του ρυθμού ανάπτυξης (rp=α rx). Η παραγωγή βασικών μεταβολικών ενζύμων, η μονοκύτταρη πρωτεΐνη και η αιθανόλη αποτελούν παραδείγματα προϊόντων από αναπτυσσόμενα κύτταρα. Σ αυτή την περίπτωση η αύξηση της βιομάζας, ο καταβολισμός των υδατανθράκων και η παραγωγή του προϊόντος τρέχουν παράλληλα. Αντίθετα, ο μη σχετιζόμενος με την ανάπτυξη σχηματισμός προϊόντος δεν είναι ανάλογος της ταχύτητας ανάπτυξης. Στην περίπτωση αυτή, ο ρυθμός παραγωγής του προϊόντος είναι ανάλογος της συγκέντρωσης της βιομάζας Χ (rp= β Χ). Σε κάποιες μάλιστα περιπτώσεις, η παραγωγή προϊόντος συνεχίζεται και μετά την παύση της μικροβιακής ανάπτυξης. Υπάρχουν δύο σημαντικές κατηγορίες προϊόντων που δεν σχετίζονται με την ανάπτυξη, όπως είναι οι δευτερογενείς μεταβολίτες και ορισμένα ζυμωτικά τελικά προϊόντα. Πολλά μεταβολικά προϊόντα, όπως αντιβιοτικά (π.χ. πενικιλίνη), προέρχονται από μη αναπτυσσόμενα κύτταρα. Το προϊόν παράγεται από ένα δευτερογενές μονοπάτι, στο οποίο ενδιάμεσα προϊόντα που σχηματίστηκαν, διαδραματίζουν το ρόλο του υποστρώματος για το σχηματισμό του επιθυμητού προϊόντος. Σχήμα 1.7α. α) Σχετιζόμενος και β) μη σχετιζόμενος με την κυτταρική ανάπτυξη σχηματισμός προϊόντος. 21

30 Μια τρίτη κατηγορία αφορά στην περίπτωση όπου, ο πρωτογενής μεταβολισμός και ο σχηματισμός του προϊόντος συμβαίνουν σε τελείως διαφορετικούς χρόνους. Το προϊόν δεν παράγεται από τον καταβολισμό, αλλά από αμφιβολική μεταβολική οδό. Αρχικά λειτουργεί ο πρωτογενής μεταβολισμός, που συνοδεύεται από κατανάλωση υποστρώματος και παραγωγή βιομάζας. Το προϊόν παράγεται με τις αντιδράσεις του ενδιάμεσου μεταβολισμού, π.χ. παραγωγή αντιβιοτικών και βιταμινών. Σχήμα 1.7β Καμπύλη παραγωγής στρεπτομυκίνης Βιομηχανικές παράμετροι ζυμώσεων Δύο είναι οι βασικές παράμετροι βιομηχανικών ζυμώσεων για την παραγωγή προϊόντων: η απόδοση και η παραγωγικότητα. Με τον όρο απόδοση Υ αναφερόμαστε στο λόγο της συγκέντρωσης του παραγόμενου προϊόντος ως προς τη συγκέντρωση του καταναλωθέντος υποστρώματος: 22

31 Οι συντελεστές απόδοσης χρησιμοποιούνται για να χαρακτηρίσουν την πορεία των ζυμώσεων, δηλαδή τη σχέση ανάμεσα στα παραγόμενα κύτταρα και ενός έκαστου υποστρώματος, το οποίο έχει μετατραπεί σε βιομάζα ή ενέργεια. Η απόδοση εξαρτάται από διάφορους παράγοντες βιολογικούς και φυσικοχημικούς, όπως η συγκέντρωση των κυττάρων, ο ρυθμός ανάπτυξης, η συγκέντρωση των υποστρωμάτων και του οξυγόνου, ο λόγος της συγκέντρωσης των υποστρωμάτων, κ.ά. Mε τον όρο παραγωγικότητα Ρ αναφερόμαστε στο λόγο συγκέντρωσης του παραγόμενου προϊόντος προς το χρόνο της ζύμωσης: Σε βιομηχανικό επίπεδο, η παραγωγικότητα επηρεάζεται από τις συνθήκες ζύμωσης (υπόστρωμα, αερισμός, ανάδευση, θερμοκρασία), αλλά και από παράγοντες που αυξάνουν το χρόνο ζύμωσης, όπως ο χρόνος αποστείρωσης, ο χρόνος που απαιτείται για την τροφοδοσία του βιοαντιδραστήρα ή τον καθαρισμό του, κ.ά. Περιοριστικοί παράγοντες ανάπτυξης Η διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών επιδρά σε μεγάλο βαθμό στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης. Αν ένα θρεπτικό συστατικό είναι σε συγκέντρωση τέτοια που να περιορίζει την ανάπτυξη των κυττάρων, αυτό ονομάζεται ως περιοριστικό για την ανάπτυξη θρεπτικό συστατικό (growth limiting nutrient). Aν δε αυτό είναι η πηγή άνθρακα ή αζώτου, τότε ονομάζεται ως περιοριστικό για την ανάπτυξη υπόστρωμα. Ο σχεδιασμός ορισμένων μέσων καλλιέργειας γίνεται με τέτοιο τρόπο, ώστε το τέλος της ζύμωσης να καθορίζεται από τη διαθέσιμη συγκέντρωση της πηγής άνθρακα. Άλλα μέσα σχεδιάζονται έτσι, ώστε η πηγή αζώτου να είναι ο περιοριστικός παράγοντας ανάπτυξης (π.χ. παραγωγή χρωστικών από φύκη, κ.ά). Σε μεγάλους ζυμωτήρες, η διαθεσιμότητα του Ο2 είναι ο παράγοντας αυτός που περιορίζει την ταχύτητα ανάπτυξης των κυττάρων. 1.5 To μοντέλο Monod Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η αύξηση της βιομάζας εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών στο μέσο ανάπτυξης. Στην περίπτωση 23

32 όπου ένα θρεπτικό συστατικό καταστεί περιοριστικός για την ανάπτυξη παράγοντας (υπόστρωμα), τότε ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μg εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υποστρώματος αυτού, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.8 Το 1942 ο Jaques Monod πρότεινε ότι η ακόλουθη εξίσωση μπορεί να περιγράψει την επίδραση του περιοριστικού για την ανάπτυξη παράγοντα (υποστρώματος) στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης μg: max g K S S S (1.7) όπου μmax o μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης, ΚS η σταθερά Monod ή σταθερά κορεσμού και S η συγκέντρωση του περιοριστικού για την ανάπτυξη παράγοντα. O μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης μmax αντιστοιχεί στη μέγιστη ταχύτητα ανάπτυξης, όταν η συγκέντρωση του περιοριστικού υποστρώματος για την ανάπτυξη δεν έχει μειωθεί. Όσο υψηλότερη είναι η τιμή του μmax, τόσο υψηλότερη είναι η ταχύτητα ανάπτυξης. Η σταθερά Monod (KS) αντιστοιχεί στη συγκέντρωση του περιοριστικού για την ανάπτυξη υποστρώματος, κατά την οποία ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης είναι ίσος με το μισό του μέγιστου ρυθμού ανάπτυξης (μg=μmax /2). Η σταθερά Monod (KS) αντιπροσωπεύει τη συγγένεια ενός οργανισμού για το υπόστρωμα. μg μmax μmax /2 KS Σχήμα 1.8. Εξάρτηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ από τη συγκέντρωση του περιοριστικού για την ανάπτυξη υποστρώματος. [S] Από τις εξισώσεις 1.1 και 1.7 προκύπτει ότι dx dt max S S S X (1.8) 24

33 Οι τιμές των σταθερών (KS, μmax) εξαρτώνται από τον οργανισμό, το περιοριστικό για την ανάπτυξη υπόστρωμα, το μέσο ανάπτυξης και από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως το ph και η θερμοκρασία. Οι συνήθεις τιμές για το μmax κυμαίνονται από h -1 και για τη σταθερά KS συνήθως είναι κάτω από 0.1 gl -1. Ο προσδιορισμός του μmax. Όπως ειπώθηκε παραπάνω, σε μια τυπική καλλιέργεια σε κλειστό σύστημα, η διαθεσιμότητα του θρεπτικού συστατικού θα μειώνεται, σε γενικές γραμμές, προς το τέλος της ζύμωσης. Αυτό θα οδηγεί σε μείωση της ταχύτητας ανάπτυξης, καθώς τα κύτταρα θα εισέρχονται στη στατική φάση (βλ. σχήμα 1.5). Παράλληλα, η κυτταρική ανάπτυξη είναι δυνατό να περιοριστεί, ως αποτέλεσμα της αναστολής της από την αύξηση της συγκέντρωσης των τελικών προϊόντων στο σύστημα. Κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης, η συγκέντρωση του περιοριστικού για την ανάπτυξη υποστρώματος σε γενικές γραμμές είναι μεγαλύτερη από την τιμή της σταθεράς ΚS. Για παράδειγμα, η τυπική αρχική συγκέντρωση ενός σακχάρου που χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα κυμαίνεται από g/l, ενώ η σταθερά ΚS μιας τυπικής μικροβιακής ζύμωσης είναι μικρότερη από 0.05 g/l. Από την εξίσωση 1.7 προκύπτει ότι, όταν S>>KS,τότε μ=μmax. Ο προσδιορισμός της σταθεράς ΚS Σε γενικές γραμμές, ο προσδιορισμός της σταθεράς ΚS γίνεται με τη βοήθεια μετασχηματισμών τύπου Lineweaver-Burke ή Eadie-Hofstee της εξίσωσης 1.7 (με τρόπο αντίστοιχο όπως στην εξίσωση Michaelis Menten). Σε γενικές όμως γραμμές, η χρησιμοποίηση κλειστών συστημάτων για τον προσδιορισμό της σταθεράς ΚS οδηγεί σε μη ικανοποιητικά αποτελέσματα. Αντίθετα, ο προσδιορισμός της σταθεράς αυτής σε συστήματα συνεχούς καλλιέργειας γίνεται με πολύ μεγαλύτερη ακρίβεια. 1.6 Θρεπτικά Υλικά Ανάπτυξης Τα περισσότερα από τα προϊόντα που σχηματίζονται από τους οργανισμούς παράγονται ως αποτέλεσμα του μεταβολισμού από τα κύτταρα των θρεπτικών συστατικών (πηγή άνθρακα και αζώτου, αυξητικές ορμόνες, ιόντα κ.ά). Τόσο οι ποιοτικές, όσο και οι ποσοτικές διατροφικές απαιτήσεις των κυττάρων, πρέπει να 25

34 προσδιορίζονται ώστε να βελτιστοποιούνται η αύξηση και ο σχηματισμός των προϊόντων. Προϋπόθεση µέγιστης παραγωγής είναι ένα άριστα ρυθµισµένο θρεπτικό υπόστρωµα του µικροοργανισµού. Οι θρεπτικοί παράγοντες (ουσίες) που απαιτούνται από τα κύτταρα ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες: 1. Οι μακροδιατροφικοί παράγοντες, όπως ο άνθρακας, το άζωτο, το οξυγόνο, το υδρογόνο, το θείο, ο φώσφορος, ιόντα Mg 2+ και Κ +, είναι απαραίτητοι σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 10-4 Μ. 2. Οι μικροδιατροφικοί παράγοντες, όπως ιόντα Μο 2+, Zn 2+, Cu 2+, Mn 2+, Ca 2+, βιταμίνες, αυξητικές ορμόνες και πρόδρομοι μεταβολιτών, οι οποίοι είναι αναγκαίοι σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 10-4 Μ. Μακροτροφικά Θρεπτικά Συστατικά Οι ενώσεις άνθρακα είναι σημαντικές πηγές κυτταρικού άνθρακα και ενέργειας. Οι μικροοργανισμοί είναι ταξινομημένοι σε δύο κατηγορίες με βάση την πηγή άνθρακά τους: (1) Οι ετερότροφοι χρησιμοποιούν οργανικές ενώσεις, όπως υδατάνθρακες, λιπίδια και υδρογονάνθρακες, ως πηγή άνθρακα και ενέργειας. (2) Οι αυτότροφοι χρησιμοποιούν διοξείδιο του άνθρακα ως πηγή άνθρακα, αν και η αυτοτροφική αύξηση ενεργοποιείται από ορισμένες οργανικές ενώσεις. Οι προαιρετικά αυτότροφοι αναπτύσσονται κανονικά σε αυτότροφες συνθήκες, αλλά μπορούν να αναπτυχθούν και σε ετερότροφες συνθήκες απουσία CO2 και ανόργανων πηγών ενέργειας. Οι χημειοαυτότροφοι χρησιμοποιούν το CO2 ως πηγή άνθρακα και λαμβάνουν ενέργεια από την οξείδωση των ανόργανων ενώσεων. Οι φωτοαυτότροφοι χρησιμοποιούν το CO2 ως πηγή άνθρακα και χρησιμοποιούν το φως ως πηγή ενέργειας. Στις βιομηχανικές ζυμώσεις, οι πιο κοινές πηγές άνθρακα είναι η μελάσα (σακχαρόζη παραπροϊόν της βιομηχανίας ζάχαρης), η σταφίδα, το άμυλο (γλυκόζη, δεξτρίνη), το σιρόπι καλαμποκιού και τα απόβλητα χαρτοποιίας (γλυκόζη). Στις εργαστηριακές ζυμώσεις, η γλυκόζη, η σακχαρόζη και η φρουκτόζη είναι οι πιο κοινές πηγές άνθρακα. Η μεθανόλη, η αιθανόλη και το μεθάνιο αποτελούν επίσης φτηνές πηγές άνθρακα για ορισμένες ζυμώσεις. Στις αερόβιες ζυμώσεις, περίπου το 50% του άνθρακα των υποστρωμάτων ενσωματώνεται στα κύτταρα και περίπου το 50% χρησιμοποιείται ως πηγή ενέργειας. Στις αναερόβιες ζυμώσεις, ένα μεγάλο 26

35 μέρος του άνθρακα των υποστρωμάτων μετατρέπεται σε προϊόντα και ένα μικρότερο μέρος (<30%) μετατρέπεται σε κυτταρική μάζα. Oι πλέον ευρύτατα χρησιμοποιούμενες πηγές αζώτου είναι η αμμωνία ή τα άλατα αμμωνίου όπως NH4CI, (NH4)2SO4 και NH4NO3, οι πρωτεΐνες, τα πεπτίδια και τα αμινοξέα. Το άζωτο ενσωματώνεται στην κυτταρική μάζα υπό μορφή πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων. Μερικοί οργανισμοί, όπως αζωτοβακτήρια και κυανοβακτήρια, δεσμεύουν άζωτο από την ατμόσφαιρα και σχηματίζουν αμμωνία. Η ουρία μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως πηγή αζώτου από μερικούς οργανισμούς. Μερικές πηγές άνθρακα και αζώτου, που χρησιμοποιούνται από τη βιομηχανία ζυμώσεων, περιγράφονται στον πίνακα 1.6. Πίνακας 1.6. Μερικές πηγές αζώτου και άνθρακα που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία ζυμώσεων Πηγές άνθρακα Πηγές αζώτου Κατάλοιπα αμύλου Μελάσα (σακχαροκάλαμο και τεύτλα) Ορός γάλακτος Κλάσματα πετρελαίου Οικιακά απόβλητα Κυτταρινούχα κατάλοιπα Σόγια Εκχύλισμα ζύμης (yeast extract) Εκχύλισμα αραβοσίτου, βαμβακόσπορου Εκχύλισμα φυστικιών Εκχυλίσματα ψαριών και καλαμποκιού Πεπτόνες (προϊόντα υδρόλυσης πρωτεϊνών) Το αέριο οξυγόνο εισάγεται στα αυξητικά θρεπτικά υλικά με ψεκασμό αέρα ή με αερισμό της επιφάνειας. Το υδρογόνο προέρχεται από ενώσεις άνθρακα, όπως οι υδατάνθρακες. Μερικά βακτήρια, όπως τα μεθανογόνα, μπορούν να χρησιμοποιήσουν ως πηγή ενέργειας το υδρογόνο. Τα ανόργανα φωσφορικά άλατα, όπως τα ΚΗ2ΡΟ4 και Κ2ΗΡΟ4, είναι κοινές πηγές φωσφόρου, ενώ τα γλυκεροφωσφορικά μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως οργανικές πηγές φωσφορικού άλατος. Αντίστοιχα, βασική πηγή θείου αποτελούν ορισμένα θειικά άλατα, όπως το (ΝΗ4)2SO4. Επίσης, ορισμένα αμινοξέα που περιέχουν θείο μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως πηγή θείου. Ορισμένοι αυτότροφοι χρησιμοποιούν ιόντα S 2+ ως πηγή ενέργειας. Το κάλιο προσλαμβάνεται κυρίως από άλατα καλίου, όπως το Κ2ΗΡΟ4, το ΚΗ2ΡΟ4 και το Κ3PO4. Το μαγνήσιο προσλαμβάνεται από άλατα, όπως το MgSΟ4 ή 27

36 το ΜgCl2. Στον πίνακα 1.7 παρουσιάζονται συνοπτικά τα μακροδιατροφικά συστατικά και οι βασικές φυσιολογικές τους λειτουργίες. Μικροδιατροφικά θρεπτικά συστατικά Τα ιχνοστοιχεία είναι απαραίτητα στη μικροβιακή διατροφή. Η έλλειψη των απαραίτητων ιχνοστοιχείων αυξάνει τη φάση υστέρησης και μπορεί να μειώσει τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης και την απόδοση. Οι τρεις σημαντικότερες κατηγορίες μικροτροφικών ουσιών παρουσιάζονται στον πίνακα 1.8. Πίνακας 1.7. Μακροδιατροφικά θρεπτικά συστατικά Αναγκαία Στοιχεία Άνθρακας Άζωτο Υδρογόνο Οξυγόνο Θείο Φώσφορος Κάλιο Αναγκαία συγκέντρωση (M) > Φυσιολογικές λειτουργίες Συστατικό οργανικών κυτταρικών ενώσεων. Συχνή πηγή ενέργειας. Συστατικό πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και συνενζύμων. Συστατικό οργανικών κυτταρικών ουσιών και του νερού. Συστατικό οργανικών κυτταρικών ουσιών και του νερού. Συστατικό πρωτεϊνών και μερικών ενζύμων. Συστατικό των νουκλεϊκών οξέων, φωσφολιπιδίων, νουκλεοτιδίων και ορισμένων συνενζύμων Το κύριο ανόργανο κατιόν του κυττάρου και συμπαράγοντας μερικών ενζύμων. Μαγνήσιο Συμπαράγοντας πολλών ενζύμων και της χλωροφύλλης (στα φωτοσυνθετικά μικρόβια), συστατικό στα κυτταρικά τοιχώματα και στις μεμβράνες. 28

37 Πίνακας 1.8. Τα μικροδιατροφικά θρεπτικά συστατικά Μικροδιατροφικά θρεπτικά συστατικά Fe, Ζn, Μn Παρατηρήσεις Τα πλέον απαραίτητα ιχνοστοιχεία. Βασικοί ενζυμικοί συμπαράγοντες Cu, Co, Μο, Ca, Na, Cl, Ni, Se. Ιχνοστοιχεία που απαιτούνται σε ειδικές συνθήκες ανάπτυξης Β, ΑΙ, Si, Cr. V, Sn, Be, F, Ti, Ga, Ge, Br, Zr, W, Li, Ι Aυξητικοί παράγοντες, όπως οι ορμόνες, οι βιταμίνες και τα αμινοξέα Iχνοστοιχεία που απαιτούνται σπάνια Οι βιταμίνες (η θειαμίνη (B1), η ριβοφλαβίνη (Β2), η πυριδοξίνη (Β6), η βιοτίνη, η κυανοκοβαλαμίνη (Β12), το φολικό οξύ, το λιποϊκό οξύ, το π- αμινοβενζοϊκό οξύ και η βιταμίνη Κ) λειτουργούν συνήθως ως συμπαράγοντες. Λιπαρά οξέα, όπως το ελαϊκό οξύ και οι στερόλες, είναι επίσης αναγκαία για ορισμένους οργανισμούς. Τα ζωικά και τα φυτικά κύτταρα, χρειάζονται ορμόνες για να ρυθμίσουν τον μεταβολισμό τους. Η ινσουλίνη είναι μία κοινή ορμόνη για τα ζωικά κύτταρα, ενώ η αυξίνη και οι κυτοκινίνες είναι ορμόνες ανάπτυξης των φυτών. Καθορισμένα και Σύνθετα Θρεπτικά Υλικά Αύξησης Στη βιομηχανία, η χρήση πολύπλοκων ή και απροσδιόριστων μέσων ανάπτυξης των μικροοργανισμών είναι συνηθισμένη. Δύο βασικοί τύποι μέσων ανάπτυξης είναι τα καθορισμένα και τα σύνθετα θρεπτικά υλικά. Τα καθορισμένα θρεπτικά υλικά περιέχουν συγκεκριμένες ποσότητες καθαρών χημικών ενώσεων με γνωστή χημική σύσταση. Για παράδειγμα, το θρεπτικό υλικό που περιέχει γλυκόζη, (NH4)2SO4, KH2PO4 και MgCl2 είναι ένα καθορισμένο μέσο. Τα σύνθετα θρεπτικά υλικά περιέχουν φυσικές ενώσεις, των οποίων η χημική σύσταση δεν είναι ακριβώς γνωστή. Το θρεπτικό υλικό που περιέχει εκχύλισμα ζύμης, πεπτόνη, μελάσα ή απόνερα έκπλυσης αραβοσίτου είναι ένα σύνθετο θρεπτικό υλικό. Ένα σύνθετο 29

38 θρεπτικό υλικό μπορεί συνήθως να παρέχει τους απαραίτητους αυξητικούς παράγοντες, τις βιταμίνες, τις ορμόνες και τα ιχνοστοιχεία, που συχνά έχουν ως αποτέλεσμα υψηλότερη παραγωγή κυττάρων σε σχέση με το καθορισμένο θρεπτικό υλικό. Συχνά, τα σύνθετα θρεπτικά υλικά είναι λιγότερο ακριβά από τα καθορισμένα θρεπτικά υλικά. Το κύριο πλεονέκτημα των καθορισμένων μέσων είναι ότι τα αποτελέσματα είναι επαναλήψιμα και ο χειριστής μπορεί να ελέγχει καλύτερα τη ζύμωση. Επιπλέον, η ανάκτηση και ο καθαρισμός ενός προϊόντος γίνονται ευκολότερα και φθηνότερα όταν χρησιμοποιούνται καθορισμένα θρεπτικά υλικά. 30

39 2. ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΕΣ 2.1 Γενικά Με τον όρο βιοαντιδραστήρας αναφερόμαστε στη διάταξη αυτή, στην οποία χημικές ενώσεις (υποστρώματα) υπόκεινται σε βιοχημικές μετατροπές, είτε με τη δράση ζωντανών κυττάρων, οπότε αναφερόμαστε σε αντιδραστήρες ζυμώσεων ή ζυμωτήρες, είτε με τη δράση κυτταρικών συστατικών, όπως είναι τα ένζυμα, οπότε αναφερόμαστε σε ενζυμικούς βιοαντιδραστήρες. Συνήθως, κάθε τέτοια διάταξη περιλαμβάνει σύστημα αναδεύσεως, δειγματοληψίας, ελέγχου και ρυθμίσεως διαφόρων παραγόντων. Οι βιοαντιδραστήρες, γενικότερα, εξασφαλίζουν τη δημιουργία κατάλληλων συνθηκών (θερμοκρασίας, ph και αερισμού) για την ανάπτυξη των κυττάρων και τη δράση των βιοκαταλυτών. Οι βιοαντιδραστήρες αποτελούν τον πυρήνα κάθε παραγωγικής διαδικασίας βιοτεχνολογικών προϊόντων, όπως είναι: α) οι μικροοργανισμοί (κύτταρα ζύμης), καθώς και τα ζωϊκά και φυτικά κύτταρα, β) τα ένζυμα και γενικότερα οι πρωτεΐνες, γ) τα προϊόντα ενζυμικών και μικροβιακών μετατροπών (φάρμακα, χειρόμορφα προϊόντα, κ.λ.π.) και δ) οι πρωτογενείς και δευτερογενείς μεταβολικές ενώσεις (αντιβιοτικά, αμινοξέα, οργανικά οξέα, αλκοόλες). Πρωταρχικός είναι επίσης ο ρόλος της χρήσης βιοαντιδραστήρων σε διαδικασίες που αφορούν στην επεξεργασία αποβλήτων μέσω ενζυμικής ή μικροβιακής επεξεργασίας (βιοαποικοδόμηση). Για τη βιομηχανική παραγωγή προϊόντων μέσω μικροβιακών ζυμώσεων χρησιμοποιούνται βιοαντιδραστήρες (ή και συστοιχία βιοαντιδραστήρων) όγκου από 20 l έως 250 m 3, ενώ σε μονάδες βιολογικού καθαρισμού οι βιοαντιδραστήρες φτάνουν σε όγκο και τα m 3 (βλ σχήμα 2.1). Η συνήθης πρακτική που ακολουθείται περιλαμβάνει αρχικά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού ή των κυττάρων σε μικρότερο βιοαντιδραστήρα. Μετά από καθορισμένο χρόνο ζύμωσης, το περιεχόμενο του βιοαντιδραστήρα αυτού μεταφέρεται σε έναν μεγαλύτερο, που περιέχει αποστειρωμένο μέσο καλλιέργειας, ώστε να συνεχισθεί η ζύμωση μέχρι τον επιθυμητό βαθμό. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου καταλήξουμε στον μεγαλύτερο σε όγκο αντιδραστήρα της συστοιχίας. 31

40 2.2. Μορφές βιοαντιδραστήρων Η διάκριση των βιοαντιδραστήρων βασίζεται σε σειρά κριτηρίων, όπως ο αριθμός των φάσεων που συνυπάρχουν στο βιοαντιδραστήρα, ο τρόπος λειτουργίας του, ο τρόπος και το εύρος αναμίξεως του περιεχομένου του, καθώς και το είδος του βιοκαταλύτη που χρησιμοποιείται. 1) Διάκριση με βάση τον αριθμό φάσεων Με βάση τον αριθμό φάσεων, οι βιοαντιδραστήρες ταξινομούνται σε ομοιογενείς (ομογενείς), στους οποίους το περιεχόμενο βρίσκεται σε μια και μόνο φάση και στους ετερογενείς, όπου στο βιοαντιδραστήρα συνυπάρχουν δύο ή περισσότερες φάσεις. Η δεύτερη περίπτωση είναι και η συνηθέστερη. Χαρακτηριστικά παραδείγματα ετερογενών βιοαντιδραστήρων αποτελούν τόσο ορισμένοι τύποι ενζυμικών βιοαντιδραστήρων, στους οποίους ο βιοκαταλύτης βρίσκεται ακινητοποιημένος σε κάποιο στερεό φορέα, όσο και οι ζυμωτήρες, αφού η αερόβια ζύμωση μπορεί να χαρακτηρισθεί ως ένα σύστημα τριών φάσεων, και συγκεκριμένα: α) την υγρή φάση, η οποία περιλαμβάνει διαλυτά άλατα, υποστρώματα, θρεπτικές ουσίες και μεταβολίτες, 32

41 β) τη στερεή φάση, η οποία αποτελείται από μεμονωμένα κύτταρα του μικροοργανισμού και αδιάλυτα υποστρώματα ή μεταβολικά προϊόντα, και γ) την αέρια φάση, που αποτελεί την πηγή οξυγόνου για το σύστημα, αλλά στην οποία εντοπίζονται τα αέρια προϊόντα της ζύμωσης, όπως το CO2. Α) Β) γ) Γ) δ) Σχήμα 2.1. Διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων α) συστοιχία βιοαντιδραστήρων β) βιοαντιδραστήρες εργαστηριακής κλίμακας 5 L, γ) φωτο-βιοαντιδραστήρες για την ανάπτυξη μικροφυκών 2) Διάκριση με βάση τον τρόπο λειτουργίας Με βάση το κριτήριο αυτό, οι βιοαντιδραστήρες ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες: α) Σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου ή ασυνεχούς λειτουργίας (batch bioreactors), όπου τα αντιδρώντα εισάγονται αρχικά στον αντιδραστήρα και τα 33

42 προϊόντα απομακρύνονται μόνο μετά το τέλος της ζύμωσης (σχήμα 2.2α). Αποτελούν τους δεύτερους σε συχνότητα εφαρμογής βιοαντιδραστήρες σε βιομηχανικό επίπεδο. β) Σε βιοαντιδραστήρες συνεχούς έργου ή συνεχούς λειτουργίας (continuous bioreactors), όπου η εισαγωγή των αντιδρώντων και η απομάκρυνση των προϊόντων είναι συνεχής (σχήμα 2.2.β). Οι βιοαντιδραστήρες του τύπου αυτού, αν και είναι οι λιγότερο χρησιμοποιούμενοι, εντούτοις εφαρμόζονται πολύ συχνά σε μονάδες βιολογικού καθαρισμού. Ο τρόπος λειτουργίας τους μπορεί να προσομοιωθεί με τη λειτουργία των φυσικών οικοσυστημάτων. γ) Σε βιοαντιδραστήρες ημισυνεχούς λειτουργίας (semi-continuous bioreactors), όπου ένα εκ των προϊόντων απομακρύνεται συνεχώς (π.χ. με υπερδιήθηση), ενώ η εισαγωγή των αντιδρώντων και η απομάκρυνση των υπόλοιπων προϊόντων γίνεται ασυνεχώς. δ) Σε βιοαντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου (fed batch), όπου τα αντιδρώντα ή το θρεπτικό υλικό της ζύμωσης προστίθεται στο βιοαντιδραστήρα σε ορισμένα χρονικά διαστήματα ή συνεχώς (σχήμα 2.2.γ). Όταν ο όγκος του αντιδραστήρα καλυφθεί, τότε αυτός εκκενώνεται μερικώς ή ολικώς και η διεργασία επαναλαμβάνεται. Οι βιοαντιδραστήρες του τύπου αυτού είναι οι πλέον συχνά χρησιμοποιούμενοι σε βιομηχανικό επίπεδο. 3) Διάκριση με βάση τον τρόπο και το εύρος αναμίξεως Mε βάση τον τρόπο και το εύρος ανάμιξης του περιεχομένου τους, οι βιοαντιδραστήρες χωρίζονται σε δύο κύριους τύπους: α) Στους βιοαντιδραστήρες πλήρους αναμίξεως, όπου η ανάμιξη είναι συνεχής, με συνέπεια το περιεχόμενο να έχει την ίδια συγκέντρωση σε όλο το λειτουργικό όγκο σε κάθε χρονική στιγμή. β) Στους βιοαντιδραστήρες εμβολικής ροής ή βιοαντιδραστήρες στήλης. Στους αντιδραστήρες του τύπου αυτού, τα περιεχόμενα συστατικά κινούνται εμβολικά κατά τη φορά ροής σε ένα μόνο κλάσμα του συνολικού όγκου του ρευστού και έτσι δεν επιτυγχάνεται πλήρης ανάμιξη με το κλάσμα του όγκου, που ακολουθεί ή προηγείται. 34

43 α) β) γ) Σχήμα 2.2. Είδη βιοαντιδραστήρων με βάση τον τρόπο λειτουργίας: α) βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου ή ασυνεχούς λειτουργίας, β) βιοαντιδραστήρες συνεχούς έργου ή συνεχούς λειτουργίας, γ) βιοαντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου. 4) Διάκριση με βάση το είδος του βιοκαταλύτη Με βάση το είδος και τη μορφή του βιοκαταλύτη, διακρίνουμε δύο γενικές κατηγορίες: α) Τους ενζυμικούς βιοαντιδραστήρες, όπου η βιοκαταλυτική διεργασία επιτελείται με ένζυμα, τόσο σε διαλυτή μορφή, όσο και σε μορφή αιωρήματος λυοφιλιωμένης σκόνης, ή ακινητοποιημένα σε στερεό φορέα. β) Τους βιοαντιδραστήρες με ολόκληρα κύτταρα, τα οποία μπορεί να βρίσκονται στη φάση ανάπτυξης ή όχι, ή ακόμη και να είναι ακινητοποιημένα σε στερεό φορέα. Βασικό σημείο στο σχεδιασμό βιοαντιδραστήρων αποτελεί η βελτιστοποίηση της παροχής αέρα, καθώς και της ανάδευσης του περιεχομένου του. Στην περίπτωση των αναερόβιων ζυμώσεων, οι βιοαντιδραστήρες είναι απλούστερης κατασκευής, καθώς δεν απαιτείται αερισμός ή ανάδευση της καλλιέργειας. Στη συνέχεια, θα αναφερθούμε σε χαρακτηριστικές διατάξεις βιοαντιδραστήρων που χρησιμοποιούνται σήμερα σε διάφορα βιοτεχνολογικά στάδια. 35

44 Βιοαντιδραστήρες πλήρους αναμίξεως (Continuously Stirred Tank Reactors, CSTR) Ο τύπος αυτός είναι ο πλέον χρησιμοποιούμενος σε διαδικασίες ζυμώσεων, αλλά και ενζυμικών βιομετατροπών. Ο βιοαντιδραστήρας αποτελείται από γυάλινο ή ανοξείδωτο κυλινδρικό δοχείο με κοίλο πυθμένα για την πλήρη εκκένωση του υγρού, όπως φαίνεται στο σχήμα 2.3. Ο λόγος του ύψους του δοχείου ως προς τη διάμετρό του κυμαίνεται από 3 έως 5. Εξαίρεση αποτελούν οι αντιδραστήρες ανάπτυξης ζωικών κυττάρων, όπου ο λόγος αυτός δεν ξεπερνά την τιμή 2. Κατά μήκος των εσωτερικών τοιχωμάτων εντοπίζονται ακίνητα πτερύγια (baffles), των οποίων το πλάτος αντιστοιχεί περίπου στο 10% της εσωτερικής διαμέτρου του αντιδραστήρα. O ρόλος τους σχετίζεται με την εκτροπή ροής και τη δημιουργία πρόσθετων στροβίλων του ρευστού, υποβοηθώντας έτσι την ανάδευση. Στην περίπτωση των βιοαντιδραστήρων ανάπτυξης ζωικών κυττάρων, τα πτερύγια αυτά αποφεύγονται, διότι η δημιουργία στροβίλων είναι δυνατό να καταστρέψει τα κύτταρα. To σύστημα αναδεύεται με τη βοήθεια ενός κεντρικού αναδευτήρα, ο οποίος συνήθως εισέρχεται από τον πυθμένα μέσω ειδικής εισόδου εφοδιασμένης με δακτύλιο στεγανοποίησης. Ο αναδευτήρας αυτός φέρει ειδικές προπέλες, των οποίων το σχήμα και το μέγεθος διαφέρει κατά περίπτωση. Συνήθως, η διάμετρος των προπελών κυμαίνεται από 0.3 έως 0.6 της διαμέτρου του δοχείου και εξαρτάται κυρίως από το είδος και το ιξώδες της καλλιέργειας. Η ταχύτητα ανάδευσης σε καλλιέργειες ζωικών κυττάρων δεν ξεπερνά τις 120 στροφές/min, ενώ αρκετά υψηλότερη ταχύτητα είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί σε μικροβιακές ζυμώσεις. Η λειτουργία του βιοαντιδραστήρα εξαρτάται από παράγοντες, όπως η θερμοκρασία, το ph και ο αερισμός. Οι παράγοντες αυτοί πρέπει να ελέγχονται και να ρυθμίζονται καθ όλη τη διάρκεια της διαδικασίας. Ο έλεγχος και η ρύθμιση της θερμοκρασίας επιτυγχάνεται με την εφαρμογή μεταλλικών μανδυών-ψυκτήρων με ελικοειδείς ή περιστρεφόμενες περιελίξεις, που περιβάλλουν το δοχείο του αντιδραστήρα εξωτερικά. Στο περιεχόμενο του βιοαντιδραστήρα εμβαπτίζεται ηλεκτρονικό θερμόμετρο με σύστημα ανάδρασης, το οποίο παρέχει τη δυνατότητα αυτόματου ελέγχου της κυκλοφορίας εξωτερικού νερού στο μανδύα-ψυκτήρα. Με αυτόματο τρόπο επιτυγχάνεται και η ρύθμιση του ph κατά τη διάρκεια της ζύμωσης ή της ενζυμικής αντίδρασης. Το εμβαπτισμένο ηλεκτρόδιο επικοινωνεί με αυτοματοποιημένο ηλεκτρονικό δοσιμετρικό σύστημα παροχής οξέος ή βάσης. Με 36

45 σκοπό τον έλεγχο παροχής οξυγόνου, όπου αυτό είναι επιθυμητό (π.χ. αερόβιες ζυμώσεις), ο βιοαντιδραστήρας είναι δυνατό να φέρει διανομέα για την παροχή αποστειρωμένου αέρα. Σχήμα 2.3. Βιοαντιδραστήρας πλήρους ανάδευσης. Οι βιοαντιδραστήρες πλήρους ανάδευσης μπορεί να είναι διαλείποντος έργου ή συνεχούς λειτουργίας. Οι βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου χρησιμοποιούνται κυρίως σε διεργασίες καταλυόμενες από ελεύθερα (διαλυτοποιημένα) ένζυμα, στις οποίες δεν πραγματοποιείται εξωτερική προσθήκη αντιδρώντων ή απομάκρυνση προϊόντων. Μετά το τέλος της διεργασίας, τα ένζυμα συνήθως δεν ανακτώνται για επαναχρησιμοποίηση, εκτός αν είναι ακινητοποιημένα σε στερεό φορέα, οπότε και ανακτώνται με διήθηση ή φυγοκέντρηση. Στους βιοαντιδραστήρες του τύπου αυτού, η συγκέντρωση των προϊόντων και των αντιδρώντων μεταβάλλεται με το χρόνο. Ωστόσο, σε κάθε χρονική στιγμή η συγκέντρωση είναι η ίδια σε οποιοδήποτε σημείο του βιοαντιδραστήρα. Στην περίπτωση του βιοαντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, ο ενεργός όγκος του παραμένει λειτουργικά σταθερός, δηλαδή ο ρυθμός εισαγωγής της υγρής φάσης (που περιέχει τα υποστρώματα) είναι ίσος με το ρυθμό εξόδου από τον αντιδραστήρα. Ο βιοκαταλύτης (ένζυμα ή ολόκληρα κύτταρα) παραμένει στον αντιδραστήρα μόνο στην περίπτωση που είναι ακινητοποιημένος ή κατακρατείται από ειδικά κόσκινα. 37

46 Στο βιοαντιδραστήρα του τύπου αυτού, αν υποτεθεί ότι η ενζυμική δραστικότητα παραμένει αμετάβλητη, η συγκέντρωση των αντιδρώντων παραμένει ομοιόμορφη και σταθερή ως προς το χρόνο Βιοαντιδραστήρες στήλης φυσαλίδων Το κύριο χαρακτηριστικό του βιοαντιδραστήρα στήλης φυσαλίδων (bubble column bioreactor) αποτελεί η απουσία μηχανικής ανάδευσης του περιεχομένου του, η οποία επιτυγχάνεται μέσω της ελεγχόμενης παροχής αερίου με ψεκασμό. Οι βιοαντιδραστήρες του τύπου αυτού βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία για την παραγωγή ζυμομύκητα, μπύρας και ξιδιού, καθώς και στην επεξεργασία υγρών αποβλήτων. Η δομή των βιαντιδραστήρων στήλης φυσαλίδων είναι πολύ απλή (βλ. σχήμα 2.4). Στην ουσία πρόκειται για κυλινδρικά δοχεία, των οποίων το ύψος είναι τουλάχιστον διπλάσιο της διαμέτρου. Συνήθως, στο εσωτερικό του δοχείου δεν υπάρχει άλλο δομικό στοιχείο πέραν του συστήματος ψεκασμού του αερίου. Το σύστημα ψεκασμού μπορεί να είναι διάτρητη πλάκα ή σωλήνας, υαλοηθμός κ.ά. Για την παραγωγή ζυμομύκητα, ο λόγος του ύψους του αντιδραστήρα ως προ τη διάμετρό του είναι περίπου 3, ενώ στην περίπτωση άλλων εφαρμογών, ο λόγος αυτός μπορεί να λάβει μεγαλύτερες τιμές. Στα πλεονεκτήματα των βιοαντιδραστήρων στήλης φυσαλίδων περιλαμβάνεται το χαμηλό κόστος κατασκευής και η ικανοποιητική απόδοση μεταφοράς μάζας και θερμότητας. 38 Σχήμα 2.4 Βιοαντιδραστήρας στήλης φυσαλίδων

47 2.2.3 Βιοαντιδραστήρες βρόχου Στους αντιδραστήρες αυτού του τύπου, τα αντιδρώντα υλικά ακολουθούν κυκλοφορία βρόχου. Ο αντιδραστήρας χωρίζεται σε δύο ζώνες με ειδικά πτερύγια ή κυλινδρικό πύργο, τα οποία κατευθύνουν τη ροή στο εσωτερικό του αντιδραστήρα. Μόνο στη μια εκ των δύο ζωνών διοχετεύεται ρεύμα αέρα ή άλλου αερίου (βιοαντιδραστήρες αερομεταφοράς) ή και υγρού. Στο σχήμα 2.5 απεικονίζονται διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων βρόχου (αερομεταφοράς, κυκλοφορίας σωλήνων και εκροής, οι οποίοι διαφέρουν ως προς τον τρόπο με τον οποίο επιτυγχάνεται η κυκλοφορία. Οι βιοαντιδραστήρες αερομεταφοράς (σχήμα 2.5α) είναι ενεργειακά αποτελεσματικότεροι σε σχέση με τους μηχανικά αναδευόμενους αντιδραστήρες, ενώ η παραγωγικότητά τους είναι συγκρίσιμη. Η αποτελεσματικότητα των βιοαντιδραστήρων του τύπου αυτού συνδέεται με την ταχύτητα εισαγωγής του αερίου και την ταχύτητα κυκλοφορίας του υγρού στο εσωτερικό. Η ανοδική ροή του υγρού στο τμήμα που δέχεται το ρεύμα του αερίου (riser) οφείλεται στη μικρότερη πυκνότητά του (λόγω της δημιουργίας φυσαλίδων), σε σχέση με αυτή που έχει το υγρό στο άλλο τμήμα του αντιδραστήρα και το οποίο κινείται καθοδικά (downcomer). Διάφορες παρόμοιες διατάξεις έχουν βρει εφαρμογή στην παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων. Η εφαρμογή των αντιδραστήρων αερομεταφοράς αφορά κυρίως σε ευαίσθητες καλλιέργειες κυττάρων, αλλά και στη βιομηχανική παραγωγή βιοφαρμακευτικών πρωτεϊνών από ευαίσθητα ζωικά κύτταρα Βιοαντιδραστήρες στήλης Οι βιοαντιδραστήρες στήλης αποτελούνται από μια κατακόρυφη στήλη και αποτελούν την απλούστερη μορφή βιοαντιδραστήρων. Χαρακτηρίζονται από τον απλό και με μικρό κόστος τρόπο λειτουργίας, καθώς και από περιορισμένη έκταση αναστολής του βιοκαταλύτη από το προϊόν. Οι βιοαντιδραστήρες του τύπου αυτού λειτουργούν με ακινητοποιημένους βιοκαταλύτες. Το διάλυμα των υποστρωμάτων εισέρχεται στη στήλη (η οποία περιέχει το βιοκαταλύτη), είτε από το πάνω άκρο (κατιούσα ροή), είτε από το κάτω άκρο (ανιούσα ροή) και τα προϊόντα εξέρχονται από την έξοδο της στήλης στο αντίθετο άκρο. Κύριο μειονέκτημα του 39

48 βιοαντιδραστήρα στήλης αποτελεί η μέτρια μεταφορά μάζας και η επιδείνωση της αναστολής του βιοκαταλύτη από το υπόστρωμα, λόγω μη καλής αναμίξεως στο εσωτερικό της στήλης. α) β) γ) Αέρας Αέρας Υγρό Σχήμα 2.5. Διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων βρόχου α) αερομεταφοράς, β) κυκλοφορίας σωλήνων, γ) εκροής Βιοαντιδραστήρες κλίνης Οι αντιδραστήρες κλίνης χρησιμοποιούνται στις περιπτώσεις αντιδράσεων που καταλύονται από βιοκαταταλύτες υπό μορφή σωματιδίων. Υπάρχουν διάφοροι τύποι αντιδραστήρων κλίνης, οι οποίοι διαφέρουν τόσο στον τρόπο ροής του υποστρώματος, όσο και στο είδος του βιοκαταλύτη. Οι πιο γνωστοί από αυτούς είναι οι αντιδραστήρες ρευστοποιημένης και πακεταρισμένης κλίνης, οι οποίοι στις περισσότερες περιπτώσεις χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήρες συνεχούς λειτουργίας. Στους βιοαντιδραστήρες ρευστοποιημένης κλίνης (fluidized bed- βλ. σχήμα 2.6α), σωματίδια με ακινητοποιημένο ένζυμο ή και κυτταρικά συσσωματώματα βρίσκονται στο δοχείο του αντιδραστήρα (στήλη) υπό συνεχή κίνηση μέσα σε ρεύμα υγρής ή αέριας φάσης. Από τη βάση της στήλης παρέχεται συνεχώς, με τη βοήθεια αντλίας, διάλυμα αντιδρώντων, το οποίο σχηματίζει τυρβώδη ροή συμπαρασύροντας τα σωματίδια του βιοκαταλύτη σε συνεχή κίνηση μαζί με την υγρή φάση. Κύρια πλεονεκτήματα των αντιδραστήρων αυτού του τύπου είναι ο εύκολος έλεγχος και η ρύθμιση παραγόντων, όπως το ph και η θερμοκρασία, καθώς και η δυνατότητα 40

49 χρήσης κολλοειδών υποστρωμάτων. Σε αρκετές περιπτώσεις, η υγρή φάση εξέρχεται γρήγορα από τον αντιδραστήρα, γεγονός που περιορίζει την επαφή με τη στερεή βιοκαταλυτική φάση. Στην περίπτωση αυτή, είναι αναγκαία η ανακύκλωση της υγρής φάσης, ώστε να αυξηθεί ο χρόνος επαφής υποστρώματος-βιοκαταλύτη στον αντιδραστήρα. Οι βιοαντιδραστήρες πακεταρισμένης κλίνης (Packed Bed BioReactor) είναι πολύ καλά μελετημένοι, καθώς επιτρέπουν την εφαρμογή των βιοκαταλυτών σε μεγάλη ποσότητα, γεγονός που αυξάνει την ταχύτητα μετατροπής των αντιδρώντων σε προϊόντα. Ο βιοκαταλύτης βρίσκεται καθηλωμένος σε στερεή επιφάνεια, που έχει τη μορφή πορώδους ή μη πορώδους πηκτώματος (gel) και πληροί τη στήλη (βλ. σχήμα 2.6β). Οι μηχανικές ιδιότητες των σωματιδίων, τα οποία φέρουν το βιοκαταλύτη και πακετάρονται για να σχηματιστεί η κλίνη, θα πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε να διευκολύνεται η ροή των αντιδρώντων με την εφαρμογή της ελάχιστης δυνατής πίεσης. Τα αντιδρώντα ρέουν συνεχώς διαμέσου του πηκτώματος (συνήθως με φορά προς τα κάτω) και τα προϊόντα της βιοκαταλυτικής διαδικασίας συλλέγονται στην έξοδο της στήλης. Αντιδραστήρες του τύπου αυτού χρησιμοποιούνται ευρέως στην περίπτωση εφαρμογής ακινητοποιημένων ενζύμων. Η χρήση των αντιδραστήρων του τύπου αυτού βοηθά στην αντιμετώπιση, σε μεγάλο βαθμό, το πρόβλημα αναστολής από το προϊόν, καθώς κατά μήκος της στήλης παρατηρείται διαβάθμιση της συγκέντρωσης του προϊόντος, η οποία αυξάνει καθώς το ρευστό μίγμα πλησιάζει την έξοδο. Έτσι ένα μικρό μόνο κλάσμα του βιοκαταλύτη εκτίθεται σε υψηλή συγκέντρωση του προϊόντος Βιοαντιδραστήρες μεμβρανών Κύριο χαρακτηριστικό των βιοαντιδραστήρων μεμβρανών αποτελεί η παρουσία μιας μικροπορώδους μεμβράνης από συνθετικό πολυμερές, συνήθως πολυακρυλαμίδιο, πολυαιθερική σουλφόνη ή παράγωγα κυτταρίνης. Η μεμβράνη επιτρέπει το διαχωρισμό μορίων υψηλού μοριακού μεγέθους, όπως ένζυμα και κύτταρα μικροοργανισμών, φυτών και κυττάρων, από ενώσεις μικρού μοριακού βάρους, όπως υποστρώματα και προϊόντα αντιδράσεων ή μεταβολισμού. Υπάρχουν διάφορα είδη μεμβρανών, όπως είναι: 41

50 α) Οι μεμβράνες μικροδιήθησης με μέγεθος πόρων μm (συνήθως μm), οι οποίες χρησιμοποιούνται για την κατακράτηση κυττάρων (τυπική διάμετρος 0.1 μm). β) Οι μεμβράνες υπερδιήθησης με δυνατότητα διαχωρισμού μορίων μοριακού βάρους από 500 έως Με τη χρήση μεμβρανών υπερδιήθησης είναι δυνατή η κατακράτηση ενζυμικών μορίων. γ) Οι μεμβράνες αντίστροφης όσμωσης για το διαχωρισμό μορίων μικρού μοριακού βάρους. α) Έξοδος υγρής φάσης β) Είσοδος υγρής φάσης Βιοκαταλύτης Πακεταρισμένη βιοκαταλυτική φάση Ανακύκλωση Αντλία Εισαγωγή υγρής φάσης Έξοδος Σχήμα 2.6. Βιοαντιδραστήρες α) ρευστοποιημένης και β) πακεταρισμένης κλίνης. Στους μεμβρανικούς βιοαντιδραστήρες, ο βιοκαταλύτης μπορεί να χρησιμοποιείται σε ελεύθερη μορφή (διαλυτοποιημένη μορφή) ή ακινητοποιημένος στην επιφάνεια της μεμβράνης, ή ακόμη και να είναι εγκλωβισμένος σε αυτή. Στο σχήμα 2.7 παρουσιάζονται σχηματικά οι διατάξεις ορισμένων μεμβρανικών βιοαντιδραστήρων, οι οποίοι μπορεί να λειτουργούν συνεχώς ή ασυνεχώς. Στην περίπτωση της εφαρμογής των μεμβρανών υπερδιήθησης, ο βιοκαταλύτης και τα υποστρώματα τοποθετούνται στη μια πλευρά της μεμβράνης και εφαρμόζεται μικρή πίεση από την ίδια πλευρά, ώστε να επιτευχθεί διαμέσου της μεμβράνης ο διαχωρισμός των προϊόντων από το βιοκαταλύτη. Στη συνήθη περίπτωση όπου διηθούνται αμφότερα τα υποστρώματα και τα προϊόντα, αυτά 42

51 ανακυκλώνονται στο βιοαντιδραστήρα, ώστε να επιτευχθεί το επιθυμητό ποσοστό μετατροπής. Μια εφαρμογή της αρχής των βιοαντιδραστήρων με μεμβράνη διήθησης αποτελούν οι βιοαντιδραστήρες κοίλων ινών. Στους βιοαντιδραστήρες αυτούς χρησιμοποιείται πορώδης μεμβράνη διηθήσεως, της οποίας μόνο η μια επιφάνεια είναι λειτουργική. Η μεμβράνη αυτή έχει τη μορφή κοίλης ίνας σχηματίζοντας λεπτούς σωλήνες εσωτερικής διαμέτρου mm. Στο εσωτερικό της επικάθεται η λειτουργική μικροπορώδης μεμβράνη. Η ροή των υποστρωμάτων πραγματοποιείται στο εσωτερικό των ινών παράλληλα προς την επιφάνειά τους. Το πλεονέκτημα των μεμβρανικών βιοαντιδραστήρων, που αφορά στην εκλεκτικότητα επί του μοριακού μεγέθους, τους καθιστά χρήσιμο εργαλείο στην αποικοδόμηση πολυμερών υποστρωμάτων. Υπόστρωμα Υπόστρωμα Προϊόν α) β) Μεμβράνη Προϊόν Σχήμα 2.7 Μεμβρανικοί ενζυμικοί βιοαντιδραστήρες: α) συνεχούς λειτουργίας με ανάδευση β) ημισυνεχούς λειτουργίας Βιοαντιδραστήρες στερεάς κατάστασης Με τον όρο ζύμωση στερεάς κατάστασης (ΖΣΚ) αναφερόμαστε στην ανάπτυξη μικροοργανισμών σε αδιάλυτα στο νερό υποστρώματα, απουσία ελεύθερου νερού. Η περιεκτικότητα του νερού στις ΖΣΚ κυμαίνεται μεταξύ 10% και 85% της συνολικής μάζας. Οι μικροοργανισμοί που έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε συνθήκες ΖΣΚ ανήκουν και στα τρία βασικά είδη: βακτήρια, ζύμες και μύκητες. Οι μύκητες παρουσιάζουν μεγαλύτερη ικανότητα προσαρμογής στο περιβάλλον της 43

52 ΖΣΚ. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στη ΖΣΚ είναι φτηνά αγροτικά προϊόντα ή παραπροϊόντα. Η προκατεργασία τους περιλαμβάνει διεργασίες απαραίτητες για τη μετατροπή τους σε μορφές που διευκολύνουν τη μικροβιακή προσβολή (π.χ. μείωση του μεγέθους). Οι κυριότεροι τύποι βιοαντιδραστήρων ΖΣΚ είναι οι: α) Βιοαντιδραστήρες με δίσκους. Αποτελούν τον παλαιότερο και απλούστερο τύπο βιοαντιδραστήρα ΖΣΚ. Ένα σχετικά λεπτό στρώμα υποστρώματος (πάχους από 5 ως 15 cm) απλώνεται στη μεγάλη επιφάνεια, που παρέχουν ειδικά κατασκευασμένοι δίσκοι τοποθετημένοι ο ένας πάνω στον άλλο. Η ύγρανση του περιβάλλοντος χώρου γίνεται με υγραντήρες ή με την κυκλοφορία υγρού αέρα. Η ανάδευση, όταν εφαρμόζεται, γίνεται χειροκίνητα και σε τακτά χρονικά διαστήματα. β) Βιοαντιδραστήρες στερεάς κλίνης. Χαρακτηρίζονται από στατικό υπόστρωμα που σταθεροποιείται πάνω σε διάτρητη βάση. Το κύριο μέρος του βιοαντιδραστήρα αποτελείται από μια ψηλή, λεπτή, κυλινδρική κολώνα. Το πλεονέκτημα των βιοαντιδραστήρων αυτού του είδους είναι η σχετική απλότητά τους, ενώ επιτρέπουν καλύτερο έλεγχο θερμοκρασίας και υγρασίας από τους βιοαντιδραστήρες με δίσκους. Στα μειονεκτήματά τους συγκαταλέγονται το δύσκολο άδειασμα του τελικού προϊόντος, η μη ομοιόμορφη ανάπτυξη του μικροοργανισμού και τα προβλήματα κατά την εφαρμογή σε μεγαλύτερη κλίμακα. γ) Βιοαντιδραστήρας περιστρεφόμενου τυμπάνου. Αποτελείται από έναν οριζόντιο ή κεκλιμένο κύλινδρο, ο οποίος περιστρέφεται γύρω από τον άξονά του, προκαλώντας ανάδευση του στερεού υποστρώματος. Μ αυτόν τον τρόπο, η ανάμιξη των στερεών είναι πιο ήπια από όλες τις μεθόδους αυτοματοποιημένης ανάδευσης και προκαλεί τη μικρότερη καταστροφή στο μικροοργανισμό και στη δομή του υποστρώματος. δ) Βιοαντιδραστήρας με ανάδευση. Διακρίνονται σε οριζόντιους και κατακόρυφους, ανάλογα με τη διεύθυνση του άξονα μετάδοσης της κίνησης. Και στα δύο είδη βιοαντιδραστήρων, η ανάδευση μπορεί να είναι συνεχής ή περιοδική Σχεδιασμός βιοαντιδραστήρων Οι σπουδαιότεροι από τους παράγοντες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αποτελεσματική λειτουργία ενός βιοαντιδραστήρα, σχετίζονται με: το είδος του βιοκαταλύτη 44

53 τις ιδιότητες του υποστρώματος και τις βιοχημικές παραμέτρους που επιδρούν στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών και στη διατήρηση της δραστικότητας των ενζύμων Οι παράγοντες αυτοί περιγράφονται στη συνέχεια. α) Επιλογή βιοκαταλύτη Ο βιοκαταλύτης μπορεί να είναι ένζυμο, ή μικροβιακά, φυτικά και ζωικά κύτταρα, τόσο σε ελεύθερη μορφή, όσο και ακινητοποιημένα στο εσωτερικό του βιοαντιδραστήρα. Στην περίπτωση βιομετατροπών, το είδος της αντίδρασης καθορίζει την επιλογή του βιοκαταλυτικού συστήματος που θα χρησιμοποιηθεί. Έτσι, η χρήση των ενζύμων είναι συνηθέστερη σε αντιδράσεις αποικοδόμησης (π.χ. υδρόλυση), ενώ αντίθετα, σε περιπτώσεις που η ενζυμική δράση απαιτεί την παρουσία συνενζύμων, τότε η βιοκαταλυτική διαδικασία διευκολύνεται με την εφαρμογή ολόκληρων κυττάρων. Στην περίπτωση των ενζύμων, δεν απαιτούνται συνθήκες αποστείρωσης ή αερισμού, ενώ αντίθετα στην καλλιέργεια κυττάρων, ιδιότητες, όπως ο αερόβιος ή αναερόβιος τρόπος ανάπτυξης, καθορίζουν την επιλογή του βιοαντιδραστήρα. Παράλληλα, ιδιότητες που σχετίζονται με το μέγεθος και το σχήμα των κυττάρων, αλλά και την ανθεκτικότητά τους σε συνθήκες ανάδευσης της καλλιέργειας, θα πρέπει να συνυπολογίζονται κατά το σχεδιασμό του βιοαντιδραστήρα. β) Οι ιδιότητες του υποστρώματος Οι ιδιότητες των υποστρωμάτων, που σχετίζονται με φυσικά, ρεολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά το σχεδιασμό του βιοαντιδραστήρα. Οι φυσικές ιδιότητες σχετίζονται με τη φυσική κατάσταση του υποστρώματος (αέριο, υγρό ή στερεό). Σημαντικό κριτήριο αποτελεί η διαλυτότητα του υποστρώματος, καθώς και το αν πρόκειται για μονομερές ή πολυμερές υπόστρωμα. Οι ρεολογικές ιδιότητες σχετίζονται κατά κύριο λόγο με το ιξώδες. Το υψηλό ιξώδες ορισμένων υποστρωμάτων αφενός δημιουργεί προβλήματα ανάδευσης, αλλά και μεταφοράς οξυγόνου. Τα βιοκινητικά χαρακτηριστικά του υποστρώματος σχετίζονται με την ικανότητά του να επηρεάζει την κινητική της κυτταρικής ανάπτυξης ή της έκφρασης των καταλυτικών ιδιοτήτων των ενζύμων. Έτσι, για παράδειγμα, η περίπτωση αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης ή της ενζυμικής 45

54 δράσης από την αυξημένη συγκέντρωση υποστρώματος μπορεί να αντιμετωπισθεί με τη χρήση βιοαντιδραστήρων συνεχούς έργου. Τέλος, η ιδιότητα του υποστρώματος να δημιουργεί αφρό στη διαδικασία ζύμωσης λαμβάνεται επίσης υπόψη κατά το σχεδιασμό του βιοαντιδραστήρα. γ) Οι βιοχημικές παράμετροι Οι βιοχημικές παράμετροι αναφέρονται κυρίως στην επίδραση της θερμοκρασίας, του ph και της συγκέντρωσης του οξυγόνου στην καλλιέργεια μικροοργανισμών και γενικότερα στην ανάπτυξη κυττάρων, καθώς και στη δραστικότητα και σταθερότητα των ενζύμων. Ο έλεγχος και η ρύθμιση των παραγόντων αυτών αποτελούν βασικά κριτήρια επιλογής του βιοαντιδραστήρα Παράγοντες που επιδρούν στη λειτουργία των βιοαντιδραστήρων Οι σημαντικότεροι παράγοντες που σχετίζονται με την αποτελεσματική λειτουργία ενός βιοαντιδραστήρα είναι η αποστείρωση, ο ρυθμός μεταφοράς οξυγόνου, ο ρυθμός μεταφοράς θερμότητας και το πρόβλημα του αφρισμού. Η αποστείρωση Η πλειοψηφία των διεργασιών ζύμωσης αφορά καλλιέργειες ενός μόνο πληθυσμού κυττάρων. Η επίτευξη και διασφάλιση ασηπτικών συνθηκών μέσα στον αντιδραστήρα αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την επιτυχία της μικροβιακής καλλιέργειας ή ζύμωσης. Οι ασηπτικές συνθήκες εξασφαλίζονται μέσω της διαδικασίας της αποστείρωσης του βιοαντιδραστήρα, του ρευστού θρεπτικού υποστρώματος, καθώς και των συστημάτων (σωληνώσεων) τροφοδοσίας, δειγματοληψίας και αερισμού. Η αποστείρωση μπορεί να γίνει με διάφορες φυσικές και χημικές μεθόδους, όπως με θέρμανση παρουσία ή απουσία νερού σε υψηλές θερμοκρασίες για καθορισμένο χρόνο, τη χρήση UV ακτινοβολίας ( nm), ακτινών-χ, ακτινοβολίας-γ, καθώς και τη χρήση χημικών (οξειδωτικών ή αλκυλιωτικών) αντιδραστηρίων. Στην περίπτωση των ασυνεχών βιοαντιδραστήρων, η αποστείρωση γίνεται πριν από κάθε κύκλο εργασίας με διοχέτευση ατμού θερμοκρασίας 121 ο C για λεπτά ή με εξωτερική θέρμανση του βιοαντιδραστήρα. Καθώς η πίεση κατά τη 46

55 διάρκεια της αποστείρωσης μπορεί να φτάσει τα 200 ΚPa, απαιτούνται ειδικές προδιαγραφές στην κατασκευή του βιοαντιδραστήρα. Στους συνεχείς αντιδραστήρες, η αποστείρωση γίνεται με θέρμανση του ρεύματος εισόδου στους 140 ο C για sec. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής σχετίζονται με το γεγονός ότι απαιτείται μικρός συνολικός χρόνος αποστείρωσης, ενώ η διαδικασία χαρακτηρίζεται από μικρό κόστος λειτουργίας και μικρή κατανάλωση ενέργειας. Μειονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι, η πλειοψηφία των πρώτων υλών και των βιομορίων είναι ευπαθής στις υψηλές θερμοκρασίες, ακόμη και για μικρό χρονικό διάστημα έκθεσης σε αυτές. Η αποστείρωση του βιοαντιδραστήρα μπορεί να γίνει είτε παρουσία του ρευστού θρεπτικού υποστρώματος, είτε, στην περίπτωση που το υπόστρωμα είναι θερμοευαίσθητο, χωριστά από αυτό. Η αποστείρωση διαλυμάτων που περιέχουν θερμοευαίσθητα μόρια (ένζυμα, βιταμίνες κ.λ.π.) επιτυγχάνεται με διήθηση του διαλύματος μέσω αποστειρωμένων φίλτρων με διάμετρο πόρων μm, τα οποία κατακρατούν τους μικροοργανισμούς χωρίς να τους θανατώνουν. Ο ρυθμός μεταφοράς οξυγόνου Η συγκέντρωση του οξυγόνου επιδρά σε μεγάλο βαθμό τόσο στο μεταβολισμό, όσο και στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών και κατά συνέπεια στην παραγωγή των τελικών προϊόντων. Διακρίνουμε δύο μορφές ζυμώσεων ανάλογα με τον τρόπο, με τον οποίο οι μικροοργανισμοί λαμβάνουν το οξυγόνο: α) Την αερόβια ζύμωση, όπου η παροχή του οξυγόνου γίνεται με την παροχή αποστειρωμένου αέρα μέσω ειδικού διανομέα για τη δημιουργία μικρών φυσαλίδων στο θρεπτικό υλικό. β) Την αναερόβια ζύμωση, η οποία εξελίσσεται απουσία αέρα και στην οποία οι μικροοργανισμοί λαμβάνουν το απαιτούμενο οξυγόνο από κάποιο υπόστρωμα, το οποίο φέρει χημικά ενωμένο οξυγόνο. Στην περίπτωση των αερόβιων ζυμώσεων, η μεταφορά του οξυγόνου στην καλλιέργεια εξαρτάται όχι μόνο από το ρυθμό παροχής του αέρα στο βιοαντιδραστήρα, αλλά και από την ανάδευση του συστήματος. Πρέπει να σημειωθεί ότι, κατά το σχεδιασμό ενός βιοαντιδραστήρα η ανάδευση υπολογίζεται με βάση τις ανάγκες για μεταφορά οξυγόνου και όχι με βάση τις ανάγκες ανάδευσης των υποστρωμάτων. Ο ρυθμός μεταφοράς οξυγόνου στο κύτταρο είναι μια σχετικά αργή διαδικασία και εξαρτάται από το ρυθμό μεταφοράς οξυγόνου από την αέρια στην 47

56 υγρή φάση της καλλιέργειας. Η μεταφορά αυτή εξαρτάται από τη συγκέντρωση του οξυγόνου στις δύο φάσεις, από την επιφάνεια επαφής των δύο φάσεων, από τη θερμοκρασία, καθώς και από την παρουσία ουσιών στην υγρή φάση. Η εισαγωγή σωλήνων για τη δημιουργία φυσαλίδων στο εσωτερικό του αντιδραστήρα καθιστά αποτελεσματικότερη τη μεταφορά του οξυγόνου στο σύστημα. Ο ρυθμός μεταφοράς θερμότητας H διαδικασία ανάπτυξης των μικροοργανισμών συνοδεύεται από έκλυση θερμότητας και μάλιστα, τόσο πιο μεγάλο είναι το ποσό θερμότητας που εκλύεται, όσο πιο υψηλός είναι ο ρυθμός ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Η θερμότητα που παράγεται (εκφραζόμενη σε ΚJ l -1 h) αντιστοιχεί περίπου στο 12% του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (σε l -1 h) από το μικροοργανισμό. Άλλοι παράγοντες που συνεισφέρουν στο συνολικό ποσό ενέργειας στο σύστημα είναι η μηχανική ανάδευση, οι απώλειες προς το περιβάλλον και η είσοδος και έξοδος ρευμάτων. Για τη διατήρηση της θερμοκρασίας του βιοαντιδραστήρα στα συνήθως στενά όρια της βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξης των μικροοργανισμών είναι απαραίτητος ο συνεχής έλεγχος και η ρύθμιση της θερμοκρασίας του αντιδραστήρα, ώστε να μην καταστραφεί ο μικροοργανισμός. Ας σημειωθεί ότι, οι καλλιέργειες μικροοργανισμών διεξάγονται σε σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες (20-65 ο C) και συνήθως μεταξύ 30 και 37 ο C, ενώ στην περίπτωση των ζωικών κυττάρων, η θερμοκρασία ανάπτυξης καθορίζεται με μεγάλη ακρίβεια και είναι ο C. Ο έλεγχος της θερμοκρασίας ανάπτυξης, συνήθως, γίνεται εξωτερικά με τη χρήση μανδύα. Η ταχύτητα απαγωγής της θερμότητας είναι ανάλογη της επιφάνειας διαμέσου της οποίας αυτή μεταφέρεται, γεγονός που καθιστά τη μεταφορά της θερμότητας ως τον κύριο περιοριστικό παράγοντα σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας, όπου το μέγεθος του δοχείου ζύμωσης αυξάνει. Το πρόβλημα του αφρισμού Ο αφρισμός του θρεπτικού μέσου συνοδεύει όλες σχεδόν τις αερόβιες ζυμώσεις και οφείλεται κατά κύριο λόγο στην παραγωγή πεπτιδίων και πρωτεϊνών (βλ. σχήμα 2.8.). Η αντιμετώπιση του προβλήματος επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο θρεπτικό υλικό αντιαφριστικών ουσιών (όπως φυσικά έλαια, ενώσεις σιλικόνης και αλκοόλες μεγάλου μοριακού βάρους), τα οποία έχουν την ιδιότητα να μειώνουν 48

57 την επιφανειακή τάση. Η προσθήκη των ουσιών αυτών γίνεται σταδιακά, είτε μέσω προκαθορισμένου προγράμματος προσθήκης, είτε με αυτόματη ενεργοποίηση αντλίας από αισθητήρα, που ανιχνεύει το ύψος του αφρού στο ζυμωτήρα. Σχήμα 2.8. Το πρόβλημα του αφρισμού σε μια αερόβια ζύμωση. Πρέπει να σημειωθεί ότι η παρουσία αντιαφριστικών ουσιών είναι δυνατό να επιδράσει τόσο στη διαδικασία της ζύμωσης, καθώς αυτά μεταβάλλουν το ρυθμό διάχυσης του οξυγόνου στο θρεπτικό υλικό, όσο και στην ευκολία διαχωρισμού του προϊόντος. Για το λόγο αυτό, η αντιμετώπιση του αφρισμού μπορεί να γίνει εναλλακτικά με τη χρήση ειδικών διατάξεων μηχανικής διάσπασης του αφρού Ποσοτικοποίηση διεργασιών παραγωγής κυτταρικών προϊόντων Η ποσοτική περιγραφή των κυτταρικών διεργασιών είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό μιας διαδικασίας καλλιέργειας ενός μικροοργανισμού (ζύμωσης). Οι δύο σημαντικότεροι ποσοτικοί παράγοντες, απαραίτητοι για το σχεδιασμό της διαδικασίας και οι οποίοι περιγράφουν ποσοτικά τη μετατροπή από το κύτταρο του υποστρώματος σε προϊόν, είναι η απόδοση και η παραγωγικότητα. Ως απόδοση ορίζεται το ποσοστό μετατροπής του υποστρώματος στο προϊόν και βέβαια έχει μεγάλη σημασία στην ανάπτυξη μιας διαδικασίας, ιδιαίτερα αν το κόστος των πρώτων υλών είναι μεγάλο, όπως συμβαίνει στην παραγωγή αντιβιοτικών, διαλυτών και άλλων πρωτογενών μεταβολικών προϊόντων. Η παραγωγικότητα ορίζει την ταχύτητα του σχηματισμού του προϊόντος και βέβαια αποτελεί καθοριστικό παράγοντα στη βιομηχανική παραγωγή ενός προϊόντος. 49

58 Ο προσδιορισμός των δύο αυτών παραγόντων από τα πειραματικά δεδομένα μιας διεργασίας δεν είναι δύσκολος. Αντίθετα, η πρόβλεψη της μεταβολής των μεγεθών αυτών κατά την εξέλιξη μιας διαδικασίας, ποιες τιμές δηλαδή λαμβάνουν τα μεγέθη αυτά, καθώς μεταβάλλεται, για παράδειγμα, η σύσταση της ζύμωσης ή η θερμοκρασία, είναι ένα σύνθετο πρόβλημα. Για την επίλυση του προβλήματος αυτού, απαραίτητη είναι η εφαρμογή μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν την αλληλεπίδραση μεταξύ των μεταβλητών του συστήματος. Στην περίπτωση της ζύμωσης, οι μεταβλητές αυτές είναι η ταχύτητα ανάδευσης, η ταχύτητα ροής εισόδου και εξόδου από τον βιοαντιδραστήρα των αντιδρώντων και των προϊόντων, το ph, η θερμοκρασία, καθώς και η συγκέντρωση των υποστρωμάτων, των μεταβολικών προϊόντων και της βιομάζας. Σήμερα, η ισχύς των ηλεκτρονικών υπολογιστών έχει ανέλθει σε υψηλότατα επίπεδα, κάνοντας δυνατή την επίλυση πολύπλοκων μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν βιολογικές διεργασίες, όπως αυτή της ζύμωσης και βοηθούν στην επεξεργασία των πειραματικών ευρημάτων. Η ανάπτυξη ενός μαθηματικού μοντέλου, που θα αφορά μια διεργασία ζύμωσης και το οποίο θα περιλαμβάνει όλες τις παραπάνω παραμέτρους, προϋποθέτει πρώτα απ όλα τον προσδιορισμό του λειτουργικού όγκου, στον οποίο η διαδικασία λαμβάνει χώρα. Στην περίπτωση της ζύμωσης, συνήθως ο όγκος αυτός αναφέρεται στον όγκο του βιοαντιδραστήρα, όπου η ζύμωση εξελίσσεται. Στη συνέχεια, θα πρέπει να καθορισθούν οι εξισώσεις ισοζυγίου, οι οποίες περιγράφουν τη ροή στην είσοδο και την έξοδο των ενώσεων (αντιδρώντων και προϊόντων) στον βιοαντιδραστήρα, καθώς και οι εξισώσεις κινητικής της διεργασίας που περιγράφουν την εξάρτηση της ταχύτητας μετατροπής του υποστρώματος συναρτήσει ορισμένων μεταβλητών, όπως η συγκέντρωση των υποστρωμάτων (και σε κάποιες περιπτώσεις και των προϊόντων). Το επόμενο βήμα στη μοντελοποίηση της διεργασίας είναι ο συνδυασμός της κινητικής της βιοκαταλυόμενης αντίδρασης με ένα μοντέλο για τον αντιδραστήρα. Το μοντέλο για τον βιοαντιδραστήρα εκφράζεται από ένα σύνολο ισοζυγίων μάζας για τα υποστρώματα, τα μεταβολικά προϊόντα και τη βιομάζα και περιγράφει πώς η συγκέντρωση των μεταβλητών αυτών μεταβάλλεται με το χρόνο. 50

59 Ισοζύγια μάζας στους βιοαντιδραστήρες Στο σχήμα 2.9 παρουσιάζεται μια σχηματική παράσταση ενός βιοαντιδραστήρα, του οποίου η τροφοδοσία γίνεται υπό στείρες συνθήκες, ενώ η συγκέντρωση της βιομάζας κατά την τροφοδοσία είναι μηδενική. F, So Fout, S, X V, c, x Σχήμα 2.9. Σχηματική παράσταση βιοαντιδραστήρα Όπως έχουμε δει, ο βιοαντιδραστήρας είναι δυνατό να λειτουργεί με τρεις διαφορετικούς τρόπους: α) ως βιοαντιδραστήρας διαλείποντος έργου, όπου F=Fout=0 με όγκο σταθερό β) ως βιοαντιδραστήρας συνεχούς λειτουργίας, όπου F=Fout>0 με όγκο επίσης σταθερό και γ) ως βιοαντιδραστήρας ημιδιαλείποντος έργου, όπου ο όγκος μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Στη συνέχεια, θα παρουσιασθούν τα μοντέλα που αφορούν στη λειτουργία βιιοαντιδραστήρων σταθερού όγκου. Γενική έκφραση του ισοζυγίου μάζας στους βιοαντιδραστήρες είναι η εξής: Η σχέση ισοζυγίου μάζας που περιγράφει την εικόνα στο βιοαντιδραστήρα Συσσώρευση = Ταχύτητα μετατροπής + Ταχύτητα εισόδου-ταχύτητα εξόδου 51

60 Για τα υποστρώματα, ο όρος ταχύτητα μετατροπής δίνεται από την ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος (με αρνητικό πρόσημο), ενώ για τα μεταβολικά προϊόντα και τη βιομάζα, ο όρος αυτός δίνεται από την ταχύτητα σχηματισμού τους. Ο όρος ταχύτητα εισόδου αντιστοιχεί στη ροή F των συστατικών στον βιοαντιδραστήρα, ενώ ο όρος ταχύτητα εξόδου αντιστοιχεί στη ροή εξόδου του συστατικού από το βιοαντιδραστήρα. Για το υπόστρωμα S, το οποίο εισέρχεται στο βιοαντιδραστήρα μέσω του συστήματος τροφοδοσίας, το ισοζύγιο μάζας δίνεται από τη σχέση: d([ S] V ) rs XV F[ S dt o ] F out [ S] (2.1) όπου [S] η συγκέντρωση του υποστρώματος, [So] η συγκέντρωση του υποστρώματος κατά την τροφοδοσία του αντιδραστήρα, F και Fout ο ογκομετρικός ρυθμός ροής εισόδου και εξόδου από το βιοαντιδραστήρα αντίστοιχα, rs η ειδική ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος, X η συγκέντρωση της βιομάζας, V ο λειτουργικός όγκος του βιοαντιδραστήρα. Ο πρώτος όρος της εξίσωσης σχετίζεται με την ταχύτητα μεταβολής του υποστρώματος στο βιοαντιδραστήρα, ο δεύτερος όρος με την ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος, ο τρίτος όρος σχετίζεται με την ταχύτητα ροής του υποστρώματος στο ρεύμα εισόδου και ο τελευταίος όρος σχετίζεται με την ταχύτητα ροής στο ρεύμα εξόδου από τον αντιδραστήρα. Από την εξίσωση (2.1) προκύπτει: d[ S] rs X dt F V [ S o F ] ( V out 1 V dv dt )[ S] (2.2) Tόσο στην περίπτωση της συνεχούς, όσο και της ασυνεχούς λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα, ο όγκος παραμένει σταθερός, οπότε dv/dt =0. Παράλληλα, και για τις δύο περιπτώσεις ισχύει ότι F=Fout. Λαμβάνοντας υπόψη τις παραδοχές αυτές και ορίζοντας ως D το ρυθμό αραίωσης (dilution rate αποτελεί μέτρο της ταχύτητας με την οποία το περιεχόμενο του αντιδραστήρα αντικαθίσταται από καινούργιο) ή πλήρωσης του χώρου του βιοαντιδραστήρα, όπου D=F/V (2.2α) τότε η εξίσωση 2.2 λαμβάνει τη μορφή: d[ S] rs X D([ So ] [ S]) (2.3) dt 52

61 Ο πρώτος όρος στο δεξιό σκέλος της εξίσωσης 2.3 είναι η ογκομετρική ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος και αντιστοιχεί στο γινόμενο της ειδικής ταχύτητας κατανάλωσης του υποστρώματος rs με τη συγκέντρωση της βιομάζας X. Ο δεύτερος όρος αφορά στην προσθήκη και απομάκρυνση του υποστρώματος από τον βιοαντιδραστήρα. Με ανάλογο τρόπο, το ισοζύγιο μάζας για το προϊόν P του μεταβολισμού δίνεται από την εξίσωση 2.4: d[ P] rs X D([ Po ] [ P]) (2.4) dt Στις συνήθεις συνθήκες λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα δεν υπάρχει προϊόν κατά την τροφοδοσία του αντιδραστήρα, οπότε ο όρος [Po] είναι ίσος με μηδέν. To ισοζύγιο μάζας για τη συνολική βιομάζα X δίνεται από τη σχέση: d( XV) XV F dt out X (2.5) όπου μ ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης της συνολικής βιομάζας. Λαμβάνοντας υπόψη ότι D=F/V, τότε η εξίσωση 2.5 λαμβάνει τη μορφή: dx dt ( D) X (2.6) Διεργασία διαλείποντος έργου Στην περίπτωση ασυνεχούς λειτουργίας, η οποία εξελίσσεται σε ένα κλειστό σύστημα, ισχύει ότι F=0, οπότε σύμφωνα με την εξίσωση 2.2α ο ρυθμός αραίωσης D λαμβάνει την τιμή μηδέν. Στην περίπτωση αυτή, οι εξισώσεις 2.3 και 2.6 που περιγράφουν το ισοζύγιο μάζας για το υπόστρωμα και τη βιομάζα, μετατρέπονται αντίστοιχα σε: d[ S] rs X dt dx (2.7) και X (2.8) dt Σύμφωνα με τις παραπάνω εξισώσεις, η συγκέντρωση της βιομάζας θα αυξάνεται, καθώς η συγκέντρωση του υποστρώματος θα μειώνεται έως ότου μηδενιστεί, οπότε η ανάπτυξη των κυττάρων θα σταματήσει. Θεωρώντας ότι ισχύει η κινητική Monod, τότε μπορούν να γραφούν οι εξισώσεις: max [ S] [ S] K s, όπου μ ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, μ maxo μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, [S] η συγκέντρωση του υποστρώματος και Κ s η συγκέντρωση του υποστρώματος όταν μ=0.5μ max. 53

62 dx X dt K 1 max[ S S] [ S] (2.9) και [S]=[S0] Yxs(X-X0) (2.10) όπου [S0] και X0 οι συγκεντρώσεις του υποστρώματος και της βιομάζας σε χρόνο 0, και Υxs o συντελεστής μετατροπής του υποστρώματος σε μικροβιακή μάζα. Από τις εξισώσεις 2.9 και 2.10 προκύπτει η εξίσωση 2.11 η οποία περιγράφει τη μεταβολή της συγκέντρωσης βιομάζας και υποστρώματος κατά τη διάρκεια μιας τυπικής ζύμωσης διαλείποντος έργου: max t (1 [ S o K S ] Y xs X 0 )ln( X X 0 ) [ S o K S ] Y xs X 0 X ln(1 Y 0 xs X ) [ S ] o (2.11) Στην περίπτωση όπου ΚS<<[S], τότε μ=μmax=σταθερό, oπότε η εξίσωση (2.11) απλουστεύεται σημαντικά: 1 X t ln( ) ) (2.12) X 0 H ολική απόδοση της ασυνεχούς διαδικασίας Υsx ολικό, όπως εκφράζεται από τον συνολικό συντελεστή μετατροπής του υποστρώματος S σε μικροβιακή μάζα X, δίνεται από τη σχέση: Υsx ολικό = (Xτελικό- Xo)/[S0] (2.13) Συνήθως Xτελικό>>Xo, οπότε: Υsx ολικό = Xτελικό/[S0] (2.14) Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, ο παράγοντας Υsx ολικό διαφέρει από τον παράγοντα Υsx, καθώς ο δεύτερος είναι χρονικά εξαρτώμενο μέγεθος (Υsx=μ/rs). Στην περίπτωση όπου η ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος και ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων δεν μεταβάλλονται σημαντικά κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, τότε οι παράγοντες Υxs ολικό και Υxs είναι παρόμοιοι. 54

63 Διεργασία συνεχούς έργου Η διεργασία συνεχούς έργου χαρακτηρίζεται, όπως έχει αναφερθεί, από το γεγονός ότι νέο θρεπτικό υλικό εισάγεται με σταθερή ταχύτητα και υπό ασηπτικές συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα, ενώ στην κατάσταση ισορροπίας ίσος όγκος καλλιέργειας κυττάρων εξάγεται από αυτόν. Στη φάση σταθερής κυτταρικής ανάπτυξης, θα ισχύει dx/dt=0, οπότε από την εξίσωση 2.6 προκύπτει ότι: μ=d (2.15) H εξίσωση 2.15 ορίζει ότι η μεταβολή του ρυθμού αραίωσης D οδηγεί σε αντίστοιχη μεταβολή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων. Στη σταθερή κατάσταση, από την γενική εξίσωση 2.3 προκύπτει ότι: 0 r X D([ S ] [ S]) s o (2.16) Από τις εξισώσεις 2.15 και 2.16 και λαμβάνονοντας υπόψη ότι Υsx=μ/rs προκύπτει: X=Ysx([So] [S]) (2.17) όπου Υsx o συντελεστής παραγωγής μικροβιακή μάζας. Από την εξίσωση 2.17 φαίνεται ότι, o συντελεστής απόδοσης της διαδικασίας Υxs μπορεί να υπολογισθεί, αν είναι γνωστές οι συγκεντρώσεις της βιομάζας και του υποστρώματος στον αντιδραστήρα. Παράλληλα, όταν είναι γνωστές οι συγκεντρώσεις στη σταθερή κατάσταση, από την εξίσωση 2.16 μπορεί να υπολογισθεί η ειδική ταχύτητα κατανάλωσης του υποστρώματος. Εφαρμόζοντας το μοντέλο Monod και λαμβάνοντας υπόψη την εξίσωση 2.15 ισχύει: D max [ S] [ S] K s (2.18) ή DK [ S] max s D (2.19) Από την 2.19 προκύπτει ότι η συγκέντρωση του υποστρώματος αυξάνει με αύξηση του ρυθμού αραίωσης D. Όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος [S] γίνει ίδια με αυτή κατά την τροφοδοσία του αντιδραστήρα [So], τότε ο ρυθμός αραίωσης λαμβάνει τη μέγιστη τιμή του γνωστή ως κρίσιμος ρυθμός αραίωσης Dcrit D crit [ S ] o max (2.20) [ So ] K s Από την εξίσωση 2.19 φαίνεται ότι, η διεργασία συνεχούς έργου επιτρέπει τη μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης του υποστρώματος που συνδέεται με την παραγωγή προϊόντος, καθώς με μεταβολή του ρυθμού αραίωσης, ο μόνος παράγοντας που μεταβάλλεται είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος. Παράλληλα, είναι δυνατή 55

64 η μελέτη της επίδρασης διαφόρων υποστρωμάτων (π.χ. γλυκόζη, αμμωνία, κλπ) στη φυσιολογία του κυττάρου. Με συνδυασμό των εξισώσεων 2.17 και 2.19 προκύπτει η σχέση X Y sx ([ S o DK S ] ) D max (2.21) Σε ένα βιοαντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, το χρήσιμο μέγεθος της ζυμωτικής παραγωγικότητας Px, που αναφέρεται στην παραγωγή βιομάζας στη μονάδα του χρόνου, δίνεται από τη σχέση: Px=DΧ = DY sx ([ S o DK S ] ) D max (2.22) Η μέγιστη τιμή του ρυθμού αραίωσης D, η οποία μεγιστοποιεί τη ζυμωτική παραγωγικότητα, περιγράφεται από τη σχέση D opt max (1 K S K S [ S o ) ] (2.23) 56

65 3. ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΑΠΟ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 3.1 Παραγωγή ετερόλογων προϊόντων Παραδοσιακά ποικίλες τεχνικές έχουν εφαρμοσθεί σε βιομηχανική κλίμακα για την παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων (ένζυμα, αντισώματα, βιταμίνες κλπ). Ωστόσο, μόνο ένα σχετικά μικρό ποσοστό αυτών των προϊόντων παράγονται χρησιμοποιώντας τους οργανισμούς, οι οποίοι τα παράγουν στη φύση. Παράλληλα, ένα μικρό μόνο ποσοστό των μικροοργανισμών που υπάρχουν στη φύση μπορούν να καλλιεργηθούν υπό ελεγχόμενες συνθήκες, π.χ. σε βιοαντιδραστήρες. Το πρόβλημα αυτό όμως αντιμετωπίζεται σήμερα με τις τεχνικές της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA, με τις οποίες απομονώνεται το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος και στη συνέχεια εισάγεται σε κύτταρα ξενιστή (ο οποίος μπορεί να καλλιεργηθεί σε ελεγχόμενες συνθήκες), όπου εκφράζεται παράγοντας το προϊόν που μας ενδιαφέρει.. Προκαρυωτικά είδη Μπορούν να καλλιεργηθούν Δεν μπορούν να καλλιεργηθούν Αναλογία προκαρυωτικών οργανισμών που μπορούν να καλλιεργηθούν Τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παραγωγή τόσο πρωτεϊνικών, όσο και μη πρωτεϊνικών ετερόλογων προϊόντων. Η πλειονότητα των ετερόλογων πρωτεϊνών αφορά στη θεραπεία, αλλά και σε πρωτεΐνες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην κτηνοτροφική παραγωγή, στις διεργασίες 57

66 τροφίμων ή ως βιοκαταλύτες (ένζυμα) σε διάφορες βιοδιεργασίες. Τα μη πρωτεϊνικά προϊόντα μπορούν να προκύψουν από κύτταρα που έχουν τροποποιηθεί με προσεγγίσεις της Συνθετικής Βιολογίας (π.χ. Mεταβολική Μηχανική), οι οποίες στοχεύουν στη δημιουργία νέων μεταβολικών οδών ή οδών με αυξημένη δυνατότητα στο να οδηγούν στη μετατροπή των αρχικών υποστρωμάτων στα επιθυμητά προϊόντα.. ΙΙροϊόντα (έτος πρώτης έγκρισης) Ορμόνες και πεπτιδικοί παράγοντες Ανθρώπινη ινσουλίνη (1982) Παράγοντας VIII-C (1992) Ανθρώπινη αυξητική ορμόνη (1985) Ερυθροποιητίνη (1989) Ιντερφερόνη-αλφα 2a (1986) Ιντερφερόνη -άλφα 2b Ιντερφερόνη-βήτα (1993) Ιντερφερόνη-γάμα (1990) Ιντερλευκίνη-2 (1992) Ένζυμα Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου Προυροκινάση/Ουροκινάση DN-άση (1994) Εμβόλια Ηπατίτιδας Β (1986) Έρπη Μονοκλωνικά αντισώματα Βασικά βιοφαρμακευτικά προϊόντα. Τελική χρήση Διαβήτης Αιμοφιλία Ατελής ανάπτυξη Αναιμία, χρόνια νεφρική ανεπάρκεια Λευχαιμικά τριχωτά κύτταρα, AIDSσχετιζόμενος καρκίνος Καρκίνος Καρκίνος, αφροδισιακά, μολυσματικές ασθενείς Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου Καρδιακή προσβολή Πνευμονική θεραπεία Εμβόλια Ηπατίτιδας Β 'Ερπης Ευρεία κλίμακα διαφορετικών αντισωμάτων: διάγνωση, παρεμπόδιση πήξης αίματος, καρκίνο μαστού, καρκίνο του πνεύμονα. Ιδιαίτερη σημασία στην παραγωγή θεραπευτικών πρωτεϊνών έχει η διασφάλιση της ποιότητας και της ασφάλειας του προϊόντος. Η καθαρότητα του προϊόντος αποτελεί ύψιστης σημασίας στόχο δεδομένου ότι ισχυρά ανοσογόνες αντιδράσεις από ασθενείς ή άλλες παρενέργειες μπορούν να είναι καταστρεπτικές. Η σωστή μεταμεταφραστική επεξεργασία της πρωτεΐνης (π.χ. γλυκοζυλίωση ή φωσφορυλίωση) είναι ενίοτε βασική για τη βιολογική της λειτουργία. Για τα ζωικά εμβόλια ή τις ζωικές ορμόνες, ο βαθμός καθαρότητας των προϊόντων πρέπει να είναι επίσης πολύ υψηλός. Η ασφάλεια των προϊόντων είναι 58

67 σημαντική όταν αυτά χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα, αλλά οι απαιτήσεις για καθαρότητα είναι λιγότερο αυστηρές σε σχέση με ένα ενέσιμο προϊόν, που χρησιμοποιείται για την πρόληψη ή τη θεραπεία ασθενειών. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες και τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται σε διάφορες βιομηχανικές διαδικασίες δεν προϋποθέτουν υψηλή καθαρότητα, γεγονός που μειώνει το κόστος παραγωγής τους. Με τις τεχνικές της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA, γενετικό υλικό από διάφορους οργανισμούς μπορεί να ανασυνδυαστεί in vitro με αποτέλεσμα τη δημιουργία νέων συνδυασμών γενετικού υλικού που δεν είναι δυνατό να προκύψουν στη φύση. Έτσι, ένα τμήμα DNA από ένα προκαρυωτικό ή ευκαρυωτικό οργανισμό μπορεί να εισαχθεί με μεθόδους γενετικού ανασυνδυασμού (βακτηριακή σύζευξη, μετασχηματισμός, μεταγωγή κλπ) σε ένα άλλο κύτταρο (ξενιστής) και να κλωνοποιηθεί (παραγωγή σε πολλά αντίγραφα). Το πρώτο βήμα συνίσταται στη λήψη του γονιδίου που μας ενδιαφέρει. Μία απλουστευτική προσέγγιση είναι η κλωνοποίηση τυφλής στόχευσης. Στην περίπτωση αυτή, το DΝΑ από τον οργανισμό-δότη πέπτεται με τη χρησιμοποίηση περιοριστικών ενζύμων. Στον επόμενo πίνακα παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγματα περιοριστικών ενζύμων που έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες DNA, ενώ στο επόμενο σχήμα απεικονίζονται οι 2 χαρακτηριστικοί τρόποι πέψης του DNA που μπορεί να οδηγήσει σε τυφλά ή συνεκτικά άκρα. Οι δύο χαρακτηριστικοί τρόποι πέψης του DNA από περιοριστικά ένζυμα Χαρακτηριστικά παραδείγματα περιοριστικών ενζύμων διαφορετικής εξειδίκευσης 59

68 Ένζυμα Οργανισμός Αλληλουχία πέψης παναγνώρισης Εφόσον είναι διαθέσιμη μία αποδοτική διαδικασία διαλογής, μεγάλοι αριθμοί κυττάρων-ξενιστών με τυχαία τμήματα του DΝΑ μπορούν να επιλεγούν με βάση μια ιδιότητα σχετική με το επιθυμητό γονίδιο. Συχνά, μια τέτοια προσέγγιση τυφλής στόχευσης είναι ανεπαρκής. Πιο ειδικές προσεγγίσεις βασίζονται στον υβριδισμό. Ένας ανιχνευτής (ιχνηθέτης) μπορεί να συντεθεί χημικά, ώστε να είναι συμπληρωματικός σε ένα τμήμα του γονιδίου. Ο ανιχνευτής είναι συνήθως πολύ μικρότερος του γονιδίου, αλλά επαρκώς μεγάλος, ώστε να είναι απίθανο για άλλα γονίδια να εμφανίζουν την ίδια συμπληρωματική αλληλουχία DΝΑ. Η κατασκευή του ιχνηθέτη απαιτεί κάποια γνώση, είτε της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του επιθυμητού γονιδίου, είτε μιας μερικής αλληλουχίας αμινοξέων του επιθυμητού γονιδίου. Οι αντιδράσεις υβριδισμού απαιτούν το DΝΑ του δότη να έχει τεμαχισθεί και να έχει μετατραπεί σε απλούς κλώνους, που μπορούν να αντιδράσουν με μονόκλωνους ιχνηθέτες. 60

69 Κλωνοποίηση γονιδίου σε πλασμίδιο για τη μεταφορά του στον ξενιστή. Ο φορέας κλωνοποίησης και το ξένο DNA επωάζονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση. Αν τα άκρα που προκύπτουν είναι μονόκλωνα συμπληρωματικά (sticky ends), τότε τα «περιορισμένα» μόρια (του ξένου DNA και του πλασμιδίου) επωάζονται μαζί παρουσία του ενζύμου DNA-λιγάση και ΑΤΡ, ώστε να συνδυαστούν με υβριδισμό. J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski, Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα Η ολοκληρωτική χημική σύνθεση ενός γονιδίου που αντιστοιχεί στην επιθυμητή πρωτεΐνη αποτελεί μια εναλλακτική μέθοδο. Ο εναλλακτικός αυτός τρόπος απαιτεί γνώση της σειράς των αμινοξέων της επιθυμητής πρωτεΐνης. Ένα τεχνητό γονίδιο μπορεί να κωδικεύει ακριβώς την ίδια πρωτεΐνη, όπως το φυσικό. Η χημική σύνθεση μας επιτρέπει επίσης να παράγουμε ειδικά τροποποιημένες φυσικές πρωτεΐνες ή ενδεχομένως εξολοκλήρου σχεδιασμένες πρωτεΐνες. 61

70 Στην περίπτωση κατά την οποία ο οργανισμός-δότης είναι ευκαρυωτικός, υπάρχουν σοβαρά εμπόδια στην έκφραση των γονιδίων του σε γενετικά τροποποιημένα κύτταρα, δεδομένου ότι στο DNA των ευκαρυωτικών κυττάρων υπάρχουν ανενεργές περιοχές (ιντρόνια- introns), οι οποίες δεν κωδικοποιούν τη σύνθεση πρωτεϊνών. Επειδή τα βακτήρια δεν έχουν τον κυτταρικό εξοπλισμό για να αποκόπτουν ιντρόνια και να επιτελέσουν τη διαδικασία του ματίσματος, τα ευκαρυωτικά γονίδια δεν μπορούν να τοποθετηθούν κατευθείαν στα βακτήρια για την παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης. Σε μερικά γονίδια υπάρχουν περισσότερες από 50 τέτοιες περιοχές, που περιέχουν περισσότερα από ζεύγη βάσεων. Στην περίπτωση αυτή, το γονίδιο, το οποίο πρόκειται να απομονωθεί, λαμβάνεται από το αντίστοιχο mrna μέσω ανάστροφης μεταγραφής (reverse transcription). Αφού απομονωθεί το m-rna, το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (τρανσκριπτάση) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συνθέσει ένα μόριο DΝΑ με την αντίστοιχη αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Το μόριο αυτό ονομάζεται συμπληρωματικό DΝΑ ή c-dνα. (Σχήμα 3.1α). συμπληρωματικό DΝΑ ή c-dνα 62 Σχήμα 3.1a. Κατασκευή συμπληρωματικού DΝΑ ( c-dνα) από mrna

71 Όταν το επιθυμητό γονίδιο απομονωθεί ή κατασκευαστεί, μπορεί να εισαχθεί σε ένα μικρό κομμάτι του μεταφορέα του DNA που αποκαλείται φορέας κλωνοποίησης για να εισαχθεί στα κύτταρα του ξενιστή, όπου θα εκφραστεί για να παραχθεί η πρωτεΐνη -στόχος. Στο σχήμα 3.1β παρουσιάζονται συνοπτικά τα βασικά βήματα έκφρασης ενός γονιδίου από ένα ευκαρυωτικό οργανισμό σε βακτήριο χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο ως φορέα κλωνοποίησης. Σχήμα 3.1β Έκφραση ενός γονιδίου από ένα ευκαρυωτικό οργανισμό σε βακτήριο χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο ως φορέα κλωνοποίησης. (Clark & Pazdernik Biotechnology Elsevier 2012) 3.2 Φορείς κλωνοποίησης Η μεταφορά τμημάτων DNA που περιέχουν γενετική πληροφορία προϋποθέτει τη διαθεσιμότητα κατάλληλων μορίων DNA, τα οποία χρησιμεύουν ως φορείς κλωνοποίησης (cloning vectors) για τη μεταφορά, καθώς και κύτταρα ξενιστές ικανά να δεχθούν το ξένο DNA. Ως φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιούνται πλασμίδια, κοσμίδια, φάγοι, ιοί και τεχνητά χρωμοσώματα βακτηρίων (BAC), ζυμών (YAC) και 63

72 ανθρώπινης προέλευσης (HAC). Οι φορείς αυτοί, είτε ενσωματώνονται ολόκληροι στο χρωμοσωμικό DNA του κυττάρου ξενιστή, είτε παραμένουν μέσα στο κύτταρο ξενιστή ως επίσωμα. Οι φορείς κλωνοποίησης που χρησιμοποιούνται πρέπει να έχουν απαραιτήτως τα παρακάτω χαρακτηριστικά προκειμένου να θεωρηθούν χρήσιμοι: 1) ικανότητα για αυτόνομη αντιγραφή του DNA (ύπαρξη αφετηρίας αντιγραφής, origin of replication), 2) ευκολία ανίχνευσής τους (αν φέρουν κάποιο γόνο μάρτυρα, όπως π.χ. ανθεκτικότητα σε κάποιο αντιβιοτικό) και 3) δυνατότητα εύκολης κατασκευής του ανασυνδυασμένου μορίου. Υπάρχουν πέντε βασικοί τύποι φορέων κλωνοποίησης που δέχονται διαφορετικά μεγέθη DNA ενθέσεων (πίνακας 3.1). Οι φορείς κλωνοποίησης πολλές φορές σχεδιάζονται με ποικίλα χαρακτηριστικά, γεγονός που επιτρέπει την έκφρασή τους τόσο σε προκαρυωτικά, όσο και σε ευκαρυωτικά κύτταρα ξενιστές. Πίνακας 3.1. Φορείς κλωνοποίησης. Φορείς Μέσο μέγεθος ένθεσης (bp) Πλασμίδιο Βακτηριοφάγος Κοσμίδιο Τεχνητό χρωματόσωμα ζύμης (YAC) Τεχνητό χρωματόσωμα βακτηρίου (BAC) Πλασμίδιο Τα πλασμίδια είναι κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA που ποικίλουν σε μέγεθος (από 1kb έως 200kb). Έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται σε πολλά (μέχρι 50) αντίγραφα ανά κύτταρο. Τα πλασμίδια μπορούν να αντιγράφονται ανεξάρτητα από τα βακτηριακά χρωματοσώματα, αν και χρησιμοποιούν ένζυμα και πρωτεΐνες από τον ξενιστή τους. Για να είναι ένα πλασμίδιο χρήσιμο στην γενετική μηχανική πρέπει να έχει τις ακόλουθες ιδιότητες: α. Να μπορεί να πολλαπλασιάζεται αυτόνομα και ανεξάρτητα από το χρωμοσωμικό DNA του βακτηρίου ξενιστή. Για τον λόγο αυτό, τα πλασμίδια περιέχουν ένα σημείο έναρξης αντιγραφής (origin of replication-ori). Ο αριθμός των αντιγράφων του πλασμιδίου σε ένα βακτηριακό κύτταρο ελέγχεται γενετικώς από το ίδιο το πλασμίδιο. Ανάλογα με τον αριθμό πλασμιδιακών αντιγράφων, υπάρχει αυστηρός (λίγα αντίγραφα) ή χαλαρός (πολλά αντίγραφα) έλεγχος αντιγραφής (πίνακας 3.2). 64

73 Πίνακας 3.2. Αριθμός αντιγράφων πλασμιδίων σε βακτηριακά κύτταρα. πλασμίδιο αριθμός αντιγράφων puc pbluescript pgem ptz >1000 pbr pacyc psc101 ~5 β. να υπάρχει ένα μοναδικό σημείο δράσης ενός ή περισσοτέρων περιοριστικών ενζύμων στο πλασμίδιο, κατά προτίμηση μέσα στην αλληλουχία του δείκτη επιλογής. Με αυτό τον τρόπο, όταν γίνεται ενσωμάτωση μίας αλληλουχίας DNA στο σημείο δράσης του περιοριστικού ενζύμου, τo γονίδιο του δείκτη επιλογής απενεργοποιείται λόγω του ανασυνδυασμού. Υπάρχουν πλασμίδια που περιέχουν ένα πολυσυνδετήρα (polylinker), δηλαδή μία DNA περιοχή που περιλαμβάνει θέσεις αναγνώρισης για περισσότερα από ένα ένζυμο περιορισμού. γ. να περιέχει δείκτες επιλογής. Συνήθως δείκτες επιλογής είναι γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (πχ αμπικιλλίνη-ap R ή amp, τετρακυκλίνη-tc R ή tet, χλωραμφενικόλη-cm R, καναμυκίνη-kn R ), ή γονίδια που ευθύνονται για την παραγωγή χρώσης, όταν τα βακτήρια βρεθούν σε κατάλληλο υπόστρωμα (βγαλακτοσιδάση σε υπόστρωμα X-gal και IPTG). Το πλασμίδιο puc18/19 έχει δύο δείκτες επιλογής: α. ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη και β. ένα γονίδιο lacz που παράγει την β-γαλακτοσιδάση. Ο πολυσυνδετήρας βρίσκεται μέσα στο lacz (εικόνα 3.2). Σε ένα μετασχηματισμό, βακτήρια που δεν έχουν μετασχηματισθεί με το πλασμίδιο, δεν έχουν ανθεκτικότητα στην αμπικιλλίνη που έχει προστεθεί στο θρεπτικό υπόστρωμα, και δεν επιβιώνουν. Βακτήρια που έχουν μετασχηματισθεί, αλλά το πλασμίδιο δεν είναι ανασυνδυασμένο (δεν περιέχει ένθεση DNA σε μία από τις θέσεις περιορισμού του πολυσυνδετήρα), έχουν χρώμα μπλε γιατί παράγουν την β-γαλακτοσιδάση και υδρολύουν την X-gal. Η β-γαλακτοσιδάση είναι ένα ένζυμο, το οποίο καταλύει τη διάσπαση της λακτόζης σε γλυκόζη και γαλακτόζη. Στο βακτηριακό θρεπτικό υπόστρωμα προστίθεται μία χρωμογενής ένωση, η X-gal (5- chloro-4-bromo-3-indolyl-β-d-galactoside), η οποία υδρολύεται παρουσία β- 65

74 γαλακτοσιδάσης και οι βακτηριακές αποικίες αποκτούν μπλε χρώμα. Τέλος, βακτηριακές αποικίες που περιλαμβάνουν DNA ένθεση, η οποία βρίσκεται ενσωματωμένη σε κάποια θέση δράσης περιοριστικού ενζύμου μέσα στον πολυσυνδετήρα, παραμένουν άσπρες γιατί έχει απενεργοποιηθεί το γονίδιο lacz και δεν είναι εφικτή η παραγωγή της β-γαλακτοσιδάσης. Σχήμα 3.2a Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης δ. το πλασμίδιο να μην μπορεί να μεταβιβάζεται, ούτε να κινείται, για λόγους ασφάλειας. ε. το μοριακό βάρος του πλασμιδίου πρέπει να είναι μικρό, γιατί η αποδοτικότητα μετασχηματισμού και ο αριθμός αντιγράφων μειώνεται, όσο μεγαλώνει το μοριακό βάρος του πλασμιδίου. στ. να είναι δυνατή η εύκολη απομόνωση του πλασμιδίου, χωρίς να καταστρέφεται η δομή του. 66

75 Σχήμα 3.2b Διάκριση μπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων φορέων J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. Recombinant DNA 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα Η εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια επιτυγχάνεται με δύο μεθόδους: 1. Με τη μέθοδο θειϊκού ασβεστίου, κατά την οποία η επώαση των κυττάρων με θειικό ασβέστιο έχει ως αποτέλεσμα να μεγαλώνουν οι πόροι της κυτταρικής μεμβράνης επιτρέποντας στα πλασμίδια να εισέλθουν στα βακτηριακά κύτταρα. 2. Mε τη μέθοδο ηλεκτροδιάτρησης (electroporation, βλ. παράγραφο 3.3). 67

76 H εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια επιτυγχάνεται μέσω της επώασης με θειϊκο ασβέστιο σε πάγο. Μετά από σύντομο θερμικό σοκ τα κύτταρα μπορούν να δεχτούν τα πλασμίδια (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012). Σημαντικά πλεονεκτήματα προσφέρουν οι φορείς κλωνοποίησης (shuttle vectors), οι οποίοι μπορούν να επιβιώσουν σε περισσότερους από έναν τύπο κυττάρων ξενιστών. Τέτοιοι φορείς συχνά είναι πλασμίδια, τα οποία μπορούν να πολλαπλασιαστούν στα κύτταρα δύο διαφορετικών ξενιστών, καθώς διαθέτουν δύο αφετηρίες αντιγραφής (ori,) καθώς και όλες τις απαραίτητες αλληλουχίες για την επιβίωσή τους στους ξενιστές. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι φορείς που προέρχονται από πλασμίδια ζυμών (2μ circle), τα οποία έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν τόσο σε βακτήρια, όσο και σε ζύμες (π.χ. Saccharomyces cerevisiae και Escherichia coli). Ενδιαφέρον παρουσιάζουν και οι φορείς κλωνοποίησης που είναι αδενοϊοί, οι οποίοι μπορούν να πολλαπλασιαστούν τόσο σε βακτήρια, όσο και σε κύτταρα θηλαστικών. 2. Φάγοι Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενοι βακτηριοφάγοι φορείς είναι ο λ και ο Μ13. Και οι δυο πολλαπλασιάζουν το DNA τους σε ψηλά επίπεδα κατά τη μόλυνση του ξενιστή (βακτηρίου) και παράγουν ιοειδή, τα οποία ελευθερώνονται στο θρεπτικό μέσο, κάνοντας έτσι τη συλλογή τους για την παρασκευή DNA ιδιαίτερα εύκολη. Ο βακτηριοφάγος μπορεί να ακολουθήσει δύο διαφορετικές πορείες πολλαπλασιασμού σε ένα βακτήριο ξενιστή: α. τη λυτική πορεία, όπου το DNA του ιού και οι πρωτεΐνες εκφράζονται γρήγορα, πακετάρονται σε σωμάτια και καταστρέφουν το 68

77 βακτήριο με ταυτόχρονη απελευθέρωση 100 έως 1000 περίπου ιοσωματίων (virions), και β. τη λυσιγονική πορεία, όπου το DNA του ιού ενσωματώνεται στο βακτηριακό γονιδίωμα και πολλαπλασιάζεται μαζί του παραμένοντας ανενεργό, μέχρις ότου αλλαγές στο περιβάλλον το ενεργοποιήσουν και ακολουθήσει τη λυτική πορεία. Η παρουσία των βακτηριοφάγων είναι από μόνη της εμφανής (πλάκα σε βακτηριακή χλόη) και έτσι δεν χρειάζονται γενετικοί δείκτες, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των πλασμιδίων. Η ποσότητα DNA που μπορεί να συσκευασθεί στην κεφαλή του βακτηριοφάγου δεν μπορεί να υπερβεί τις 52kb ή να είναι λιγότερη από 38kb, γιατί η κεφαλή έχει καθορισμένο σχήμα και χωρητικότητα. Για να μπορέσει, λοιπόν, να είναι χρήσιμος ένας φάγος σαν φορέας, θα πρέπει: 1. να αφαιρεθούν αλληλουχίες από το γονιδίωμα του φάγου, οι οποίες δεν είναι απαραίτητες για τον κύκλο ζωής του, ώστε να μπορεί να δεχθεί το ξένο DNA (φορείς παρεμβολής). Ο φάγος λ έχει γονιδίωμα περίπου 50 kb, 20 kb από τις οποίες είναι περιττές για την αύξησή του σε E. coli και μπορούν να αντικατασταθούν με ξένο DNA. 2. να δημιουργηθούν δύο θέσεις δράσης περιοριστικού ενζύμου στα άκρα της αλληλουχίας του φάγου που θα απομακρυνθεί και θα αντικατασταθεί από το ξένο DNA (φορείς αντικατάστασης). Η ικανότητα του λ φάγου να δέχεται σχετικά μεγάλα ενθέματα τον κάνει ιδανικό για την κατασκευή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών. Το γονιδίωμα του Μ13 είναι μονόκλωνο DNA και έτσι παράγει και το ένθεμα σε μονόκλωνη μορφή, ιδανική για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του. Σχήμα 3.3α Τροποποιήσεις λ βακτηριοφάγων για να είναι χρήσιμοι σαν φορείς. 69

78 Ο γενετικός χάρτης του λ-φάγου είναι γνωστός και αποτελείται από περίπου 40 γονίδια, τα οποία είναι οργανωμένα σε συστάδες. Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες για την κατασκευή της κεφαλής και της ουράς (γονίδια A-J) βρίσκονται στο αριστερό μέρος του συμβατικού γενετικού χάρτη. Στην κεντρική περιοχή υπάρχουν γονίδια υπεύθυνα για την λυσιγονική πορεία του φάγου, ενώ αμέσως μετά υπάρχουν αλληλουχίες που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του DNA (γονίδια O και P) και τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών (γονίδια S και R). Η περιοχή της αρχής αντιγραφής (ori) βρίσκεται μέσα στο γονίδιο O. Στα άκρα του μορίου υπάρχουν δύο συνεκτικές συμπληρωματικές μονόκλωνες αλληλουχίες 12 νουκλεοτιδίων στο 5 άκρο. Τα άκρα αυτά ονομάζονται cos και επιτρέπουν στο μόριο DNA, μετά τη μόλυνση του βακτηρίου, να πάρει κυκλικό σχήμα. Οι αλληλουχίες που μπορούν να αφαιρεθούν, για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν φορέας ο φάγος, βρίσκονται στην κεντρική περιοχή που εδράζονται τα γονίδια της λυσιγονικής πορείας του φάγου. Σχήμα 3.3β Γενετικός χάρτης του λ-βακτηριοφάγου. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ο τρόπος που συσκευάζεται το DNA στην κεφαλή του φάγου. Όταν το DNA του φάγου βρεθεί μέσα στο βακτηριακό κύτταρο γίνεται κυκλικό λόγω της παρουσίας των cos άκρων. Στη συνέχεια αρχίζει να αντιγράφεται με το μηχανισμό του κυλιόμενου κύκλου, με αποτέλεσμα τη δημιουργία πολλών γονιδιωμάτων σε σειρά (συγκαταμερή). Με τη δημιουργία και παρουσία των κεφαλών του φάγου, το συγκαταμερές αρχίζει να διασπάται με τη δράση του ενδονουκλεοτιδικού ενζύμου (που παράγεται από το γονίδιο Α) στις cos θέσεις και παράγονται γραμμικά μονομερή με κολλώδη άκρα, που συσκευάζονται στις κεφαλές. Όταν ολοκληρωθεί η συσκευασία του μορίου DNA μέσα στην κεφαλή του φάγου προστίθεται και η ουρά του. 70

79 3. Κοσμίδια Eίναι φορείς-υβρίδια μεταξύ λ φάγου και πλασμιδίου, οι οποίοι αντιπαρέρχονται την αδυναμία των προηγούμενων φορέων να μεταφέρουν μεγάλα κομμάτια DNA (τα κοσμίδια μπορούν να μεταφέρουν μέχρι και 45 kb). Το DNA τους μπορεί να αντιγράφεται όπως ένα πλασμίδιο και να πακετάρεται όπως συμβαίνει σε ένα φάγο. Η δημιουργία τους βασίζεται στην παρουσία των αλληλουχιών cos του φάγου (cos sites), οι οποίες είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των γονιδίων που δημιουργούν την πρωτεϊνική κάψα του φάγου. Αν ανάμεσα στις δυο περιοχές cos κλωνοποιηθεί μια πλασμιδιακή περιοχή που περιέχει ένα γονίδιο-δείκτη ανθεκτικότητας σε ένα αντιβιοτικό και ένα πολυσυνδέτη (polylinker ή Multiple Cloning Site - MCS) για να εισαχθεί το ξένο DNA, τότε δημιουργείται ένα κοσμίδιο. Το γεγονός ότι τα κοσμίδια έχουν τη δυνατότητα ενσωμάτωσης μεγάλων μορίων DNA, αποτελεί και το κυριότερο πλεονέκτημά τους για την κατασκευή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών. Εισαγωγή γονιδίου σε κοσμίδιο (Clark & Pazdernik Biotechnology Elsevier 2012) 71

80 4. Τεχνητά χρωματοσώματα ζύμης Τα τεχνητά χρωματοσώματα ζύμης είναι φορείς που αποτελούνται από τα δομικά μέρη των χρωματοσωμάτων ζύμης και έχουν τη δυνατότητα να δέχονται μεγάλα κομμάτια DNA (μέχρι 1000kb). Τα δομικά αυτά μέρη είναι: α. το κεντρομερές, που είναι απαραίτητο για την κατανομή των χρωματίδων στα κύτταρα κατά την διάρκεια της μίτωσης, β. τα δύο τελομερή στα άκρα του χρωματοσώματος, τα οποία προστατεύουν το DNA από τη δράση εξωνουκλεασών, γ. τις περιοχές έναρξης αντιγραφής DNA, για τη δυνατότητα αντιγραφής του χρωματοσώματος, και δ. δύο γονίδια επιλογής, ένα σε κάθε άκρο του χρωματοσώματος. Σε αντίθεση με όλους τους φορείς που προαναφέρθηκαν και οι οποίοι χρησιμοποιούν βακτήρια για ξενιστές, τα YACs χρησιμοποιούν κύτταρα μυκήτων. 5. Τεχνητά χρωματοσώματα βακτηρίων Τα τεχνητά χρωματοσώματα βακτηρίων (BACs) είναι φορείς που αποτελούνται από δομικά μέρη βακτηριακών χρωματοσωμάτων. Είναι ένας νέος τύπος φορέα, κατάλληλος για κλωνοποίηση ενθεμάτων ξένου DNA μεγέθους kb. Βασίζεται στον παράγοντα F (μεγέθους 7 kb) της E. coli, ο οποίος έχει τη δυνατότητα να μεταφέρει μεγάλα κομμάτια του γενετικού υλικού της E. coli σαν F παράγωγα. Το μέγεθος του ενθέματος είναι μικρότερο από αυτό που κλωνοποιείται στα YACs, όμως τα BACs μπορούν να απομονωθούν και να χρησιμοποιηθούν ακολουθώντας απλές τεχνικές, οι οποίες εφαρμόζονται στο χειρισμό των πλασμιδίων. 72

81 3.3 Περιορισμοί στην παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων από γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς Η παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών μπορεί να αποβεί καταστρεπτική για το κύτταρο ξενιστή. Αυτό είναι αποτέλεσμα της γενετικής αστάθειας που παρατηρείται, καθώς τα κύτταρα που περιέχουν πλασμίδια και παράγουν ετερόλογη πρωτεΐνη αναπτύσσονται πολύ πιο αργά σε σχέση με τα κύτταρα που δεν περιέχουν πλασμίδια. Καθώς τα κύτταρα που δεν περιέχουν πλασμίδια δεν επιβαρύνονται με την παραγωγή, μπορούν να επενδύσουν την ενέργειά τους στην κυτταρική διαίρεση. Για να ελαχιστοποιηθεί η επιλογή κατά των κυττάρων που υπερεκφράζουν το προϊόν, θα πρέπει να ελαχιστοποιηθεί η έκφραση του ανασυνδυασμένου γονιδίου. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση ρυθμιζόμενων υποκινητών με ελεγχόμενο αριθμό αντιγράφων, όπως θα δούμε στη συνέχεια. Η γενετική αστάθεια μπορεί να εμφανιστεί σε οποιοδήποτε σύστημα έκφρασης λόγω της απώλειας διαχωρισμού, της δομικής αστάθειας των πλασμιδίων, των μεταλλάξεων των κυττάρων-ξενιστών, και του διαφορετικού ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων που δεν περιέχουν πλασμίδια σε σχέση με τα κύτταρα που περιέχουν πλασμίδια. Η απώλεια διαχωρισμού εμφανίζεται όταν ένα κύτταρο διαιρείται έτσι, ώστε ένα από τα θυγατρικά κύτταρα να μην εμπεριέχει κανένα πλασμίδιο. Τα πλασμίδια αναφέρονται ως πλασμίδια υψηλού αριθμού αντιγράφων (περισσότερα από 20 αντίγραφα ανά κύτταρο) και πλασμίδια χαμηλού αριθμού αντιγράφων (ακόμη και 1-2 αντίγραφα ανά κύτταρο). Η απώλεια διαχωρισμού των πλασμιδίων επηρεάζεται από πολλούς περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως το διαλυμένο οξυγόνο, τη θερμοκρασία, τη σύνθεση του θρεπτικού υλικού ανάπτυξης και το ρυθμό αραίωσης σε ένα χημοστάτη. Τo φαινόμενο της δομικής αστάθειας των πλασμιδίων συνδέεται με την ιδιότητα ορισμένων κυττάρων να διατηρούν τα πλασμίδια, αλλά να τα τροποποιούν τόσο, ώστε να μειωθούν οι επιβλαβείς επιδράσεις τους στο κύτταρο (δομική αστάθεια). Τα κύτταρα που περιέχουν τα δομικά αλλαγμένα πλασμίδια μπορούν να αυξηθούν με διαφορετικό ρυθμό από τα κύτταρα που έχουν τα αρχικά πλασμίδια. Ένας άλλος περιοριστικός παράγοντας σχετίζεται με το γεγονός ότι στα κύτταρα-ξενιστές είναι δυνατό να εμφανιστούν μεταλλάξεις, που τα καθιστούν ακατάλληλα ως συστήματα παραγωγής ενός συγκεκριμένου προϊόντος. Οι 73

82 μεταλλάξεις αυτές αλλάζουν συχνά τη ρύθμιση του κυττάρου και οδηγούν σε μειωμένη σύνθεση της πρωτεΐνης-στόχου. Η σημασία και των τριών αυτών παραγόντων (απώλεια διαχωρισμού του πλασμιδίου, δομικές αλλαγές του πλασμιδίου και μεταλλάξεις των κυττάρωνξενιστών) εξαρτάται από τη διαφοροποίηση του ρυθμού ανάπτυξης του αλλαγμένου συστήματος κύτταρο-πλασμίδιο ως προς το αρχικό σύστημα ξενιστή-φορέα. Εάν το αλλαγμένο σύστημα ξενιστή-φορέα έχει ένα διακριτό πλεονέκτημα ανάπτυξης σε σχέση με το αρχικό σύστημα ξενιστή-φορέα, το αλλαγμένο σύστημα τελικά θα κυριαρχήσει (δηλ. θα εμφανιστεί γενετική αστάθεια). Το πρόβλημα της γενετικής αστάθειας είναι πιο σημαντικό για τις εμπορικές διαδικασίες παρά για πειράματα εργαστηριακού επιπέδου. Ο κύριος λόγος είναι ότι η καλλιέργεια πρέπει να περάσει από πολύ περισσότερες γενεές για να φθάσει σε μια πυκνότητα κυττάρων/ml σε πολύ μεγάλου όγκου βιοαντιδραστήρα, απ ό,τι σε μια αναδευόμενη φιάλη μικρού όγκου Έκφραση και μεγιστοποίηση της έκφρασης Η κλωνοποίηση του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος δεν μπορεί από μόνη της να εξασφαλίσει την έκφρασή της. Για το λόγο αυτό, κατά την κλωνοποίηση του γονιδίου πρέπει να ληφθούν τα κατάλληλα μέτρα, έτσι ώστε να εκφραστεί το γονίδιο στον κατάλληλο χρόνο και στα επιθυμητά επίπεδα στο φορέα έκφρασης. Η παραγωγή της συνολικής πρωτεΐνης εξαρτάται από τον αριθµό των πλασµιδίων και από την ισχύ του υποκινητή που χρησιμοποιείται. Ο αυξανόμενος αριθµός αντιγράφων αυξάνει την παραγωγή της πρωτεΐνης, αλλά όχι απεριόριστα. Για να μεγιστοποιηθεί η έκφραση ενός γονιδίου θα πρέπει να ληφθούν διάφοροι παράγοντες υπόψη, οι κυριότεροι εκ των οποίων αναφέρονται στη συνέχεια. Μεταγραφή Η περιοχή του υποκινητή (προαγωγός -promoter) αποτελεί μία σημαντική αλληλουχία DNA για τον έλεγχο της έκφρασης του γονιδίου που κλωνοποιείται, καθώς εκεί συνδέεται η RNA πολυμεράση για να ξεκινήσει η μεταγραφή του DNA σε mrna. 74

83 Πλασμίδιο που διαθέτει υποκινητή (προαγωγέα) (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012) Ένα γονίδιο που δεν βρίσκεται μεταξύ του υποκινητή και του σήματος τερματισμού δεν θα μεταγραφεί. Θα πρέπει να έχουμε υπόψη ότι, ορισμένα γονίδια που έχουν απομονωθεί με κλωνοποίηση του cdna δεν έχουν το δικό τους υποκινητή και θα πρέπει να εισαχθούν στον φορέα κλωνοποίησης κοντά στην περιοχή του υποκινητή. Παράλληλα, ακόμη και στην περίπτωση όπου ένα κλωνοποιημένο γονίδιο έχει το δικό του υποκινητή, αυτός είναι πιθανό να μην είναι λειτουργικός στα κύτταρα του ξενιστή και θα πρέπει να αντικατασταθεί. Για παράδειγμα, στο E. coli η παραγωγή μίας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης μπορεί να φθάσει σε επίπεδα που αντιστοιχούν στο 50% του συνόλου των πρωτεϊνών που εκφράζει ο μικροοργανισμός, ανάλογα με τον υποκινητή που επιλέγεται για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου. Πλήθος υποκινητών που απαντώνται στη φύση έχουν χρησιμοποιηθεί για την άμεση έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε υψηλά επίπεδα. Ωστόσο απαιτείται υψηλό επίπεδο γνώσεων προκειμένου να επιτευχθεί η παραγωγή υποκινητών που μπορούν να ελέγξουν αυστηρά την έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Υποκινητές, οι οποίοι ενεργοποιούνται από ακριβές και τοξικές χημικές ουσίες, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μεγάλη κλίμακα, οπότε για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται υποκινητές, οι οποίοι ενεργοποιούνται αυξάνοντας τη θερμοκρασία του μέσου επώασης. Ο υποκινητής lac του οπερονίου της λακτόζης µπορεί να επαχθεί µε την προσθήκη λακτόζης ή ένα ανάλογο της λακτόζης (π.χ. IPTG ή ισοπροπυλο-β- D-θειογαλακτοζίδιο). Άλλοι υποκινητές ενεργοποιούνται σε χαμηλή πίεση οξυγόνου ή με φθηνούς και εύκολα διαθέσιμους υδατάνθρακες. Η χρησιμοποίηση υποκινητή που επάγεται από τη µείωση του οξυγόνου μπορεί να δώσει καλά αποτελέσματα, 75

84 καθώς το επίπεδο του οξυγόνου µπορεί να ελεγχθεί σχετικά εύκολα σε βιοαντιδραστήρες. Η επαγωγή με μεταβολή της θερμοκρασίας χρησιμοποιείται συχνά σε µικρή κλίµακα. Στα θερμοεξαρτώμενα πλασμίδια ο αριθμός των αντιγράφων σε θερμοκρασία κάτω από 30 ο C μπορεί να είναι πολύ χαμηλός (<10 πλασμίδια ανά κύτταρο). Αντίθετα, όταν η θερμοκρασία αυξηθεί στους 37 ο C, ο αριθμός των αντιγράφων μπορεί να αυξηθεί σε μερικές εκατοντάδες έως και σε μερικές χιλιάδες. Οι αλληλουχίες τερματισμού της μεταγραφής είναι ένα άλλο στοιχείο που πρέπει να ελεγχθεί. Στην αντίθετη περίπτωση, μπορεί να μειωθεί σημαντικά η παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης, αφού καταναλώνεται από το φορέα έκφρασης μεγάλο ποσό ενέργειας άσκοπα για την παραγωγή μη λειτουργικών mrna μορίων. Μετάφραση Η αποτελεσματικότητα της μετάφρασης από τα mrna μεταγραφήματα απαιτεί την παρουσία μίας θέσης σύνδεσης του ριβοσώματος (RBS: ribosome binding site) περίπου 5 bp πριν από το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης. Η RBS δομή τείνει να είναι διαφορετική από βακτήριο σε βακτήριο σύμφωνα με τις αλληλουχίες στο 3 -ΟΗ άκρο του 16S ριβοσωμικού (r)rna, το οποίο αλληλεπιδρά με το mrna. Μετά τη σύνδεση του mrna, το ριβόσωμα κινείται κατά μήκος του mrna και ξεκινά τη σύνθεση της πρωτεΐνης όταν συναντήσει το πρώτο κωδικόνιο AUG και συνεχίζει έως ότου συναντήσει ένα κωδικόνιο τερματισμού (UAA, UAG ή UGA). Στην περίπτωση όπου το γονίδιο που επιθυμούμε να κλωνοποιήσουμε δεν διαθέτει περιοχή σύνδεσης με το ριβόσωμα, θα πρέπει να εισαχθεί σε φορέα που να επιτρέπει την ένθεσή του μετά από έναν υποκινητή και μια θέση σύνδεσης με το ριβόσωμα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων στην περιοχή σύνδεσης με το ριβόσωμα, καθώς και μεταξύ της περιοχής σύνδεσης με το ριβόσωμα και του κωδικονίου έναρξης AUG, είναι ιδιαίτερα σημαντική και καθορίζει τα επίπεδα έκφρασης. Ένας ακόμη σημαντικός παράγοντας που θα πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι το γεγονός ότι ο κώδικας είναι εκφυλισµένος, δεδοµένου ότι περισσότερα από ένα κωδικόνια µπορούν να προσδιορίσουν ένα αµινοξύ (π.χ. το καθένα από τα UCU, UCC, UCA και UCG προσδιορίζει το αµινοξύ σερίνη). Τα κωδικόνια που κωδικοποιούν το ίδιο αμινοξύ χαρακτηρίζονται ως συνώνυμα. Τα συνώνυμα κωδικόνια δεν χρησιμοποιούνται και με την ίδια συχνότητα στους διάφορους 76

85 οργανισμούς. Τα περισσότερα βακτήρια δείχνουν προτίμηση σε συγκεκριμένα συνώνυμα κωδικόνια που κωδικοποιούν κάποιο αμινοξύ, ιδίως στην περίπτωση των γονιδίων που εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα. Καθώς τα περισσότερα κωδικόνια αναγνωρίζονται από συγκεκριμένα trnas, η χρησιμοποίηση μη κοινών κωδικονίων θα οδηγούσε σε πρώιμο τερματισμό της αμινοξικής αλληλουχίας και σε αυξημένο ποσοστό ενσωμάτωσης λάθους αμινοξέων στις συντιθέμενες πρωτεΐνες (το φυσιολογικό ποσοστό λάθους είναι περίπου 1 στα 3000 αμινοξέα). Εισαγωγή γονιδίου προς κλωνοποίηση σε φορέα που να επιτρέπει την ένθεσή του μετά από έναν υποκινητή και μια θέση σύνδεσης (RΒS) με το ριβόσωμα. (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012) Έκφραση πολλαπλών υπομονάδων σε κύτταρα θηλαστικών Για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών, που αποτελούνται από περισσότερες υπομονάδες, ακολουθείται διαδικασία, η οποία βασίζεται στη χρήση: Α) δύο ξεχωριστών φορέων, όπου ο καθένας φέρει το γονίδιο της κάθε υπομονάδας Β) ενός κοινού φορέα, ο οποίος μεταφέρει σε χωριστές θέσεις τα γονίδια των υπομονάδων, όπου ο έλεγχος γίνεται από ξεχωριστούς υποκινητές (ένας για κάθε γονίδιο) 77

86 Γ) ενός κοινού φορέα, ο οποίος μεταφέρει ένα τεχνητό οπερόνιο, στο οποίο τα γονίδια των υπομονάδων εκφράζονται χρησιμοποιώντας τον ίδιο υποκινητή. Σύνθεση υπομονάδων πρωτεΐνης με τη χρήση κοινού φορέα, ο οποίος μεταφέρει σε χωριστές θέσεις τα γονίδια των υπομονάδων, όπου ο έλεγχος γίνεται από ξεχωριστούς υποκινητές (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012) Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις και σταθερότητα του προϊόντος Πολλοί παράγοντες, που αφορούν σε διαδικασίες μετά την έκφραση του κλωνοποιημένου γονιδίου, είναι σημαντικοί και καθορίζουν τις ιδιότητες ενός ετερόλογου προϊόντος. Για παράδειγμα, μια ανεπιθύμητη πρωτεόλυση του προϊόντος θα επηρεάσει την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας παραγωγής. Για να αποτραπεί η πρωτεολυτική διάσπαση της πρωτεΐνης-στόχου, συχνά δημιουργείται ένα υβριδικό γονίδιο για την παραγωγή µιας πρωτεΐνης σύντηξης (fusion proteins), όπου µία φυσική πρωτεΐνη του κυττάρου-ξενιστή συντήκεται µε την αλληλουχία της πρωτεΐνης-στόχου. H διαδικασία αυτή μπορεί να επιτρέψει την έκκριση της 78

87 πρωτεΐνης στόχο, στην περίπτωση που αυτή συνδεθεί με μια πρωτεΐνη του κυττάρου που έχει τη δυνατότητα να βγει έξω από το κύτταρο. Η διαδικασία επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης πλασμιδιακού φορέα, στον οποίο το γονίδιο στόχος συντήκεται με το γονίδιο της πρωτεΐνης που μπορεί να εκκριθεί. Φυσικά, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ανάκτησης η πρωτεΐνη-στόχος θα πρέπει να ελευθερωθεί. Παράλληλα, είναι δυνατή η κατασκευή πρωτεϊνών σύντηξης, που θα διευκολύνουν την κατιούσα διαδικασία ανάκτησης παρέχοντας µια «ουρά» (π.χ. αποτελούμενη από 6 κατάλοιπα ιστιδίνης), που προσκολλάται εύκολα σε κάποιο ειδικό χρωµατογραφικό µέσο. Πρωτεΐνη σύντηξης µε «ουρά» αποτελούμενη από 6 κατάλοιπα ιστιδίνης. (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012) Μια πρωτεΐνη που δηµιουργήθηκε από ένα ριβόσωµα πρέπει συχνά να υποβληθεί σε περαιτέρω επεξεργασία για να αναδιπλωθεί σωστά και να αποκτήσει τη βιολογική της λειτουργία. Σε άλλες περιπτώσεις, διάφορες πολυπεπτιδικές αλυσίδες πρέπει να συνδεθούν για να σχηματίζουν ένα συγκεκριµένο ένζυµο ή µια δοµική πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες που έχουν διπλωθεί µε λάθος τρόπο, συσσωµατώνονται και δηµιουργούν αδιάλυτα µόρια (έγκλειστα). Για παράδειγμα, υψηλά επίπεδα έκφρασης ξένων πρωτεϊνών στο Ε. coli οδηγούν στην παραγωγή εγκλείστων. Αυτό αυξάνει σε µέγιστο βαθµό την πολυπλοκότητα ανάκτησης της πρωτεΐνης-στόχου με τη σωστή 79

88 διαμόρφωση, καθώς θα πρέπει να χρησιµοποιηθούν in vitro µέθοδοι (όπως θα δούμε στη συνέχεια). Η ορθή αναδίπλωση των πρωτεϊνών υποβοηθιέται με τη συμμετοχή µιας σηµαντικής κατηγορίας πρωτεϊνών (chaperones) που βοηθούν στο κατάλληλο δίπλωµα των πεπτιδίων. Το επίπεδο των πρωτεϊνών αυτών σε ένα κύτταρο αυξάνεται, αντιδρώντας σε μεταβολή των περιβαλλοντικών συνθηκών, όπως η υψηλή θερµοκρασία. Ο ρόλος των chaperons στη σωστή διαμόρφωση των πρωτεϊνών (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012) Το κατά πόσο µια πρωτεΐνη παραµένει ή εξέρχεται του κυττάρου έχει µεγάλη επίδραση στο σχεδιασµό της βιοδιεργασίας. Για την έκκριση των πρωτεϊνών έξω από το κύτταρο είναι απαραίτητη η παρουσία µιας σηµατοδοτικής αλληλουχίας 20 έως 25 επιπλέον αµινοξέων στο αμινοτελικό άκρο, η οποία περιλαμβάνει ένα κεντρικό πυρήνα από υδρόφοβα αμινοξέα, τα οποία περιβάλλονται από υδρόφιλα αμινοξέα. Αυτή η αλληλουχία αφαιρείται κατά τη διάρκεια της έκκρισης διαμέσου της μεμβράνης. Όταν είναι επιθυμητό η πρωτεΐνη-στόχος να εκκρίνεται στον εξωκυτταρικό χώρο, τότε η αλληλουχία σήματος είναι απαραίτητη και θα πρέπει να ενσωματωθεί, εάν δεν υπάρχει, στο κλωνοποιημένο γονίδιο. Σε άλλες περιπτώσεις μπορεί να είναι επιθυμητό οι πρωτεΐνες να παραμείνουν στο εσωτερικό του κυττάρου. 80

89 Έκκριση των πρωτεϊνών έξω από το κύτταρο (Clark & Pazdernik Biotechnology, Elsevier 2012) Στα προκαρυωτικά κύτταρα, η έκκριση πρωτεϊνών γίνεται µέσω της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης. Στο Ε. coli και τα περισσότερα κατά Gram-αρνητικά βακτήρια, η εξωτερική µεµβράνη δεν επιτρέπει την έκκριση πρωτεϊνών στον εξωκυτταρικό χώρο, ακόμη και στην περίπτωση που η πρωτεΐνη διαθέτει την αλληλουχία σήματος. Στην περίπτωση αυτή, οι πρωτεΐνες κατευθύνονται στο χώρο μεταξύ της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και του κυτταρικού τοιχώματος (περιπλασματικός χώρος), όπου συχνά υδρολύονται από πρωτεάσες. Στα κατά Gramθετικά βακτήρια (που δεν διαθέτουν εξωτερική μεμβράνη), αλλά και σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η αλληλουχία σήματος κατευθύνει τις πρωτεΐνες που πρόκειται να εκκριθούν να διαπερνούν εύκολα το κυτταρικό τοίχωµα και να φθάνουν στον εξωκυτταρικό χώρο. 81

90 Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, οι πρωτεΐνες απελευθερώνονται µέσα από διαδικασίες που περιλαµβάνουν εξωκύτωση, όπου κυστίδια µεταφοράς συγχωνεύονται µε την κυτταρική µεµβράνη και απελευθερώνουν το περιεχόµενό τους. Τα κυστίδια µεταφοράς µεσολαβούν στη µεταφορά πρωτεϊνών και άλλων χηµικών ουσιών από το ενδοπλασµατικό δίκτυο στο σύµπλεγµα Golgi και έπειτα συγχωνεύονται µε την κυτταρική µεµβράνη. Τα κυστίδια αυτά σχηματίζονται από µια µεµβράνη και εσωκλείουν ένα υδατικό διάλυµα συγκεκριµένων πρωτεϊνών, λιπιδίων, ή άλλων συστατικών. Είναι δυνατό να πραγµατοποιηθούν και άλλες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών, ιδιαίτερα στα ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα, οι οποίες περιλαµβάνουν το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών, και την προσθήκη συστατικών εκτός από αµινοξέα, όπως σακχάρων μέσω αντιδράσεων γλυκοζυλίωσης, λιπιδίων, και φωσφορικών ομάδων μέσω αντιδράσεων φωσφορυλίωσης. Αυτές οι τροποποιήσεις µπορεί να είναι αρκετά σύνθετες και είναι σηµαντικές για την επιλογή ξενιστών για την παραγωγή πρωτεϊνών, όπως θα δούμε στη συνέχεια. Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις σε ευκαρυωτικά κύτταρα 82 Μια ιδιαίτερα σηµαντική πλευρά της µετα-µεταγραφικής διεργασίας είναι η Ν συνδεδεµένη γλυκοζυλίωση. Αυτός ο τύπος γλυκοζυλίωσης µπορεί να

91 χρησιµεύσει για να κατευθύνει µια πρωτεΐνη σε ένα συγκεκριµένο διαµέρισµα ή να ελέγξει την αποικοδόµηση και την αφαίρεσή της από τον οργανισµό. Μια πρωτεΐνη µπορεί να είναι µη αποτελεσµατική, εάν η Ν συνδεδεµένη γλυκοζυλίωση δεν είναι συµβατή µε το ανοσοποιητικό σύστηµα του ανθρώπου, καθώς η πρωτεΐνη µπορεί να µη φθάσει στον ιστό στόχο ή µπορεί να απομακρυνθεί από το σώµα πριν ασκήσει την επιθυµητή δράση της. Η διεργασία της Ν συνδεδεµένης γλυκοζυλίωσης εµφανίζεται µόνο στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, η χρήση προκαρυωτικών κυττάρων ως ξενιστών για την έκφραση ανθρώπινων θεραπευτικών πρωτεϊνών περιορίζεται σε εκείνες τις πρωτεΐνες, όπου η Ν συνδεδεµένη γλυκοζυλίωση δεν είναι παρούσα ή ση- µαντική. Γενικά, το κόστος παραγωγής του τελικού προϊόντος έχει μεγάλη σημασία, ιδιαίτερα στην περίπτωση όπου είναι διαθέσιμα εναλλακτικά προϊόντα από φυσικές πηγές. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ακόµα και όταν ένα κύτταρο τροποποιεί κατάλληλα τη δοµή µιας πρωτεΐνης, πρέπει να γίνουν πρόσθετα βήµατα κυτταρικής επεξεργασίας για να παραχθεί µια χρήσιµη πρωτεΐνη. Είναι εύλογο ότι, οι περιορισμοί στην παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων μπορεί να ποικίλλουν ανάλογα με την κατηγορία προϊόντων. Οι περιορισμοί αυτοί καθορίζουν την επιλογή των τεχνικών και των στρατηγικών που θα ακολουθηθούν, καθώς και την επιλογή του συστήματος ξενιστή-φορέα. Διάφορα συστήματα μετασχηματισμού και κλωνοποίησης έχουν αναπτυχθεί ή ερευνώνται για διάφορους μικροοργανισμούς που χρησιμοποιούνται σε διάφορες βιοτεχνολογικές εφαρμογές, όπως στα βακτήρια Ε. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Sreptomyces και στους ζυμομύκητες S. cerevisiae και S. pombe και τους μύκητες Aspergillus, Neurospora, Fusarium κ.ά.. Η κλωνοποίηση ενός γονιδίου δεν πιστοποιεί την έκφρασή του, ούτε η έκφραση ενός γονιδίου σε έναν άλλο οργανισμό, πέραν αυτού που το εκφράζει φυσιολογικά στη φύση, πιστοποιεί ότι η πρωτεΐνη που θα προκύψει θα είναι και λειτουργική. Για το λόγο αυτό, πολλά είναι τα σημεία που πρέπει να ελεγχθούν προκειμένου να επιβεβαιωθεί η παραγωγή και η βιολογική δραστικότητα ενός τέτοιου προϊόντος σε εμπορική κλίμακα. Για παράδειγμα, ο φορέας έκφρασης καθορίζει τον τρόπο κλωνοποίησης και έκφρασης ενός γονιδίου, καθώς και την ποσότητα και ποιότητα του παραγόμενου προϊόντος. Σε κάποιες περιπτώσεις δεν είναι δυνατή η χρησιμοποίηση ενός βακτηρίου για την παραγωγή ενός βιολογικά δραστικού προϊόντος ή ενός προϊόντος για φαρμακευτική χρήση. Σε τέτοιες περιπτώσεις, 83

92 επιλέγονται ανώτεροι οργανισμοί, όπως έντομα ή θηλαστικά, για την παραγωγή του συγκεκριμένου προϊόντος, όπως θα δούμε στη συνέχεια Γενετική Μηχανική των Ανώτερων Οργανισμών Η άμεση γενετική μηχανική των ανώτερων οργανισμών μπορεί να είναι πολύ δυσχερέστερη εξαιτίας της έλλειψης αποτελεσματικών τεχνικών για να εισαχθεί το ξένο DNA, καθώς και της ελλιπούς κατανόησης της γενετικής των κυττάρων ξενιστών. Η εισαγωγή των νέων γονιδίων σε φυτικά και ζωικά κύτταρα επιτυγχάνεται κυρίως με δύο τρόπους: α) με άμεση μεταφορά γονιδίων απευθείας μεταφορά DNA στον πυρήνα β) με έμμεση μεταφορά γονιδίων μέσω ενός βιολογικού φορέα Άμεση μεταφορά γονιδίων Χημικά επαγόμενος μετασχηματισμός: To DNA προσλαμβάνεται άμεσα από πρωτοπλάστες παρουσία διαλύματος υψηλής οσμωτικής συγκέντρωσης. Ουσίες όπως η πολυαιθυλική γλυκόλη (PEG), παρουσία ασβεστίου και υψηλού ph, προωθούν τη μεταφορά DNA από το διάλυμα στο εσωτερικό των πρωτοπλαστών, προκαλώντας παροδικά ανοίγματα στις κυτταρικές μεμβράνες. Η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για τη μεταφορά και σταθερή ενσωμάτωση εξωγενούς DNA στο γονιδίωμα αρκετών φυτών. Μέθοδος βομβαρδισμού με μικροβλήματα (microprojectiles): Η διαδικασία για το μετασχηματισμό των φυτών συνίσταται στην επικάλυψη μικρών (διαμέτρου 1 μm) βλημάτων (π.χ. βολφραμίου) και στην εκτόξευσή τους στα κύτταρα με υψηλή ταχύτητα. Τα αποτελέσματα αυτής της προσέγγισης είναι εντυπωσιακά και η τεχνική αυτή είναι αρκετά διαδεδομένη (Σχήμα 3.4). 84

93 Σχήμα 3.4 Μέθοδος βομβαρδισμού με μικροβλήματα (Γονιδιακό πιστόλι) J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα Μια άλλη αρκετά διαδεδομένη προσέγγιση είναι η ηλεκτροδιάτρηση, που περιλαμβάνει συνοπτικά μια σύντομη ηλεκτρική αποφόρτιση υψηλής τάσης, που κάνει τα κύτταρα διαπερατά στο DΝΑ (Σχήμα 3.5). Η ηλεκτροδιάτρηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ζωικά, φυτικά, ή και μικροβιακά κύτταρα. Ο σχηματισμός πρωτοπλαστών, αν και δεν είναι απαραίτητος, μπορεί να ενισχύσει τη μεταμόλυνση. Πρωτοπλάστης καλείται το κύτταρο, στο οποίο έχει μετακινηθεί ο εξωτερικός κυτταρικός φάκελος και έχει παραμείνει μόνο η κυτταροπλασματική μεμβράνη. 85

94 Σχήμα 3.5 Η μέθοδος της ηλεκτροδιάτρησης. J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers J.A. Witkowski, Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα Μικροέγχυση του DNA (microinjection): Το DNA εισάγεται κατευθείαν στον πυρήνα των κυττάρων μέσω λεπτών γυάλινων βελονών. Το άκρο της γυάλινης μικροπιπέτας έχει μικρή διάμετρο, που επιτρέπει τη διείσδυσή της μέσω της πλασματικής μεμβράνης στο κυτταρόπλασμα, χωρίς να καταστρέφει το κύτταρο. Η επιτυχία της μικροέγχυσης εξαρτάται από τον εντοπισμό και προσανατολισμό του πυρήνα, ώστε το ξένο DNA να εγχέεται απευθείας στον πυρήνα, καθώς και από τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Στη διαδικασία αυτή απαραίτητη είναι η ακινητοποίηση των κυττάρων. Σήμερα η μέθοδος ελέγχεται από Η/Υ και έτσι μπορεί να γίνει ένεση εκατοντάδων κυττάρων σε μικρό χρονικό διάστημα. 86

95 Εισαγωγή γενετικού υλικού με μικροένεση Η χημικά ή ηλεκτρικά διαμεσολαβούμενη σύντηξη πρωτοπλαστών είναι μια άλλη τεχνική για τη μεταφορά της γενετικής πληροφορίας από το ένα κύτταρο στο άλλο. Οι προσεγγίσεις αυτές είναι ιδιαίτερα χρήσιμες σε μερικούς μύκητες, για τους οποίους έχουν προσδιορισθεί ελάχιστα έως καθόλου πλασμίδια. Η σύντηξη πρωτοπλαστών μπορεί να γίνει ανάμεσα σε είδη και να οδηγήσει στη δημιουργία σταθερών υβριδίων με επιθυμητές ιδιότητες, που θα οφείλονται στον ανασυνδυασμό δύο γονιδιωμάτων ή εξωχρωμοσωμικών τμημάτων του DΝΑ. Η έμμεση μεταφορά γονιδίων Το βακτήριο Agrobacterium tumefaciens, το οποίο ζει στο έδαφος, διαθέτει τη φυσική ικανότητα να μολύνει φυτικά κύτταρα μεταφέροντας σε αυτά ένα πλασμίδιο που ονομάζεται Ti (Ti = tumor inducing factor). Το πλασμίδιο ενσωματώνεται στο γενετικό υλικό των φυτικών κυττάρων και δημιουργεί εξογκώματα (όγκους) στο σώμα των φυτών (Σχήμα 3.6). Οι ερευνητές, αφού απομόνωσαν το πλασμίδιο από το βακτήριο κατόρθωσαν να απενεργοποιήσουν τα γονίδια που δημιουργούν τους όγκους τοποθετώντας στο πλασμίδιο το γονίδιο που θα προσδώσει στο φυτό μια επιθυμητή ιδιότητα. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο εισάγεται σε φυτικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε ειδικές καλλιέργειες στο εργαστήριο. Τα τροποποιημένα αυτά φυτικά κύτταρα τελικά δίνουν ένα νέο φυτικό οργανισμό, που περιέχει και εκφράζει το ξένο γονίδιο. Τα διαγονιδιακά φυτά που δημιουργούνται έχουν την ικανότητα να μεταβιβάζουν τις νέες ιδιότητες στους απογόνους τους. Το βακτήριο Agrobacterium tumefaciens χρησιμοποιήθηκε, αρχικά, για να τροποποιηθούν γενετικά φυτά που ανήκουν στα δικοτυλήδονα, όπως ο καπνός και τα εσπεριδοειδή. Σήμερα, χρησιμοποιείται και για την τροποποίηση φυτών, όπως τα δημητριακά και το ρύζι, καθώς και στις τομάτες, τις πατάτες, κ.ά. 87

96 \ Σχήμα 3.6 Σχηματισμός όγκων (κάλων) Οι όγκοι επάγονται από το πλασμίδιο Ti του βακτηρίου. Μέρος του DNA του Ti ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του φυτικού κυττάρου. Για τα περισσότερα ζωικά κύτταρα, ο γενετικός χειρισμός μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση ιικών φορέων γενετικού υλικού. Για παράδειγμα, σε σύστημα κυττάρων εντόμων ένας βακιλοϊός μπορεί να τροποποιηθεί έτσι, ώστε να θέσει ένα επιθυμητό γονίδιο υπό τον έλεγχο ενός πολύ ισχυρού υποκινητή, εις βάρος ενός γονιδιακού προϊόντος, που δεν είναι σημαντικό για την αντιγραφή του ιού στην κυτταροκαλλιέργεια. Οι φυτικοί ιοί αποτελούν τη δεύτερη κατηγορία φορέων μεταφοράς γονιδίων στα φυτά. Δυο κατηγορίες DNA ιών που μολύνουν τα ανώτερα φυτά είναι οι: Caulimoviruses και οι Geminiviruses. Οι ιοί αυτοί εμφανίζουν μικρό γονιδίωμα, εύκολη μόλυνση του φυτού, επέκταση της μόλυνσης σε όλο το φυτό και άλλα, που τους καθιστούν ενδιαφέροντα συστήματα κλωνοποίησης για τη μεταφορά ξένων γονιδίων στα φυτά. Τα εξωγενή γονίδια εισάγονται στο DNA του ιού και μεταφέρονται στα φυτικά κύτταρα, όπου και εκφράζονται. Έχει αποδειχθεί, όμως, ότι το νέο χαρακτηριστικό των γενετικά τροποποιημένων φυτών δεν κληρονομείται στους απογόνους και γι αυτό οι φυτικοί ιοί χρησιμοποιούνται μόνο σε εξειδικευμένες εφαρμογές της γενετικής μηχανικής. 88

97 Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, ανεξάρτητα από την τεχνική που χρησιμοποιείται, η μοίρα του μεταφερθέντος DNA ξενιστή δεν μπορεί πάντοτε να προβλεφθεί, καθώς μπορεί να υποστεί διάσπαση από νουκλεάσες, ενώ στα ζωικά ή φυτικά κύτταρα δεν φτάνει πάντοτε στον πυρήνα ή δεν ενσωματώνεται με τον ορθό τρόπο. Για το λόγο αυτό, είναι απαραίτητη η εφαρμογή μεθόδων επιλογής (selection methods) για τον εντοπισμό των κυττάρων, στα οποία έχει εισαχθεί αποτελεσματικά το γονίδιο. Τέτοιες μεθόδους επιλογής θα συζητήσουμε στην επόμενη παράγραφο. 3.5 Επιλογή ανασυνδυασμένων κλώνων H επιλογή των κυττάρων που φέρουν το γονίδιο-στόχο μπορεί να γίνει: Α) Μέσω γενετικών μεθόδων. Οι περισσότεροι φορείς περιέχουν επιλεγμένους δείκτες, όπως ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ή γονίδια που είναι υπεύθυνα για αυξητικούς παράγοντες και έχουν απομακρυνθεί με μετάλλαξη από τα κύτταρα-ξενιστές. Στην τελευταία περίπτωση, η ανάπτυξη σε ελάχιστο θρεπτικό υλικό καλλιέργειας είναι δυνατή μόνο παρουσία του πλασμιδίου. Οι επιλεγμένοι δείκτες επιτρέπουν την απομόνωση γενετικών κλώνων που έχουν μετασχηματισθεί με επιτυχία. Β) Με την τεχνική που βασίζεται στον in situ υβριδισμό νουκλεϊκών οξέων. Στην περίπτωση αυτή, γίνεται σάρωση μιας βιβλιοθήκης γονιδίων, που στεγάζονται σε αποικίες βακτηρίων ή φάγων, για τον εντοπισμό του επιθυμητού κλώνου με ιχνηθέτη (ανιχνευτή) νουκλεϊκό οξύ. Ένας ανιχνευτής μπορεί να συντεθεί χημικά, ώστε να είναι συμπληρωματικός σε ένα τμήμα του γονιδίου. Ο ανιχνευτής είναι συνήθως πολύ μικρότερος του γονιδίου, αλλά επαρκώς μεγάλος ώστε είναι απίθανο για άλλα γονίδια να υπάρξει η ίδια συμπληρωματική αλληλουχία DΝΑ. Η κατασκευή του ιχνηθέτη απαιτεί κάποια γνώση, είτε της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του επιθυμητού γονιδίου, είτε μιας μερικής αλληλουχίας αμινοξέων του επιθυμητού γονιδίου. Μια τέτοια διαδικασία περιλαμβάνει τη μεταφορά αποικιών σε χαρτί νιτροκυτταρίνη ή μεμβράνη, όπου λύονται (Σχήμα 3.7). Μετά τη λύση, το DΝΑ διαχέεται έξω και προσδένεται σε χαρτί φίλτρου. Το χαρτί είναι πλημμυρισμένο με τον ραδιενεργά επισημασμένο ιχνηθέτη. Ο ιχνηθέτης δεσμεύει μόνο το DΝΑ με συμπληρωματική αλληλουχία (υβριδίωση) και η περίσσεια ιχνηθέτη ξεπλένεται. Εάν το φίλτρο (ή η μεμβράνη) καλυφθεί με το φιλμ των ακτίνων Χ, η ραδιενέργεια θα 89

98 εκτεθεί στο φιλμ (ορατή ως μαύρο σημείο), προσδιορίζοντας ποιες αποικίες είχαν το δότη-dνα. Η διαδικασία αυτή προσδιορίζει τις αποικίες που έχουν μετασχηματιστεί με το επιθυμητό DΝΑ. Σχήμα 3.7 In situ υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski, Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα Γ) Με βάση το προϊόν έκφρασης του γονιδίου. H προσέγγιση αυτή προϋποθέτει την έκφραση του γονιδίου. Χρησιμοποιείται ένας πρωτεϊνικός ιχνηθέτης (ραδιενεργό αντίσωμα ή άλλο πρόσδεμα (ligand)) για την ανίχνευση πρωτεΐνης που έχει παραχθεί από συγκεκριμένο κλώνο. Επίσης, τα αντισώματα στην πρωτεΐνηστόχο, όταν σημαίνονται με ένα ραδιενεργό ή φθορίζον σήμα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιορίσουν τις αποικίες που εκφράζουν την πρωτεΐνηστόχο (Σχήμα 3.8). 90

99 Σχήμα 3.8 Σάρωση μιας βιβλιοθήκης cdna με τη χρήση ενός επισημασμένου αντισώματος Δ) Μια άλλη προσέγγιση στην εξερεύνηση μιας βιβλιοθήκης γονιδίων, για να βρεθούν γονίδια που εκφράζουν πρωτεΐνες με συγκεκριμένες λειτουργίες, είναι η χρήση των τεχνολογιών έκθεσης. Οι πιο συνηθισμένες είναι οι εκθέσεις μέσω φάγων και μέσω βακτηρίων. Για παράδειγμα, ένας βακτηριοφάγος ή ένα βακτήριο μπορεί να εκθέσει στην επιφάνειά του πρωτεΐνες, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια που προέρχονται από τη βιβλιοθήκη. Κάθε κύτταρο μπορεί να εκθέσει, στην καλύτερη περίπτωση, μερικά μόνο από αυτά τα γονιδιακά προϊόντα. Ένα παράδειγμα 91

100 χρησιμοποίησης ενός τέτοιου συστήματος είναι η απομόνωση ενός κυττάρου, που παράγει ένα γονιδιακό προϊόν, που θα δεθεί σε ένα ιδιαίτερο μόριο (πρόσδεμα). Το πρόσδεμα μπορεί να δεθεί σε μια επιφάνεια και μόνο εκείνα τα κύτταρα που εκφράζουν μία πρωτεΐνη στην επιφάνεια τους, η οποία δένεται με αυτό το πρόσδεμα, μπορούν να «κολλήσουν» στην επιφάνεια. Αυτά τα κύτταρα, που κολλούν, μπορούν να ανακτηθούν, να πολλαπλασιασθούν και να κάνουν περισσότερα αντίγραφα του γονιδίου και της πρωτεΐνης (Σχήμα 3.9). Σχήμα 3.9 Διαλογή με βάση τον φαινότυπο. Η επιλογή γίνεται με βάση την εξειδικευμένη σύνδεση της συνδεδεμένης στη μεμβράνη πρωτεΐνης σε εξειδικευμένο πρόσδεμα 3.6 Η επιλογή του συστήματος ξενιστή-φορέα Η επιτυχία μιας διαδικασίας παραγωγής ετερόλογων βιοτεχνολογικών προϊόντων (δηλ. προϊόντων που παράγονται με τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA) εξαρτάται συχνά από την επιλογή του ξενιστή οργανισμού και του συστήματος έκφρασης. Τα συστήματα έκφρασης μπορεί να είναι τόσο προκαρυωτικά, όσο και ευκαρυωτικά κύτταρα. Η επιλογή του κατάλληλου συστήματος έκφρασης απαιτεί να λάβουμε υπόψη διάφορους παράγοντες, όπως το ποσό της επιθυμητής πρωτεΐνης που δύναται να παραχθεί, τη δομή της, τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (φωσφορυλίωση, γλυκοζυλίωση) που δύναται να υποστεί, την κατά το δυνατό πιο οικονομική παραγωγή της. Ως εκ τούτου, δεν υπάρχει ένα σύστημα έκφρασης για κάθε χρήση. 92

101 Στον πίνακα 3.4 συνοψίζονται τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των συνηθισμένων συστημάτων ξενιστών που χρησιμοποιούνται στη Βιοτεχνολογία για την παραγωγή πρωτεϊνών. Ιδιαίτερη σημασία για την αποτελεσματική παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης έχει η ανάγκη, ή όχι, για μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στο μόριο της. Εάν οι τροποποιήσεις αυτές είναι απαραίτητες, τότε πρέπει να επιλεχθεί ένα ζωικό σύστημα κυττάρων ξενιστών. Εάν απαιτούνται κάποιες απλές μετα-μεταφραστικές επεξεργασίες (π.χ. μερικές μορφές γλυκοζυλίωσης), τότε μπορεί ως ξενιστής να χρησιμοποιηθεί ζύμη ή μύκητας. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, το κατά πόσον οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις είναι απαραίτητες για την αποτελεσματική δράση μιας θεραπευτικής πρωτεΐνης, δεν μπορεί πάντοτε να προβλεφθεί με βεβαιότητα, και στην περίπτωση αυτή είναι απαραίτητες οι κλινικές δοκιμές. Ιδιαίτερη σημασία για τα προϊόντα που χρησιμοποιούνται σε τρόφιμα αποτελεί ο χαρακτηρισμός των οργανισμών που θα χρησιμοποιηθούν ως ξενιστές ως ασφαλείς (Generally Regarded As Safe, οργανισμοί GRAS), όπως για παράδειγμα μερικές ζύμες (π.χ. S. cerevisiae). Πίνακας 3.4. Χαρακτηριστικά γνωρίσματα των συνηθισμένων συστημάτων ξενιστών. Χαρακτηριστικά Ταχύτητα ανάπτυξης Διαθεσιμότητα γενετικών συστημάτων Επίπεδα έκφρασης Aνάπτυξη σε μέσα χαμηλού κόστους ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ Ε. coli S. cerevisiae P. pastoris Έντομο Θηλαστικό /0 +/ /+ ++/ /++ ++/ Πρωτεϊνική αναδίπλωση Απλή γλυκοζυλίωση Σύνθετη γλυκοζυλίωση Απέκκριση ή έκκριση + ++/+ ++/+ ++++/ Όχι Ναι Ναι Ναι Ναι Όχι Όχι Όχι Ναι Ναι εξαιρετική, +++ πολύ καλή, ++ καλή, + μέτρια, 0 ανεπαρκής 93

102 Βακτήρια ως ξενιστές Η έκφραση των ετερόλογων πρωτεϊνών στα βακτήρια είναι ευρέως διαδεδομένη σε εργαστηριακή και βιομηχανική κλίμακα, όπως για κυτοκίνες, αντισώματα, ιικά αντιγόνα. Τα βακτήρια έχουν μικρό κόστος καλλιέργειας και μπορούν εύκολα να τροποποιηθούν γενετικά. Μπορούν ταχύτατα να φθάσουν σε πολύ μεγάλες συγκεντρώσεις και να εκφράσουν υψηλά επίπεδα ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις, η μεγάλη παραγωγή συνοδεύεται από μικρή ποιότητα. Συχνά, η πρωτεΐνη που ενδιαφέρει δεν έχει τη σωστή στερεοχημική διαμόρφωση, οπότε και απαιτούνται επιπλέον διεργασίες προκειμένου να καταστεί λειτουργική. Σε αντίθεση με τα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα προκαρυωτικά κύτταρα δεν μπορούν να πραγματοποιήσουν μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (π.χ. Ν- ή Ο- γλυκοζυλίωση), οι οποίες πολλές φορές είναι απαραίτητες για τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Ωστόσο, μπορούν να πραγματοποιήσουν πλήθος άλλων βιοχημικών τροποποιήσεων, όπως η ακετυλίωση, αμινοποίηση, απαμινοποίηση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, κ.ά. Σχήμα 3.10 Συγκριτική παρουσίαση συστημάτων έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών 94

103 Στις περιπτώσεις όπου οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις δεν είναι αναγκαίες, ο συχνότερα επιλεγόμενος ξενιστής είναι το Ε. coli. Η επιλογή αυτή οφείλεται κυρίως στο εύρος των γνώσεων της φυσιολογίας και της γενετικής σχετικά με τον οργανισμό αυτό. Οι σχετικά υψηλοί ρυθμοί ανάπτυξης για το Ε. coli και η δυνατότητα ανάπτυξής του σε υψηλές κυτταρικές συγκεντρώσεις (>50 g ξηρών κυττάρων ανά λίτρο καλλιέργειας), καθώς και το ότι το Ε. coli μπορεί να αναπτυχθεί σε απλά και φθηνά θρεπτικά υλικά, κατέστησαν το βακτήριο αυτό δημοφιλές. Παρ όλα τα σημαντικά πλεονεκτήματα που προαναφέρθηκαν, το Ε. coli δεν είναι ο καλύτερος ξενιστής. Τα σημαντικότερα προβλήματα προκύπτουν από το ότι το Ε. coli κανονικά δεν εκκρίνει τις πρωτεΐνες. Όταν οι πρωτεΐνες είναι ενδοκυτταρικές και παράγονται σε υψηλά επίπεδα, η ποσότητα της διαλυτής ενεργού πρωτεΐνης είναι συνήθως περιορισμένη εξαιτίας είτε της πρωτεολυτικής αποδόμησής της, είτε της μη διαλυτότητάς της στα κυτταρικά έγκλειστα. Η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων της ξένης πρωτεΐνης μπορεί να προκαλέσει μια απόκριση θερμικού σοκ. Μια τέτοια απόκριση του ρεγουλονίου θερμικού σοκ σχετίζεται με αυξημένη πρωτεολυτική δράση. Σε μερικές περιπτώσεις, η ενδοκυτταρική πρωτεολυτική δράση οδηγεί στην αποικοδόμηση του πρωτεϊνικού προϊόντος με ρυθμό σχεδόν ίσο με το ρυθμό παραγωγής του. 95

104 Σχηματισμός εγκλείστων σωματίων Πολλές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, κυρίως αυτές που παράγονται σε υψηλά επίπεδα, δεν μπορούν να αποκτήσουν την τρισδιάσταση δομή τους εντός των κυττάρων, αλλά αυτή την αποκτούν εντός των εγκλείστων σωματίων, τα οποία τα βλέπουμε συχνά στα βακτήρια που εκφράζουν πρωτεΐνες θηλαστικών. Η πρωτεΐνη μπορεί στην συνέχεια να απομακρυνθεί από το έγκλειστο σωμάτιο, είτε πολύ εύκολα όταν έχει την επιθυμητή τρισδιάστατη μορφή της, είτε πολύ δύσκολα όταν δεν έχει διαμορφωθεί πλήρως, οπότε και απομακρύνεται από το έγκλειστο σωμάτιο μόνο σε υψηλά αποδιατακτικές συνθήκες (Σχήμα 3.11.). Το μέγεθος, η κατάσταση και το πλήθος των εγκλείστων σωματίων εξαρτώνται από τα χαρακτηριστικά της ίδιας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, αλλά και την φυσιολογία του κυττάρου (θερμοκρασία, μέσο ανάπτυξης μικροοργανισμού, ρυθμό ανάπτυξής του). Σε άλλες πάλι περιπτώσεις, αλλάζοντας τις συνθήκες καλλιέργειας μπορούμε να εμποδίσουμε το σχηματισμό του εγκλείστου σωματίου. Σχήμα Ανάκτηση πρωτεϊνών από έγκλειστα. 1. Μετά την λύση των κυττάρων, τα έγκλειστα συλλέγονται με φυγοκέντρηση, πλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα για να απομακρυνθούν τα διαλυτά κυτταρικά συστατικά και στη συνέχεια διαλύονται σε διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης σε κάποιον αποδιατακτικό παράγοντα (6-8Μ ουρίας ή 5-6M υδροχλωρικής γουανιδίνης). 2. Στην περίπτωση όπου η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη περιέχει υπολείμματα κυστεϊνών, προστίθεται ένα ρυθμιστικό σύστημα που αποτελείται από μίγμα ανηγμένο και οξειδωμένο γλουταθείο (GSH/GSSC) σε ασθενές αλκαλικό περιβάλλον. Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη αφήνεται να αναδιπλωθεί (σχηματίζοντας τους ορθούς δισουλφιδικούς δεσμούς) με αργή απομάκρυνση του αποδιατακτικού παράγοντα (π.χ. με διαπίδυση) 3. Σε πολλές περιπτώσεις, η χρήση προσθέτων (όπως η αργινίνη) βελτιώνουν την απόδοση της αναδίπλωσης της πρωτεΐνης. 96 Ο σχηματισμός των εγκλείστων σωματίων μπορεί να οδηγήσει σε: α) παραγωγή μη δραστικών πρωτεϊνών, β) παραγωγή λιγότερης πρωτεΐνης, γ)

105 προβλήματα αναφορικά με την απομόνωση και καθαρισμό της επιθυμητής πρωτεΐνης. Σε ορισμένες όμως περιπτώσεις, ο σχηματισμός των εγκλείστων σωματίων μπορεί να αποτελεί πλεονέκτημα, καθώς το έγκλειστο σωμάτιο περιέχει σχετικά καθαρή την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος και αδιάλυτη κάτω από ήπιες συνθήκες απομόνωσής της. Για το λόγο αυτό, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί το συγκεκριμένο πλεονέκτημα για την απομόνωση της πρωτεΐνης σε αδιάλυτη μορφή και κατόπιν να επιτραπεί στην πρωτεΐνη να αποκτήσει την πλήρη διαμόρφωσή της σε συνθήκες, που ταυτόχρονα ευνοούν και την βιολογική της δραστικότητα. Εάν τα έγκλειστα αυτά ανακτηθούν από την καλλιέργεια, τότε μπορούν να επαναδιαλυτοποιηθούν και η δραστικότητα (και η αξία) της πρωτεΐνης να αποκατασταθεί. Η επαναδιαλυτοποίηση μπορεί να παρουσιάζει διαφορετικό βαθμό δυσκολίας από πρωτεΐνη σε πρωτεΐνη. Όταν η επαναδιαλυτοποίηση είναι απλή και οι ανακτήσεις υψηλές, ο σχηματισμός των εγκλείστων μπορεί να αποτελεί πλεονέκτημα, δεδομένου ότι απλοποιεί τα αρχικά στάδια της ανάκτησης και του καθαρισμού. Κατά τη διάρκεια της επαναδιαλυτοποίησης είναι σημαντικό η πρωτεΐνη να ελέγχεται με διάφορες αναλυτικές μεθόδους, για να εξασφαλισθεί ότι καμία χημική τροποποίηση δεν έχει συμβεί. Επιπλέον, οι μικρές αλλαγές σε μια πλευρική ομάδα μπορούν να αλλάξουν την αποτελεσματικότητα του προϊόντος. Ένα επιπλέον πρόβλημα αποτελεί το γεγονός ότι, το ενδοκυτταρικό περιβάλλον του Ε. coli είναι δυνατόν να μην επιτρέψει το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών, απαραίτητων για την διαμόρφωση της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών. Πολλοί από τους περιορισμούς στο Ε. coli μπορούν να παρακαμφθούν με την πρωτεϊνική έκκριση και απέκκριση. Έκκριση ονομάζουμε εδώ τη δυνατότητα μετακίνησης μιας πρωτεΐνης κατά μήκος της εσωτερικής μεμβράνης του Ε. coli. Απέκκριση ορίζεται η απελευθέρωση της πρωτεΐνης στον εξωκυτταρικό χώρο. Περίπου το 20% της συνολικής πρωτεΐνης στο Ε. coli μεταφέρεται κατά μήκος της εσωτερικής μεμβράνης στον περιπλασματικό χώρο, ή ενσωματώνεται στην εξωτερική μεμβράνη. Η παρουσία μίας αλληλουχίας-σήματος είναι ένας απαραίτητος (αλλά μη επαρκής) όρος για την έκκριση. Η αλληλουχία-σήμα συνδέεται με την ώριμη πρωτεΐνη και διασπάται κατά τη διάρκεια της έκκρισης, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Η εξωκυτταρική απελευθέρωση πρωτεϊνών-στόχων συνοδεύεται από σημαντικά πλεονεκτήματα, καθώς απλοποιούνται οι διαδικασίες ανάκτησης και καθαρισμού των πρωτεϊνών. Κανονικά, το Ε. coli δεν εκκρίνει την πρωτεΐνη, όμως 97

106 αναπτύσσονται διάφορες στρατηγικές, ώστε ο περιορισμός αυτός να αρθεί. Οι στρατηγικές αυτές περιλαμβάνουν συνήθως την προσπάθεια, είτε να καταστραφεί η δομή της εξωτερικής μεμβράνης, είτε να επιτευχθεί η σύντηξη της πρωτεΐνης-στόχου με συστήματα έκκρισης άλλων πρωτεϊνών. Η έκκριση χωρίς τη λύση κυττάρων μπορεί να απλοποιήσει την ανάκτηση και τον καθαρισμό. Η έλλειψη καθιερωμένων συστημάτων έκκρισης στο Ε. coli έχει στρέψει το ενδιαφέρον σε εναλλακτικά συστήματα έκφρασης. Το θετικό κατά Gram βακτήριο Bacillus subtilis είναι η καλύτερα μελετημένη βακτηριακή εναλλακτική λύση σε σχέση με το Ε. coli. Δεδομένου ότι είναι ένα βακτήριο θετικό κατά Gram, δεν υπάρχει καμία εξωτερική μεμβράνη, γεγονός που το καθιστά αποτελεσματικό σύστημα για την έκκριση των πρωτεϊνών. Εντούτοις, το Β. subtilis έχει διάφορα προβλήματα που εμποδίζουν την εμπορική αξιοποίησή του. Βασικό πρόβλημα αποτελεί το γεγονός ότι το Β. subtilis παράγει μεγάλη ποσότητα και μια ποικιλία πρωτεασών, οι οποίες μπορούν να αποικοδομήσουν το προϊόν πολύ γρήγορα. Μεταλλάγματα με μειωμένη δραστικότητα των πρωτεασών διατίθενται, αλλά ακόμη και αυτά συχνά χαρακτηρίζονται από σημαντικές ποσότητες πρωτεασών. Το Β. subtilis είναι επίσης δυσκολότερο σε γενετικούς χειρισμούς απ ότι το Ε. coli, εξαιτίας της περιορισμένης ποικιλίας φορέων και υποκινητών. Επίσης, η γενετική αστάθεια των πλασμιδίων είναι περισσότερο προβληματική στο Β. subtilis απ ότι στο Ε. coli. Τέλος, τα υψηλά επίπεδα έκκρισης, που έχουν παρατηρηθεί με τις εγγενείς πρωτεΐνες του Β. subtilis, δεν είναι ακόμα δυνατά με τις ετερόλογες πρωτεΐνες. Κάποια άλλα θετικά κατά Gram βακτήρια που έχουν θεωρηθεί ως ξενιστές περιλαμβάνουν τους Streptococcus cremoris και είδη Streptomyces. Και τα αρνητικά κατά Gram και τα θετικά κατά Gram βακτήρια παρουσιάζουν περιορισμούς στην επεξεργασία πρωτεϊνών, οι οποίοι μπορούν να παρακαμφθούν με τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Κατώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα ως ξενιστές Ζύμες Οι ζύμες χρησιμοποιούνται ευρέως, καθώς έχουν μελετηθεί σε βάθος σε γενετικό/ μοριακό επίπεδο, γεγονός που καθιστά πλεονεκτική τη χρήση τους ως συστήματα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Καθώς είναι μονοκύτταροι οργανισμοί, διατηρούν τα πλεονεκτήματα των βακτηρίων (χαμηλό κόστος καλλιέργειας, υψηλός ρυθμός αναπαραγωγής, εύκολος χειρισμός τους σε γενετικό 98

107 επίπεδο, μεγάλη ικανότητα παραγωγής ετερόλογων πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα) σε συνδυασμό με τα πλεονεκτήματα των ευκαρυωτικών οργανισμών (μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις). Για την έκφραση των ετερόλογων πρωτεϊνών, κατά κύριο λόγο χρησιμοποιείται η ζύμη Saccharomyces cerevisae, ωστόσο πλήθος άλλων ζυμών έχουν χρησιμοποιηθεί τα τελευταία χρόνια, όπως η Hansenula polymorpha, Candida boidinii, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Yarrowia lipolytica. Όπως στα βακτήρια, η έκφραση των πρωτεϊνών στις ζύμες βασίζεται στο επίσωμα ή στα άθικτα πολλαπλά αντίγραφα των πλασμιδίων, των οποίων η γονιδιακή έκφραση είναι αυστηρά ελεγχόμενη. Πέραν όμως αυτών των πλεονεκτημάτων, οι εκφραζόμενες πρωτεΐνες δεν είναι ελεύθερες και πρέπει να πραγματοποιηθούν κατάλληλες επεξεργασίες, ώστε να ελευθερωθούν από τα κυστίδια μέσα στα οποία βρίσκονται. Η μετα-μεταφραστική τροποποίηση στις ζύμες είναι διαφορετική από αυτή που πραγματοποιείται στα κύτταρα των θηλαστικών, γεγονός που τις καθιστά μη κατάλληλες προς χρήση, όταν πολύπλοκες αντιδράσεις γλυκοζυλίωσης είναι απαραίτητες, ώστε η πρωτεΐνη να καταστεί λειτουργική. Η ζύμη Saccharomyces cerevisiae έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς στα τρόφιμα και τις βιομηχανικές ζυμώσεις και συγκαταλέγεται μεταξύ των πρώτων οργανισμών, που έχουν χρησιμοποιηθεί από τον άνθρωπο. Η ζύμη βρίσκεται βεβαίως στον κατάλογο GRAS, γεγονός που επισημαίνει την καταλληλότητα της ζύμης για την παραγωγή πρωτεϊνών σχετικών με τρόφιμα. Η ζύμη μπορεί να αναπτυχθεί με σχετικά υψηλό ρυθμό ανάπτυξης και σε υψηλές πυκνότητες κυττάρων. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της χρήσης της ζύμης ως ξενιστή αποτελεί η ικανότητά της να γλυκοζυλιώνει τις πρωτεΐνες και να τις εκκρίνει. Εντούτοις, ο S. cerevisiae τείνει να υπεργλυκοζυλιώνει τις πρωτεΐνες, προσθέτοντας πολλές μονάδες μανόζης στο πρωτεϊνικό μόριο, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην αδρανοποίησή τους. Κύριο πρόβλημα για την εφαρμογή της ζύμης ως ξενιστή αποτελεί το γεγονός ότι, δεν μπορούν να επιτευχθούν υψηλά επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης όπως στο Ε. coli. Παράλληλα, στη ζύμη S. cerevisiae η ικανότητα έκκρισης είναι περιορισμένη, γεγονός που μπορεί να δυσχεραίνει την παραγωγή εκκρινόμενων πρωτεϊνών, ακόμα και όταν επιτυγχάνονται υψηλά επίπεδα έκφρασης. Συνοπτικά, οι περιορισμοί στη χρήση του S. cerevisiae συνίστανται στη δυσκολία επίτευξης υψηλών επιπέδων πρωτεϊνικής έκφρασης, στην υπεργλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών και της μη ικανοποιητικής έκκρισης. 99

108 Οι ζύμες Pichia pastoris και Hansenula polymorpha, που μπορούν να αναπτυχθούν σε μεθανόλη ως ενεργειακή πηγή άνθρακα, χαρακτηρίζονται ως ελκυστικοί ξενιστές για μερικές πρωτεΐνες. Η μεθανόλη αποτελεί παράλληλα τον επαγωγέα για τον υποκινητή ΑΟΧ 1, ο οποίος χρησιμοποιείται συνήθως για να ελέγξει την έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου. Οι ζύμες αυτές αναπτύσσονται δίνοντας πολύ υψηλές πυκνότητες κυττάρων (π.χ. έως 100 g/ί), ενώ τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων πρωτεϊνών είναι υψηλά. Παράλληλα, η αναδίπλωση του πρωτεϊνικού μορίου και η έκκριση είναι συχνά καλύτερες απ' ότι στο Ε. coli. Οι ζύμες αυτές κάνουν απλές γλυκοζυλιώσεις πρωτεϊνών, ενώ οι υπεργλυκοζυλιώσεις είναι λιγότερο πιθανές από ότι με το S. cerevisiae. Τα κύρια μειονεκτήματα των ζυμών αυτών σχετίζονται με την υψηλή πυκνότητα κυττάρων, αλλά και με το ρυθμό του μεταβολισμού, ο οποίος δημιουργεί υψηλά επίπεδα μεταβολικής θερμότητας που πρέπει να απομακρύνεται, καθώς και υψηλές απαιτήσεις σε οξυγόνο. Το γεγονός αυτό αποτελεί μειονέκτημα για την ανάπτυξη της διεργασίας σε μεγάλους βιοαντιδραστήρες, όπου η παροχή σε οξυγόνο και η απομάκρυνση της θερμότητας επιτυγχάνονται δυσκολότερα. Παράλληλα, η αποτελεσματική επαγωγή έκφρασης απαιτεί πολύ καλό έλεγχο της διεργασίας, λόγω της διπλής δράσης της μεθανόλης ως υποστρώματος ανάπτυξης και ως επαγωγέα. Επίσης, το γεγονός ότι η μεθανόλη είναι εύφλεκτη προϋποθέτει ιδιαίτερη προσοχή στον χειρισμό της. Οι μύκητες, όπως οι Aspergilus nidulans και Trichoderma reesei, μπορούν επίσης να είναι ξενιστές για ορισμένες πρωτεΐνες, καθώς χαρακτηρίζονται από σχετικά αυξημένη ικανότητα για την έκκριση πρωτεϊνών. Θα πρέπει να τονισθεί ότι στην περίπτωση όπου απαιτούνται πολύπλοκες γλυκοζυλιώσεις και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, όλα τα συστήματα των κατώτερων ευκαρυωτικών που προαναφέρθηκαν δεν είναι κατάλληλα και για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ιστοκαλλιέργειες ζωικών κυττάρων. Μαστιγοφόροι μύκητες Οι μαστιγοφόροι μύκητες έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στις μελέτες της δομής, λειτουργίας και κυτταρικής διαφοροποίησης των ευκαρυωτικών οργανισμών. Επιπλέον, οι μύκητες που ανήκουν στο γένος Aspergillus και Penicillium είναι πολύ σημαντικοί στη βιοτεχνολογία λόγω των πολλών εφαρμογών τους στην παρασκευή πολλών τροφίμων και στην ιδιότητά τους να εκκρίνουν ένζυμα που διασπούν ποικίλα 100

109 βιοπολυμερή, να παράγουν πρωτογενείς (οργανικά οξέα) και δευτερογενείς (αντιβιοτικά, βιταμίνες) μεταβολίτες. Ως εκ τούτου, οι μύκητες χρησιμοποιούνται για την έκφραση τόσο δικών τους πρωτεϊνών, όσο και πρωτεϊνών θηλαστικών, σε βιομηχανική κλίμακα. Ωστόσο, η έκφραση ετερόλογων πρωτεϊνών στους μύκητες Aspergillus και Trichoderma είναι πολύ μικρή σε σχέση με αυτή των ομόλογών τους πρωτεϊνών. Προκειμένου να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί στην έκφραση των ετερόλογων πρωτεϊνών, η ετερόλογη πρωτεΐνη κλωνοποιείται εντός του 3 - άκρου μίας υψηλά εκφραζόμενης ομόλογης πρωτεΐνης, όπως της γλυκοαμυλάσης. Παρόλα αυτά, διάφοροι περιορισμοί πρέπει να ξεπεραστούν, όπως η σωστή στερεοχημική διαμόρφωση της ετερόλογης πρωτεΐνης, η μετα-μεταφραστική τροποποίησή της, η ενδοκυττάρια μεταφορά και έκκρισή της, προκειμένου να καταστεί λειτουργική. Ζωικά κύτταρα ως ξενιστές Σε πολλές περιπτώσεις, η ετερόλογη πρωτεΐνη ως βιοτεχνολογικό προϊόν θα πρέπει να είναι όσο πιο κοντά γίνεται στη φυσική πρωτεΐνη, τόσο όσο αφορά την αλληλουχία των αμινοξέων, όσο και τις απαραίτητες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούνται κύτταρα θηλαστικών, αν και σε ορισμένες περιπτώσεις, τα κύτταρα θηλαστικών σε μια καλλιέργεια μπορεί να μην κάνουν τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις με τον ίδιο τρόπο που τις κάνει το ίδιο κύτταρο στον ζωντανό οργανισμό. Διάφορες κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί ως ξενιστές για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών. Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενες είναι οι σειρές κυττάρων CHO (κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ). Τα κύτταρα των θηλαστικών είναι κατάλληλα, όταν απαιτούνται μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις (Ν- και Ο-γλυκοζυλίωση, σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών) για τη σωστή λειτουργία των εκφραζόμενων πρωτεϊνών. Παρ όλο το υψηλό κόστος, τη χαμηλή παραγωγικότητα, τη μη σταθερότητα έκφρασης, το μεγάλο χρόνο που απαιτείται για την παραγωγή, πλήθος σημαντικών πρωτεϊνών, όπως κυτοκίνες, αντισώματα, ένζυμα, ιικά αντιγόνα και αιμοποιητικοί παράγοντες, παράγονται σε αυτού του είδους τα κύτταρα λόγω της υψηλής ποιότητάς τους. Σημαντικό μειονέκτημα της χρησιμοποίησης κυττάρων θηλαστικών σχετίζεται τόσο με το υψηλό κόστος της διεργασίας, όσο και με το γεγονός ότι τα ζωικά κύτταρα διαιρούνται μερικές μόνο φορές (θνησιγενείς κυτταρικές σειρές). Βέβαια, μερικά κύτταρα είναι αθάνατα ή συνεχή και μπορούν να διαιρούνται συνεχώς, ακριβώς όπως ένα βακτήριο. Οι συνεχείς σειρές κυττάρων είναι 101

110 μετασχηματισμένα κύτταρα, όπως τα καρκινικά κύτταρα (δηλ. έχουν χάσει την αναστολή της κυτταρικής αντιγραφής). Θεωρητικά, η θνησιμότητα των κυττάρων θα μπορούσε να αντιμετωπιστεί με τη χορήγηση μια ουσίας που μπορεί να καταστήσει τα κύτταρα καρκινικά. Η προσέγγιση όμως αυτή απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή και μέριμνα, τόσο στην ασφάλεια των εργαζομένων, όσο και στη διαδικασία καθαρισμού του προϊόντος (καθώς θα πρέπει να αποκλειστούν τα νουκλεϊκά οξέα από το προϊόν). Επιπρόσθετα, οι φορείς που χρησιμοποιούνται συνήθως στις καλλιέργειες κυττάρων θηλαστικών προέρχονται από ιούς ανώτερων θηλαστικών, γεγονός που εγείρει επιφυλάξεις για τη χρησιμοποίησή τους, καθώς θα μπορούσαν να είναι παθογόνοι για τον άνθρωπο. Οι περισσότεροι από αυτούς τους φορείς δεν μπορούν να δώσουν υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης-στόχου σε κοινά κύτταρα ξενιστών (συνήθως <5% της συνολικής πρωτεΐνης). Πάντως, υψηλότερα επίπεδα έκφρασης (π.χ. >100 mg/1 της εκκρινόμενης, ενεργής πρωτεΐνης) μπορεί να ληφθούν μέσω της ενίσχυσης του αριθμού αντιγράφων των γονιδίων. Μπορεί να περάσουν μέχρι και έξι μήνες με μια κυτταρική σειρά CHO για να επιτευχθεί σταθερή έκφραση υψηλού επιπέδου. Βέβαια, σε κάθε περίπτωση, η αύξηση της κλίμακας της καλλιέργειας των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε μεταβολή των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων και σε γενικότερη μεταβολή της ποιότητας της πρωτεΐνης. Κύτταρα εντόμων Για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών σε μικρή (<100 l) ή σε εργαστηριακή κλίμακα χρησιμοποιείται το σύστημα κύτταρο εντόμου-βακιλοϊού. Το σύστημα αυτό διαθέτει επίσης τον κυτταρικό μηχανισμό για να κάνει όλες σχεδόν τις πολύπλοκες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που κάνουν και τα κύτταρα των θηλαστικών. Οι ανασυνδυασμένοι βακιλοϊοί χρησιμοποιούνται ευρέως ως φορείς για την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα εντόμων, όπως ανοσοσφαιρινών, ιικών αντιγόνων, και μεταγραφικών παραγόντων. Τα ανασυνδυασμένα γονίδια συχνά εκφράζονται υπό τον έλεγχο της πολυεδρίνης ή του p10 πρωαγωγέα του γονιδίου AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) σε καλλιεργούμενα κύτταρα εντόμων Spodoptera frugiperda ή σε λάβρες του είδους Lepidopteran, τα οποία έχουν επιμολυνθεί με ανασυνδυασμένους βακιλοϊούς, που φέρουν το γονίδιο ενδιαφέροντος. Η πολυεδρίνη και τα p10 γονίδια διαθέτουν αυστηρό έλεγχο μεταγραφής από τους προαγωγείς τους και μεταγράφονται σε μεγάλο βαθμό κατά τα 102

111 τελικά στάδια του ιικού κύκλου. Συνήθως, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες λαμβάνονται σε διαλυτή μορφή από τα επιμολυσμένα κύτταρα των εντόμων στοχεύοντας στην κατάλληλη υποκυτταρική δομή έκφρασής τους. Τα κύτταρα των εντόμων διαθέτουν πολλές ομοιότητες σε διεργασίες μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, μεταφοράς και λειτουργίας με τα ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα, αν και η δυνατότητα γλυκοζυλίωσης που διαθέτουν είναι περιορισμένη και επιπλέον δεν μπορούν να προσθέσουν στις πρωτεΐνες σύνθετους ολιγοσακχαρίτες. Το σύστημα εντόμου-βακιλοϊού χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα έκφρασης, ενώ θεωρείται σημαντικά πιο ασφαλές σύστημα σε σχέση με τα συστήματα θηλαστικών-ρετροϊών. Αν και υπάρχουν όλοι οι απαραίτητοι μηχανισμοί μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, κάποιες τουλάχιστον από τις πρωτεΐνες, που παράγονται από το σύστημα κύτταρο εντόμου-βακιλοϊού, δεν σχηματίζονται πανομοιότυπα με τις φυσικές πρωτεΐνες. Σε μερικές περιπτώσεις, οι μικρές παραλλαγές τους μπορούν να είναι ευεργετικές (π.χ. αυξανόμενη αντιγονική απάντηση στην ανάπτυξη ενός εμβολίου του AIDS), ενώ άλλες μπορούν να είναι ανεπιθύμητες. Dictyostelium discoideum Πρόσφατα, ο μονοκύτταρος οργανισμός Dictyostelium discoideum έχει αναδειχθεί σε ένα χρήσιμο ευκαρυωτικό σύστημα για την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και ενζύμων. Το πλεονέκτημά του έγκειται στο γεγονός ότι διαθέτει την ικανότητα μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων (φωσφορυλίωσης, ακετυλίωσης, γλυκοζυλίωσης) ανάλογων αυτών που παρατηρούνται στους ανώτερους εξελικτικά ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Πρόκειται για έναν απλό οργανισμό με απλοειδές γονιδίωμα της τάξεως των 5x10 7 bp και κυτταρικό κύκλο που εναλλάσσεται μεταξύ μονοκύτταρων και πολυκύτταρων σταδίων. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εκφράζονται από εξωχρωμοσωμικά πλασμίδια (ο Dictyostelium discoideum είναι από τους λίγους ευκαρυωτικούς οργανισμούς που έχει κυκλικό πυρηνικό πλασμίδιο). Τα πυρηνικά πλασμίδια υπόκεινται εύκολα σε χειρισμούς γενετικής τροποποίησης και επιπλέον απομονώνονται πολύ εύκολα. Αυτός ο οργανισμός είναι ιδανικός για την έκφραση σύνθετων γλυκοπρωτεϊνών. Αν και διαθέτει το πλεονέκτημα των βακτηρίων σχετικά με το χαμηλό κόστος καλλιέργειας και τα πλεονεκτήματα των κυττάρων των θηλαστικών δηλ. της σταθερής κυτταρικής σειράς και της δυνατότητας 103

112 γλυκοσυλίωσης των πρωτεϊνών, ο μικρός ρυθμός αναπαραγωγής του σε σχέση με τα βακτήρια καθιστά τη χρήση του μη χρηστική σε βιομηχανική κλίμακα. Πρωτόζωα του γένους τρυπανόσωμα Αποτελούν νέα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Πολλές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η γλυκοσυλίωση μοιάζουν με αυτές των ανώτερων εξελικτικά ευκαρυωτικών οργανισμών. Διαθέτουν υψηλό ρυθμό διπλασιασμού οπότε και μπορούν να αναπαραχθούν ταχύτατα σε σχετικά φθηνό θρεπτικό μέσο. Το ανασυνδυασμένο γονίδιο εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα. Αυτά τα πρωτόζωα δεν είναι παθογόνα για τον άνθρωπο και έτσι έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για την έκφραση πολύ σημαντικών πρωτεϊνών για τον άνθρωπο όπως της ερυθροποιητίνης, της ιντερφερόνης-γ, και της ιντερλευκίνης ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Η συνθετική Βιολογία (Synthetic Βiology) είναι ένας ραγδαία αναπτυσσόμενος επιστημονικός κλάδος της Βιοτεχνολογίας, που στοχεύει στο σχεδιασμό βιολογικών συστημάτων, τα οποία θα επιδεικνύουν λειτουργίες που δεν υπάρχουν στη φύση με στόχο την παρασκευή νέων προϊόντων και την ανάπτυξη υπηρεσιών για τον άνθρωπο. Η προσέγγιση αυτή αφορά σε όλα τα επίπεδα της ιεραρχίας των βιολογικών συστημάτων (από απλά βιομόρια σε ολόκληρα κύτταρα, ιστούς ή οργανισμούς) Το 2010 ερευνητές ανακοίνωσαν ότι δημιούργησαν το πρώτο τεχνητό κύτταρο στο εργαστήριο, την επονομαζόμενη Synthia που αποτελεί σταθμό στη Συνθετική Βιολογία. Ουσιαστικώς οι επιστήμονες συνέθεσαν ολόκληρο το «γενετικό λογισμικό» ενός βακτηρίου και το μεταμόσχευσαν σε ένα άλλο βακτήριο. Ο νέος οργανισμός που δημιουργήθηκε διαθέτει μια τεχνητή εκδοχή του DNA ενός υπάρχοντος βακτηρίου Mycoplasma mycoides -, το οποίο προκαλεί μαστίτιδα στις αίγες. Το τεχνητό γονιδίωμα που προέκυψε (το οποίο αποτελούνταν περίπου από 1 εκατομμύριο ζεύγη βάσεων) εισήχθη σε ένα άλλο βακτήριο-λήπτη, του είδους Mycoplasma capricolum, από το οποίο προηγουμένως είχε αφαιρεθεί το γενετικό υλικό. Το βακτήριο λήπτης «διάβασε» αμέσως τις οδηγίες και μετατράπηκε στο είδος που καθόριζε το συνθετικό DNA. Ο οργανισμός που προέκυψε πολλαπλασιάστηκε 104

113 μάλιστα για περισσότερες από ένα δισεκατομμύριο φορές, παράγοντας αντίγραφα που έφεραν το τεχνητό DNA. Καθώς ο επόμενος στόχος των ερευνητών θα είναι πιθανά η δημιουργία πολυκύτταρων οργανισμών, πολλές επιφυλάξεις και φόβοι διατυπώνονται για την επίπτωση που μπορεί να υπάρχει στο περιβάλλον η απελευθέρωση τέτοιων συνθετικών οργανισμών. Ενδεικτικά, ορισμένοι στόχοι της εφαρμογής συνθετικών μικροοργανισμών είναι οι παρακάτω: 1. Ταχύτατη παραγωγή εμβολίων, τα οποία θα παράγονται από συνθετικούς μικροοργανισμούς 2. Μεταφορά τεχνητών βακτηρίων εντός του οργανισμού για θεραπεία ασθενειών, όπως ασθένειες που οφείλονται σε ανισορροπία του βακτηριακού πληθυσμού στον οργανισμό 3. Δοκιμή της δράσης περισσότερων νέων φαρμάκων στο εργαστήριο με τη βοήθεια συνθετικών οργανισμών 4. Δημιουργία καυσίμων-παραγωγή βιοκαυσίμων με χρήση φυκών τα οποία με βάση τη φωτοσύνθεση θα παράγουν λιπαρά οξέα τα οποία θα μετατρέπονται σε βιοντήζελ. Παράλληλα, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας τα φύκη θα απομακρύνουν το CO2 από την ατμόσφαιρα 5. Καθαρισμός πετρελαιοκηλίδων και μεγάλων εστιών ρύπανσης. Αποφυγή μόλυνσης υδροφόρου ορίζοντα με συνθετικούς οργανισμούς που θα δρουν ως βιοφράγματα 6. Καθαρισμός του νερού με τεχνητά μικρόβια 7. Αποφυγή της καταστροφής δασών με σκοπό τη μετατροπή τους σε φυτείες ενεργειακών φυτών 8. Ανάπτυξη νέων βελτιωμένων τροφίμων, π.χ. παραγωγή λιπιδίων μέσω της φωτοσύνθεσης από συνθετικούς οργανισμούς 3. 8 ΜΕΤΑΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ H μεταγονιδιωματική ανάλυση είναι ένα νέο εργαλείο της Βιοτεχνολογίας, όπου οι δυνατότητες που προσφέρει η γονιδιωματική ανάλυση (η ανάλυση όλου του DNA ενός οργανισμού) εφαρμόζονται σε ολόκληρες βιοκοινότητες μικροβίων παρακάμπτοντας την ανάγκη για απομόνωση και καλλιέργεια μεμονωμένων ειδών. Το συνθετικό μετα- προσδίδει την έννοια της υπέρβασης. Η προσέγγιση και οι μέθοδοι της μεταγονιδιωματικής υπερβαίνουν μεμονωμένα γονίδια και γονιδιώματα 105

114 και επιτρέπουν στους επιστήμονες να μελετήσουν όλα τα γονιδιώματα μίας βιοκοινότητας μικροβίων ως σύνολο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η τεράστια πλειονότητα του μικροβιακού κόσμου δεν ήταν μέχρι τώρα προσβάσιμη στην επιστήμη, επειδή δεν είναι δυνατή η καλλιέργεια παρά μόνο ενός πολύ μικρού ποσοστού (<1%) από τα εκατομμύρια είδη μικροβίων που εκτιμάται ότι υπάρχουν στη γη. Ενώ τα εργαλεία της κλασικής μικροβιολογίας και της γονιδιωματικής βασίζονται πρωτίστως στην απομόνωση μεμονωμένων ειδών μικροβίων σε αμιγείς καλλιέργειες που περιέχουν μικρόβια ενός και μόνο συγκεκριμένου είδους, η μεταγονιδιωματική υπερβαίνει τους περιορισμούς αυτούς καθώς παρέχει στους επιστήμονες πρόσβαση στο γονιδίωμα μίας βιοκοινότητας μικροβίων χωρίς τη χρήση αμιγών καλλιεργειών. Η μεθοδολογία που ακολουθείται σε γενικές γραμμές έχει ως εξής: Λαμβάνεται ένα δείγμα από ένα συγκεκριμένο περιβάλλον (όπως το έδαφος, το θαλασσινό νερό ή το ανθρώπινο στόμα) και ακολουθεί μαζική εξαγωγή DNA από όλα τα μικρόβια του δείγματος. (Η ανάλυση μπορεί να περιλαμβάνει εξαγωγή πρωτεϊνών ή RNA). Τα περισσότερα προγράμματα μεταγονιδιωματικής αυτή τη στιγμή επικεντρώνονται στα μικρόβια με τη μικρότερη ποσότητα DNA, όπως τα βακτήρια και τα αρχαία. Αφού γίνει εξαγωγή DNA από ένα δείγμα, ακολουθεί πρόσληψη και αντιγραφή του DNA. Δημιουργείται έτσι μία «βιβλιοθήκη» που περιέχει τμήματα των γονιδιωμάτων όλων των μικροβίων του δείγματος. (Οι νέες τεχνολογίες αλληλούχησης επιτρέπουν την αλληλούχηση του DNA άμεσα από το δείγμα, κάτι που βελτιώνει την όλη διαδικασία, καθώς παρακάμπτεται η δημιουργία βιβλιοθήκης). Η μεταγονιδιωματική βιβλιοθήκη δεν είναι όμως ξεκάθαρα οργανωμένη σε τόμους που περιέχουν το γονιδίωμα ενός είδους ο καθένας. Αντιθέτως, αποτελείται από εκατομμύρια τυχαία τμήματα DNA που προέρχονται από όλα τα μικρόβια της βιοκοινότητας του δείγματος. Έχοντας πλέον στα χέρια τους μία βιβλιοθήκη γονιδιωμάτων, ή ένα μεταγονιδίωμα, οι επιστήμονες το χρησιμοποιούν ανάλογα με το τι θέλουν να ανακαλύψουν. 106

115 Σχήμα 3.12 Η πορεία της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης Στη μεταγονιδιωματική ανάλυση με βάση την αλληλούχηση DNA (μεταγονιδιωματική αλληλούχηση), οι ερευνητές προσπαθούν να βρουν ολόκληρη τη γενετική αλληλουχία. Στη συνέχεια, η αλληλουχία μπορεί να αναλυθεί με πολλούς διαφορετικούς τρόπους. Για παράδειγμα, οι ερευνητές μπορούν να χρησιμοποιήσουν την αλληλουχία μίας βιοκοινότητας για να προσδιορίσουν το πλήρες γονιδίωμα ενός μεμονωμένου είδους μικροβίου, ή μπορεί να χρησιμοποιήσουν την αλληλουχία για να αναλύσουν το γονιδίωμα της βιοκοινότητας ως σύνολο, κάτι που μπορεί να προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την οικολογία και την εξέλιξη των πληθυσμών. 107

116 Η μεταγονιδιωματική ανάλυση με βάση τη λειτουργία (λειτουργική μεταγονιδιωματική) μελετά τα προϊόντα που μπορούν να παράγουν τα μικρόβια μίας βιοκοινότητας. Μέσω της μεθόδου αυτής, μπορούν να εντοπιστούν λειτουργίες άγνωστες στον περιορισμένο αριθμό μικροβίων που μπορούν να αναπτυχθούν σε ένα εργαστήριο. Χάρη στη μέθοδο αυτή έχουν ήδη ανακαλυφθεί νέα αντιβιοτικά. Μία άλλη προσέγγιση της λειτουργικής μεταγονιδιωματικής, την οποία μπορούμε να εφαρμόσουμε χάρη στις πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις, μας επιτρέπει την άμεση εξαγωγή και ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνών (ενζύμων) και μεταβολιτών (προϊόντων κυτταρικών διαδικασιών) από μία βιοκοινότητα μικροβίων. Η προσέγγιση της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης προϋποθέτει την απόκτηση ενός καλού δείγματος από το περιβάλλον. Θα πρέπει να προσδιοριστεί ο καλύτερος τρόπος δειγματοληψίας από το περιβάλλον, ο αριθμός των δειγματοληψιών και το εάν ένα δείγμα είναι αντιπροσωπευτικό του περιβάλλοντος. Η εφαρμογή αποτελεσματικών τεχνικών εξαγωγής DNA θα μπορούσε να διασφαλίσει ότι μία μεταγονιδιωματική βιβλιοθήκη θα εκπροσωπεί με ακρίβεια το γονιδίωμα ολόκληρης της βιοκοινότητας με ελάχιστη ή καθόλου μόλυνση. Ο εντοπισμός των σπάνιων μελών μίας βιοκοινότητας μικροβίων αποτελεί πρόκληση, μπορεί δε να είναι ιδιαίτερα σημαντικός εάν παίζει σημαντικό ρόλο στη βιοκοινότητα. Η επέκταση των αναλύσεων πέρα από την αλληλουχία του DNA για τη μελέτη των πρωτεϊνών και των μεταβολιτών (των προϊόντων των κυτταρικών διαδικασιών) που παράγει μία βιοκοινότητα θα διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο για την κατανόηση του τρόπου λειτουργίας μίας συγκεκριμένης βιοκοινότητας. 108

117 4. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΖΩΙΚΩΝ KAI ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΖΩΑ ΚΑΙ ΦΥΤΑ 4.1 Ανάπτυξη ζωικών κυττάρων Τα ζωικά κύτταρα είναι κατάλληλα για παραγωγή πρωτεϊνών που απαιτούν εκτενή και ακριβή μετα-μεταφραστική επεξεργασία, οργανωμένων ιστών (τεχνητό δέρμα), ορισμένων εμβολίων και ιών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φυτοφάρμακα. Τα πρωτεϊνικά προϊόντα των ζωικών κυττάρων αποτελούνται συνήθως από πρωτεΐνες υψηλού μοριακού βάρους με ή χωρίς γλυκοζιτικές ομάδες. Διάφορα ένζυμα, ορμόνες, εμβόλια, ανοσοβιολογικά προϊόντα (μονοκλωνικά αντισώματα, λεμφοκίνες) και αντικαρκινικοί παράγοντες μπορούν να παραχθούν χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ζωικών κυτταροκαλλιεργειών (βλ. πίνακα 4.1). Πίνακας 4.1 Προϊόντα ζωικών κυτταροκαλλιεργειών. Φαρμακευτικές πρωτεΐνες Λειτουργία Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου Παράγοντας που αποτρέπει την πήξη του αίματος Ερυθροποιητίνη Αντιαναιμικός παράγοντας Παράγοντες VII, VIII, IX, X Aιμοφιλία Ιντερλευκίνη-2 Αντικαρκινική δράση, θεραπεία για HIV Μονοκλωνικά αντισώματα Θεραπευτικά και διαγνωστικά μέσα Ιντερφερόνη α, β και γ Αντικαρκινικά και αντι-ιικά μέσα Τα ζωικά κύτταρα είναι πιο σύνθετα και πιο εύθραυστα από τα κύτταρα βακτηρίων, μυκήτων και ζυμών. Τα ζωικά κύτταρα ποικίλουν, τόσο ως προς το μέγεθος (από 10 έως 30 μm), όσο και ως προς τη μορφή (σφαιρικά ή ελλειψοειδή κύτταρα). Τα τυπικά αυτά ευκαρυωτικά κύτταρα δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμα, αλλά περιβάλλονται από μια λεπτή και εύθραυστη κυτταρική μεμβράνη που αποτελείται από λίπη, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Η σύσταση της κυτταρικής μεμβράνης δεν είναι ομοιόμορφη και ποικίλει στις διάφορες περιοχές της. Η επιφάνεια των ζωικών κυττάρων είναι αρνητικά φορτισμένη, γεγονός που επιτρέπει την ανάπτυξη τους σε θετικά φορτισμένες επιφάνειες, ενώ πολλά κύτταρα διαθέτουν συγκεκριμένους 109

118 υποδοχείς στην επιφάνειά τους, γεγονός που επιτρέπει την προσκόλληση σε προσδέματα. Ο μεταβολισμός των θρεπτικών ουσιών από καλλιέργεια ζωικών κυττάρων είναι πολύ διαφορετικός από αυτόν σε άλλους τύπους κυττάρων. Ένα τυπικό θρεπτικό υλικό αύξησης μιας ζωικής κύτταροκαλλιέργειας περιέχει γλυκόζη, γλουταμίνη, μη απαραίτητα και απαραίτητα αμινοξέα, ορό (υγρό χωρίς κύτταρα που ανακτάται από το αίμα) αλόγου (ΗS), μόσχου (CS) ή εμβρύου βοοειδών (FBS) και μεταλλικά άλατα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο ορός είναι ακριβός, ενώ αυξάνει την πιθανότητα μόλυνσης και η σύνθεσή του είναι απροσδιόριστη και μεταβλητή από παρτίδα σε παρτίδα, γεγονός που περιπλέκει τις κατιούσες διεργασίες ανάκτησης πρωτεϊνικών προϊόντων. Σε πολλές περιπτώσεις, οι γνώσεις μας για τη διατροφή των κυττάρων έχουν καταστήσει εφικτή την ανάπτυξη θρεπτικών υλικών χωρίς ορό [π.χ. τροποποιημένα υλικά Eagle's (MEM), F12 (Ham s), CMRl 1066], η χρήση των οποίων αποκτά ολοένα και μεγαλύτερη σημασία. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια ζωικών κυττάρων διαφέρουν σημαντικά από εκείνες που χρησιμοποιούνται στα βακτήρια, τις ζύμες και τους μύκητες. Ιστοί που αφαιρούνται υπό συνθήκες αποστείρωσης από συγκεκριμένα όργανα ζώων, όπως ο πνεύμονας και το νεφρό, μεταφέρονται σε θρεπτικό υλικό αύξησης που περιέχει ορό και μικρά ποσά αντιβιοτικών στις μικρές Τ-φιάλες. Αυτά τα κύτταρα διαμορφώνουν μια αρχική καλλιέργεια. Αντίθετα από τα κύτταρα φυτών, τα πρωτοταγή κύτταρα θηλαστικών δεν σχηματίζουν συσσωματώματα, αλλά αυξάνονται υπό μορφή μονοστοιβάδων στις επιφάνειες στήριξης, όπως είναι οι γυάλινες επιφάνειες φιαλών. Για να αρχίσει μια καλλιέργεια ζωικών κυττάρων, οι ιστοί που αφαιρούνται τεμαχίζονται σε μικρά τεμάχια (~2 mm 3 ) και τοποθετούνται σε ανακινούμενη φιάλη που περιέχει τρυψίνη σε αραιό ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού για 120 min στους 37 o C. Το αιώρημα των κυττάρων αποστειρώνεται καθώς διέρχεται μέσω ενός αποστειρωμένου φίλτρου για τη λήψη καθαρoύ διαλύματος και τα κύτταρα πλένονται. Τα καθαρά κύτταρα επανατοποθετούνται στο θρεπτικό υλικό που περιέχεται σε Τ-φιάλες ή κυλιόμενες φιάλες. Τα κύτταρα συνήθως προσκολλώνται στις γυάλινες επιφάνειες των φιαλών και των δοχείων, σχηματίζοντας μονοστοιβάδα. Τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε αυτές τις επιφάνειες στήριξης είναι γνωστά ως κύτταρα εξαρτώμενα από προσφύσεις. Εντούτοις, μερικά κύτταρα αναπτύσσονται υπό μορφή αιωρήματος και είναι γνωστά ως κύτταρα μη εξαρτώμενα από 110

119 προσφύσεις. Η κυτταρική σειρά που λαμβάνεται από την πρωτογενή καλλιέργεια είναι γνωστή ως δευτερογενής καλλιέργεια. Τα κύτταρα θηλαστικών αναπτύσσονται στους 37 ο C και σε pη = 7.3. Οι τυπικοί χρόνοι διπλασιασμού είναι h. Οι κινητικές αύξησης των κυττάρων των θηλαστικών είναι παρόμοιες με τη μικροβιακή αύξηση. Συνήθως, η στάσιμη φάση είναι σχετικά σύντομη και η συγκέντρωση των ζωντανών κυττάρων μειώνεται αισθητά στη συνέχεια, ως αποτέλεσμα της συσσώρευσης τοξικών μεταβολικών προϊόντων, όπως του γαλακτικού οξέος και του αμμωνίου. Το υψηλό επίπεδο αμμωνίου είναι συνήθως το αποτέλεσμα του μεταβολισμού της γλουταμίνης, ενώ το γαλακτικό οξύ είναι συνήθως προϊόν του μεταβολισμού της γλυκόζης. Η συγκέντρωση κυττάρων φθάνει στη μέγιστη τιμή σε τρεις έως πέντε ημέρες. Εντούτοις, ο σχηματισμός προϊόντων, όπως μονοκλωνικά αντισώματα από κύτταρα υβριδιωμάτων, μπορεί να συνεχιστεί υπό συνθήκες μη ανάπτυξης. Τα περισσότερα από τα προϊόντα των κυτταροκαλλιεργειών θηλαστικών συνδέονται με συνθήκες μεικτής ανάπτυξης και ο σχηματισμός τους πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης και μετά σταματά. Σχήμα 4.1 Hela κύτταρα (ανθρώπινη, αθάνατη κυτταρική σειρά) που χρησιμοποιούνται στην έρευνα Οι περισσότερες από τις διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές θηλαστικών (π.χ. ανθρώπινοι ινοβλάστες, όπως οι WI- 38 και MRC-5, που έχουν εγκριθεί για χρήση στην παραγωγή ανθρώπινων εμβολίων) είναι θνητές. Αυτές οι κυτταρικές 111

120 σειρές υπόκεινται στη διαδικασία της γήρανσης. Ουσιαστικά, τα κύτταρα, για λόγους που δεν είναι εντελώς γνωστοί, θα διαιρεθούν μόνο για έναν περιορισμένο αριθμό γενεών (π.χ. περίπου 30 γενεές για τα MRC-5 κύτταρα). Τα κύτταρα που μπορούν να πολλαπλασιαστούν για αόριστο χρόνο καλούνται συνεχείς, μη θνητές ή μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές. Τα καρκινικά κύτταρα είναι φυσικώς μη θνητά. Όλες οι καρκινικές κυτταρικές σειρές μετασχηματίζονται, αν και δεν είναι σαφές εάν όλες οι μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές είναι καρκινικές. Λόγω της σύνδεσης του καρκίνου με το μετασχηματισμό κυττάρων, έχουν εκφραστεί ορισμένες επιφυλάξεις προκειμένου να λάβουν έγκριση προϊόντα που έγιναν από μετασχηματισμένα κύτταρα. Εντούτοις, τα μετασχηματισμένα κύτταρα είναι συνήθως ανεξάρτητα από προσφύσεις και μπορούν να πολλαπλασιασθούν για αόριστο χρόνο σε αιωρήματα καλλιεργειών, γεγονός ιδιαίτερα επιθυμητό για μεγάλης κλίμακας παραγωγή σε βιοαντιδραστήρες. Τα τελευταία χρόνια έχουν εγκριθεί διεργασίες που χρησιμοποιούν μη θνητά κύτταρα για την παραγωγή θεραπευτικών προϊόντων, όπως ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου. Η έγκριση τέτοιων διεργασιών έχει συμβάλει αποφασιστικά στην ανάπτυξη βιοδιεργασιών βασισμένων σε καλλιέργειες ζωικών κυττάρων σε αιώρημα. Μια άλλη σημαντική κατηγορία ζωικών κυττάρων είναι η καλλιέργεια υβριδωμάτων (Σχήμα 4.2). Τα κύτταρα υβριδωμάτων λαμβάνονται από τη σύντηξη λεμφοκυττάρων (κανονικά κύτταρα αίματος που παράγουν αντισώματα) με κύτταρα μυελωμάτων (καρκινικά). Τα λεμφοκύτταρα που παράγουν αντισώματα αυξάνονται αργά και είναι θνητά. 'Έπειτα από τη σύντηξη με τα κύτταρα μυελωμάτων, τα υβριδώματα γίνονται μη θνητά, μπορούν να αναπαραχθούν για απεριόριστο χρόνο και παράγουν αντισώματα. Χρησιμοποιώντας κύτταρα υβριδωμάτων, συγκεκριμένα μονοκλωνικά (προερχόμενα από ένα κύτταρο) αντισώματα μπορούν να παραχθούν για συγκεκριμένα αντιγόνα. 112

121 Σχήμα 4.2 Δημιουργία υβριδιώματος για την παραγωνή μονοκλωνικού αντισώματος, (α) αντιγόνο εισάγεται σε ένα ποντίκι (β) τα λεμφοκύτταρα στο ποντίκι ενεργοποιούνται για να παράγουν τα συγκεκριμένα αντισώματα στο αντιγόνο (γ) τα λεμφοκύτταρα συλλέγονται από το ποντίκι. Αυτά τα λεμφοκύτταρα αυξάνονται ανεπαρκώς σε ιστοκαλλιέργειες (δ) κύτταρα μυελωμάτων (καρκινικά κύτταρα) παράγονται αυξανόμενα σε ιστοκαλλιέργειες (ε) τα κύτταρα μυελωμάτων συντήκονται με λεμφοκύτταρα (στ) το υβριδικό κύτταρο αυξάνεται ικανοποιητικά σε ιστοκαλλιέργειες και δημιουργεί ένα ενιαίο μονοκλωνικό αντίσωμα. Οι απόγονοι καλούνται υβριδιώματα και μπορούν να πολλαπλασιάζονται συνεχώς. Σε γενικές γραμμές, η ανάπτυξη κυττάρων θηλαστικών γίνεται σε καλλιέργειες διαλείποντος έργου και ημιδιαλείποντος έργου, σε χημειοστάτη και σε καλλιέργειες διάχυσης, όπου έχουμε διαχωρισμό των κυττάρων in situ, ή τα κύτταρα διαχωρίζονται έξω από τον αντιδραστήρα (βλ. σχήμα 4.3). Στις καλλιέργειες διάχυσης, η βιομάζα συσσωρεύεται, καθώς τα κύτταρα συγκρατούνται στον 113

122 αντιδραστήρα μέσω μιας ειδικής συσκευής, ενώ νέο μέσο εισάγεται καθώς απομακρύνεται το προηγούμενο. Καλλιέργεια διαλείποντος έργου Καλλιέργεια ημιδιαλείποντος έργου Καλλιέργεια συνεχούς λειτουργίας α) β) Καλλιέργειας με α) διαχωρισμό κυττάρων in situ ή β) με εξωτερικό διαχωρισμό. Σχήμα 4.3 Μέθοδοι καλλιέργειας ζωικών κυττάρων. Τα λευκά βέλη δείχνουν τη ροή του μέσου καλλιέργειας, τα σκούρα βέλη δείχνουν τη ροή του μέσου καλλιέργειας με τη βιομάζα. Με τον τρόπο αυτό, επιτυγχάνεται πυκνότητα κυττάρων έως κύτταρα ανά ml, ενώ η συγκέντρωση του προϊόντος μπορεί να είναι μια τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρείται σε καλλιέργειες διαλείποντος έργου. 114

123 4.2 H ποιότητα και η ποσότητα των βιοτεχνολογικών προϊόντων από ζωικά κύτταρα. Ένα προϊόν που προέρχεται από καλλιέργειες ζωικών κυττάρων μπορεί να μην είναι 100% βιολογικά ενεργό, καθώς ο βαθμός ή ο τύπος γλυκοζυλίωσής του μπορεί να είναι διαφορετικός. Και οι δύο αυτοί παράγοντες εξαρτώνται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος, στο οποίο το προϊόν παράγεται. Για παράδειγμα, η κατάσταση γλυκοζυλίωσης εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, όπως ο τρόπος καλλιέργειας, η συγκέντρωση των υποστρωμάτων (γλυκόζη, αμμωνία), η διαθεσιμότητα ορμονών στο μέσο ανάπτυξης, η σύσταση του μέσου σε πρωτεΐνες και λιπίδια, το ph, η συγκέντρωση Ο2 και άλλα. Κατά συνέπεια, η απαραίτητη κατάσταση γλυκοζυλίωσης μιας φαρμακευτικής πρωτεΐνης εξαρτάται από τις συνθήκες, όπου η πρωτεΐνη αυτή παράγεται. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, όχι μόνο η ποιότητα των προϊόντων από ζωικά κύτταρα, αλλά και η παραγωγικότητα της καλλιέργειας εξαρτάται από σειρά παραγόντων που σχετίζονται με τις συνθήκες ανάπτυξης και τη σύσταση του μέσου ανάπτυξης. Ο κυριότερος παράγοντας που επιδρά στην ειδική παραγωγικότητα των ζωικών κυττάρων είναι η ταχύτητα ανάπτυξής τους. Η παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων από ζωικά κύτταρα μπορεί να είναι εξαρτώμενη ή όχι από την ανάπτυξη των κυττάρων. Το ποσό του προϊόντος που παράγεται από μια καλλιέργεια εκφράζεται ως το % ποσοστό της συνολικής πρωτεΐνης που παράγεται. Σε γενικές γραμμές, η παραγωγικότητα των ζωικών κυττάρων μπορεί να είναι στα ίδια υψηλά επίπεδα με τις μικροβιακές καλλιέργειες. Διάφορα ένζυμα, ορμόνες, εμβόλια, ανοσοβιολογικά προϊόντα (μονοκλωνικά αντισώματα, λεμφοκίνες) και αντικαρκινικοί παράγοντες μπορούν να παραχθούν χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ζωικών κυτταροκαλλιεργειών. Οι σημαντικότεροι τύποι ανοσοβιολογικών προϊόντων που παράγονται από ζωικά κύτταρα είναι (1) τα μονοκλωνικά αντισώματα, (2) οι ανοσοβιολογικοί ρυθμιστές (ιντερλευκίνες, λεμφοκίνες) και (3) τα εμβόλια ιών. Μονοκλωνικά Αντισώματα Μεταξύ των σημαντικότερων προϊόντων ζωικών κυτταροκαλλιεργειών κατατάσσονται τα μονοκλωνικά αντισώματα (ΜΑ). Αυτά παράγονται από κύτταρα υβριδιωμάτων και χρησιμοποιούνται στα διαγνωστικά συστήματα για θεραπευτικούς 115

124 λόγους και για βιολογικούς διαχωρισμούς (π.χ. χρωματογραφία συγγένειας). Τα ΜΑ έχουν χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικοί παράγοντες για να προσδιορίσουν εκατοντάδες φαρμάκων, τοξινών, βιταμινών και άλλων βιολογικών ενώσεων. Τα ΜΑ χρησιμοποιούνται επίσης στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς συγγένειας για τον καθαρισμό πρωτεϊνών. Τα ΜΑ μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως μόρια για να στοχεύσουν τοξικούς παράγοντες στους καρκινικούς όγκους. Εντούτοις, το μεγάλο μέγεθος των ΜΑ έχει περιορίσει τη δυνατότητά τους να διαπεράσουν μερικούς όγκους. Τμήματα αντισωμάτων (που παράγονται από κύτταρα μη θηλαστικών) μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντί ολοκλήρου του αντισώματος. Ανοσοβιολογικοί Ρυθμιστές Η ιντερφερόνη (αντικαρκινική γλυκοπρωτεΐνη που εκκρίνεται από ζωικά κύτταρα κατά τη διάρκεια έκθεσης σε καρκινογόνους παράγοντες) αποτελεί ένα παράδειγμα ενός ανοσορυθμιστή που παράγεται από κύτταρα θηλαστικών. Η ιντερφερόνη μπορεί να παραχθεί είτε από ζωικά κύτταρα, είτε από γενετικώς τροποποιημένα βακτήρια. Άλλοι ανοσορυθμιστές είναι οι λεμφοκίνες (ορμονικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τις ανοσοαπαντήσεις), οι ιντερλευκίνες (αντικαρκινικοί παράγοντες), ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου (μια ένωση που αποτρέπει την πήξη του αίματος) και η θυμισίνη. Εμβόλια Ιών Διάφορα εμβόλια ιών έχουν παραχθεί για χρήση στους ανθρώπους και στα ζώα. Σε κάποιες περιπτώσεις ο ζωντανός ιός διαδίδεται στα ζωικά κύτταρα. Έπειτα ο ιός συλλέγεται και αδρανοποιείται και χρησιμοποιείται ως εμβόλιο. Σε κάποιες άλλες περιπτώσεις, μια αποδυναμωμένη μορφή του ιού χρησιμοποιείται για να προκαλέσει προστατευτική απόκριση, αλλά όχι ασθένεια. Εντούτοις, τα περισσότερα υπό ανάπτυξη εμβόλια είναι εμβόλια υπομονάδων. Τυπικά, παράγεται μια πρωτεΐνη που εμφανίζεται στην επιφάνεια του μορίου του ιού. Το ανοσοποιητικό σύστημα αναγνωρίζει έναν επίτοπο ή μια μικρή περιοχή της πρωτεΐνης και προκαλείται μια προστατευτική ανοσοαπόκριση. Για επίτοπο που εκτίθεται κατάλληλα, η πρωτεΐνη μπορεί να συγκροτηθεί σε σωμάτιο όμοιο με ιό. Ένα τέτοιο σωμάτιο είναι ένα κενό καψίδιο που δεν περιέχει κανένα νουκλεϊκό οξύ. Η απουσία του DNA ή RNA του ιού αυξάνει την ασφάλεια του προϊόντος. 116

125 Ορμόνες Πρωτεϊνικές ορμόνες μπορούν να παραχθούν με τη χρησιμοποίηση κυτταροκαλλιεργειών από το όργανο που συνθέτει την ορμόνη. Προϊόντα ορμονών από ζωικά κύτταρα είναι η θυλακιοτρόπος ορμόνη, η χοριονική ορμόνη και η ερυθροποιητίνη. Ορισμένες ζωικές ορμόνες είναι σχετικά μικρά πολυπεπτίδια (20-30 αμινοξέα) και μπορούν να παραχθούν με χημική σύνθεση. Η ερυθροποιητίνη είναι ένα πολύ επιτυχημένο εμπορικά προϊόν, χρήσιμο στην αντιμετώπιση της αναιμίας σε ένα ευρύ φάσμα διαταραχών, από ασθενείς με τεχνητά νεφρά έως και όσους πάσχουν από ΑΙDS. 4.3 Ανάπτυξη φυτικών κυττάρων Το φυτικό βασίλειο χαρακτηρίζεται από μια εξαιρετική ποικιλία και δυνατότητα για την παραγωγή ενώσεων χρήσιμων στον άνθρωπο. Τα φυτικά προϊόντα αφορούν τόσο σε φαρμακευτικές ενώσεις (πάνω από το 25% των φαρμακευτικών ουσιών προέρχονται από εκχύλιση ολόκληρων φυτών), όσο και σε ενώσεις που χρησιμεύουν ως βαφές, χρωστικές και ευώδεις ουσίες στα τρόφιμα, γλυκαντικές ουσίες, αρώματα, αγροχημικά (μικροβιοκτόνα και ζιζανιοκτόνα). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι ενώσεις αυτές είναι χημικά πολύπλοκες και παράγονται συνήθως μέσω της συμπύκνωσης ενδιαμέσων που προέρχονται από διαφορετικά μεταβολικά μονοπάτια. Πρόσφατες ανακαλύψεις στη γενωμική, καθώς και η κατανόηση της μοριακής βιολογίας των φυτών καθιστούν δυνατή την παρασκευή των βιοσυνθετικών μονοπατιών των φυτικών κυττάρων με τη χρήση της γενετικής μηχανικής, τα οποία σύντομα θα μπορούμε να ανακατευθύνουμε για την παρασκευή επιθυμητών χημικών. Η βιοτεχνολογική βιομηχανία προσεγγίζει τη γενετική τροποποίηση φυτών για την παραγωγή τροφής σαν δευτερεύον θέμα, ο κυρίως στόχος είναι η παραγωγή φαρμάκων μέσω τροποποιημένων φυτών, το λεγόμενο Pharming. Οι εταιρείες θέλουν να δημιουργήσουν γενετικά τροποποιημένα φυτά που θα παράγουν φάρμακα, ανθρώπινες και ζωικές πρωτεΐνες, αγροκαύσιμα, καθώς και εξειδικευμένα χημικά και συγκεκριμένες βιομηχανικές πρώτες ύλες. Άλλες πιθανές εφαρμογές περιλαμβάνουν την παραγωγή θρεπτικών ουσιών με φαρμακευτική δράση (nutraceuticals), πρόσθετα τροφίμων, υδατάνθρακες, RNA, λιπίδια, καύσιμα, χρωστικές, βιταμίνες, αρωματικές ουσίες, εμβόλια, αντισώματα, ορμόνες και άλλα σχετικά. Η ιδέα της χρήσης φυτών 117

126 για την παραγωγή φαρμάκων είναι πολύ ενδιαφέρουσα για τη βιομηχανία για δυο λόγους: τα φυτά μπορούν να είναι πιο αποδοτικά σε σχέση με τα ζώα ή τα βακτήρια, ενώ είναι πιο εύκολο τα παραγόμενα φάρμακα να χορηγούνται δια στόματος σε ανθρώπους και ζώα. Η βασική διαφορά μεταξύ των φυτικών κυττάρων και των μικροβίων είναι η ικανότητα των κυττάρων να υφίστανται διαφοροποίηση και οργάνωση, ακόμα και μετά από εκτεταμένη καλλιέργεια στη μη διαφοροποιημένη κατάσταση. Η ικανότητα της αναγέννησης ολόκληρων φυτών από μη διαφοροποιημένα κύτταρα, υπό κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες, ονομάζεται ολοδυνητικότητα (totipotency). Αν μπορούσαμε να κάνουμε για τα ζώα ότι μπορούμε να κάνουμε για πολλά φυτά, θα μπορούσαμε με την αφαίρεση ενός ζωικού κυττάρου να δημιουργήσουμε εκατομμύρια σχεδόν ταυτόσημους κλώνους ολόκληρου του σώματος από όπου προήλθε! Τα φυτικά κύτταρα μπορεί να είναι πολύ μεγάλα, με κυτταρικές διαμέτρους της τάξης των 10 έως 100 μm. Τα κύτταρα αυτά αναπτύσσονται αργά με χρόνους διπλασιασμού που κυμαίνονται από 20 μέχρι 100 h. Η ανάπτυξή τους είναι συνήθως μη φωτοσυνθετική. Η πηγή άνθρακα και ενέργειας είναι συνήθως η σακχαρόζη ή η γλυκόζη, που τροφοδοτούνται εξωγενώς. Οι τυπικοί ρυθμοί αναπνοής αντιστοιχούν στο 5% έως 15% του ρυθμού αναπνοής του Ε. coli. Τα φυτικά κύτταρα μπορούν συχνά να καλλιεργηθούν σε πολύ υψηλές πυκνότητες, μέχρι και 70% του τελικού όγκου του αντιδραστήρα σε κύτταρα. Αν και ο ρυθμός αναπνοής τους είναι μικρός, η υψηλή κυτταρική πυκνότητα απαιτεί πολύ καλή μεταφορά οξυγόνου στον αντιδραστήρα. Τα φυτικά κύτταρα περιέχουν μεγαλύτερο ποσοστό νερού απ' ότι τα βακτηριακά κύτταρα (90% έως 95% αντί για 80%). Το υψηλό αυτό ποσοστό νερού οφείλεται, εν μέρει, στην παρουσία του κεντρικού κενοτοπίου, που μπορεί να καταλαμβάνει σε ακραίες περιπτώσεις έως και το 95% του ενδοκυτταρικού όγκου. Τα φυτικά κύτταρα έχουν την τάση να εκκρίνουν σχετικά λίγες ενώσεις, τις οποίες απομονώνουν μέσα στο κενοτόπιο. Πολλές από αυτές τις ενώσεις είναι δευτερογενείς μεταβολίτες εμπορικού ενδιαφέροντος, ενώ άλλες μπορούν επίσης να είναι κυτταροτοξικές, αν δεν απομακρυνθούν από το κυτταρόπλασμα. Για την παραγωγή ενός συγκεκριμένου χημικού από φυτικά κύτταρα, η καθιερωμένη διεργασία βασίζεται, είτε στη χρησιμοποίηση των κάλλων (callus) (φυτικός όγκος), είτε στις καλλιέργειες εναιωρήματος (suspension cultures). Ένας κάλλος 118

127 μπορεί να σχηματιστεί από οποιοδήποτε τμήμα του φυτού που περιέχει διαιρούμενα κύτταρα. Το φυτικό υλικό που προέρχεται από εκτομή τοποθετείται σε στερεοποιημένο μέσο που περιέχει θρεπτικά συστατικά και ορμόνες που προάγουν τη γρήγορη κυτταρική διαφοροποίηση. Ο κάλλος που σχηματίζεται μπορεί να είναι αρκετά μεγάλος (>1 cm) και δεν έχει οργανωμένη δομή. Διάφοροι παράγοντες φαίνεται να επιδρούν στην ικανότητα παραγωγής ενός χημικού από φυτικά κύτταρα, όπως η πηγή του αρχικού ιστού (ρίζα, βλαστός, κ.λπ.), αλλά και η φύση του φυτού, καθώς μπορεί να υπάρχει σημαντική διαφορά από φυτό σε φυτό όσον αφορά στη βιοσυνθετική τους ικανότητα. Ανάπτυξη φυτικών κυττάρων από κάλλο και με καλλιλεργεια εναιωρήματος Τόσο για τον κάλλο, όσο και για την καλλιέργεια σε εναιώρημα, χρησιμοποιείται ένα χημικά καθορισμένο μέσο. Συνήθως, οι καλλιέργειες, ιδιαίτερα οι καλλιέργειες σε εναιώρημα, διατηρούνται απουσία φωτός. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ενώ η έκθεση στο φως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη ρύθμιση της έκφρασης συγκεκριμένων μονοπατιών, το φως σπάνια χρησιμοποιείται μόνο για την υποστήριξη της ανάπτυξης, καθώς τα περισσότερα κύτταρα δεν έχουν την ικανότητα φωτοαυτότροφης ανάπτυξης. Ένα συνηθισμένο μέσο που χρησιμοποιείται ως πηγή 119

128 άνθρακα / ενέργειας είναι η σακχαρόζη. Το μέσο της ανάπτυξης περιέχει επίσης ανόργανα θρεπτικά υλικά, βιταμίνες και «ορμόνες» (ή ρυθμιστές ανάπτυξης). Οι διάφοροι τύποι των φυτικών ορμονών που αποτελούν τους αυξητικούς παράγοντες είναι οι αυξίνες, οι κυτοκινίνες και οι γιβερελίνες. Η καλλιέργεια σε εναιώρημα από κάλλο διευκολύνεται, εάν ο κάλλος είναι «εύθραυστος» (σπάει εύκολα σε μικρά κομμάτια). Ένα μέρος του κάλλου τοποθετείται σε υγρό μέσο σε μία αναδευόμενη κωνική φιάλη. Οι συνήθεις συνθήκες επώασης είναι 27 C σε pη 5.5 απουσίας φωτός. Από τον κάλλο αποβάλλονται κύτταρα ή μικρά συσσωματώματα κυττάρων. Τα αιωρούμενα κύτταρα, στη συνέχεια, αντιγράφονται και σε διάστημα δύο τριών εβδομάδων τα αιωρούμενα κύτταρα μεταφέρονται σε φρέσκο μέσο, και τα μεγάλα συσσωματώματα ή ο παραμένων κάλλος απορρίπτονται (βλ. σχήμα 4.4). Τα εναιωρήματα μπορούν να αναπτυχθούν σε υψηλές συγκεντρώσεις κυττάρων. Αν και όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες περιέχουν συσσωματώματα, είναι δυνατό να επιτευχθούν «λεπτά» αιωρήματα με το να απορρίπτονται τα μεγάλα συσσωματώματα σε κάθε διαδοχική μεταφορά. Σε κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες, τα κύτταρα σε εναιώρημα μπορεί να οδηγηθούν σε διαφοροποίηση και οργάνωση. Τα επίπεδα των θρεπτικών υλικών και των ορμονών πρέπει να προσαρμοστούν αντίστοιχα. Από συσσωματώματα κυττάρων σε εναιώρημα μπορούν να παραχθούν έμβρυα, βλαστοί και ρίζες.. Πολλές από τις διαφορές μεταξύ των καλλιεργειών φυτικών κυττάρων και μικροβίων έχουν άμεσες επιπτώσεις στο σχεδιασμό και στην κλιμάκωση συστημάτων καλλιέργειας σε εναιώρημα, όπως αυτό φαίνεται στον πίνακα 4.2. Διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη βιοδιεργασιών με τη χρήση καλλιεργειών φυτικών κυττάρων και περιλαμβάνουν βιοαντιδραστήρες καλλιεργειών σε εναιώρημα, βιοαντιδραστήρες ακινητοποιημένων κυττάρων και βιοαντιδραστήρες καλλιέργειας οργανωμένων ιστών. Στο σχήμα 4.4 παρουσιάζονται διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια φυτικών κυττάρων 120

129 Πίνακας 4.2 Διαφορές μεταξύ των καλλιεργειών φυτικών κυττάρων και μικροβίων Διαφορές Μικρότερος ρυθμός αναπνοής Μεγαλύτερη ευαισθησία στις διατμητικές τάσεις Τα κύτταρα συχνά μεγαλώνουν ως συσσωματώματα ή συμπαγής μάζα Ο βαθμός της συσσωμάτωσης μπορεί να επιδρά στο δευτερογενή μεταβολισμό Πτητικές ουσίες (π.χco2) μπορεί να είναι σημαντικές στον κυτταρικό μεταβολισμό Επιπτώσεις στο σχεδιασμό των βιοαντιδραστήρων Απαιτείται χαμηλότερος ρυθμός μεταφοράς Ο2 Χειρισμός υπό συνθήκες χαμηλής διάτμησης Περιορισμοί στη μεταφορά μάζας που εμποδίζουν τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών στα κύτταρα Μπορεί να υφίσταται ένα άριστο μέγεθος συσσωματωμάτων για την παραγωγή του προϊόντος Μπορεί να απαιτείται ψεκασμός μείγματος αερίων Σχήμα 4.4 Διάφοροι τύποι βιοαντιδραστήρων που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη φυτικών κυττάρων (αλλά και ιστών και οργάνων). Α) Μηχανικά αναδευόμενοι βιοαντιδραστήρες Β) Βιοαντιδραστήρες που αναδεύονται με την κίνηση αέρα C) Μη αναδευόμενοι βιοαντιδραστήρες. 121

130 4.7 Διαγονιδιακά Ζώα και Φυτά Διαγονιδιακά Ζώα Η διαγονιδιακή τεχνολογία έχει εφαρμοστεί και σε πλήθος ζωικών ειδών (ποντίκι, πρόβατο, χοίρο, αγελάδα, κουνέλι). Η τεχνική της μικροένεσης ήταν η πρώτη από τις τεχνικές που εφαρμόστηκαν με επιτυχία αρχικά σε ποντίκι το 1981 και στη συνέχεια και σε άλλα θηλαστικά. Το DNA που περιέχει το γονίδιο ενδιαφέροντος εισάγεται μέσα σε προπυρήνα ενός ζυγωτικού κυττάρου, ενσωματώνεται μέσα στο γονιδίωμα του κυττάρου δέκτη, οπότε και το ξένο γενετικό υλικό μεταφέρεται από γενιά σε γενιά (Σχήμα 4.5). Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν δύο άλλες τεχνικές όπως η μεταφορά γονιδίων μέσω ρετροϊών και η μεταφορά γονιδίων μέσω αρχέγονων εμβρυικών κυττάρων. Οι εφαρμογές της διαγένεσης στα ζώα αφορά: 1. Στη δημιουργία μοντέλων από ζώα για τη μελέτη ασθενειών και την ανάπτυξη νέων θεραπειών. Η πρόβλεψη διαγονιδιακών φαινοτύπων παρέχει τη δυνατότητα για τον έλεγχο διαγνωστικών και θεραπευτικών μεθόδων. Η δυνατότητα απαλοιφής γονιδίων επιτρέπει την εμφάνιση επιθυμητού φαινοτύπου και τη χρήση του διαγονιδιακού στελέχους ως μοντέλο για την μελέτη παθολογικών καταστάσεων. 2. Στη βελτίωση της ποιότητα των ζωικών προϊόντων π.χ. στη γενετική παρέμβαση στο γάλα, κρέας και αυγά, στην τροποποίηση των ρυθμών αύξησης και άλλων φυσιολογικών διεργασιών, στη βελτίωση της ποιότητας μαλλιού στην αυξημένη αναπαραγωγική απόδοση αλλά και στην αύξηση της ανθεκτικότητας σε ασθένειες. 3. Στην παραγωγή χρήσιμων για τον άνθρωπο προϊόντων π. χ πρωτεϊνών, ενζύμων, ορμονών αυξητικών παραγόντων Καθώς ορισμένες πολύπλοκες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις δεν μπορούν να πραγματοποιηθούν σε κυτταροκαλλιέργειες, εξετάστηκε η περίπτωση να αντιμετωπιστεί το πρόβλημα αυτό με τη χρησιμοποίηση διαγονιδιακών ζώων. Ο σχεδιασμός στην περίπτωση των διαγονιδιακών ζώων γίνεται έτσι, ώστε η πρωτεΐνη να εκκρίνεται στο γάλα ή τα ούρα του ζώου. Με την προσέγγιση αυτή είναι δυνατή η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων σύνθετων πρωτεϊνών, αν και σε ορισμένες περιπτώσεις δεν πραγματοποιούνται όλα τα σύνθετα μετα-μεταφραστικά βήματα. Η ετερόλογη πρωτεΐνη μπορεί να συνδυαστεί να παράγεται ταυτόχρονα με μία άλλη που εκκρίνεται στο γάλα, οπότε κατά αυτόν τον τρόπο μπορεί εύκολα να συλλεχθεί και να 122

131 απομονωθεί. Οι ανθρώπινες πρωτεΐνες που παράγονται από διαγονιδιακούς ζωικούς οργανισμούς είναι σχεδόν πανομοιότυπες με αυτές που εκκρίνονται στον άνθρωπο, και ως εκ τούτου, τα διαγονιδιακά ζώα χρησιμοποιούνται ευρέως για την παραγωγή πρωτεϊνών ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, όπως είναι αυτές με φαρμακευτική αξία π.χ. αιμοσφαιρίνη, λακτοφερίνη, αντιθρομβωτική πρωτεΐνη ΙΙΙ, πρωτεΐνη C, καθώς και για την παραγωγή διαγονιδιακών ιστών κατάλληλων για λόγους μεταμόσχευσης. Πάρ όλο το αρχικά υψηλό κόστος παραγωγής των διαγονιδιακών ζωικών οργανισμών, το γεγονός ότι η γενετική τροποποίησή τους μεταφέρεται στους απογόνους τους, τα καθιστά σημαντικά συστήματα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Παρά τα πλεονεκτήματα αυτά υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί σε αυτή την τεχνολογία. Σε μερικές περιπτώσεις, η ετερόλογη πρωτεΐνη μπορεί να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα υγείας στο ζώο παραγωγής. Επιπροσθέτως η έκφραση του διαγονιδίου, δεν είναι ελεγχόμενη είτε λόγω υπο-, είτε λόγω υπερ-παραγωγής της επιθυμητής πρωτεΐνης. Παράλληλα, η χρήση ζώων εγείρει ανησυχίες όσον αφορά την ασφάλεια ως προς τη μετάδοση ιών ή μολυσματικής πρωτεΐνης (prion) (επιμόλυνση των ετερόλογων πρωτεϊνών από παθογόνους μικροοργανισμούς ή τοξικούς παράγοντες των διαγονιδιακών ζώων). Παράλληλα, το κόστος της τεχνολογίας αυτής είναι υπερβολικά υψηλό (Πίνακας 4.3). Πίνακας 4.3 Το κόστος παραγωγής διαγονιδιακών ζώων 123

132 Σχήμα 4.5 Κατασκευή διαγονιδιακών ποντικών με μικροένεση. J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα 124

133 Διαγονιδιακά Φυτά Τα Γενετικά Τροποποιημένα Φυτά (ΓΤΦ) προκύπτουν από την άμεση επέμβαση στο γενετικό τους υλικό με τεχνικές του ανασυνδυασμένου DNA, οι οποίες περιλαμβάνουν την εισαγωγή στο φυτό ενός ή μερικών γονιδίων από μη συγγενείς φυτικούς οργανισμούς ή οργανισμούς που ανήκουν σε διαφορετικές ομάδες από αυτό (ζώα, μύκητες, μονοκύτταροι οργανισμοί κ.α.). Ο στόχος της γενετικής τροποποίησης είναι να δημιουργηθούν φυτά που δεν απαιτούν φυτοφάρμακα, εντομοκτόνα και ζιζανιοκτόνα για να καλλιεργηθούν αποδοτικά, αντέχουν στον παγετό και την ξηρασία, μειώνουν το κόστος καλλιέργειας, παράγουν τρόφιμα υψηλότερης διατροφικής αξίας, κ.ά. (Σχήμα 4.6). Σχήμα 4.6 Παραγωγή διαγονιδιακών καλλιεργειών Ένα κλασικό παράδειγμα ΓΤΦ είναι τα φυτά που παράγουν το βιοεντομοκτόνο Bt. Το βακτήριο Bacillus thuringiensis παράγει βιοδιασπώμενη, μη τοξική, δραστική εντομοκτόνο ουσία. Το γονίδιο του βακτηρίου που κωδικοποιεί την παραγωγή αυτής της ουσίας μεταφέρθηκε με την τεχνική του ανασυνδυασμένου DNA και τη βοήθεια ενός πλασμιδίου εντός του DNA φυτών, όπως πατάτα, καλαμπόκι κτλ., με αποτέλεσμα τα φυτά αυτά να παράγουν βιοεντομοκτόνο και να μην απαιτούν χημικά εντομοκτόνα. Παρά τα πλεονεκτήματα τους, τα τελευταία χρόνια πληθώρα επιστημονικών ερευνών στοχεύει στη διερεύνηση των πιθανών επιπτώσεων των ΓΤΦ στην ανθρώπινη υγεία και στο περιβάλλον και στη 125

134 διαλεύκανση των ασαφών στοιχείων που προκύπτουν από τις τεχνικές της γενετικής τροποποίησης. Η έκφραση των πρωτεϊνών στα φυτά μπορεί να είναι είτε συνεχής είτε παροδική και κατευθυνόμενη σε συγκεκριμένο φυτικό ιστό. Τα πλεονεκτήματα αυτής της ετερόλογης έκφρασης έγκεινται στο χαμηλό κόστος παραγωγής, στον υψηλό ρυθμό παραγωγής βιομάζας, και στην χωρίς περιορισμούς δυνατότητα εφαρμογών της. Τα φυτά επίσης διαθέτουν υψηλής ακρίβειας συστήματα έκφρασης, στερεοχημικής διαμόρφωσης των πρωτεϊνών, και μετα-μεταφραστικής τροποποίησής τους, τα οποία μπορούν να παράγουν ανθρώπινες πρωτεΐνες ανάλογης ποιότητας με αυτές που παράγονται όταν χρησιμοποιούνται κύτταρα θηλαστικών ως συστήματα ετερόλογης έκφρασης. Επιπλέον, οι ανθρώπινες πρωτεΐνες που παράγονται στα φυτά, όπως αντισώματα, εμβόλια, και ένζυμα, είναι ελεύθερα νοσογόνων παραγόντων και ιικών ή βακτηριακών τοξινών για τον άνθρωπο. Ωστόσο, οι ηθικοί περιορισμοί για τη δημιουργία αυτών των διαγονιδιακών φυτών και τα μέτρα που πρέπει να ληφθούν για την μη εξάπλωσή τους στο φυσικό περιβάλλον αυξάνουν το κόστος παραγωγής των ετερόλογων πρωτεϊνών. H χρησιμοποίηση διαγονιδιακών φυτών (όπως το καλαμπόκι) για την παραγωγή πρωτεϊνών, αντισωμάτων αλλά και εμβολίων παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα τα οποία σχετίζονται τόσο με το χαμηλό σχετικά κόστος που απαιτεί η ανάπτυξη αυτής της διεργασίας όσο και με το γεγονός ότι οι ιοί των φυτών δεν είναι μολυσματικοί για τους ανθρώπους, και έτσι δεν υπάρχει λόγος ανησυχίας ως προς την ασφάλεια όσον αφορά τους ενδογενείς ιούς ή τις μολυσματικές πρωτεΐνες (prions). Σημαντικό πλεονέκτημα αποτελεί επίσης το γεγονός ότι η κλίμακα παραγωγής μπορεί σχετικά εύκολα να αυξηθεί με αύξηση της επιφάνειας καλλιέργειας των διαγονιδιακών φυτών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η δυνατότητα χρησιμοποίησης των διαγονιδιακών φυτών ως εδώδιμοι φορείς για τη λήψη μιας θεραπευτικής πρωτεΐνης ή εμβολίου. Στον πίνακα 4.4 παρουσιάζονται χαρακτηριστικά προϊόντα με φαρμακευτική δράση που παράγονται σε φυτά. Τα προϊόντα αυτά παρασκευάζονται σε φυτά είτε για να απομονωθούν είναι και να χρησιμοποιηθούν ως φαρμακευτικά σκευάσματα είτε να παραμείνουν στο φυτό (φρούτο, λαχανικό) μαζί με αυτό. Για τα προϊόντα αυτά έχει αρχίσει να επικρατεί ο όρος τροφοφάρμακα ή βιοφάρμακα. Τα κύρια μειονεκτήματα της εφαρμογής των διαγονιδιακών φυτών σχετίζονται με τα σχετικά χαμηλά επίπεδα έκφρασης καθώς και το ότι απουσιάζουν ορισμένες μετά-μεταφραστικές διεργασίες των θηλαστικών. 126

135 Σημαντικό μειονέκτημα θεωρείται επίσης το γεγονός ότι, σε ανοιχτές καλλιέργειες των φυτών αυτών, η ποσότητα και πιθανά και η ποιότητα ποικίλουν, αποτέλεσμα των περιβαλλοντικών συνθηκών, που βέβαια δεν μπορούν να καθοριστούν. Οι ΗΠΑ κατέχουν το 68% της συνολικής έκτασης γενετικά τροποποιημένων καλλιεργειών παγκοσμίως, ενώ τα εγκεκριμένα Γενετικά τροποποιημένα τρόφιμα (ΓΤΤ) είναι ισοδύναμα με τα συμβατικά, θεωρούνται ασφαλή και εξάγονται σε όλο τον κόσμο. Η ΕΕ κατέχει έκταση γενετικά τροποποιημένων καλλιεργειών περίπου 1%, ενώ τρόφιμα που ανιχνεύονται με ποσοστό γενετικά τροποποιημένων συστατικών άνω του 0,9% πρέπει να έχουν ειδική επισήμανση ενημέρωσης του καταναλωτή (Οδηγία EC 1829/2003). Πίνακας 4.4 Χαρακτηριστικά παραδείγματα πρωτεϊνών με φαρμακευτική δράση που παράγονται σε φυτά. Πρωτεΐνη Καλλιέργεια που Θεραπευτική εφαρμογή χρησιμοποιήθηκε Ανθρώπινη πρωτεάση καπνός Αντιθρομβωτικό αίματος ορού Ανθρώπινη εγκεφαλίνη ελαιοκράμβη Αντιυπεραναλγητικό Ανθρώπινος επιδερμικός καπνός Θεραπεία τραυμάτων παράγοντας Ανθρώπινη ιντερφερόνη-α ρύζι Κατά της Ηπατίτιδας Β και C Ανθρώπινη αλβουμίνη πατάτα Κίρρωση ύπατος ορού Ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη πατάτα Υποκατάστατο αίματος Ανθρώπινη α-1 ρύζι Ασθένειες ήπατος αντιθρυψίνη Αγγειοτασίνη Ι ντομάτα υπέρταση Γλυκοσερεβροσιδάση καπνός Ασθένεια Gaucher Συνθετάση καροτενίων ρύζι Έλλειψη βιταμίνης Α Από το ξεκίνημα της, η Γενετική Μηχανική αντιμετώπισε δυο μεγάλα εμπόδια. Πρώτον, υπάρχει το ευρέως πια αποδεκτό γεγονός ότι η θεωρία πως κάθε γονίδιο είναι υπεύθυνο για ένα μόνο χαρακτηριστικό του οργανισμού (ένα γονίδιοένα γνώρισμα), αν ισχύει καν, θα ισχύει μόνο για λίγα γονίδια. Όσο περισσότερα μαθαίνονται για τη λειτουργία των κυττάρων και οργανισμών, τόσο περισσότερο ευέλικτη και πολλαπλή φαίνεται να είναι η σχέση μεταξύ των γονιδίων και των 127

136 λειτουργιών τους. Δεύτερον, υπάρχει μια περίπλοκη και δυναμική αυτό-ρυθμιστική ικανότητα των χρωμοσωμάτων και των γονιδιωμάτων, η οποία τα κάνει να αποβάλλουν, διαγράφουν ή να αποσιωπούν γενετικό υλικό, το οποίο δεν είναι κομμάτι της κανονικής δομής τους. Οι μεταλλάξεις συμβαίνουν ευρέως στη φύση και πολύ συχνά, το ίδιο το γενετικό υλικό ενεργοποιεί μηχανισμούς που τις διορθώνουν ή διαγράφουν. Το αποτέλεσμα της διαδικασίας αυτής είναι μια αξιοθαύμαστη σταθερότητα μορφής και λειτουργίας από πλευράς οργανισμών. DSP Σχήμα 4.7 Παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων σε φυτικά κύτταρα. DSP κατιούσα διεργασία (downstream processing), QA βεβαίωση ποιότητας (quality assurance), QC έλεγχος ποιότητας (quality control). Τρία σημαντικά προβλήματα αξίζει να μνημονευτούν: 1) οι πολλαπλές και απρόβλεπτες παρενέργειες λόγω της γενετικής τροποποίησης, 2) το πολύ χαμηλό ποσοστό επιτυχημένης και σταθερής έκφρασης των γενετικά τροποποιημένων χαρακτηριστικών και 3) η σημαντική δυσκολία απόδοσης χαρακτηριστικών, μέσω γενετικής τροποποίησης, τα οποία εμπλέκουν πολλά γονίδια ταυτόχρονα. Η βιοτεχνολογική βιομηχανία αποφεύγει να αναφέρει πως λιγότερο από το 1% των προσπαθειών της στη γενετική μηχανική παρουσιάζουν κάποια επιτυχία (π,χ παραγωγή εμβολίων σε φυτά). Σημαντικός παράγοντας για την εξήγηση των παραπάνω αποτυχιών είναι πως όλα αυτά τα χαρακτηριστικά ή προϊόντα προϋποθέτουν συμπλέγματα γονιδίων. Αντιθέτως, όλα τα μέχρι τώρα βιοτεχνολογικά 128

137 προϊόντα βασίζονται στη δράση ενός μόνο γονιδίου κάθε φορά (π.χ. φυτά ανθεκτικά σε ζιζανιοκτόνα ή φυτά που παράγουν την τοξίνη Bt). Πρόσφατα έχει αναφερθεί ότι είναι δυνατή η δυνατότητα παρασκευής μικρών τεχνητών χρωμοσωμάτων τα οποία φέρουν πολλαπλά γονίδια και γίνονται πλήρως λειτουργικά με το που εισέρχονται στο κύτταρο. Έχει υποστηριχτεί η άποψη ότι αυτά τα τεχνητά χρωμοσώματα θα κάνουν δυνατή τη μηχανική πολλαπλών χαρακτηριστικών και θα μειώσουν δραματικά τις παρενέργειες, καθώς δεν θα διαταράσσουν το καθαυτού γενετικό υλικό των οργανισμών που θα τροποποιούνται. Μια δεύτερη σημαντική εξέλιξη έχει επίσης πραγματοποιηθεί και αφορά στη γενετική τροποποίηση κυτταρικών οργανιδίων, όπως οι χλωροπλάστες και τα μιτοχόνδρια. Καθώς υπάρχουν έως και εκατοντάδες οργανίδια ανά κύτταρο, η τεχνική αυτή θα μπορούσε να επιτρέψει μια πολύ ισχυρή έκφραση των γενετικά τροποποιημένων χαρακτηριστικών. Καθώς τα γενετικώς τροποποιημένα οργανίδια δεν μεταφέρονται με τη γύρη, η βιομηχανία υποστηρίζει πως η γενετική επιμόλυνση μπορεί έτσι να αποφευχθεί. 129

138 130

139 5. ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΕΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA -ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ 5.1 Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης και οι εφαρμογές της Η ανακάλυψη της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR) στα μέσα της δεκαετίας του 80, επιτρέποντας την ενίσχυση τμημάτων DNA 0,2-40 kbp, είχε άμεσο αντίκτυπο στις εφαρμογές της βιοτεχνολογίας. H PCR δίνει τη δυνατότητα εκθετικής αύξησης των υπό ενίσχυση τμημάτων DNA. Θεωρητικά μπορούν να προκύψουν 10 6 μόρια DNA μετά από 20 κύκλους αντίδρασης PCR και περίπου 10 9 μόρια DNA μετά από 20 κύκλους αντίδρασης PCR ξεκινώντας από ng DNA. Για την πραγματοποίηση της PCR αντίδρασης απαιτείται μία θερμοσταθερή DNA πολυμεράση, το DNA, το ζευγάρι των εκκινητών για την υπό ενίσχυση περιοχή, και μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (datp, dctp, dgtp, dttp). Οι εκκινητές (primers) συντίθενται χημικά, ώστε να είναι συμπληρωματικοί στα άκρα του υπό ενίσχυση τμήματος, έχουν συνήθως μέγεθος 20 νουκλεοτίδια και το ελεύθερο 3 -ΟΗ βρίσκεται προς την κατεύθυνση της αλληλουχίας του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί, αφού η DNA πολυμεράση συνθέτει τη θυγατρική αλυσίδα βάσει της συμπληρωματικότητας με τη μητρική αλυσίδα και με κατεύθυνση 5 3. Κάθε κύκλος ενίσχυσης διαθέτει τρία στάδια: αποδιάταξη των δίκλωνων DNA, υβριδισμός των εκκινητών, ενίσχυση της θυγατρικής αλυσίδας. Καθώς η αποδιάταξη των δίκλωνων μορίων DNA πραγματοποιείται στους 95 ο C και το στάδιο αυτό μπορεί να επαναληφθεί τουλάχιστον 30 φορές απαιτείται μία υψηλά θερμοσταθερή DNA πολυμεράση. H Taq DNA πολυμεράση, η οποία έχει απομονωθεί από το θερμόφιλο αρχαιοβακτήριο Thermus aquaticus, στερείται 3 5 εξωριβονουκλεοτιδικής δράσης αναγνώρισης λαθών, με αποτέλεσμα την πιθανή τοποθέτηση λάθος νουκλεοτιδίων κατά την ενίσχυση των θυγατρικών αλυσίδων. Αντίθετα, η Pfu πολυμεράση από το αρχαιοβακτήριο Pyrococcus furiosus διαθέτει 3 5 εξωριβονουκλεοτιδική δράση αναγνώρισης λαθών, μειώνοντας σημαντικά το ποσοστό λάθους κατά την ενίσχυση των θυγατρικών αλυσίδων. Το πρώτο στάδιο της PCR είναι η αποδιάταξη του δίκλωνου μορίου DNA στους 95 ο C. Κατόπιν, το μίγμα της αντίδρασης ψύχεται στους ο C για την υβριδοποίηση των εκκινητών. Η σύσταση των εκκινητών σε γουανίνη και κυτοσίνη καθορίζει την ακριβή θερμοκρασία υβριδοποίησής τους. Τέλος, η θερμοκρασία 131

140 αυξάνεται στους 70 ο C, οπότε και προκύπτουν οι θυγατρικές αλυσίδες DNA. Τα τρία αυτά στάδια επαναλαμβάνονται φορές δίνοντας ακόμη και προϊόντα 40 kbp με βελτιστοποίηση των συνθηκών της υπό μελέτη αντίδρασης (εικόνα 5.1). Εικόνα 5.1: Τα τρία στάδια (αποδιάταξη, υβριδισμός των εκκινητών και ενίσχυση των θυγατρικών αλυσίδων) της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης, τα οποία διεξάγονται αυτόματα σε κυκλοποιητή θερμοκρασιών (PCR συσκευή). J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski, Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα Σήμερα, έχουν προκύψει διάφορες προεκτάσεις από την εφαρμογή της απλής αντίδρασης PCR, όπως εύρεση της πρωτοδιάταξης του DNA (sequencing), κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση των PCR προϊόντων, ιχνηθέτηση των PCR προϊόντων και παραγωγή χιμαιρικών γονιδίων. Επιπλέον, είναι δυνατή η εισαγωγή θέσεων δράσης περιοριστικών ενζύμων στο 5 -άκρο των εκκινητών, το οποίο παρέχει τη δυνατότητα τα προϊόντα PCR να πεμφθούν και να κλωνοποιηθούν σε κάποιο πλασμίδιο. Επίσης, η σε πραγματικό χρόνο PCR (real-time PCR, RT-PCR) χρησιμοποιείται σήμερα ολοένα και περισσότερο στην ποσοτικοποίηση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων. Το mrna μετατρέπεται σε DNA με τη βοήθεια της ανάστροφης τρανσκριπτάσης και τα DNA μόρια που προκύπτουν ποσοτικοποιούνται με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος της RT-PCR. H RT-PCR πραγματοποιείται με 132

141 φθορίζοντες εκκινητές, οι οποίοι όταν ενσωματωθούν στα προκύπτοντα PCR προϊόντα εκπέμπουν φθορισμό, ο οποίος καταμετράται από φθοριομετρητή ενσωματωμένο στην RT-PCR συσκευή. Σχήμα 5.2 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων DNA κατά την PCR.J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski, Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα 133

142 5.2 Εύρεση της αλληλουχίας του DNA. H εύρεση της αλληλουχίας του DNA είναι μία από τις πιο χρήσιμες μεθόδους στην ανάλυση και χειρισμό των μορίων DNA. Η γνώση της αλληλουχίας των DNA μορίων και της κλωνοποίησης τους σε φορείς έκφρασης έδωσε τη δυνατότητα παραγωγής πλήθους πρωτεϊνών. Επίσης, δίνει τη δυνατότητα του σχεδιασμού ειδικών ιχνηθετών και εκκινητών για τη χαρτογράφηση των γονιδίων και των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Η χημική μέθοδος εύρεσης της αλληλουχίας του DNA (sequencing) των Maxam και Gilbert έχει αντικατασταθεί από την ενζυμική μέθοδο των Sanger και συνεργατών του. Η ενζυμική μέθοδος βασίζεται στην ιδιότητα της DNA πολυμεράσης από το μικροοργανισμό Ε.coli να συνθέτει τη θυγατρική DNA αλυσίδα τοποθετώντας δεοξυριβονουκλεοτίδια, αλλά και 2-3 -διδεοξυριβονουκλεοτίδια. Τα 2-3 -διδεοξυριβονουκλεοτίδια δεν έχουν ελεύθερο υδροξύλιο στο 3 -άκρο τους και ως εκ τούτου τα μόρια DNA, στα οποία έχουν εισαχθεί διδεοξυριβονουκλεοτίδια, δεν επιμηκύνονται περαιτέρω. Συγκεκριμένα, ο εκκινητής που χρησιμοποιείται καθορίζει το τμήμα DNA, στο οποίο θα γίνει ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του. Η DNA πολυμεράση συνθέτει τη θυγατρική αλυσίδα DNA παρουσία των τεσσάρων δεοξυριβονουκλεοτιδίων (datp, dctp, dgtp, dttp), ένα από τα οποία είναι ραδιενεργά σημασμένο, π.χ. (α- 35 S)-dATP. Η ίδια αντίδραση πραγματοποιείται σε τέσσερα διαφορετικά σωληνάκια, σε καθένα από τα οποία υπάρχει επιπλέον καθένα από τα τέσσερα 2-3 -διδεοξυριβονουκλεοτίδια (ddatp, ddttp, ddgtp, ddctp), έχοντας ως αποτέλεσμα τη δυνατότητα τερματισμού των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων σε κάθε νουκλεοτιδική θέση, οπότε και προκύπτουν τμήματα DNA, τα οποία διαφέρουν μεταξύ τους ανά μία νουκλεοτιδική βάση. Τα τμήματα αυτά ακολούθως διαχωρίζονται σε αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και ακολουθεί αυτοραδιογραφία (εικόνα 5.3). Η ανάγκη εύρεσης της αλληλουχίας του DNA σε μεγάλη κλίμακα οδήγησε σε αυτοματοποίηση της όλης διαδικασίας. Αυτό έχει επιτευχθεί ανιχνεύοντας σε πραγματικό χρόνο εντός τριχοειδών πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου τα προκύπτοντα φθορίζοντα τμήματα DNA. Κατά αυτόν τον τρόπο μπορούν να διαβαστούν ως και 1000 νουκλεοτίδια και η αλληλουχία αποθηκεύεται άμεσα σε ηλεκτρονική μορφή για την μετέπειτα επεξεργασία της. 134

143 Σχήμα 5.3: H ενζυμική μέθοδοs κατά Sanger για εύρεση της αλληλουχίας του DNA. Οι στήλες ορίζουν καθένα από τα τέσσερα νουκλεοτίδια, στα οποία έχει τερματισθεί η αντίδραση κατά την αλληλούχιση του τμήματος DNA (Α-αδενίνη, C-κυτοσίνη, G- γουανίνη, T-θυμίνη). J.D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski, Recombinant DNA, 3rd edition, Ελληνική Έκδοση 2007, Εκδόσεις Μπάσδρα 135

144 Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Η κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση χρησιμοποιείται για να μελετηθεί η λειτουργία των γονιδίων, καθώς και να τροποποιηθούν οι ιδιότητες των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Για παράδειγμα, με την κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μπορεί να αντικατασταθούν συγκεκριμένα αμινοξέα σε πρωτεΐνες, ώστε να βελτιστοποιηθούν τα χαρακτηριστικά διαφόρων χρήσιμων ενζύμων. Οι μεταλλάξεις εισάγονται στο DNA με in vitro μεθόδους (π.χ με PCR), κατόπιν αυτά τα μόρια DNA μεταφέρονται σε βακτήρια για να μελετηθεί το φαινοτυπικό αποτέλεσμα της συγκεκριμένης γενετικής αλλαγής. Η γενική αρχή της κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση με PCR παρουσιάζεται στην επόμενη εικόνα Σχήμα 5.4: Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση με PCR. O μεταλλαξιογόνος εκκινητής περιέχει μια μη συμπληρωματική βάση 136

145 Μικροσυστοιχίες μέτρησης της έκφρασης των γονιδίων Μία άλλη τεχνολογία που έχει μεγάλη επίδραση στη γενωμική είναι οι μικροσυστοιχίες μέτρησης της έκφρασης των γονιδίων με τη μέτρηση των επιπέδων του αντίστοιχου m-rνα. Αυτές οι μικροσυστοιχίες είναι συστοιχίες υψηλής πυκνότητας νουκλεοτιδίων (Σχήμα 5.5). Τα νουκλεοτίδια αυτά υβριδιώνονται με τα αντίστοιχα m-rna. Για ένα γνωστό γονίδιο ή μια πρωτεΐνη μπορεί να συντεθεί ένα νουκλεοτίδιο που συνδέεται με το αντίστοιχο m-rna. Χρησιμοποιώντας τη φωτολιθογραφία, η κατασκευή συστοιχιών που περιέχουν μεμονωμένα ολιγονουκλεοτίδια σε υποστρώματα γυαλιού 1.64 cm 2 είναι πλέον ρουτίνα. Τέτοιες συστοιχίες μπορούν να αναλύσουν ταυτόχρονα την έκφραση από έως γονιδίων. Οι βασικές εφαρμογές της τεχνολογίας αυτής περιλαμβάνουν: Μελέτη έκφρασης γονιδίων Ανάλυση αλληλουχίας DNA Ανίχνευση μεταλλάξεων Κατασκευή γονιδιακών χαρτών με βάση την έκφραση ή τη λειτουργία γονιδίων Εντοπισμό γονιδίων ιών που ενεργοποιούνται μόνο κατά τη μόλυνση Μελέτη επίδρασης φαρμάκων και του μηχανισμού δράσης Σύγκριση υγιών και παθολογικών κυττάρων για τον εντοπισμό γονιδίων που σχετίζονται με ασθένειες Σύγκριση διαφορετικών φάσεων ανάπτυξης ενός κυττάρου με εντοπισμό των γονιδίων που συμμετέχουν στην ανάπτυξη Ανάλυση πρωτεώματος Ο όρος πρωτέωμα αναφέρεται στις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα ενός οργανισμού. Το πρωτέωμα δίνει τις σχέσεις μεταξύ του γενετικού υπόβαθρου ενός οργανισμού και της φυσιοπαθολογίας του. Επίσης, δίνει την δυνατότητα να μελετηθούν οι αλληλουχίες του γονιδιώματος ενός οργανισμού, να προσδιοριστούν τα ρυθμιστικά στοιχεία έκφρασης των γονιδίων ενός οργανισμού, αλλά και να προσδιοριστεί ο τρόπος απόκρισης ενός οργανισμού στα περιβαλλοντολογικά ερεθίσματα. Το Ε. coli με γονιδίωμα της τάξεως των 4,6 Μbp κωδικοποιεί περίπου 4400 πρωτεΐνες. Διάφορα πειραματικά δεδομένα και ομολογίες 137

146 με πρωτεΐνες άλλων οργανισμών οδήγησαν στον προσδιορισμό της λειτουργίας περίπου του 60% αυτών των πρωτεϊνών. Ο βιολογικός ρόλος των υπόλοιπων πρωτεϊνών, περίπου 1800 πρωτεΐνες, είναι υπό διερεύνηση. Ίδιο ποσοστό πρωτεϊνών με μη προσδιορισμένη λειτουργία ισχύει και για τον μικροοργανισμό Mycoplasma genitalium, παρόλο που το γονιδίωμά του είναι πολύ μικρότερο. Εικόνα 5.5 Μια μικροσυστοιχία DNA (DNA microarray) αποτελείται από μερικές χιλιάδες περιοχές DNA (ανιχνευτές ή probes) τοποθετημένες σε μια πολύ μικρή γυάλινη επιφάνεια 138

147 Μελέτη της έκφρασης γονιδίων από τον ίδιο οργανισμό σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης Η μέθοδος Western blot χρησιμοποιείται ευρέως στην ανίχνευση των πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με SDS-PAGE (sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis) ή ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, κατόπιν μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή πλαστική μεμβράνη και ακολούθως ταυτοποιούνται, αφού υβριδιστούν με ένα αντίσωμα, το οποίο στη συνέχεια ανιχνεύεται με ένα άλλο αντίσωμα- ιχνηθέτη. Σύμφωνα με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών σε δύο διαστάσεις αυτή οι πρωτεϊνες αρχικά διαχωρίζονται βάσει του ισοηλεκτρικού τους σημείου σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με βαθμίδωση του ph και κατόπιν στο ίδιο πήκτωμα, αλλά στη δεύτερη διάστασή του διαχωρίζονται βάσει του μοριακού τους βάρους (2-DPAG: two-dimensional polyacrylamide gel). 139

148 Μεμβράνη κυτταρίνης όπου προσδένονται οι πρωτεΐνες Προσθήκη πρώτου αντισώματος και πρωτεϊνών γάλακτος Το πρώτο αντίσωμα συνδέεται στην πρωτεΐνη στόχο Προσθήκη δεύτερου αντισώματος συνδεδεμένο με αλκαλική φωσφατάση Το δεύτερο αντίσωμα συνδέεται στο πρώτο αντίσωμα Προσθήκη ΧPHOS για την ανίχνευση του δεύτερου αντισώματος Θέση της πρωτεΐνης-στόχου στστόχου Western blot: Οι πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή πλαστική μεμβράνη Στη συνέχεια ακολουθεί προσθήκη πρωτεϊνών γάλατος οι οποίες θα μπλοκάρουν όλες τις ελεύθερες θέσεις στη μεμβράνη για να αποφευχθεί η μη ειδική σύνδεση του αντισώματος. Στη συνέχεια ακολουθεί η προσθήκη δεύτερου αντισώματος το οποίο αναγνωρίζει το πρώτο και συνδέεται σε αυτό χωρίς να επηρεάζεται η σύνδεση με την πρωτεΐνη. Στο δεύτερο αντίσωμα είναι συνδεδεμένος κάποιος ιχνηθέτης για την εύκολη ανίχνευσή του. Συχνά αυτό είναι το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση που αφαιρεί φωσφορικές ομάδες από το μόριο του υποστρώματος Το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται είναι το Χ-Phos. Όταν από αυτό αφαιρεθεί η φωσφορική ομάδα με τη δράση της αλκαλικής φωσφατάσης τότε το εναπομείναν τμήμα του υποστρώματος αντιδρά με το οξυγόνο σχηματίζοντας ιζημα μπλέ χρώματος στη θέση της πρωτεΐνης 140

149 Oι πρωτεΐνες αποκαλύπτονται είτε με τεχνικές χρώσης ή ραδιογραφίας. Συγκρίνοντας τέτοια πηκτώματα πολυκρυλαμιδίου μεταξύ τους μπορεί κάποιος να αποκαλύψει τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης, σε στρεσογόνες καταστάσεις ή μετά από συγκεκριμένα περιβαλλοντολογικά ερεθίσματα. Επιπλέον, από τα πηκτώματα αυτά του πολυακρυλαμιδίου μπορούν να απομονωθούν τα σημεία στα οποία έχουν εγκλωβιστεί οι πρωτεΐνες, ακολούθως αυτές να υδρολυθούν με τρυψίνη και να μελετηθούν με φασματοφωτομετρία μάζας με τεχνικές ιονισμού όπως η matrix-assisted laser desorption /ionization ( MALDI) ή η τεχνική electrospray ionization (ESI). Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε δύο διαστάσεις Στη φασματομετρία MALDI δημιουργούνται ιόντα πρωτεΐνης που επιταχύνονται μέσω ενός ηλεκτρικού πεδίου. Τα ιόντα αυτά ταξιδεύουν μέσα από 141

150 έναν σωλήνα επιτάχυνσης, όπου τα μικρά ιόντα ταξιδεύουν γρηγορότερα και φθάνουν πρώτα στον ανιχνευτή. Επομένως, ο χρόνος πτήσης (time of flight, TOF) στο ηλεκτρικό πεδίο είναι παράμετρος εξαρτώμενη από το λόγο μάζα/φορτίο. Ελάχιστες ποσότητες βιομορίων, τόσο μικρές όσο λίγα picomol έως femtomol, χρειάζονται για μια τέτοια ανάλυση. Υδρόλυση πρωτεΐνης με τρυψίνη και ανάλυση με φασματοφωτομετρία μάζας In silico ανάλυση του βακτηριακού γονιδιώματος Γενικά, οι πληροφορίες αλληλουχίας του DΝΑ θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιορισθεί το ποιες αλληλουχίες είναι γονίδια που κωδικεύουν πρωτεΐνες, ποιες είναι αυτές οι πρωτεΐνες, ποια είναι η βιολογική λειτουργία τους και τελικά το πώς ρυθμίζονται αυτά τα γονίδια. Η απόφαση ως προς το ποια αλληλουχία νουκλεοτιδίων αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο δεν είναι πάντα εύκολη διαδικασία. Οι ερευνητές ψάχνουν για «ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης» ή ΟRF (open reading frame). Ένα ΟRF είναι μια αλληλουχία νουκλεοτιδίων που μπορεί να μεταφραστεί σε πρωτεϊνη. Στα προκαρυωτικά ο προσδιορισμός ΟRF είναι αρκετά 142

151 απλός. Στα ευκαρυωτικά, εξαιτίας των ιντρονίων και των εξονίων, ο προσδιορισμός των ΟRF είναι περίπλοκος. Μερικά προγράμματα υπολογιστών μπορούν να αναγνωρίσουν τα πιθανά (συναινετικά) όρια ιντρονίων /εξονίων. Φάσμα μάζας ενός πεπτιδίου (m/z ). Όταν προσδιορίζεται ένα υποψήφιο γονίδιο, είναι αναγκαίο να γνωρίζουμε τη λειτουργία της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Σε μερικές περιπτώσεις, η λειτουργία μπορεί να συναχθεί από τις βάσεις δεδομένων εάν συγκριθεί με την αλληλουχία αμινοξέων γνωστών πρωτεϊνών. Ενίοτε, η αλληλουχία των αμινοξέων και η λειτουργία μιας πρωτεΐνης συντηρείται στα διάφορα είδη. Ακόμη και για τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί εις βάθος, όπως το Ε. coli, μπορούμε να υποθέσουμε μόνο για το 50% των γονιδίων. Είναι σαφές ότι η γνώση της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος αποδεικνύει ότι γνωρίζουμε ελάχιστα πράγματα. Η διαδικασία του προσδιορισμού των απλών γονιδίων και της λειτουργίας των αντίστοιχων γονιδίων αποτελεί αντικείμενο της βιοπληροφορικής. Σήμερα, η γνώση του γονιδιώματος πλήθος μικροοργανισμών και η χρήση της βιοπληροφορικής δίνει τη δυνατότητα να μελετηθούν οι εξελικτικές σχέσεις των βακτηρίων και η λειτουργία των γονιδίων τους. Ο συνδυασμός της βιοπληροφορικής και των in vivo και in vitro μεθοδολογιών έδωσε τη δυνατότητα χειρισμού πλήθος δεδομένων που προκύπτουν από τις σύγχρονες εργαστηριακές μεθόδους ανάλυσης. Ο απώτερος βέβαια σκοπός είναι η δημιουργία μοντέλων που προσομοιώνουν το σύνολο ενός οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων και στοιχείων της εξέλιξής του. 143

152 Σήμερα υπάρχουν διάφοροι τύποι λογισμικών προγραμμάτων που δίνουν τη δυνατότητα ανάλυσης του γονιδιώματος των βακτηρίων. Κάποια από αυτά βοηθούν να προσδιοριστούν: τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, οι ρυθμιστικές αλληλουχίες της έκφρασης των γονιδίων π.χ. υποκινητές, θέσεις σύνδεσης των ριβοσωμάτων και ο βαθμός ομοιότητάς τους με άλλες αλληλουχίες που υπάρχουν σε βάσεις δεδομένων. Επίσης, με κατάλληλα προγράμματα μπορούν να βρεθούν όλα τα αναγνωστικά πλαίσια μίας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, ενώ τα πιο σύγχρονα προγράμματα βιοπληροφορικής προβλέπουν τις πιθανές κωδικοποιούσες πρωτεΐνες, λαμβάνοντας επίσης υπόψη τις θέσεις σύνδεσης των ριβοσωμάτων πριν από το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης και τις πιθανές θέσεις που ευνοούν την παρουσία μεταλλάξεων. Σε μία ειδικά διατηρημένη πρωτεΐνη είναι δυνατό να βρεθούν όμοιες αλληλουχίες αμινοξέων - για παράδειγμα, στη μύγα των φρούτων και στους ανθρώπους. Στην περίπτωση αυτή θα μπορούσε να καθορισθεί πόσο ομόλογες είναι οι δύο αλληλουχίες των αμινοξέων. Η συντήρηση των αμινοξέων που βρίσκονται κοντά σε μια καταλυτική περιοχή ή περιοχή σύνδεσης είναι ιδιαίτερα σημαντική. Υπό ιδανικές συνθήκες θα ήταν επιθυμητή η δυνατότητα πρόβλεψης της δομής μιας πρωτεΐνης από την αλληλουχία των αμινοξέων. Αν και έχουν γίνει μεγάλες προσπάθειες για το σκοπό αυτό, δεν υπάρχει ακόμη μία ικανοποιητική λύση και έτσι η κατανόηση της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών είναι ένα πολύ δύσκολο πρόβλημα. Mε τη βοήθεια λογισμικών προγραμμάτων, μπορούν να προβλεφθούν οι ομοιότητες μεταξύ των προβλεπόμενων και ήδη γνωστών πρωτεϊνών. Απαραίτητη όμως προϋπόθεση για αυτού του τύπου την ανάλυση είναι η πρόσβαση σε βιβλιοθήκες δεδομένων. Η πρόσβαση σε αυτές τις βιβλιοθήκες μπορεί να γίνει μέσω του διαδυκτίου, όπου προγράμματα όπως το FASTA και BLAST δίνουν τη δυνατότητα εύρεσης ομολογιών με άλλες αλληλουχίες. Επίσης, με κατάλληλα προγράμματα μπορούν να προβλεφθούν οι διαμεμβρανικές επικράτειες μίας πρωτεΐνης, η δευτεροταγής δομή της πρωτεΐνης, τα πεπτίδια σήματος των εκκριτικών πρωτεϊνών, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών και ο πιθανός τρόπος δράσης των πρωτεϊνών στα μεταβολικά μονοπάτια. 144

153 6. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ 6.1 Εισαγωγή Αν και τα ένζυμα έχουν χρησιμοποιηθεί έμμεσα ή άμεσα από τον άνθρωπο για χιλιάδες χρόνια, μόνο από το δεύτερο μισό του 20 ου αιώνα ξεκίνησε η συστηματική έρευνα για τους βιολογικούς αυτούς καταλύτες. Η συσσωρευμένη γνώση που απέφερε η έρευνα το διάστημα αυτό σε τεχνικές προσδιορισμού, απομόνωσης, χαρακτηρισμού και βελτίωσης των ενζύμων, οδήγησε στη συνεχώς αυξανόμενη εφαρμογή των βιοκαταλυτών σε διάφορες διεργασίες μικρής και μεγάλης κλίμακας.η βιοκατάλυση αποτελεί την καρδιά του σύγχρονου κλάδου της Λευκής Βιοτεχνολογίας. Σήμερα, η παγκόσμια αγορά των ενζύμων ξεπερνά τα 1.8 δις, ποσό που αναμένεται να διπλασιασθεί στο τέλος της πρώτης δεκαετίας του 21 ου αιώνα. Τα τελευταία χρόνια, το πεδίο των εφαρμογών των ενζύμων αφορά κυρίως σε διαδικασίες που αποτελούν αντικείμενο της βιομηχανίας τροφίμων, φαρμάκων, διαγνωστικών και αναλυτικών προϊόντων, βιοκαυσίμων, αλλά και πολλών άλλων βιομηχανικών κλάδων. Τόσο η ανάπτυξη νέων ενζυμικών εφαρμογών, όσο και η παραγωγή ενζύμων με συνεχώς βελτιωμένες ιδιότητες που αφορούν στη δραστικότητα, σταθερότητα και εκλεκτικότητα, επικεντρώνουν σε μεγάλο βαθμό το ενδιαφέρον των βιοτεχνολόγων σήμερα. Στο κεφάλαιο 7 αναπτύσσονται οι κύριες εφαρμογές των ενζύμων σε βιομηχανική κλίμακα. Αν και σήμερα έχουν απομονωθεί και χαρακτηρισθεί πάνω από 2500 ένζυμα, μόνο μερικές δεκάδες από αυτά βρίσκουν εφαρμογή σε διάφορες διεργασίες με εμπορικό ενδιαφέρον. Κύριος ανασταλτικός παράγοντας είναι το υψηλό κόστος παρασκευής (απομόνωσης κα καθαρισμού) και χρήσης πολλών ενζύμων. Με την ανάπτυξη όμως της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA και της γενετικής μηχανικής, η παραγωγή ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα είναι σήμερα ρεαλιστική και οικονομικά συμφέρουσα διαδικασία. Το γεγονός αυτό αναμένεται να διευρύνει την εφαρμογή των ενζύμων τόσο σε βιομηχανικές διεργασίες, όσο και για αναλυτικούς, διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς. 6.2 Τεχνολογική κατάταξη ενζύμων Η τεχνολογική κατάταξη των ενζύμων βασίζεται κυρίως στον όγκο παραγωγής και το μέγεθος εφαρμογής τους. Με βάση τα κριτήρια αυτά, τα ένζυμα 145

154 κατατάσσονται: α) στα μεγάλου όγκου ή βιομηχανικά ένζυμα, τα οποία παράγονται κατά εκατοντάδες χιλιάδες τόνους και β) στα μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίας, τα οποία παράγονται σε πολύ μικρότερες ποσότητες (έως μερικά χιλιόγραμμα). Τα βιομηχανικά ένζυμα αντιπροσωπεύουν το 90% της συνολικής ετήσιας αγοράς ενζύμων, η δε αξία τους ανά μονάδα βάρους μπορεί να είναι χιλιάδες φορές μικρότερη από αυτή των ενζύμων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Ο κύριος λόγος της διαφοροποίησης αυτής έχει να κάνει με το κόστος απομόνωσης και καθαρισμού των ενζύμων, αλλά και τον τελικό βαθμό καθαρότητας. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι σε ένα βιομηχανικό ενζυμικό παρασκεύασμα, το ποσοστό της πρωτεΐνης με χαρακτηριστική ενζυμική δραστικότητα ανέρχεται από 1 έως 6% του συνόλου του παρασκευάσματος, ενώ ποσοστό 10-15% αντιστοιχεί σε άλλες πρωτεΐνες και το υπόλοιπο σε ανόργανα άλατα ή άλλα οργανικά μόρια μικρού μοριακού βάρους (π.χ. σάκχαρα). Αντίθετα, ο βαθμός καθαρότητας των περισσότερων ενζύμων υψηλής προστιθέμενης αξίας (αναλυτικά, διαγνωστικά, θεραπευτικά και ένζυμα γενετικής μηχανικής) είναι σημαντικά μεγαλύτερος, αποτέλεσμα πολύπλοκων και πιο δαπανηρών τεχνικών που εφαρμόζονται για τον καθαρισμό τους. Στην κατηγορία αυτή υπάγονται και ένζυμα που προέρχονται από γενετικά ανασυνδυασμένους μικροοργανισμούς και τα οποία ύστερα από κατάλληλο γενετικό σχεδιασμό παράγονται και εκκρίνονται σε μεγάλη ποσότητα. 6.3 Πηγές προέλευσης των ενζύμων Αν και οι παλαιότερες πηγές ενζύμων είναι ζωικής και φυτικής προέλευσης, σήμερα μόλις το 8-10% της συνολικής παραγόμενης ποσότητας ενζύμων προέρχεται από ζώα και φυτά. Οι ζωικοί ιστοί και όργανα έχουν αποδειχθεί εξαιρετικές πηγές για ορισμένα ένζυμα όπως λιπάσες, εστεράσες και πρωτεάσες. Παράλληλα, ορισμένα καλλιεργήσιμα φυτά αποτελούν πλούσια πηγή πρωτεασών, αλλά και α-αμυλάσης και υπεροξειδάσης. Στους πίνακες 6.1 και 6.2 αναφέρονται χαρακτηριστικά παραδείγματα ενζύμων ζωικής κα φυτικής προέλευσης. Ένζυμα είναι δυνατόν επίσης να παραχθούν απευθείας από καλλιέργειες ζωικών (θηλαστικών) κυττάρων. Το κόστος όμως παραγωγής τους είναι υψηλότατο (έως 5000 ανά γραμμάριο) και μπορεί να δικαιολογηθεί μόνο για την παραγωγή θεραπευτικών ενζύμων, όπως είναι ο ιστικός ενεργοποιητής του πλασμινογόνου (tissue plasminogen activator). 146

155 Οι μικροοργανισμοί θεωρούνται ως η ιδανική πηγή ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα. Σημαντικό πλεονέκτημα της χρήσης των μικροοργανισμών στην παραγωγή ενζύμων αποτελεί η σταθερότητα και προβλεψιμότητα της απόδοσης του τελικού προϊόντος. Η εξαιρετικά μεγάλη ταχύτητα ανάπτυξης των μικροοργανισμών αποτελεί σαφέστατο πλεονέκτημα της χρήσης των μικροοργανισμών στην παραγωγή ενζύμων. Παράλληλα, η παραγωγή ενζύμων μέσω μικροοργανισμών διευκολύνει (ιδιαίτερα σε βιομηχανική κλίμακα) τον καθαρισμό και την απομόνωση τους. Ακόμη και στην περίπτωση των εσωκυτταρικών ενζύμων μικροβιακής προέλευσης, τα στάδια καθαρισμού που απαιτούνται είναι λιγότερα σε σχέση με αυτά που αφορούν τον καθαρισμό ενζύμων ζωικής ή φυτικής προέλευσης. Σήμερα υπολογίζεται ότι το 90% των ενζύμων που παράγονται μέσω ζυμώσεων, με σκοπό την εφαρμογή σε διάφορους κλάδους της βιομηχανίας, προέρχεται από μικροοργανισμούς. Η βιοχημική ποικιλία ιδιαίτερα ως προς τη δραστικότητα και την εξειδίκευση των ενζύμων είναι τεράστια, καθώς κάθε μικροοργανισμός παράγει τόσο εσωκυτταρικά, όσο και εξωκυτταρικά ένζυμα με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Πίνακας 6.1. Ένζυμα ζωικής προέλευσης και εφαρμογές αυτών. Ένζυμα Ζωική πηγή Εφαρμογές Ρεννίνη Ήνυστρο μόσχου Παρασκευή τυριού Θρυψίνη Πάγκρεας μόσχου και χοίρου Χημική σύνθεση, επεξεργασία δερμάτων, παρασκευή πρωτεϊνικών υδρολυμάτων Λιπάση Πάγκρεας χοίρου Τεχνολογία τροφίμων, επεξεργασία λιπών, χημική σύνθεση, βιομηχανία καλλυντικών Αλκαλική Φωσφατάση Έντερο μόσχου Αναλυτικές και διαγνωστικές εφαρμογές Αφυδρογονάσες του L-γαλακτικού και L-μηλικού Καρδιακός ή σκελετικός μυς θηλαστικών Αναλυτικές και διαγνωστικές εφαρμογές Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μικροβιακή παραγωγή ενζύμων, τα οποία έχουν όμοιες καταλυτικές ιδιότητες με αυτά που προέρχονται από ζωικούς ή φυτικούς ιστούς. Το ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή είναι αποτέλεσμα τόσο του μειωμένου κόστους της παραγωγής, όσο και για λόγους που σχετίζονται με τη 147

156 διασφάλιση της δημόσιας υγείας. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα βιομηχανικών ενζύμων που προέρχονται από ιστούς ή σπλάχνα βοοειδών, τα οποία είναι ύποπτα για τη μετάδοση της νόσου της σπογγώδους εγκεφαλοπάθειας. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι η ρεννίνη που προέρχεται από το στομάχι μοσχαριών χρησιμοποιείται ακόμη στην παραγωγή τυριού. Σήμερα είναι δυνατή η παραγωγή της ρεννίνης από πρωτεολυτικά ένζυμα που παράγει ο μικροοργανισμός Mucor. Πίνακας 6.2 Ένζυμα φυτικής προέλευσης και εφαρμογές αυτών. Ένζυμο Φυτική πηγή Εφαρμογές α-αμυλάση Σπόροι δημητριακών, βύνη Στην ενζυμική επεξεργασία αμύλου Παπαΐνη Φικίνη Βρομελαΐνη Οξαλική οξειδάση Από το χυμό φρούτων ή φύλλων του φυτού Carica papaya Aπό το χυμό του τροπικού δέντρου Ficus glabrata Aπό το χυμό των τροπικών φυτών Ananas conosus και Ananas bractea Από ρίζες κριθαριού Στη ζυθοποιία (διαύγαση μπύρας), στο σίτεμα του κρέατος (υδρόλυση κολλαγόνου), στη βρυσοδεψία, στην παρασκευή πρωτεϊνικών υδρολυμάτων, ως υποβοηθητικό της πέψης Στο σίτεμα του κρέατος (υδρόλυση κολλαγόνου), στην παρασκευή πρωτεϊνικών υδρολυμάτων, Στο σίτεμα του κρέατος (υδρόλυση κολλαγόνου), στην αρτοποιία, στην παρασκευή πρωτεϊνικών υδρολυμάτων, ως υποβοηθητικό της πέψης Αναλυτικές εφαρμογές (προσδιορισμός της οξαλικής οξειδάσης σε βιολογικά δείγματα) Υπεροξειδάση Από το φυτό ραφανίδα Αναλυτικές και διαγνωστικές εφαρμογές (προσδιορισμός υπεροξειδίου του υδρογόνου Ουρεάση Από τους καρπούς του φυτού Canavalia ensiformis Διαγνωστικές εφαρμογές Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ένζυμα που προέρχονται από μικροοργανισμούς, οι οποίοι αναπτύσσονται σε ακραίες συνθήκες θερμοκρασίας, ph, πίεσης και αλατότητας, δηλαδή, από μικροοργανισμούς που ζουν κοντά σε θερμές 148

157 πηγές, ή στην περιοχή του αρκτικού κύκλου, ή ακόμη και σε θαλάσσιο περιβάλλον υπό υψηλή πίεση. Σήμερα είναι δυνατή η καλλιέργεια βακτηρίων σε θερμοκρασία έως 105 ο C και πίεση έως 400 bar. Στον πίνακα 6.3 εμφανίζεται η εξάρτηση της δραστικότητας και της σταθερότητας ορισμένων βιομηχανικών ενζύμων μικροβιακής προέλευσης ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Πίνακας 6.3. Όρια δραστικότητας ( ) και σταθερότητας ( ) ορισμένων βιομηχανικών ενζύμων μικροβιακής προέλευσης συναρτήσει της θερμοκρασίας. Ένζυμα Μικροοργανισμός Bέλτιστη περιοχή δραστικότητας/σταθερότητας * Θερμ/σία ( ο C) Πρωτεϊνάση Πρωτεϊνάση α-αμυλάση β-αμυλάση β-αμυλάση β-γαλακτοζιδάση Aspergillus niger Bacillus subtilis Aspergillus oryzae Bacillus subtilis Baciluslichen iformis Aspergillus oryzae Iσομεράσητηςξ Bacilus υλόζης coagulans * 80% της βέλτιστης τιμής. 149

158 6.4 Παραγωγή ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα Η παραγωγή ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα είναι σήμερα εφικτή μέσω της τεχνολογίας ζυμώσεων, η οποία επιτρέπει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών χρησιμοποιώντας φθηνές πρώτες ύλες και κάτω από απόλυτα ελεγχόμενες συνθήκες. Το γεγονός αυτό, αφενός μειώνει το κόστος της διαδικασίας, αφετέρου εξασφαλίζει ομοιογένεια στο τελικό προϊόν (ένζυμο). Η παραγωγικότητα μιας διεργασίας παραγωγής ενζύμων μπορεί να αυξηθεί δραματικά με την αριστοποίηση των συνθηκών ανάπτυξης σε βιοαντιδραστήρα. H προσθήκη κατάλληλων υποστρωμάτων στο μέσο καλλιέργειας του μικροοργανισμού είναι δυνατό να οδηγήσει σε εντυπωσιακή αύξηση (έως και 1000 φορές) της παραγόμενης ποσότητας ενός συγκεκριμένου ενζύμου. Η παραγωγή πολλών καταβολικών ενζύμων είναι δυνατό να αυξηθεί μέσω της διαδικασίας αυτής. Για παράδειγμα, η βιοσύνθεση και κατά συνέπεια η παραγωγή της ινβερτάσης επάγεται από την προσθήκη στο μέσο ανάπτυξης σακχαρόζης, η παραγωγή της αμυλάσης αντίστοιχα επάγεται από το άμυλο και της λιπάσης από την προσθήκη λιπαρών οξέων και τριγλυκεριδίων. Το συγκριτικά απλό γενετικό υλικό των μικροοργανισμών επιτρέπει τη σχετικά εύκολη διαχείρισή του με τεχνικές της γενετικής μηχανικής, με σκοπό την αύξηση της παραγωγικότητας σε τελικό προϊόν (ένζυμο). Ο μικροοργανισμός επιλέγεται από συλλογές καλλιεργειών, είτε προκύπτει μέσω της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA, είτε απομονώνεται από το κατάλληλο οικολογικό περιβάλλον, στο οποίο επιβιώνει αποικοδομώντας μια ένωση που βρίσκεται σε μεγάλη περιεκτικότητα στο περιβάλλον αυτό (π.χ. ένας βιομηχανικός ρύπος στο στενό οικολογικό περιβάλλον μιας ρυπογόνου βιομηχανίας). Η αύξηση της παραγωγικότητας ενός μικροοργανισμού για ένα συγκεκριμένο ένζυμο μπορεί να επιτευχθεί μέσω μεταλλάξεων και επιλογών. Η μεθοδολογία όμως αυτή δεν επιτρέπει τον έλεγχο των επιθυμητών γενετικών αλλαγών. Αντίθετα, η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA επιτρέπει τις εκλεκτικές και ελεγχόμενες μεταλλάξεις που οδηγούν σε κατευθυνόμενες γενετικές αλλαγές. Με την εφαρμογή τεχνικών της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA είναι δυνατή η απομόνωση του γονιδίου που κωδικεύει το ένζυμο, η ενσωμάτωσή του σε φορέα κλωνοποίησης (πλασμιδικό ή ιικό φορέα) και τέλος η εισαγωγή του σε κύτταρο ξενιστή για την έκφρασή του. Οι κυριότεροι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για το σκοπό 150

159 αυτό είναι το βακτήριο E. coli, οι μύκητες του γένους Aspergillus και Fusarium και ο ζυμομύκητας του γένους Saccharomyces. Ένζυμα που προέρχονται από προκαρυωτικούς οργανισμούς μπορούν να παραχθούν σε μεγάλη κλίμακα χρησιμοποιώντας ως ξενιστή ανασυνδυασμένο βακτήριο E.coli. Σε κύτταρα ξενιστή E. coli εισάγεται πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο που κωδικεύει το συγκεκριμένο ένζυμο, καθώς και γονίδιο που κωδικοποιεί ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά (αμπικιλίνη, νεομυκίνη), καθώς και έναν επαγωγέα όπως το TAC (κωδικόνιο ειδικό για την επαγωγή από λακτόζη). Σχετικά υψηλή παραγωγή επιτυγχάνεται σε ζύμωση ημιδιαλείποντος έργου σε βιοαντιδρασήρες χωρητικότητας από 3000 έως L. Μύκητες, όπως αυτοί από Aspergillus, Fusarium και Pichia, είναι κατάλληλοι για την παραγωγή γλυκοζυλιωμένων ενζύμων, δηλ. αυτών που προέρχονται από μύκητες ή ζώα. Το γονίδιο του ενζύμου ενσωματώνεται απευθείας στο χρωμοσωμικό DNA μαζί με έναν προαγωγέα (promoter). Oι ανασυνδυασμένοι ξενιστές μπορούν να αναπτύσσονται σε βιοαντιδραστήρες με παρόμοιο τρόπο με τις μη ανασυνδυασμένες καλλιέργειες, ενώ υψηλές συγκεντρώσεις κυττάρων μπορούν να σημειωθούν χρησιμοποιώντας ως θρεπτικό υλικό χαμηλού κόστους ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Στο σχήμα 6.1 παρουσιάζονται τα βασικά στάδια που αφορούν στην παραγωγή ενός ενζύμου μέσω της έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου σε ένα ξενιστή. Η επαγωγή της παραγωγής ενός ενζύμου, το οποίο συνδέεται με την ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού, μπορεί να επιτευχθεί με κάποιον επαγωγέα (inducer), που συνήθως είναι το υπόστρωμά του. Το επίπεδο της επαγωγής μπορεί να είναι πολύ υψηλό και η παραγωγή του ενζύμου να αυξηθεί έως και πάνω από 1000 φορές σε σχέση με την περίπτωση όπου ο επαγωγέας απουσιάζει. Πολλά καταβολικά ένζυμα επάγονται από τα υποστρώματά τους, όπως για παράδειγμα: η ινβερτάση από σακχαρόζη, η αμυλάση από το άμυλο, η β-γαλακτοζιδάση από γαλακτόζη. Σε ορισμένες περιπτώσεις η επαγωγή μπορεί να γίνει από τα προϊόντα της ενζυμικής αντίδρασης ή και από ενδιάμεσα προϊόντα, όπως για παράδειγμα η λιπάση από λιπαρά οξέα και η ξυλανάση από ξυλοβιόζη. 151

160 Αναγνώριση του ενζύμου -στόχου Ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού της δραστικότητά του (assay) Απομόνωση του ενζύμου Ανίχνευση του γονιδίου με βάση την πληροφορία από την πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης Ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της πρωτεΐνης Κατασκευή ή απομόνωση του γονιδίου και έκφρασή του στον ξενιστή Καθαρισμός του ενζύμου Σχήμα 6.1. Στάδια για την παραγωγή σε μεγάλη κλίμακα ενός ανασυνδυασμένου ενζύμου Ανάπτυξη σε βιοαντιδραστήρα του ενζύμου Τα περισσότερα βιομηχανικά ένζυμα παράγονται από ένα περιορισμένο αριθμό μικροοργανισμών (11 μύκητες, 4 ζυμομύκητες και 8 βακτήρια), οι οποίοι έχουν χαρακτηρισθεί ασφαλείς (σύμφωνα με διεθνείς οδηγίες που αφορούν θέματα ελέγχου και ασφάλειας). Οι κυριότεροι από τους μικροοργανισμούς αυτούς, πέρα από τους παραπάνω, είναι τα βακτήρια των γενών Bacillus, Lactobacillus και Streptomyces, καθώς και μύκητες των γενών Penicillium, Mucor και Rhizopus. Η χρήση ενζύμων μικροβιακής προέλευσης σε διεργασίες παραγωγής και επεξεργασίας τροφίμων, αλλά και προϊόντων με θεραπευτική και φαρμακευτική χρήση, προϋποθέτει τη μη τοξικότητά τους και την πλήρη απουσία οποιασδήποτε επιπλοκής ανοσολογικής φύσης, που μπορεί να επιφέρει το ενζυμικό παρασκεύασμα. 152

161 Γενικότερα, οι τεχνικές της γενετικής μηχανικής επέτρεψαν την παραγωγή μικροβιακών ενζύμων μέσω ζυμώσεων, μειώνοντας το κόστος παραγωγής τους. Παράλληλα, η εφαρμογή τεχνικών της πρωτεϊνικής και ενζυμικής μηχανικής (βλ. κεφάλαιο 6) επιτρέπει σε πολλές περιπτώσεις την τροποποίηση των ιδιοτήτων των ενζύμων, που σχετίζονται με την δραστικότητα, την εξειδίκευση και τη σταθερότητά τους σε διάφορες διεργασίες. 6.5 Mέθοδοι ανάκτησης και καθαρισμού ενζύμων Η διαδικασία καθαρισμού των ενζύμων, με σκοπό την εφαρμογή τους σε βιομηχανικές διαδικασίες, είναι δυνατό να διαφέρει σημαντικά από αυτή που εφαρμόζεται στο εργαστήριο, κυρίως για πρακτικούς, αλλά και για οικονομικούς λόγους. Σε γενικές γραμμές, το μέγεθος της κλίμακας που αφορά στον καθαρισμό ενζύμων και γενικότερα των βιομορίων, σε συνδυασμό βέβαια και με τον επιθυμητό βαθμό καθαρισμού, καθορίζει τις τεχνικές διαχωρισμού που θα εφαρμοσθούν. Για παράδειγμα, η χρωματογραφία μοριακής διήθησης, μέθοδος που εφαρμόζεται με επιτυχία στο εργαστήριο, επιτρέπει το διαχωρισμό βιομορίων με βάση το μοριακό βάρος τους, λειτουργώντας όμως αποτελεσματικά μόνο στην περίπτωση όπου ο όγκος του δείγματος είναι έως 5% του ολικού όγκου της χρωματογραφικής στήλης. Κατά συνέπεια, η εφαρμογή της τεχνικής σε βιομηχανική κλίμακα θα απαιτούσε στήλες πολύ μεγάλου όγκου, καθιστώντας έτσι τη διαδικασία οικονομικά ασύμφορη. Πρέπει να τονισθεί, ότι δεν υπάρχει μια καθολική μεθοδολογία καθαρισμού, η οποία μπορεί να εφαρμοσθεί για όλα τα ένζυμα. Στην περίπτωση του καθαρισμού βιομηχανικών ενζύμων, η μεθοδολογία και οι τεχνικές που θα εφαρμοσθούν θα πρέπει αφενός να εξασφαλίζουν όσο το δυνατόν περισσότερο τη διατήρηση της ενζυμικής δραστικότητας και αφετέρου να χαρακτηρίζονται από το χαμηλότερο δυνατό κόστος. Ο χειρισμός ευαίσθητων βιολογικών μορίων, όπως είναι τα ένζυμα, κατά την εφαρμογή των σταδίων καθαρισμού (κάθετης επεξεργασίας) προϋποθέτει τον έλεγχο και τη ρύθμιση όλων των παραγόντων που επιδρούν στη δραστικότητα και σταθερότητά τους, όπως είναι το ph, η θερμοκρασία, η ιοντική ισχύς, καθώς και η παρουσία αναστολέων της ενζυμικής δράσης. Η διατήρηση της ενζυμικής δραστικότητας και η επίδραση των παραπάνω παραγόντων στις καταλυτικές ιδιότητες, ποικίλει από ένζυμο σε ένζυμο. Συνήθως, τα εξωκυτταρικά ένζυμα είναι φύση σταθερότερα από τα ενδοκυτταρικά. Θα πρέπει να τονισθεί ότι ορισμένοι 153

162 παράγοντες όπως το ph, η συγκέντρωση οξυγόνου, η παρουσία μεταβολιτών ή η δράση πρωτεολυτικών ενζύμων, διαφοροποιούνται σε σημαντικό βαθμό μετά τη διάρρηξη του κυττάρου (πρωταρχικό στάδιο στον καθαρισμό ενδοκυτταρικών ενζύμων). Αυτό συχνά έχει ως αποτέλεσμα τη μερική ή και ολική απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας στο νέο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Για να μειωθεί η αδρανοποίηση των ενζύμων, η διαδικασία καθαρισμού πραγματοποιείται σε χαμηλές θερμοκρασίες (4 ο C) χρησιμοποιώντας κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα, των οποίων το pη είναι συνήθως κοντά στο αντίστοιχο ενδοκυτταρικό (ph 6-8). Παράλληλα, η προσθήκη αντιδραστηρίων, που σταθεροποιούν τη λειτουργία των ενζύμων, θεωρείται σε ορισμένες περιπτώσεις απαραίτητη. Με σκοπό τον περιορισμό ανεπιθύμητων χημικών τροποποιήσεων στο ενζυμικό μόριο, όπως είναι για παράδειγμα η οξείδωση των σουλφυδρυλομάδων των υπολειμμάτων κυστεΐνης, προστίθενται στο ρυθμιστικό διάλυμα αναγωγικά αντιδραστήρια, όπως η β- μερκαπτοαιθανόλη ή η διθειοθρεϊτόλη, καθώς και ενώσεις, όπως το αιθυλενοδινιτριλο-τετραοξικό οξύ (ΕDTA), οι οποίες δεσμεύουν (σχηματίζοντας σύμπλοκα) τα μεταλλοϊόντα που επιταχύνουν τις αντιδράσεις οξείδωσης. Συχνά, η προσθήκη αναστολέων των πρωτεασών, όπως το φαινυλομεθυλο-σουλφονυλο-φθορίδιο (PMSF), θεωρείται απαραίτητη για την αναστολή της ανεπιθύμητης πρωτεολυτικής δράσης. Στον πίνακα 6.4 αναφέρονται τα στάδια και οι τεχνικές που εφαρμόζονται για τον καθαρισμό των ενδοκυτταρικών ενζύμων. Η αρχή των περισσοτέρων τεχνικών που χρησιμοποιούνται στην κάθετη επεξεργασία των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών αναπτύσσεται στο κεφάλαιο 13. Ανάκτηση εξωκυτταρικών ενζύμων Στην περίπτωση των εξωκυτταρικών ενζύμων, τα στάδια καθαρισμού απλοποιούνται, καθώς μετά το πρώτο κιόλας στάδιο που αφορά στο διαχωρισμό της υγρής φάσης (στην οποία εντοπίζεται το ένζυμο) από τα στερεά (κύτταρα), το ένζυμο είναι σχετικά καθαρό και μπορεί απευθείας να χρησιμοποιηθεί σε ορισμένες εφαρμογές. Η διαδικασία περαιτέρω καθαρισμού των ενδοκυτταρικών ενζύμων είναι όμοια με αυτή που ακολουθείται για τα ενδοκυτταρικά ένζυμα, μετά βέβαια τη διάρρηξη των κυττάρων και την απομάκρυνση των κυτταρικών σωματιδίων ή και των ενδοκυτταρικών βιομακρομορίων (DNA, RNA). 154

163 Ανάκτηση ενδοκυτταρικών ενζύμων Στην περίπτωση των ενδοκυτταρικών ενζύμων, η διαδικασία καθαρισμού προϋποθέτει αρχικά τη διάρρηξη των κυττάρων, (ομογενοποίηση με μηχανικές ή μη μηχανικές τεχνικές), με σκοπό την έξοδο του συνολικού περιεχομένου μαζί με το συγκεκριμένο ένζυμο στην υγρή φάση (ρυθμιστικό διάλυμα). Το ένζυμο που μας ενδιαφέρει εντοπίζεται πιθανά είτε στο κυτταρόπλασμα, είτε βρίσκεται δεσμευμένο στην κυτταρική μεμβράνη. Ακολουθεί ο διαχωρισμός της υγρής φάσης, στην οποία εντοπίζεται το ένζυμο και η απομάκρυνση των ανεπιθύμητων στερεών (θραύσματα κυττάρου κλπ) με τεχνικές, όπως η φυγοκέντρηση και η διήθηση. Η φυγοκέντρηση εφαρμόζεται ευρέως σε εργαστηριακή κλίμακα, όχι όμως και σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται κυρίως η τεχνική της διήθησης και υπερδιήθησης. Η παρουσία λιπιδίων συχνά δημιουργεί πρόβλημα σε διεργασίες, όπως η φυγοκέντρηση. Η απομάκρυνση των λιπιδίων επιτυγχάνεται μέσω της υγρής εκχύλισης, ενώ η τεχνική της καθίζησης με ακετόνη αποτελεί συνήθη τρόπο για την απομάκρυνση πρωτεϊνών από περιβάλλον μεγάλης περιεκτικότητας σε λιπίδια. Στην ιδιαίτερη περίπτωση όπου το ένζυμο εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη, απαιτείται η προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης επιφανειακά ενεργών ουσιών (επιφανειοενεργών ή απορρυπαντικών), η παρουσία των οποίων συμβάλλει στην απομάκρυνσή του από τη μεμβράνη. Οι τεχνικές διάρρηξης των κυττάρων που εφαρμόζονται εξαρτώνται κατά κύριο λόγο από το είδος των κυττάρων που χρησιμοποιούνται ως πηγή των ενζύμων, όπως αυτό περιγράφεται στο κεφάλαιο 13. Στο δεύτερο επίπεδο καθαρισμού, εφαρμόζοντας τεχνικές, όπως η κατακρήμνιση με άλατα, οργανικούς διαλύτες, πολυμερή ή με αλλαγή του ph, αλλά και με την εφαρμογή της τεχνικής της κατανομής σε υδατικό διφασικό σύστημα (βλ. & 13.3), επιτυγχάνεται η απομάκρυνση των νουκλεϊκών οξέων, καθώς και μέρους πρωτεϊνών. Η απομάκρυνση των νουκλεϊκών οξέων βασίζεται στην προσθήκη θετικά φορτισμένων ενώσεων (όπως το πολυαιθυλεναμίδιο, η πολυλυσίνη, το κατιοντικό απορρυπαντικό βρωμιούχο κετυλοτριμεθυλαμμώνιο CTAB, η θειική πρωταμίνη), οι οποίες αλληλεπιδρούν σχηματίζοντας σύμπλοκα με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες των νουκλεϊκών οξέων. Τα σύμπλοκα αυτά καθιζάνουν και απομακρύνονται με φυγοκέντρηση. Τελευταία χρησιμοποιείται ενζυμική μέθοδος που βασίζεται στην κατεργασία με νουκλεάσες 155

164 Πίνακας 6.4. Στάδια και τεχνικές στην κατιούσα επεξεργασία ενζύμων Σκοπός σταδίου Αρχικό στάδιο καθαρισμού Τεχνικές Παραλαβή κυττάρων (διαχωρισμός υγρών-στερεών) Θραύση κυττάρων Απομάκρυνση στερεών (θραύσματα κυττάρων, κυτταρική μεμβράνη κλπ) Μηχανικές τεχνικές Φυγοκέντρηση ή διήθηση Εφαρμογή υπερήχων, ή υψηλής πίεσης, ομογενοποίηση, λυοτρίβηση Στάδιο χαμηλού καθαρισμού Μη μηχανικές τεχνικές Κατεργασία με απορρυπαντικά ή ένζυμα, Εφαρμογή ωσμωτικού σοκ, Επεξεργασία με αλκαλικό διάλυμα Φυγοκέντρηση ή διήθηση Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων Απομάκρυνση μέρους πρωτεϊνών Κατακρήμνιση, ενζυμική υδρόλυση Κατακρήμνιση με άλατα ή οργανικούς διαλύτες Κατανομή σε διφασικό σύστημα υγρού-υγρού Απομάκρυνση πρωτεϊνών Τελικός καθαρισμός Στάδιο υψηλού καθαρισμού Υγρή χρωματογραφία στήλης (μοριακού ηθμού, ιοντοαλλαγής, συγγένειας, υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων κ.ά) Μορφοποίηση τελικού προϊόντος Συμπύκνωση, σταθεροποίηση, Υπερδιήθηση, Κατακρήμνιση, Λυοφίληση συσκευασία, ποιοτικός έλεγχος. Στο δεύτερο επίπεδο καθαρισμού, επιτυγχάνεται η δραστική μείωση του όγκου του ενζυμικού διαλύματος (έως και 20 φορές), γεγονός που διευκολύνει στη συνέχεια την εφαρμογή των χρωματογραφικών τεχνικών, όπως της χρωματογραφίας διαπερατότητας, ιοντοανταλλαγής, συγγένειας και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, που αφορούν στο τρίτο επίπεδο καθαρισμού ενζύμων. Η χρωματογραφία της ιοντοανταλλαγής είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη τεχνική και ακολουθεί η 156

165 χρωματογραφία συγγένειας, η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλή εκλεκτικότητα και τέλος η χρωματογραφία διαπερατότητας, η οποία κυρίως εφαρμόζεται σε εργαστηριακή κλίμακα. Τέλος, η υδρόφοβη χρωματογραφία συνήθως εφαρμόζεται όταν η ιοντική ισχύς του πρωτεϊνικού διαλύματος είναι υψηλή, όπως στην περίπτωση της κατακρήμνισης με άλατα ή μετά από χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Οι χρωματογραφικές αυτές τεχνικές συνδυάζονται τόσο μεταξύ τους, όσο και με άλλες διεργασίες, όπως είναι η κατανομή σε υδατικά διφασικά συστήματα, η υπερδιήθηση, η επεξεργασία με οργανικούς διαλύτες, κ.ά.. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των τεχνικών της υγρής χρωματογραφίας αναφέρονται στο κεφάλαιο Σταθεροποίηση ενζύμων Η χρησιμοποίηση των ενζύμων σε διαδικασίες και εφαρμογές με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον προϋποθέτει τη διατήρηση της δραστικότητάς τους στις συνθήκες εφαρμογής τους, οι οποίες καθορίζονται από παράγοντες όπως το ph, η θερμοκρασία, η φύση του μέσου, η παρουσία παραγόντων που αλληλεπιδρούν με τα ενζυμικά μόρια και αποδιατάσσουν την τρισδιάστατη δομή τους και οδηγούν στην αδρανοποίησή τους, καθώς και διάφοροι άλλοι παράγοντες. Η δυνατότητα εφαρμογής ενός ενζύμου εξαρτάται μεταξύ άλλων τόσο από τη σταθερότητα αποθήκευσης, όσο και από τη λειτουργική σταθερότητα. Η σταθερότητα αποθήκευσης αναφέρεται σε ένα ένζυμο, το οποίο διατηρεί τις καταλυτικές του ιδιότητες στο χρονικό διάστημα ανάμεσα στην παραγωγή και τη χρήση. Η λειτουργική σταθερότητα περιγράφει τη διατήρηση της ενζυμικής δραστικότητας κατά τη διάρκεια μίας διεργασίας. Η αύξηση της ενζυμικής σταθερότητας μπορεί να επιτευχθεί με διάφορες στρατηγικές, στις οποίες περιλαμβάνονται: Η ακινητοποίηση σε κάποιο στερεό φορέα με φυσικές ή χημικές μεθόδους (βλ. κεφάλαιο 8). Η πρωτεϊνική μηχανική (protein engineering), η οποία αφορά στην τροποποίηση της δομής των ενζύμων με ενζυμικές ή χημικές μεθόδους, καθώς και μεθόδους της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA (βλ. κεφάλαιο 6). Η μηχανική του μέσου (medium engineering), η οποία αναφέρεται στον έλεγχο του περιβάλλοντος του ενζύμου και κατά συνέπεια των ιδιοτήτων του και της 157

166 σταθερότητάς του με βάση τις φυσικοχημικές ιδιότητες (πολικότητα, υδροφιλικότητα, ιξώδες, κ.ά) του μέσου, στο οποίο βρίσκεται. Εκτενέστερη αναφορά στις μεθόδους αυτές γίνεται σε επόμενα κεφάλαια του βιβλίου αυτού Νομοθεσία και κανόνες ασφάλειας στην εφαρμογή των ενζύμων Aν και τα ένζυμα θεωρούνται φυσικά προϊόντα και η παραδοσιακή χρήση τους στη παρασκευή τροφίμων και ποτών αποδεικνύει σε γενικές γραμμές την έλλειψη κινδύνου για τον καταναλωτή, η εφαρμογή τους σε διάφορες διεργασίες υπόκειται σε ελέγχους και περιορισμούς. Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση της ανεξέλεγκτης και βιαστικής εφαρμογής των ενζύμων στη βιομηχανία απορρυπαντικών κατά τη δεκαετία του 1960, η οποία συνοδεύτηκε από ανεπιθύμητες αλλεργικές αντιδράσεις και δερματικές παθήσεις. Σήμερα, πολλά ένζυμα προέρχονται από στελέχη μικροοργανισμών που έχουν χαρακτηρισθεί ασφαλή (Generally Recognized As Safe, GRAS), ενώ η παρασκευή τους γίνεται με καθορισμένες διαδικασίες, ώστε να ικανοποιούνται συγκεκριμένα κριτήρια ασφάλειας (Good Manufacturing Practice, GMP). Παράλληλα, μεγάλος είναι σήμερα ο αριθμός ενζύμων που προέρχεται μέσω της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA από μικροοργανισμούς, όπως το βακτήριο Escherichia coli, οι μύκητες του γένους Aspergillus και Fusarium και ο ζυμομύκητας του γένους Saccharomyces. Για τα ένζυμα που προέρχονται από ζωικούς και φυτικούς ιστούς, δεν απαιτούνται τοξικολογικοί έλεγχοι, ενώ τα ένζυμα που προέρχονται από μη παθογενείς μικροοργανισμούς υπόκεινται σε περιορισμένους τοξικολογικούς ελέγχους. Στην περίπτωση που τα ένζυμα προέρχονται από άγνωστα στελέχη μικροοργανισμών, οι έλεγχοι περιλαμβάνουν τη δοκιμή τους σε πειραματόζωα. Η εφαρμογή που μπορεί να έχει το ενζυμικό παρασκεύασμα καθορίζει τα κριτήρια και τις τεχνικές του ποιοτικού ελέγχου των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών. Στην περίπτωση αναλυτικών και διαγνωστικών ενζύμων, τα ενζυμικά παρασκευάσματα που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας. Ιδιαίτερα στην περίπτωση θεραπευτικών πρωτεϊνών και ενζύμων, εφαρμόζονται αυστηρότατες διεργασίες ποιοτικού ελέγχου, οι οποίες βασίζονται κυρίως σε βιολογικές μετρήσεις και μεθόδους για την ανίχνευση ανεπιθύμητων προσμίξεων, που μπορεί να προκαλέσουν ανοσολογικές ή ανοσοδιεγερτικές επιπλοκές. Αντίθετα, τα βιομηχανικά 158

167 ένζυμα είναι παρασκευάσματα περιορισμένης καθαρότητας. Ο ποιοτικός έλεγχος των βιομηχανικών ενζύμων αποσκοπεί στη διασφάλιση συγκεκριμένης καταλυτικής δραστικότητας ανά μονάδα βάρους του παρασκευάσματος. Τέλος, η εφαρμογή των ενζύμων για την κατάλυση αντιδράσεων βιομηχανικού ενδιαφέροντος δεν απαιτεί υψηλού βαθμού καθαρότητας ενζυμικά παρασκευάσματα, προϋποθέτει όμως τον καθαρισμό του τελικού προϊόντος και βέβαια τον αυστηρό ποιοτικό έλεγχο αυτού. 159

168 160

169 7. ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ 7.1. Στόχοι της ενζυμικής μηχανικής Μέχρι πριν μερικά χρόνια, ο όρος βιομηχανικά ένζυμα ήταν ένας μη συμβατός όρος, κυρίως ως αποτέλεσμα της μειωμένης σταθερότητας των ενζύμων στις συνθήκες πολλών βιομηχανικών διεργασιών. Η δομή των ενζύμων, που διασφαλίζει την καταλυτική τους δραστικότητα, σε μεγάλο βαθμό σταθεροποιείται από ευαίσθητους μη ομοιοπολικούς δεσμούς. Oι δεσμοί αυτοί εύκολα διασπώνται σε μη φυσιολογικές συνθήκες (όπως αυτές σε μια βιομηχανική διαδικασία), οδηγώντας στη μετουσίωση των πρωτεϊνών και βέβαια στην απενεργοποίηση των ενζύμων. Βέβαια, ορισμένες εξαιρέσεις έχουν διαπιστωθεί, που αφορούν ένζυμα τα οποία παραμένουν δραστικά σε ακραίες συνθήκες ph, θερμοκρασίας, πίεσης και ιοντικής ισχύς, ή δεν αποδιατάσσονται παρουσία απορρυπαντικών ή οργανικών διαλυτών. Ακόμη και στην περίπτωση που οι συνθήκες αυτές δεν είναι ζητούμενες σε μια βιομηχανική διαδικασία, η σταθερότητα των ενζύμων στις ακραίες συνθήκες θεωρείται πολύτιμη, κυρίως σε εμπορικούς βιοαντιδραστήρες, των οποίων οι συνθήκες λειτουργίας δεν ελέγχονται με ακρίβεια. Για πολλά χρόνια, ο προσδιορισμός νέων βιοκαταλυτών με επιθυμητές ιδιότητες βασιζόταν στην επίπονη και χρονοβόρα διαλογή μικροβιακών στελεχών. Σήμερα, σχεδόν όλοι ο βιοκαταλύτες που χρησιμοποιούνται προέρχονται από λίγους σχετικά οργανισμούς, οι οποίοι μπορούν να αναπτυχθούν σε ελεγχόμενες συνθήκες. Ενδεικτικό είναι το γεγονός ότι, μόνο το 1% του συνόλου των μικροοργανισμών καλλιεργούνται. Παράλληλα όμως, ένα ένζυμο είναι δυνατόν να τροποποιηθεί σε μοριακό επίπεδο, με σκοπό την τροποποίηση των καταλυτικών του ιδιοτήτων ή της εξειδίκευσης ως προς το υπόστρωμα, ή ακόμη και την αύξηση της σταθερότητάς του. Ο επιστημονικός αυτός κλάδος, που στοχεύει στην ανάπτυξη μεθόδων για το σχεδιασμό πρωτεϊνών (και ενζύμων) και την τροποποίηση της δομής τους σε μοριακό επίπεδο, ονομάζεται πρωτεϊνική (ενζυμική) μηχανική. Η τροποποίηση σε μοριακό επίπεδο της δομής μιας πρωτεΐνης μπορεί να γίνει τόσο με χημικές και ενζυμικές μεθόδους, όσο και με τεχνικές της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA. Δύο κύριες στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί: α) ο ορθολογικός σχεδιασμός ήδη υπαρχόντων βιοκαταλυτών, κυρίως με την τεχνική της 161

170 τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης και β) η παραγωγή νέων βιοκαταλυτών μέσω της εφαρμογής «εξελικτικών» μεθόδων πρωτεϊνικού σχεδιασμού (κατευθυνόμενης εξέλιξης ή μοριακής εξέλιξης directed or molecular evolution), κυρίως μέσω της εισαγωγής τυχαίων μεταλλάξεων και παράλληλα, τον in vitro ανασυνδυασμό των γονιδίων. Έτσι, μέσω κατευθυνόμενων μεταλλάξεων στο γονίδιο μιας πρωτεΐνης είναι δυνατή η αλλαγή συγκεκριμένων αμινοξέων στο πρωτεϊνικό μόριο, γεγονός που οδηγεί και στην τροποποίηση των ιδιοτήτων της. Η εφαρμογή της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA για το σχεδιασμό των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών (που ονομάζονται χιμαιρικές), διευκολύνεται από την εφαρμογή υπολογιστικών προγραμμάτων, τα οποία επιτρέπουν την πρόβλεψη των μεταβολών στη δομή μιας πρωτεΐνης, που προκαλεί η αντικατάσταση κάποιων αμινοξέων. Η ενζυμική μηχανική, όχι μόνο είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την τροποποίηση των ιδιοτήτων των ενζύμων, με σκοπό την εισαγωγή τους σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες, αλλά αποτελεί και μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη μελέτη και τον προσδιορισμό της σχέσης μεταξύ της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνικών μορίων και της βιολογικής τους δράσης. Οι κύριοι στόχοι της ενζυμικής μηχανικής είναι: 1. Η αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας ως προς το υπόστρωμα. 2. Η τροποποίηση της ενζυμικής εκλεκτικότητας ως προς τα δομικά χαρακτηριστικά των υποστρωμάτων. Συγκεκριμένα, η τροποποίηση της καταλυτικής περιοχής του ενζύμου οδηγεί σε αλλαγή τόσο της τοπο-εκλεκτικότητας, όσο και της εναντιοεκλεκτικότητας. 3. Η αύξηση της θερμοανθεκτικότητας ενός ενζύμου μέσω της ενίσχυσης των εσωτερικών αλληλεπιδράσεων που σταθεροποιούν την τριτοταγή δομή του πρωτεϊνικού μορίου. Η ενίσχυση αυτή μπορεί να επιτευχθεί με την εισαγωγή συγκεκριμένων αμινοξέων στην πρωτεϊνική αλληλουχία, η οποία μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών ή στην αύξηση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων στο εσωτερικό του πρωτεϊνικού μορίου. 4. Η τροποποίηση της εξάρτησης της ενζυμικής δραστικότητας και σταθερότητας από το ph του μέσου, στο οποίο το ένζυμο δρα. Η τροποποίηση αυτή είναι δυνατό να οδηγήσει σε αλλαγή του βέλτιστου ph για την ενζυμική δράση, ή ακόμη και σε μετατόπιση της βέλτιστης τιμής ph σε ακραίες τιμές. Η τροποποίηση αυτή μπορεί να επιτευχθεί, για παράδειγμα, μέσω της μεταβολής του ηλεκτροστατικού 162

171 περιβάλλοντος στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, αποτέλεσμα της εισαγωγής/ αντικατάστασης ενός ή περισσότερων αμινοξέων. 5. Η αύξηση της αντοχής σε οξειδωτικά αντιδραστήρια. Η ιδιότητα αυτή αφορά κυρίως ένζυμα, όπου στο ενεργό κέντρο τους (ή κοντά σε αυτό) εντοπίζονται αμινοξέα των οποίων οι χαρακτηριστικές ομάδες οξειδώνονται εύκολα, όπως η μεθειονίνη, η κυστεΐνη ή η θρυπτοφάνη. Η εισαγωγή, μέσω κατευθυνόμενων μεταλλάξεων, αμινοξέων λιγότερο ευαίσθητων σε οξειδωτικές συνθήκες (όπως η σερίνη, η αλανίνη ή η λευκίνη) αυξάνει τη σταθερότητα των ενζύμων παρουσία οξειδωτικών αντιδραστηρίων. 6. Η αύξηση της σταθερότητας των ενζύμων, η διαλυτοποίησή τους και η έκφραση των καταλυτικών ιδιοτήτων των ενζύμων σε μη υδατικά διαλύματα. Η χημική τροποποίηση των αμινοξέων, που εντοπίζονται στην επιφάνεια του πρωτεϊνικού μορίου, με υδρόφοβα αντιδραστήρια οδηγεί σε αύξηση της συνολικής υδροφοβικότητας των ενζύμων και σε παράλληλη αύξηση της διαλυτοποίησής τους σε μη πολικά μέσα. Παράλληλα, η μη ομοιοπολική τροποποίηση του ενζυμικού μορίου με λιπίδια και επιφανειακά ενεργές ενώσεις (π.χ. απορρυπαντικά) οδηγεί σε τροποποίηση της αλληλεπίδρασης των ενζύμων (πρωτεασών, λιπασών κλπ) με διεπιφάνειες (π.χ. νερό/λάδι ή νερό/αέρας). 7. Η αύξηση της σταθερότητας των ενζύμων σε πρωτεολυτική υδρόλυση. 8. Ο σχεδιασμός και η εφαρμογή μίμων ενζύμων. Η χρησιμοποίηση δηλαδή στη θέση του ενζύμου ενός μορίου που παρουσιάζει καταλυτική δράση μιμούμενος το ένζυμο (όπως τα καταλυτικά αντισώματα). 9. Η συγχώνευση διαφορετικών ενζύμων, που συμμετέχουν σε μια βιοχημική οδό, σε ένα κοινό πρωτεϊνικό μόριο. H εφαρμογή της ενζυμικής μηχανικής στην τροποποίηση των ιδιοτήτων ενζύμων βιομηχανικού ενδιαφέροντος έχει δώσει θεαματικά αποτελέσματα. Χαρακτηριστικά παραδείγματα που αφoρούν στην τροποποίηση ενζύμων, τόσο με χημικές και ενζυμικές μεθόδους, όσο και με τεχνικές της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA (τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση, μοριακή εξέλιξη), αναπτύσσονται στη συνέχεια. 163

172 7.2. Χημική τροποποίηση των ενζύμων Με τον όρο χημική τροποποίηση του ενζύμου εννοούμε οποιαδήποτε μετατροπή της πρωτοταγούς δομής του πρωτεϊνικού μορίου, που έχει ως αποτέλεσμα την τροποποίηση της δραστικότητας ή και σταθερότητάς του. Η χημική τροποποίηση των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται συνήθως μέσω αντιδράσεων αλκυλίωσης ή ακυλίωσης των αμινοξέων με διάφορα αντιδραστήρια. Ανάλογα με τη φύση των αντιδραστηρίων που θα χρησιμοποιηθούν, είναι δυνατή η αύξηση της υδροφοβικότητας, η τροποποίηση του συνολικού ηλεκτρικού φορτίου, αλλά και η εισαγωγή υδατανθρακικών αλυσίδων στο πρωτεϊνικό μόριο, γεγονός που επιφέρει τροποποίηση στη δομή και τη λειτουργία του. Για παράδειγμα, η αύξηση της υδροφοβικότητας ενός ενζύμου και γενικότερα μιας πρωτεΐνης είναι δυνατό να επιτευχθεί τόσο με χημική, όσο και με ενζυμική σύνδεση υδρόφοβων αλυσίδων στο πρωτεϊνικό μόριο. Η χημική τροποποίηση βασίζεται σε αντιδράσεις ακυλίωσης με ανυδρίτες και χλωρίδια οξέων ή ενεργοποιημένων εστέρων λιπαρών οξέων, κυρίως με ελεύθερες αμινο-ομάδες των καταλοίπων λυσίνης (σχήμα 7.1α). Η εισαγωγή υδρόφοβων ομάδων σε ένα πρωτεϊνικό μόριο είναι δυνατό να τροποποιήσει την συμπεριφορά της πρωτεΐνης κοντά σε διεπιφάνειες τύπου νερό/λάδι, νερό/αέρας, στερεή επιφάνεια/νερό, οδηγώντας μάλιστα στην αύξηση της προσρόφησης της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια (βλ. σχήμα 7.1β). Η αύξηση της υδροφοβικότητας των πρωτεϊνών και η τροποποίηση της διεπιφανειακής τους συμπεριφοράς βρίσκει σημαντικές εφαρμογές στη βιομηχανία τροφίμων, αλλά εφαρμόζεται επίσης για τον εγκλωβισμό ενζύμων και αντισωμάτων σε μικκύλια και λιποσώματα, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς των μορίων αυτών σε πολλές εφαρμογές της χημικής και φαρμακευτικής βιομηχανίας. Ενδιαφέρον παράδειγμα χημικής τροποποίησης ενζύμων αφορά στην τροποποίηση της καταλυτικής φύσης ορισμένων πρωτεασών. Η τροποποίηση 15 ελεύθερων αμινομάδων στο μόριο της χυμοθρυψίνης, μέσω αλκυλίωσης με ακρολεΐνη ή ακυλίωσης με ανυδρίτη του ηλεκτρικού οξέος, οδηγεί σε αύξηση της σταθερότητας του ενζύμου. Αξιοσημείωτο παράδειγμα αποτελεί η τροποποίηση της καταλυτικής συμπεριφοράς της χυμοθρυψίνης, η οποία εκφράζεται με απώλεια της ικανότητας υδρόλυσης των πεπτιδικών δεσμών, όταν η ιστιδίνη 57 της καταλυτικής περιοχής του ενζύμου αντιδράσει με το p-νιτροβενζυλο-σουλφονικό οξύ. Το 164

173 τροποποιημένο ένζυμο χρησιμοποιείται με επιτυχία στη σύνθεση ολιγοπεπτιδίων, τα οποία δεν μπορεί να υδρολύσει. α) P NH 2 O + C Cl HCl P NH O C β) P NH C ΛΑΔΙ O Σχήμα 7.1. α) Χημική τροποποίηση ενζύμου P μέσω της ακυλίωσης της αμινο-ομάδας της λυσίνης. β) Αύξηση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης σε μη υδατικό περιβάλλον. Σημαντικό ενδιαφέρον παρουσιάζει, τέλος, η τροποποίηση της δομής πρωτεϊνών μέσω της ομοιοπολικής σύνδεσης μορίων πολυαιθυλενο-γλυκόλης (PEG) με τις ε-αμινομάδες των καταλοίπων λυσίνης της πρωτεΐνης. Η τροποποίηση της δομής συνοδεύεται από μεταβολή ορισμένων ιδιοτήτων των ενζύμων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η τροποποποίηση της L-ασπαριγινάσης. Το ένζυμο καταλύει τη μετατροπή της ασπαραγίνης σε ασπαραγινικό οξύ και χρησιμοποιείται ως θεραπευτικό μέσο για την αντιμετώπιση της λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας. Η χορήγηση του ενζυμικού σκευάσματος συνοδεύεται από μια σειρά παρενεργειών, οι οποίες όμως μειώνονται σημαντικά με την τροποποίηση του ενζύμου με PEG. Η τροποποίηση αυξάνει παράλληλα, τόσο το χρόνο ημιζωής του ενζύμου, όσο και τη σταθερότητά του σε πρωτεολυτική δράση. Η αύξηση της σταθερότητας μετά την τροποποίηση με PEG χαρακτηρίζει αρκετές περιπτώσεις ενζύμων και πρωτεϊνών με θεραπευτικές εφαρμογές. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η δισμουτάση του υπεροξειδίου, ένζυμο που βρίσκει εφαρμογή στην αντιμετώπιση φλεγμονών, καθώς και η αιμοσφαιρίνη, η οποία μετά την τροποποίησή της με PEG βρίσκει εφαρμογή ως υποκατάστατο του αίματος. 7.3 Ομοιοπολική σύνδεση ενζύμου-συνενζύμου Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η δυνατότητα τροποποίησης ενζύμων μέσω της ομοιοπολικής σύνδεσής τους με κάποιο συνένζυμο, που οδηγεί στο σχηματισμό ενός σταθερού καταλυτικού συμπλόκου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η 165

174 σύνδεση συνενζύμου, όπως το νικοτιναμιδο-αδενινoδινουκλεοτίδιο (NAD + ) σε οξειδοαναγωγικά ένζυμα, όπως η γαλακτική αφυδρογονάση, ή ένζυμα των οποίων η έκφραση των καταλυτικών ιδιοτήτων δεν απαιτεί την παρουσία συνεζύμου. Για παράδειγμα, η ομοιοπολική σύνδεση ενός φλαβο-υποκαταστάτη στην πρωτεάση παπαΐνη οδηγεί στο σχηματισμό ενός δραστικού ενζυμικού φλαβο-παραγώγου, το οποίο εμφανίζει οξειδοαναγωγική και όχι πρωτεολυτική δράση. Στην περίπτωση αυτή, ο συνδεδεμένος φλαβο-υποκαταστάτης διαδραματίζει το ρόλο φλαβοσυνενζύμου οδηγώντας στο τροποποιημένο ένζυμο. Η οικονομική σημασία της εφαρμογής τροποποιημένων ενζύμων είναι μεγάλη, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις όπου αυτά αντικαθιστούν δαπανηρότερα ένζυμα 7.4 Ενζυμική τροποποίηση ενζύμων Η ενζυμική τροποποίηση των πρωτεϊνών, μέσω ενζυμικά καταλυόμενων αντιδράσεων φωσφορυλίωσης, ακυλίωσης και γλυκοζυλίωσης, αν και έχει μελετηθεί σε εργαστηριακή κλίμακα δεν έχει βρει μέχρι σήμερα εμπορική εφαρμογή. Εξαίρεση αποτελεί η περίπτωση που αφορά στην τροποποίηση των πρωτεϊνών με εξειδικευμένες πρωτεάσες. Χαρακτηριστική περίπτωση αποτελεί η DNA πολυμεράση Ι από Escherichia coli. H πολυμεράση αυτή έχει την ικανότητα υπό ορισμένε συνθήκες να συνθέτει DNA, ενώ παράλληλα υδρολύει DNA καθώς εμφανίζει δραστικότητα 3 5 και 5 3 εξωνουκλεάσης. Ιn vivo αντίθετες αυτές ιδιότητες μπορούν να ρυθμιστούν. Για την vitro χρησιμοποίηση του ενζύμου με σκοπό τη σύνθεση DNA, η ανεπιθύμητη δράση 5 3 εξωνουκλεάσης δεν είναι επιθυμητή. Η υδρόλυση της DNA πολυμεράσης Ι, που καταλύεται από την πρωτεάση σαμπτιλυσίνη Carlsberg, οδηγεί στο σχηματισμό δύο πρωτεϊνικών τμημάτων, τα οποία μπορούν να διαχωριστούν με χρωματογραφία στήλης. Το πρωτεϊνικό τμήμα με το μεγαλύτερο μοριακό βάρος είναι γνωστό ως DNA πολυμεράση Klenow, ένζυμο το οποίο χαρακτηρίζεται ταυτόχρονα από δράση πολυμεράσης Ι και 3 5 DNA εξωνουκλεάσης και χρησιμοποιείται στην in vitro σύνθεση του DNA. Η ενζυμική τροποποίηση της δομής της DNA πολυμεράσης Ι εξαλείφει την ανεπιθύμητη δραστικότητα 5 3 DNA εξωνουκλεάσης, που χαρακτηρίζει τη δράση του ενζύμου in vivo. 166

175 7.5 Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση Η σημειακή ή τοποκατευθυνόμενη (ή θεσηκατευθυνόμενη) μεταλλαξιγένεση (site-directed mutagenesis), έχει ως στόχο την αντικατάσταση συγκεκριμένων αμινοξέων στο ενζυμικό μόριο. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αντικατάστασης των αντίστοιχων βάσεων του γονιδίου. Η αντικατάσταση των βάσεων γίνεται με τεχνικές της μηχανικής του DNA, όπως η ολιγονουκλεοτιδίου τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση (oligonucleotide or side directed mutagenesis). Τα βασικά στάδια της τοποκατεθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης έχουν ως ακολούθως: Αρχικά, το γονίδιο κλωνοποιείται σε μονόκλωνο φορέα DNA (M13). Στη συνέχεια, κατασκευάζεται ένα ολιγονουκλεοτίδιο (με τυπικό μέγεθος 18 κατάλοιπα), ουσιαστικά συμπληρωματικό για εκείνη την περιοχή του γονιδίου που θα μεταλλαχθεί, το οποίο περιέχει όμως ένα λανθασμένα συνδυασμένο νουκλεοτίδιο, έτσι ώστε να προκληθεί η επιθυμητή μεταλλαγή. Με τη χρήση των κατάλληλων ενζύμων ολοκληρώνεται η in vitro σύνθεση του δίκλωνου φορέα. Ακολουθεί η ενίσχυση της ποσότητας του δίκλωνου φορέα και τέλος, η ανίχνευση του μεταλλαγμένου γονιδίου με υβριδιοποίηση με συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο. Η μέθοδος της τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης πλεονεκτεί σε σχέση με τη διαδικασία της μετάλλαξης-επιλογής. Ο βασικός λόγος είναι ότι η μετάλλαξη που ακολουθείται από την επιλογή, σε σχέση με κάποιες ιδιαίτερες ιδιότητες, είναι αρκετά δύσκολη, στην περίπτωση όπου οι αλλαγές στις ιδιότητες της πρωτεϊνηςστόχου είναι ανεπαίσθητες. Παράλληλα, η τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μπορεί να οδηγήσει στην εισαγωγή ενός συγκεκριμένου αμινοξέος σε μια απόλυτα καθορισμένη θέση, ενώ μια τυχαία μετάλλαξη που να οδηγεί στο ίδιο αποτέλεσμα εμφανίζεται τόσο σπάνια, ώστε να θεωρείται μη εφικτή. Πολλά είναι τα παραδείγματα που σχετίζονται με την εφαρμογή της τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης στην τροποποίηση ενζύμων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. H τεχνική αυτή, αν και έδωσε αξιοσημείωτα αποτελέσματα, κυρίως όσο αφορά στην τροποποίηση της εξειδίκευσης των ενζύμων, εντούτοις δε βρίσκει καθολική εφαρμογή, καθώς προϋποθέτει την ολοκληρωμένη γνώση της σχέσης που συνδέει την πρωτοταγή δομή και τη λειτουργία του πρωτεϊνικού μορίου (ενζύμου). Στο σχήμα 7.2 παρουσιάζονται τα κύρια στάδια στο σχεδιασμό, μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης, ενός ενζύμου, με σκοπό την ενσωμάτωσή του σε μια βιομηχανική εφαρμογή. 167

176 Η μέθοδος Μια ευρέως διαδεδομένη μέθοδος είναι αυτή της κλωνοποίησης του γονιδίου ή του cdna σε έναν φορέα (π.χ. φάγος Μ13). Ακολούθως σχεδιάζεται μία ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία, η οποία είναι ομόλογη σε όλες της τις βάσεις γύρω από το τμήμα του κλωνοποιημένου DNA, στο οποίο θέλουμε να εισάγουμε τη μετάλλαξη, εκτός από τη θέση της μετάλλαξης (Σχήμα 7.3). Σε αυτή τη θέση η ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία φέρει όχι το νουκλεοτίδιο το συμπληρωματικό στην άγριου τύπου βάση, αλλά αυτό το οποίο είναι συμπληρωματικό προς το νουκλεοτίδιο της μετάλλαξης. Κατά συνέπεια, ο μεταλλαγμένος αυτός εκκινητής θα αποτελέσει το εναρκτήριο μόριο της 5 ->3 αντιγραφής του εσωτερικού κλώνου του DNA του Μ13. Ακολούθως, μπορεί να γίνει μετασχηματισμός κυττάρων E. coli με το ανασυνδυασμένο γενετικό υλικό του φάγου M13, οπότε και να μελετηθεί το αποτέλεσμα της μετάλλαξης στην υπό μελέτη πρωτεΐνη, η οποία κωδικοποιείται από το μεταλλαγμένο πλέον γονίδιο. Σχήμα 7.2. Βασικά στάδια σχεδιασμού βιομηχανικών ενζύμων μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης 168

177 Αξίζει να σημειωθεί ότι, εάν στην μεταλλαγμένη ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία αφαιρεθούν τρεις κατά σειρά βάσεις, μπορούμε να προκαλέσουμε μετάλλαξη απώλειας ενός αμινοξέος από την πρωτεΐνη. Παρόμοια, η προσθήκη τριών βάσεων στη μεταλλαγμένη ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία μπορεί να μας επιτρέψει τη μελέτη προσθήκης ενός ολόκληρου αμινοξέος στην πρωτεΐνη. Ωστόσο, σε αυτές τις περιπτώσεις καλό είναι οι εκκινητές να είναι μεγάλοι σε μέγεθος και η προκαλούμενη μετάλλαξη στην αλληλουχία τους να βρίσκεται κεντρικά, ώστε να μπορεί να υβριδιστεί στην ομόλογη περιοχή της στο συμπληρωματικό τμήμα DNA του κλωνοποιημένου γονιδίου. Τέλος, στη μεταλλαξιγένεση τύπου κασέτας, το άγριου τύπου γονίδιο πέπτεται με περιοριστική ενδονουκλεάση, κάποιο τμήμα του απομακρύνεται και αντικαθίσταται από άλλη αλληλουχία (ολιγονουκλεοτιδική κασέτα), η οποία φέρει την επιθυμητή μετάλλαξη. Ανασυνδυασμένος φάγος M13 Μεταλλαγμένος εκκινητής Μεταλλαγμένη αλληλουχία Μετασχηματισμός κυττάρων Ε. coli Άγριου τύπου αλληλουχία Άγριου τύπου ομοδιμερές Ετεροδιμερής δομή Αντιγραφή του DNA Σχήμα 7.3 Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση σε γονίδιο το οποίο προηγούμενα έχει κλωνοποιηθεί στο γονιδίωμα του φάγου Μ13. Μεταλλαγμένο ομοδιμερές Οι μοριακές μέθοδοι μεταλλαξιγένεσης, οι οποίες βασίζονται στην τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) είναι πολύ δημοφιλείς τα τελευταία χρόνια. Με την PCR μπορεί να προκληθεί μετάλλαξη αντικατάστασης μίας βάσης από μία άλλη, μετάλλαξη ελλείμματος ή προσθήκης, καθώς επίσης μπορεί να γίνει προσθήκη μιας αλληλουχίας ή μίας χημικής ομάδας στο 5 -άκρο της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Στο σχήμα που ακολουθεί περιγράφεται η διαδικασία εισαγωγής μιας μετάλλαξης σε γονίδιο που έχει ενσωματωθεί σε ένα πλασμίδιο με αντίδραση PCR. 169

178 Σχήμα 7.4 Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση με χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). To μεθυλιωμένο πλασμίδιο περιέχει την αλληλουχία του γονιδίου την οποία επιθυμούμαι να τροποποιήσουμε και να ενισχύσουμε με αντίδραση PCR. Ακολουθεί μετουσίωση του πλασμιδίου με αύξηση της θερμοκρασίας ενώ οι εκκινητές που φέρουν τις επιθυμητές μεταλλάξεις υβριδοποιούνται με τις αλληλουχίες στόχους. Ακολουθεί η επιμήκυνση των εκκινητών με τη δράση της DNA πολυμεράσης με αποτέλεσμα τον σχηματισμό κυκλικών κλώνων DNA. Ακολουθεί η προσθήκη του περιοριστικού ενζύμου DpnI που πέπτει το μεθυλιωμένο DNA. To DNA που προήλθε από την αντίδραση PCR δεν πέπτεται και μπορεί να μετασχηματιστεί στα κύτταρα του ξενιστή. Τα κύτταρα αυτά χρησιμοποιούν τις ενδογενείς λιγάσες για να συγκολλήσουν τα άκρα του DNA. 170

179 Στη συνέχεια θα αναφερθούμε σε χαρακτηριστικά παραδείγματα εφαρμογής της τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης για την τροποποίηση ενζύμων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Παραδείγματα βελτίωσης των ιδιοτήτων ενζύμων με τη μέθοδο του λογικού ΕΝΖΥΜΑ και Χαρακτηριστικά αμινοξέα Συνθετάση τυροσινυλο-trna (στην ενεργό περιοχή υπάρχει η τριάδα Cys35, His48 & Thr51) β-λακταμάση (στο ενεργό κέντρο περιλαμβάνει τα αμινοξέα Ser70, Thr71) Αλκοολική αφυδρογονάση (στην ενεργό περιοχή υπάρχουν τα αμινοξέα Thr48, Thr54, Trp57 & Trp93) Iσομεράση γλυκόζης H Lys253 γλυκοζυλιώνεται παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης και μειώνει τη δραστικότητα και τη σταθερότητα του ενζύμου ενζυμικού ανασυνδυασμού Μεταλλαγή και τροποποίηση Η μεταλλαγή Thr51Ala αυξάνει τη σταθερά εξειδίκευσης kcat/km Oι μεταλλαγές His48Gly & Cys35Gly δεν άλλαξαν την ενέργεια αλληλεπίδρασης με το ΑΤΡ αλλά σταθεροποίησαν τη μεταβατική κατάσταση προάγοντας την κατάλυση. Η μεταλλαγή στην Ser70 τροποποιεί την εξειδίκευση και ταυτόχρονα αυξάνει τη θερμοσταθερότητα και την αντοχή σε πρωτεολυτική διάσπαση Η αντικατάσταση της Thr71 με 19 άλλα αμινοξέα δεν έδωσε κάποια μεταβολή στη δραστικότητα Η μεταλλαγή Trp54Leu αυξάνει τη δραστικότητα για διακλαδιζόμενες αλκοόλες Η μεταλλαγή Trp54Ala αντιστρέφει την εκλεκτικότητα ως προς το μέγεθος των αλκοολών Η μεταλλαγή Lys253Arg αυξάνει σημαντικά τη σταθερότητα Σταθεροποίηση της ισομεράσης της D-ξυλόζης Tο ένζυμο ισομεράση της D-ξυλόζης (ή D-γλυκόζης) καταλύει in vivo τον ισομερισμό της D-ξυλόζης. Το ένζυμο βρίσκει εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα για τη μετατροπή του αμύλου σε σιρόπι υψηλής περιεκτικότητας σε φρουκτόζη, το οποίο χρησιμοποιείται ως γλυκαντικό σε αναψυκτικά. Συγκεκριμένα, το ένζυμο μετατρέπει τη γλυκόζη του αμύλου σε φρουκτόζη. Στη βιομηχανική εφαρμογή της αντίδρασης 171

180 έχει παρατηρηθεί ότι, στη βέλτιστη θερμοκρασία δράσης του ενζύμου η αδρανοποίησή του είναι γρήγορη, σαν αποτέλεσμα της αποδιάταξης της τεταρτοταγούς δομής του, η οποία αποτελείται από τέσσερα μονομερή που συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου και δυνάμεις ηλεκτροστατικής φύσης. Η αποδιάταξη οφείλεται στη χημική γλυκοζυλίωση της ε-αμινομάδας της λυσίνης 253, ως αποτέλεσμα της υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο επανασχεδιασμός του ενζύμου με τη βοήθεια υπολογιστικών προγραμμάτων οδήγησε, μέσω της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης, στην αντικατάσταση της λυσίνης 253 από ένα κατάλοιπο αργινίνης. Η αντικατάσταση αυτή οδηγεί στη μείωση της ταχύτητας γλυκοζυλίωσης και κατ επέκταση στη σταθεροποίηση του ενζύμου, η οποία εκφράζεται με τον τριπλασιασμό του χρόνου ημιζωής στους 60 ο C. Τροποποίηση της εκλεκτικότητας της β-λακταμάσης Οι β-λακταμάσες παράγονται από μικροοργανισμούς με χαρακτηριστική ανθεκτικότητα σε ορισμένα αντιβιοτικά. Τα ένζυμα αυτά καταλύουν τη διάνοιξη (υδρόλυση) του β-λακταμικού δακτυλίου πενικιλλινών και αντιβιοτικών με παρεμφερή δομή, όπως είναι οι κεφαλοσπορίνες. Ο μηχανισμός κατάλυσης των λακταμασών έχει μελετηθεί με τη βοήθεια της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης. Διαπιστώθηκε ότι κυρίαρχο ρόλο στη δράση του ενζύμου διαδραματίζει η σερίνη 70, το υδροξύλιο της οποίας πιθανά αλληλεπιδρά με το καρβονύλιο του λακταμικού δακτυλίου με τρόπο ανάλογο της σερίνης των πρωτεασών και λιπασών. Η αντικατάσταση της σερίνης 70 με άλλο αμινοξύ, όπως είναι η κυστεΐνη, το οποίο επίσης διαθέτει πυρηνόφιλη πλευρική ομάδα, διαπιστώθηκε ότι τροποποιεί την εξειδίκευση του ενζύμου ως προς τη δομή του λακταμικού δακτυλίου του αντιβιοτικού. Συγκεκριμένα, η ενζυμική δραστικότητα επί της πενικιλλίνης σχεδόν εκμηδενίζεται, ενώ αντίθετα παραμένει σταθερή για τις κεφαλοσπορίνες. Με αντίστοιχο τρόπο, μελετήθηκε και διαπιστώθηκε ο ρόλος ενός άλλου αμινοξέος της καταλυτικής περιοχής του ενζύμου, της θρεονίνης 71, στην έκφραση των καταλυτικών ιδιοτήτων της β-λακταμάσης. Η αντικατάσταση της θρεονίνης 71 με άλλα αμινοξέα, αν και δεν μεταβάλλει την καταλυτική δράση των μεταλλαγμένων β-λακταμασών, οδηγεί σε μείωση της ανθεκτικότητας του ενζύμου στην πέψη (υδρόλυση) από θρυψίνη. Η διαπίστωση αυτή οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ο ρόλος 172

181 της θρεονίνης 71 σχετίζεται περισσότερο με τη σταθερότητα της β-λακταμάσης, παρά με τη δέσμευση του υποστρώματος και την κατάλυση της αντίδρασης. Τροποποίηση πρωτεασών Χαρακτηριστικό παράδειγμα τροποποίησης πρωτεασών αποτελεί η σαμπτιλυσίνη (subtilisin), που είναι μια πρωτεάση σερίνης, γνωστό βιομηχανικό ένζυμο με εφαρμογή στα απορρυπαντικά. Για το ένζυμο αυτό, διαπιστώθηκε ότι το αμινοξύ μεθειονίνη 222, που εντοπίζεται κοντά στο ενεργό κέντρο, οξειδώνεται παρουσία οξειδωτικών παραγόντων ή μοριακού οξυγόνου, περιορίζοντας με τον τρόπο αυτό την προσέγγιση του υποστρώματος στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου, με συνέπεια την αναστολή της ενζυμικής δράσης. Για το λόγο αυτό, καθίσταται προβληματική η χρησιμοποίηση του ενζύμου παρουσία οξειδωτικών ενώσεων, όπως αυτές που εντοπίζονται σε απορρυπαντικά και λευκαντικά. Η αντικατάσταση της μεθειονίνης 222 με αμινοξέα, όπως η αλανίνη και η σερίνη, αν και έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της δραστικότητας, παράλληλα οδηγεί σε σημαντική αύξηση της σταθερότητας παρουσία οξειδωτικών παραγόντων, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Αξιοσημείωτη είναι επίσης η δυνατότητα τροποποίησης της εξάρτησης της ενζυμικής δραστικότητας των πρωτεασών από το ph. Για παράδειγμα, στη σαμπτιλυσίνη, η αντικατάσταση του όξινου ασπαρτικού 99, το οποίο εντοπίζεται σε απόσταση Å από το καταλυτικό κέντρο, με μια μη φορτισμένη σερίνη, έχει ως αποτέλεσμα την τροποποίηση της σταθεράς ιοντισμού της ιστιδίνης του καταλυτικού κέντρου επηρεάζοντας το σύνολο των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και κατά συνέπεια την εξάρτηση της ενζυμικής δραστικότητας από το ph. Με αντίστοιχο τρόπο, η επιλεκτική αντικατάσταση αμινοξέων κοντά στο ενεργό κέντρο της παπαΐνης σταθεροποιεί την κατάσταση ιοντισμού του ζεύγους των αμινοξέων (της ιστιδίνης και της κυστεΐνης) του ενεργού κέντρου σε χαμηλές τιμές ph. Αποτέλεσμα της τροποποίησης αυτής είναι η διεύρυνση της δυνατότητας εφαρμογής του τροποποιημένου ενζύμου Μακρομοριακές τροποποιήσεις - Πρωτεΐνες σύντηξης Με την εφαρμογή της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA είναι δυνατή η τροποποίηση της δομής μιας πρωτεΐνης σε μεγαλύτερη έκταση από αυτή που πραγματοποιείται κατά την κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Η τροποποίηση 173

182 (αποτέλεσμα επεμβάσεων σε γενετικό επίπεδο) επιτυγχάνεται με την αποκοπή ολόκληρης αλληλουχίας βάσεων, ή την προσθήκη τμήματος άλλου γονιδίου, οδηγώντας στην τροποποίηση της δομής και λειτουργίας του ενζύμου ή της πρωτεΐνης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα της εφαρμογής τροποποιήσεων σε τέτοιο επίπεδο είναι η σύνθεση πρωτεϊνών σύντηξης (fusion proteins), οι οποίες προκύπτουν από την απλή ένωση δύο ή περισσοτέρων πρωτεϊνικών (ή και πεπτιδικών) αλληλουχιών. Η ένωση αυτή είναι αποτέλεσμα του ανασυνδυασμού των γονιδίων τους σε γειτονικές θέσεις σε ένα φορέα έκφρασης (πλασμίδιο), που οδηγεί στην παραγωγή της πρωτεΐνης σύντηξης. Γενικότρεα οι προσεγγίσεις που εφαρμόζονται συνοψίζονται στον πίνακα που ακολουθεί: Παραδείγματα δημιουργίας υβριδικών ενύμων Τροποποίηση Εφαρμογή-Παραδείγματα Τροποποίηση δευτεροταγών Τροποποίηση ενός NAD + εξαρτώμενου δομικών στοιχείων (π.χ α-έλικας, β- ενζύμου σε NAPD + - εξαρτώμενο στροφή β-πτυχωτή επιφάνεια) με άλλα Σύντηξη δομικών περιοχών, Τροποποίηση της εξειδίκευσης περιοριστικών μοτίβων ή υπομονάδων από ενζύμων μέσω σύντηξης με δομικές περιοχές διαφορετικά ένζυμα που αναγνωρίζουν και δεσμεύουν αλληλουχίες DNA και καταλυτικών στοιχείων από πρωτεάσες Συνδυασμός ολόκληρων ενζύμων διαφορετικής φύσης μέσω σύντηξης των γονιδίων τους Δημιουργία υβριδίων από 2 ή 3 διαφορετικά ένζυμα με αυξημένες καταλυτικές ικανότητες σε σχέση με την περίπτωση όπου μονήρη ένζυμα δρουν σε μίγμα Η μακρομοριακή τροποποίηση που οδηγεί στη σύντηξη των πρωτεϊνών μπορεί να αυξήσει τη σταθερότητα της δομής μιας πρωτεΐνης και να διευκολύνει την απομόνωση και τον καθαρισμό της. Παράλληλα, το πρόσθετο τμήμα, το οποίο συχνά ονομάζεται «ουρά», μπορεί να χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένες φυσικοχημικές ή βιοχημικές ιδιότητες, οι οποίες είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν όχι μόνο για τον 174

183 καθαρισμό, αλλά και για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ή του ενζύμου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα εφαρμογής της μακρομοριακής τροποποίησης στον καθαρισμό των πρωτεϊνών αποτελεί η σύνδεση μιας ολιγοπεπτιδικής «ουράς», όπως για παράδειγμα μιας πολυιστιδίνης ή πολυαργινίνης, στην πρωτεΐνη στόχο, που έτσι αποκτά ισχυρά θετικό φορτίο διευκολύνοντας τον καθαρισμό της με χρήση στήλης κατιοντο-ανταλλάκτη. Μια άλλη εφαρμογή αφορά στην αντιμετώπιση της ανεπιθύμητης πρωτεολυτικής δράσης των πρωτεασών του βακτηρίου Ε. coli, στο οποίο εκφράζεται μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών και ενζύμων. Με την εφαρμογή της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA είναι δυνατή η παραγωγή συμπλόκου (προϊόν σύντηξης), το οποίο αποτελείται κατά σειρά από την πρωτεΐνη, ένα πεπτίδιο και το ένζυμο β-γλυκοζιδάση. Το μέγεθος και η στερεοδιάταξη του συμπλόκου αποτρέπουν την εύκολη προσέγγιση από άλλα ένζυμα, περιορίζοντας έτσι την ανεπιθύμητη υδρολυτική δράση των πρωτεασών του βακτηρίου «Εξελικτικές» μέθοδοι σχεδιασμού νέων βιοκαταλυτών Τα τελευταία 15 χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες μέθοδοι κατευθυνόμενης ή μοριακής εξέλιξης (directed or molecular evolution) για τη βελτίωση των ιδιοτήτων των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών, οι οποίες στοχεύουν στη μίμηση της διαδικασίας της εξέλιξης στο εργαστήριο. Στις μεθόδους αυτές, η αλληλουχία των αμινοξέων στο πρωτεϊνικό μόριο αλλάζει συνεχώς, έως ότου οι ιδιότητες του ενζυμικού μορίου γίνουν οι επιθυμητές. Οι πιο δημοφιλείς στόχοι είναι η αύξηση της δραστικότητας και της σταθερότητας, η τροποποίηση της εκλεκτικότητας, η αύξηση της ανθεκτικότητας σε οξειδωτικούς παράγοντες ή ακραίες τιμές του ph και η αύξηση της σταθερότητας σε οργανικά μέσα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η εφαρμογή των τεχνικών της κατευθυνόμενης ή μοριακής εξέλιξης έχει οδηγήσει σε ένζυμα με βελτιωμένες ιδιότητες, που χρησιμοποιούνται σε βιομηχανικές βιοκαταλυτικές διεργασίες για την παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων, μειώνοντας σημαντικά τα στάδια που απαιτεί μια συμβατική χημική μέθοδος. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται στα εξής τρία στάδια: α) στη δημιουργία μιας δεξαμενής γονιδίων ή μεταλλαγμάτων ενός γονιδίου που κωδικεύει την πρωτεΐνηστόχο, είτε μέσω κατευθυνόμενων μεταλλάξεων, είτε με την εισαγωγή τυχαίων 175

184 μεταλλάξεων και την εισαγωγή τους σε βακτηριακό φορέα έκφρασης β) στον in vitro ανασυνδυασμό των γονιδίων αυτών και γ) στη διαλογή των μεταλλαγμάτων, είτε με βάση την φυσική επιλογή, που βασίζεται στην έκθεση των μεταλλαγμάτων σε συνθήκες τέτοιες που να διευκολύνουν την απομόνωση και τον προσδιορισμό αυτών που διαθέτουν την επιθυμητή ιδιότητα, είτε με βάση την in vitro διαλογή, που βασίζεται στην εφαρμογή μεθόδων διαλογής υψηλού ρυθμού και απόδοσης (high throughput), που βασίζονται στον προσδιορισμό μιας χαρακτηριστικής ιδιότητας (π.χ. δραστικότητα, εκλεκτικότητα, σταθερότητα σε διάφορους παράγοντες) της πρωτεΐνης που παράγεται. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται έως ότου προκύψουν μεταλλάγματα, που να οδηγούν στην πρωτεΐνη στόχο με τις επιθυμητές ιδιότητες (Σχήμα 7.5). Η δημιουργία βιβλιοθηκών μεταλλαγμένων γονιδίων βασίζεται τόσο στην εφαρμογή μη ανασυνδυαστικών τεχνικών, όπως η μετάλλαξη κασέτας και κυρίως η επιρρεπής σε λάθη PCR (error-prone PCR), η οποία σε κατάλληλες συνθήκες οδηγεί στην εισαγωγή περίπου μιας μετάλλαξης ανά 1000 ζεύγη βάσεων, όσο και στην εφαρμογή τεχνικών κατευθυνόμενης εξέλιξης, που βασίζονται στον ανασυνδυασμό γονιδίων. Μεταξύ αυτών, η τεχνική ανασυνδυασμού, μετάθεσης ή «ανακατέματος» του DNA (DNA shuffling), η οποία παρουσιάσθηκε για πρώτη φορά στα μέσα της δεκαετίας του 90 από τον Stemmer (Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature, 370: , 1994), είναι η πλέον διαδεδομένη σήμερα. H τεχνική μετάθεσης ή «ανακατέματος» του DNA επιτρέπει τη δημιουργία συλλογής υβριδικών γονιδίων (hybrid gene), αποτέλεσμα ομόλογων ανασυνδυασμών γονιδίων και βασίζεται στην ενζυμική διάσπαση του γονιδίου με το ένζυμο DNA-άση I και τον ανασυνδυασμό των θραυσμάτων με PCR (βλ. σχήματα 7.6). Συγκεκριμένα, η μέθοδος περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: α) Την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων με PCR στο γονίδιο της πρωτεΐνης. 176

185 β) Τη διάσπαση του γονιδίου με το ένζυμο DNA-άσηI και την απομόνωση των θραυσμάτων DNA που προκύπτουν. γ) Την επανασύνδεση των μικρότερων θραυσμάτων DNA με αντίδραση τύπου PCR απουσία εκκινητών (primers). Τα θραύσματα αυτά αποδιατάσσονται και τα μονόκλωνα τμήματα που προκύπτουν επανασυσπειρώνονται. Τα επανασυσπειρωθέντα αυτά τμήματα αποτελούν εκκινητές το ένα του άλλου σε αντιδράσεις που καταλύονται από την πολυμεράση και με τις οποίες θα συμπληρωθούν οι μη επικαλυπτόμενες περιοχές των κλώνων DNA. Μετά από αλλεπάλληλους κύκλους θα σχηματιστούν γονίδια, που θα διαθέτουν τον πλήρη αριθμό νουκλεϊνικών βάσεων. Η διαδικασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα τον ταυτόχρονο ανασυνδυασμό όλων των γονιδίων με παράλληλη εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων στα ανασυνδυασμένα τμήματα. δ) Τον πολλαπλασιασμό των ανασυνδυασμένων γονιδίων με PCR και την κλωνοποίηση σε κατάλληλους ξενιστές και στη συνέχει την επιλογή/διαλογή (screening) για βελτιωμένες ιδιότητες της εκφραζόμενης πρωτεΐνης.. ε) Ακολουθεί η επιλογή των βέλτιστων μεταλλαγμένων μορίων της πρωτεΐνης (ενζύμου). Μέσω διασταύρωσης ελέγχου με την αρχική πρωτεΐνη (baseline protein) είναι δυνατή η επιλογή των ευεργετικών μεταλλάξεων μόνο και ο αποκλεισμός εκείνων με ουδέτερες ή ακόμα και αρνητικές επιδράσεις. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που εμφάνισαν τις βέλτιστες ιδιότητες υποβάλλονται σε νέους κύκλους in vitro ανασυνδυασμού και επιλογής, έως ότου οι ιδιότητες του ενζύμου βελτιωθούν στον επιθυμητό βαθμό. Οι ανασυνδυαστικές μέθοδοι μπορούν να περιλαμβάνουν τον ανασυνδυασμό ακόμη και ομόλογων γονιδίων από άλλα είδη. Η μέθοδος αυτή, γνωστή με τον όρο μοριακή βελτίωση (molecular breeding), οδηγεί στην παραγωγή πρωτεϊνών που φέρουν χαρακτηριστικά στην αλληλουχία τους από περισσότερα πατρικά γονίδια (βλ. σχήμα 7.7). 177

186 Σχήμα 7.5 Η διαδικασία της κατευθυνόμενης μοριακής εξέλιξης Σχήμα 7.6 Ιn vitro ανασυνδυασμός του DNA. (1). Υδρόλυση των γονιδίων, (2) Αποδιάταξη κα αναδιάταξη (υβριδισμός) του DNA. (3) Επιμήκυνση. (4) Η διαδικασία επαναλαμβάνεται οδηγώντας στη δημιουργία βιβλιοθήκης νέων ανασυνδυασμένων γονιδίων. 178

187 Η παραπάνω μεθοδολογία οδηγεί σε εντυπωσιακά αποτελέσματα ως προς το σχεδιασμό νέων βιοκαταλυτών με βελτιωμένες ιδιότητες και χαρακτηριστικά που δεν απαντώνται στη φύση. Με την εφαρμογή των «εξελικτικών» αυτών τεχνικών έχει επιτευχθεί η δημιουργία νέων ενζύμων με τροποποιημένη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, τροποποιημένη εναντιοεκλεκτικότητα, αυξημένη θερμοανθεκτικότητα και αντοχή σε οργανικούς διαλύτες. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η δυνατότητα κατάλυσης αντιδράσεων με υποστρώματα που δεν απαντώνται στη φύση. Χαρακτηριστικό παράδειγμα που αφορά στα αποτελέσματα της εφαρμογής αλλεπάλληλων τυχαίων μεταλλάξεων αφορά το ένζυμο τρανσαμινάση του ασπαρτικού, για το οποίο παρατηρήθηκε δραματική αύξηση της δραστικότητάς του (έως φορές) ως προς το μη φυσικό υπόστρωμα βαλίνη. Όπως διαπιστώθηκε, με ανάλυση της κρυσταλλογραφικής δομής του ενζύμου, η τροποποίηση της εξειδίκευσης συνδέεται με αλλαγές σε όλη την πρωτεϊνική δομή και οι οποίες είναι το αθροιστικό αποτέλεσμα σειράς μεταλλάξεων στο εργαστήριο. Φυσική εξέλιξη Αρχέγονο γονίδιο Είδος 1 Είδος 2 Είδος 3 Ιn vitro aνασυνδυασμός (shuffling) DNA Υβριδικά γονίδια Σχήμα 7.7. Η μέθοδος της μοριακής βελτίωσης (molecular breeding). Στον πίνακα 7.1 παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγματα εφαρμογής μεθόδων της κατευθυνόμενης εξέλιξης που οδηγούν στη βελτίωση ιδιοτήτων των ενζύμων. 179

188 Πίνακας 7.1. Bελτίωσης χαρακτηριστικών ενζύμων με εφαρμογή τεχνικών κατευθυνόμενης εξέλιξης. Ένζυμα Αλδολάση από E. coli Εστεράση από Pseudomonas fluorescence Λιπάση από Pseudomonas aeruginosa Εστεράση από Bacillus subtilis Κυττόχρωμα P450 με δράση μονο-οξυγονάσης από Pseudomonas putida Υπεροξειδάση από Coprinus cinereus Tροποποίηση Τροποποίηση της στερεοεκλεκτικότητας Τροποποίηση της εξειδίκευσης ως προς το υπόστρωμα Aύξηση 26 φορές της εναντιοεκλεκτικότητας Aύξηση της δραστικότητας έως 150 φορές παρουσία οργανικών διαλυτών. Αύξηση της θερμοσταθερότητας κατά 14 ο C Aύξηση της δραστικότητας κατά 20 φορές. Αύξηση 170 φορές της θερμοσταθερότητας και 100 φορές της δραστικότητας 7.8. Καταλυτικά αντισώματα Τα μόρια των αντισωμάτων χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν δομές άλλων μορίων (αντιγόνων) και να προσδένονται σε αυτά με μεγάλη συγγένεια και εκλεκτικότητα. Η πρόσδεση περιλαμβάνει την ανάπτυξη ηλεκτροστατικών, υδρόφοβων και van der Waals αλληλεπιδράσεων, καθώς και δεσμών υδρογόνου, με τρόπο παρόμοιο με αυτόν που χαρακτηρίζει τη σύνδεση της μεταβατικής κατάστασης (transition state) του υποστρώματος με το ένζυμο. Τα τελευταία χρόνια είναι εφικτή η παραγωγή αντισωμάτων έναντι μορίων (απτενίων), τα οποία είναι ανάλογα της μεταβατικής κατάστασης ενζυμικών υποστρωμάτων (βλ. σχήματα 7.8 και 7.9). Τα αντισώματα που παράγονται με αυτόν τον τρόπο εμφανίζουν καταλυτική δράση ως προς το συγκεκριμένο υπόστρωμα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η παραγωγή καταλυτικών αντισωμάτων (catalytic antibodies, abzymes, ΜAb) με ικανότητα υδρόλυσης εστερικών και αμιδικών δεσμών, αντιδράσεων οξειδοαναγωγής, ισομερίωσης, κυκλοποίησης ή απόσπασης. Στο σχήμα 7.10 παρουσιάζονται τα στάδια παραγωγής καταλυτικών αντισωμάτων. 180

189 Εστέρας R O CH 2 C O R' + H 2 O O - O - Τετραεδρική μεταβατική κατάσταση R CH 2 C O R' OH R CH 2 P O O R' Φωσφονικό ανάλογο Προϊόντα O R CH 2 C OH + R' OH Σχήμα 7.8 Υδρόλυση εστέρα μέσω μιας τετραεδρικής μεταβατικής κατάστασης (όταν το υπόστρωμα συνδέεται στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου). Το φωσφονικό ανάλογο της τετραεδρικής μεταβατικής κατάστασης χρησιμοποιείται για την ανοσοποίηση και την παραγωγή καταλυτικών αντισωμάτων. Αν και η καταλυτική ισχύς των αντισωμάτων υστερεί σε σχέση με αυτή των ενζύμων, εντούτοις η εφαρμογή τεχνικών πρωτεϊνικής μηχανικής, όπως η κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση είναι δυνατό να οδηγήσει σε καταλυτικά αντισώματα με αυξημένη καταλυτική ισχύ ή διευρυμένη εκλεκτικότητα. Αναμένεται τα καταλυτικά αντισώματα να βρουν εφαρμογή σε περιπτώσεις, κατά τις οποίες οι υπάρχοντες βιολογικοί καταλύτες δεν έχουν την επιθυμητή εξειδίκευση. Φωσφονικό ανάλογο Καταλυτικό αντίσωμα Σχήμα 7.9. Σύνθεση ενός καταλυτικού αντισώματος με δράση εστεράσης μετά την ανοσοποίηση με ανάλογο της μεταβατικής κατάστασης (φωσφονικό ανάλογο) που παρασκευάζεται χημικώς 181

190 Επιλογή της αντίδρασης Σχεδιασμός και σύνθεση αναλόγου της μεταβατικής κατάστασης Σύζευξη σε πρωτεΐνηφορέα (απτένιο) Ανάλυση δομής Επανασχεδιασμός (αν είναι αναγκαίο) Τεχνολογία παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων Καταλυτικά αντισώματα Διαλογή για αντισώματα με καταλυτική δράση Μονοκλωνικά αντισώματα Σχήμα Στάδια παραγωγής καταλυτικών αντισωμάτων. 182

191 8. ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΕΝΖΥΜΩΝ 8.1 Γενικά Η βιομηχανία ενζύμων, που είναι το αποτέλεσμα της ταχείας ανάπτυξης της μοντέρνας βιοτεχνολογίας, παράγει ένζυμα για ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών. Τα ένζυμα μπορεί να είναι ζωικής, φυτικής ή μικροβιακής προέλευσης. Όπως ειπώθηκε σε προηγούμενη παράγραφο, φυσικοί ή ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί παράγουν ένα μεγάλο αριθμό χρήσιμων ενζύμων με ποικιλία στην εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, την ταχύτητα της αντίδρασης, τη θερμοκρασιακή σταθερότητα και το βέλτιστο ph. Εκτιμάται ότι, πάνω από 400 εταιρείες σε όλο τον κόσμο παράγουν ένζυμα που βρίσκουν εφαρμογή στην βιομηχανία. Η εκτιμούμενη αξία των εφαρμογών των βιομηχανικών ενζύμων στην παγκόσμια αγορά έχει αυξηθεί από το 1 δισεκατομμύριο $ το 1995 στο 1.5 δισεκατομμύριο $ το 2000, στα 2.3 δισεκατομμύρια $ το 2007, ενώ εκτιμάται να φθάσει τα 5 δισεκατομμύρια $ το Οι βιομηχανίες απορρυπαντικών (37%), η κλωστοϋφαντουργεία (12%), η βιομηχανία τροφίμων (20%), οι ζωοτροφές (6%), είναι οι κύριες βιομηχανίες, οι οποίες χρησιμοποιούν το 75% των διαθέσιμων ενζύμων στη βιομηχανία. Τα ένζυμα κατηγοριοποιούνται σε 6 μεγάλες κατηγορίες με βάση την αντίδραση που καταλύουν. Έτσι, διακρίνουμε τις : Ε.C.1 Oξειδοαναγωγάσες (oxidoreductases) -Ένζυμα πoυ καταλύoυν την oξείδωση ή αναγωγή τoυ υπoστρώματoς, δηλαδή αντιδράσεις μεταφοράς ηλεκτρονίων (σε ορισμένες περιπτώσεις συνοδεύεται και με μεταφορά πρωτονίων) από ένα υπόστρωμα δότη ηλεκτρονίων σε ένα άλλο υπόστρωμα, που είναι ο δέκτης. Οι oξειδοαναγωγάσες κατατάσσονται σε έξι υποομάδες. Αυτές είναι οι: α) αφυδρογονάσες, οι οποίες καταλύουν αντιδράσεις αφυδρογόνωσης, β) υδροξυλάσες ή μονοοξυγονάσες, που καταλύουν την ενσωμάτωση ενός ατόμου ατμοσφαιρικού μοριακού οξυγόνου σε ένα υπόστρωμα προκαλώντας έτσι υδροξυλίωση, ενώ το δεύτερο άτομο ανάγεται σε νερό, γ) διοξυγονάσες, που καταλύουν την ενσωμάτωση δύο ατόμων οξυγόνου στα υποστρώματά τους, δ) οξειδάσες, που καταλύουν αντιδράσεις μεταφοράς δύο ή τεσσάρων ηλεκτρονίων, δέκτης των οποίων είναι το μοριακό οξυγόνο, ε) υπεροξειδάσες, που χρησιμοποιούν το υπεροξείδιο του υδρογόνου ως αποδέκτη για να καταλύσουν την οξείδωση ενός πλήθους οργανικών 183

192 και ανόργανων υποστρωμάτων και, τέλος, στ) καταλάσες, που καταλύουν τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου. E.C.2. Τρανσφεράσες (transferases). Εδώ έχoυν καταταγεί όλα τα ένζυμα πoυ δεν καλύπτoνται από τις άλλες πέντε μεγάλες κατηγoρίες, μιας και όλα τα ένζυμα μπoρoύν να θεωρηθoύν κατά κάποιο τρόπο τρανσφεράσες. Τα ένζυμα της ομάδας αυτής καταλύουν ένα μεγάλο αριθμό αντιδράσεων του ενδιάμεσου μεταβολισμού, όπου μεταφέρεται μια χημική ομάδα (εκτός από τα πρωτόνια) από ένα μόριο σε ένα άλλο και στις οποίες είναι απαραίτητη η συμμετοχή ενός συμπαράγοντα μεταφοράς. E.C.3 Υδρολάσες (hydrolases). Ένζυμα πoυ καταλύoυν υδρoλυτικές διασπάσεις. Τα ένζυμα της ομάδας αυτής καταλύουν αντιδράσεις υδρολυτικής διάσπασης ενός δεσμού (C-O, C-N, C-C, καθώς και του δεσμού P-O) με τη συμμετοχή του νερού. Επομένως, στις αντιδράσεις αυτές που είναι εύκολα αντιστρεπτές, το μόριο του νερού είναι το δεύτερο υπόστρωμα που υφίσταται και αυτό διάσπαση. Εδώ υπάγονται: α) οι εστεράσες και οι λιπάσες, που καταλύουν την υδρόλυση εστερικών δεσμών, β) οι γλυκοσιδάσες, που καταλύουν την υδρόλυση γλυκοσιδικών δεσμών, γ) οι πρωτεάσες, που καταλύουν την υδρόλυση αμιδικών /πεπτιδικών δεσμών. E.C.4. Λυάσες (lyases). Ένζυμα πoυ καταλύoυν μη υδρoλυτικό σπάσιμo δεσμών (δηλαδή καταλύoυν αντιδράσεις απoμάκρυνσης oμάδων με σχηματισμό διπλoύ δεσμoύ, ή αντίστρoφα, πρoσθήκες oμάδων σε διπλό δεσμό). E.C.5. Ισομεράσες (isomerases). Ένζυμα πoυ καταλύoυν ενδoμoριακές μεταβoλές (ανακατατάξεις). E.C.6 Λιγάσες (ligases) Ένζυμα πoυ καταλύoυν τo σχηματισμό δεσμών με ταυτόχρoνη διάσπαση ATP. Τα ένζυμα της ομάδας αυτής καταλύουν αντιδράσεις δημιουργίας δεσμών μεταξύ ατόμων άνθρακα (C-C), άνθρακα και οξυγόνου (C-O), άνθρακα και αζώτου (C-N), άνθρακα και θείου (C-S). Ως πηγή ενέργειας χρησιμοποιούν μόρια ΑΤP ή άλλα τριφωσφωρικά νουκλεοτίδια. Τουλάχιστον το 75% των ενζύμων που χρησιμοποιούνται σε βιομηχανικές διεργασίες χαρακτηρίζονται από υδρολυτική δράση και χρησιμοποιούνται στην αποικοδόμηση βιοπολυμερών (πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες). Οι πρωτεϊνάσες και οι λιπάσες αντιπροσωπεύουν το 50% της παγκόσμιας αγοράς των ενζύμων, καθώς βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή τόσο στη βιομηχανία τροφίμων, όσο και στη βιομηχανία 184

193 απορρυπαντικών. Τα ένζυμα που εμπλέκονται στη χημεία των υδατανθράκων αποτελούν τη δεύτερη μεγαλύτερη κατηγορία ενζύμων βιομηχανικής χρήσης, καθώς βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία αμύλου, στην υφαντουργία, στην παραγωγή μπύρας, κλπ. Συνεχώς αυξανόμενος είναι ο ρόλος των λιπασών, οι οποίες βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία απορρυπαντικών, στην τροποποίηση λιπών, καθώς και σε διάφορες ενζυμικές βιομετατροπές. Στο σχήμα 8.1 εμφανίζεται η σχετική κατανομή των ενζύμων, που χρησιμοποιούνται σε βιομηχανικές εφαρμογές.. Στον πίνακα 8.1 παρουσιάζονται οι κύριες εφαρμογές πολλών βιομηχανικών ενζύμων. Σχήμα 8.1 Συμμετοχή διαφόρων ενζύμων σε βιοκαταλυόμενες διεργασίες Σήμερα στον τομέα της χημικής βιομηχανίας και της φαρμακοβιομηχανίας, πολλές κλασσικές χημικές μέθοδοι, έχουν αντικατασταθεί από βιοκαταλυτικές. Τα ένζυμα, που χρησιμοποιούνται στις μεθόδους αυτές, είναι στερεοεκλεκτικοί και τοποεξειδικευμένοι καταλύτες, που επιτρέπουν τον έλεγχο των προϊόντων και την αύξηση της απόδοσης, αφού παράγονται λιγότερα παραπροϊόντα.. Στους πίνακες που ακολουθούν παρουσιάζονται σημαντικές εφαρμογές ενζύμων, στη βιομηχανία φαρμάκων και χημικών αντίστοιχα 185

194 186 Ενδεικτικές εφαρμογές ενζύμων στη βιομηχανία τροφίμων ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΑ α &β -αμυλάση Επεξεργασία αμύλου Προϊόντα γλυκιάς Γλυκοαμυλάση Υδρόλυση αμυλόζης και αμυλοπηκτίνης γεύσης. Σιρόπι από βακτήρια και γλυκόζης, μύκητες φρουκτόζης κ.ά, Λιποξυγενάση αλεύρι σόγιας α & β -αμυλάση Γλυκοαμυλάση Κυτταρινάσες Γλυκανάσες Πρωτεάσες πεπτιδάσες από Λεύκανση του ζυμαριού στην αρτοποιεία Το ένζυμο οξειδώνει ακόρεστα λιπαρά οξέα του ζυμαριού Τα ένζυμα υδρολύουν βιοπολυμερή (πολυσακχαρίτες, πρωτεΐνες) και οδηγούν σε προϊόντα που καθορίζουν τη γεύση, την υφή και άλλες ιδιότητες Ασπαραγινάση Το ένζυμο μετατρέπει την ασπαραγίνη σε ασπαραγινικό οξύ και όχι σε ακρυλαμίδιο κατά το ψήσιμο. Απάλειψη του ακρυλαμιδίου από προϊόντα αρτοποιίας α & β -αμυλάση β-γλυκανάση γλυκοαμυλάση αποκαρβοξυλάση α- κετογλουρατικού παπαϊνη Πηκτινεστεράσες Πηκτινάσες Πηκτινολυάσες Αμυλάσες Κυτταρινάσες ημικυτταρινάσες Πηκτινάσες Πρωτεάσες Γλυκοζιτικά ένζυμα Γλυκανάσες Πηκτινάσες Κυτταρινάσες Ημικυτταρινάσες Πρωτεάσες Λιπάσες Φωσφολιπάσες Πρωτεάσες Εστεράσες Λιπάσες Καταλάση Λακτάση Πρωτεάσες πεπτιδάσες Οξειδάση της γλυκόζης Καταλάση Εφαρμογή στη ζυθοποιία Παρασκευή και τροποποίηση της βύνης Παρασκευή και βρασμός βυνογλεύκους Ρύθμιση περιεκτικότητας σακχάρων, ωρίμανση ζύθου Αποσάρθρωση ιστού των φρούτων, διαύγαση φρουτοχυμών Ενίσχυση του αρώματος Μείωση του ιξώδους Προστασία από την οξείδωση Αντιμετώπιση πρωτεϊνικού θολώματος Παρασκευή βρώσιμων ελαίων Βελτίωση της απόδοσης ελαίων Εξευγενισμός ελαίων Πήξη του γάλακτος (χυμοσίνη) Ανάπτυξη οργανοληπτικών χαρακτηριστικών (λιπάσες/εστεράσες) Προστασία τυριού από μικροοργανισμούς (λυσοζύμη) Απομάκρυνση συντηρητικού H 2O 2 από το γάλα Επιτάχυνση ωρίμανσης (αμινοπεπτιδάσες) Εκμετάλλευση του τυρογάλακτος (υδρόλυση λακτόζης με λακτάση) Πρωτεϊνικό υδρόλυμα σόγιας Εκχύλισμα ζυμομύκητα Τρυφεροποίηση κρέατος Περιορισμός της αμαύρωσης των τροφίμων, μείωση της συγκέντρωσης της γλυκόζης Αρτοσκευάσματα και άρτος με επιθυμητά χαρακτηριστικά Προϊόντα ζυθοποιίας Διαυγής φρουτοχυμός Θολός φρουτοχυμός τύπου «νέκταρ» Οινοποιία Κρασί επιθυμητές ιδιότητες Ελαιόλαδο Φυτικά έλαια Ιχθυέλαια Γαλακτοκομικά προϊόντα με Διάφορα διατροφικά προϊόντα, προϊόντα διαίτης, ζωοτροφές Ασφαλή διατροφικά προϊόντα

195 Εφαρμογές ενζύμων στη βιομηχανία φαρμάκων ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΦΑΡΜΑΚΑ Ακυλάση της πενικιλλίνης Σύνθεση πενικιλλινικών αντιβιοτικών Αντιβιοτικά Ακυλάση κεφαλοσπορίνης Σύνθεση κεφαλοσπορινών Υδροξυλάσες (Ρ450 μονοξυγονάση) Υδροξυλίωση στεροειδών για την παρασκευή κορτικοστεροειδών Αφυδρογονάση 20β-υδροξυστεροειδών Αφυδρογόνωση στεροειδών Ρεδουκτάση 3-υδροξυ-5- μεθυλογλουταρυλο CoA Αλκοολική αφυδρογονάση Νιτριλάση Οξειδάση γλουταμινικού οξέος ε-αμινοτρανσφεράση L- λυσίνης Διοξυγονάση Αφυδρογονάση διυδροδιόλης Γλυκοαμυλάση Οξειδάσης της γλυκόζης Λακτοϋπεροξειδάση Σύνθεση στατιτών Σύνθεση πρόδρομων ενώσεων για την παρασκευή ΒΜS (αναστολέας ενδοπεπτιδάσης/αce) Σύνθεση αναστολέα αντίστροφης τρανσκριπτάσης και της όξινης πρωτεάσης, ένζυμα που εμπλέκονται στη δράση του ιού ΗΙV Πρόσθετα σε οδοντόπαστες για αντιμικροβιακή δράση Στεροειδή Αδρενοκορτικοειδών ορμονών (κορτιζόλη, κορτιζόνη και παράγωγα αυτών) Φάρμακα κατά της υπερχοληστερολαιμίας Φάρμακα κατά της υπέρτασης Φάρμακα κατά του HIV Προϊόντα υγιεινής στόματος ΕΝΖΥΜΑ β-aποκαρβοξυλάση L-Asp Λακταμάσες L και D Aμινοακυλάση Αμμονιωλυάση L-Asp Υδαντοϊνάσες Καρβαμοϋλάσες Αμιδάσες εστεράσες πρωτεάσες Αφυδρογονάση Leu Νιτριλάση Τρανσαμινάσες L-Asp & αμινοβουτρικού Νιτριλάσες και αμιδάσες Οξειδάσες Εφαρμογές ενζύμων στη βιομηχανία χημικών Νιτριλάσες ΠΡΟΪΟΝΤΑ L και D ΑΜΙΝΟΞΕΑ R & S ΟΡΓΑΝΙΚΑ ΟΞΕΑ ΑΜΙΔΙΑ (ακρυλαμίδιο, νικοτιναμίδιο) Λιπάσες Νιτριλάσες και αφυδρογονάσες Λυάση υδροξυνιτριλίου Διοξυγονάση ναφθαλενίου R & S ΑΛΚΟΟΛΕΣ ΑΜΙΝΕΣ, ΝΙΤΡΙΛΙΑ 187

196 Στον επόμενο Πίνακα παρουσιάζονται σημαντικές εφαρμογές ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα στη βιομηχανία. Εφαρμογές σε μεγάλη κλίμακα στη βιομηχανία. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Λακκάση Διάσπαση λιγνίνης Υπεροξειδάση Ξυλανάσες Λεύκανση ξυλοπολτού Προϊόντα χαρτοποιίας Λακάσες Αμυλάσες Απομάκρυνση κόλλας (άμυλο) στα κολλαρισμένα υφάσματα Κυτταρινάσες του γένους Humicola Κυτταρινάσες του γένους Trichoderma ή Βιοεξευγενισμός υφασμάτων μέσω της υδρόλυσης της κυτταρίνης των ινών Υδρόλυση της κυτταρίνης της ίνας υφασμάτων που οδηγεί στην απομάκρυνση χρωστικών (indigo blue) σε υφάσματα τύπου τζιν Υφάσματα Humicola Λακκάσες Καταλάση Υπεροξειδάση Εξουδετέρωση λευκαντικών χημικών Αλκαλικές πρωτεάσες (θρυψίνη, χυμοθρυψίνη) Πρωτεολυτικά ένζυμα Λιπάσες Πρωτεάσες Λιπάσες Αμυλάσες Κυτταρινάσες Οξειδάση της γλυκόζης, οξειδάση της γλυκερόλης, λιποξυγονάση Φυτάση του γένους Αspergillus β-γλυκανάσες Μείωση της συνεκτικότητας του ιστού του δέρματος Απομάκρυνση τριχών ή μαλλιού του δέρματος Αποδόμηση πρωτεϊνών και υδρόλυση λιπών του δέρματος Υδρόλυση και απομάκρυνση πρωτεϊνούχων ρύπων Υδρόλυση και απομάκρυνση λιπαρών ρύπων Υδρόλυση και απομάκρυνση αμυλούχων ρύπων Βιοεξευγενισμός και απομάκρυνση κυτταρινούχων ρύπων Ελευθερώνουν κατά τη δράση τους H 2O 2 το οποίο δρ ως οξειδωτικό μέσο που μπορεί να αντικαταστήσει τα χημικά λευκαντικά Προστίθεται στην τροφή ζώων για να υδρολύσει και να ελευθερώσει φωσφορικές ομάδες από το φυτικό οξύ (μη βιοδιαθέσιμη μορφή P των δημητριακών) Προστίθεται στην τροφή ζώων (χοίρων, πουλερικών) ια την υδρόλυση μη αφομοιώσιμων β-πολυσακχαριτών (β-γλυκάνες) των δημητριακών Προϊόντα δέρματος στη βρυσοδεψία Βιολογικά απορρυπαντικά Ζωοτροφές 188

197 8.2. Εφαρμογές υδρολυτικών ενζύμων Με τον όρο υδρολάσες αναφερόμαστε στα ένζυμα, τα οποία έχουν την ιδιότητα να καταλύουν αντιδράσεις υδρόλυσης χημικών δεσμών (αμιδικών, εστερικών και γλυκοζιδικών). Η φυσική λειτουργία των ενζύμων αυτών σχετίζεται με τη διεργασία της πέψης, καθώς συμμετέχουν στην αποικοδόμηση μεγαλομοριακών ενώσεων σε μικρότερα μόρια. Για παράδειγμα, οι πρωτεάσες υδρολύουν τις πρωτεΐνες σε μικρότερα πεπτίδια ή και σε απλά αμινοξέα, τα αμυλολυτικά ένζυμα (όπως η α- και β-αμυλάση) καταλύουν την υδρόλυση του αμύλου, ενώ οι λιπάσες καταλύουν την υδρόλυση λιπιδίων (τριγλυκεριδίων) σε γλυκερόλη και λιπαρά οξέα (βλ. σχήμα 8.2). Στον πίνακα 8.2 παρουσιάζονται τα κυριότερα υδρολυτικά ένζυμα που βρίσκουν εφαρμογή σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες με βιομηχανικό ενδιαφέρον. Συγκεκριμένες βιοτεχνολογικές εφαρμογές υδρολυτικών ενζύμων αναφέρονται στη συνέχεια. Σχήμα 8.2 α) Υδρόλυση τριγλυκεριδίου που καταλύει μια μη ειδικευμένη λιπάση προς γλυκερόλη και λιπαρό οξύ. β) Υδρόλυση πεπτιδικού και εστερικού δεσμού, που καταλύει μια πρωτεάση και μία λιπάση αντίστοιχα. Λιπάσες και Εστεράσες Τόσο οι λιπάσες (ΕC ), όσο και οι εστεράσες (EC ), καταλύουν την υδρόλυση εστέρων. Βασική όμως διαφορά της εξειδίκευσής τους αποτελεί η προτίμηση των λιπασών για την υδρόλυση μη υδατοδιαλυτών υποστρωμάτων, όπως 189

198 τα τριγλυκερίδια με λιπαρά οξέα μεγάλης αλειφατικής αλυσίδας, ενώ αντίθετα η δράση των εστερασών εκφράζεται κυρίως σε υδατοδιαλυτά υποστρώματα ή τριγλυκερίδια μικρής αλειφατικής αλυσίδας (τριβουτυρίνη). Ανάλογα με τη θέση υδρόλυσης των εστερικών δεσμών των τριγλυκεριδίων, οι λιπάσες διακρίνονται σε: α) 1,3 τόπo-ειδικευμένες λιπάσες, oι oπoίες υδρoλύoυν τoυς εστερικoύς δεσμoύς τωv τριγλυκεριδίων στις θέσεις 1 και 3 αντίστoιχα. β) μη ειδικευμένες λιπάσες, όπου δεv παρoυσιάζoυν κάπoια συγκεκριμέvη εξειδίκευση ως πρoς τη θέση υδρόλυσης των εστερικών δεσμών των τριγλυκεριδίων Οι λιπάσες συνδέονται σε διεπιφάνειες τύπου νερό/λάδι, γεγονός που αφενός επιτρέπει στα ένζυμα αυτά να πλησιάσουν το προς υδρόλυση υπόστρωμα, ενώ παράλληλα οδηγεί σε ενεργοποίησή τους. Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό με τον όρο διεπιφανειακή ενεργοποίηση (interfacial activation) και είναι αποτέλεσμα δομικών μεταβολών στο ενζυμικό μόριο. Πίνακας 8.2 Τα κυριότερα υδρολυτικά ένζυμα που εφαρμόζονται σε βιοτεχνολογικές διεργασίες 190

199 Η ανάλυση της δομής λιπασών και εστερασών με κρυσταλλογραφία ακτινών X αποκάλυψε ότι το καταλυτικό κέντρο τους καλύπτεται από ένα κάλυμμα ή «καπάκι» (lid) ελικοειδούς δομής. Στην περίπτωση που η λιπάση συνδέεται με ανάλογα της μεταβατικής κατάστασης ή με λιπίδια, το ελικοειδές αυτό τμήμα μετακινείται αποκαλύπτοντας το ενεργό κέντρο. Οι λιπάσες επιδεικνύουν μειωμένη δραστικότητα ως προς τα διαλυτά υποστρώματα, διότι το ελικοειδές τμήμα καλύπτει το ενεργό κέντρο του ενζύμου..αντίθετα, η σύνδεση του ενζύμου σε μια διεπιφάνεια τύπου νερό/λάδι έχει ως αποτέλεσμα τη μετακίνηση του ελικοειδούς τμήματος και την αποκάλυψη του ενεργού κέντρου (βλ.σχήμα 8.3). Για τις εστεράσες, όπως η κουτινάση (cutinase) και η ακετυλοχολινεστεράση, ένζυμα τα οποία δεν χαρακτηρίζονται από διεπιφανειακή ενεργοποίηση, η κρυσταλλογραφική ανάλυση δεν αποκάλυψε την παρουσία του χαρακτηριστικού ελικοειδούς τμήματος. Παρά τις σημαντικές αυτές πληροφορίες, ο μηχανισμός ενεργοποίησης των λιπασών δεν έχει ακόμη διερευνηθεί πλήρως. Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές των λιπασών σε βιομηχανική κλίμακα αποτελεί η τροποποίηση λιπών και ελαίων, η παραγωγή προϊόντων, όπως γαλακτοματοποιητές ή το βούτυρο του κακάο, καθώς και προϊόντων υψηλής διατροφικής αξίας. Χαρακτηριστικά παραδείγματα των εφαρμογών αυτών παρουσιάζονται στην παράγραφο 4.2. Οι λιπάσες βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία παρασκευής γαλακτοκομικών προϊόντων, ιδιαίτερα στα στάδια που αφορούν την ωρίμανση του τυριού, αλλά και στην παρασκευή ορισμένων τύπων τυριού, όπως της φέτας. Η εξωτερική προσθήκη λιπασών στο γάλα, πριν την εισαγωγή του πηκτικού παράγοντα, έχει ως αποτέλεσμα την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων του γάλακτος προς ελεύθερα λιπαρά οξέα, γεγονός που καθορίζει σε σημαντικό βαθμό τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (γεύση, άρωμα) του τελικού προϊόντος. Οι λιπάσες βρίσκουν (μαζί με άλλα υδρολυτικά ένζυμα) εφαρμογή και στην βυρσοδεψία, καθώς έχουν την ικανότητα να υδρολύουν τα λίπη του δέρματος, δίχως να επηρεάζουν την υπόλοιπη δομή του ιστού. Σημαντική εφαρμογή των λιπασών αποτελεί το πεδίο των βιολογικών απορρυπαντικών, όπου χρησιμοποιούνται ως συστατικό του προϊόντος μαζί με πρωτεολυτικά κυρίως ένζυμα. Πρόσφατα, η εταιρεία Novozyme (Δανία) εισήγαγε, για το σκοπό αυτό, ένα νέο εμπορικό παρασκεύασμα λιπάσης (LipoPrime TM ), του οποίου οι καταλυτικές ιδιότητες έχουν βελτιστοποιηθεί μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής. Έτσι, το ένζυμο είναι σταθερό στις 191

200 συνθήκες πλύσης (υψηλή ιοντική ισχύς, παρουσία χλωριωμένου νερού και λευκαντικών, παρουσία πρωτεασών, και υψηλή θερμοκρασία). Τα τελευταία 15 χρόνια, τα υδρολυτικά ένζυμα, όπως οι λιπάσες, οι εστεράσες, αλλά και οι πρωτεάσες, αποτέλεσαν ένα πολύτιμο εργαλείο στη σύνθεση και παραγωγή νέων προϊόντων, που βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία φαρμάκων και τροφίμων. Οι λόγοι που ανέδειξαν και κατέστησαν εμπορικά εκμεταλλεύσιμη την εφαρμογή των ενζύμων αυτών σχετίζονται με: α) το ευρύ φάσμα εξειδίκευσης των λιπασών, που επιτρέπει την τροποποίηση όχι μόνο φυσικών, αλλά και συνθετικών υποστρωμάτων, β) την υψηλή στερεο- και τοπο-εκλεκτικότητα που επιδεικνύουν ως προς το υπόστρωμα, γ) το γεγονός ότι η έκφραση των καταλυτικών τους ιδιοτήτων δεν απαιτεί την παρουσία συνενζύμων, δ) το μεγάλο αριθμό λιπολυτικών ενζύμων που είναι εμπορικά διαθέσιμα (περίπου 70 λιπάσες είναι σήμερα διαθέσιμες), ε) τη δυνατότητα διατήρησης των καταλυτικών τους ιδιοτήτων σε συστήματα, των οποίων η περιεκτικότητα σε νερό είναι περιορισμένη (μη συμβατικά συστήματα, βλ κεφ. 9), γεγονός που επιτρέπει την κατάλυση αντιδράσεων προς την πλευρά της σύνθεσης και όχι της υδρόλυσης. Αντιδράσεις που καταλύονται από λιπάσες 192

201 Σχήμα 8.3. Σχηματική α) απεικόνιση των βημάτων μετακίνησης του καλύμματος (lid) κατά την: (α) "κλειστή", (β) "ανοικτή" διαμόρφωση του ενζύμου, (γ) σύγκριση των δυο καταστάσεων Πρωτεάσες και αμιδάσες Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές των πρωτεολυτικών ενζύμων αφορά στη χρησιμοποίησή τους ως βοηθητικών προσθέτων στα απορρυπαντικά. Η μεγαλύτερη εφαρμογή στον κλάδο των απορρυπαντικών αφορά τις πρωτεάσες σερίνης, γνωστές με το όνομα σαμπτιλυσίνες. Η εφαρμογή της πρωτεϊνικής μηχανικής στις σαμπτιλυσίνες έχει οδηγήσει σε βελτίωση των ιδιοτήτων τους και συγκεκριμένα σε αύξηση της σταθερότητάς τους σε υψηλές τιμές του ph, καθώς και β) σε υψηλές τιμές θερμοκρασίας, ώστε να διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες στις συνθήκες πλύσης. Σημαντική εφαρμογή βρίσκουν οι πρωτεάσες στη βιομηχανία τροφίμων. Συγκεκριμένα, τα πρωτεολυτικά ένζυμα παπαΐνη και βρωμελαΐνη βρίσκουν εφαρμογή στο σίτεμα (τρυφεροποίηση) του κρέατος. Εισάγονται με ένεση στο σώμα του ζώου λίγο πριν τη θανάτωσή του ή απευθείας στο νωπό κρέας. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα, βρίσκουν ακόμη εφαρμογή στην επεξεργασία προϊόντων κρέατος, τα οποία προορίζονται για ζωοτροφές, στην παραγωγή καθαρής ζελατίνης από το δέρμα και τα οστά των ζώων, καθώς και στη διεργασία παραγωγής προϊόντων ψαριού. Οι πρωτεάσες βρίσκουν επίσης εφαρμογή και στην παραλαβή πρωτεΐνης και πρωτεϊνικών προϊόντων φυτικής και μικροβιακής προέλευσης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί εφαρμογή των πρωτεολυτικών ενζύμων στην τεχνολογία παραγωγής προϊόντων σόγιας, τα οποία χρησιμοποιούνται ως πρόσθετα σε προϊόντα διαίτης, καλλυντικά και ζωοτροφές. Άλλες εφαρμογές των πρωτεολυτικών ενζύμων 193

202 σχετίζονται με την τεχνολογία παραγωγής εκχυλίσματος ζυμομύκητα (yeast extract), καθώς και την αξιοποίηση των πρωτεϊνών του αίματος. Σημαντική είναι η εφαρμογή του όξινου πρωτεολυτικού ενζύμου ρεννίνη από ήνυστρο μόσχου στην τυροκομία. Το ένζυμο αυτό υδρολύει εκλεκτικά την κ-καζεΐνη του γάλακτος, γεγονός που οδηγεί στην πήξη του. Τελευταία, χρησιμοποιείται στην τυροκομία μια πρωτεάση μικροβιακής προέλευσης (από Mucor miehei), ενώ η εφαρμογή της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA οδήγησε σε ρεννίνη εκφρασμένη σε γενετικά ανασυνδυασμένο μικροοργανισμό (Aspergillus niger), ώστε να αντιμετωπιστεί το πρόβλημα της χρήσης ζωικής ρεννίνης. Σε αντίθεση με τις λιπάσες, οι πρωτεάσες και οι αμιδάσες δρουν αποκλειστικά σε υδατοδιαλυτά υποστρώματα. Οι δύο κυριότερες εφαρμογές των ενζύμων αυτών στο πεδίο των ενζυμικών βιομετατροπών σχετίζονται με την εναντιοεκλεκτική υδρόλυση τόσο φυσικών, όσο και συνθετικών α-αμινοεστέρων, αλλά και εστέρων λιπαρών οξέων, καθώς και στη σύνθεση δι- και ολιγοπεπτιδίων. ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΑ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Ένζυμα στην επεξεργασία πολυσακχαριτών Στην κατηγορία αυτή υπάγονται κυρίως ένζυμα, που εμπλέκονται στην υδρόλυση γλυκοζιδικών δεσμών φυσικών πολυσακχαριτών (άμυλο, κυτταρίνη, πηκτίνες και γλυκάνες), γνωστά ως αμυλάσες, κυτταρινάσες, πηκτινάσες και γλυκανάσες, αντίστοιχα. Στον πίνακα 8.3 εμφανίζονται τα κυριότερα ένζυμα βιομηχανικού ενδιαφέροντος, που συμμετέχουν στην αποικοδόμηση ολιγο- και πολυσακχαριτών. Ένζυμα στην επεξεργασία του αμύλου. Το άμυλο είναι πηγή εφεδρείας υδατανθράκων και αποτελεί μίγμα δύο τύπων πολυσακχαριτών με δομική μονάδα την D-γλυκόζη: της αμυλόζης (15-30%) και της αμυλοπηκτίνης (70-85%). Η αμυλόζη αποτελείται από μη διακλαδιζόμενες πολυσακχαριτικές αλυσίδες, όπου τα μόρια γλυκόζης είναι ενωμένες με α-1,4- γλυκοζιδικούς δεσμούς. Αντίθετα, η αμυλοπηκτίνη είναι ένα διακλαδωμένο πολυμερές, όπου επίσης τα μόρια γλυκόζης είναι ενωμένα με α-1,4-γλυκοζιδικούς δεσμούς, ενώ στις θέσεις διακλάδωσης (κάθε μόρια γλυκόζης) συναντούμε α- 1,6-γλυκοζιδικούς δεσμούς. 194

203 Η ενζυμική επεξεργασία του αμύλου παρέχει προϊόντα γλυκιάς γεύσης, όπως σιρόπια φρουκτόζης, γλυκόζης, δεξτρόζης και μαλτόζης, με εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων και ποτών. Τα ένζυμα που εμπλέκονται στη βιομηχανική επεξεργασία του αμύλου και τα χαρακτηριστικά της δράσης τους εμφανίζονται στον πίνακα 8.4. Στο σχήμα 8.4 απεικονίζονται σχηματικά οι θέσεις διάσπασης της αμυλόζης και της αμυλοπηκτίνης. Πίνακας 8.3 Ένζυμα υδρόλυσης γλυκοζιδικών δεσμών με βιομηχανικές εφαρμογές Ένζυμα Εξειδίκευση Βιομηχανική εφαρμογή α και β-αμυλάσες α-1,4 γλυκοζιδικός δεσμός στο άμυλο Παραγωγή γλυκαντικών ουσιών από άμυλο, ζυθοποιία, χαρτοποιία, υφαντουργία Κυτταρινάσες β-1,4 γλυκοζιδικός δεσμός στην κυτταρίνη Παρασκευή προϊόντων φρούτων και λαχανικών, υφαντουργία, (βιοεξευγενισμών και αποκολλάρισμα ινών υφασμάτων) κλπ. Λακτάση β-1,4 γλυκοζιδικός δεσμός στη λακτόζη Προϊόντα γάλακτος και τυρογάλακτος β-γλυκανάσες β-1,3 και κυρίως β-1,4 γλυκοζιδικοί δεσμοί Ζωοτροφές, ζυθοποιία, εκχύλιση χυμών πολυσακχαριτών όπως οι β-γλυκάνες Πηκτινάσες ή α-1,4 δεσμός μονάδων Εκχύλιση και διαύγαση πολυγαλακτουρονάσες και πηκτινολυάσες γαλακτουρονικού οξέος πηκτινών φρουτοχυμών, διαύγαση κρασιών Eφαρμογή στη ζυθοποιία H παρασκευή ζύθου (μπίρας) αποτελεί μια από τις παλαιότερες βιοτεχνολογικές εφαρμογές των ενζύμων. Τα χρησιμοποιούμενα υλικά για την παραγωγή μπύρας είναι βύνη (κριθάρι, το οποίο μόλις έχει εκβλαστήσει), νερό, ζύμη 195

204 και φυτικά πρόσθετα γεύσης και αρώματος, όπως ο λυκίσκος. Τα στάδια παρασκευής είναι τα εξής: α) παρασκευή βύνης, β) επεξεργασία βύνης για την παρασκευή βυνογλεύκους, γ) βρασμός βυνογλεύκους παρουσία λυκίσκου, δ) ζύμωση του βινογλεύκους με ειδικά στελέχη ζυμομυκήτων, ε) ωρίμανση, παστερίωση και συσκευασία. Η προσθήκη ενζύμων αφορά τρία στάδια της παραγωγής του ζύθου και συγκεκριμένα: α) το στάδιο παρασκευής βυνογλεύκους με τη προσθήκη α-αμυλάσης, β-γλυκανάσης (που διασπά τα πολυμερή β-γλυκάνια του κριθαριού), αλλά και πρωτεάσης, β) το στάδιο της ζύμωσης, όπου η προσθήκη β-αμυλάσης από Aspergillus oryzae βοηθά τη διάσπαση δεξτρινών προς ζυμώσιμη μαλτόζη και γ) το στάδιο ωρίμανσης του ζύθου, όπου η προσθήκη πρωτεολυτικών ενζύμων (παπαΐνη) έχει ως σκοπό την αποδόμηση πρωτεϊνών, που υποβοηθούν το σχηματισμό θολώματος. Πίνακας 8.4 Ένζυμα που συμμετέχουν στη βιομηχανική επεξεργασία του αμύλου. Ένζυμα α-αμυλάση από στελέχη Βacillus και Αspergillus β-αμυλάση Αμυλογλυκοζιδάση ή γλυκοαμυλάση από στελέχη Αspergillus Στάδιο επεξεργασίας Αμύλου Πηκτωματοποίηση Ρευστοποίηση και δεξτρινοποίηση Σακχαροποίηση Σακχαροποίηση Σακχαροποίηση Δράση-χαρακτηριστικά Υδρολύει τους εσωτερικούς α-1,4 γλυκοζιδικούς δεσμούς του αμύλου προς μίγμα ολιγοσακχαριτών (μαλτοδεξτρίνες). Υδρολύει τους α-1,4 γλυκοζιδικούς δεσμούς ξεκινώντας από το μη αναγωγικό άκρο του υποστρώματος αφαιρώντας μόρια μαλτόζης Υδρολύει τους α-1,4 γλυκοζιδικούς δεσμούς ξεκινώντας από το αναγωγικό άκρο του υποστρώματος αφαιρώντας μόρια β-d-γλυκόζης. Υδρολύει και α-1,6 γλυκοζιδικούς δεσμούς αλλά με πολύ μικρότερη ταχύτητα Πουλουλανάση Σακχαροποίηση Υδρολύει τους α-1,6 γλυκοζιδικούς δεσμούς της αμυλοπηκτίνης 196

205 Σχήμα 8.4 Ενζυμική διάσπαση του αμύλου από αμυλάσες Εφαρμογή στην παρασκευή προϊόντων φρούτων Κατά τη διεργασία παραγωγής προϊόντων φρούτων και φρουτοχυμών, τέσσερις κατηγορίες ενζύμων διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο: τα πηκτικά ένζυμα, οι αμυλάσες, οι ημικυτταρινάσες και οι κυτταρινάσες. Η κυριότερη κατηγορία ενζύμων που εμπλέκονται στη διεργασία παραγωγής προϊόντων φρούτων και φρουτοχυμών είναι τα πηκτικά ένζυμα, τα οποία υδρολύουν τις πηκτινικές ενώσεις, που αποτελούν το βασικό δομικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των φρούτων. Οι πηκτινικές ενώσεις είναι πολυσακχαρίτες με δομική μονάδα το α-d-γαλακτουρονικό οξύ, το οποίο στην κεντρική αλυσίδα του πολυμερούς ενώνεται με α-1,4- γλυκοζιδικό δεσμό, ενώ τα καρβοξύλια είναι εστερεοποιημένα κυρίως με μεθυλομάδες Τα πηκτινικά ένζυμα διακρίνονται α) στις πηκτινεστεράσες, οι οποίες υδρολύουν τα εστεροποιημένα υδροξύλια της πηκτίνης και β) στις πηκτινάσες και πηκτινολυάσες, που υδρολύουν (με διαφορετικό μηχανισμό) τους α-1,4- γλυκοζιδικούς δεσμούς που συνδέουν τις μονάδες του α-d-γαλακτουρονικού οξέος Τόσο τα πηκτινικά ένζυμα, όσο οι αμυλάσες, οι ημικυτταρινάσες και οι κυτταρινάσες, συμμετέχουν στη μείωση της συνεκτικότητας του ιστού του φρούτου οδηγώντας στην εύκολη και αποτελεσματική εκχύλιση του χυμού, καθώς και στη μείωση του ιξώδους και στη διαύγασή του. Στο σχήμα 8.5 παρουσιάζεται μια τυπική διεργασία παρασκευής διαυγούς φρουτοχυμού. 197

206 Τεμαχισμός καρπού Πηκτινάση, πηκτινεστεράση, πηκτινολυάση, κυτταρινάση Αποσάρθρωση ιστού Εξαγωγή χυμού, παστερίωση Αποπηκτινοποίηση, διαύγαση Πηκτινάση, πηκτινεστεράση, πηκτινολυάση, αμυλάση Διήθηση, συμπύκνωση τυποποίηση Σχήμα 8.5 Στάδια επεξεργασία φρούτων για την παρασκευή διαυγούς χυμού. Εφαρμογή στην υφαντουργία Σημαντική εφαρμογή στην υφαντουργία αποτελεί η εφαρμογή ενζύμων για την απομάκρυνση της κόλλας από τα υφάσματα. Η επεξεργασία των υφασμάτων με κόλλα (συνήθως άμυλο) αυξάνει την αντοχή τους κατά την ύφανση. Η παρουσία όμως της κόλλας αποτελεί πρόβλημα για την περαιτέρω επεξεργασία των υφασμάτων (π.χ. βαφή). Η αφαίρεση του αμύλου από τα υφάσματα επιτυγχάνεται με τη χρήση βακτηριακών αμυλασών. Η διεργασία προϋποθέτει ήπιες συνθήκες, προστατεύοντας έτσι τις ίνες του υφάσματος. Σημαντική είναι η εφαρμογή ενζύμων (κυτταρινασών) τόσο στον βιοεξευγενισμό (bio-polishing) των υφασμάτων, όσο και στο φινίρισμα των υφασμάτων τύπου τζην. Ο βιο-εξευγενισμός αφορά στην επεξεργασία με κυτταρινάση για την απομάκρυνση μικροϊνιδίων από το ύφασμα, γεγονός που του προσδίδει μεγαλύτερη απαλότητα. Το φινίρισμα των υφασμάτων τύπου τζην αφορά στην ενζυμική επεξεργασία του υφάσματος με μίγμα κυτταρινασών, που έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση της χρωστικής του, ώστε αυτό να αποκτήσει την εμφάνιση φθαρμένου υφάσματος. Εφαρμογές στις ζωοτροφές Δύο κύριες κατηγορίες ενζύμων βρίσκουν εφαρμογή στις ζωοτροφές: α) ένζυμα υδρόλυσης πολυσακχαριτών, όπως οι β-γλυκανάσες και β) ένζυμα υδρόλυσης της εξαφωσφορικής ινοσιτόλης, όπως οι φυτάσες. Οι β-γλυκανάσες χρησιμοποιούνται 198

207 για την υδρόλυση πολυσακχαριτών των δημητριακών μεγάλης ενεργειακής αξίας (όπως οι β-γλυκάνες), οι οποίοι όμως δεν μπορούν να μεταβολιστούν και να αφομοιωθούν από τα ζώα και τα πουλερικά. Οι φυτάσες (από Aspergillus niger) αποσπούν φωσφορικές ομάδες από την εξαφωσφορική ινοσιτόλη, ένωση που περιέχει το μεγαλύτερο ποσοστό του συνολικού φωσφόρου των δημητριακών. Με τον τρόπο αυτό αντιμετωπίζεται η έλλειψη βιολογικά διαθέσιμου φωσφόρου κατά την εκτροφή πουλερικών και χοίρων. Η εφαρμογή των ενζύμων αφορά είτε στην προσθήκη τους στις ζωοτροφές, είτε στην ενζυμική τροποποίηση των ζωοτροφών πριν τη χορήγησή τους Εφαρμογές οξειδοαναγωγικών ενζύμων Ο όρος οξειδοαναγωγικά ένζυμα περιλαμβάνει τρεις ομάδες ενζύμων και συγκεκριμένα τις δεϋδρογονάσες, τις οξυγονάσες και τις οξειδάσες. Σε αντίθεση με τα υδρολυτικά ένζυμα, η έκφραση των καταλυτικών ιδιοτήτων των οξειδοαναγωγικών ενζύμων εξαρτάται από την παρουσία συνενζύμου, συνήθως το νικοτιναμίδιο (ΝAD + ), ή το φωσφορικό παράγωγό του NADP +, καθώς και παράγωγα φλαβινών, όπως το φλαβινομονο-νουκλεοτίδιο (FMN) και το φλαβινοαδενινοδινουκλεοτίδιο (FAD). Η αναγωγή ενός mole υποστρώματος προϋποθέτει την παράλληλη οξείδωση ενός mole συνενζύμου και αντίστροφα. Καθώς το κόστος των συνενζύμων είναι εξαιρετικά υψηλό, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα, ώστε αυτά να αναγεννιόνται κατά τη διάρκεια της διεργασίας. Συχνά, στις ενζυμικά καταλυόμενες αντιδράσεις οξείδωσης και αναγωγής τον ρόλο του βιοκαταλύτη διαδραματίζουν ολόκληρα κύτταρα, γεγονός που εξασφαλίζει την αναγέννηση του συνενζύμου. Για παράδειγμα, η αναγωγή κετονών επιτυγχάνεται κατά την ανάπτυξη κυττάρων ζύμης με παράλληλη οξείδωση του σακχάρου, που χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα στο μέσο ανάπτυξης της ζύμης. Τα οξειδοαναγωγικά ένζυμα βρίσκουν τελευταία σημαντική εφαρμογή στο πεδίο των ενζυμικών βιομετατροπών και ιδιαίτερα στη σύνθεση οπτικά ενεργών ενώσεων, που ενδιαφέρουν τη φαρμακευτική και χημική βιομηχανία (βλ. παράγραφο 8.3). Η καταλάση και η οξειδάση της γλυκόζης είναι τα δύο οξειδοαναγωγικά ένζυμα που βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία. Η καταλάση είναι ένζυμο που καταλύει τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου προς μοριακό οξυγόνο και νερό. Η βιομηχανική εφαρμογή του ενζύμου αυτού σχετίζεται με διεργασίες που απαιτούν την απομάκρυνση του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Για παράδειγμα, η 199

208 καταλάση από μύκητα βρίσκει εφαρμογή στην υφαντουργία κατά την εξουδετέρωση του Η2Ο2, που χρησιμοποιείται ως λευκαντικό φυσικών ινών, όπως είναι το βαμβάκι. Παράλληλα, το ένζυμο χρησιμοποιείται για την απαλλαγή υπολειμμάτων Η2Ο2, το οποίο χρησιμοποιείται ως βακτηριοστατικό στο γάλα και το τυρόγαλα σε περιπτώσεις αδυναμίας συντήρησης των προϊόντων αυτών (π.χ. σε ψυχρούς θαλάμους ή με παστερίωση). Η οξειδάση της γλυκόζης καταλύει την αντίδραση οξείδωσης της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ σύμφωνα με την αντίδραση: οξειδάση της γλυκόζης β-d-γλυκόζη + H 2 O + 1/2 O 2 δ-γλυκονολακτόνη D-γλυκονικό οξύ + Η 2 Ο 2 (3.1) FAD FADH 2 Το ένζυμο αυτό βρίσκει εφαρμογή σε βιοαισθητήρες για την ανίχνευση της γλυκόζης στο αίμα σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη. Βιοαισθητήρας ονομάζεται μια αναλυτική συσκευή ευαίσθητη σε ένα φυσικό ή χημικό ερέθισμα, η οποία μετατρέπει μια βιολογική απόκριση σε ηλεκτρικό σήμα μεταδίδοντας πληροφορίες για μια ζωτική διαδικασία. Ο πρώτος βιοαισθητήρας που κυκλοφόρησε στο εμπόριο είναι αυτός για την ανίχνευση γλυκόζης στο αίμα σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη Ο αισθητήρας βασίζεται στην οξείδωση της γλυκόζης με το ένζυμο οξειδάση της γλυκόζης Σήμερα υπάρχουν πολλοί βιοαισθητήρες ανίχνευσης βιοχημικών και άλλων οργανικών ενώσεων όπως αυτός που παρουσιάζεται στο επόμενο σχήμα. 200

209 Σχηματική παράσταση ενός βιοαισθητήρα με ένζυμο μια ακινητοποιημένη λακκάση που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση φαινολικών ενώσεων σε διάφορα δείγματα Η προς ανίχνευση ένωση οξειδώνεται και παράγονται ηλεκτρόνια (σήμα), το σήμα μεταβιβάζεται, ενισχύεται (amplifier) και καταλήγει στον επεξεργαστή όπου τελικά ποσοτικοποιείται. Η λειτουργία ενός ενζυμικού βιοαισθητήρα χαρακτηρίζεται από τα ακόλουθα στάδια. Το βιολογικό σήμα είναι αποτέλεσμα μιας ή περισσοτέρων ενζυμικών αντιδράσεων που καταλύονται από ένα ή περισσότερα ένζυμα ακινητοποιημένα οε στερεό φορέα. Αποτέλεσμα της αντίδρασης αυτής είναι η μεταβολή κάποια χημικής ή φυσικής παραμέτρου στο βιολογικό σύστημα (όπως συγκέντρωση ιόντων, πρωτονίων, οξυγόνου, αερίων, μεταβολή θερμότητας κ.ά). Η μεταβολή αυτή αποτελεί το «σήμα» Το σήμα μεταφέρεται στον μετατροπέα ή μεταλλάκτη (transducer) o oποίος μετατρέπει το σήμα σε μετρήσιμη μορφή (ρεύμα, δυναμικό, απορρόφηση, θερμοκρασία). Το σήμα αυτό διορθώνεται αφού συγκριθεί με το σήμα αναφοράς (reference) το οποίο αντιστοιχεί σε σήμα δίχως τo βιολογικό σύστημα. Το σήμα στη συνέχεια μπορεί να ενισχυθεί (amplifier), να αναλυθεί και να αποθηκευτεί. Aνάλογα με την αρχή λειτουργίας τους οι ενζυμικοί βιοαισθητήρες διακρίνονται σε ηλεκτροχημικούς (ένταση ρεύματος), οπτικούς (απορρόφηση, φθορισμός, χημειφωταύγεια, βιοφωταύγεια) πιεζοηλεκτρικούς (δυναμικό), ακουστικούς (ακουστικό κύμα) και αγωγιμετρικούς (αγωγιμότητα) 201

210 8.4. Εφαρμογή των ενζύμων στη σύνθεση φαρμακευτικών ενώσεων Η πλειοψηφία των βιοχημικών διεργασιών, στις οποίες μια φαρμακευτική ουσία εμπλέκεται, όπως για παράδειγμα η αναστολή ενζύμων, η μεταφορά της διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, καθώς και η σύνδεσή της με εξειδικευμένους υποδοχείς, εξαρτάται από τη στερεοχημεία του μορίου της ένωσης αυτής. Σήμερα είναι γνωστό ότι, η βιολογική δραστικότητα, η τοξικότητα, η διάθεση, αλλά και ο μεταβολισμός, διαφέρουν σημαντικά για τον κάθε οπτικό αντίποδα ενός ρακεμικού φαρμάκου. Έτσι, ο ένας οπτικός αντίποδας μπορεί να διαθέτει θεραπευτική δράση, ενώ ο άλλος όχι, ή ακόμη και να είναι τοξικός. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η βιολογικά δραστική ένωση Dopa, της οποίας ο (S) οπτικός αντίποδας χρησιμοποιείται στη θεραπεία της ασθένειας Parkinson, ενώ ο (R) αντίποδας εμφανίζει σοβαρές παρενέργειες. Μεταξύ των μεθόδων και τεχνικών που έχουν βρει εφαρμογή στην παρασκευή οπτικά ενεργών ενώσεων, πρωταγωνιστικό ρόλο έχει η χρήση βιολογικών καταλυτών (απομονωμένων ενζύμων ή μικροοργανισμών). Αυτό είναι αποτέλεσμα των χαρακτηριστικών ιδιοτήτων των ενζύμων και συγκεκριμένα: α) της δυνατότητας να δέχονται ως υποστρώματα όχι μόνο φυσικά, αλλά και συνθετικά υποστρώματα, και β) της εξαιρετικής εκλεκτικότητας ως προς τα δομικά χαρακτηριστικά των υποστρωμάτων. Η εκλεκτικότητα αυτή αναφέρεται τόσο στην τοπο-εκλεκτικότητα (regio-selectivity), όσο και στην εναντιο-εκλεκτικότητα (enantio-selectivity). Οι χαρακτηριστικές αυτές ιδιότητες συνοδεύουν την εφαρμογή των ενζύμων σε πολύπλοκες διεργασίες, έχοντας ως αποτέλεσμα την ελαχιστοποίηση της εμφάνισης παραπροϊόντων. Γενικότερα, η σύνθεση και παραγωγή εναντιομερών ενώσεων επιτυγχάνεται με δύο κυρίως μεθόδους: α) την ασύμμετρη σύνθεση, ξεκινώντας από προχειρόμορφα ή μεσο-μορφής υποστρώματα β) τον κινητικό διαχωρισμό ρακεμικών μιγμάτων. Και στις δύο μεθόδους, ο ρόλος των ενζύμων ως χειρόμορφων καταλυτών είναι πρωταρχικός. Η μέθοδος, η οποία θα επιλεγεί, εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, όπως είναι το κόστος του αρχικού υποστρώματος, ο αριθμός των συνθετικών σταδίων, καθώς και η δυνατότητα παραγωγής σε μεγάλη κλίμακα κλπ. 202

211 8.5 Εφαρμογές ενζύμων ως θεραπευτικά μέσα Αξιοσημείωτες είναι οι εφαρμογές των ενζύμων ως θεραπευτικά μέσα, η εφαρμογή τους αφορά α) στη θεραπευτική αντικατάσταση ως εξωγενή ένζυμα και β) ως θεραπευτικοί παράγοντες. Διάφοροι τρόποι αντιμετώπισης των προβλημάτων χορήγησης έχουν προταθεί αφορούν στην μικροεγκαψυλλίωση των ενζύμων σε μη ανοσογόνα υλικά, εγκλωβισμός σε λιποσώματα τα οποία στην επιφάνειά τους διαθέτουν ομάδες συγγένειας για να αναγνωρίζονται από αντίστοιχους υποδοχείς σε ιστούς-στόχους. Θεραπευτική αντικατάσταση ενζύμων. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ α-αντιθρυψίνη τροποποιημένη Μet358Val ώστε να είναι ανθεκτική σε Το ένζυμο υδρολύει την ελαστάση και έτσι ελέγχει τα Πνευμονικά νοσήματα (Κυστική ίνωση, βρογχίτιδα, εμφύσημα) οξειδωτικό περιβάλλον (π.χ σε καπνιστές) επίπεδά της Υδρολάση της Έλλειψη του ενζύμου οδηγεί σε αδυναμία μεταβολισμού της Φαινυλκετονούρια φαινυλαλανίνης φαινυλαλανίνης Παγκρεατικά ένζυμα (λιπάση πρωτεάση, Ενζυμα πέψης πρωτεϊνών, Ασθένειες του παγκρέατος αμυλάση, νουκλεάση) Παγκρεατίνη από χοίρο λιπών, πολυσακχαριτών Λακτάση Υδρόλυση της λακτόζης Δυσανεξία σε γαλακτοκομικά Απαμινάση αδενοσίνης Η έλλειψη του ενζύμου οδηγεί σε μη λειτουργικά Τ- και Β- κύτταρα Νόσος SCID Γενετικά κληρονομούμενη ανοσοανεπάρκεια Γύκοκερεβροζιδάση Τροποποιημένο ένζυμο Ηis495Arg με τροποιημένη υδατανθρακική περιοχή Το ένζυμο υδρολύει το γλυκοκερεραμίδιο η συσσώρευση του οποίου στα λυσοσώματα οδηγεί σε σοβαρές ασθένειες Νόσος του Gaucher (γενετική ασθένεια) 203

212 Τα ένζυμα ως θεραπευτικά μέσα. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ DNAάση Κυστική ίνωση (Κλωνοποιημένη ανθρώπινη δεοξυρυβονουκλεάση Ι) σε εισπνεόμενη μορφή Υδρολύει το DNA της βλέννας στους πνεύμονες (συσσώρευση πηκτής βλέννας στους πνεύμονες) L-ασπαραγινάση Εξωγενής χορήγηση Το ένζυμο μετατρέπει την L-ασπαραγίνη σε L-ασπαραγινικό και έτσι μειώνει την L-ασπαραγίνη που είναι απαραίτητο αμινοξύ για τον πολλαπλασιασμό των Λεμφοκυτταρική λευχαιμία καρκινικών κυττάρων τα οποία, σε αντίθεση με τα υγιή, δεν μπορούν να συνθέσουν το αμινοξύ αυτό Θρομβολυτικά ένζυμα Μη πρωτεολυτικές πρωτεΐνες όπως η στρεπτοκινάση και Θρομβόλυση (Τα ένζυμα μετατρέπουν το πλασμινογόνο σε πλασμίνη η οποία λύει Θρομβολυτική θεραπεία σταφυλοκινάση. Πρωτεολυτικά ένζυμα όπως η ουροκινάση και ο ιστικός ενεργοποιητής του πλασμινογόνου Η σερονοπρωτεάση ancord το ινώδες των θρόμβων) Δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) Καταλάση Η SOD καταλύει τη μετατροπή - σουπεροξειδικών ριζών (Ο 2 ) σε Η 2Ο 2. Οι ρίζες σουπεροξειδίου προξενούν κυτταρικές βλάβες καθώς προσβάλουν τα ακόρεστα λιπαρά των μεμβρανών. Η καταλάση μετατρέπει το Η 2Ο 2 σ ε Η 2Ο Πρόληψη καταστροφής ιστών από οξειδωτικής καταπόνηση 204

213 9. ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 9.1 Γενικά Η ακινητοποίηση (immobilization) ή καθήλωση των βιοκαταλυτών είναι μια ευρέως διαδεδομένη τεχνική, που βρίσκει εφαρμογή τόσο σε αναλυτικές και θεραπευτικές εφαρμογές, όσο και σε μεγάλης κλίμακας βιομηχανικές διεργασίες. Με τον όρο ακινητοποίηση ενζύμων ή κυττάρων αναφερόμαστε στον περιορισμό τους σε μια τεχνητή στερεά φάση (αδιάλυτο υλικό-υπόστρωμα στήριξης), στην οποία διατηρούνται οι καταλυτικές ιδιότητες και η σταθερότητά τους, έτσι ώστε το βιοκαταλυτικό αυτό σύστημα να μπορεί να χρησιμοποιηθεί επαναλαμβανόμενα και συνεχώς. Η ακινητοποίηση γίνεται με τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτρέπεται η αμφίδρομη μεταφορά αντιδρώντων (υποστρώματα), προϊόντων, οξυγόνου κ.λ.π. μεταξύ της βιοκαταλυτικής στερεάς φάσης και μιας κύριας υγρής φάσης. Η εφαρμογή των ακινητοποιημένων βιοκαταλυτών συνοδεύεται από μια σειρά σημαντικών πλεονεκτημάτων όπως: Οι βιοκαταλύτες που μπορούν να ακινητοποιηθούν είναι ελεύθερα απομονωμένα ένζυμα, πολυενζυμικά συστήματα, ενεργά μικροβιακά κύτταρα, καθώς επίσης φυτικοί και ζωικοί ιστοί. Η ακινητοποίηση απομονωμένων ενζύμων βρίσκει εφαρμογή στην ανάπτυξη βιοαισθητήρων και στην παρασκευή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Σε λιγότερο καθαρή μορφή, τα ακινητοποιημένα ένζυμα εφαρμόζονται σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες, που αφορούν στη βιομηχανία υδατανθράκων, τροφίμων και φαρμάκων. 205

214 Η εφαρμογή των ακινητοποιημένων κυτταρικών συστημάτων εκμεταλλεύεται τη φυσική τάση τους να προσκολλώνται σε στερεές επιφάνειες και στην περίπτωση των ζωντανών κυττάρων να πολλαπλασιάζονται. Χαρακτηριστική εφαρμογή ακινητοποίησης ζωντανών κυττάρων είναι η παραγωγή αιθανόλης από σάκχαρα, όπου χρησιμοποιούνται κύτταρα ζύμης ή βακτήρια, τα οποία ακινητοποιούνται σε ειδικούς βιοαντιδραστήρες ανάπτυξης κυττάρων. Άλλες εφαρμογές σχετίζονται με τη χρήση ακινητοποιημένων ανενεργών κυττάρων σε βιομετατροπές, που οδηγούν στην παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων και αμινοξέων Μέθοδοι και τεχνικές ακινητοποίησης βιοκαταλυτών. H ακινητοποίηση των βιοκαταλυτών σε φορείς αδιάλυτους στο νερό επιτυγχάνεται τόσο με χημικές, όσο και με φυσικές μεθόδους, οι οποίες περιλαμβάνουν διάφορες τεχνικές (βλ. σχήμα 9.1). Σχήμα 9.1. Σχηματική απόδοση χαρακτηριστικών τρόπων ακινητοποίησης ενζύμων 206

215 Στις φυσικές μεθόδους ακινητοποίησης, ο βιοκαταλύτης είτε προσροφάται στην επιφάνεια του φορέα, είτε εγκλωβίζεται σε μη υδατοδιαλυτές πηκτές πολυμερών, ενθυλακώνεται σε αδρανείς ημιπερατές μεμβράνες ή μικροκάψουλες, είτε τέλος περιορίζεται σε λιποσώματα. Οι χημικές μέθοδοι χαρακτηρίζονται από το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών, είτε μεταξύ του φορέα και του βιοκαταλύτη, είτε μεταξύ των μορίων του βιοκαταλύτη (ενζύμου). Οι πιο διαδεδομένες τεχνικές χημικής ακινητοποίησης είναι η διαμοριακή σύνδεση (cross-linking) των ενζυμικών μορίων και η ομοιοπολική (covalent binding) σύνδεση σε ενεργοποιημένο φορέα. Η διαμοριακή σύνδεση μέσω διλειτουργικών υποκαταστατών (bi-functional agents) συνδυάζεται συνήθως με προσρόφηση ή παγίδευση των ενζύμων. Η παραπάνω ομαδοποίηση των μεθόδων ακινητοποίησης είναι συμβατική, αφού κάθε μία από αυτές έχει πολλές παραλλαγές και σε αρκετές περιπτώσεις, η ακινητοποίηση ενός ενζύμου είναι αποτέλεσμα συνδυασμού των μεθόδων αυτών Φυσικές μέθοδοι προσρόφησης βιοκαταλυτών Προσρόφηση και ιοντική σύνδεση: Η προσρόφηση (adsorption) σε στερεό φορέα αποτελεί την απλούστερη και παλαιότερη τεχνική ακινητοποίησης βιοκαταλυτών. Ανάλογα με τη φύση του φορέα, οι δυνάμεις που οδηγούν το βιοκαταλύτη σε προσρόφηση είναι ασθενείς δυνάμεις van der Waals, ηλεκτροστατικές ή υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και δεσμοί υδρογόνου. Η ακινητοποίηση επιτυγχάνεται κατά την επαφή υδατικού διαλύματος του ενζύμου με το προσροφητικό μέσο για κάποια χρονική περίοδο, μετά την πάροδο της οποίας η περίσσεια του ενζύμου απομακρύνεται από το διάλυμα. Κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου αποτελεί τόσο το χαμηλό κόστος, όσο και το γεγονός ότι οι βιοκαταλύτες, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, διατηρούν τη φυσική τους διαμόρφωση και κατά συνέπεια τις καταλυτικές τους ιδιότητες. Αντίθετα, η γενικευμένη εφαρμογή της μεθόδου περιορίζεται σημαντικά από την ασθενή φύση του δεσμού μεταξύ φορέα και βιοκαταλύτη. Είναι χαρακτηριστικό ότι, η παραμονή του βιοκαταλύτη στο φορέα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από παράγοντες, όπως το ph, η ιοντική ισχύς και η διηλεκτρική σταθερά του μέσου, στο οποίο εξελίσσεται μια βιοκαταλυόμενη διεργασία. Το γεγονός αυτό αποτελεί σημαντικό μειονέκτημα της εφαρμογής των προσροφημένων βιοκαταλυτών σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες, καθώς σημαντική ποσότητα βιοκαταλύτη εύκολα 207

216 απομακρύνεται από το στερεό φορέα. Αυτό επιδρά αρνητικά τόσο στην παραγωγικότητα της διεργασίας, όσο και στην καθαρότητα του τελικού προϊόντος. Το παραπάνω μειονέκτημα, θεωρούμενο από άλλη οπτική γωνία, αποτελεί πλεονέκτημα της τεχνικής, καθώς καθίσταται εύκολη η αναγέννηση του βιοκαταλυτικού φορέα, δηλαδή η αντικατάσταση του αδρανούς βιοκαταλύτη με νέα δραστική ποσότητα. Ως φορείς ακινητοποίησης μέσω προσρόφησης σε στερεό φορέα έχουν χρησιμοποιηθεί τόσο ανόργανα υλικά (αλουμίνα, μπετονίτης, πηκτή πυρολίθου κ.ά.), όσο και οργανικά υλικά, τα οποία μπορεί να είναι φυσικά (πολυσακχαρίτες, πρωτεΐνες) ή συνθετικά πολυμερή (πολυστυρένια, πολυαμίδια, πολυακρυλικά κ.ά.). Αντίστοιχα, ως φορείς για την ιοντική σύνδεση βιοκαταλυτών χρησιμοποιούνται πολυσακχαρίτες (παράγωγα κυτταρίνης, δεξτράνες κ.ά.) ή συνθετικά πολυμερή που φέρουν ομάδες ανιοντικών ή κατιοντικών ανταλλακτών (DEAE-κυτταρίνη, CMκυτταρίνη κ.ά.). Ενζυμο Σχηματική απεικόνιση της ακινητοποίησης ενζύμου μέσω προσρόφησης. Το προσροφητικό υλικό πρέπει να έχει υψηλή προσροφητική χωρητικότητα, μεγάλη συγγένεια με το προσροφούμενο βιομόριο και να μην προσροφά τα προϊόντα αντίδρασης ή τους αναστολείς του ενζύμου. Τέλος, το βιομόριο πρέπει να προσροφάται κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να διατηρεί το μεγαλύτερο ποσοστό της ενεργότητάς του. Τα προσροφούμενα βιομόρια διατηρούν πολύ υψηλό ποσοστό ή σχεδόν όλη την αρχική τους ενεργότητα, ανάλογα με τη φύση των αναπτυσσόμενων δεσμών, οι οποίοι δεν προκαλούν καταστροφή των ενεργών κέντρων. Έχει επίσης αποδειχτεί ότι, η μέγιστη προσρόφηση των ενζύμων επιτυγχάνεται κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης. 208

217 Η προσρόφηση πρωτεϊνών στην επιφάνεια ενός υλικού είναι μία αντιστρεπτή διαδικασία, γι αυτό οι συνθήκες παρασκευής και λειτουργίας (ph, ιοντική ισχύς, θερμοκρασία, διαλύτης), πρέπει να διατηρούνται σταθερές. Αλλαγές των συνθηκών λειτουργίας μπορούν να προκαλέσουν την εκρόφηση του ενζύμου με αποτέλεσμα τη μείωση της ενζυμικής του δραστικότητας. Χαρακτηριστικό παράδειγμα βιομηχανικής εφαρμογής ακινητοποίησης με ιοντική σύνδεση αποτελεί η καθήλωση της ισομεράσης της γλυκόζης από Streptomyces rubiginous (που καταλύει την ισομερίωση της γλυκόζης σε φρουκτόζη) σε DEAE-κυτταρίνη. Αντίστοιχα, η φυσική προσρόφηση βιοκαταλυτών σε στερεό φορέα βρίσκει σήμερα διαρκώς αυξανόμενη εφαρμογή στη μη υδατική βιοκατάλυση (βλ. κεφάλαιο 9). Η χρήση της ακινητοποιημένης λιπάσης από Rhizomucor miehei στην παραγωγή λιπών (υποκατάστατα του βούτυρου-κακάο) σε οργανικούς διαλύτες αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα με βιομηχανική εφαρμογή (βλ. κεφ.9) Εγκλωβισμός (παγίδευση) σε πλέγμα: Με τον όρο εγκλωβισμό ή παγίδευση (entrapment) αναφερόμαστε στον περιορισμό των βιοκαταλυτών στο εσωτερικό της δομής πολυμερούς υλικού (πλέγματος), που αποτελεί το φορέα. Η μέθοδος εκμεταλλεύεται τη διαφορά μεγέθους μεταξύ υποστρώματος ή προϊόντος, τα οποία κινούνται ελεύθερα μεταξύ της εξωτερικής υγρής φάσης και του πλέγματος, στο εσωτερικό του οποίου ο βιοκαταλύτης παραμένει εγκλωβισμένος. Κρίσιμο κατά συνέπεια παράγοντα για την αποτελεσματικότητα της ακινητοποίησης μέσω εγκλωβισμού, αποτελεί το μέγεθος των πόρων του φορέα, το οποίο θα πρέπει να είναι τέτοιο ώστε να ελαχιστοποιεί τα φαινόμενα περιορισμού της μεταφοράς ουσιών λόγω του μοριακού τους μεγέθους. 209

218 Ενζυμο Εγκλωβισμός ενζύμου σε πλέγμα Kατά τον εγκλωβισμό σε πολυμερή υλικά δεν αναπτύσσονται ισχυρές δυνάμεις σύνδεσης μεταξύ φορέα και βιοκαταλύτη και έτσι σε γενικές γραμμές δεν παρατηρείται απώλεια της καταλυτικής δραστικότητας. Ο εγκλωβισμός γενικά θεωρείται ως η καταλληλότερη τεχνική για την ακινητοποίηση κυττάρων και μεγαλομοριακών συστημάτων. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι η περιορισμένη διάχυση υποκαταστατών υψηλού μοριακού βάρους, όπως τα νουκλεϊνικά οξέα, η οποία συνεπάγεται υψηλούς χρόνους απόκρισης και χαμηλά ποσοστά μετατροπής και η συνεχής απώλεια της ενζυμικής ενεργότητας λόγω της εκρόφησης του ενζύμου από το τρισδιάστατο πλέγμα του πολυμερούς. Η εκρόφηση του ενζύμου οφείλεται στην ανομοιογένεια του πλέγματος και παρατηρείται κυρίως κατά τα πρώτα στάδια της χρήσης του. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να ξεπεραστεί, αν η παγίδευση συνδυαστεί με διαμοριακή σύνδεση των βιομορίων με τη χρησιμοποίηση διαφόρων δι-λειτουργικών (bifunctional agents) υποκαταστάτων, όπως η γλουταραλδεϋδη (βλέπε παρακάτω). Τέλος, σε αρκετές περιπτώσεις έχει αναφερθεί απώλεια της ενζυμικής ενεργότητας λόγω της δράσης ελευθέρων ριζών, οι οποίες δημιουργούνται κατά το σχηματισμό των πολυμερών. Το πλέγμα εγκλωβισμού παρασκευάζεται: α) μέσω του in situ πολυμερισμού αρχικών μονομερών παρουσία του βιοκαταλύτη β) μέσω της δημιουργίας πηκτωμάτων (gels) ορισμένων φυσικών πολυμερών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα πολυμερούς υλικού αποτελεί το πολυακρυλαμίδιο, το οποίο παρασκευάζεται από μονομερή συστατικά ακρυλαμιδίου και Ν,Ν -μεθυλενο- 210

219 δισ-ακρυλαμιδίου παρουσία Κ2S2O5. H μέθοδος βρίσκει εφαρμογή κυρίως στον εγκλωβισμό ενζύμων, όχι όμως και κυττάρων, κυρίως λόγω της τοξικότητας των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται. Αντίθετα, τα πηκτώματα που παρασκευάζονται με βάση φυσικά βιοπολυμερή, όπως το άγαρ, η κ-καρραγενάνη, το αλγινικό ασβέστιο και η ζελατίνη, δεν παρουσιάζουν προβλήματα τοξικότητας και χρησιμοποιούνται ευρέως στην ακινητοποίηση τόσο ενζύμων, όσο και ολόκληρων κυττάρων. Η δημιουργία πηκτωμάτων βασίζεται στη διαλυτοποίηση του πολυμερούς σε θερμοκρασία που εξαρτάται από το είδος του πολυμερούς (συνήθως πάνω από 40 ο C). Στο διάλυμα προστίθεται ο βιοκαταλύτης (π.χ. εναιώρημα κυττάρων) και το θερμό μίγμα πηκτωματοποιείται καθώς η θερμοκρασία μειώνεται, είτε σε οργανικό διαλύτη, όπως στην περίπτωση της ζελατίνης, είτε, όπως στην περίπτωση του αλγινικού νατρίου, σε υδατικό διάλυμα άλατος, όπως είναι το CaCl2. Κρίσιμος παράγοντας θεωρείται ο έλεγχος του μεγέθους των πόρων των πηκτωμάτων, ο οποίος συνδέεται τόσο με τη σταθερότητα του φορέα, όσο και με τη διάχυση των αντιδρώντων. Αρκετά είναι τα παραδείγματα που αφορούν στη βιομηχανική εφαρμογή των ακινητοποιημένων βιοκαταλυτών (κυρίως κυττάρων) σε πολυμερή πλέγματα και πηκτώματα, όπως η παραγωγή αμινοξέων (L-ασπαρτικού και L-ισολευκίνης), L- μηλικού, υδροκινόνης και ακρυλαμιδίου. Εγκλωβισμός ή Ενθυλάκωση (encapsulation) σε μεμβράνες: Ο τύπος αυτός ακινητοποίησης αφορά στον εγκλωβισμό των βιοκαταλυτών στο εσωτερικό ημιπερατών μεμβρανών που έχουν τη μορφή μικροσφαιριδίων ή μικροκαψυλλίων, των οποίων η διάμετρος είναι μικρότερη από 100 μm. Τα μόρια του βιοκαταλύτη βρίσκονται έτσι ελεύθερα και διαλυμένα σε εξαιρετικά μικρό όγκο νερού στο εσωτερικό των μικροκαψυλλίων. Ο εγκλωβισμός σε μικροκάψουλες συχνά αναφέρεται με τον όρο εγκαψυλλίωση ή ενθυλάκωση (encapsulation). H ημιπερατή μεμβράνη διαθέτει πόρους, το μέγεθος των οποίων είναι τέτοιο ώστε να εμποδίζεται η έξοδος των μορίων του βιοκαταλύτη, αλλά ταυτόχρονα να επιτρέπεται η διέλευση των υποστρωμάτων και των προϊόντων. Οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται συνήθως σε αυτή τη μέθοδο είναι: 1) οξικής κυτταρίνης (cellulose acetate) 2) πολυκαρβονικές (polycarbonate). 3) κολλαγόνο (collagen) 211

220 4) νανοσωματίδια CaCO3 Η ακινητοποίηση βιοκαταλυτών (κυρίως ενζύμων) με την τεχνική της εγκαψυλλίωσης χαρακτηρίζεται από α) μεγάλη ειδική επιφάνεια, β) υψηλό βαθμό συγκράτησης του ενζύμου, γ) υψηλή ταχύτητα μεταφοράς μάζας και δ) δυνατότητα ακινητοποίησης διαφορετικών ενζύμων. Αυτός ο τύπος ακινητοποίησης βρίσκει εφαρμογή σε διαδικασίες όπως η τροποποίηση λιπιδίων και λαδιών με λιπάσες, καθώς και η σύνθεση διπεπτιδίων με πρωτεάσες σε οργανικά συστήματα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η εφαρμογή μεμβρανικών αντιδραστήρων, των οποίων η μεμβράνη είναι διαπερατή μόνο για το προϊόν (βλ. κεφαλ.10). Αντιδραστήρες του τύπου αυτού βρίσκουν εφαρμογή στη μετατροπή βιοπολυμερών, όπως το άμυλο, η κυτταρίνη ή πρωτεΐνες. Εγκλωβισμός ενζύμων σε ημιπερατή μεμβράνη και λιποσώματα Υπάρχουν αρκετές εκδοχές της γενικής μεθοδολογίας που αφορά στην εγκαψυλίωση των ενζύμων. Μια από αυτές αφορά στον εγκλωβισμό των ενζύμων στο εσωτερικό αντίστροφων μικυλλίων (reverse micelles). Τα αντίστροφα μικύλλια σχηματίζονται με απλή προσθήκη μικρής ποσότητας νερού σε ένα μη πολικό οργανικό διαλύτη (εξάνιο, ισοοκτάνιο), ο οποίος περιέχει κάποιο συνθετικό ή φυσικό επιφανειοενεργό. Τα μόρια του επιφανειοενεργού συσσωματώνονται και προσανατολίζονται στη μεσεπιφάνεια των δύο φάσεων με τέτοιο τρόπο, ώστε η πολική τους κεφαλή να είναι στραμμένη προς την υδατική φάση, ενώ η υδρόφοβη αλυσίδα προς τον κυρίως οργανικό διαλύτη. Η συσσωμάτωση των επιφανειοενεργών έχει σαν αποτέλεσμα το σχηματισμό των αντίστροφων μικυλλίων, δηλαδή θυλάκων νερού (waterpools) με διάμετρο έως 100Å, που περιβάλλονται από μόρια του επιφανειοενεργού και βρίσκονται λεπτότατα διεσπαρμένα στον οργανικό διαλύτη. Τα 212

221 αντίστροφα μικύλλια επιτρέπουν στο ένζυμο να παραμένει διαλυτό στην υδατική μικροφάση, ενώ τα μόρια των υποστρωμάτων και προϊόντων να διαχέονται από και προς την οργανική φάση του συστήματος. Η τεχνική αυτή βρίσκει εφαρμογή σε βιοκαταλυτικές αντιδράσεις, οι οποίες αφορούν μη υδατοδιαλυτά υποστρώματα (βλ. κεφ.9). Aκινητοποίηση σε sol-gels Τα sol-gel είναι μήτρες από ανόργανα υλικά, κυρίως ενώσεις του πυριτίου, αλουμινίου, διοξείδιο του τιτανίου, διοξείδιο του ζιρκονίου, αλλά και άλλα οξείδια μετάλλων. Iδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι μήτρες σιλανίων και διοξειδίου του πυριτίου, όπως τα αλκοξείδια Si(OR)4, ή αλκοξυσιλάνια του τύπου XSi(OR)3 ή του τύπου XX Si(OR)2, όπου Χ και Χ είναι οργανικές ομάδες, οι οποίες ενώνονται άμεσα με το άτομο του πυριτίου μέσω ενός οργανομεταλλικού δεσμού. Τα πιο κοινά χρησιμοποιούμενα αλκοξείδια είναι το τετραμεθυλοξυ-σιλάνιο (TMOS) και το τετρααιθυλοξυ-σιλάνιο (TEOS), τα οποία έχουν μία μεθυλ- και μία αιθυλ- ομάδα στη θέση του R του γενικού τύπου. Τα αλκοξείδια δημιουργούν αυθόρμητα σύμπλοκα πολυμερών διαφόρων μεγεθών, στο εσωτερικό των οποίων μπορούν να εγκλωβιστούν βιομόρια, ένζυμα, πρωτεΐνες, αλλά και κύτταρα σύμφωνα με τα σχήματα 9.2. Σε μια αποτελεσματική εγκαψυλίωση θα πρέπει να έχει μείνει ικανοποιητικός χώρος στο ένζυμο, ώστε να διεκπεραιώνει τις αλλαγές της διαμόρφωσης που χρειάζονται για την καταλυτική του δράση, αλλά και οι πόροι που διαπερνούν το δίκτυο να είναι αρκετά μεγάλοι, ώστε να επιτρέπουν την ελεύθερη διάχυση των υποστρωμάτων και προϊόντων. Σχήμα 9.2. Ακινητοποίηση ενζύμου σε sol gel 213

222 Καθώς υπάρχουν πολλοί παράγοντες που μπορεί να οδηγήσουν στην αποδιάταξη της δομής των βιομορίων κατά την παρασκευή των sol gels, η μέθοδος συχνά περιλαμβάνει τη χρήση προσθέτων (κυρίως πολύ-υδροξυλιωμένων ενώσεων). Οι εφαρμογές αυτών των υλικών είναι αρκετές, όχι όμως στη βιοτεχνολογική παραγωγή προϊόντων. Λόγω των ιδιοτήτων τους χρησιμοποιούνται είτε σε βιοαισθητήρες, είτε σε αναλυτικές μεθόδους, για παράδειγμα ως στερεή φάση στην χρωματογραφία συγγένειας Χημικές τεχνικές ακινητοποίησης Ομοιοπολική σύνδεση του βιοκαταλύτη με το φορέα: Η μέθοδος της ομοιοπολικής σύνδεσης του βιοκαταλύτη (ένζυμο) με το φορέα βασίζεται στο σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ των υπολειμμάτων των αμινοξέων του ενζύμου και δραστικών χημικών ομάδων του φορέα. Οι ελεύθερες χημικές ομάδες ενός πρωτεϊνικού μορίου, που συμμετέχουν στο σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών με το φορέα ακινητοποίησης, είναι η ε-αμινομάδα (-ΝH2) της Lys, η α-αμινομάδα του αμινοτελικού άκρου του πρωτεϊνικού μορίου, η σουλφυδρυλομάδα (-SH) της Cys, οι υδροξυλομάδες (-ΟΗ) της Tyr, Ser και Thr, οι καρβοξυλομάδες (-COOH) του Asp και Glu, καθώς και η γουανιδινομάδα της Αrg. Μερικές από τις πλέον συνηθισμένες αντιδράσεις ομοιοπολικής σύνδεσης ενός ενζύμου σε στερεό φορέα περιγράφονται στο σχήμα 9.4. Η δραστικότητα των σπουδαιότερων από τις παραπάνω ομάδες με τα πιο συνήθη αντιδραστήρια ομοιοπολικής σύνδεσης φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί: 214

223 Κατά την ομοιοπολική σύνδεση, τα βιομόρια βρίσκονται σε μία κατάσταση που μοιάζει με το φυσικό τους περιβάλλον, με αποτέλεσμα να παρουσιάζουν υψηλή ενεργότητα, μεγάλους χρόνους ημιζωής και έχουν το πρόσθετο πλεονέκτημα της μη αντιστρεπτής πορείας ακινητοποίησης κατά τη μεταβολή διαφόρων παραμέτρων, όπως το ph, η ιοντική ισχύς, η θερμοκρασία και ο διαλύτης. Η πορεία ακινητοποίησης με ομοιοπολική σύνδεση περιλαμβάνει τρία βασικά στάδια: 1) Ενεργοποίηση της επιφάνειας του υλικού στήριξης, 2) Ομοιοπολική σύνδεση του βιομορίου και 3) Απομάκρυνση της μη ακινητοποιημένης ποσότητας του βιομορίου. Η ομοιοπολική σύνδεση του βιομορίου γίνεται απ ευθείας ή μέσω ενός διλειτουργικού αντιδραστηρίου (π.χ γλουταραλδεΰδης), το οποίο έχει ήδη συνδεθεί στην επιφάνεια του υλικού στήριξης. Ομοιοπολική ακινητοποίηση ενζύμων σε στερεό φορέα Η χημική σύσταση ανόργανων και ιδιαίτερα οργανικών στερεών υλικών που χρησιμοποιούνται ως φορείς ακινητοποίησης ενζύμων καλύπτει ένα ευρύτατο φάσμα. Τα υλικά στήριξης επιλέγονται ανάλογα με τη διαλυτότητά τους, το είδος των ενώσεων που φέρουν στην επιφάνεια τους, τη χωρητικότητα τους και το βαθμό διόγκωσης τους στο συγκεκριμένο διαλύτη. Τα πιο διαδεδομένα υλικά στήριξης είναι η πορώδης ύαλος, το νάυλον, διάφορα παράγωγα της κυτταρίνης και άλλων πολυσακχαριτών όπως η αγαρόζη, πολυμερή πολυακρυλαμιδίου, οι επιφάνειες των ηλεκτροδίων (γραφίτη, χρυσού, λευκόχρυσου), κ.ά. 215

224 Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η πολυπλοκότητα της διαδικασίας, η οποία κατά κανόνα απαιτεί την ενεργοποίηση της επιφάνειας του φορέα με υψηλής δραστικότητας αντιδραστήρια. Αυτό συχνά οδηγεί στη μερική απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας, ως αποτέλεσμα ανεπιθύμητων αντιδράσεων με τις πλευρικές ομάδες αμινοξέων, γεγονός που περιορίζει την εφαρμογή της μεθόδου. Υλικά στήριξης Ανόργανα υλικά: Το πορώδες γυαλί είναι ο περισσότερο χρησιμοποιούμενος ανόργανος φορέας για την ακινητοποίηση ενζύμων με ομοιοπολική σύνδεση. Θεωρείται απαραίτητη η ενεργοποίηση των ανόργανων αυτών υλικών παρουσία κυρίως αμινοαλκυλοεθοξυπυριτικών αντιδραστηρίων. Η χρήση των αντιδραστηρίων αυτών έχει σκοπό την επικάλυψη της ανόργανης επιφάνειας με στιβάδες οργανικής σύστασης, που φέρουν λειτουργικές οργανικές ομάδες και οι οποίες συμμετέχουν στο σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών με τα μόρια του βιοκαταλύτη. Κυτταρίνη Η κυτταρίνη είναι ένας γραμμικός (ινώδης) πολυσακχαρίτης, που αποτελείται από 8-15x10 3 μόρια γλυκόζης συνδεδεμένα μεταξύ τους με (1 4)-β-γλυκοζιτικούς δεσμούς. Κάθε μόριο γλυκόζης έχει τρία ελεύθερα υδροξύλια. Κατά τη μερική ή ολική νίτρωση (HNO3/H2SO4) ή ακετυλίωση (οξικός ανυδρίτης/h2so4) της κυτταρίνης, λαμβάνονται τα παράγωγα της (τρι-)νιτρικής ή (τρι-)οξικής κυτταρίνης, τα οποία σε μορφή μεμβρανών χρησιμοποιούνται ευρέως για την ακινητοποίηση βιομορίων ή ως φράγματα διάχυσης (difusional barriers). Συνθετικά παράγωγα της κυτταρίνης με (C2H5)2+NH-CH2CH2-O- (διαιθυλαμινοαιθυλο-, DEAE), -OOC-CH2- Ο- (καρβοξυμεθυλο-, CM), m-αμινοβενζυλοξυμεθυλο- (m-abom), π-αμινοβενζυλο, αμινοαιθυλο- (AE-) και τριαιθυλοαμινοαιθυλο- (TEAE) είναι διαθέσιμα στο εμπόριο και χρησιμοποιούνται ευρέως ως υλικά ακινητοποίησης. Ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο παράγωγο, μπορούν να εφαρμοστούν διάφορες μέθοδοι ακινητοποίησης. Ευρέως χρησιμοποιούμενες είναι η μέθοδος της διαζώτωσης και της γλουταραλδεΰδης για τα άμινο παράγωγα της, ενώ για τη φυσική κυτταρίνη (-ΟΗ), η μέθοδος του BrCN και του χλωροκυανουριδίου (τριαζινικά παράγωγα). Άγαρ(οζη), Sepharose 216

225 Το άγαρ είναι πολυσακχαρίτης αποτελούμενος από διάφορα συστατικά, όπως την όξινη καραγενάση και την ουδέτερη αγαρόζη. Η τελευταία αποτελείται από D- γαλακτόζη και από ομάδες της 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζης. Πηκτές αγαρόζης σε μορφή σφαιριδίων (beads), συγκέντρωσης 2-10%, ονομάζονται Sepharose (Pharmacia, LKB, π.χ. Sepharose 4B είναι πηκτή 4% σε αγαρόζη) και διατίθενται σε διάφορες ενεργοποιημένες μορφές, όπως CNBr-Sepharose 4B, εποξυ-sepharose 6B ή σε συνδυασμό με βραχίονες (spacer arms) έξι ατόμων άνθρακα, όπως το 1,6- διαμινοεξάνιο (AH-Sepharose 4B με ελεύθερα -NH2 άκρα και CH-Sepharose 4B με ελεύθερα -COOH άκρα). Οι βραχίονες κρατούν το ένζυμο μακριά από το υλικό στήριξης και χρησιμοποιούνται προκειμένου να αποφευχθεί η στερεοχημική παρεμπόδιση των ενζύμων. Η ακινητοποίηση των βιομορίων μπορεί να γίνει με την εφαρμογή διαφόρων μεθόδων ανάλογα με την εξωτερική ομάδα του εκάστοτε παραγώγου. Άμυλο, Δεξτρίνη (Sephadex) Το άμυλο είναι ένας από τους πιο συχνά χρησιμοποιούμενους πολυσακχαρίτες και βρίσκεται σε μορφή μίγματος διαλυτής αμυλόζης (20%) και αδιάλυτης αμυλοπηκτίνης (80%). Μερική υδρόλυση της αμυλοπηκτίνης οδηγεί σε μίγμα ολιγοσακχαριτών, τις δεξτρίνες. Οι δεξτρίνες είναι παράγωγα ποικίλης σύνταξης με περισσότερους (1 6)-α-δεσμούς και λιγότερους (1 2)-α-δεσμούς. Η χημική κατεργασία των δεξτρινών με επιχλωροϋδρίνη (C3H5OCl) παρέχει το γνωστό με την εμπορική του ονομασία υλικό, Sephadex (Pharmacia LKB), το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως ως υλικό πλήρωσης χρωματογραφικών στηλών και ως υλικό ακινητοποίησης, μετά την ενεργοποίηση του με BrCN. Σχήμα 9.4. Ομοιοπολική σύνδεση ενός ενζύμου σε στερεό φορέα. 217

226 Ακρυλικά συμπολυμερή Τα συμπολυμερή διαφόρων υδρόφιλων ακρυλικών μονομερών (ακρυλικού οξέος, ακρυλαμιδίου, μεθακρυλικού οξέος) είναι τα πιο διαδεδομένα υλικά ακινητοποίησης στην κατηγορία των συνθετικών πολυμερών. Παράγωγα του πολυακρυλαμιδίου διατίθενται με διάφορες εμπορικές ονομασίες, όπως: Bio-Gel CM (ακρυλαμίδιο/ακρυλικό οξύ), Bio-Gel P (ακρυλαμίδιο/ν,ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο), Τα υλικά αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ακινητοποίηση μέσω διαζώτωσης, διαλυτών καρβαδιιμιδίων και γλουταραλδεΰδης. Λόγω της υψηλής υδροφιλικότητάς τους, τα ακρυλικά πολυμερή αποτελούν ένα καλό υλικό ακινητοποίησης. Nylon Οι κυριότεροι τύποι εμπορικά διαθέσιμων μεμβρανών αυτού του τύπου είναι οι εξής: Biodyne A: Αμφοτερική μεμβράνη πάχους 120 μm με διάμετρο πόρων 0,2 μm με υψηλή ικανότητα δέσμευσης βιομορίων, η επιφάνεια της οποίας περιέχει 50% αμινικές και 50% καρβοξυλικές ομάδες με ισοηλεκτρικό σημείο σε ph 6,5. Biodyne B: Θετικά φορτισμένη μεμβράνη πάχους 120 μm με διάμετρο πόρων 0,45 μm, η επιφάνεια της οποίας φέρει υψηλό ποσοστό αμμωνιακών ομάδων. Το θετικό της φορτίο διατηρείται σε ph 3-10 και ευνοεί τη δέσμευση αρνητικά φορτισμένων πρωτεϊνών, μέσω ισχυρών ιοντικών δεσμών. Biodyne C: Αρνητικά φορτισμένη μεμβράνη πάχους 120 μm με διάμετρο πόρων 0,45 μm, η επιφάνεια της οποίας περιέχει 100% καρβοξυλικές ομάδες. Το αρνητικό της φορτίο διατηρείται σε ph 3-10 και ευνοεί τη δέσμευση βασικών πρωτεϊνών. Immunodyne ABC: Προκατεργασμένη (pre-activated) μεμβράνη πάχους 120 μm με διάμετρο πόρων 0,45 μm. Παρουσιάζει υψηλή ικανότητα δέσμευσης βιομορίων μέσω ομοιοπολικών δεσμών, που αναπτύσσονται κυρίως μεταξύ των τελικών ΝΗ2 άκρων τους και των ενεργών ομάδων που υπάρχουν στην ενεργοποιημένη επιφάνειά της Διαμοριακή σύνδεση με δι-λειτουργικά αντιδραστήρια Η τεχνική της διαμοριακής σύνδεσης (cross-linking) βασίζεται στο σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ των μορίων του ενζύμου ή και μεταξύ ολόκληρων κυττάρων παρουσία δι- ή και πολύ-λειτουργικών αντιδραστηρίων, όπως διάφορες αλδεΰδες ή αμίνες. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται ένα πολυμερές 218

227 τρισδιάστατο πλέγμα, αδιάλυτο στο νερό, του οποίου οι δομικές μονάδες είναι τα ενζυμικά μόρια ή κύτταρα, όπως αυτό φαίνεται στο σχήμα 9.6. Η γλουταραλδεΰδη είναι το πλέον διαδεδομένο αντιδραστήριο διαμοριακής σύνδεσης, το οποίο αντιδρά με την α-νη2 ομάδα της λυσίνης, σχηματίζοντας την αντίστοιχη βάση Schiff σύμφωνα με το σχήμα 9.7. Σε πολλές περιπτώσεις, η χρήση δι-λειτουργικών αντιδραστηρίων συνδυάζεται με ένα πρωτεϊνικό φορέα, όπως η αλβουμίνη. Έχει παρατηρηθεί ότι η παρουσία της αλβουμίνης αυξάνει την ενζυμική ενεργότητα και το χρόνο ζωής του προκύπτοντος παρασκευάσματος. Αν και οι αντιδράσεις διαμοριακής σύνδεσης γίνονται υπό ήπιες συνθήκες, μεγάλο μέρος της καταλυτικής δραστικότητας χάνεται ως αποτέλεσμα παράπλευρων αντιδράσεων, που αφορούν ομάδες του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Η αρνητική αυτή επίπτωση είναι δυνατό να περιορισθεί με τη χρήση υποστρωμάτων ή συναγωνιστικών αναστολέων, τα οποία συνδέονται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου προστατεύοντάς το από τα αντιδραστήρια διαμοριακής σύνδεσης. Το κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου σχετίζεται με το γεγονός ότι μόνο ένα αντιδραστήριο απαιτείται για την ακινητοποίηση, ενώ η όλη διαδικασία είναι σχετικά απλή. Η μέθοδος έχει βρει εφαρμογή στην ακινητοποίηση βιομηχανικών ενζύμων, όπως η ισομεράση της γλυκόζης και η αμιδάση της πενικιλλίνης. Σχήμα 9.6 Ακινητοποίηση μορίων ενζύμου μέσω διαμοριακής σύνδεσης. E NH 2 O=CH E N CH + CH3 CH 2 CH 2 + 2H 2 O CH 3 CH 2 CH 2 HC=O N H 2 E HC N E Σχήμα 9.7. Διαμοριακή σύνδεση ενζύμων με γλουταραλδεΰδη. 219

228 Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει σήμερα η ομοιοπολική διαμοριακή σύνδεση ενζυμικών κρυστάλλων (cross-linked enzyme crystals, CLECs). H μορφή αυτή αφορά κρυστάλλους του ενζύμου συνδεδεμένους με ένα δι-λειτουργικό αντιδραστήριο, όπως η γλουταραλδεΰδη. Κύριο χαρακτηριστικό της ακινητοποιημένης αυτής μορφής είναι το γεγονός ότι παραμένει αδιάλυτη σε υδατικό διάλυμα. Η διαμοριακή σύνδεση ενζυμικών κρυστάλλων οδηγεί σε αύξηση τόσο της θερμοσταθερότητας του ενζύμου, όσο και της ανεκτικότητας έναντι πολικών οργανικών διαλυτών. Σήμερα, τέτοια βιοκαταλυτικά παρασκευάσματα με βάση ένζυμα, όπως ορισμένες λιπάσες μικροβιακής προέλευσης, η ακυλάση της πενικιλλίνης και η θερμολυσίνη είναι διαθέσιμα στην αγορά. 9.3 Ακινητοποίηση πολυενζυμικών συστημάτων και ολόκληρων κυττάρων Τα βασικά κριτήρια επιλογής της μεθόδου ακινητοποίησης των πολυενζυμικών συστημάτων και των ολόκληρων κυττάρων δεν διαφέρουν από τα αντίστοιχα κριτήρια που εφαρμόζονται στην ακινητοποίηση ενζύμων. Και στις δύο περιπτώσεις, η μέθοδος ακινητοποίησης πρέπει να είναι απλή και με χαμηλό κόστος, ενώ θα πρέπει να εξασφαλίζει την υψηλή καταλυτική δραστικότητα και σταθερότητα στις συνθήκες εφαρμογής. Ο κύριος όμως στόχος στην ακινητοποίηση κυττάρων είναι η διασφάλιση της βιωσιμότητάς τους. Έτσι, για την ακινητοποίηση ζωντανών κυττάρων, τεχνικές, όπως η σύνδεση μέσω τοξικών αντιδραστηρίων (π.χ. μονο- ή διλειτουργικές αλδεΰδες), συνήθως αποφεύγονται. Αντίθετα, ήπιες τεχνικές, όπως ο εγκλωβισμός σε μη υδατοδιαλυτά πηκτώματα πολυμερών (ιδιαίτερα του αλγινικού ασβεστίου), βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή στην ακινητοποίηση κυττάρων Η χρήση ακινητοποίημένων κυττάρων με σκοπό την επίτευξη βιομετατροπών παρέχει τρία σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την εφαρμογή των ακινητοποιημένων ενζύμων. Το πρώτο πλεονέκτημα σχετίζεται με τη μείωση του κόστους της διαδικασίας, καθώς δεν απαιτείται η απομόνωση του ενζύμου, αλλά χρησιμοποιούνται κύτταρα (ενεργά ή μη ενεργά), τα οποία χαρακτηρίζονται από επιθυμητή ενζυμική δράση. Το δεύτερο πλεονέκτημα έχει να κάνει με τη δυνατότητα κατάλυσης πιο πολύπλοκων, σε σχέση με τα ακινητοποιημένα ένζυμα, αντιδράσεων, ως αποτέλεσμα της σύνθετης βιοχημικής λειτουργίας των ζωντανών κυττάρων. Το 220

229 τρίτο και ίσως σημαντικότερο πλεονέκτημα αφορά στη δυνατότητα αναγέννησης των συνενζύμων, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση πολλών ενζύμων (π.χ. οξειδοαναγωγικών). Η αναγέννηση συνενζύμων αφορά κατά πρώτο την εφαρμογή ακινητοποιημένων ζωντανών κυττάρων και αναπτύσσεται στη συνέχεια. Χαρακτηριστικό παράδειγμα βιομηχανικής εφαρμογής ακινητοποιημένων κυττάρων αποτελεί η χρήση μη ενεργών κυττάρων με δράση ισομεράσης της γλυκόζης, ένα ενδοκυτταρικό ένζυμο υψηλού κόστους, που καταλύει τη σύνθεση της φρουκτόζης από γλυκόζη. Στον πίνακα 9.1 παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγματα εφαρμογής ακινητοποιημένων κυττάρων για την επίτευξη απλών ή και πολυπλοκότερων μετατροπών βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Πίνακας 9.1. Παραδείγματα εφαρμογής ακινητοποιημένων κυττάρων σε μετατροπές βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Μικροβιακά κύτταρα Μέθοδος ακινητοποίησης Εφαρμογή Εscherichia coli Eγκλωβισμός Παραγωγή L-θρυπτοφάνης από ινδόλιο και DL-σερίνη Βακτήρια και ζύμες όπως Bιοαισθητήρες για τον Saccharomyces cerivisiae Eγκλωβισμός προσδιορισμό σακχάρων, Bacillus subtilis διαλυτών, οξέων, Εscherichia coli βιταμινών κ.ά. Εscherichia coli Eγκλωβισμός Παραγωγή L-ασπαρτικού οξέος από φουμαρικό οξύ και αμμωνία Eγκλωβισμός Παραγωγή ακρυλαμιδίου Rhodococus rhodocrus από ακρυλονιτρίλιο Saccharomyces cerivisiae Σύνδεση σε επιφάνεια φορέα Υδρόλυση σακχαρόζης Eγκλωβισμός Παραγωγή σορβιτόλης και Zymomonas mobilis γλυκονικού οξέος από γλυκόζη και φρουκτόζη Προσρόφηση σε Παραγωγή αιθανόλης Saccharomyces cerivisiae ιοντοανταλλάκτη Eγκλωβισμός Παραγωγή L-σερίνης από Pseudomonas AM I γλυκίνη και μεθανόλη 221

230 Η ακινητοποίηση των κυττάρων συχνά, όμως, συνοδεύεται και από μειονεκτήματα, όπως είναι: α) η μικρή καταλυτική δραστικότητα ανά μονάδα βάρους β) η διεξαγωγή παράπλευρων αντιδράσεων, καθώς άλλα κυτταρικά ένζυμα είναι δυνατό να συναγωνίζονται για το υπόστρωμα ή να μετατρέπουν το προϊόν. γ) το αυξημένο κόστος και η δυσκολία καθαρισμού του προϊόντος, ως αποτέλεσμα της προσθήκης στο σύστημα της βιοκατάλυσης σειράς χημικών ενώσεων για την κάλυψη των διατροφικών αναγκών των ζωντανών κυττάρων. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η διαδικασία ανάκτησης ενός προϊόντος από αντιδραστήρα ακινητοποιημένων κυττάρων προϋποθέτει ότι το προϊόν είναι εξωκυτταρικό. Παρά τα σημαντικά όμως μειονεκτήματα, η χρήση ακινητοποιημένων ενζύμων παρέχει, όπως έχει αναφερθεί, μεταξύ άλλων και τη δυνατότητα αναγέννησης των συνενζύμων, που θεωρείται σημαντικότατο πλεονέκτημα στην περίπτωση πολλών βιομετατροπών με εφαρμογή σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες Επίδραση της ακινητοποίησης στα καταλυτικά χαρακτηριστικά. Η ακινητοποίηση είναι δυνατό να επηρεάσει τα μοριακά και κινητικά χαρακτηριστικά των ενζύμων, οδηγώντας σε τροποποίηση της λειτουργικής σταθερότητάς τους, της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας, καθώς και της εκλεκτικότητας ως προς το υπόστρωμα. Οι τροποποιήσεις αυτές είναι δυνατό να αποδοθούν στους παρακάτω λόγους: α) σε μεταβολές της δομής του ενζυμικού μορίου, β) σε στερεοχημικούς περιορισμούς, γ) σε φαινόμενα κατανομής και γ) σε περιορισμούς διάχυσης. Α) Δομικές μεταβολές στο ενζυμικό μόριο Κατά κανόνα, οι ιδιότητες των ακινητοποιημένων ενζύμων διαφέρουν από αυτές των αντιστοίχων διαλυτών. Οι ιδιότητες των ενζύμων καθορίζονται από τη διαμόρφωση του πρωτεϊνικού μορίου στο χώρο και κατά συνέπεια οι παρατηρούμενες διαφορές εξαρτώνται από το ίδιο το ένζυμο, το υλικό στήριξης, τη μέθοδο και τις συνθήκες ακινητοποίησης. Η συνολική πορεία ακινητοποίησης μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στις κινητικές σταθερές, στη συμπεριφορά του ενζύμου ως προς το ph και τη θερμοκρασία, ακόμα και στην εξειδίκευσή του. Η ακινητοποίηση του ενζύμου σε στερεό φορέα μέσω ομοιοπολικών δεσμών συχνά συνοδεύεται από μείωση της δραστικότητας, ως αποτέλεσμα δομικών μεταβολών στο ενζυμικό μόριο. 222

231 Η μεταβολή της τριτοταγούς δομής των ενζύμων μπορεί να είναι αποτέλεσμα ανεπιθύμητης αλληλεπίδρασης των αντιδραστηρίων, που χρησιμοποιούνται για την ακινητοποίηση με το ενζυμικό μόριο. Η αδρανοποίηση μπορεί επίσης να είναι αποτέλεσμα της μη αντιστρεπτής σύνδεσης των αντιδραστηρίων αυτών στην ενεργό περιοχή του ενζύμου. Η περίπτωση αυτή αντιμετωπίζεται, όπως έχει αναφερθεί, με την προσθήκη υποστρώματος ή αναστολέα κατά την ακινητοποίηση. Β) Επίδραση των στερεοχημικών περιορισμών Οι στερεοχημικοί περιορισμοί, οι οποίοι οδηγούν σε μείωση της ενζυμικής δραστικότητας, οφείλονται κατά κύριο λόγο στην πολύ μικρή απόσταση μεταξύ του βιοκαταλύτη και του στερεού φορέα. Αποτέλεσμα είναι να περιορίζεται η μεταφορά του υποστρώματος στο ένζυμο. Το φαινόμενο της παρεμπόδισης είναι εντονότερο σε υποστρώματα μεγάλου μοριακού μεγέθους (πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, νουκλεϊκά οξέα). Μείωση της ενζυμικής δραστικότητας παρατηρείται και στην περίπτωση, κατά την οποία μόρια του ενζύμου δεσμεύονται στο φορέα με τέτοιο τρόπο, ώστε η ενεργός περιοχή να είναι στραμμένη προς τη δομή του πλέγματος του φορέα. Στην περίπτωση αυτή παρεμποδίζεται η προσέγγιση του υποστρώματος στην ενεργό περιοχή του ενζύμου. Ο περιορισμός των στερεοχημικών παρεμποδίσεων είναι δυνατό να αντιμετωπισθεί με την εισαγωγή μοριακών βραχιόνων (spacers, arms), οι οποίοι παρεμβάλλονται μεταξύ του φορέα και του ενζύμου και αυξάνουν τη μεταξύ τους απόσταση. Για παράδειγμα, η εισαγωγή ενός δι-λειτουργικού αντιδραστηρίου, όπως το 1,6-διαμινο-εξάνιο, μεταξύ της γλυκοαμυλάσης και του φορέα (SiO2), οδηγεί σε αύξηση της δραστικότητας του ενζύμου κατά 10 φορές. Γ) Επίδραση των φαινομένων κατανομής στα καταλυτικά χαρακτηριστικά των ενζύμων Η δομή του φορέα ακινητοποίησης και ιδιαίτερα η παρουσία φορτισμένων ή υδρόφοβων ομάδων, είναι δυνατό να επηρεάσει την κινητική συμπεριφορά του ακινητοποιημένου ενζύμου. Η επίδραση στα καταλυτικά χαρακτηριστικά του ενζύμου συνδέεται άμεσα με την επίδραση της φύσης του φορέα στην κατανομή υποστρωμάτων, προϊόντων, καθώς και ιόντων υδρογόνου, μεταξύ της κύριας υγρής φάσης και του μικροπεριβάλλοντος του ακινητοποιημένου ενζύμου. Τα φαινόμενα κατανομής είναι αποτέλεσμα ανάπτυξης ηλεκτροστατικών (ελκτικών ή απωστικών) 223

232 δυνάμεων μεταξύ των μορίων και του φορέα, γεγονός που οδηγεί στην αύξηση ή μείωση της συγκέντρωσης των υποστρωμάτων στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου. Μια από τις σημαντικότερες συνέπειες του φαινομένου κατανομής είναι η μετατόπιση της βέλτιστης τιμής του ph του ακινητοποιημένου ενζύμου σε σχέση με αυτή του ελεύθερου βιοκαταλύτη. Η μετατόπιση εκφράζεται είτε με αύξηση, είτε με μείωσης της βέλτιστης τιμής, ανάλογα με το αν ο φορέας φέρει αρνητικά ή θετικά φορτία. Όταν ο φορέας φέρει αρνητικά φορτία, τότε παρατηρείται αύξηση της συγκέντρωσης πρωτονίων στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου, η οποία εκφράζεται με μείωση του τοπικού ph σε σχέση με αυτό της κύριας υγρής φάσης. Αντίθετη βέβαια είναι η εικόνα, στην περίπτωση που ο φορέας φέρει θετικά φορτία. Σε γενικές γραμμές, η αύξηση της ιοντικής ισχύος του διαλύματος συνεπάγεται μείωση των φαινομένων κατανομής, που οφείλονται σε ιοντικές αλληλεπιδράσεις. Ακόμη και στην περίπτωση που η ακινητοποίηση δεν μεταβάλει τη συγγένεια του ενζύμου ως προς το υπόστρωμα, η καταλυτική σταθερά του ενζύμου Michaelis- Menten (Κm) είναι δυνατό να τροποποιηθεί προς κάποια άλλη φαινομενική τιμή (Κm φαιν ), ως αποτέλεσμα των φαινομένων κατανομής του υποστρώματος στο ενζυμικό μικροπεριβάλλον. Η συγκέντρωση του υποστρώματος στο μικροπεριβάλλον του ακινητοποιημένου ενζύμου [S]e διαφέρει από αυτή στην κυρίως υγρή φάση [S]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο λόγος των δύο συγκεντρώσεων αντιστοιχεί στο συντελεστή κατανομής Ρ (Ρ=[S]e/[S]), τότε η γνωστή εξίσωση Micaelis-Μenten: v V K ' max m [ S] e [ S] e (9.1) όπου V max η μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης ακινητοποιημένου ενζύμου, v η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης, λαμβάνει τη μορφή: ' Vmax [ S] v (9.2) K m [ S] P Από την εξίσωση 9.2 προκύπτει ότι η φαινομενική σταθερά Μichaelis-Menten (Κm φαιν ) δίνεται από τη σχέση: Κm φαιν =Κm/P (9.3) 224 Στην περίπτωση ελκτικών δυνάμεων μεταξύ του υποστρώματος και του φορέα, η συγκέντρωση του υποστρώματος στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου τείνει

233 να αυξηθεί, οπότε και η τιμή του P επίσης αυξάνεται. Από τη σχέση 9.3 προκύπτει ότι Κm φαιν <Κm, δηλαδή, η συγγένεια του υποστρώματος προς το ακινητοποιημένο ένζυμο εμφανίζεται μεγαλύτερη σε σχέση με αυτή που παρατηρείται για το ελεύθερο ένζυμο. Αντίθετη, βέβαια, θα είναι η εικόνα στην περίπτωση ανάπτυξης απωστικών δυνάμεων μεταξύ υποστρώματος και φορέα. Δ) Επίδραση του περιορισμού διάχυσης στα καταλυτικά χαρακτηριστικά των ενζύμων Kατά την ακινητοποίηση των ενζύμων σε ένα στερεό φορέα, η μεταφορά των υποστρωμάτων στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου γίνεται με περιορισμούς διάχυσης λόγω της φυσικής παρουσίας του φορέα. Η εμφάνιση των περιορισμών διάχυσης έχει ως αποτέλεσμα τη διαβάθμιση της συγκέντρωσης των υποστρωμάτων και των προϊόντων από την κυρίως φάση προς το μικροπεριβάλλον του ενζύμου. Οι περιορισμοί διάχυσης χαρακτηρίζονται ως εξωτερικής και εσωτερικής φύσης. Οι εξωτερικοί περιορισμοί διάχυσης είναι αποτέλεσμα της ύπαρξης της στιβάδας του Nernst, η οποία δημιουργείται από μόρια διαλύτη μειωμένης κινητικότητας, τα οποία περιβάλουν τα σφαιρίδια του φορέα, όπως φαίνεται στο σχήμα 9.8. Πρέπει να σημειωθεί ότι, κατά τη διέλευση της στιβάδας του Nernst δεν συντελείται ενζυμική αντίδραση. Οι εξωτερικοί περιορισμοί διάχυσης είναι οι μόνοι περιορισμοί που εμφανίζονται, στην περίπτωση που ο βιοκαταλύτης είναι ακινητοποιημένος σε μια μη πορώδη επιφάνεια ενός φορέα. Αντίθετα, στην περίπτωση ακινητοποίησης του βιοκαταλύτη σε πορώδη φορέα, έχουμε την εμφάνιση και εσωτερικών περιορισμών διάχυσης, αποτέλεσμα του περιορισμού της κίνησης των μορίων στο εσωτερικό του φορέα. Οι περιορισμοί αυτοί οφείλονται τόσο στη δομή του φορέα, όσο και στην ενζυμική αντίδραση που συντελείται. Το φαινόμενο του περιορισμού διάχυσης επηρεάζει τη σταθερά Michaelis-Menten με τέτοιο τρόπο, ώστε η τιμή της φαινομενικής σταθεράς Κm φαιν να είναι πάντα μεγαλύτερη από την τιμή της πραγματικής σταθεράς Κm (που αφορά τον ελεύθερο βιοκαταλύτη). Αυτό είναι αναμενόμενο, αφού για να υπάρξει στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου συγκέντρωση υποστρώματος ίση με την τιμή της Κm, θα πρέπει η συγκέντρωση στην κύρια (υγρή) φάση να είναι μεγαλύτερη από την Κm (λόγω του φαινομένου περιορισμού διάχυσης). Στην περίπτωση του εξωτερικού περιορισμού διάχυσης, η τιμή της φαινομενικής σταθεράς Κm φαιν δίνεται από τη σχέση 9.4. Κm φαιν =V max δ/ds (9.4) 225

234 όπου: Ds ο συντελεστής διάχυσης του υποστρώματος στο διάλυμα V max η μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης του ακινητοποιημένου ενζύμου δ το πάχος της στιβάδας του Nernst S P φορέας P S Στιβάδα Nernst Σχήμα 9.9. Σχηματική απόδοση του φαινομένου περιορισμού διάχυσης σε σύστημα ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη. Οι καμπύλες αναφέρονται στη συγκέντρωση υποστρώματος S και προϊόντος P της ενζυμικής αντίδρασης. Από τη σχέση 9.4. προκύπτει ότι η μείωση της τιμής της σταθεράς Κm φαιν μπορεί να προέλθει από μείωση της τιμής δ, η οποία επιτυγχάνεται με αύξηση της ανάδευσης (ταχύτητας αναμίξεως) στο βιοαντιδραστήρα. Το αποτέλεσμα του εσωτερικού περιορισμού διάχυσης μπορεί να εκτιμηθεί από τον συντελεστή αποτελεσματικότητας (effectiveness factor) η, ο οποίος αντιστοιχεί στο λόγο της ταχύτητας της βιοκαταλυόμενης αντίδρασης ως προς την αντίστοιχη ταχύτητα, απουσία εσωτερικών περιορισμών διάχυσης. Από γραφικές παραστάσεις που περιγράφουν την εξάρτηση της τιμής του η συναρτήσει της τιμής του λόγου Κm/[S] προσδιορίζεται η τιμή του μέτρου του Thiele (φ). Το μέτρο φ δίνεται από τη σχέση 9.5 και εξαρτάται από παράγοντες, όπως η ακτίνα του σωματιδίου του φορέα R, η σταθερά Michaelis-Menten, Κm φαιν, και η μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης του ακινητοποιημένου ενζύμου V max, καθώς και από το συντελεστή διάχυσης στο εσωτερικό του φορέα De. 226

235 R 3 V ' max K m D e (9.5) Όταν η τιμή του μέτρου φ τείνει προς το μηδέν ως αποτέλεσμα της αύξησης της διάχυσης, τότε ο συντελεστής αποτελεσματικότητας τείνει προς τη μέγιστή του τιμή (n=1). Στην περίπτωση αυτή, ο περιορισμός λόγω της διάχυσης του υποστρώματος στο εσωτερικό του σωματιδίου μειώνεται. Από τη σχέση 9.5 φαίνεται ότι, η ελάττωση του περιορισμού διάχυσης μπορεί να επιτευχθεί με μείωση του πάχους της στερεάς φάσης (μείωση της ακτίνας του σωματιδίου του φορέα R). 227

236 228

237 10. ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ ΚΑΙ ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΕΣ 10.1 Γενικά Με τον όρο βιομετατροπές χαρακτηρίζονται οι βιοκαταλυόμενες αντιδράσεις ενός η περισσοτέρων σταδίων, που οδηγούν στη σύνθεση προϊόντων. Στις αντιδράσεις ενός σταδίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιοκαταλύτης ένα απομονωμένο ένζυμο. Στις αντιδράσεις πολλών σταδίων που καταλύονται από περισσότερα ένζυμα, συνήθως χρησιμοποιούνται ζωντανά ή εφησυχάζοντα κύτταρα, σπόρια ή ακόμη και νεκρά κύτταρα. Η επιλογή εξαρτάται από τρεις κυρίως παράγοντες: α) από τον τύπο της αντίδρασης, β) από την αναγκαιότητα για αναγέννηση του συνενζύμου και γ) από το μέγεθος εφαρμογής της διεργασίας. Συνήθως, η βιομετατροπή διαχωρίζεται από τη ζύμωση, στην οποία πλήθος μεταβολικών αντιδράσεων λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Στη ζύμωση παράγονται προϊόντα που αποτελούν πρωτογενείς ή δευτερογενείς μεταβολίτες όπως αντιβιοτικά, πρωτεΐνες, αμινοξέα, οργανικοί διαλύτες κ.ά. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι στην περίπτωση των βιομετατροπών πολλών σταδίων, τα κύτταρα δεν είναι κατ ανάγκη ζωντανά, αλλά ουσιαστικά έχουν το ρόλο της δεξαμενής των ενζύμων που συμμετέχουν στη μετατροπή. Στον πίνακα 10.1 παρουσιάζονται οι χαρακτηριστικές διαφορές μεταξύ των βιομετατροπών και των ζυμώσεων. Οι βιοκαταλύτες υπερτερούν έναντι των χημικών καταλυτών για δύο κυρίως λόγους, καθώς: α) εμφανίζουν χαρακτηριστική τοπο- και στερεο-εξειδίκευση β) η τεράστια καταλυτική τους ισχύς εκφράζεται σε ήπιες συνθήκες θερμοκρασίας, πίεσης και ph. Η πρόοδος τα τελευταία χρόνια στην τεχνολογία των βιομετατροπών αντικατοπτρίζεται στο μεγάλο αριθμό προϊόντων, που παράγονται σήμερα σε βιομηχανική κλίμακα. Σε αντίθεση με τις βιομηχανικές ζυμώσεις, καθώς και τις βιομετατροπές με ολόκληρα κύτταρα, η ιστορία των ενζυμικών βιομετατροπών είναι σχετικά μικρή. Ως πρώτη βιομηχανική εφαρμογή μπορεί να θεωρηθεί ο διαχωρισμός ρακεμικού μίγματος αμινοξέων το 1967 στην Ιαπωνία, με τη χρήση ακινητοποιημένης αμινοακυλάσης από Aspergillu oryzae. Tα επόμενα χρόνια έχουμε 229

238 τη βιομηχανική παραγωγή του 6-αμινοπενικιλλανικού οξέος (6-APA) με εφαρμογή της ακυλάσης της πενικιλίνης, καθώς και την παραγωγή της φρουκτόζης με χρήση ακινητοποιημένης ισομεράσης της γλυκόζης, με ετήσια παραγωγή που σήμερα ξεπερνά το τόνους. Χαρακτηριστικά παραδείγματα βιομετατροπών αποτελεί η τροποποίηση στεροειδών ορμονών (όπως της προγεστερόνης, κορτιζόνης και υδροκορτιζόνης), μέσω τόσο τοποεκλεκτικών αντιδράσεων υδροξυλίωσης και αφυδρογόνωσης, που καταλύουν ολόκληρα κύτταρα μικροοργανισμών Rhizopus ή Aspergillus, όσο και οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Τα τελευταία 15 χρόνια, η δυνατότητα εφαρμογής βιοκαταλυτικών αντιδράσεων, όχι μόνο σε υδατικά συστήματα, αλλά και σε μη υδατοσυμβατά συστήματα, άνοιξε νέους ορίζοντες στην εφαρμοσμένη βιοκατάλυση, καθώς είναι πλέον εφικτή η επίτευξη βιομετατροπών με τη συμμετοχή όχι μόνο υδατοδιαλυτών, αλλά και μη υδατοδιαλυτών υποστρωμάτων (όπως είναι οι περισσότερες οργανικές ενώσεις). Πίνακας Χαρακτηριστικές διαφορές βιομετατροπών και ζυμώσεων στην παραγωγή βιοτεχνολογικών προϊόντων. Χαρακτηριστικά Βιομετατροπή Ζύμωση Βιοακαταλύτης Ελεύθερα ένζυμα, κύτταρα ζωντανά, εφυσηχάζοντα ή νεκρά Τύπος αντιδράσεων Ενός ή περισσοτέρων σταδίων που καταλύονται από περιορισμένο αριθμό ενζύμων Ζωντανά κύτταρα σε ανάπτυξη Αντιδράσεις μεταβολισμού που καταλύονται από πλήθος ενζύμων Αρχικό υλικό Υπόστρωμα Πηγή άνθρακα και αζώτου Προϊόν Φυσικό ή μη φυσικό Φυσικό προϊόν πρωτογενούς ή δευτερογενούς μεταβολισμού Ανθεκτικότητα στη συγκέντρωση αντιδρώντων ή προϊόντων Απομόνωση προϊόντος Παραπροϊόντα Υψηλή Μειωμένη Εύκολη με εφαρμογή μικρού Απαιτεί μεγάλο αριθμό αριθμού σταδίων σταδίων Μικρός αριθμός ή και καθόλου Μεγάλος αριθμός Στον πίνακα 10.2 παρουσιάζονται πρόσφατες βιομηχανικές εφαρμογές βιοκαταλυόμενων αντιδράσεων. 230

239 Πίνακας Πρόσφατες βιομηχανικές εφαρμογές βιοκαταλυόμενων αντιδράσεων. Προϊόν Αντίδραση Βιοκαταλύτης Εφαρμογές Ασπαρτάμη Στερεοεκλεκτικός σχηματισμός αμιδικού Ακινητοποιημένη θερμολυσίνη από Bacillus Γλυκαντικό χαμηλών θερμίδων δεσμού subtilis Ακρυλαμίδιο Υδρόλυση ακρυλονιτριλίου Υδράση του νιτριλίου από Rhodococcus rhodochrous Στην παραγωγή πολυμερών 6-Αμινοπενικιλλανικό οξύ (6-ΑPA), 7-αμινικεφαλοσπορανικό (7-ACA) Ημισυνθετικές πενικιλίνες και κεφαλοσπορίνες Mη πρωτεϊνικά L-αμινοξέα Υδρόλυση πενικιλίνης G ή κεφαλοσπορίνης C Ακινητοποιημένη ακυλάση της πενικιλλίνης (κεφαλοσπορίνης) από Ε. coli Στερεοεκλεκτική ακυλίωση του 6-ΑPA Ακυλάσες από Ε. coli και Pseudomonas putida Αντιβιοτικά Στερεοεκλεκτικός διαχωρισμός ρακεμικών αμιδίων των αμινοξέων Αμιδάσες από Ε. coli, Pseudomonas putida κά. Ν-Ετεροκυκλικέςενώσεις Υδρόλυση παραγώγων πυριδίνης Ολόκληρα κύτταρα με δράση νιτριλάσης και υδρολάσης (S)-2- Χλωροπροπιονικό οξύ Οπτικά ενεργές καθαρές αλκοόλες και αμίνες L-Ασκορβικό οξύ Αφαλογόνωση ρακεμικού μίγματος του οξέος Ολόκληρα κύτταρα από Pseudomona sputida με δράση δεαλογονάσης Στην παραγωγή ημισυνθετικών αντιβιοτικών Πρόδρομοι στη σύνθεση οπτικώς ενεργών φαρμάκων Πρόδρομοι φαρμάκων, εντομοκτόνων, κλπ. Παρασκευή ζιζανιοκτόνων Ακυλίωση ρακεμικών αλκοολών ή αμινών Ακινητοποιημένες λιπάσες Στη σύνθεση χημικών ενώσεων με βιολογική δράση Τοποεκλεκτική οξείδωση της D-σορβιτόλης προς L-σορβόζη Στεροειδή C-1 αφυδρογόνωση, 11α και 11β υδροξυλίωση, 17-κετο- αναγωγή Ακινητοποιημένα κύτταρα από Acetobacter xylinum Κύτταρα από διάφορους μικροοργανισμούς με δράση υδροξυλασών, αφυδρογονασών, Βιταμίνη C Φάρμακα Φρουκτόζη Ισομερίωση της γλυκόζης Ακινητοποιημένη κετοϊσομεράση της ξυλόζης Γλυκαντικό Τροποποιημένα λίπη, εστέρες Υδρόλυση, εστεροποίηση, διεστεροποίηση Ακινητοποιημένες λιπάσες και εστεράσες Τρόφιμα, φάρμακα, καλλυντικά λιπαρών οξέων L-Ασπαρτικό Προσθήκη αμμωνίας σε φουμαρικό Ακινητοποιημένη λυάση του ασπαρτικούαμμωνίας ή ακινητοποιημένα κύτταρα Σε φαρμακευτικά παρασκευάσματα και τρόφιμα 231

240 Aνάπτυξη βιοκαταλυτικής διεργασιας - Ο βιοκαταλυτικός κύκλος Η ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής βιοκαταλυτικής διεργασίας προϋποθέτει τη διερεύνηση παραγόντων, που σχετίζονται με τη φύση και τη λειτουργία του βιοκαταλύτη, το μέσο διεξαγωγής της αντίδρασης, αλλά και τον τύπο του βιοαντιδραστήρα που θα χρησιμοποιηθεί. Στο σχήμα 10.1 παρουσιάζονται διαγραμματικά τα στάδια που χαρακτηρίζουν ένα βιοκαταλυτικό κύκλο. Όπως φαίνεται, o βιοκαταλυτικός κύκλος συνδέεται με διάφορους παράγοντες, από τους οποίους τελικά εξαρτάται αν η διαδικασία θα χαρακτηρισθεί ως οικονομικά συμφέρουσα και εμπορικά εκμεταλλεύσιμη. Ο πρώτος βασικός παράγοντας έχει να κάνει με την επιλογή του βιοκαταλύτη (ενζύμου ή ολόκληρων κυττάρων), αλλά και τη διαθεσιμότητά του. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA επέτρεψε την έκφραση και παραγωγή ενζύμων σε διάφορους μικροοργανισμούς, αυξάνοντας το φάσμα επιλογής βιοκαταλυτών με τις επιθυμητές ιδιότητες. Ο επιλεγόμενος βιοκαταλύτης θα πρέπει να εμφανίζει την επιθυμητή εκλεκτικότητα ως προς τα δομικά χαρακτηριστικά του υποστρώματος, καθώς επίσης αυξημένη δραστικότητα και σταθερότητα στις συνθήκες αντίδρασης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, οι συνθήκες αντίδρασης μπορεί να μην είναι συμβατές όσον αφορά τη θερμοκρασία, την πίεση, την αυξημένη συγκέντρωση των υποστρωμάτων ή τη σύσταση. Παράλληλα, το μέσο της αντίδρασης μπορεί να είναι όχι μόνο υδατικό, αλλά επίσης ένα μη υδατοσυμβατό σύστημα (π.χ. άνυδρος οργανικός διαλύτης, αέριο σε υπερκρίσιμη κατάσταση, κλπ), όπως περιγράφεται στην παράγραφο Βασικό κριτήριο για την εφαρμογή της διαδικασίας σε μεγάλη κλίμακα αποτελεί επίσης η διαθεσιμότητα του βιοκαταλύτη. Για το σκοπό αυτό, επιστρατεύονται τεχνικές διαλογής και επιλογής, οι οποίες στοχεύουν: α) στην απομόνωση βιοκαταλυτών (ενζύμων ή κυττάρων) ικανών να καταλύσουν νέες βιομετατροπές βιομηχανικού ενδιαφέροντος και β) στην επιλογή ή και το σχεδιασμό βιοκαταλυτών με βελτιωμένα κινητικά χαρακτηριστικά και αυξημένη σταθερότητα. Η επίτευξη των στόχων αυτών προϋποθέτει αφενός την κατανόηση των μηχανισμών μετουσίωσης της πρωτεΐνης και αναστολής της ενζυμικής δράσης στις συνθήκες αντίδρασης, αφετέρου την εφαρμογή τεχνικών, όπως είναι η χημική τροποποίηση των ενζύμων, η ακινητοποίηση των βιοκαταλυτών, καθώς και τεχνικές της μηχανικής των

241 βιοκαταλυτών, που στοχεύουν κυρίως στην αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας και σταθερότητας (βλ. κεφάλαιο 6). Στην περίπτωση της χρήσης ολόκληρων κυττάρων, οι κύριοι στόχοι αφορούν στην αύξηση της ανοχής τους στους οργανικούς διαλύτες, στην τροποποίηση της εισόδου των υποστρωμάτων και εξόδου των προϊόντων από και προς το κύτταρο, καθώς και στη μείωση της διεξαγωγής παράπλευρων αντιδράσεων. Σχήμα Ο βιοκαταλυτικός κύκλος. Η βελτιστοποίηση της διαδικασίας προϋποθέτει παράλληλα την αποτελεσματική λειτουργία του βιοκαταλύτη στο μέσο αντίδρασης, ιδιαίτερα στην περίπτωση πολυφασικών συστημάτων, τα οποία μπορεί να περιλαμβάνουν μια στερεή βιοκαταλυτική φάση (όπως ο ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης) και μία ή περισσότερες ρευστές φάσεις (υδατική και οργανική φάση). Θεωρείται, επίσης, αναγκαία η συλλογή αξιόπιστων πειραματικών δεδομένων και η ανάπτυξη μοντέλων, τα οποία θα περιγράφουν την επίδραση φυσικοχημικών παραγόντων (όπως η διάχυση και η κατανομή των υποστρωμάτων και των προϊόντων στις φάσεις του συστήματος, ή η περιεκτικότητα του συστήματος σε νερό) στις καταλυτικές ιδιότητες των ενζύμων. 233

242 Η επίδραση του μέσου, στο οποίο εξελίσσεται μια βιοκαταλυτική διεργασία, διαδραματίζει σημαντικότατο ρόλο στην έκφραση των καταλυτικών ιδιοτήτων (εκλεκτικότητα, δραστικότητα και σταθερότητα) των βιοκαταλυτών. Έτσι, τροποποιώντας και ελέγχοντας τις ιδιότητες του μέσου (μηχανική του μέσου - medium engineering) είναι δυνατό να βελτιώσουμε την καταλυτική συμπεριφορά των ενζυμικών συστημάτων. Τέλος, ο σχεδιασμός του βιοαντιδραστήρα προϋποθέτει γνώση της κινητικής της αντίδρασης, της διασποράς του υποστρώματος και των φαινομένων μεταφοράς μάζας. Στην περίπτωση δε των πολυφασικών βιοντιδραστήρων, παράγοντες, όπως η κατανομή των υποστρωμάτων και των προϊόντων μεταξύ των φάσεων, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη Βιοκατάλυση σε μη Συμβατικά Συστήματα Αν και η πρώτη αναφορά στη διεθνή βιβλιογραφία, σχετικά με τη δυνατότητα δράσης των ενζύμων (συγκεκριμένα της παγκρεατικής εστεράσης) σε οργανικά συστήματα, χρονολογείται από το 1930, χρειάστηκε να περάσουν πάνω από 50 χρόνια, ώστε να αρχίσει να διαφαίνεται ότι η ιδιότητα αυτή αφορά σχεδόν όλα τα ένζυμα. Το χρονικό αυτό χάσμα ήταν αποτέλεσμα της διαπίστωσης ότι, η προσθήκη πολικών οργανικών διαλυτών (ακετόνη, αιθανόλη, διοξάνιο κλπ) σε ένα υδατικό ενζυμικό διάλυμα, οδηγεί συχνά σε αποδιάταξη της πρωτεϊνικής δομής και κατά συνέπεια σε απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας. Με βάση την παρατήρηση αυτή, είχε διαμορφωθεί η αντίληψη ότι και οι μη πολικοί οργανικοί διαλύτες οδηγούν σε αδρανοποίηση των ενζύμων και θα πρέπει να αποφεύγονται, ως μη συμβατοί, σε ένα βιοκαταλυτικό σύστημα αντίδρασης. Αποτέλεσμα της παραπάνω αντίληψης ήταν ο περιορισμός της εφαρμογής των βιοκαταλυτών μόνο σε υδατικά συστήματα και μάλιστα σε διεργασίες που αφορούσαν κυρίως υδατοδιαλυτά υποστρώματα. Καθώς η πλειοψηφία των οργανικών ενώσεων είναι μη υδατοδιαλυτά μόρια, εύκολα γίνεται κατανοητό ότι ο ορίζοντας των βιοκαταλυτικών μετατροπών μπορεί να διευρυνθεί σε μεγάλο βαθμό στην περίπτωση που η εφαρμογή της ενζυμικής κατάλυσης συμπεριλάβει και τα υποστρώματα αυτά. Κατά κανόνα, αυτό μπορεί να επιτευχθεί με την επιλογή οργανικών συστημάτων χαμηλής περιεκτικότητας σε νερό, στα οποία όμως τα ένζυμα θα διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες. Η έρευνα 234

243 προς την κατεύθυνση αυτή οδήγησε τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη τέτοιων συστημάτων, γνωστά με τον όρο μη υδατοσυμβατά ή μη συμβατικά συστήματα (nonconνentional media), στα οποία το ρόλο του διαλύτη διαδραματίζουν κυρίως μη πολικοί οργανικοί διαλύτες, υπερκρίσιμα ρευστά ή ακόμη και τα ίδια τα υποστρώματα (συστήματα χωρίς διαλύτη -solvent free systems). Χαρακτηριστικά παραδείγματα εφαρμογής της βιοκατάλυσης σε μη συμβατικά συστήματα αποτελεί η σύνθεση πεπτιδίων από αμινοξέα που καταλύουν πρωτεολυτικά ένζυμα (θρυψίνη, χυμοθρυψίνη, παπαΐνη), η σύνθεση του γλυκαντικού ασπαρτάμη που καταλύει η θερμολυσίνη σε οξικό αιθυλεστέρα, αλλά και η εφαρμογή λιπασών στην κατάλυση αντιδράσεων εστεροποίησης και διεστεροποίησης ρακεμικών υποστρωμάτων (βλ κεφάλαιο 7) Πλεονεκτήματα της ενζυμικής κατάλυσης σε μη συμβατικά συστήματα Η εφαρμογή μη συμβατικών συστημάτων στη βιοκατάλυση συνοδεύεται από μια σειρά σημαντικών πλεονεκτημάτων, τα οποία σχετίζονται με: 1. Την αύξηση της διαλυτότητας των υδρόφοβων υποστρωμάτων, γεγονός που συνοδεύεται από αύξηση της παραγωγικότητας του συστήματος. 2. Τη δυνατότητα μετατόπισης της χημικής ισορροπίας της αντίδρασης, ως αποτέλεσμα είτε της μεταβολής της κατανομής του υποστρώματος ή του προϊόντος στις φάσεις του συστήματος, είτε ως αποτέλεσμα της μείωσης της περιεκτικότητας του συστήματος σε νερό. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η σύνθεση εστέρων και τριγλυκεριδίων, μέσω αντιδράσεων εστεροποίησης και διεστεροποίησης που καταλύονται από λιπάσες σε οργανικά συστήματα (βλ. σχήμα 3.2α) και οι οποίες δεν μπορούν να πραγματοποιηθούν σε υδατικά μέσα. 3. Τη δυνατότητα περιορισμού παράπλευρων αντιδράσεων, όσο και του περιορισμού της αναστολής από το υπόστρωμα ή το προϊόν, γεγονός που συνοδεύεται από αύξηση της απόδοσης της βιοκαταλυτικής διαδικασίας. 4. Την εύκολη ανάκτηση του βιοκαταλύτη από το μίγμα αντίδρασης και κατά συνέπεια τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησής του. Καθώς οι βιοκαταλύτες δεν είναι διαλυτοί σε οργανικά συστήματα, εύκολα ανακτώνται από αυτά με διήθηση, φυγοκέντρηση ή εξάτμιση του διαλύτη. 235

244 5. Τη δυνατότητα ελέγχου της τοπο- και στερεοεκλεκτικότητας των βιοκαταλυτών, καθώς οι ιδιότητες αυτές σχετίζονται με φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των οργανικών διαλυτών, όπως η πολικότητά τους, κ.ά. 6. Την αυξημένη διαλυτότητα αερίων υποστρωμάτων στους οργανικούς διαλύτες σε σχέση με τα υδατικά διαλύματα. 7. Την ελαχιστοποίηση της μικροβιακής επιμόλυνσης του αντιδραστήρα Εκτός όμως από τα παραπάνω πλεονεκτήματα, η παρουσία της οργανικής φάσης συνοδεύεται και από μειονεκτήματα, που σχετίζονται τόσο με φαινόμενα αναστολής της βιοκαταλυτικής δραστικότητας και μετουσίωσης των βιοκαταλυτών, όσο και με το γεγονός ότι αυξάνεται η πολυπλοκότητα του βιοκαταλυτικού συστήματος. Τα μη συμβατικά συστήματα εφαρμόσθηκαν κυρίως για την επίτευξη ενζυμικά καταλυόμενων μετατροπών και λιγότερο σε βιομεταροπές με ολόκληρα κύτταρα. Τελευταία όμως, η ανακάλυψη βακτηριακών στελεχών, ικανών να πολλαπλασιαστούν παρουσία οργανικών διαλυτών, έδωσε νέα ώθηση στην εφαρμογή κυττάρων σε οργανικά συστήματα. Μάλιστα, η εφαρμογή τους σε διάφορες διεργασίες αναμένεται να αυξηθεί, καθώς οι γνώσεις για το μηχανισμό της ανθεκτικότητας των κυττάρων μικροοργανισμών στους οργανικούς διαλύτες θα αυξάνουν Η επιλογή του μέσου Η επιλογή του οργανικού διαλύτη ως συστατικό του μέσου, στο οποίο λαμβάνει χώρα μια βιοκαταλυτική διεργασία, θα πρέπει να ικανοποιεί συγκεκριμένα κριτήρια, που σχετίζονται κατά πρώτο λόγο με τη βιοσυμβατότητα και τη δυνατότητα ανάκτησης του προϊόντος, αλλά και με άλλα επιθυμητά χαρακτηριστικά, όπως η αυξημένη χημική και θερμική σταθερότητα, η μειωμένη τάση για σχηματισμό γαλακτώματος με την υδατική φάση, η μειωμένη τοξικότητα και το χαμηλό κόστος. Μεταξύ των παραπάνω κριτηρίων, η βιοσυμβατότητα αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την εκλογή. Το κριτήριο αυτό συσχετίζεται με ορισμένα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των οργανικών διαλυτών και κυρίως με την υδροφοβικότητά τους. Η υδροφοβικότητα των οργανικών διαλυτών (η οποία σχετίζεται με την πολικότητα) εκφράζεται από το λογάριθμο του συντελεστή κατανομής του διαλύτη σε διφασικό σύστημα οκτανόλης/νερού (logpoct), γνωστή ως παράμετρος του Hansch. Έχει 236

245 διαπιστωθεί μάλιστα σαφέστατη εξάρτηση της ενζυμικής δραστικότητας από τον παράγοντα logpoct του διαλύτη. Έτσι, στους υδρόφιλους διαλύτες, με τιμή logpoct μικρότερη από 2, η καταλυτική δραστικότητα των ενζύμων είναι σημαντικά περιορισμένη, στους διαλύτες με τιμές logpoct μεταξύ 2 και 4 η ενζυμική δραστικότητα ποικίλει, ενώ είναι πολύ αυξημένη στους μη πολικούς διαλύτες με τιμή logpoct μεγαλύτερη από 4. Η αυξημένη δραστικότητα των ενζύμων στους υδρόφοβους διαλύτες μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι, οι διαλύτες αυτοί δεν διαταράσσουν το υδατικό στρώμα που περιβάλλει το βιοκαταλυτικό μόριο και το οποίο θεωρείται απαραίτητο για τη διατήρηση της καταλυτικής του διαμόρφωσης. Στον πίνακα 10.3 παρουσιάζονται χαρακτηριστικές τιμές της παραμέτρου logpoct για διάφορους οργανικούς διαλύτες. Πίνακας Χαρακτηριστικές τιμές logpoct οργανικών διαλυτών Οργανικοί Διαλύτες log Poct Διμεθυλοσουλφοξείδιο -1.3 Μεθανόλη -1.1 Ακετονιτρίλιο Αιθανόλη Ακετόνη Προπανόλη 0.28 Οξικός αιθυλεστέρας 0.68 Βουτανόλη 0.80 Φαινόλη 1.5 Εξανόλη 1.8 Διισοπροπυλικός αιθέρας 1.9 Βενζόλιο 2.0 Τολουόλιο 2.5 Πεντάνιο 3.0 Κυκλοεξάνιο 3.2 Εξάνιο 3.5 Δεκανόλη 4.0 Επτάνιο 4.0 Οκτάνιο 4.5 Δεκάνιο 5.6 Δωδεκάνιο 6.6 Δεκαεξάνιο

246 Παρόμοια επίδραση των διαλυτών χαρακτηρίζει και τη μεταβολική δραστηριότητα μικροοργανισμών, όταν αυτοί έρχονται σε επαφή με την οργανική φάση διφασικών συστημάτων. Σε γενικές γραμμές, η ανεκτικότητα των μικροοργανισμών στους οργανικούς διαλύτες δεν είναι ίδια. Για παράδειγμα, τα κατά Gram-αρνητικά βακτήρια (ιδιαίτερα του είδους Pseudomonas) εμφανίζουν αυξημένη ανθεκτικότητα στους οργανικούς διαλύτες σε σχέση με τα κατά Gram-θετικά βακτήρια, γεγονός που αποδίδεται στη διαφορετική σύσταση της κυτταρικής μεμβράνης Κατηγορίες μη συμβατικών συστημάτων Τα μη συμβατικά συστήματα, που χρησιμοποιούνται για την επίτευξη ενζυμικών μετατροπών, διακρίνονται στις ακόλουθες κατηγορίες: α) Σε ομογενή μίγματα νερού και πολικών υδατοδιαλυτών οργανικών διαλυτών. β) Σε διφασικά υγρά συστήματα νερού/οργανικού μη πολικού διαλύτη. γ) Σε μικροετερογενή συστήματα, όπως μικρογαλακτώματα και αντίστροφα μικκύλια. δ) Σε συστήματα, όπου στερεό ενζυμικό παρασκεύασμα, όπως η λυοφιλιωμένη σκόνη ενζύμου ή κυττάρων, ή ένας ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης σε στερεό φορέα, βρίσκεται υπό μορφή αιωρήματος, σε άνυδρους σε οργανικούς διαλύτες ή υπερκρίσιμα ρευστά. ε) Σε συστήματα, όπου χημικά τροποποιημένα ένζυμα είναι διαλυτά σε οργανικούς διαλύτες. Στο σχήμα 10.2 παρουσιάζονται τα μη συμβατικά συστήματα που χρησιμοποιούνται στην εφαρμοσμένη βιοκατάλυση. Ομογενή μίγματα νερού και υδατοδιαλυτού οργανικού διαλύτη Η προσθήκη υδατοδιαλυτών οργανικών διαλυτών, όπως μεθανόλη, αιθανόλη, ακετόνη, οξικός αιθυλεστέρας, διμεθυλοφορμαμίδιο, διμεθυλοσουλφοξείδιο κ.ά., σε ένα υδατικό διάλυμα, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός ομογενούς μίγματος, στο οποίο η διαλυτότητα των μη πολικών υποστρωμάτων είναι αυξημένη. Σημαντικό πλεονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι, σε ένα τέτοιο σύστημα η διάχυση του υποστρώματος στο μικροπεριβάλλον του βιοκαταλύτη γίνεται χωρίς περιορισμούς. Μειονέκτημα, όμως, αποτελεί η περιορισμένη σταθερότητα των βιοκαταλυτών, ιδιαίτερα όταν η συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη είναι μεγαλύτερη από 50% (ν/ν). H αδρανοποίηση των ενζύμων στις συνθήκες αυτές οφείλεται στην 238

247 αλληλεπίδραση του πολικού διαλύτη με το νερό, η οποία μπορεί να οδηγήσει στη διατάραξη της ενυδατικής κατάστασης του βιοκαταλύτη, η οποία είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της καταλυτικής του διαμόρφωσης. A) B} Γ) E E E E E E E E E E E E E E Δ) E) ΣΤ) E E E E E E E E E E Οργανική φάση Φορέας ακινητοποίησης Υδατική φάση E Ένζυμο Σχήμα Σχηματική παράσταση μη συμβατικών συστημάτων: α) & β) διφασικά υγρά συστήματα νερού/οργανικού μη πολικού διαλύτη, γ) ο βιοκαταλύτης είναι ακινητοποιημένος σε στερεό φορέα δ) ο βιοκαταλύτης είναι σε μoρφή λυoφυλιωμένης σκόνης σε οργανικό μη πολικό διαλύτη, ε) ο βιοκαταλύτης είναι διαλυτός σε μη πολικό οργανικό διαλύτη μετά την τροποποίησή του με πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG), στ) ο βιοκαταλύτης είναι εγκλωβισμένος στο εσωτερικό αντίστροφων μικκυλίων. 239

248 Διφασικά υγρά συστήματα νερού/οργανικού μη πολικού διαλύτη Στα διφασικά υγρά συστήματα νερού/οργανικού μη πολικού διαλύτη, ο βιοκαταλύτης, που μπορεί να είναι ένζυμο (σε διαλυτή μορφή ή ακινητοποιημένο σε στερεό φορέα) ή ακόμη και ολόκληρα κύτταρα -ακινητοποιημένα ή εγκλωβισμένα σε πηκτώματα (γέλες) πολυμερών-, εντοπίζεται στην υδατική φάση του συστήματος (βλ. σχήματα 10.2α και 10.2β). Αντίθετα, το υπόστρωμα εντοπίζεται συνήθως στην οργανική φάση του συστήματος, την οποία αποτελεί ένας μη πολικός διαλύτης, όπως υδρογονάνθρακες με πάνω από 5 άτομα άνθρακα, αιθέρες, χλωροφόρμιο κ.ά.. Στα συστήματα αυτού του τύπου, η ενζυμική αντίδραση λαμβάνει χώρα στην υδατική φάση, ενώ τόσο το υπόστρωμα, όσο και το προϊόν, κατανέμονται μερικώς στην υδατική φάση του συστήματος (βλ σχήμα 10.3). Τα διφασικά αυτά συστήματα χρησιμοποιούνται για το φυσικό περιορισμό (ακινητοποίηση) των βιοκαταλυτών στην υδατική φάση, ενώ η οργανική φάση είναι δυνατό να ανανεώνεται. Η επιφάνεια επαφής των δύο φάσεων θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μεγαλύτερη, ώστε οι περιορισμοί στη μεταφορά μάζας να είναι όσο το δυνατόν μικρότεροι. Αυτό συνήθως επιτυγχάνεται με ισχυρή ανάδευση του συστήματος, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό γαλακτώματος. Η κατανομή των υποστρωμάτων και των προϊόντων της αντίδρασης επηρεάζεται από τη φύση του οργανικού διαλύτη, ενώ στην περίπτωση ενώσεων που διίστανται (π.χ. οργανικά οξέα), εξαρτάται και από το ph της υδατικής φάσης. Στην τελευταία αυτή περίπτωση, το ph της υδατικής φάσης θα πρέπει να είναι συμβατό με την ενζυμική δραστικότητα. Τα πλεονεκτήματα των διφασικών συστημάτων έχουν να κάνουν με τον εύκολο τρόπο παρασκευής τους, την εύκολη σχετικά ανάκτηση του προϊόντος και του βιοκαταλύτη, αλλά και τον περιορισμό της αναστολής της ενζυμικής δράσης από το προϊόν ή το υπόστρωμα. Το τελευταίο είναι αποτέλεσμα της κατανομής των υποστρωμάτων στις δύο φάσεις του συστήματος, γεγονός που αποτρέπει τη συσσώρευσή τους στην υδατική φάση, όπου εντοπίζεται ο βιοκαταλύτης. Παράλληλα, η δυνατότητα εκχύλισης του σχηματιζόμενου προϊόντος στην οργανική φάση έχει ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση της θέσης της χημικής ισορροπίας και την αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης. Καθώς αρκετοί οργανικοί διαλύτες εμφανίζουν έστω και μικρή διαλυτότητα στο νερό, η παρουσία τους είναι δυνατό να οδηγήσει στην αδρανοποίηση του βιοκαταλύτη, γεγονός που αποτελεί μειονέκτημα της εφαρμογής των διφασικών 240

249 συστημάτων. Σε παρόμοιο ανεπιθύμητο αποτέλεσμα μπορεί να οδηγήσει η προσρόφηση του βιοκαταλύτη στη διεπιφάνεια του συστήματος, ιδιαίτερα όταν πρόκειται για γαλάκτωμα. Τα διφασικά υγρά συστήματα χρησιμοποιούνται σε ένα ευρύ φάσμα μετατροπών, το οποίο περιλαμβάνει: την υδρόλυση ελαίων από λιπάσες, τη σύνθεση πεπτιδίων με λιπάσες και πρωτεάσες, την τροποποίηση στεροειδών με ολόκληρα κύτταρα, αλλά και σε ορισμένες μικροβιακές ζυμώσεις. Οργανική φάση S P S E P Υδατική φάση Σχήμα Σχηματική παρουσίαση ενζυμικής μετατροπής σε οργανικό/υδατικό διφασικό σύστημα. S υπόστρωμα, P προϊόν, Ε ένζυμο. Βιοκατάλυση σε συστήματα πολύ μικρής περιεκτικότητας σε νερό Σε πολλές περιπτώσεις βιοκαταλυτικών μετατροπών θεωρείται αναγκαία η δραστική μείωση της περιεκτικότητας του νερού στο βιοκαταλυτικό σύστημα. Ήδη από το 1967 διαπιστώθηκε ότι, η α-χυμoθρυψίνη διατηρεί σε κρυσταλλική μoρφή τις καταλυτικές της ιδιότητες σε άνυδρoυς oργανικoύς διαλύτες. Σχεδόν είκoσι χρόνια αργότερα ξεκίνησε μια επανάσταση στο πεδίο αυτό, καθώς διαπιστώθηκε ότι και άλλα ένζυμα έχoυν την ικανότητα να παραμένoυν δραστικά σε άνυδρoυς oργανικoύς διαλύτες, όταν βρίσκoνται με τη μoρφή λυoφυλιωμένης σκόνης, ή είναι ακινητοποιημένα σε στερεό φορέα, ή ακόμη και διαλυτά μετά από ομοιοπολική τους τροποποίηση με πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG), ή ως σύμπλοκα με λιπίδια (βλ. σχήματα 10.2γ, 10.2δ και 10.2ε). Πιστεύεται ότι η διατήρηση των καταλυτικών ιδιοτήτων των ενζύμων σε άνυδρα (ή σχεδόν άνυδρα) οργανικά συστήματα οφείλεται στο γεγονός ότι, η δομή 241

250 του πρωτεϊνικού μορίου στα συστήματα αυτά παρουσιάζει μικρότερη ευκαμψία και κατά συνέπεια μικρότερη τάση για μετουσίωση σε σχέση με αυτή που παρατηρείται σε μίγματα νερού και ενός οργανικού διαλύτη. Σε κάθε περίπτωση, στο πρωτεϊνικό μόριο παραμένει συνδεδεμένη μια μικρή έστω ποσότητα νερού, απαραίτητη για τη διατήρηση της καταλυτικής διαμόρφωσης. Η επιλογή του οργανικού διαλύτη διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη σταθερότητα και τη δραστικότητα των ενζύμων. Ένας υδρόφιλος οργανικός διαλύτης είναι δυνατό να απομακρύνει τα μόρια του νερού από το ενζυμικό μόριο σχηματίζοντας με αυτά δεσμούς υδρογόνου, γεγονός που οδηγεί στην αποσταθεροποίηση της δομής του και βέβαια στην απώλεια της δραστικότητάς του. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι η δραστικότητα της α-χυμοθρυψίνης είναι φορές υψηλότερη στο οκτάνιο σε σχέση με την πυριδίνη. Ο βαθμός ενυδάτωσης ενός βιοκαταλυτικού συστήματος επιδρά τόσο στη δραστικότητα των βιοκαταλυτών, όσο και στη σταθερότητά τους. Ο βαθμός ενυδάτωσης εκφράζεται συνήθως όχι μέσω της συγκέντρωσης του νερού στο σύστημα, αλλά μέσω της θερμοδυναμικής παραμέτρου της ενεργότητας του νερού aw. Tο πλεονέκτημα της χρήσης της παραμέτρου αυτής έγκειται στο γεγονός ότι, εκφράζει την επίδραση του νερού στη χημική ισορροπία αντιδράσεων, όπου ένα από τα προϊόντα ή αντιδρώντα είναι το νερό (π.χ. εστεροποίηση και υδρόλυση αντίστοιχα). Μια από τις σημαντικότερες ιδιότητες των λυοφιλιωμένων ενζύμων σε άνυδρους οργανικούς διαλύτες αποτελεί το γεγονός ότι, οι καταλυτικές τους ιδιότητες εξαρτώνται από το ph του υδατικού διαλύματος, από το οποίο προέρχονται. Πιθανότατα, οι ιονισμένες ομάδες των λυοφιλιωμένων πρωτεϊνών διατηρούν την ίδια κατάσταση ιοντισμού με αυτή σε ένα υδατικό διάλυμα. O έλεγχος της κατάστασης ιοντισμού των ενζύμων μπορεί κατά συνέπεια να γίνει είτε με την επιλογή του ρυθμιστικού διαλύματος, από το οποίο το ένζυμο θα παραληφθεί με λυοφιλίωση, είτε ακόμη με την προσθήκη οργανικών ρυθμιστικών παραγόντων (organic-phase buffers), όπως για παράδειγμα κάποια ζεύγη οξέων με τις συζυγείς τους βάσεις. Χαρακτηριστική ιδιότητα της βιοκατάλυσης σε άνυδρους οργανικούς διαλύτες αποτελεί η διατήρηση της ενζυμικής δραστικότητας ακόμη και σε εξαιρετικά υψηλές θερμοκρασίες. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι, στους 100 ο C ο χρόνος ημιζωής ενζύμων, όπως η παγκρεατική λιπάση, η ριβονουκλεάση και η α- χυμοθρυψίνη, σε οργανικούς διαλύτες είναι αρκετές ώρες, ενώ σε υδατικά διαλύματα 242

251 μόλις μερικά δευτερόλεπτα! Η μεγάλη αυτή σταθερότητα των ενζύμων είναι αποτέλεσμα της μείωσης της δομικής ευκαμψίας των πρωτεϊνικών μορίων σε άνυδρα συστήματα. Τα ένζυμα σε άνυδρους οργανικούς διαλύτες εμφανίζουν συχνά τροποποιημένη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα σε σχέση με τα υδατικά διαλύματα. Η επιλογή του οργανικού διαλύτη επιδρά σε σημαντικό βαθμό τόσο στην στερεοεκλεκτικότητα, όσο και στην τοποεκλεκτικότητα των ενζύμων. Η εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα των ενζύμων σε οργανικούς διαλύτες περιλαμβάνει την τροποποίηση τριγλυκεριδίων μέσω αντιδράσεων διεστεροποίησης λιπών και ελαίων που καταλύονται από λιπάσες, την παρασκευή οπτικά ενεργών οξέων, αλκοολών και αμινών μέσω αντιδράσεων ασύμμετρης υδρόλυσης ή (δι)εστεροποίησης εστέρων ή αμιδίων που καταλύουν υδρολυτικά ένζυμα, όπως λιπάσες, εστεράσες και πρωτεάσες, την παρασκευή πολυφαινολών μέσω αντιδράσεων πολυμερισμού φαινολών που καταλύουν υπεροξειδάσες, κ.ά Βιοκατάλυση σε συστήματα αέριας φάσης Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η δυνατότητα επίτευξης ενζυμικά καταλυόμενων αντιδράσεων, των οποίων τα υποστρώματα είναι σε αέρια κατάσταση και ο βιοκαταλύτης σε στερεή (π.χ. λυοφιλιωμένη σκόνη ή ακινητοποιημένος σε στερεό φορέα). Η ενζυμική αντίδραση είναι αποτέλεσμα της προσρόφησης των αέριων υποστρωμάτων (S) στη στερεή επιφάνεια, όπου βρίσκεται ακινητοποιημένος ο βιοκαταλύτης. Η βιοκατάλυση σε συστήματα αέριας φάσης βρίσκει εφαρμογή τόσο σε αντιδράσεις σύνθεσης προϊόντων από αέρια υποστρώματα, όσο και στον ενζυμικό προσδιορισμό αερίων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η χρήση ακινητοποιημένου συστήματος δύο ενζύμων, όπως της οξειδάσης της γλυκόζης και της υπεροξειδάσης, που βρίσκει εφαρμογή στην ανίχνευση της αιθανόλης (στην ανθρώπινη αναπνοή) ή της φορμαλδεΰδης (για παράδειγμα στον εσωτερικό αέρα ενός 243

252 εργοστασίου). Και στις δύο περιπτώσεις, οι υπό ανάλυση ενώσεις οξειδώνονται ενζυμικά προς υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο με τη σειρά του συμμετέχει στην οξείδωση ενός δεύτερου υποστρώματος, που καταλύει η υπεροξειδάση. Η δεύτερη αυτή αντίδραση οξείδωσης οδηγεί στη σύνθεση ενός έγχρωμου προϊόντος, του οποίου η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της υπό ανάλυση αρχικής ένωσης. Βιοκατάλυση σε υπερκρίσιμα ρευστά. Ενδιαφέρον, τέλος, παρουσιάζει η χρήση ρευστών σε υπερκρίσιμη κατάσταση (supercritical fluids) ως μέσο για την επίτευξη βιοκαταλυόμενων αντιδράσεων. Κύριο χαρακτηριστικό των υπερκρίσιμων ρευστών αποτελεί το γεγονός ότι ορισμένες φυσικοχημικές τους ιδιότητες (π.χ ιξώδες) βρίσκονται μεταξύ των αντίστοιχων ιδιοτήτων των αερίων και των υγρών, ενώ εξαρτώνται από την εξωτερική πίεση. Η επίτευξη των υπερκρίσιμων συνθηκών για ένα ρευστό προϋποθέτει ότι η τιμή πίεσης και θερμοκρασίας υπερβαίνουν τις χαρακτηριστικές κρίσιμες τιμές. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η περίπτωση του υπερκρίσιμου διοξειδίου του άνθρακα (SC- CO2) κυρίως λόγω της σχετικά χαμηλής κρίσιμης πίεσης (7.3 ΜPa) και θερμοκρασίας (31 ο C), η οποία είναι συμβατή με βιοκαταλυτικές διεργασίες, αλλά και του γεγονότος ότι το CO2 δεν είναι ούτε τοξικό, ούτε εύφλεκτο. Σημαντικό πλεονέκτημα της εφαρμογής των υπερκρίσιμων ρευστών ως μέσο για την επίτευξη βιοκαταλυόμενων αντιδράσεων αποτελεί το γεγονός ότι, η ταχύτητα διάχυσης των υποστρωμάτων στο μέσο αυτό γίνεται χωρίς περιορισμούς, ενώ η ανάκτηση του προϊόντος γίνεται εύκολα, καθώς ο διαλύτης απομακρύνεται με απλή εκτόνωση. Mικροετερογενή συστήματα Στην κατηγορία αυτή υπάγονται τα μικρογαλακτώματα νερού σε οργανικό διαλύτη (έλαιο) ή αντίστροφα μικκύλια (water-in-oil microemulsions or reνerse micelles). Αυτά αποτελούν μια ειδική περίπτωση των διφασικών συστημάτων, με τη διαφορά ότι η υδατική φάση δεν είναι μακροσκοπικά διακριτή από την οργανική φάση του συστήματος, αλλά είναι διεσπαρμένη σε αυτή, γεγονός που καθιστά το σύστημα οπτικά διαυγές. Η διασπορά της υδατικής φάσης, καθώς και του περιεχομένου της, στη συνεχή οργανική φάση σταθεροποιείται από επιφανειοενεργά μόρια (surfactants). Τα επιφανειοενεργά μόρια είναι αμφίφιλα μόρια που 244

253 αποτελούνται από μια ή περισσότερες υδρόφοβες αλυσίδες και μια πολική κεφαλή, πoυ μπoρεί να είναι ή όχι ηλεκτρικά φoρτισμένη. Στην περίπτωση πoυ η πoλική oμάδα δεν είναι φoρτισμένη, τότε αναφερόμαστε σε μη ιoντικά επιφανειoενεργά, ενώ στην αντίθετη περίπτωση, ανάλoγα με τo φoρτίo της πoλικής κεφαλής, διακρίνουμε τα ανιoντικά επιφανειoενεργά αν η πoλική κεφαλή είναι αρνητικά φoρτισμένη, τα κατιoντικά επιφανειoενεργά όταν η πoλική κεφαλή είναι θετικά φoρτισμένη και τα αμφoτερικά (zwitterionic) επιφανειoενεργά όταν στo μόριo συνυπάρχoυν και τα δύo φoρτία. Στον πίνακα 10.4 παρουσιάζονται τα κυριότερα επιφανειοενεργά που χρησιμοποιούνται σε διάφορες βιοκαταλυτικές διεργασίες. Όταν τα μόρια αυτά βρεθούν σε ένα μη πολικό περιβάλλον, σχηματίζουν σφαιρικής συνήθως μορφής συσσωματώματα, καθώς προσανατολίζονται με τέτοιο τρόπο ώστε οι υδρόφοβες αλυσίδες να είναι στραμμένες προς το μη πολικό περιβάλλον, ενώ οι υδρόφοβες κεφαλές στρέφονται προς το εσωτερικό των συσσωματωμάτων σχηματίζοντας ένα πολικό πυρήνα με διάμετρο 15-20Å (βλ. σχήμα 10.2στ). Ο πολικός αυτός πυρήνας έχει την ικανότητα να εγκλωβίσει νερό ή άλλες υδρόφιλες ενώσεις. H δoμή των αντίστροφων μικκυλίων εξαρτάται άμεσα, τόσo από τη φύση των συστατικών, όσo και από την αναλoγία τoυς στo σύστημα, όπως επίσης από τη θερμoκρασία, αλλά και την ιoντική ισχύ τoυ διαλύματoς. Η αναλoγία των συστατικών τoυ συστήματoς παριστάνεται συνήθως μέσω τριγωνικών διαγραμμάτων φάσης. Η ποσότητα του νερού στο σύστημα εκφράζεται από τoν μοριακό λόγο (wo) του νερού ως προς το επιφανειοενεργό, όπου wo=[h2o]/[eπιφανειοενεργό]. Ανάλογα με την ποσότητα του νερού που εγκλωβίζεται, η διάμετρος του υδάτινου πυρήνα των αντίστροφων μικκυλίων μπορεί να λάβει τιμές έως και πάνω από 100 Å. Χαρακτηριστική ιδιότητα αποτελεί η δυνατότητα εγκλωβισμού στο εσωτερικό των ενυδατωμένων μικκυλίων τόσο βιομορίων (ενζύμων, καταλυτικών αντισωμάτων DNA ή και κυτταρικών σωματιδίων), όσο και ολόκληρων βακτηριακών κυττάρων, τα οποία διατηρούν τη βιολογική τους δράση. Το επιφανειοενεργό ΑΟΤ είναι το πλέον χρησιμοποιούμενο για το σχηματισμό αντίστροφων μικκυλίων. Η μέγιστη ποσότητα του νερού, που μπορεί να διαλυτοποιηθεί σε ένα διάλυμα του σε ισοοκτάνιο, αντιστοιχεί στο μοριακό λόγο wo=60. Πάνω από την τιμή αυτή, το διαυγές διάλυμα αντίστροφων μικκυλίων καθίσταται θολό, ενώ παρατηρείται διαχωρισμός φάσεων. Η δυνατότητα τρoπoπoίησης τόσo υδρόφιλων, όσo και υδρόφoβων υπoστρωμάτων στo ίδιo σύστημα, απoτελεί ένα σημαντικό πλεoνέκτημα των 245

254 μικρoγαλακτωμάτων έναντι άλλων μη συμβατικών συστημάτων. Τo σημαντικό αυτό πλεoνέκτημα πηγάζει από τo γεγoνός ότι, ανάλoγα με τη φύση τoυς, τα υπoστρώματα έχoυν την ικανότητα να εντoπίζoνται είτε στην υδατική διασπαρμένη μικρoφάση τoυ συστήματoς, είτε στην μικυλλιακή μεσεπιφάνεια πoυ oρίζoυν τα μόρια τoυ επιφανειοενεργoύ, είτε ακόμη, όταν πρόκειται για υδρόφoβα υπoστρώματα, στoν εξωτερικό oργανικό διαλύτη (βλ. σχήμα 10.4). Η εφαρμογή του συστήματος για τη διεξαγωγή ενζυμικά καταλυόμενων μετατροπών περιλαμβάνει αντιδράσεις υδρόλυσης λιπιδίων και ελαίων, καθώς και αντιδράσεις εστεροποίησης και διεστεροποίησης καταλυόμενες από λιπάσες, σύνθεσης πεπτιδίων με πρωτεάσες και τροποποίησης στεροειδών. Οργανικός διαλύτης S P Σχήμα Ενζυμική τροποποίηση ενός σχετικά υδρόφιλου υποστρώματος S σε υδρόφοβο προϊόν P σε σύστημα αντίστροφων μικκυλίων Πίνακας Χαρακτηριστικά παραδείγματα επιφανειοενεργών μορίων που σχηματίζουν αντίστροφα μικκύλια Είδος με βάση το Επιφανειοενεργά φορτίο Διαλύτες Δις-(2-αιθυλεξυλ)σουλφοηλεκτρικό νάτριο (ΑΟΤ) Βρωμιούχο κετυλτριμεθυλοαμμώνιο (CTAB) Tετραιαθυλενογλυκολδωδεκυλαιθέρας (C12E4) Ανιοντικό Κατιοντικό Μη ιοντικό Υδρογονάνθρακες (C6-C10) Iσο-οκτάνιο Κυκλοεξάνιο Βενζόλιο Εξανόλη / Ισο-οκτάνιο Χλωροφόρμιο / Ισο-οκτάνιο Υδρογονάνθρακες (C8-C10) Iσο-οκτάνιο Φωσφατιδυλοχολίνη Αμφοτερικό Βενζόλιο Προπανόλη / Επτάνιο Φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη Αμφοτερικό Βενζόλιο Προπανόλη / Επτάνιο 246

255 10.4. Μέθοδοι για την αναγέννηση του συνενζύμου Η σημασία της αναγέννησης των συνενζύμων γίνεται κατανοητή, αν αναλογιστούμε, αφενός ότι το 1/3 των ενζυμικών αντιδράσεων απαιτεί τη συμμετοχή συνενζύμου και αφετέρου ότι το κόστος των συνενζύμων είναι πολύ υψηλό. Η in vitro αναγέννηση των συνενζύμων είναι πολύπλοκο πρόβλημα και αποτελεί το κύριο εμπόδιο, που θα πρέπει να υπερνικηθεί πριν την βιομηχανική εφαρμογή των ακινητοποιημένων ενζύμων. Η αποτελεσματικότητα ανακύκλωσης ενός συνενζύμου συνδέεται με τον αριθμό βιοκαταλυτικών κύκλων, που επιτυγχάνονται πριν την καταστροφή του. Η αποτελεσματικότητα αυτή εκφράζεται από τον ολικό αριθμό ανακύκλωσης (total turnover number, TNT), ο οποίος αντιστοιχεί στον ολικό αριθμό moles του προϊόντος που παράγεται ανά mole συνενζύμου κατά την ολοκλήρωση της αντίδρασης. Ο αριθμός ΤΝΤ λαμβάνει τιμές από 1000 σε εργαστηριακή κλίμακα έως και σε μεγάλης κλίμακας εφαρμογές. Έχουν αναπτυχθεί αρκετές μέθοδοι για την αποτελεσματική αναγέννηση του συνενζύμου σε μια βιοκαταλυτική διεργασία. Για παράδειγμα, η αναγέννηση του NADH από το ΝΑD + μπορεί να επιτευχθεί με τέσσερις τρόπους: α) Μέσω της χημικής αναγωγής χρησιμοποιώντας διθειονικό νάτριο Na2S2O4. β) Μέσω της ηλεκτροχημικής ή φωτοχημικής αναγέννησης. γ) Μέσω της εφαρμογής συζευγμένων υποστρωμάτων. Στην περίπτωση αυτή, η αναγέννηση του συνενζύμου, που απαιτείται για την μετατροπή του πρώτου υποστρώματος, επιτυγχάνεται παρουσία ενός δεύτερου υποστρώματος, το οποίο μετατρέπεται από το ίδιο ένζυμο, αλλά προς την αντίθετη κατεύθυνση (Σχήμα 10.5α). δ) Μέσω της εφαρμογής συζευγμένων ενζύμων. Στην περίπτωση αυτή, δύο παράλληλες αντιδράσεις οξείδωσης και αναγωγής, που οδηγούν στην μετατροπή του προϊόντος και την αναγέννηση του συνενζύμου, καταλύονται από δύο διαφορετικά ένζυμα (Σχήμα 10.5β). Η μέθοδος αυτή είναι και η πλέον αποτελεσματική για την αναγέννηση του συνενζύμου. Μια από τις αποτελεσματικότερες στρατηγικές περιλαμβάνει τη σύζευξη του συνενζύμου NAD(H) σε διαλυτό πολυμερές, όπως είναι η πολυαιθυλενική γλυκόλη PEG, ή κάποιος πολυσακχαρίτης, όπως η δεξτράνη. Το τροποποιημένο συνένζυμο μαζί με το ένζυμο τοποθετούνται σε αντιδραστήρα που φέρει μεμβράνη υπερδιήθησης. Η αναγέννηση του συνενζύμου επιτυγχάνεται με σύζευξη δύο ενζυμικών αντιδράσεων: το πρώτο ένζυμο χρησιμοποιεί το συνένζυμο για την κατάλυση της αντίδρασης που θα δώσει το επιθυμητό προϊόν, ενώ το δεύτερο ένζυμο 247

256 χρησιμοποιεί το συνένζυμο σε μια παράλληλη αντίδραση. Μια χαρακτηριστική εφαρμογή της στρατηγικής αυτής παρουσιάζεται στο σχήμα 10.6α&β και αφορά στην ενζυμική παραγωγή αμινοξέων, όπως η L-αλανίνη, η οποία πραγματοποιείται με τη συμμετοχή τριών ενζύμων και του ιδίου συνενζύμου NAD(H). Συγκεκριμένα, η διαδικασία περιλαμβάνει τη μετατροπή ρακεμικού μίγματος γαλακτικού οξέος σε πυροσταφυλικό, που καταλύουν τα ένζυμα L και D-δεϋδρογονάσης του γαλακτικού (LDH), σε συνδυασμό με την παράλληλη αντίδραση μετατροπής του πυροσταφυλικού σε L-αλανίνη, που καταλύει η δεϋδρογονάση της αλανίνης (ADH). α) Ο ΟΗ NADH Aλκοολική δεϋδρογονάση NAD + CH 3 CHO CH 3 CH 2 OH β) (CH 3 ) 3 C O - - COO Δεϋδρογονάση λευκίνης (CH COO 3 ) 3 C + + NH H 3 N H H 2 O NADH NAD+ L-tert-λευκίνη CO 2 Δεϋδρογονάση φορμικού HCOO - Σχήμα 10.5 Χαρακτηριστικά παραδείγματα αναγέννησης συνενζύμου α) κατά την αναγωγή κετονών, όπως η κυκλοεξανόνη, στις αντίστοιχες αλκοόλες που καταλύει το ένζυμο αλκοολική δεϋδρογονάση και η οποία εξελίσσεται παράλληλα με την αντίδραση οξείδωσης της αιθανόλης σε ακεταλδεϋδη που καταλύει το ίδιο ένζυμο β) κατά τη βιομηχανική παραγωγή α-αμινοξέων (όπως η L-tert-λευκίνη) από τα αντίστοιχα α- κετοξέα. Η διεργασία καταλύεται από τη δεϋδρογονάση του εκάστοτε α-αμινοξέος και εξελίσσεται παράλληλα με τη μετατροπή του φορμικού σε CO2, που καταλύει η δεϋδρογονάση του φορμικού. Αντίθετα, όμως, από την απλή σχετικά διαδικασία που περιγράφεται στο σχήμα 10.6, πολλές βιομετατροπές απαιτούν τη διεξαγωγή πλήθους ενζυμικών αντιδράσεων με παράλληλη αναγέννηση των συνενζύμων. Για παράδειγμα, η 248

257 μετατροπή της γλυκόζης σε αιθανόλη περιλαμβάνει δώδεκα ενζυμικές αντιδράσεις, έξι εκ των οποίων απαιτούν την παρουσία συνενζύμων. Έτσι, είναι μάλλον αδύνατη η προσπάθεια μίμησης ενός βιοκαταλυτικού συστήματος, το οποίο θα περιλαμβάνει μεγάλο πλήθος απομονωμένων και ακινητοποιημένων ενζύμων και στο οποίο θα εξασφαλίζεται η συνεχής αναγέννηση των συνενζύμων. Η εναλλακτική λύση, που φαίνεται να αντιμετωπίζει σε μεγάλο βαθμό βιομετατροπές που περιλαμβάνουν αλυσιδωτές αντιδράσεις με τη συμμετοχή συνενζύμων, έχει να κάνει με την εφαρμογή ακινητοποιημένων μεταβολικά ενεργών κυττάρων. α) CH 3 -CHOH-COOH D,L-Γαλακτικό L- και D-LDH CH 3 -CO-COOH Πυροσταφυλικό PEG-NAD + PEG -NADH CH 3 -CHNH 2 -COOH L-αλανίνη L-ADH NH 4 OH β) L-αλανίνη D,L-Γαλακτικό + NH 4 OH Πυροσταφυλικό D-LDH L-ADH L-LDH PEG -NADH PEG-NAD + μεμβράνη υπερδιήθησης Σχήμα α) Ανακύκλωση του συνενζύμου NAD(H) μέσω της σύζευξής του σε πολυαιθυλενική γλυκόλη PEG κατά την ενζυμική παραγωγή της L-αλανίνης β) Ενζυμική παραγωγή L-αλανίνης σε μεμβρανικό βιοαντιδραστήρα. 249

258 250

259 11. ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ 11.1 Παραγωγή βιομάζας Η μικροβιακή μάζα (μικροβιακή πρωτεΐνη Single Cell Protein - SCP) με προορισμό την κατανάλωσή της από τον άνθρωπο παρήχθη για πρώτη φορά σε βιομηχανική κλίμακα στη Γερμανία κατά τη διάρκεια του Α Παγκοσμίου πολέμου και ήταν βιομάζα της ζύμης Candida sp. To κόστος παραγωγής της μικροβιακής πρωτεΐνης εξαρτάται σημαντικά από το κόστος της πηγής άνθρακα. Oι μικροοργανισμοί είναι ικανοί να χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα και ενέργειας ένα μεγάλο αριθμό υποστρωμάτων μικρού κόστους ή ακόμη και αρνητικού κόστους (π.χ υποστρώματα από γεωργικά παραπροϊόντα). Στις αναπτυσσόμενες χώρες, η μικροβιακή πρωτεΐνη χρησιμοποιείται στη διατροφή του ανθρώπου και αποτελεί συχνά μια προσιτή οικονομικά πηγή απαραίτητων αμινοξέων. Στις αναπτυγμένες χώρες, αντίθετα, η μικροβιακή πρωτεΐνη χρησιμοποιείται κυρίως ως πρόσθετο στη διατροφή των ζώων και σπάνια στη διατροφή των ανθρώπων (π.χ. βιομάζα από το μικροφύκος Spirulina piatensis). Τα στάδια παραγωγής βιομάζας είναι η παρασκευή του υποστρώματος με ανάμειξη των πρώτων υλών πριν τη ζύμωση, η αποστείρωση του υποστρώματος (όταν αυτή κρίνεται αναγκαία), η ζύμωση, ο διαχωρισμός της βιομάζας από το ζυμωμένο υπόστρωμα, η ξήρανση της βιομάζας και τέλος, η αποθήκευση του τελικού προϊόντος. Η παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης απαιτεί αποτελεσματικό σύστημα αερισμού, καθώς η ζύμωση απαιτεί μεγάλη κατανάλωση οξυγόνου, καθώς και σύστημα ψύξης ικανό να απάγει τις σημαντικές ποσότητες θερμότητας που παράγονται κατά τη ζύμωση. Η βιομάζα, που παράγεται από μια ταχέως αυξανόμενη μικροβιακή καλλιέργεια, περιέχει σημαντικές ποσότητες νουκλεϊκών οξέων, συστατικών γνωστών για τις αντιδιατροφικές τους ιδιότητες. Για το λόγο αυτό, τις περισσότερες φορές η παραγόμενη βιομάζα κατεργάζεται με σκοπό τη μείωση της περιεκτικότητάς της σε νουκλεϊκά οξέα. Η βιομάζα θα πρέπει να παράγεται με χαμηλό κόστος, να μην περιέχει τοξικά συστατικά και να είναι υψηλής διαιτητικής αξίας. Επίσης, θα πρέπει να συνιστά τρόφιμο, να έχει δηλ. επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Οι μικροοργανισμοί, που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης, δε θα πρέπει να είναι παθογόνοι για τον άνθρωπο, τα ζώα και τα φυτά.. 251

260 Στελέχη που συγκεντρώνουν τα κριτήρια αυτά συναντούμε σε όλες τις κατηγορίες των μικροοργανισμών (μικρο-φύκη, βακτήρια, ζύμες και μύκητες). Τα μικροφύκη που χρησιμοποιούνται για παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης ανήκουν συνήθως στα γένη Chlorella, Scenedesmus και Spirulina. To μεγάλο πλεονέκτημα των μικροφυκών έναντι των άλλων μικροοργανισμών είναι η ικανότητά τους να φωτοσυνθέτουν και επομένως να αναπτύσσονται απουσία οργανικής πηγής άνθρακα. Η καλλιέργειά τους πραγματοποιείται σε υπαίθριες δεξαμενές (λίμνες), όπου ο περιοριστικός για την αύξηση παράγοντας είναι συνήθως ο φωτισμός. Παρόλο που οι συνθήκες καλλιέργειας των μικροφυκών είναι ακραίες (pη >10, υψηλή αλατότητα), ο κίνδυνος επιμόλυνσης της καλλιέργειας είναι πάντα υπαρκτός. To μειονέκτημα των μικροφυκών είναι ο μικρός ειδικός ρυθμός αύξησής τους. Αν η συγκέντρωση της βιομάζας υπερβεί τα 1-2 g/l, ο ειδικός ρυθμός αύξησης του πληθυσμού λαμβάνει εξαιρετικά χαμηλές τιμές, επειδή ο φωτισμός συνιστά τον περιοριστικό για την αύξηση παράγοντα. Έτσι, η συγκέντρωση της βιομάζας παραμένει χαμηλή, γεγονός που αυξάνει υπερβολικά το κόστος παραγωγής βιομάζας. Η βιομάζα των μικροφυκών χρησιμοποιείται ευρέως στη διατροφή των ζώων και μόνο το μικροφύκος Spirulina piatensis χρησιμοποιείται στη διατροφή του ανθρώπου. Πολλά γένη βακτηρίων (Pseudomonas, Methylomonas, Methylococcus και Corynebacterium) είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή βιομάζας. Πλεονεκτήματα των βακτηρίων αποτελούν ο υψηλός ειδικός ρυθμός με τον οποίο αυξάνονται, καθώς επίσης και η ικανότητά τους να χρησιμοποιούν μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων. Το άριστο pη αύξησης των βακτηρίων βρίσκεται στην περιοχή του 7 ή και υψηλότερα, περιοχή στην οποία ο κίνδυνος επιμόλυνσης των καλλιεργειών είναι μεγάλος. Η βακτηριακή μάζα περιέχει μέχρι 80% πρωτεΐνη, της οποίας η σύσταση είναι αρκετά καλή. Συνήθως, παρατηρείται μικρή έλλειψη σε θειούχα αμινοξέα. Περιέχει, επίσης, μέχρι 20% RNA. Τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια θα πρέπει να εξετάζονται ως προς την ικανότητα παραγωγής ενδοτοξινών. Οι μικροοργανισμοί που έχουν χρησιμοποιηθεί, και χρησιμοποιούνται, κατ' εξοχήν για την παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης είναι οι ζύμες, όπως αυτές που ανήκουν στα γένη Saccharomyces, Torulopsis και Candida. Οι ζύμες αυξάνονται σχετικά γρήγορα, το δε άριστο pη αύξησής τους είναι μεταξύ 3,5 και 5,0. Συχνά, επίσης, χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πρωτεΐνης μύκητες των γενών Geotrichum, Rhizopus και Paecilomyces. Οι μύκητες αυξάνονται 252

261 ικανοποιητικά σε ευρεία κλίμακα τιμών του pη (3-8), με ειδικούς όμως ρυθμούς μικρότερους εκείνων των ζυμών. Αν και οι χαμηλές τιμές του pη επιδρούν αρνητικά στον ειδικό ρυθμό αύξησης, προτιμώνται συχνά στη βιομηχανική πράξη, λόγω του ότι προστατεύουν μερικώς την καλλιέργεια από βακτηριακές επιμολύνσεις. Οι μύκητες, που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή βιομάζας, ελέγχονται αυστηρά ως προς την ικανότητά τους να παράγουν μυκοτοξίνες. Τα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα για την παραγωγή βιομάζας μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες, σε υδρογονάνθρακες (υγροί ή αέριοι) και σε ανανεώσιμες πηγές άνθρακα. Υγροί υδρογονάνθρακες Οι υγροί υδρογονάνθρακες (n-αλκάνια) με αριθμό ατόμων άνθρακα μικρότερο ή ίσο του 8 είναι τοξικοί για το μικροβιακό κύτταρο. Εκείνοι, συνεπώς, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πηγή άνθρακα είναι οι υδρογονάνθρακες αδιάλυτοι στο νερό, με αριθμό ατόμων άνθρακα 9 έως 18 (C9-C18). Απαραίτητη προϋπόθεση για την απρόσκοπτη μεταφορά του αδιάλυτου στο μέσο καλλιέργειας υποστρώματος στο μικροβιακό κύτταρο είναι η δημιουργία γαλακτώματος. Αυτό επιτυγχάνεται με μηχανικά μέσα, όπως η ανάδευση και ο αερισμός, με χημικά μέσα, όπως με τη χρήση επιφανειοδραστικών μορίων, ή με βιολογικά μέσα (έκκριση από το μικροβιακό κύτταρο ουσιών με επιφανειοδραστικές ιδιότητες), που δημιουργούν ένα σταθερό μικρογαλάκτωμα. Αέριοι υδρογονάνθρακες Με το μεθάνιο ως πηγή άνθρακα συνήθως λαμβάνονται υψηλές αποδόσεις και υψηλή παραγωγικότητα του βιοαντιδραστήρα, ενώ δεν παρατηρούνται παραπροϊόντα. Η παρουσία του μεθανίου μπορεί να μειώσει τη διαθεσιμότητα του οξυγόνου στο μέσο ανάπτυξης, γεγονός που αποτελεί σημαντικό μειονέκτημα του μεθανίου και γενικότερα των αέριων υποστρωμάτων. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι, το μεθάνιο είναι εύφλεκτο και κατά συνέπεια οι εγκαταστάσεις των μονάδων είναι πολυδάπανες και γι αυτό μέχρι στιγμής δεν εφαρμόζεται σε βιομηχανικό επίπεδο. Ανανεώσιμες πηγές άνθρακα Διοξείδιο του άνθρακα To διοξείδιο του άνθρακα μπορεί να αξιοποιηθεί μόνον από τους φωτοσυνθέτοντες μικροοργανισμούς (μικροφύκη). Η παραγωγή μικροβιακής 253

262 πρωτεΐνης από μικροφύκη έχει πολλές ομοιότητες με τη συμβατική γεωργία, κυρίως σε τεχνικό επίπεδο. To ενδιαφέρον έχει στραφεί κυρίως στο κυανοφύκος Spirulina spp., το οποίο συλλέγεται σχετικά εύκολα και ξηραίνεται με φυσικό τρόπο στον ήλιο. Αναπτύσσεται σε εξαιρετικά υψηλές τιμές pη (>11), όπου ο κίνδυνος επιμολύνσεων είναι μικρός. Μελάσα Η μελάσα είναι παραπροϊόν της βιομηχανίας ζάχαρης και θεωρείται το σπουδαιότερο υπόστρωμα για την παραγωγή ζύμης αρτοποιίας (Saccharomyces cerevisiae). Γενικά, η μελάσα θεωρείται ακριβό υπόστρωμα για την παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης. Τυρόγαλα Το τυρόγαλα είναι ένα παραπροϊόν της γαλακτοβιομηχανίας, που παράγεται σε μεγάλες ποσότητες. Σήμερα υπάρχουν μεγάλες μονάδες σε πολλές χώρες του κόσμου που παράγουν μικροβιακή μάζα από τυρόγαλα. Υδρόλυμα πολυσακχαριτών Οι πολυσακχαρίτες (κυτταρίνες, πηκτίνες, άμυλο) είναι δυνατό να αξιοποιηθούν μετά από χημικά ή ενζυμικά καταλυόμενη υδρόλυσή τους σε απλά σάκχαρα (κυρίως γλυκόζη), που θα χρησιμοποιηθούν ως πηγή άνθρακα. Λίπη και Έλαια Τα λίπη είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα για την παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης, κυρίως από λιπολυτικούς μικροοργανισμούς, ικανούς να χρησιμοποιούν ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας τριγλυκερίδια. 'Έχουν μελετηθεί κυρίως ζύμες του γένους Candida, οι οποίες δίνουν άριστες αποδόσεις σε ξηρή βιομάζα, πολύ κοντά στο 100%. 'Όπως όλα τα προϊόντα, τα οποία προορίζονται να συμμετάσχουν στη διατροφή του ανθρώπου, έτσι και η μικροβιακή πρωτεΐνη ελέγχεται όσον αφορά την ποιότητά της (βιολογική της αξία) και την ασφάλειά της. Ακόμη και αν το προϊόν προορίζεται για ζωοτροφή, η βιολογική εκτίμηση είναι ένα απαραίτητο στάδιο και αφορά όχι μόνον την ασφάλεια των ζώων, αλλά και την ασφάλεια των ανθρώπων που χρησιμοποιούν τα προϊόντα των ζώων. 254

263 11. 2 Παραγωγή Μικροβιακών Ελαίων Ο όρος μικροβιακό έλαιο (single cell oil) αφορά σε φυτικά ή ζωϊκά έλαια που έχουν υποστεί βιοτροποποίηση, με σκοπό τη βελτίωση της σύστασης ή/και της δομής των λιπαρών υλών. To ενδιαφέρον των μικροβιακών ελαίων είναι μεγάλο, καθώς αυτά θεωρούνται άριστη πηγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Αυτά τα λιπαρά οξέα χρησιμοποιούνται τόσο στη διατροφή, όσο και ως πρώτες ύλες για την παρασκευή ειδικών τροφών και καλλυντικών. Από την άλλη πλευρά, μερικοί μικροοργανισμοί κάτω από ορισμένες συνθήκες αύξησης συσσωρεύουν λιπιδιακά αποθέματα, των οποίων η δομή παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον, επειδή μοιάζει με τη δομή διάφορων «εξωτικών» λιπών, όπως π.χ. του λίπους του κακάο. Τα στάδια παραγωγής των μικροβιακών ελαίων είναι, μέχρι το στάδιο παραγωγής της αποξηραμένης μικροβιακής μάζας, τα ίδια με αυτά της μικροβιακής πρωτεΐνης. Μετά την παραλαβή της βιομάζας πραγματοποιείται εκχύλιση του λίπους με εξάνιο ή πετρελαϊκό αιθέρα και απομάκρυνση του διαλύτη υπό συνθήκες κενού. Διάφοροι μικροοργανισμοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή μικροβιακών ελαίων. Μεταξύ των πλουσιοτέρων σε λίπος μικροφυκών είναι το Botryococcus braunii, το Dunaliella salina και Chlorella vulgaris με ποσοστό λίπους πάνω από 40%. Λιγότερο πλούσια είναι η βιομάζα του Spirulina platensis, αφού περιέχει μόνον 20% λίπος. To λίπος όμως αυτό περιέχει περίπου 15% γ-λινολενικό οξύ, γεγονός που το κάνει να παρουσιάζει υψηλό εμπορικό ενδιαφέρον. Λίγα γένη βακτηρίων (όπως το Arthrobacter ΑΚ19, Acinetobacter) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή ελαίων, όμως τα περισσότερα δεν είναι δυνατόν να αξιοποιηθούν βιομηχανικά, επειδή περιέχουν και αλλεργιογόνες ουσίες. Οι ζύμες είναι πολύ καλά μελετημένες ως προς την ικανότητά τους να συσσωρεύουν λίπος και θεωρούνται ως οι κατ' εξοχήν ελαιογόνοι μικροοργανισμοί (Rhodotorula glutinis, Candida curvata, Candida spp και Rhodotorula graminisτα, οι οποίες περιέχουν λίπος >40% ). Λιγότερο πλούσιες σε λίπος (<40%) είναι οι ζύμες Yarrowia (Candida) lipolytica και C. paralipolytica. Οι μύκητες είναι επίσης πολύ καλά μελετημένοι μικροοργανισμοί. Τα πλέον πλούσια σε λίπος είδη μυκήτων είναι τα Zygomycetes, Εntomophthorales και Ascomycetes. Απ' τους μύκητες αυτούς, το μεγαλύτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι Mucorales, καθώς βιοσυνθέτουν λιπαρά οξέα της οικογένειας ω6, και στελέχη του γένους Mortierella, που είναι ικανά να βιοσυνθέτουν λιπαρά οξέα της επίσης ενδιαφέρουσας οικογένειας ω3. 255

264 Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για την παραγωγή μικροβιακών ελαίων. Όμως, αν και η καλλιέργεια των ελαιογόνων μικροοργανισμών είναι δυνατό να πραγματοποιηθεί σε γεωργικά υποπροϊόντα μικρού κόστους, το τελικό κόστος των μικροβιακών ελαίων είναι 3-5 φορές υψηλότερο των φυτικών ελαίων. Η παραγωγή συνεπώς των μικροβιακών ελαίων αφορά προς το παρόν μόνον ειδικής σύστασης ή δομής έλαια, που χρησιμοποιούνται ως πρώτες ύλες στη βιομηχανία φαρμάκων και καλλυντικών Παραγωγή Βιοκαυσίμων Ο άνθρωπος δεν μπορεί να βασιστεί επί μακρόν σε μη ανανεώσιμα ορυκτά καύσιμα για τις ενεργειακές του ανάγκες, κάτι που γίνεται όλο και περισσότερο αντιληπτό. Επιπλέον, τα αέρια του φαινομένου του θερμοκηπίου που παράγονται από την καύση των ορυκτών καυσίμων θεωρούνται ευρέως ως πρωταρχική αιτία της υπερθέρμανσης του πλανήτη. Όλοι αυτοί οι παράγοντες καθιστούν αναγκαία την ανεύρεση ανανεώσιμων καυσίμων, φιλικών προς το περιβάλλον. 'Eνα σημαντικό τμήμα της έρευνας στο πεδίο αυτό αφορά στη βιοτεχνολογική παραγωγή καυσίμων (βιοκαυσίμων). Στα βιοκαύσιμα περιλαμβάνεται η αιθανόλη, το βιοντήζελ (μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων, biodiesel, που παράγονται είτε χημικώς, είτε με τη χρήση ενζύμων (λιπασών)), το μεθάνιο (βιοαέριο), το υδρογόνο και οι υδρογονάνθρακες μικροβιακής προέλευσης. Στον Πίνακα 11.1 παρουσιάζεται η ετήσια παραγωγή βιοντήζελ και βιοαιθανόλης της Ελλάδας σύμφωνα με την οδηγία 2003/30 της ΕΕ Βιοαιθανόλη Η αιθανόλη παράγεται μικροβιακά μέσω της αλκοολικής ζύμωσης, η οποία θεωρείται η σπουδαιότερη και καλύτερα μελετημένη ζύμωση (Σχήμα 11.1). Οι ζύμες, ακόμη και κάτω από ιδεώδεις συνθήκες, μετατρέπουν σε αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα μόνον το 95% του σακχάρου, το δε υπόλοιπο 5% χρησιμοποιείται για τη βιοσύνθεση κυτταρικών υλικών. Παραπροϊόντα της αλκοολικής ζύμωσης που παράγονται σε μικροποσότητες είναι η γλυκερόλη, το ηλεκτρικό οξύ, ανώτερες αλκοόλες, 2,3 βουτανοδιόλη, ακεταλδεύδη, οξικό οξύ και γαλακτικό οξύ. 256

265 Πίνακας 11.1 Παγκόσμια παραγωγή βιοαιθανόλης [ Η αιθανόλη παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον ως πηγή ενέργειας, ιδίως για τις χώρες που δεν είναι ενεργειακά αυτάρκεις. Η ποσοτική μετατροπή των σακχάρων σε αιθανόλη μέσω της αλκοολικής ζύμωσης δίνεται με βάση τους υπολογισμούς Gay-Lussac από τη στοιχειομετρική μετατροπή μιας εξόζης σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα: C6H12Ο6 2C2H5OH + 2C02 εξόζη αιθανόλη διοξείδιο του άνθρακα ,1 48,9 Η θεωρητική απόδοση 51,1% (β/β) ονομάζεται συντελεστής Gay-Lussac. Οι υπολογισμοί Pasteur είναι ορθότεροι, αφού πλησιάζουν περισσότερο στην πραγματικότητα: εξόζη αιθανόλη + διοξείδιο του άνθρακα + γλυκερόλη+ οργανικοί διαλ. + βιομάζα ,4 46,6 3,3 0,6 1,2 Στην πράξη, η απόδοση της ζύμωσης υπολογίζεται ως προς το συντελεστή Gay- Lussac. Για παράδειγμα, η απόδοση κατά Pasteur είναι 94,7% επί της κατά Gay- Lussac απόδοσης και θεωρείται η μέγιστη δυνατή. Τα συστήματα καλλιέργειας που εφαρμόζονται για την παραγωγή αιθανόλης είναι κλειστά, συνεχούς καλλιέργειας (οπότε απαιτούνται μικρότεροι βιοαντιδραστήρες) και συνεχούς καλλιέργειας με ανακύκλωση κυττάρων. Σε 257

266 πειραματικό στάδιο βρίσκεται η παραγωγή αλκοόλης σε βιοαντιδραστήρα με ακινητοποιημένα κύτταρα. Σχήμα 11.1 Αλκοολική ζύμωση Η βέλτιστη θερμοκρασία παραγωγής αλκοόλης είναι 2-4 C υψηλότερη της βέλτιστης θερμοκρασίας αύξησης της ζύμης. Η θερμοκρασία που συχνά πραγματοποιείται η ζύμωση είναι C και η τιμή του pη 4,5-5. To σύστημα ψύξης που εφαρμόζεται είναι συνάρτηση του όγκου του βιοαντιδραστήρα. Για όγκους έως l, συνήθως η θερμότητα, η οποία παράγεται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, απομακρύνεται με φυσική απαγωγή, κυρίως ακτινοβολία, και έτσι δε λαμβάνεται κάποια ειδική μέριμνα. Για πιο μεγάλους όγκους (> l) πραγματοποιείται συμπληρωματική ψύξη με νερό ή εναλλάκτη θερμότητας. Στο σχήμα 11.2 παρουσιάζεται συνοπτικά η παραγωγή βιοαιθανόλης. To φαινόμενο παρεμπόδισης της ζύμωσης από το προϊόν (αιθυλική αλκοόλη) αντιμετωπίζεται με συνεχή απομάκρυνση της αιθανόλης από το βιοαντιδραστήρα, έτσι ώστε η συγκέντρωσή της στο περιβάλλον της ζύμωσης να διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται είναι γεωργο-βιομηχανικά ή δασικά προϊόντα και παραπροϊόντα της βιομηχανίας ζάχαρης (μελάσες) και της 258

267 χαρτοβιομηχανίας. Χρησιμοποιούνται, επίσης, φυτά με υψηλή περιεκτικότητα σε σάκχαρα (σακχαροκάλαμο), δημητριακά (καλαμπόκι, ρύζι), κόνδυλοι (πατάτες, γλυκοπατάτες), ξύλα ευκαλύπτου και πεύκου κ.λπ. Οι µικροοργανισµοί που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή αιθανόλης είναι ζύμες και ορισμένα βακρήρια. Αν και ο µηχανισµός της ζύµωσης και τα τελικά προϊόντα της, είναι ίδια για όλους τους οργανισµούς, αυτοί εμφανίζουν διαφορές ως προς την ικανότητα να ζυµώνουν σακχαρούχα διαλύµα τα διαφορετικής πυκνότητας, το είδος του υποστρώµατος που μπορεί να ζυμώσουν, τον χρόνο διάρκειας της ζύµωσης και η ποσότητα των παραπροϊόντων που παράγουν. Είδη ζυµών και βακτηρίων που παράγουν αιθανόλη καθώς και τα υποστρώματα που χρησιμοποιούν ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ZYMEΣ Saccharomyces cerevisiae Γλυκόζη, Φρουκτόζη, Γαλακτόζη, Μαλτόζη, Μαλτοτριόζη, Ξυλουλόζη. Saccharomyces carlsbergensis Γλυκόζη, Φρουκτόζη, Γάλα Μαλτοτριόζη, Ξυλουλόζη. Kluyveromyces fragilis & Kluyveromyces Γλυκόζη, Γαλακτόζη, Λακτόζη lactis Candida pseudotropicalis Γλυκόζη, Γαλακτόζη, Λακτόζη Candida tropicalis Γλυκόζη, Γαλακτόζη, Ξυλουλόζη ΒΑΚΤΗΡΙΑ Zymomonas mobilis Γλυκόζη, Φρουκτόζη, Σακχαρόζη. Clostridium termocellum Γλυκόζη, Κελλοβιόζη, Κυτταρίνη Clostridium thermohydrosulfuricum Γλυκόζη, Κελλοβιόζη, Ξυλόζη, Σακχαρόζη, Άµυλο. Thermoanaerobium brockii & Γλυκόζη, Σακχαρόζη, Κελλοβιόζη Thermoanaerobium acetoethylicus Η διαδικασία παραγωγής αιθανόλης όπως παρουσιάζεται στο πιο κάτω σχήµα 1.2, περιλα µβάνει τρία στάδια Στάδιο Ι : Παραλαβή των περιεχόµενων ζυµώσιµων σακχάρων από τις πρώτες ύλες, µε την βοήθεια φυσικών, χηµικών ή ενζυµικών τεχνικών. Στάδιο ΙΙ : Μετατροπή των σακχάρων σε αιθανόλη Στάδιο ΙΙΙ: Ανάκτηση της αιθανόλης, µε απόσταξη, ως µίγµα 95.6% αιθανόλης και 4.4% νερού. 259

268 Σχήμα 11.2 Στάδια παραγωγής βιοαιθανόλης Μεθάνιο (βιοαέριο) To μεθάνιο που παράγεται από τους μικροοργανισμούς (μεθανογόνα αρχαία) είναι μια σπουδαία πηγή ενέργειας, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή θερμότητας, αλλά και ηλεκτρικής ενέργειας. Η παγκόσμια κατανάλωση προέρχεται κατά 80% από απορρίμματα, που ζυμώνονται στους χώρους υγειονομικής ταφής απορριμμάτων και κατά 20% από αναερόβιους βιοαντιδραστήρες. Η παραγωγή μεθανίου πραγματοποιείται σε τέσσερα στάδια, στα οποία συμμετέχουν τέσσερις διαφορετικές ομάδες (group) μικροοργανισμών. Oι μικροοργανισμοί της ομάδας I (Clostridium, Bacteroides και Ruminococcus) έχουν ως ρόλο την υδρολυτική διάσπαση των πολυμερών μορίων (πρωτεϊνών, πολυσακχαριδίων, λιπών κ.λπ.) προς απλούστερα μόρια, όπως H2, CO2, μυρμηγκικό οξύ, οξικό οξύ, αιθανόλη, προπιονικό οξύ, προπανόλη, βουτυρικό οξύ, βουτανόλη κ.λπ. Οι μικροοργανισμοί της ομάδας II (Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii) μετατρέπουν το CO2 και το H2 σε 260

269 οξικό οξύ. Τα μέλη της ομάδας III (Syntrophomonas, Syntrophobacter) ζυμώνουν τα προϊόντα μεταβολισμού της ομάδας I προς οξικό οξύ, H2 και CO2. Οι μικροοργανισμοί τέλος της ομάδας IV (Methanobacterium, Methanococcus, Methanogenium, κ.ά) χρησιμοποιούν οξικό οξύ, CO2, μυρμηγκικό οξύ και μεθανόλη και αποδίδουν μεθάνιο και CO2. Σε πολλές περιπτώσεις, η παραγωγή μεθανίου δεν απαιτεί βιοαντιδραστήρες υψηλής τεχνολογίας και έτσι μπορεί να εφαρμοστεί σε χώρες που δε δύνανται να επενδύσουν σημαντικά ποσά σε υποδομές Υδρογόνο Ορισμένοι φωτοσυνθέτοντες μικροοργανισμοί (άλγη), αλλά και βακτήρια όπως Bacillus licheniformis, Clostridium butyricum, κ.ά, παράγουν σημαντικές ποσότητες H2, χρησιμοποιώντας την ηλιακή ενέργεια ή αναπτυσσόμενα σε βιομηχανικά υποστρώματα, αντίστοιχα. Σημαντική έρευνα στον τομέα αυτό πραγματοποιείται στην Ιαπωνία, όπου ήδη παράγονται αυτοκίνητα, τα οποία χρησιμοποιούν ως καύσιμο το υδρογόνο. Το H2 θεωρείται αποδοτική πηγή ενέργειας και συγχρόνως δε ρυπαίνει το περιβάλλον. Προς το παρόν χρησιμοποιείται ως καύσιμο σε πιλοτικά μόνο προγράμματα, επειδή δεν έχουν βρεθεί ακόμη οικονομικοί τρόποι παραγωγής σε μεγάλη κλίμακα. Τέλος, μερικοί μικροοργανισμοί (μικροφύκη) είναι ικανοί να συσσωρεύουν ενέργεια υπό τη μορφή υδρογονανθράκων, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως καύσιμη ύλη. Ενδιαφέρον φαίνεται να παρουσιάζει το μικροφύκος Botryococcus brawnii, το οποίο συσσωρεύει μεγάλο μέρος των ενεργειακών του αποθεμάτων (περίπου 20% επί του συνόλου) υπό μορφή υδρογονανθράκων. To μεγάλο μειονέκτημα του συγκεκριμένου μικροοργανισμού είναι ο εξαιρετικά χαμηλός ρυθμός αύξησής του (6 εβδομάδες) Βιοαποδομήσιμα πολυμερή Παρά τα σημαντικά πλεονεκτήματα που απορρέουν από τις ιδιότητες των πολυμερών ουσιών (φυσική και χημική αντοχή, ελαστικότητα, πλαστικότητα, δηλ. διαμόρφωση σε διάφορα σχήματα), η δυσχέρεια αποικοδόμησής τους στο φυσικό περιβάλλον έχει οδηγήσει στην αναζήτηση νέων πολυμερών υλών Μια σχετικά πρόσφατη επιδίωξη της βιοτεχνολογίας είναι η παραγωγή βιοαποδομήσιμων πολυμερών με στόχο την αντικατάσταση των πλαστικών που παράγονται από τη χημική βιομηχανία. 261

270 Η έρευνα για την παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών έχει εστιαστεί στη μικροβιακή παραγωγή πολυϋδροξυαλκανοϊκών οξέων (PHA) και κυρίως του πολυυδροξυ βουτυρικού (ΡΗΒ). Το PHB αποτελεί το σημαντικότερο εκπρόσωπο της ομάδας αυτής των βιοαποικοδομήσιμων και βιοσυμβατών πολυμερών. Πρόκειται για ένα σκληρό και άκαμπτο πολυμερές με πολύ υψηλή κρυσταλλικότητα και μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες με αυτές του πολυπροπυλενίου. Σήμερα πραγματοποιείται διεθνώς μια προσπάθεια, ώστε το PHB ή κάποιο συμπολυμερές του (π.χ. με πολυβαλερικό οξύ, PHV) να αντικαταστήσει το πολυπροπυλένιο σε πλήθος εφαρμογών, εισάγοντας στην καθημερινότητα σημαντικά οφέλη για το περιβάλλον και την ανθρώπινη υγεία Η δομική μονάδα των πολυϋδροξυαλκανοϊκών οξέων (PHA) To βακτήριο Rastonia eutropha συσσωρεύει σε ποσοστά 70-80% επί ξηρής βιομάζας πολυ-β-υδροξυβουτυρικό (ΡΗΒ). Μερικά μάλιστα στελέχη του R. eutropha βιοσυνθέτουν έναν πολυεστέρα αποτελούμενο από δομικές μονάδες 3- υδροξυβουτυρικού και 4-υδροξυβουτυρικού. Η αναλογία των δύο μονομερών στο μόριο του πολυμερούς εξαρτάται από τις συνθήκες καλλιέργειας του βακτηρίου (κυρίως από τη χρησιμοποιούμενη πηγή άνθρακα) και καθορίζει τις φυσικές ιδιότητες (π.χ. ελαστικότητα) του πολυμερούς. Το πολυμερές μετά την παραγωγή του εγκλωβίζεται στο εσωτερικό συσσωματωμάτων, που περιβάλλονται από μεμβράνη λιπιδικής και πρωτεϊνικής φύσης και περιέχουν μεγάλες ποσότητες μορίων του βιοπολυμερούς (μέχρι 80% του ξηρού βάρους των κυττάρων), χρησιμοποιείται δε από το κύτταρο ως αποθήκη ενέργειας και άνθρακα. Η σύνθεση και συσσώρευση του βιοπολυμερούς πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα κάτω από συνθήκες έλλειψης συγκεκριμένων θρεπτικών συστατικών (π.χ. άζωτο, φωσφόρος) (σχήμα 11.3). Από το σύνολο των βακτηρίων, άλγεων, μυκήτων κλπ. που δύνανται να παράγουν ενδοκυττάρια PHB, το βακτήριο Alcaligenes latus παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, αφού χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα μια φθηνή πρώτη ύλη (σακχαρόζη) και παράγει το πολυμερές με μεγάλη απόδοση κατά τη διάρκεια της 262

271 ανάπτυξής του. Για τη βιομηχανική παραγωγή του ΡΗΒ (εμπορική ονομασία BIOPOL) χρησιμοποιούνται ανασυνδυασμένα στελέχη του βακτηρίου Escherichia coli, τα οποία περιέχουν στο πλασμίδιό τους πολλαπλά αντίγραφα των γονιδίων που κωδικοποιούν το ΡΗΒ, προερχόμενα από στελέχη του βακτηρίου R. eutropha. Ανασυνδυασμένα στελέχη του Ε. coli συσσωρεύουν στο κύτταρό τους περισσότερο από 90% ΡΗΒ. Για τη μείωση του κόστους παραγωγής στο ανασυνδυασμένο Ε. coli εισάγεται ένα επιπλέον πλασμίδιο, το οποίο περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί τη λυσοζύμη του φάγου Τ7. Μετά το πέρας της συσσώρευσης του πολυμερούς στα βακτηριακά κύτταρα, αυτά επεξεργάζονται με EDTA, ουσία η οποία επιτρέπει στη λυσοζύμη να προσεγγίσει το κυτταρικό τοίχωμα και να προκαλέσει λύση του κυττάρου. Αυτό έχει ως συνέπεια την απελευθέρωση του πολυμερούς στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, από όπου ανακτάται εύκολα. Λιπαρά οξέα, αλκένια, σάκχαρα Σχήμα 11.3 Η βιοσύνθεση του PHBελέγχεται από οπερόνιο που κωδικεύει τα ένζυμα β κετοθειολάση, β-κετακυλ-coa-ρεδουκτάση και PHB συνθάση. Υπάρχουν 4 κατηγορίες βιοαποδομήσιμων πλαστικών, από τις οποίες οι 3 προέρχονται από ανανεώσιμες πηγές: Α) Τα πολυμερή από βιομάζα, όπως τα αγροπολυμερή. Β) Τα πολυμερή από μικροβιακή δράση. 263

272 Γ) Τα συμβατικά και συνθετικά πολυμερή, των οποίων τα μονομερή λαμβάνονται από αγροτικές καλλιέργειες. Δ) Τα πολυμερή, των οποίων τα μονομερή λαμβάνονται συμβατικά με χημική σύνθεση. Βιοδιάσπαση σε ένα συγκεκριμένο περιβάλλον για ένα πλαστικό σημαίνει πως το πλαστικό αυτό μπορεί να αποτελέσει υπόστρωμα μεταβολισμού για μικροοργανισμούς που ζουν στο περιβάλλον αυτό. Η βιοαποδόμηση των πλαστικών είναι αποδόμηση που γίνεται από τη δράση φυσικών μικροοργανισμών, όπως βακτήρια, μύκητες ή άλγη. Κατά τη βιοαποδόμηση παράγονται διοξείδιο του άνθρακα και/ή μεθάνιο. Αν γίνεται παρουσία οξυγόνου, συμβαίνει αερόβια αποικοδόμηση, ενώ χωρίς οξυγόνο λέγεται αναερόβια και παράγεται μεθάνιο, αντί διοξειδίου του άνθρακα. Η βιοαποδόμηση περιλαμβάνει ενζυμικές υδρολύσεις. Η ενζυμική αποδόμηση των βιοπλαστικών από μικροοργανισμούς μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: 1) Με ενδοκυττάρια αποδόμηση μέσω της δράσης (βακτηριακών) αποπολυμερασών, διαδικασία που γένεται με στόχο τη χρησιμοποίηση πολυμερούς ως πηγή άνθρακα 2) Με εξωκυττάρια αποδόμηση μέσω της δράσης εξωκυττάριων αποπολυμερασών, που εκκρίνουν πολλοί ευκαρυωτικοί και προκαρυωτικοί οργανισμοί σε αερόβιο περιβάλλον (Σχήμα 11.4). Και στις δύο περιπτώσεις η πολυμερική αλυσίδα διασπάται σε μικρότερα τμήματα. Τα ένζυμα μπορεί να είναι είτε ενδοένζυμα, που σπάζουν εσωτερικούς δεσμούς μέσα στην αλυσίδα, είτε εξωένζυμα που διασπούν τις τελικές μονάδες των μονομερών διαδοχικά. Τα ενδοένζυμα σπάζουν τους δεσμούς της αλυσίδας σε τυχαίες θέσεις κα αυτό συνεπάγεται την ταχεία μείωση του μοριακού βάρους. Η συνεχής διάσπαση των παραγόμενων θραυσμάτων οδηγεί σε λιγότερο άμεσες δραματικές αλλαγές στο μοριακό βάρος. Τα θραύσματα του πολυμερούς μπορεί να γίνουν τόσο μικρά, ώστε να μεταφερθούν στο εσωτερικό του κυττάρου, όπου η αποδόμηση συνεχίζεται ως την πλήρη διάσπαση. Αυτό μπορεί να γίνει από τον ίδιο οργανισμό που παρέχει τα εξωκυτταρικά ένζυμα για την αρχική θραυσματοποίηση ή από άλλους οργανισμούς. Περιβαλλοντικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την βιοαποδόμηση, όπως η θερμοκρασία, τα επίπεδα της υγρασίας, η ατμοσφαιρική πίεση, η πίεση του οξυγόνου, η συγκέντρωση οξέων και μετάλλων και ο βαθμός έκθεσης στο φως. Παράγοντες που σχετίζονται με του μικροοργανισμούς περιλαμβάνουν τη συγκέντρωσή τους, αν αυτοί έχουν ή όχι ένζυμα, τα οποία χρησιμοποιούν το πολυμερές ως υπόστρωμα, τη 264

273 συγκέντρωση των ενζύμων, την παρουσία θρεπτικών υλικών για τους μικροοργανισμούς και την παρουσία παρεμποδιστών ή ανταγωνιστών. Ακόμη, ο ρυθμός της βιοαποικοδόμησης εξαρτάται ιδιαίτερα από τη σύσταση του πολυμερούς, μιας και αυτό αποτελεί υπόστρωμα για τα ένζυμα. Η φύση των διακλαδώσεων στην ανθρακική αλυσίδα και η στερεοδιάταξη ενδιαφέρει ιδιαίτερα στους μηχανισμούς βιοαποικοδόμησης, επειδή τα ένζυμα είναι εκλεκτικά σε κάποιο ιδιαίτερο τύπο διακλαδισμένης αλυσίδας και στερεοδιάταξης. Σχήμα 11.4 Μικροβιακή αποδόμηση πολυμερών 11.5 Οργανικοί διαλύτες Παλαιότερα, η βιομηχανική παραγωγή αρκετών οργανικών διαλυτών γινόταν μέσω ζυμωτικών διεργασιών, όπως η βουτυρική ζύμωση. Σήμερα, οι διεργασίες αυτές έχουν σε μεγάλο βαθμό εγκαταλειφθεί, επειδή θεωρείται περισσότερο οικονομική διεργασία η χημική σύνθεση. Ακόμη και η αιθανόλη, η οποία παράγεται σε μεγάλες ποσότητες μέσω ζυμωτικών διεργασιών, για να χρησιμοποιηθεί ως καύσιμο ή στην ποτοποιία, παράγεται μέσω χημικής σύνθεσης, όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως οργανικός διαλύτης. Δεδομένου όμως ότι οι πολιτικές και οικονομικές συνθήκες 265

274 αλλάζουν με ταχείς ρυθμούς, είναι πιθανό να δούμε την επάνοδο των βιοτεχνολογικών διεργασιών στο προσκήνιο της παραγωγής οργανικών διαλυτών Πολυσακχαρίτες Μερικοί μικροοργανισμοί, καλλιεργούμενοι σε θρεπτικά υλικά με περιοριστικό για την αύξηση παράγοντα την πηγή αζώτου (ή άλλο θρεπτικό συστατικό), συνθέτουν μεγάλες ποσότητες πολυσακχαριτών. Συνήθως, οι μικροοργανσμοί βιοσυνθέτουν πολυσακχαρίτες, όταν η πηγή άνθρακα στο περιβάλλον της αύξησής τους είναι σε επάρκεια, ενώ τους χρησιμοποιούν για τις ανάγκες της αύξησης σε συνθήκες πενίας. Οι πολυσακχαρίτες χρησιμοποιούνται από το μικροβιακό κύτταρο και ως δομικές ύλες, ως υλικό πρόσφυσης σε επιφάνειες και ως μέσο ανάπτυξης συμβιωτικών σχέσεων με άλλους οργανισμούς. Ενισχύουν την προστασία των μικροοργανισμών απέναντι σε βακτηριοφάγους και πρωτόζωα και προσφέρουν προστασία έναντι τοξινών και άλλων τοξικών ουσιών. Οι μικροβιακοί πολυσακχαρίτες μπορεί να είναι ομοπολυσακχαρίτες, όταν στο μόριό τους συμμετέχει ως δομική μονάδα ένα και μοναδικό σάκχαρο, ή ετεροπολυσακχαρίτες, όταν στο μόριό τους συμμετέχουν ως δομικές μονάδες περισσότερα του ενός σάκχαρα. To βακτήριο Xanthomonas campestris βιοσυνθέτει τον πολυσακχαρίτη ξανθάνη, τον οποίο εκκρίνει στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Είναι ετεροπολυσακχαρίτης με δομικές ομάδες D-γλυκόζη, 6-ακετυλο-Ο-μαννόζη, D-γλυκουρονικό οξύ και 4,6-πυροσταφυλική-Ο-μαννόζη. Η ξανθάνη έχει ενδιαφέρουσες φυσικοχημικές ιδιότητες και παράγεται προς το παρόν σε ημι-βιομηχανική κλίμακα. To βακτήριο Leuconostocmes enteroides συνθέτει εξωκυτταρικά δεξτράνια. Η βιοσύνθεση των δεξτρανίων πραγματοποιείται εξ ολοκλήρου εξωκυτταρικά. Τα δεξτράνια είναι ομοπολυσακχαρίτες με δομική ομάδα τη D-γλυκοπυρανόζη. 266

275 Βρίσκουν εφαρμογές στην τεχνολογία τροφίμων και ως υποκατάστατα πλάσματος του αίματος. Άλλοι μικροβιακοί πολυσακχαρίτες είναι η σκληρογλυκάνη, που παράγεται από μύκητες του γένους Sclerotium, η πουλλουλάνη που παράγεται από τον πολυμορφικό μύκητα Aureobasidium puilulans και το αλγινικό οξύ, που παράγεται από το βακτήριο Azotobacter vinelandii. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται ορισμένα βασικά χαρακτηριστικά (δομή, εφαρμογές) των κυριοτέρων πολυσακχαριτών που παράγονται μικροβιακά. Δεξτράνη (μονομερή α-d-γλυκόζης συνδεόμενα με διάφορα είδη δεσμών (επικρατεί ο α-1,6-δεσμός) Μοριακό Βάρος: x10 7 Εφαρμογές: Ρύθμιση ιξώδους σε τρόφιμα (γλυκίσματα, είδη αρτοποιίας) Σταθεροποιητής (ποτά, παγωτά) Συντηρητικό (ξήρανση) Υλικό κατασκευής γαζών (απορρόφηση υγρών) Υποκατάστατο πλάσματος (μετά από υδρόλυση) Υλικό χρωματογραφίας (Sephadex) Ξανθάνη (κύρια αλυσίδα με β,1-4 δεσμούς ανάμεσα σε μόρια γλυκόζης με 267

276 διακλάδωση γλυκουρονικού και εστέρων της μαννόζης με οξικό και πυροσταφυλικό οξύ) Μοριακό Βάρος: 2x10 6-5x10 7 Εφαρμογές: Ρύθμιση ιξώδους σε τρόφιμα και καλλυντικά Σταθεροποιητής / γαλακτωματοποιητής, Βελτιωτικό στην τεχνολογία τροφίμων και στην τεχνολογία εξόρυξης πετρελαίου για αύξηση των αποδόσεων. Πολλουλάνη Επαναλαμβανόμενη δομική μονάδα η μαλτοτρική τετραόζη συνδεόμενη με β-1,6-δεσμό. Μοριακό Βάρος.: Εφαρμογές: Ρύθμιση ιξώδους και σταθεροποίηση τροφίμων, καλλυντικών Παραγωγή μη διαπερατών από το Ο2 φίλμ Πρόσθετο διαιτητικών τροφίμων Αλγινικό οξύ Είναι ένας γραμμικός πολυσακχαρίτης που παράγεται από καφέ φύκη (συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος) Αποτελείται από (1-4)-συνδεδεμένα μόρια β-d-μαννουρονικού και α-l-γουλουρονικού Εφαρμογές: Έχει την ιδιότητα να προσροφά φορές το βάρος του σε νερό Πρόσθετο ως αφυδατικό σε διάφορες διεργασίες-εφαρμογή στη βιομηχανία χαρτιού και στην υφαντουργία. Χρήση ως βελτιωτικό στη βιομηχανία τροφίμων Χρησιμοποιείται ως πηκτικός παράγοντας και γαλακτωματοποιητής. Υλικό ακινητοποίησης βιομορίων και κυττάρων. 268

277 11.8 Παραγωγή Φαρμακευτικών Προϊόντων Ένα μεγάλο μέρος των φαρμακευτικών προϊόντων (αντιβιοτικών, στεροειδών, βιταμινών, εμβολίων) παράγεται από μικροοργανισμούς ή μέσω ενζυμικά καταλυόμενων διεργασιών. Ο τζίρος από την εμπορία μόνο των αντιβιοτικών στην παγκόσμια αγορά πλησιάζει τα 10 δισεκατομμύρια δολάρια ετησίως. Ο ρόλος της ενζυμικής και μικροβιακής τεχνολογίας στη διαμόρφωση του κόστους παραγωγής και κατά συνέπεια στην τελική τιμή των φαρμάκων είναι σημαντικός. Στη συνέχεια αναπτύσσονται ορισμένα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της βιοτεχνολογικής παραγωγής φαρμακευτικών προϊόντων. Στα σχήματα που ακολουθούν συνοψίζονται τα στάδια ανάπτυξης και παραγωγής νέων φαρμάκων. Tα βασικά στάδια στην ανάπτυξη νέων υποψήφιων φαρμάκων 269

278 Διαδικασία παραγωγής νέων φαρμάκων Αντιβιοτικά Από τις εκατοντάδες γνωστές αντιβιοτικές ουσίες, τις οποίες συνθέτουν οι μικροοργανισμοί στη φύση, λίγες μόνο παράγονται βιομηχανικά. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία είναι στις περισσότερες των περιπτώσεων ακτινομύκητες του γένους Streptomyces και μύκητες του γένους Penicillium. Σπανιότερα χρησιμοποιούνται βακτήρια του γένους Bacillus, μύκητες του γένους Aspergillus ή άλλοι μικροοργανισμοί. Η βιομηχανική παρασκευή των περισσοτέρων αντιβιοτικών επιτυγχάνεται μέσω μικροβιακών ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρες υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Η πλειοψηφία όμως των αντιβιοτικών υπόκειται σε τροποποίηση της δομής τους τόσο με χημικές, όσο και με ενζυμικές μεθόδους. Σήμερα, η πλειοψηφία των αντιβιοτικών αφορά στις ημισυνθετικές μορφές της πενικιλίνης και της κεφαλοσπορίνης. 270

279 Πενικιλίνη G Οι πενικιλίνες ανήκουν σε μια από τις σπουδαιότερες ομάδες αντιβιοτικών, την ομάδα της β-λακτάμης (Σχήμα 11.5). Στην ομάδα αυτή ανήκουν, επίσης, οι κεφαλοσπορίνες. Η δράση των αντιβιοτικών αυτών οφείλεται στην ικανότητά τους να παρεμποδίζουν τη σύνθεση των κυτταρικών τοιχωμάτων των μικροοργανισμών σχηματίζοντας ισχυρούς δεσμούς με τις βακτηριακές τρανσπεπτιδάσες, ένζυμακλειδιά στη βιοσύνθεση των κυτταρικών τοιχωμάτων των βακτηρίων. Οι τρανσπεπτιδάσες είναι γνωστές ως penicillin binding proteins (PBPs). Σχήμα 11.5 Δομή μορίων της πενικιλίνης G. To 6-αμινο-πενικιλινικό οξύ, το οποίο περιλαμβάνει ένα δακτύλιο β-λακτάμης, συνιστά τη βασική δομή των πενικιλινών. Στη βιομηχανία χρησιμοποιείται συχνά για την παραγωγή της πενικιλίνης G ο μύκητας Penicillium chrysogenum. Η σύνθεση του αντιβιοτικού δεν συνδέεται με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και για τον λόγο αυτό, η διαδικασία που ακολουθείται είναι, αρχικά, η ανάπτυξη του μικροοργανισμού μέσω μίας διεργασίας διαλείποντος έργου (batch process) και στη συνέχεια, η εφαρμογή μίας διεργασίας ημιδιαλείποντος έργου (fed-batch process), η οποία επάγει την παραγωγή του αντιβιοτικού. Η παραγωγή γίνεται σε βιοαντιδραστήρες μεγάλου όγκου (έως L), οι οποίοι εμβολιάζονται με την κατάλληλη ποσότητα εμβολίου, παραγόμενη μετά από διαδοχικές προκαλλιέργειες του μύκητα σε βιοαντιδραστήρες μικρότερου όγκου. To θρεπτικό υλικό περιέχει 100 gr/1 γλυκόζη (μελάσα), gr/1 παραπροϊόντα της βιομηχανίας παραγωγής αμύλου, 5-8 gr/1 φαινυλοξικό οξύ, ως πρόδρομο ουσία 271

280 βιοσύνθεσης του πλευρικού βενζολικού δακτυλίου του μορίου της πενικιλίνης G, και 5 g/l φυτικό έλαιο. Τα θρεπτικά συστατικά προσθέτονται στο βιοαντιδραστήρα σταδιακά, γιατί έχει βρεθεί ότι έτσι λαμβάνονται αυξημένες αποδόσεις σε αντιβιοτικό. Η καλλιέργεια πραγματοποιείται υπό αερόβιες συνθήκες σε θερμοκρασία C και pη 6. Η ζύμωση διαρκεί 7-10 ημέρες αναλόγως του όγκου του βιοαντιδραστήρα. Η βιοσύνθεση πενικιλίνης είναι δευτερογενής μεταβολική διεργασία. Τις 1-2 πρώτες ημέρες της ζύμωσης παρατηρείται ταχεία αύξηση της μυκηλιακής μάζας (trophophase) με ταυτόχρονη κατανάλωση της πηγής άνθρακα. Η βιοσύνθεση του αντιβιοτικού επάγεται σε συνθήκες πενίας άνθρακα, αρχίζει δηλ. ουσιαστικά μετά το πέρας της μικροβιακής αύξησης (idiophase). Σχήμα 11.6 Τυπικό διάγραμμα παραγωγής πενικιλίνης G από το μύκητα Penicillium chrysogenum. Διακρίνεται η φάση της αύξησης της μυκηλιακής μάζας και η φάση βιοσύνθεσης του αντιβιοτικού. Μετά το πέρας της ζύμωσης, η βιομάζα του μύκητα διαχωρίζεται με διήθηση και χρησιμοποιείται στη διατροφή των ζώων, το δε αντιβιοτικό εκχυλίζεται από το διήθημα με οργανικούς διαλύτες. Στη συνέχεια, διαλύεται σε νερό, από όπου παραλαμβάνεται σε κρυσταλλική μορφή ως άλας καλίου ή νατρίου. Από το μόριο της πενικιλίνης G παρασκευάζεται με ενζυμική ή χημική υδρόλυση το 6-αμινο-πενικιλινικό οξύ 6-ΑPA, στο οποίο προστίθενται διάφορες πλευρικές ομάδες (Σχήμα 11.7). Τα προϊόντα που προκύπτουν έχουν νέο φάσμα δράσης και μεγαλύτερη διάρκεια δράσης από την αρχική ένωση. 272

281 Σχήμα 11.7 Ενζυμικάκαταλυόμενη υδρόλυση από ακυλάση της πενικιλλίνης Τα μαθηματικά μοντέλα σχετικά με την παραγωγή του αντιβιοτικού περιλαμβάνουν διάφορες μεταβλητές δεδομένων (input variables), για παράδειγμα συγκέντρωση υποστρώματος, ph, θερμοκρασία κ.ά., οι οποίες συσχετίζονται με διάφορες μεταβλητές εξόδου (output variables), όπως για παράδειγμα τη βιομάζα, την παραγόμενη συγκέντρωση της πενικιλίνης, κ.ά. Τα μοντέλα αυτά είναι ιδιαίτερα σημαντικά, καθώς συμβάλλουν στην κατανόηση της επίδρασης των διαφόρων παραμέτρων (μεταβλητών), στον αποτελεσματικό έλεγχο, καθώς και στη βελτιστοποίηση της διεργασίας παραγωγής της πενικιλίνης. Τα μαθηματικά μοντέλα μπορούν να διακριθούν σε δύο κύριες κατηγορίες, τα δομημένα και τα μη-δομημένα μοντέλα. Τα δομημένα μοντέλα λαμβάνουν υπόψη την επίδραση της φυσιολογίας και διαφοροποίησης των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Αντίθετα, στα μη δομημένα μοντέλα, όλες οι πληροφορίες σχετικά με τη φυσιολογία των κυττάρων αποδίδονται μέσω μίας μοναδικής παραμέτρου, της βιομάζας, με αποτέλεσμα το μοντέλο να απλοποιείται σημαντικά. Κεφαλοσπορίνη C Παρόμοια τεχνολογία με αυτή της παραγωγής πενικιλίνης G χρησιμοποιείται και για την παραγωγή κεφαλοσπορίνης C από το μύκητα Cephalosporium acremonium. Η παραγωγή κεφαλοσπορινών αναπτύχθηκε ως εναλλακτική λύση στα αλλεργικά συμπτώματα της πενικιλλίνης και υιοθετήθηκε λόγω και της μεγαλύτερης ανθεκτικότητας έναντι των λακταμασών (Σχήμα 11.8). Η κεφαλοσπορίνη C δεν είναι αρκετά δραστική ουσία για να χρησιμοποιηθεί ως έχει στη θεραπευτική. Για το λόγο αυτό, μετά την παραγωγή της ακολουθεί χημική επεξεργασία, κατά την οποία αποκόπτεται η πλευρική αλυσίδα και παραλαμβάνεται το 7-α-αμινο-κεφαλοσπορανικό οξύ, στο οποίο προστίθενται 273

282 διάφορες πλευρικές ομάδες. Οι ουσίες που προκύπτουν έχουν αυξημένη δραστικότητα σε ευρύ φάσμα παθογόνων βακτηρίων. Σήμερα παράγονται οι λεγόμενες κεφαλοσπορίνες τρίτης γενιάς, όπως η μοξαλακτάμη, οι οποίες είναι δραστικές κατά βακτηρίων, που αποδομούν ενζυμικά τις πενικιλίνες και τις προγενέστερες κεφαλοσπορίνες. Σχήμα 11.8 Δομή του μορίου της κεφαλοσπορίνης C. To 7-α-αμινο-κεφα\οσπορανικό οξύ (7-ACA), το οποίο περιλαμβάνει ένα δακτύλιο β-λακτάμης, συνιστά τη βασική δομή των κεφαλοσπορινών. 274

283 Σχήμα 11.9 Παραγωγή του 7-ΑCA. Ε1=οξειδάση D-αμινοξέων, E2- γλουταρυλοαμιδάση Άλλα αντιβιοτικά Η στρεπτομυκίνη και η τετρακυκλίνη είναι ισχυρά αντιβιοτικά, τα οποία παράγονται από ακτινομύκητες και δρουν ως παρεμποδιστές της πρωτεϊνο-σύνθεσης μέσω πρόσδεσης στη ριβοσωμική μονάδα 30S στα βακτηριακά κύτταρα. Τετρακυκλίνη Στρεπτομυκίνη 275

284 Αντιβιοτικά μακροκυκλικών δακτυλίων (ερυθρομυκίνη, νυστατίνη) Στεροειδή Ορισμένοι μικροοργανισμοί είναι ικανοί να τροποποιούν τη δομή των στεροειδών ενώσεων, ιδιότητα με βιομηχανικό ενδιαφέρον. Oι στεροειδείς ορμόνες κατέχουν εξέχουσα θέση στη ρύθμιση του μεταβολισμού των ζώων και του ανθρώπου. Οι κορτιζόνες, για παράδειγμα, μετριάζουν τα συμπτώματα πολλών αλλεργιών και της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Άλλες στεροειδείς ορμόνες ρυθμίζουν τη σεξουαλικότητα και τον αναπαραγωγικό κύκλο στον άνθρωπο. Oι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την τροποποίηση στεροειδών ενώσεων είναι ικανοί να προκαλούν εξειδικευμένες υδροξυλιώσεις, υδρογονώσεις, αφυδρογονώσεις και εποξειδώσεις επί των στεροειδών δακτυλίων, καθώς επίσης και μεταφορές ομάδων από και προς διάφορες πλευρικές θέσεις των στεροειδών δακτυλίων. Τα προϊόντα που παράγονται χρησιμοποιούνται ως έχουν στη φαρμακευτική ή, συνηθέστερα, επεξεργάζονται περαιτέρω. Οι βιομετατροπές των στεροειδών περιλαμβάνουν εξειδικευμένες αντιδράσεις, οι οποίες πραγματοποιούνται από συγκεκριμένα στελέχη μυκήτων. Κατ' αρχήν, πραγματοποιείται καλλιέργεια του μύκητα σε βιοαντιδραστήρα σε κατάλληλες συνθήκες αερισμού, θερμοκρασίας κ.λπ. Μετά το πέρας της αύξησης, προστίθεται στο βιοαντιδραστήρα το πρόδρομο στεροειδές στην κατάλληλη συγκέντρωση. Η 276

285 αντίδραση βιομετατροπής είναι σχετικά γρήγορη και διαρκεί 1-2 ημέρες. Μετά το πέρας της αντίδρασης, το προϊόν εκχυλίζεται από το διήθημα της καλλιέργειας με κάποιον οργανικό διαλύτη, καθαρίζεται χρωματογραφικά και ανακτάται σε κρυσταλλική μορφή. Σχήμα Μικροβιακή υδροξυλίωση της προγεστερόνης από Rhizopus arrhizus Ανθρώπινες και θεραπευτικές πρωτεΐνες Οι θεραπευτικές πρωτεΐνες που παράγονται βιοτεχνολογικά περιλαμβάνουν πρωτεΐνες, παράγοντες ανάπτυξης, αντισώματα και ένζυμα, που χρησιμοποιούνται ως ενεργά συστατικά φαρμακευτικών σκευασμάτων. Σήμερα πάνω από 60 ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται στη θεραπεία, ενώ πάνω από 200 είναι στη φάση της ανάπτυξης. Στους πίνακες 11.2 και 11.3 παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγματα πρωτεϊνών (ενζύμων), που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία διαφόρων παθήσεων, καθώς και επιλεγμένα βιοφαρμακευτικά προϊόντα. Ανθρώπινες πρωτεΐνες σε εμπορική κλίμακα μπορούν να παραχθούν από τα ανασυνδυασμένα βακτήρια, καλλιεργούμενα σε βιοαντιδραστήρες μεγάλου όγκου. Σήμερα παράγονται βιομηχανικά από βακτήρια ή άλλα ανασυνδυασμένα κύτταρα πολλές πρωτεΐνες, όπως η ινσουλίνη, η αυξητική ορμόνη, οι ιντερφερόνες α, β και γ, η ιντερλευκίνη-2 κ.ά., οι οποίες βρίσκουν πολλές εφαρμογές στη θεραπευτική ιατρική. 277

286 Πίνακας 11.2 Περιπτώσεις ενζύμων με εφαρμογή στη διάγνωση. Ένζυμο Πηγή Προσδιορισμός Οξειδάση της Nocardia erythropolis ή Χολεστερόλη χολεστερόλης Brevibacterium sp. Κρεατινάση Pseudomonas sp. Κρεατίνη, κρεατινίνη β-γαλακτοζιδάση Εscherichia coli Ιόντα νατρίου, εφαρμογή σε ανοσοπροσδιορισμούς Οξειδάση της γλυκόζης Aspergillus niger Γλυκόζη α-γλυκοζιδάση Ζύμη ή Bacillus sp. Δραστικότητα α-αμυλάσης Εξοκινάση Ζύμη Γλυκόζη και άλλες εξόζες Ουρεάση Klebsiella aerogenes Oυρία Οξειδάση της 2- φωσφορικής γλυκερόλης Aeroccus viridans Τριακυλογλυκερόλες Η πρώτη ανθρώπινη πρωτεΐνη, η ινσουλίνη από γενετικά τροποποιημένα κύτταρα του βακτηρίου E. coli, παρήχθη το Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, που κωδικοποιούν τη βιοσύνθεση των πεπτιδικών αλυσίδων A και Β του μορίου της ινσουλίνης, εισάγονται σε δύο πλασμίδια (pbr322), τα οποία μεταφέρονται σε διαφορετικά κύτταρα του βακτηρίου το καθένα. Τα βακτήρια αυτά καλλιεργούμενα παράγουν πολυ-πεπτίδια, τα οποία περιέχουν τα πεπτίδια A ή Β της ινσουλίνης και επιπλέον την πρωτεΐνη β-γαλακτοσιδάση, η οποία κωδικοποιείται από γονίδιο του πλασμιδίου-φορέα. Τα παραγόμενα πολυπεπτίδια καθαρίζονται και στη συνέχεια επεξεργάζονται με βρωμίδιο του κυανίου, με σκοπό την απομάκρυνση του μορίου της β-γαλακτοζιδάσης. Τέλος, παράγεται η ινσουλίνη από ενζυμική συνένωση των πεπτιδικών αλυσίδων A και Β. 278

287 Πίνακας 11.3 Πωλήσεις βιοφαρμακευτικών προϊόντων το 2015 (εκτίμηση). ΠΡΟΪΟΝ ΕΝΔΕΙΞΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΠΩΛΗΣΕΙΣ (εκ US$) Aranesp & Epogen, Aναιμία ΑΜGEN >5000 (Ερυθροποιητίνη) Neulasta & Aναιμία ΑΜGEN >4000 Neupogen, (Ερυθροποιητίνη) Procrit/Eprix (Ερυθροποιητίνη) Aναιμία Johnson & Johnson >6000 Avonex (Iντερφερόνη-β) Σκλήρυνση κατά πλάκας Βiogen >2000 Rituxan Herceptin (Μονοκλωνικά αντισώματα) Humulin Humalog (Ινσουλίνη) Λέμφωμα Καρκίνος του στήθους Genentech >1000 Διαβήτης Lilly >2000 Η ινσουλίνη μπορεί να παραχθεί και από γενετικά τροποποιημένα κύτταρα του βακτηρίου Ε. coli, στα οποία έχει μεταφερθεί το πλασμίδιο pbr322, που περιέχει γονίδιο (c-dna) που κωδικοποιεί τη βιοσύνθεση της προ-ινσουλίνης (Σχήμα 11.12). Η προ-ινσουλίνη έχει ακριβώς την ίδια σύσταση με την ινσουλίνη, δεν έχει όμως την ίδια διαμόρφωση και συνεπώς στερείται δραστικότητας. To cdna παράγεται με τη μέθοδο της ανάστροφης μεταγραφής (reverse transcription) από το mrna της προινσουλίνης, το οποίο απομονώνεται από παγκρεατικά κύτταρα ανθρώπου. Τα τροποποιημένα βακτήρια παράγουν ανθρώπινη προ-ινσουλίνη, η οποία καθαρίζεται και στη συνέχεια επεξεργάζεται με βρωμίδιο του κυανίου. Η προ-ινσουλίνη μετατρέπεται σε ινσουλίνη μετά από ενζυμική υδρόλυση και απομάκρυνση του συνδετικού πεπτιδίου, με αποτέλεσμα το μόριο της να αλλάζει διαμόρφωση στο χώρο και να αποκτήσει δραστικότητα (Σχήμα 11.13). 279

288 Σχήμα Σύνθεση προϊνσουλίνης σε βακτήρια μέσω της κλωνοποίησης cdna Σχήμα Μεταφορά γονιδίoυ προϊνσουλίνης σε E. coli, παραγωγή της προϊνσουλίνης και ενζυμική της υδρόλυση προς την παρασκευή της ινσουλίνης 280

289 Παραγωγή Βιταμινών και Αμινοξέων Βιταμίνες Οι βιταμίνες χρησιμοποιούνται ως πρόσθετα τροφίμων ή στη φαρμακευτική. Μερικές βιταμίνες παράγονται σε βιομηχανική κλίμακα από μικροοργανισμούς. Η βιταμίνη Β12 (κοβαλαμίνη) παράγεται από ακτινομύκητες του γένους Streptomyces ως παραπροϊόν της παραγωγής αντιβιοτικών. Καθώς στη δομή της βιταμίνης Β12 συμμετέχει το κοβάλτιο, το θρεπτικό υλικό θα πρέπει να περιέχει κάποιο άλας κοβαλτίου ως πρόδρομη ουσία βιοσύνθεσης της βιταμίνης. Επιπροσθέτως, η βιταμίνη Β12 παράγεται ως κύριο προϊόν ζύμωσης από καλλιέργειες προπιονικών βακτηρίων (π.χ. Propionibacterium shermanii) που αναπτύσσονται, αρχικά, σε αναερόβιες συνθήκες για διάστημα 3 ημερών. Στη συνέχεια, οι συνθήκες καθίστανται αερόβιες με διοχέτευση αέρα στην καλλιέργεια, η οποία διαρκεί 4 επιπλέον ημέρες. To θρεπτικό υλικό περιέχει υποπροϊόντα της βιομηχανίας του αμύλου, γλυκόζη και άλατα κοβαλτίου. Η βιταμίνη Β2 (ριβοφλαβίνη) παράγεται ως παραπροϊόν της ζύμωσης παραγωγής οργανικών διαλυτών (ακετόνης, βουτανόλης) από διάφορα είδη του γένους Clostridium. Η βιταμίνη Β2 παράγεται ως κύριο προϊόν ζύμωσης από καλλιέργειες των ασκομυκήτων Eremothecium ashbyi και Ashbyagos sypii σε θρεπτικά υλικά με πηγή άνθρακα γλυκόζη και αραβοσιτέλαιο. Οι καλλιέργειες πραγματοποιούνται σε θερμοκρασία C, pη 6,0-7,5 και διαρκούν 5 ημέρες. Γενικότερα, πολλές βιταμίνες μπορούν να παραχθούν από μικροοργανισμούς αλλά οι αποδόσεις τους είναι μικρές, γεγονός που καθιστά τη βιομηχανική παραγωγή οικονομικά ασύμφορη. Αμινοξέα Τα αμινοξέα βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων, ενώ χρησιμοποιούνται και ως ενδιάμεσα μόρια στην παρασκευή οπτικά ενεργών ενώσεων με φαρμακευτική δράση. Η παραγωγή αμινοξέων με κλασσική χημική σύνθεση οδηγεί στην παραγωγή ρακεμικού μείγματος D και L ισομερών. Η ανενεργός D μορφή απομακρύνεται μετά από επιπλέον στάδια καθαρισμού, που έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση του κόστους παραγωγής. Αντίθετα, η εφαρμογή βιοκαταλυτών (ενζύμων ή μικροοργανισμών) οδηγεί στην παραγωγή αποκλειστικά L ισομερών (Πίνακας 11.4, Σχήμα 11.14). Η βιοσύνθεση των αμινοξέων ελέγχεται από ρυθμιστικούς μηχανισμούς, για την αντιμετώπιση των οποίων απαραίτητη είναι η 281

290 γενετική τροποποίηση στελεχών, τα οποία δεν διαθέτουν μηχανισμούς ελέγχου, ενώ εκκρίνουν τα παραγώμενα αμινοξέα στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Παράλληλα, έχουν αναπτυχθεί και άλλες βιοκαταλυτικές μέθοδοι, που βασίζονται στην εφαρμογή ολόκληρων κυττάρων ή και απομονωμένων ενζύμων. Πίνακας 11.4 Βιοτεχνολογική παραγωγή αμινοξέων Σχήμα Βιοσύνθεση αμινοξέων 282

291 Η παραγωγή του L-Asp βασίζεται στη μετατροπή του φουμαρικού αμμωνίου σε L-Asp, η οποία καταλύεται από ακινητοποιημένα κύτταρα από E. coli με δράση αμμωνιολυάσης του Asp σε βιοαντιδραστήρα στήλης, σύμφωνα με την αντίδραση του σχήματος Εναλλακτικά, η διαδικασία μπορεί να καταλυθεί αποτελεσματικά από απομονωμένο ένζυμο, το οποίο πρώτα έχει ακινητοποιηθεί σε φυσικό πολυσακχαρίτη (όπως η κ-καρραγενάνη). COOH CH CH COOH + NH3 Aμμωνιολυάση του L-Asp COOH CH 2 CHNH 2 COOH φουμαρικό L-ασπαραγινικό Σχήμα Βιοκαταλυόμενη σύνθεση L-ασπαραγινικού Μια από τις πλέον σημαντικές ενζυμικές μεθόδους, που εφαρμόζεται ήδη από τα μέσα της δεκαετίας του 1970 στην παραγωγή οπτικά ενεργών αμινοξέων, αφορά στην εφαρμογή του ενζύμου αμινοακυλάση ή ακυλάση L-αμινοξέων από το μύκητα Aspergillus oryzae, το οποίο υδρολύει εκλεκτικά το L-ισομερές ρακεμικού μίγματος ακέτυλο-d,l-αμινοξέων (βλ. σχήμα 11.17). Η διεργασία πραγματοποιείται σε βιοαντιδραστήρα στήλης, όπου το ένζυμο βρίσκεται ακινητοποιημένο σε ανιοντοανταλλάκτη DEAE-Sephadex. R HC COOH HN CO CH 3 + H2 O ακινητοποιημένη αμινοακυλάση από A. oryzae H COOH C + R NH 2 H NHCOCH 3 C R COOH Aκετυλο-D,L-αμινοξύ L-αμινοξύ Aκετυλο-D-αμινοξύ ρακεμοποίηση Σχήμα Ενζυμική υδρόλυση ρακεμικού μίγματος ακετυλο-d,l-αμινοξέων. 283

292 11.9 Βιομετατροπές με εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων Στη συνέχεια θα παρουσιαστούν χαρακτηριστικά παραδείγματα που σχετίζονται με βιομετατροπές, που βρίσκουν εφαρμογή στη βιομηχανία τροφίμων. Παραγωγή φρουκτόζης H βιομηχανική μετατροπή της γλυκόζης σε φρουκτόζη έχει μεγάλο ενδιαφέρον, καθώς η γλυκόζη έχει μόνο το 65% της γλυκαντικής ικανότητας της σακχαρόζης (κοινή ζάχαρη), σε αντίθεση με τη φρουκτόζη που το ποσοστό αυτό είναι σχεδόν το διπλάσιο. Η μετατροπή της γλυκόζης σε φρουκτόζη επιτυγχάνεται ενζυμικά παρουσία της ισομεράσης της γλυκόζης ή ακριβέστερα της κετοϊσομεράσης της ξυλόζης. Το ενδοκυτταρικό αυτό ένζυμο προέρχεται κυρίως από τους μικροοργανισμούς Streptomyces, Bacillus και Arthrobacter, με κύριο χαρακτηριστικό το γεγονός ότι η βέλτιστη δράση του εκφράζεται παρουσία κατιόντων μαγνησίου. Το ενζυμικό παρασκεύασμα που χρησιμοποιείται σε βιομηχανική κλίμακα είναι είτε ακινητοποιημένο ένζυμο (μερικώς καθαρισμένο), είτε ακινητοποιημένα κύτταρα του μικροοργανισμού. Παραγωγή ασπαρτάμης Η ασπαρτάμη (α-μεθυλεστέρας του διπεπτιδίου L-ασπαραγινυλο-Lφαινυλαλανίνη) αποτελεί σημαντικό γλυκαντικό χαμηλής θερμιδικής αξίας, που βρίσκει εφαρμογή σε πολλά προϊόντα (π.χ. αναψυκτικά τύπου light ) με παραγωγή χιλιάδων τόνων ετησίως. Η χημική μέθοδος για τη σύνθεση της ασπαρτάμης συνοδεύεται από δύο κυρίως μειονεκτήματα, τα οποία σχετίζονται α) με τον παράλληλο σχηματισμό του β-ισομερούς, το οποίο χαρακτηρίζεται από πικρή γεύση και το οποίο θα πρέπει να διαχωριστεί από το κυρίως προϊόν και β) με το γεγονός ότι μόνο υψηλού κόστους L-αμινοξέα είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν και όχι ρακεμικά μίγματα αυτών που είναι σαφώς φθηνότερα. Σε αντίθεση με τη χημική διαδικασία, η εφαρμογή της τεχνολογίας της ενζυμικής κατάλυσης, χρησιμοποιώντας ως ένζυμο την πρωτεάση θερμολυσίνη, δεν συνοδεύεται από τα παραπάνω μειονεκτήματα, καθώς το ένζυμο εμφανίζει χαρακτηριστική τοπο- και στερεοεξειδίκευση, καθώς ο βιοκαταλύτης αναγνωρίζει συγκεκριμένα μόνο τον L οπτικό αντίποδα (βλ. σχήμα 11.18). Η διεργασία σε βιομηχανική κλίμακα γίνεται σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου (βλ. κεφ. 10) παρουσία ελεύθερης θερμολυσίνης, όπου το παραγόμενο διπεπτίδιο απομακρύνεται 284

293 ως ίζημα, γεγονός που οδηγεί την αντίδραση προς την κατεύθυνση της σύνθεσης. O D-οπτικός αντίποδας του μεθυλεστέρα της φαινυλαλανίνης ρακεμοποιείται και ανακυκλώνεται στην παραπάνω διεργασία. Τελευταία, έχει αναπτυχθεί η διεργασία σε βιοαντιδραστήρα στήλης, όπου το ένζυμο βρίσκεται ακινητοποιημένο σε στερεό φορέα. HOOC COOH H 2 C C ZHN H N-βενζυλοξυ-L-Asp + θερμολυσίνη CH 2 CH COOCH 3 αποπροστασία αμινομάδας CH 2 HOOC H 2 C C H 2 N C NH CO H COOH H NH 2 Μεθυλεστρέρας της D,L-Phe Ασπαρτάμη Σχήμα Ενζυμική παρασκευή ασπαρτάμης. Παραγωγή κυκλοδεξτρινών Oι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες κρυσταλλικής μορφής αποτελούμενοι από μόρια D-γλυκόζης συνδεδεμένα με α-1,4 γλυκοζιδικούς δεσμούς. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι δομές με έξι, επτά και οκτώ μόρια γλυκόζης, οι οποίες ονομάζονται α-β- και γ-κυκλοδεξτρίνες, αντίστοιχα. Οι διαστάσεις του εσωτερικού των κυκλικών αυτών δομών είναι τέτοιες (μήκος 7 Å και διάμετρος Å), ώστε να καθίσταται εφικτή η υποδοχή ορισμένου μεγέθους χημικών ομάδων ή ενώσεων. Τα μόρια αυτά βρίσουν εφαρμογή τόσο στη βιομηχανία τροφίμων, όπως για την προστασία πρόσθετων ενώσεων που προσδίδουν άρωμα, όσο και ως ενεργά συστατικά χειρόμορφων στατικών φάσεων, που χρησιμοποιούνται στην αέρια χρωματογραφία. Η βιομηχανική παραγωγή τους σήμερα επιτυγχάνεται μέσω της μετατροπής του αμύλου σε κυκλοδεξτρίνες. Η διεργασία καταλύεται από το ένζυμο κυκλοδεξτρινο-γλυκοζυλoτρανσφεράση από Escherichia coli ή Bacillus subtilis. 285

294 Τροποποίηση λιπών και ελαίων Από τις αρχές της δεκαετίας του 1970 ξεκίνησαν οι πρώτες προσπάθειες για την εφαρμογή των λιπασών στην ενζυμική τροποποίηση των φυσικών τους υποστρωμάτων, των τριγλυκεριδίων. Η διαπίστωση ότι τα ένζυμα είναι δυνατό να δρουν και σε άνυδρα συστήματα (βλ. παράγραφο 9.2), επέτρεψε τη χρήση εξειδικευμένων λιπασών, όπως είναι οι 1,3-τοποεκλεκτικές λιπάσες, για την τροποποίηση λιπών και ελαίων μέσω αντιδράσεων διεστερεοποίησης. Αποτέλεσμα ήταν η σύνθεση νέων τριγλυκεριδίων με ιδιότητες, όπως αυτές του βουτύρου του κακάο (cocoabutter), καθώς και προϊόντων υψηλής διατροφικής αξίας. Το βούτυρο του κακάο αποτελείται κυρίως από τριγλυκερίδια με δύο ακόρεστα λιπαρά οξέα (κυρίως παλμιτικό C16 και στεατικό C18) στις θέσεις C-1 και C-3 και ένα μονοακόρεστο λιπαρό οξύ, όπως το ελαϊκό (C18:1) στη θέση C-2. Οι χαρακτηριστικές του ιδιότητες (σημείο τήξης ο C) το καθιστούν σημαντικό προϊόν, καθώς είναι σε στερεά μορφή σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, ενώ τήκεται στη θερμοκρασία σώματος. Σήμερα, η βιομηχανική παραγωγή του επιτυγχάνεται με τη χρήση 1,3-ειδικευμένων λιπασών (όπως από τον μύκητα Μucor miehei), που καταλύουν την αντικατάσταση του παλμιτικού οξέος με στεατικό στις θέσεις C-1 και C-3 μέσω αντιδράσεων μετεστεροποίησης σε εξάνιο (βλ. σχήμα 11.19). Χαρακτηριστικό παράδειγμα ενζυμικής τροποποίησης τριγλυκεριδίων για την παρασκευή προϊόντος υψηλής διατροφικής αξίας αποτελεί η παρασκευή του τριγλυκεριδίου 2-παλμιτο-1,3-δι-ελαϋλο τριγλυκερίδιο, του οποίου τα λιπαρά οξέα είναι το ελαϊκό οξύ (C18:1) και το παλμιτικό οξύ (C16) και το οποίο αποτελεί πρόσθετο στο γάλα πρόωρων νεογνών, καθώς περιέχεται στο ανθρώπινο γάλα και πέπτεται εύκολα. Η παρασκευή του βασίζεται στην ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση μετεστεροποίησης της τριπαλμιτίνης (PPP) με ελαϊκό οξύ (Ο) που καταλύει η 1,3- ειδικευμένη λιπάση του μύκητα Μucor miehei σε μη υδατοσυμβατά συστήματα. OC 16:0 OC 18:1 OC 16:0 + 3 C 18:0 1,3-ειδικευμένη λιπάση εξάνιο OC 16:0 OC 18:1 OC 18:0 OC 18:0 + OC 18:1 + OC 18:0 3 C 16:0 κλάσμα φοινικέλαιου 1,3-διπαλμιτο-2-ελαϊκό τριγλυκερίδιο υποκατάστατο βουτύρο του κακάου 286 Σχήμα Σύνθεση υποκατάστατου του βουτύρου του κακάο μέσω ενζυμικής μετεστεροποίησης που καταλύει μια 1,3-ειδικευμένη λιπάση σε εξάνιο.

295 Παραγωγή Γαλακτοματοποιητών-Επιφανειοενεργών ενώσεων Με τον όρο επιφανειοενεργές ενώσεις ή γαλακτοματοποιητές αναφερόμαστε σε ενώσεις αμφίφιλου χαρακτήρα, οι οποίες χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών. Σήμερα, η παγκόσμια αγορά επιφανειοενεργών ενώσεων ανέρχεται σε δεκάδες χιλιάδες τόνους, εκ των οποίων το 75% αφορά ενώσεις, όπως τα μονο-γλυκερίδια, καθώς και μίγματα μονο- και διγλυκεριδίων. Η χημική παραγωγή των μονο-γλυκεριδίων επιτυγχάνεται μέσω αντιδράσεων γλυκερόλυσης λιπών και ελαίων σε υψηλές θερμοκρασίες ( ο C) παρουσία ανόργανων αλκαλικών καταλυτών. Το κύριο μειονέκτημα της παραπάνω διεργασίας είναι η μειωμένη εκλεκτικότητα, γεγονός που οδηγεί σε προϊόντα χαμηλής καθαρότητας, η οποία συνήθως δεν ξεπερνά το 50%. Σε αντίθεση με την κλασική χημική διαδικασία, η εφαρμογή 1,3-ειδικευμένων λιπασών για την κατάλυση αντιδράσεων υδρόλυσης, αλκοόλυσης ή γλυκερόλυσης τριγλυκεριδίων οδηγεί σε προϊόντα υψηλής περιεκτικότητας σε μονο-γλυκερίδια (βλ σχήμα 11.20) OCOR OCOR + OH 1,3-ειδικευμένη λιπάση 2 R'OH OCOR + 2 RCOOR' OCOR τριγλυκερίδια αλκοόλη ή νερό OH 2-μονο-γλυκερίδια εστέρας ή λιπαρό οξύ Σχήμα Ενζυμικά καταλυόμενη παραγωγή μονο-γλυκεριδίων. Ενζυμική παρασκευή ζιζανιοκτόνων και εντομοκτόνων Η κατηγορία των R-2-αρυλοξυ-προπιονικών ζιζανιοκτόνων αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα βιομηχανικής παραγωγής χειρόμορφων ενώσεων με βιολογική δράση, μέσω ενζυμικά καταλυόμενων αντιδράσεων. Οι ενώσεις αυτές συντίθενται από (S)-2-χλωροπροπιονικό οξύ, το οποίο λαμβάνεται από το αντίστοιχο ρακεμικό μίγμα μέσω του ενζυμικά καταλυόμενου διαχωρισμού του. Για το σκοπό αυτό εφαρμόζονται δύο ενζυμικές μέθοδοι, οι οποίες βασίζονται: α) Στην εκλεκτική εστεροποίηση του ρακεμικού 2-χλωροπροπιονικού οξέος με βουτανόλη, που καταλύεται από λιπάση σε εξάνιο. β) Στην εκλεκτική απομάκρυνση του αλογόνου από το ρακεμικό μίγμα του 2- χλωροπροπιονικού οξέος, που καταλύει το ένζυμο δεαλογονάση από τον 287

296 μικροοργανισμό Pseudomonas putida (βλ. σχήμα 11.21). Η αποτελεσματικότητα της ενζυμικής αυτής διεργασίας έχει αυξηθεί (ee>98%) μετά από γενετική τροποποίηση του μικροοργανισμού, με σκοπό την αφαίρεση της δραστικότητας της (S)-εκλεκτικής δεαλογονάσης. Τελευταία, έχει αναπτυχθεί σε βιομηχανική επίσης κλίμακα, μια άλλη ενζυμική διαδικασία σύνθεσης R-2-αρυλοξυ-προπιονικών ζιζανιοκτόνων. Η διεργασία βασίζεται στην υδροξυλίωση του R-2-αρυλοξυ-προπιονικού οξέος, που καταλύει η μονο-οξυγονάση του μύκητα Beauveria bassiana (Σχήμα 11.22). Το προϊόν της αντίδρασης αποτελεί ενδιάμεσο στη σύνθεση εντομοκτόνων. CH 3 CHCl COOH Δεαλογονάση (P. putida) (R,S)-2-Χλωροπροπιονικό οξύ C H 3 HOOC C ee > 98% Cl H + (S)-2-Χλωροπροπιονικό οξύ C H 3 HOOC C OH H (S)-Γαλακτικό οξύ Xημικώς C H 3 HOOC C H O R (R)-2-Αρυλοξυπροπιονικό οξύ Σχήμα Εκλεκτικός διαχωρισμός του (R,S) 2-χλωροπροπιονικού οξέος που καταλύει το ένζυμο δεαλογονάση από το μικροοργανισμό Pseudomonas putida. R' O μονο-οξυγονάση από Beauveria bassiana HO O OH OH (R)-2-αρυλοξυ-προπιονικό οξύ (R)-2-(4-υδροξυ-αρυλοξυ)-προπιονικό οξύ Σχήμα Ενζυμικά καταλυόμενη υδροξυλίωση του (R) 2-αρυλοπροπιονικού οξέος που καταλύει το ένζυμο μονο-οξυγονάση από το μικροοργανισμό Beauveria bassiana. 288

297 12. ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Οι εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στην προστασία του περιβάλλοντος (Περιβαλλοντική Βιοτεχνολογία) αφορούν μεταξύ άλλων σε διαδικασίες, όπως η βιοαποδόμηση ρύπων, η βιοεκχύλιση μετάλλων, ο βιοέλεγχος και η βιοαποκατάσταση. Στη συνέχεια θα αναφερθούμε σε ορισμένες από αυτές τις εφαρμογές ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ Για τη μείωση/απομάκρυνση του ρυπαντικού φορτίου των υγρών αποβλήτων είναι απαραίτητη η εφαρμογή των κατάλληλων μεθόδων επεξεργασίας. Ο απαιτούμενος βαθμός επεξεργασίας εξαρτάται από τον τελικό αποδέκτη του επεξεργασμένου αποβλήτου (λίμνη, ποτάμι, έδαφος, θάλασσα, αποχετευτικό δίκτυο) και τα αντίστοιχα αποδεκτά όρια για τελική διάθεση (καθορισμός ανώτατων επιτρεπτών ορίων απόρριψης). Η επιλογή της μεθόδου πρέπει να γίνεται πολύ προσεκτικά και ύστερα από ανάλυση των προβλημάτων της κάθε περίπτωσης ξεχωριστά. Η μέθοδος (φυσικοχημική ή βιολογική) ή ο συνδυασμός μεθόδων που μπορούν να εφαρμοσθούν εξαρτάται από τις συγκεντρώσεις και το είδος του προς απομάκρυνση ρυπαντικού φορτίου. Οι κυριότερες βιολογικές μέθοδοι, οι οποίες χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία των αποβλήτων (μεμονωμένα ή σε συνδυασμό) μπορούν να είναι αερόβιες ή αναερόβιες και συνοψίζονται ως εξής: (α) Αερόβια βιολογική επεξεργασία - Ενεργός ιλύς (activated studge) - Αεριζόμενες λίμνες (aerated lagoons) - Βιολογικά φίλτρα (trickling filters) - Περιστρεφόμενοι βιολογικοί δίσκοι (rotating biological discs) (β) Αναερόβια βιολογική επεξεργασία - Αναερόβια φίλτρα (anaerobic filters) - Αναερόβιος χωνευτήρας (conventional anaerobic digester) - Αναερόβια μονάδα ενεργού ιλύος (anaerobic activated sludge plant) 289

298 α) Αερόβια βιολογική επεξεργασία Στις περιπτώσεις που τα περισσότερα από τα οργανικά συστατικά, που περιέχονται σε ένα απόβλητο, είναι βιοαποδομήσιμα, επιδέχονται ευκολότερα βιολογική επεξεργασία. Με κατάλληλη ρύθμιση του ph και προσθήκη των απαιτούμενων θρεπτικών, μπορεί να επιτευχθεί η δημιουργία υγιούς πληθυσμού μικροοργανισμών που θα διασπούν το οργανικό φορτίο των αποβλήτων (μέσω ανάπτυξης βιοχημικών δράσεων). Τα βιοαποδομήσιμα οργανικά, τα οποία χρησιμεύουν ως πηγή άνθρακα και ενέργειας, μετατρέπονται σε αιωρούμενα συστατικά, τα οποία συσσωματώνονται και καθιζάνουν ή μετατρέπονται σε αέρια προϊόντα. Συμπληρωματικά, μπορεί να απομακρυνθούν και μέταλλα (Fe, Mg, κ.ά.), χωρίς αυτό να αποτελεί τον κύριο στόχο της βιολογικής επεξεργασίας. Κατά την αερόβια βιολογική επεξεργασία, ο βακτηριακός πληθυσμός μπορεί να βρίσκεται σε αιώρηση ή να είναι προσκολλημένος σε κάποια επιφάνεια. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν η μέθοδος της ενεργού ιλύος και οι αεριζόμενες λίμνες, ενώ στη δεύτερη τα βιολογικά φίλτρα και οι περιστρεφόμενοι βιολογικοί δίσκοι. Ο αερισμός, ο οποίος εφαρμόζεται σε όλες τις μεθόδους παρέχει το οξυγόνο που χρειάζονται οι μικροοργανισμοί για την οξείδωση, επιτυγχάνει την κατάλληλη ανάδευση του αποβλήτου, διατηρεί τα συσσωματώματα σε αιώρηση και βοηθά στην απομάκρυνση των παραγόμενων αερίων. Επεξεργασία με ενεργό ιλύ Κατά την επεξεργασία με την εφαρμογή της μεθόδου της ενεργού ιλύος (activated sludge) χρησιμοποιείται δεξαμενή αερισμού, στην οποία το απόβλητο αναμιγνύεται και αερίζεται με παροχή του απαιτούμενου οξυγόνου. Η έξοδος της δεξαμενής αερισμού καταλήγει σε δεξαμενή καθίζησης, όπου το επεξεργασμένο απόβλητο αφήνεται σε ηρεμία για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Η υπερχείλιση της δεξαμενής καθίζησης αποτελεί την έξοδο του επεξεργασμένου αποβλήτου. Από τον πυθμένα της δεξαμενής αυτής απομακρύνεται η ενεργός λάσπη, μέρος της οποίας ανακυκλώνεται στη δεξαμενή αερισμού. Αεριζόμενες λίμνες Οι αεριζόμενες λίμνες (aerated lagoons) είναι αβαθείς λίμνες (βάθους μέχρι 3 μέτρα) πολύ απλής κατασκευής, που επιτυγχάνεται με εκσκαφή του εδάφους και στεγανοποίηση του πυθμένα με άργιλο, μπετόν ή πλαστικά φύλλα PVC. Το απόβλητο 290

299 οξυγονώνεται με τη βοήθεια επιφανειακών επιπλεόντων αεριστήρων ή διαχυτήρων. Η μέθοδος αυτή προσεγγίζει τον τύπο της επεξεργασίας με ενεργό ιλύ, χωρίς όμως να υπάρχει δεξαμενή καθίζησης. Η καθίζηση της λάσπης επιτυγχάνεται διακόπτοντας τον αερισμό για μικρό χρονικό διάστημα, επιτρέποντας έτσι στα αιωρούμενα στερεά να κατακαθίσουν. Βιολογικά φίλτρα Η λειτουργία των βιολογικών φίλτρων (trickling filters) περιγράφεται ως ένας πνεύμονας που εισπνέει απόβλητα και εκπνέει καθαρό νερό, δεσμεύοντας ρύπους για την ανάπτυξη της κυτταρικής ύλης. Τα φίλτρα είναι βιολογικοί αντιδραστήρες σταθερής κλίνης, συνεχούς τροφοδοσίας χωρίς ανάμιξη και αποτελούνται από σύστημα κυλινδρικής διατομής που περιέχει αδρανή υλικά. Το απόβλητο εισέρχεται στην πάνω επιφάνεια του φίλτρου και εξέρχεται από τον πυθμένα, αφού διαπεράσει το υλικό πλήρωσης. Από τον πυθμένα τροφοδοτείται και ο αέρας που είναι απαραίτητος για τη λειτουργία των φίλτρων. Η απομάκρυνση του ρυπαντικού φορτίου των αποβλήτων στηρίζεται σε διαδικασίες προσρόφησης και αποδόμησης του ρυπαντικού φορτίου από το μικροβιακό πληθυσμό που αναπτύσσεται προσκολλημένος στα αδρανή πληρωτικά υλικά και τα οποία προσφέρουν μεγάλες επιφάνειες για την ανάπτυξη της βιομάζας. Περιστρεφόμενοι βιολογικοί δίσκοι Οι περιστρεφόμενοι βιολογικοί δίσκοι (rotating biological discs) βασίζονται στην ίδια αρχή λειτουργίας με τα αερόβια φίλτρα, με τη διαφορά ότι έρχονται σε επαφή με το απόβλητο και τον αέρα περιοδικά. Οι βιοδίσκοι είναι βυθισμένοι στο απόβλητο κατά 40-45% και περιστρέφονται πολύ αργά. Κατά την περιστροφή αυτή λαμβάνεται και το απαιτούμενο για τη δράση των μικροοργανισμών οξυγόνο. β) Αναερόβια βιολογική επεξεργασία Η αναερόβια επεξεργασία βασίζεται στην παρουσία μικροοργανισμών, οι οποίοι αναπτύσσονται απουσία οξυγόνου μετατρέποντας το οργανικό φορτίο κυρίως σε μεθάνιο, διοξείδιο του άνθρακα και άλλα προϊόντα μεταβολισμού. Η επεξεργασία αποτελείται από δύο φάσεις: Στην πρώτη κυριαρχεί η παραγωγή οξέων (οξυγενές στάδιο), όπου αναερόβια βακτήρια διασπούν σύνθετες οργανικές ενώσεις σε απλούστερες, π.χ. οξικό οξύ και άλλα οξέα χαμηλού μοριακού βάρους. Στη δεύτερη 291

300 φάση (μεθανογένεση), τα μεθανογενή βακτήρια παράγουν μεθάνιο και διοξείδιο του άνθρακα με τη διάσπαση των απλών οργανικών οξέων. Η παραγωγή οξέων κατά το οξυγενές στάδιο οδηγεί σε πτώση του ph, ενώ το στάδιο της μεθανογένεσης απαιτεί ph από 6.5 έως 7. Για το σκοπό αυτό, πρέπει να εξασφαλίζεται η επιθυμητή περιοχή ph, έτσι ώστε να είναι σταθεροποιημένη η παραγωγή μεθανίου. Η επεξεργασία γίνεται με αργούς ρυθμούς και σε ελεγχόμενο θερμοκρασιακό περιβάλλον, αφού η ανάπτυξη και η δράση των αναερόβιων μικροοργανισμών ευνοείται σε μεσόφιλες περιοχές (Τ=35 ο C). Γενικά, οι αναερόβιες επεξεργασίες είναι κατάλληλες για την επεξεργασία αποβλήτων που έχουν υψηλό ρυπαντικό φορτίο. Μια τυπική εγκατάσταση αναερόβιας επεξεργασίας δύο σταδίων έχει ως εξής: Στο πρώτο στάδιο, η δεξαμενή είναι κλειστή, υπάρχει πλήρης ανάμιξη λάσπης σε αυτή και γίνεται ανακύκλωση του αποβλήτου ή/και του παραγόμενου αερίου. Η δεξαμενή θερμαίνεται και το παραγόμενο αέριο συλλέγεται και χρησιμοποιείται για τη θέρμανση του συστήματος. Στο δεύτερο στάδιο, η δεξαμενή είναι ανοικτή, δε θερμαίνεται και χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό του επεξεργασμένου αποβλήτου από την παραγόμενη λάσπη. Ένας τρόπος μείωσης του απαιτούμενου χρόνου παραμονής είναι η ανακύκλωση μέρους της λάσπης που καθιζάνει στη δεύτερη δεξαμενή. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα της αναερόβιας επεξεργασίας είναι η κάλυψη των ενεργειακών αναγκών της από το παραγόμενο μεθάνιο ΒΙΟΕΚΧΥΛΙΣΗ ΜΕΤΑΛΛΩΝ Το αποτέλεσμα της δράσης ορισμένων μικροοργανισμών είναι η διαλυτοποίηση, μεταφορά και απόθεση μετάλλων και ορυκτών στο περιβάλλον. Με την αποδοτική χρήση αυτών των δράσεων, η βιοϋδρομεταλλουργία έχει εξελιχθεί σε μία ελκυστική εναλλακτική μεθοδολογία για την αξιοποίηση μεταλλευμάτων και βιομηχανικών ορυκτών και, επίσης, για την ανάκτηση μετάλλων (σίδηρος, χαλκός, ουράνιο, χρυσός) από υδατικά διαλύματα. Σήμερα, οι εφαρμογές της σε βιομηχανική κλίμακα είναι: α) η εκχύλιση χαλκού και ουρανίου β) η προκατεργασία βιολογικής οξείδωσης για τη βελτίωση της ανάκτησης χρυσού και αργύρου, κατά την κυάνωση, από δυσκατέργαστα θειούχα συμπυκνώματα 292

301 γ) η επεξεργασία υγρών βιομηχανικών αποβλήτων για την ανάκτηση μετάλλων (βιορόφηση). H ανάκτηση μετάλλων από υδατικά διαλύματα με τη χρήση μικροοργανισμών ονομάζεται βιορόφηση (biosorption). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ μικροοργανισμών και μετάλλων μελετώνται πολλά χρόνια κι έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι χρήσης μικροβιακής βιομάζας για την ανάκτηση μετάλλων. Αναλυτικά, τα πλεονεκτήματα των βιοϋδρομεταλλουργικών μεθόδων σε σχέση με τις κλασσικές τεχνικές είναι τα εξής: Η βιοτεχνολογική εκχύλιση είναι εφαρμόσιμη σε όλες τις ποιότητες μεταλλευμάτων, καθώς και σε απορρίμματα από τη συμβατική κατεργασία τους. Η βιολογική εκχύλιση έχει χαμηλότερες ενεργειακές απαιτήσεις από τις συμβατικές μεθόδους. Η θερμοκρασία λειτουργίας, στις περισσότερες περιπτώσεις, είναι αυτή του περιβάλλοντος. Από περιβαλλοντικής απόψεως, η βακτηριακή εκχύλιση είναι ακίνδυνη. Δε συνοδεύεται από θειώδεις εκπομπές και το απόρριμμα παράγεται είτε σε υγρή, είτε σε στερεή μορφή, η οποία είναι ελεγχόμενη. Η βακτηριακή κατεργασία έχει χαμηλό κόστος εγκατάστασης και λειτουργίας. Tα κύρια μειονεκτήματα των βακτηριακών μεθόδων είναι: Χαμηλές ταχύτητες αντίδρασης, σε σύγκριση με μεθόδους εξαγωγής μετάλλων σε υψηλή θερμοκρασία και πίεση, με χρήση ισχυρών οξέων και οξειδωτικών ή αναγωγικών μέσων. Έλλειψη εκλεκτικότητας. Δύσκολη προσαρμογή σε ακραίες συνθήκες, τυπικές των βιομηχανικών κατεργασιών, όπως είναι οι υψηλές συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων, θερμοκρασίες, πιέσεις, διατμήσεις ανάδευσης. Αναμένεται όμως ότι, οι νέες μηχανικές σχεδιάσεις αντιδραστήρων, μαζί με τη συνεχιζόμενη εξέλιξη στη βιοτεχνολογία μικροοργανισμών, θα καταστήσουν δυνατή την ανάπτυξη νέων βιοϋδρομεταλλουργικών μεθόδων ικανών να ξεπεράσουν τους περιορισμούς αυτούς. Oι θειοβάκιλλοι (Thiobacillus sp) χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να οξειδώνουν ενώσεις θείου για την παραγωγή μεταβολικά χρήσιμης ενέργειας. Η εξαγωγή μετάλλων από τα μεταλλεύματα μπορεί να ενισχυθεί από τη δράση αυτών των βακτηρίων με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς: τον άμεσο και τον έμμεσο. 293

302 Η άμεση βακτηριακή εκχύλιση συμβαίνει με την προσβολή των αδιάλυτων συστατικών του ορυκτού από τα βακτήρια, με αποτέλεσμα την οξείδωσή τους και τη μετατροπή τους σε ευδιάλυτες ενώσεις. βακτήρια 2FeS2 + 7O2 + 2H2O > 2FeSO4 + 2H2SO4 βακτήρια 4FeSO4 + O2 + 2H2SO >2Fe2(SO4)3 + 2H2O Η έμμεση εκχύλιση, αντίθετα, δεν γίνεται με προσβολή του ορυκτού από τα βακτήρια. Σε αυτή, τα βακτήρια παράγουν Fe 3+ από την οξείδωση διαλυτού Fe 2+ (Fe2(SO4)3). Στη συνέχεια, ο τρισθενής σίδηρος, ως ισχυρό οξειδωτικό μέσο, οξειδώνει άλλα ορυκτά στο μετάλλευμα, τα οποία, έτσι, μεταπίπτουν σε διαλυτή μορφή. Ανάκτηση πολύτιμων μετάλλων Τα μεταλλεύματα πολύτιμων μετάλλων επεξεργάζονται με κυάνωση, καθώς αυτή είναι η πιο αποδοτική μέθοδος ανάκτησης των πολύτιμων μετάλλων από το μετάλλευμα. Η βιο-οξείδωση βελτιώνει σημαντικά την προσπελασιμότητα του χρυσού από το κυάνιο και έτσι διευκολύνεται η διαδικασία της ανάκτησης. Κατά την οξειδωτική βιοεκχύλιση, συμβαίνουν οι αντιδράσεις άμεσης και έμμεσης εκχύλισης. Mικροβιακή Αποθείωση και Αποτοξικοποίηση Αερίων Τα αέρια διοξείδιο του θείου, υδρόθειο και διοξείδιο του άνθρακα παράγονται κατά την επεξεργασία ή την καύση πολλών ορυκτών καυσίμων, όπως του φυσικού αερίου, του πετρελαίου και του λιθάνθρακα, και κατά την αεριοποίηση υδρογονανθράκων. Οι χημικές διεργασίες αποθείωσης αυτών των αερίων είναι ενεργοβόρες και υψηλού κόστους. Έχουν διερευνηθεί εναλλακτικές βιοχημικές διεργασίες, που βασίζονται στη χρήση αναερόβιων φωτοσυνθετικών βακτηρίων Chlorobium και Chromatium, καθώς και αερόβιων αυτότροφων Thiobacillus, τα οποία οξειδώνουν το υδρόθειο και το διοξείδιο του θείου προς στοιχειακό θείο και θειικό οξύ, αντιστοίχως, και αφομοιώνουν το διοξείδιο του άνθρακα για να συνθέσουν τον κυτταρικό τους άνθρακα. Οι μικροοργανισμοί αυτοί, μαζί με τα αερόβια Beggiatoum, παίζουν σημαντικό ρόλο στο φυσικό κύκλο του θείου, αποθέτοντας στοιχειακό θείο με οξείδωση ηφαιστειακού και βιογενούς υδροθείου σε πολλές λίμνες του κόσμου. 294

303 Σχήμα 12.1 Διάγραμμα βιο-οξείδωσης μεταλλεύματος χρυσού 12.3 ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΣΤΗΝ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΜΕΤΑΛΛΩΝ Ορισμένοι μικροοργανισμοί έχουν την ικανότητα πρόσληψης μεταλλικών ιόντων, ενώ ταυτόχρονα διαθέτουν και μηχανισμούς αδρανοποίησής τους, καθώς σε μεγάλες συγκεντρώσεις τα βαρέα μέταλλα είναι τοξικά. Το φαινόμενο αυτό, που παρουσιάζεται τόσο σε ζωντανά κύτταρα, όσο και σε μη-ζώσα βιομάζα, ονομάζεται βιορόφηση. Όταν οι μικροοργανισμοί δεσμεύουν τα μέταλλα ενεργώς μέσω της δράσης μεταβολιζόντων κυττάρων, η διεργασία ονομάζεται βιοσυσσώρευση (bioaccumulation), ενώ όταν η δέσμευση γίνεται παθητικώς μέσω φυσικοχημικών δράσεων ανεξαρτήτων από τη διαδικασία ανάπτυξης, η διεργασία ονομάζεται 295

304 βιοπροσρόφηση (bioadsorption). Αυτή η ικανότητα παρουσιάζεται σε βακτήρια, μύκητες, ζύμες, φύκη και μικροφύκη. Η βιορόφηση έχει αποκτήσει μεγάλο βιομηχανικό ενδιαφέρον λόγω της δυνατότητας που προσφέρει τόσο για ανάκτηση μετάλλων, όσο και για απομάκρυνση τοξικών και ραδιενεργών στοιχείων από υδρομεταλλουργικά ρεύματα και υγρά βιομηχανικά απόβλητα. Η βιορόφηση αποτελεί μια εναλλακτική μέθοδο απομάκρυνσης και ανάκτησης μετάλλων από υδατικά διαλύματα, οικονομικά ανταγωνιστική προς τις καθιερωμένες υδρομεταλλουργικές τεχνικές. Υπάρχουν τρεις τύποι δέσμευσης των μετάλλων από βιολογικό υλικό: α) προσρόφηση των μετάλλων πάνω στα κυτταρικά τοιχώματα β) δέσμευση από εξωκυτταρικά προϊόντα, όπως πολυσακχαρίδια, χρωστικές ουσίες, βιοπολυμερή κ.ά. γ) εσωκυτταρική δέσμευση, που εξαρτάται από το μεταβολισμό και μπορεί να συνοδεύεται από τοξικά συμπτώματα. Αναλυτικά, οι μηχανισμοί που λειτουργούν στους τύπους (α) και (β) είναι: 1) Δέσμευση του μετάλλου από εξωτερικά τριχοειδή του κυτταρικού περιβλήματος. 2) Ανταλλαγή κατιόντων και συμπλοκοποίηση στην επιφάνεια του κυττάρου. Η εκλεκτική δέσμευση των μεταλλοκατιόντων στις επιφάνειες των κυττάρων είναι αποτέλεσμα ηλεκτροστατικών έλξεων με τις ανιονικές ομάδες, όπως είναι οι καρβοξυλικές και πολυφωσφορικές ομάδες. Μπορεί, επίσης, να δημιουργηθεί σύμπλοκο μεταξύ του μεταλλοκατιόντος και των συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος (πολυσακχαριτών και πρωτεϊνών). Η αντοχή των κυττάρων στα μέταλλα οφείλεται συχνά στην παρεμπόδιση της μεταφοράς τοξικών κατιόντων μέσα στα κύτταρα με την ισχυρή δέσμευσή τους στην κυτταρική επιφάνεια. 3) Καταβύθιση ανόργανου μεταλλικού ιζήματος στο εξωτερικό του κυττάρου ως αποτέλεσμα μικροβιακής οξειδοαναγωγικής δράσης. Στον τύπο (γ) συμβαίνουν: 1) Βιοσυσσώρευση μεταλλικών ιόντων σε ειδικές πρωτεΐνες του κυττοπλάσματος (π.χ. μεταλλοθειονεΐνες) ή με τη μορφή εσωκυτταρικού μεταλλικού ιζήματος. 2) Ενεργή μεταφορά ιόντων εντός του κυττάρου. Τα ενυδατωμένα κατιόντα δεν μπορούν να διαχυθούν διαμέσου της διπλής στοιβάδας λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης για να βρεθούν εντός του κυττάρου. Αυτό το φράγμα μπορεί να ξεπεραστεί (α) με δημιουργία λιποδιαλυτού συμπλόκου του μετάλλου με μόρια- 296

305 φορείς, στο οποίο επιτρέπεται η διάχυση μέσω της μεμβράνης, (β) με χρήση υδροφιλικών καναλιών διαμέσου της μεμβράνης. Οι παράγοντες που επιδρούν στην απομάκρυνση μετάλλων από μικροοργανισμούς είναι οι ιδιότητες της επιφάνειας των κυτταρικών τοιχωμάτων (δομή, σύσταση, κλπ.), ο μεταβολισμός των κυττάρων (μόνο όταν πρόκειται για βιοσυσσώρευση), το ph και η παρουσία ανταγωνιστικών κατιόντων. Tα επιφανειακώς δεσμευμένα μέταλλα μπορούν να απομακρυνθούν από το κυτταρικό τοίχωμα με χρήση χηλικών συμπλοκοποιητών (π.χ. EDTA) ή αραιών οξέων Άλλες εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στην προστασία του περιβάλλοντος Βιοαποκατάσταση μολυσμένων περιοχών Οι μικροοργανισμοί διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην απομάκρυνση πολλών επικίνδυνων ουσιών, φυσικής και ανθρωπογενούς προέλευσης. Μετατρέπουν επικίνδυνες χημικές ουσίες σε μορφές ήπιες τόσο για τον άνθρωπο, όσο και για το περιβάλλον. Ορισμένα μικρόβια καταναλώνουν αέριο μεθάνιο ένα σημαντικό αέριο του φαινομένου του θερμοκηπίου, το οποίο εκλύεται σε χωματερές και βάλτους. Άλλα μικρόβια αποικοδομούν τα λύματα στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας υγρών αποβλήτων. Βιοκοινότητες θαλάσσιων βακτηρίων, όμοιων με τα μικρόβια του εδάφους που αποικοδομούν τη βενζίνη στη χέρσο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον καθαρισμό των πετρελαιοκηλίδων από τους ωκεανούς. Η βιοαποκατάσταση αφορά στην αξιοποίηση μικροοργανισμών για την αποικοδόμηση ή τη μείωση της τοξικότητας των ρύπων μιας μολυσμένης περιοχής (έδαφος, υδάτινα συστήματα). Συνήθεις τοξικές ουσίες είναι το αργό πετρέλαιο ή κλάσματά του, οργανικοί διαλύτες, χλωριωμένες-αρωματικές ενώσεις. Η διεργασία βιοαποκατάστασης περιλαμβάνει συνήθως τα ακόλουθα στάδια: Επιλογή μικροοργανισμών Μελέτη απαιτήσεων σε θρεπτικά συστατικά Εμβολιασμός Τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα της προσέγγισης έχουν να κάνουν με την απλότητα της εφαρμογής, το χαμηλό κόστος, την απουσία προβλήματος διάθεσης ρύπων (φυσική διασπορά μεταβολιτών) και τον μειωμένο κίνδυνο παραγωγής δευτερογενών ρύπων. Τα σημαντικότερα μειονεκτήματα έχουν να κάνουν με τη μικρή σχετικά ταχύτητα αποδόμησης και την έλλειψη εμπειρίας, καθώς η μεθοδολογία έχει εφαρμοσθεί σε σχετικά μικρό αριθμό περιπτώσεων. 297

306 Αν και γνωρίζουμε ότι οι μικροοργανισμοί είναι εξαιρετικά χρήσιμοι για την αποικοδόμηση των λυμάτων και των επικίνδυνων πετρελαιοκηλίδων, δεν έχουμε ακόμη κατανοήσει, παρά ελάχιστα, τις σχετικές διαδικασίες και το πώς θα μπορούσαμε να τις εκμεταλλευτούμε, για να διαχειριστούμε τις χημικές ουσίες που αποβάλλει στο περιβάλλον ο άνθρωπος με αυτές τις προσεγγίσεις Βιοέλεγχος Με τον όρο αυτό αναφερόμαστε στον έλεγχο της αύξησης του πληθυσμού ενός είδους μέσω της σκόπιμης απελευθέρωσης κάποιου άλλου. Οι προϋποθέσεις που πρέπει να πληροί το απελευθερωμένο είδος έχουν να κάνουν με το: -Να είναι αποτελεσματικό στην αναχαίτιση του πρώτου -Να πολλαπλασιάζεται και εξαπλώνεται γρήγορα -Να μην αποσταθεροποιείται η φυσική ισορροπία άλλων ειδών Παραδείγματα βιοελέγχου αποτελούν η χρησιμοποίηση μυρμηγκιών Φαραώ για τη μείωση του πληθυσμού εντόμων δημητριακών, καθώς και η χρησιμοποίηση μυκήτων, βακτηρίων και εντόμων για την καταπολέμηση ζιζανίων του ρυζιού και των εσπεριδοειδών 298

307 13. ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Γενικά Η διαδικασία απομόνωσης και καθαρισμού ενός βιοτεχνολογικού προϊόντος είναι γνωστή με τον όρο κάθετη επεξεργασία (downstream processing). Ο όρος βιοτεχνολογικά προϊόντα περιλαμβάνει πλήθος ενώσεων, που διαφέρουν τόσο στη φύση, όσο και στο μέγεθος και τις ιδιότητες. Τα βιοτεχνολογικά προϊόντα μπορεί να είναι: ολόκληρα κύτταρα, οργανικά οξέα και αμινοξέα, διαλύτες, αντιβιοτικά, βιομηχανικά ένζυμα και θεραπευτικές πρωτεΐνες, εμβόλια, κ.ά. Σε γενικές γραμμές, η πολυπλοκότητα της κάθετης επεξεργασίας προσδιορίζεται από τον επιθυμητό βαθμό καθαρότητας του προϊόντος, που με τη σειρά του καθορίζεται από το είδος εφαρμογής του προϊόντος αυτού. Η φύση και το μέγεθος των βιοτεχνολογικών προϊόντων καθορίζει σε μεγάλο βαθμό το είδος των τεχνικών, που θα χρησιμοποιηθούν για τον διαχωρισμό και την απομόνωσή τους. Σημαντικότατο ρόλο στην επιλογή της διαδικασίας που θα ακολουθηθεί, διαδραματίζει η ευαισθησία ορισμένων βιοπροϊόντων, όπως των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών, σε παράγοντες που περιλαμβάνουν το ph, τη θερμοκρασία ή την ιοντική ισχύ του διαλύματος. Τέλος, βασικό στοιχείο στο σχεδιασμό της διαδικασίας αποτελεί η ελαχιστοποίηση των σταδίων που απαιτούνται, αλλά και η διατήρηση υψηλών αποδόσεων μετά την ολοκλήρωση του κάθε σταδίου. Στο σχήμα 13.1 παρουσιάζεται η σχέση της συγκέντρωσης ενός βιοτεχνολογικού προϊόντος στην αρχική του πηγή (πριν τον καθαρισμό του) συναρτήσει της τιμής πώλησής του. Το βασικό σχήμα της κατιούσας επεξεργασίας, που αφορά στον καθαρισμό και την απομόνωση βιομορίων, περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1) το διαχωρισμό υγρού-στερεού 2) τη συμπύκνωση 3) τον καθαρισμό 4) και τη μορφοποίηση του προϊόντος Τα βασικά στάδια της κατιούσας επεξεργασίας περιγράφονται στο σχήμα Διαχωρισμός υγρού- στερεού. Ο διαχωρισμός υγρού-στερεού αποτελεί πρωταρχικό στάδιο σε διαδικασίες, όπως ο διαχωρισμός των κυττάρων από το υγρό καλλιέργειας, η απομάκρυνση 299

308 κυτταρικών θραυσμάτων και η συλλογή πρωτεϊνικού ιζήματος. Οι δύο κύριες τεχνικές που εφαρμόζονται είναι αυτή της διήθησης και της φυγοκέντρησης. Συγκέντρωση στο αρχικό υλικό (g/l) Νερό Αιθανόλη Πενικιλλίνη Μικροβιακές πρωτεάσες Οξειδάση της γλυκόζης Ινσουλίνη Αυξητική ορμόνη Παράγοντας VIII Εμβόλιο ηπατίτιδας Β Μονοκλωνικά αντισώματα Tιμή πώλησης ( /Kg) Σχήμα Σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης στο αρχικό υλικό και της τιμής πώλησης (κατά προσέγγιση) του νερού και διάφορων βιοτεχνολογικών προϊόντων. Διήθηση Η αρχή της διήθησης βασίζεται στη διαφορά μεγέθους μεταξύ των πόρων του ηθμού (φίλτρου) και των προς διήθηση ουσιών. Όταν το μέγεθος των μορίων της ουσίας είναι μικρότερο από αυτό των πόρων του ηθμού, τότε αυτά μαζί με το διαλύτη διαπερνούν τον ηθμό. Αντίθετα, τα μόρια ενώσεων μεγαλύτερου μεγέθους κατακρατούνται στον ηθμό. Μεγάλη είναι η ποικιλία των υλικών που χρησιμοποιούνται ως ηθμοί. Τα υλικά αυτά περιλαμβάνουν κεραμικές και συνθετικές μεμβράνες, υαλοβάμβακα, κυτταρίνη, κ.λ.π. Αρκετοί τύποι συσκευών διήθησης χρησιμοποιούνται. Μεταξύ αυτών, τα φίλτρα διήθησης υπό κενό (vacuum filters) είναι αρκετά διαδεδομένα, κυρίως λόγω του χαμηλού κόστους, αλλά και της ευκολίας χειρισμού. Φίλτρα αυτού του τύπου βρίσκουν εφαρμογή σε περιπτώσεις διαχωρισμού ουσιών από υγρά καλλιέργειας, των οποίων η περιεκτικότητα σε στερεά είναι 10-40% κατ όγκο, ενώ το μέγεθος των σωματιδίων κυμαίνεται από m. 300

309 Παραγωγή προϊόντος Εξωκυτταρικό προϊόν Ενδοκυτταρικό προϊόν Διάρρηξη κυττάρων Μηχανικές ή φυσικές μέθοδοι Διαχωρισμός υγρού στερεού Φυγοκέντρηση, διήθηση, εκχύλιση Συμπύκνωση Καθαρισμός Υπερδιήθηση, καθίζηση, εκχύλιση Υγρή χρωματογραφία Μορφοποίηση προϊόντος Kρυστάλλωση, λυοφίληση, ξήρανση Τελικό προϊόν Σχήμα Κατιούσα επεξεργασία. Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού βιοτεχνολογικών προϊόντων. Ένας πολύ γνωστός τύπος συστήματος διήθησης υπό κενό, που βρίσκει εφαρμογή σε μεγάλη κλίμακα, είναι ο ηθμός περιστρεφόμενου τυμπάνου (rotary drum vacuum filter). Ο ηθμός του τύπου αυτού χρησιμοποιείται κυρίως στη διήθηση κυττάρων από ζύμες και νηματοειδείς μύκητες και περιγράφεται στο σχήμα Ο 301

310 ηθμός εντοπίζεται στην εξωτερική επιφάνεια του τυμπάνου, στο οποίο εφαρμόζεται υποπίεση. Ενώ το τύμπανο περιστρέφεται (με ταχύτητα έως 5 rpm), τμήμα του βυθίζεται στη δεξαμενή με το προς διήθηση υλικό. Καθώς το υλικό ρέει κάθετα προς την επιφάνεια του ηθμού, τα στερεά παραμένουν στον ηθμό, ενώ τα υγρά κινούνται διαμέσου οπών από την επιφάνεια του τυμπάνου προς το εσωτερικό του. Ακολουθεί η φάση της έκπλυσης, στράγγισης και απόξυσης του στερεού από τον ηθμό. Το μέγεθος των φίλτρων που χρησιμοποιούνται κυμαίνεται από 120 cm 2 για εργαστηριακή εφαρμογή έως πάνω από cm 2 σε μεγάλης κλίμακας εφαρμογές. Στερεά γ δ β ε Ηθμός α Σχήμα Ηθμός περιστρεφόμενου τυμπάνου. Φάσεις λειτουργίας: α) διήθηση, β) στράγγιση, γ) έκπλυση, δ) στράγγιση, ε) απόξυση. Οι ηθμοί με βάση τις μικροπορώδεις μεμβράνες (membrane filter), οι οποίοι λειτουργούν υπό πίεση, βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή (κυρίως εναλλακτικά της φυγοκέντρησης) στα αρχικά στάδια της κατιούσας επεξεργασίας για το διαχωρισμό στερών και υγρών. Η αρχή λειτουργίας της τεχνικής και τα χαρακτηριστικά των ηθμών-μεμβρανών περιγράφονται στην παράγραφο Φυγοκέντρηση Ο διαχωρισμός των στερεών με φυγοκέντρηση βασίζεται στη διαφορά πυκνότητας μεταξύ των στερεών σωματιδίων και του περιβάλλοντος μέσου. Η μέθοδος βρίσκει κυρίως εφαρμογή στο διαχωρισμό κυττάρων ή άλλων σωματιδίων μεγάλου σχετικά μεγέθους. Η ταχύτητα κίνησης ενός σωματιδίου στο υγρό κατά τη φυγοκέντρηση επηρεάζεται κυρίως από το μέγεθός του και πολύ λιγότερο από την πυκνότητά του. Έτσι, αν και τα κύτταρα έχουν μικρότερη πυκνότητα από τις πρωτεΐνες (ρ = gcm -3 έναντι 1.3 gcm -3 αντίστοιχα) αυτά καθιζάνουν πολύ πιο 302

311 γρήγορα, καθώς η διαφορά στο μέγεθός τους είναι πολύ μεγάλη (τυπικά m έναντι m αντίστοιχα). Στην παρασκευαστική και βιομηχανική κλίμακα χρησιμοποιούνται κυρίως φυγόκεντροι συνεχούς ροής (continuous flow centrifuges). Στις φυγόκεντρους του τύπου αυτού η είσοδος του υλικού και η έξοδος του διηθήματος γίνεται συνεχώς, ενώ η απομάκρυνση των στερεών γίνεται είτε συνεχώς, είτε περιοδικά. O απλούστερoς τύπος φυγόκεντρου συνεχούς ροής είναι αυτός του κυλινδρικού δοχείου. Ο τύπος αυτός, που χρησιμοποιείται κυρίως σε πιλοτικές μονάδες, αποτελείται από μεταλλικό σωλήνα που περιστρέφεται γύρω από τον κατακόρυφο άξονα συμμετρίας του. Η είσοδος του υλικού γίνεται συνεχώς από το κάτω μέρος, τα στερεά υλικά καθιζάνουν κατά μήκος της κεφαλής, ενώ το διήθημα εξέρχεται από πάνω (βλ. σχήμα 13.4). Η φυγόκεντρος λειτουργεί ημισυνεχώς, καθώς η λειτουργία της διακόπτεται περιοδικά για την απομάκρυνση και παραλαβή των στερεών. Με τη φυγόκεντρο του τύπου αυτού επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός μικρών σχετικά ποσοτήτων υλικού. Ένας άλλος τύπος φυγοκέντρου συνεχούς ροής, που χρησιμοποιείται ευρέως στη βιοτεχνολογία, είναι γνωστός με τον όρο δοχείο δίσκων. Η κεφαλή της φυγοκέντρου αυτής φέρει κατά μήκος του άξονα περιστροφής δίσκους (30-200), οι οποίοι βρίσκονται υπό γωνία ο, ενώ η μεταξύ τους απόσταση κυμαίνεται από mm (βλ. σχήμα 13.4). Η τροφοδοσία της φυγοκέντρου, καθώς και η παραλαβή του διηθήματος, γίνονται από το πάνω μέρος σε διαφορετικές θέσεις της κεφαλής. Το προς φυγοκέντρηση υλικό κινείται συνεχώς προς τα κάτω κατά μήκος του άξονα περιστροφής και εισέρχεται στο θάλαμο φυγοκέντρησης από το κάτω μέρος. Στη συνέχεια αρχίζει να κινείται διαμέσου των δίσκων σε αντίθετη κατεύθυνση προς το κέντρο της κεφαλής. Τα στερεά καθιζάνουν στο εσωτερικό τοίχωμα του δοχείου, ενώ το διήθημα εξέρχεται από την έξοδο στο πάνω μέρος. Η φυγόκεντρος του τύπου αυτού επιτρέπει την απομάκρυνση των στερεών με τρόπο συνεχή ή περιοδικό χωρίς να διακόπτεται η λειτουργία της. Φυγόκεντροι του τύπου αυτού βρίσκουν εφαρμογή στο διαχωρισμό ζυμών και τη διαύγαση υγρών ζυμωτικών διεργασιών Αποδέσμευση βιομορίων από το εσωτερικό των κυττάρων Ο κύριος στόχος κατά τη διαδικασία αποδέσμευσης των βιομορίων (ένζυμα, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα, κλπ) από τα κύτταρα είναι η ανάκτηση της μέγιστης δυνατής ποσότητας του βιομορίου στη δραστική του μορφή. Η ανάκτηση αυτή 303

312 προϋποθέτει πρώτα απ όλα τη διάρρηξη (λύση) των κυττάρων. Πολλοί είναι οι παράγοντες που μπορεί να επιδράσουν αρνητικά στη δραστικότητα των βιομορίων κατά τη λύση των κυττάρων, όπως είναι η θερμοκρασία, το ph, καθώς και η παρουσία πρωτεολυτικών ενζύμων. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη διάρρηξη των κυττάρων στη βιοτεχνολογία, διακρίνονται σε μηχανικές και μη μηχανικές τεχνικές και η επιλογή τους εξαρτάται από το είδος των κυττάρων, που χρησιμοποιούνται ως πηγή βιομορίων. Στον πίνακα 13.1 αναφέρονται συνοπτικά οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται. α) β) Είσοδος υλικού Είσοδος υλικού Σχήμα Κεφαλές φυγοκέντρων συνεχούς ροής. α) Τύπος κυλινδρικού δοχείου, β) τύπος δοχείου δίσκων. Οι μη μηχανικές τεχνικές διάρρηξης των κυττάρων περιλαμβάνουν φυσικές, χημικές και ενζυμικές διεργασίες, οι κυριότερες εκ των οποίων είναι: α) Το ωσμωτικό σοκ. Η διεργασία εφαρμόζεται για τη λύση κυττάρων, των οποίων τα τοιχώματα έχουν μειωμένη μηχανική αντοχή (π.χ. ερυθροκύτταρα, Gram αρνητικά βακτηριακά κύτταρα). Η τεχνική βασίζεται στην επώαση των κυττάρων σε διάλυμα σακχαρόζης 20-25% w/v, γεγονός που οδηγεί στη συρρίκνωσή τους λόγω 304

313 απώλειας νερού από το εσωτερικό τους. Ακολουθεί η επώασή τους σε νερό στους 4 ο C, οπότε και διαρρηγνύονται. β) Η θερμική επεξεργασία. Αν και με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται με εύκολο και οικονομικό τρόπο η διάρρηξη των κυττάρων, η διεργασία βρίσκει εφαρμογή μόνο στην περίπτωση θερμοανθεκτικών προϊόντων. γ) Η επεξεργασία των κυττάρων με αλκαλικό διάλυμα (ph για 20 min). Πλεονέκτημα της μεθόδου θεωρείται η απενεργοποίηση των πρωτεασών, ενώ μειονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι, η τεχνική προϋποθέτει τη σταθερότητα του ενζύμου στις υψηλές τιμές ph που εφαρμόζονται. δ) Η επεξεργασία με ένζυμα. Για παράδειγμα, το ένζυμο λυσοζύμη καταλύει την υδρόλυση των β-1,4 γλυκοσιδικών δεσμών των βλεννοπεπτιδίων του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος, οδηγώντας στη μείωση της δομικής σταθερότητας του κυτταρικού τοιχώματος. Συνήθως, η μέθοδος εφαρμόζεται σε συνδυασμό με άλλες διεργασίες, όπως το ωσμωτικό σοκ. Με αντίστοιχο τρόπο, η εφαρμογή ενζύμων, όπως οι γλυκανάσες σε συνδυασμό με πρωτεάσες, οδηγεί στη λύση του κυτταρικού τοιχώματος κυττάρων ζυμών. Το υψηλό κόστος των ενζύμων αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα στην εφαρμογή της μεθόδου σε βιομηχανική κλίμακα. ε) Χρήση επιφανειακά ενεργών ουσιών (επιφανειοενεργών ή απορρυπαντικών). Ο αμφίφιλος χαρακτήρας των ενώσεων αυτών βοηθά τη διαλυτοποίηση των λιπιδίων και των λιποπρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης, αυξάνοντας την διαπερατότητά της. Ιδιαίτερα τα μη ιονικά επιφανειοενεργά (όπως το TritonX-100) χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση πρωτεϊνών, ακόμη και σε μεγάλης κλίμακας εφαρμογές. Οι μηχανικές τεχνικές λύσης των κυττάρων χρησιμοποιούνται περισσότερο, τόσο σε βιομηχανική, όσο και σε εργαστηριακή κλίμακα. Οι τεχνικές αυτές περιλαμβάνουν: α) Την εφαρμογή υπερήχων. Με τον όρο υπέρηχοι αναφερόμαστε σε ηχητικά κύματα συχνότητας μεγαλύτερης των 20 ΚHz, τα οποία προκαλούν ωστικές δυνάμεις ικανές να διασπάσουν τα κύτταρα. Η μέθοδος εφαρμόζεται αποκλειστικά σε μικρή κλίμακα, καθώς η δύναμη δύσκολα μεταφέρεται σε μεγάλους όγκους, ενώ παράλληλα απαιτείται συνεχής ψύξη του βιολογικού υγρού, καθώς κατά τη διαδικασία παράγεται θερμότητα. 305

314 β) Την ομογενοποίηση με υψηλή πίεση. Η διαδικασία είναι γνωστή ως τεχνική Gaulin ή French-press και εφαρμόζεται ευρέως σε βιομηχανική κλίμακα. Η διάρρηξη των κυττάρων επιτυγχάνεται μετά τη διαβίβαση του κυτταρικού αιωρήματος υπό υψηλή πίεση ( psi) διαμέσου μιας μεταλλικής βαλβίδας, η οποία σχηματίζει μια μικρή δίοδο. Η έξοδος του αιωρήματος από τη βαλβίδα συνοδεύεται από απότομη μεταβολή της πίεσης, η οποία οδηγεί στη διάρρηξη των κυττάρων. Η μέθοδος είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στη διάρρηξη βακτηριακών κυττάρων (ιδιαίτερα των κατά Gram αρνητικών) και λιγότερο στη διάρρηξη ανθεκτικότερων κυττάρων, όπως αυτά των ζυμομυκήτων. γ) Το μηχανικό θρυμματισμό των κυττάρων. Σε εργαστηριακή κλίμακα, ο θρυμματισμός γίνεται με λυοτρίβηση των κυττάρων σε γουδί παρουσία σφαιριδίων υάλου ή αλουμίνας. Σε βιομηχανική κλίμακα, η λυοτρίβηση επιτυγχάνεται σε κυλινδρικούς θαλάμους που φέρουν περιστρεφόμενο άξονα με πτερύγια. Η περιστροφή του άξονα έχει ως αποτέλεσμα τη σύνθλιψη των κυττάρων στα σφαιρίδια χάλυβα ή υάλου ή στα τοιχώματα του κυλίνδρου. Κατά την παραπάνω διεργασία αναπτύσσονται υψηλές θερμοκρασίες και για το λόγο αυτό απαιτείται η ψύξη του κυλίνδρου με εξωτερικούς μανδύες. Πίνακας Μηχανικές και μη μηχανικές μέθοδοι για τη διάρρηξη κυττάρων και ιστών. Μηχανικές μέθοδοι Εφαρμογή υπερήχων Ομογενοποίηση με υψηλή πίεση Μηχανικός θρυμματισμός Ομογενοποίηση Επεξεργασία με εκχυμωτή υπό ψύξη Κονιορτοποίηση υπό ψύξη Μικροβιακά κύτταρα Ζωικοί ιστοί Φυτικοί ιστοί Ωσμωτικό σοκ Θερμικό σοκ Μη μηχανικές μέθοδοι Χρήση επιφανειοενεργών, οργανικών διαλυτών, αλκαλικού διαλύματος Εφαρμογή ενζύμων Εφαρμογή ενζύμων 306

315 Διάρρηξη ζωικών και φυτικών ιστών και κυττάρων Τα ζωικά κύτταρα διαρρηγνύονται σχετικά εύκολα εξαιτίας της έλλειψης κυτταρικού τοιχώματος. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η διάρρηξη των ερυθροκυττάρων, η οποία επιτυγχάνεται με απλή μεταβολή της ωσμωτικής πίεσης. Στην περίπτωση των ζωικών ιστών, η τυπική διαδικασία περιλαμβάνει τον τεμαχισμό του ιστού σε μικρά τεμάχια και την επεξεργασία αυτών σε εκχυμωτή (blender) παρουσία ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος. Τα φυτικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από ανθεκτικό κυτταρικό τοίχωμα και διαρρηγνύονται δυσκολότερα. Η διαδικασία απαιτεί την ταχεία επεξεργασία με εκχυμωτή σε ψυχρό περιβάλλον ή την κονιορτοποίηση του ιστού έπειτα από προσθήκη υγρού αζώτου και την εκχύλιση με ρυθμιστικό διάλυμα. Για την εξουδετέρωση ενώσεων όξινου χαρακτήρα, όπως οι φαινόλες, κατά τη διαδικασία της επεξεργασίας χρησιμοποιούνται ρυθμιστικά διαλύματα με τιμές ph Τα ρυθμιστικά αυτά διαλύματα μπορούν να περιέχουν συνθετικά πολυαμίδια (π.χ πολυβινυλο-πυρρολιδόνη, PVP) ή αναγωγικά αντιδραστήρια (ασκορβικό οξύ, θειόλες), που αποτρέπουν τη συσσώρευση προϊόντων οξείδωσης των φαινολών (κινόνες), η παρουσία των οποίων είναι υπεύθυνη για την αδρανοποίηση των ενζύμων του φυτικού ιστού. Η εφαρμογή ενζύμων, όπως οι κυτταρινάσες και οι πηκτινάσες, αποτελούν μια εναλλακτική διαδικασία για τη διάρρηξη του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος, η εφαρμογή της μεθόδου όμως περιορίζεται από το υψηλό κόστος των ενζύμων Συμπύκνωση βιοτεχνολογικών προϊόντων Η διαδικασία που αφορά στη συμπύκνωση βιοτεχνολογικών προϊόντων επιτυγχάνεται με διαφορετικούς τρόπους, όπως: εξάτμιση, διήθηση με μεμβράνες, εκχύλιση, καθίζηση και προσρόφηση. Η επιλογή της τεχνικής που θα ακολουθηθεί καθορίζεται από τη φύση του προϊόντος και έχει ως κύριο κριτήριο την ελαχιστοποίηση της απώλειας της βιολογικής δραστικότητας του προϊόντος. 1) Εξάτμιση Η εξάτμιση είναι μια απλή αλλά συχνά ενεργειακά ασύμφορη μέθοδος απομάκρυνσης του νερού, η οποία συχνά εφαρμόζεται σε μεγάλη κλίμακα χρησιμοποιώντας ατμό ως πηγή θέρμανσης. Καθώς τα περισσότερα βιοτεχνολογικά 307

316 προϊόντα είναι θερμοευαίσθητα, χρησιμοποιούνται συσκευές εξάτμισης, οι οποίες προϋποθέτουν μικρό χρόνο παραμονής των μορίων αυτών στο χώρο εξάτμισης. Οι συσκευές εξάτμισης αποτελούνται από το χώρο εξάτμισης όπου διοχετεύεται το ρεύμα ατμού, το τμήμα όπου ο ατμός και το συμπύκνωμα διαχωρίζονται, καθώς και ψυκτήρα για τη συμπύκνωση της αέριας φάσης. Διάφοροι τύποι συσκευών εξάτμισης έχουν αναπτυχθεί, τόσο για εργαστηριακή χρήση (με ρυθμό εξάτμισης νερού έως 1 lh -1 ), όσο και σε βιομηχανική κλίμακα (150 m 3 h -1 ). Oι συσκευές εξάτμισης λεπτής στιβάδας (film evaporators), στις οποίες το προς συμπύκνωση διάλυμα διέρχεται από το χώρο εξάτμισης υπό μορφή λεπτής στιβάδας, χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιοτεχνολογία. Ο χώρος εξάτμισης μπορεί να είναι κύλινδρος ή δίσκος. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο φυγοκεντρικός συμπυκνωτής ωθούμενης λεπτής στιβάδας (centrifugal forced-film evaporators), στον οποίο η εξάτμιση γίνεται πάνω σε κωνικές επιφάνειες ή δίσκους, στους οποίους το ρευστό κινείται με τη φυγόκεντρο δύναμη που αναπτύσσεται από περιστρεφόμενο τύμπανο. Στο συμπυκνωτή αυτού του τύπου, το προς συμπύκνωση ρευστό παραμένει για μερικά μόνο δευτερόλεπτα στο χώρο εξάτμισης, έτσι ώστε ακόμη και θερμοευαίσθητα μόρια να συμπυκνώνονται χωρίς απώλεια της δραστικότητάς τους. 2) Εκχύλιση υγρής-υγρής φάσης. Η εκχύλιση υγρής-υγρής φάσης εφαρμόζεται σε μεγάλη κλίμακα στη βιοτεχνολογία, τόσο στη συμπύκνωση όσο και στον καθαρισμό βιολογικά ενεργών ενώσεων. Η διαδικασία αφορά στη μεταφορά μιας διαλυτής ουσίας από μια υγρή φάση σε άλλη. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου εξαρτάται από την κατανομή της ουσίας μεταξύ των δύο φάσεων. Το μέτρο της κατανομής ορίζεται από τον συντελεστή κατανομής P ως εξής: όπου: Coρ Cυ C P (13.1) C συγκέντρωση της ένωσης στην οργανική φάση συγκέντρωση της ένωσης στην υδατική φάση Οι φυσικοχημικές ιδιότητες του προϊόντος καθορίζουν τις απαιτήσεις της διαδικασίας εκχύλισης, όπως περιγράφεται στη συνέχεια. 308

317 α) Εκχύλιση προϊόντων μικρού μοριακού βάρους Μόρια λιπόφιλου (μη πολικού) χαρακτήρα μικρού σχετικά μοριακού βάρους, εκχυλίζονται με τη βοήθεια οργανικού διαλύτη μη αναμίξιμου με το νερό. Η κατανομή του μορίου-στόχος στις δύο φάσεις βασίζεται: α) Στη διαφορά διαλυτότητας της ένωσης στις δύο φάσεις και αφορά μόρια που δεν είναι φορτισμένα. Στην περίπτωση αυτή, η βελτιστοποίηση της εκχύλισης προϋποθέτει την επιλογή κατάλληλου οργανικού διαλύτη, τέτοιου ώστε ο συντελεστής κατανομής P να λαμβάνει υψηλή τιμή. β) Στη διαφορά της σταθεράς διάστασης μιας ιοντικής ένωσης μεταξύ των δύο φάσεων, η οποία μπορεί να είναι τόσο μεγάλη, ώστε να υπερκαλύπτει άλλους παράγοντες που καθορίζουν την κατανομή της ένωσης. Η μέθοδος εφαρμόζεται με επιτυχία στην εκχύλιση της πενικιλλίνης, καθώς και άλλων αντιβιοτικών. γ) Στη μεταβολή της διαλυτότητας του προϊόντος ως αποτέλεσμα της προσθήκης ενώσεων (π.χ. ενώσεων φωσφόρου ή αλειφατικών αμινών) στην οργανική φάση, οι οποίες αλληλεπιδρούν εκλεκτικά με το προϊόν σχηματίζοντας σύμπλοκα, τα οποία είναι αδιάλυτα στην υδατική φάση. Η μέθοδος οδηγεί σε ικανοποιητικά αποτελέσματα στην περίπτωση υδατοδιαλυτών προϊόντων, όπως τα οργανικά οξέα. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, κύτταρα και άλλα σωματίδια απομακρύνονται πριν την εφαρμογή της εκχύλισης, ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός γαλακτώματος στη διεπιφάνεια. Μετά την εκχύλιση το προϊόν ανακτάται από το διαλύτη, είτε με απόσταξη, είτε, στην περίπτωση θερμοευαίσθητου προϊόντος, με αντίστροφη εκχύλιση (back-extraction), σε μια νέα υδατική φάση σε συνθήκες διαφορετικές από την πρώτη εκχύλιση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η περίπτωση, όπου ο οργανικός διαλύτης αντικαθίσταται από κάποιο υπερκρίσιμο ρευστό (supercritical fluid, SCF). Με τον όρο αυτό αναφερόμαστε σε αέρια (CO2, αιθάνιο, προπάνιο) που περνούν σε ρευστή κατάσταση, όταν η πίεση και η θερμοκρασία υπερβεί τις αντίστοιχες κρίσιμες τιμές που είναι χαρακτηριστικές για κάθε ένωση. Στις υπερκρίσιμες αυτές τιμές πίεσης και θερμοκρασίας, πολλές από τις φυσικοχημικές ιδιότητες των υπερκρίσιμων ρευστών βρίσκονται μεταξύ αυτών των αερίων και των υγρών. Το πλεονέκτημα της μεθόδου έγκειται στο γεγονός ότι, οι ιδιότητες του υπερκρίσιμου ρευστού και κυρίως η διαλυτική του ικανότητα μπορούν εύκολα να ελεγχθούν με μεταβολή της πίεσης ή και της θερμοκρασίας. Το υπερκρίσιμο CO2 βρίσκει τη μεγαλύτερη εφαρμογή στην υπερκρίσιμη εκχύλιση, ιδιαίτερα σε διαδικασίες που αφορούν τη βιομηχανία 309

318 τροφίμων, καθώς οι κρίσιμες τιμές πίεσης και θερμοκρασίας είναι σχετικά χαμηλές (72.9 bar και 31.3 ο C αντίστοιχα), ενώ παράλληλα είναι φθηνό, μη τοξικό και μη εύφλεκτο. Σε μια τυπική διαδικασία εκχύλισης, στην εκχυλιστική στήλη το συμπιεσμένο υπερκρίσιμο CO2 έρχεται σε επαφή με το προς εκχύλιση υλικό και στη συνέχεια μεταφέρεται στο διαχωριστή, όπου με μείωση της πίεσης το ρευστό επιστρέφει στην αέρια κατάσταση ελευθερώνοντας το προϊόν ως ίζημα. β) Κατανομή πρωτεϊνών σε υδατικά διφασικά συστήματα Τα υδατικά διφασικά συστήματα παρασκευάζονται με προσθήκη καθορισμένων ποσοτήτων δύο διαφορετικών πολυμερών (π.χ. πολυαιθυλενογλυκόλης PEG και δεξτράνες μεγάλου μοριακού βάρους), ή ενός πολυμερούς (PEG) και ενός άλατος (φωσφορικό κάλιο) σε νερό, και βρίσκουν εφαρμογή στην εκχύλιση των πρωτεϊνών. Οι δύο φάσεις που σχηματίζονται είναι εμπλουτισμένες σε PEG (άνω φάση) και δεξτράνη ή άλας (κάτω φάση). Η κατανομή μιας ουσίας στις δύο φάσεις του συστήματος εξαρτάται από την υδροφοβικότητα της ουσίας, αλλά και από τη σύσταση των δύο φάσεων, το ph, την ιοντική ισχύ και τη θερμοκρασία. Έχει παρατηρηθεί ότι στην περίπτωση μικρών μορίων, η κατανομή τους στις δύο φάσεις δεν διαφέρει σημαντικά. Αντίθετα, στην περίπτωση των πρωτεϊνών έχει παρατηρηθεί ότι τα υδρόφοβα μόρια κατανέμονται κυρίως στην άνω φάση του PEG, ενώ υδρόφιλες ή φορτισμένες πρωτεΐνες τείνουν να κατανεμηθούν στην κάτω φάση. Η εκλεκτικότητα κατά την εκχύλιση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης από ένα μίγμα πρωτεϊνών αυξάνει σημαντικά, στην περίπτωση όπου εξειδικευμένα προσδέματα (ligants) συνδεθούν με ένα εκ των δύο πολυμερών, τα οποία αποτελούν το διφασικό σύστημα εκχύλισης (βλ.σχήμα 13.5) Αν κατά την παρασκευή του υδατικού διφασικού συστήματος προστεθεί και το υλικό που προκύπτει από τη διάρρηξη κυττάρων, τότε μια ακόμη φάση σχηματίζεται μεταξύ των δύο προηγουμένων. Η φάση αυτή περιέχει ολόκληρα κύτταρα και θραύσματα των κυττάρων, ενώ οι διαλυτοποιημένες πρωτεΐνες κατανέμονται μεταξύ των δύο ακραίων φάσεων. Κατά συνέπεια, με την τεχνική της κατανομής σε υδατικό διφασικό σύστημα, επιτυγχάνεται αφενός ο διαχωρισμός στερεών σωματιδίων και διαλυτών κυτταρικών συστατικών και αφετέρου η μερική απομάκρυνση των ανεπιθύμητων πρωτεϊνών. Η διαδικασία εύκολα προσαρμόζεται σε μεγάλη κλίμακα με τη χρήση κατάλληλων εκχυλιστικών συσκευών. Στη βιομηχανία 310

319 εφαρμόζεται το σύστημα PEG/άλας κυρίως εξαιτίας του χαμηλού κόστους του (βλ. σχήμα 13.6). Ένα άλλο σύστημα που χρησιμοποιείται στην απομόνωση των πρωτεϊνών είναι αυτό των αντίστροφων μικυλλίων (βλ. παράγραφο 9.3.3). Τα αντίστροφα μικκύλια έχουν την ικανότητα να «φιλοξενήσουν» στο εσωτερικό τους πρωτεΐνες και ένζυμα χωρίς απώλεια της βιολογικής τους δράσης. Το σύστημα βρίσκει εφαρμογή στην εκχύλιση πρωτεϊνικών μορίων από ένα υδατικό διάλυμα. Η εκχυλιστική ικανότητα των μικκυλίων βασίζεται σε ηλεκτροστατικές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ του πρωτεϊνικού μορίου και των επιφανειοενεργών μορίων και κατά συνέπεια εξαρτάται από το ph και την ιοντική ισχύ. Οι κυριότερες διεργασίες που επιτελούνται με την εφαρμογή μεμβρανών και βρίσκουν εφαρμογή σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες είναι η μικροδιήθηση (microfiltration), η υπερδιήθηση (ultrafiltration), η αντίστροφη ώσμωση (reverse osmosis ή hyperfiltration), η υπερεξάτμιση (pervaporation) και η υπερεκχύλιση (perstraction) Οι κύριες βιοτεχνολογικές εφαρμογές των τεχνικών αυτών παρουσιάζονται στον πίνακα Κατά τη διαδικασία της διήθησης με μεμβράνες, τα σωματίδια με μέγεθος μικρότερο από τους πόρους της μεμβράνης, διέρχονται υπό την επίδραση πίεσης ή και άλλης δύναμης; μέσα από τη μεμβράνη, ενώ μεγαλύτερα σωματίδια κατακρατούνται και παραμένουν στο αρχικό υλικό. Οι τεχνικές της μικροδιήθησης και της υπερδιήθησης που χρησιμοποιούνται σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες, αλλά και στην κατιούσα επεξεργασία βιομορίων, διαφέρουν ως προς το μοριακό μέγεθος των ουσιών τις οποίες διηθούν. Η μικροδιήθηση εφαρμόζεται στο διαχωρισμό σωματιδίων με διάμετρο 0.02 έως 10 μm ενώ η υπερδιήθηση διαχωρίζει σωματίδια με διάμετρο από έως 0.02 μm. Και οι δύο τεχνικές βρίσκουν ευρεία εφαρμογή στα πρώτα στάδια κάθετης επεξεργασίας. Η μικροδιήθηση χρησιμοποιείται για χονδροειδείς διαχωρισμούς στερεών από υγρά, όπως στον διαχωρισμό της υγρής φάσης από καλλιέργειες. Αντίθετα, η υπερδιήθηση εφαρμόζεται κυρίως για τη συμπύκνωση ενζυμικών και πρωτεϊνικών διαλυμάτων αλλά και για την απομάκρυνση ουσιών μικρού μοριακού μεγέθους. 311

320 Σχήμα Κατανομή πρωτεϊνών σε διφασικό σύστημα πολυμερών παρουσία εξειδικευμένου προσδέματος. Ζυμωτήρας + PEG Ανακύκλωση PEG Aνακύκλωση άλατος mixer mixer Ομογενοποιητής + AΛΑΤΙ Φάση πλούσια σε άλας. Υπολείμματα κυτταρικού τοιχώματος, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα Φυγόκεντρος Φάση πλούσια σε άλας. Προϊόν Φυγόκεντρος Υπερδιήθηση Προϊόν Σχήμα Διεργασία εκχύλισης πρωτεϊνών σε υδατικό διφασικό σύστημα PEG/άλατος συνδυαζόμενη με την ανακύκλωσή τους. 312

321 Αρχικά, η διήθηση με μεμβράνες γινόταν κυρίως με την τεχνική της κάθετης ή αδιέξοδης ροής (dead-end filtration), κατά την οποία το διηθούμενο υλικό ρέει υπό πίεση κατά διεύθυνση κάθετη προς την επιφάνεια του ηθμού. Η συνεχής συσσώρευση στερεού υλικού στην επιφάνεια του ηθμού έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση με το χρόνο της ροής διαμέσου της μεμβράνης. Η τεχνική που σήμερα εφαρμόζεται περισσότερο, ιδιαίτερα για τον διαχωρισμό κυττάρων από την καλλιέργεια σε μεγάλη κλίμακα, είναι η τεχνική της παράλληλης ροής (tangential-flow ή cross-flow). Στην τεχνική αυτή, το προς διήθηση υλικό ρέει κατά διεύθυνση παράλληλη προς την επιφάνεια του ηθμού. Παράλληλα, το στρώμα του στερεού υλικού είναι σημαντικά πιο λεπτό σε σχέση με αυτό που σχηματίζεται στη διήθηση αδιέξοδης ροής επιτρέποντας έτσι την επίτευξη υψηλών ροών. USA Φωτογραφία Εσωτερική δομή πόρων μεμβράνης της εταιρείας Μilipore, Κύριες διατάξεις διήθησης παράλληλης ροής αποτελούν οι ηθμοί κοίλων ινών (hollowfibres), οι οποίοι βρίσκουν εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα καθώς χαρακτηρίζονται από μεγάλη επιφάνεια ανά μονάδα όγκου. Ο ηθμός του τύπου αυτού, αποτελείται από δέσμη κοίλων ινών τοποθετημένη σε ειδικό δοχείο, ενώ το προς διήθηση υλικό κινείται εσωτερικά κατά μήκος των κοίλων ινών. Το διήθημα διαπερνά εγκάρσια τους πόρους των ινών, εκβάλλοντας στον περιβάλλοντα χώρο, ενώ το διηθούμενο υγρό εξέρχεται συμπυκνωμένο και εισέρχεται εκ νέου στο σύστημα (βλ. σχήμα 13.7). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι μεμβρανικοί ηθμοί οι οποίοι φέρουν φορτισμένες ομάδες που δρουν ως ιοντοανταλλάκτες ή προσδέματα συγγένειας, 313

322 γνωστά με τον όρο μεμβρανικοί προσροφητές (membrane adsrorbers), οι οποίοι προσδένουν αντιστρεπτά πρωτεϊνικά μόρια-στόχους. Η έκλουση των πρωτεϊνών γίνεται με τη χρήση διαλυμάτων όπως και στις αντίστοιχες χρωματογραφικές τεχνικές Πίνακας Χαρακτηριστικά διεργασιών διήθησης μέσω μεμβρανών. Διεργασία Κατευθυντήρια δύναμη Εφαρμογές Μικροδιήθηση Υδροστατική πίεση Διαφορά πίεσης 0.5-2bar Συμπύκνωση βακτηρίων και ιών Διαχωρισμός κυττάρων Υπερδιήθηση Διαφορά πίεσης 2-10bar Διαχωρισμός βιομορίων Αντίστροφη Ώσμωση Hλεκτροδιαπίδυση Υπερεξάτμιση Διαφορά πίεσης bar Διαφορά στο ηλεκτρικό πεδίο Διαφορά στη μερική πίεση ατμών Καθαρισμός ενζύμων Αφαλάτωση Παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων Συμπύκνωση φαρμακευτικών προϊόντων Παραγωγή λακτόζης Μερική αφαλάτωση διαλυμάτων Καθαρισμός μικρών φορτισμένων ενώσεων όπως τα οργανικά οξέα Εκλεκτική απομάκρυνση διαλυτών (αιθανόλη) κατά τη ζύμωση Καθαρισμός διαλυτών από αζεοτροπικά μίγματα Υπερεκχύλιση Κατανομή μεταξύ φάσεων Εκχύλιση μικρών μορίων από υδατικά/οργανικά διαλύματα Η τεχνική της αντίστροφης ώσμωσης αφορά στο διαχωρισμό μορίων μικρού μοριακού μεγέθους (άλατα, ιόντα, οργανικές ενώσεις κ.ά.) ο οποίος γίνεται διαμέσου μεμβρανών με τη βοήθεια υψηλής πίεσης. Η πίεση αυτή εφαρμόζεται για να υπερνικήσει την ωσμωτική πίεση της διαλυμένης ουσίας και τη διάχυση του διαλύτη μέσα από τη μεμβράνη. Η τεχνική εφαρμόζεται σε βιομηχανική κλίμακα τόσο για τη συμπύκνωση διαλυμάτων (με απομάκρυνση νερού), όσο και σε διεργασίες αφαλάτωσης ή απομάκρυνσης οργανικών ενώσεων μικρού μοριακού βάρους. 314

323 Διαλύτης & ενώσεις μικρού μοριακού βάρους Μεμβράνη Ενώσεις μεγάλου μοριακού βάρους Σχήμα Σχηματική απόδοση συστήματος ηθμού κοίλων ινών. H τεχνική της υπερεξάτμισης εφαρμόζεται για τον διαχωρισμό πτητικών προϊόντων, όπως για παράδειγμα είναι οργανικοί διαλύτες, που παράγονται κατά διάρκεια της ζύμωσης. Η διαδικασία συνδυάζει τόσο τη διέλευση των συστατικών, μέσα από τον μεμβρανικό ηθμό, όσο και την εξάτμιση που είναι αποτέλεσμα της μειωμένης πίεσης από την άλλη πλευρά της μεμβράνης (σχήμα 13.8). Κατά συνέπεια, ο διαχωρισμός βασίζεται τόσο στη διαχωριστική ικανότητα του μεμβρανικού ηθμού όσο και στη διαφορά της τάσης ατμών των συστατικών του προς διήθηση μίγματος. Η τεχνική της υπερεκχύλισης εφαρμόζεται τόσο στη συμπύκνωση όσο και το διαχωρισμό βιοτεχνολογικών προϊόντων συνδυάζοντας τόσο τη διήθηση με μεμβρανικό ηθμό όσο και τη διαδικασία εκχύλισης με διαλύτη. Η τεχνική βασίζεται στη χρήση μεμβρανικών ηθμών ως φράγμα μεταξύ του προς διήθηση υδατικού διαλύματος και ενός οργανικού διαλύτη. Η διαδικασία βρίσκει εφαρμογή στην ανάκτηση υδρόφοβων ενώσεων από το μίγμα καλλιέργειας. Η παρουσία της μεμβράνης αποτρέπει την ανεπιθύμητη επαφή των κυττάρων της ζύμωσης με τον οργανικό διαλύτη που χρησιμοποιείται στην εκχύλιση. 315

324 Είσοδος δείγματος Υγρή φάση Μεμβράνη Αέρια φάση Αντλία κενού Διήθημα Ψυκτήρας Συμπύκνωμα Σχήμα 13.8.Σχηματική παράσταση της υπερεξάτμισης. 3) Κατακρήμνιση Η κατακρήμνιση βρίσκει μεγάλη εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα ιδιαίτερα για τη συμπύκνωση πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών αλλά και για την απομάκρυνση παραπροϊόντων (όπως τα νουκλεϊκά οξέα οι χρωστικές ενώσεις κ.ά.), από το διάλυμα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η κατακρήμνιση των πρωτεϊνών, η οποία βασίζεται σε μείωση της διαλυτότητάς της η οποία επάγεται από εξωτερικούς παράγοντες που περιγράφονται στη συνέχεια. Κατακρήμνιση με προσθήκη αλάτων Η σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης ενός άλατος σε ένα πρωτεϊνικό διάλυμα (συνήθως με συγκέντρωση μεγαλύτερη από 50% w/v), συνεπάγεται την ενυδάτωση των αντίστοιχων ιόντων. Για την ενυδάτωση των ιόντων συμμετέχουν τόσο τα ελεύθερα μόρια νερού, όσο και «δεσμευμένα» μόρια νερού από την επιφάνεια των πρωτεϊνών και ιδιαίτερα από το περιβάλλον υδρόφοβων περιοχών της επιφάνειάς τους. Μετά την απομάκρυνση των «δεσμευμένων» μορίων νερού οι υδρόφοβες περιοχές είναι πλέον ελεύθερες να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους, σχηματίζοντας συσσωματώματα τα οποία κατακρημνίζονται. Καθώς το φαινόμενο της κατακρήμνισης των πρωτεϊνών σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος είναι αποτέλεσμα υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, όσο περισσότερες υδρόφοβες περιοχές εντοπίζονται στην επιφάνεια του πρωτεϊνικού μορίου τόσο εντονότερο είναι το 316

325 φαινόμενο αυτό. Το πιο κοινό αντιδραστήριο για την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών είναι το θειικό αμμώνιο καθώς παρουσιάζει υψηλή διαλυτότητα στο νερό, δεν αναστέλλει τη δράση των περισσοτέρων ενζύμων και το κόστος του είναι χαμηλό. Αξίζει να σημειωθεί ότι η δράση του άλατος εξαρτάται άμεσα από παράγοντες όπως η θερμοκρασία και το ph. Η κατακρήμνιση διευκολύνεται όταν το ph του διαλύματος έχει τιμή κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης. Παράλληλα η αύξηση της θερμοκρασίας σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος, οδηγεί σε αύξηση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και κατά συνέπεια υποβοηθά τη συσσωμάτωση των πρωτεϊνικών μορίων και την καταβύθισή τους. Κατακρήμνιση με προσθήκη οργανικών διαλυτών Η προσθήκη πολικών οργανικών διαλυτών όπως η ακετόνη, η αιθανόλη ή η προπανόλη-2, σε υδατικό πρωτεϊνικό διάλυμα οδηγεί σε μείωση της διηλεκτρικής σταθεράς του διαλύματος, η οποία συνοδεύεται από μείωση του βαθμού ενυδάτωσης των πρωτεϊνών. Η μείωση της διηλεκτρικής σταθεράς οδηγεί σε ανάπτυξη ισχυρότερων ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ αντίθετα φορτισμένων πρωτεϊνικών μορίων με αποτέλεσμα την συσσωμάτωση και την κατακρήμνισή τους. Καθώς θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 10 ο C είναι δυνατό να οδηγήσουν σε μετουσίωση των πρωτεϊνών, η προσθήκη διαλύτη γίνεται σε χαμηλές θερμοκρασίες (συνήθως υπό του μηδενός). Σε βιομηχανική κλίμακα, η μέθοδος δεν βρίσκει μεγάλη εφαρμογή καθώς η πλειοψηφία των διαλυτών που χρησιμοποιούνται είναι εύφλεκτοι. Αντίθετα, η βακτηριοκτόνος δράση των διαλυτών αυτών αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα σε ορισμένες βιομηχανικές εφαρμογές. Κατακρήμνιση με προσθήκη πολυμερών Τα άλατα και οι οργανικοί διαλύτες δεν είναι οι μόνοι παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν κατακρήμνιση των πρωτεϊνών χωρίς τη μετουσίωσή τους. Για παράδειγμα, η χρησιμοποίηση πολυμερών μεγάλου μοριακού βάρους παρουσιάζει σημαντικό ενδιαφέρον. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η προσθήκη πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), με μοριακό βάρος Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σε βιομηχανικό επίπεδο χρησιμοποιούνται φορτισμένα πολυμερή (πολυηλεκτρολύτες), καθώς είναι φθηνά και η εφαρμογή τους προϋποθέτει εξαιρετικά χαμηλή συγκέντρωση (έως 0.1% w/v). Τα πολυμερή σχηματίζουν 317

326 σύμπλοκα ηλεκτροστατικής φύσης με τις πρωτεΐνες οδηγώντας στην καθίζησή τους. Μειονέκτημα της χρήσης πολυμερών στον καθαρισμό των πρωτεϊνών είναι ότι αυτά στη συνέχεια δεν διαχωρίζονται εύκολα από το μίγμα των πρωτεϊνών. Κατακρήμνιση με μεταβολή του ph Η μέθοδος, γνωστή με τον όρο ως ισοηλεκτρική καταβύθιση, βασίζεται στη μείωση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης όταν το ph του διαλύματος λάβει τιμή ίση με αυτή που αντιστοιχεί στο ισοηλεκτρικό σημείο (pi) της πρωτεΐνης. Στο ισοηλεκτρικό σημείο η πρωτεΐνη έχει μηδενικό ηλεκτρικό φορτίο, με αποτέλεσμα να εξουδετερώνονται οι απωστικές δυνάμεις φύσης και να εμφανίζονται αντίστοιχες ελκτικές, οι οποίες βοηθούν στο σχηματισμό συσσωματωμάτων και στην κατακρήμνιση της πρωτεΐνης. Στα πρωτεϊνικά μίγματα η κατάσταση είναι πολυπλοκότερη, καθώς παρατηρείται κατακρήμνιση συσσωματωμάτων πρωτεϊνικών μορίων. Οι παραπάνω τεχνικές κατακρήμνισης των πρωτεϊνών δεν εμφανίζουν εκλεκτικότητα, καθώς βασίζονται σε ιοντικές ή υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που λιγότερο ή περισσότερο είναι κοινές σε όλες τις πρωτεΐνες. Τελευταία, έχουν αναπτυχθεί τεχνικές οι οποίες χαρακτηρίζονται από μεγάλη εξειδίκευση. Μια από τις τεχνικές αυτές είναι η κατακρήμνιση συγγένειας που περιγράφεται στη συνέχεια. Κατακρύμνιση πρωτεϊνών συναρτήσει του ph. 318

327 Κατακρήμνιση συγγένειας Η κατακρήμνιση συγγένειας (affinityprecipitation) βασίζεται στο σχηματισμό συμπλόκων μεταξύ των πρωτεϊνών με ειδικά προσδέματα, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με τα επονομαζόμενα «έξυπνα» πολυμερή, των οποίων η διαλυτότητα μεταβάλλεται με μικρές αλλαγές παραγόντων όπως το ph, η θερμοκρασία και η ιοντική ισχύς. Η εκλεκτικότητα της μεθόδου, ως προς τα μόρια-στόχους, είναι αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων συγγένειας σαν αυτές που χαρακτηρίζουν τη σύνδεση του αντιγόνου με το αντίσωμα. 4) Προσρόφηση Η τεχνική της προσρόφησης σε στερεά προσροφητικά υλικά χρησιμοποιείται ευρέως για τη συμπύκνωση βιοτεχνολογικών προϊόντων. Ο ενεργός άνθρακας είναι το πρώτο προσροφητικό υλικό που έχει χρησιμοποιηθεί. Χαρακτηρίζεται από μεγάλη πορώδη επιφάνεια (1.5x10 6 m 2 Kg -1 ), δεν εμφανίζει πολικά χαρακτηριστικά και δεν αλληλεπιδρά χημικά με τα προσροφημένα μόρια. Οι ιοντοαναταλλακτικές ρητίνες βρίσκουν επίσης μεγάλη εφαρμογή στη δέσμευση προϊόντων μικρού μοριακού βάρους, καθώς επίσης και πρωτεϊνών, ως αποτέλεσμα της μεγάλης δεσμευτικής ικανότητας που εμφανίζουν, του σχετικά χαμηλού κόστους, αλλά και της δυνατότητας άμεσης εφαρμογής τους (π.χ. στο υγρό μια ζύμωσης). Ένας άλλος τύπος προσροφητικών υλικών αφορά τα υδρόφοβα συνθετικά υλικά που χρησιμοποιούνται για την ανάκτηση μέσω προσρόφησης οργανικών κυρίως ενώσεων και σε ορισμένες περιπτώσεις και πρωτεϊνών. Το πλεονέκτημα της προσρόφησης έναντι της συμβατικής υγρής εκχύλισης είναι ότι η διαδικασία απαιτεί πολύ μικρότερες ποσότητες τοξικών και εύφλεκτων οργανικών διαλυτών. Μεγάλος είναι ο αριθμός των φορέων των προσροφητικών υλικών που χρησιμοποιούνται σήμερα στη βιομηχανία. Για την προσρόφηση βιοτεχνολογικών προϊόντων μικρού μοριακού βάρους όπως αντιβιοτικών, βιταμινών και πεπτιδίων χρησιμοποιούνται φορείς με βάση το πολυστυρένιο ή τους ακρυλικούς και μεθακρυλικούς εστέρες. Αντίστοιχα, για την προσρόφηση βιομορίων (πρωτεϊνών) χρησιμοποιούνται φορείς κυτταρίνης Διαχωρισμός βιοτεχνολογικών προϊόντων με χρωματογραφία H χρωματογραφία είναι η τεχνική που βρίσκει εφαρμογή στα στάδια υψηλού καθαρισμού βιοτεχνολογικών προϊόντων ιδιαίτερα πρωτεϊνών και ενζύμων. Η αρχή 319

328 όλων των χρωματογραφικών τεχνικών είναι η ίδια, καθώς βασίζεται στην κατανομή των συστατικών του μίγματος μεταξύ μιας κινητής υγρής φάσης (mobileliquidphase) και μιας στατικής φάσης (stationaryphase). H στατική φάση (χρωματογραφικό υλικό) αποτελείται από ομοιόμορφα σωματίδια συνήθως σφαιρικής μορφής με μηχανική, χημική και βιολογική σταθερότητα. Το υλικό αυτό τοποθετείται σε χρωματογραφική στήλη και εξισορροπείται με κατάλληλο διαλύτη. Το προς διαχωρισμό μίγμα προστίθεται (φορτώνεται) στη στήλη και ακολουθεί η διαβίβαση της κινητής υγρής φάσης (έκλουση), η οποία παρασύρει τα συστατικά του μίγματος προς την έξοδο της στήλης. Η έκλουση των συστατικών του μίγματος επιτυγχάνεται είτε με ισοκρατικό τρόπο (isocraticmode), είτε με διαβάθμιση (gradient) της έκλουσης. Στην πρώτη περίπτωση, η ίδια κινητή φάση εφαρμόζεται καθ όλη τη διάρκεια του διαχωρισμού και ο διαχωρισμός των συστατικών εξαρτάται από το χρόνο κατακράτησης στη στήλη. Αντίθετα, στη δεύτερη περίπτωση, η υγρή φάση μεταβάλλεται συνεχώς με σκοπό την αποδέσμευση των συστατικών που είναι συνδεδεμένα με μη ομοιοπολικές δυνάμεις στο χρωματογραφικό υλικό. Η ανίχνευση των εξερχόμενων συστατικών γίνεται συνεχώς με φασματοσκοπικές τεχνικές (π.χ. μέτρηση της απορρόφησης στα 280 nm για τις πρωτεΐνες), ενώ η εξερχόμενη υγρή φάση συλλέγεται σε κλάσματα καθορισμένου όγκου με τη βοήθεια αυτοματοποιημένου κλασματικού συλλέκτη. 320

329 Στον πίνακα 13.3 παρουσιάζονται οι διάφορες χρωματογραφικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται στο διαχωρισμό των πρωτεϊνών. Οι τεχνικές αυτές εκμεταλλεύονται ορισμένα χαρακτηριστικά των πρωτεϊνικών μορίων, όπως το μέγεθος, το φορτίο, την παρουσία υδρόφοβων περιοχών στην επιφάνεια του μορίου ή την παρουσία περιοχών οι οποίες αναγνωρίζονται από άλλα μόρια. Στον πίνακα εμφανίζονται τα κυριότερα χρωματογραφικά υλικά που χρησιμοποιούνται στις διάφορες τεχνικές για την πλήρωση των χρωματογραφικών στηλών. Τα τελευταία χρόνια, χρησιμοποιούνται χρωματογραφικά υλικά με βελτιωμένες φυσικές ιδιότητες και με εξαιρετική διαχωριστική ικανότητα που είναι αποτέλεσμα της παρουσίας πολύ μικρών σωματιδίων από τα οποία αποτελούνται. Τα σωματίδια αυτά, εμφανίζουν ισχυρή αντίσταση στη ροή της υγρής φάσης, με αποτέλεσμα να απαιτείται η εφαρμογή χρωματογραφικών συστημάτων που να λειτουργούν σε υψηλή πίεση. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (high performance liquid chromatography, HPLC) καθώς και η ταχεία υγρή χρωματογραφία πρωτεϊνών (fast protein liquid chromatography, FPLC) αποτελούν σήμερα χρήσιμα εργαλεία στον καθαρισμό πρωτεϊνών, ενώ η δυνατότητά τους εκτείνεται μέχρι την πιλοτική κλίμακα. Τα κύρια χαρακτηριστικά των τεχνικών υγρής χρωματογραφίας περιγράφονται στη συνέχεια. α) Xρωματογραφία διαπερατότητας ή αποκλεισμού ή μοριακού ηθμού (gelpermeation ή gelexclusion ή gelfiltrationchromatography). Tα συστατικά του πρωτεϊνικού διαλύματος διαχωρίζονται με βάση το μοριακό τους μέγεθος και στο σχήμα τα οποία καθορίζουν την κατανομή τους στο εσωτερικό της στατικής φάσης αποτελούμενη από πορώδη σφαιρίδια πηκτής (gel) και τον εξωτερικό χώρο των σφαιριδίων όπου εντοπίζεται η υγρή κινητή φάση. Αυτό σημαίνει ότι μόρια με διάμετρο μικρότερη από εκείνη των πόρων των σωματιδίων της πηκτής, διαχέονται στο εσωτερικό των σωματιδίων και καθυστερούν καθώς κινούνται στη στήλη, σε αντίθεση με τα βιομόρια μεγαλύτερου μεγέθους τα οποία κινούνται μαζί με το μέτωπο του διαλύτη στον εξωτερικό χώρο (βλ. σχήμα 13.9). 321

330 Πίνακας Χρωματογραφικές τεχνικές για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών Μοριακή ιδιότητα Τύπος χρωματογραφίας Χαρακτηριστικά Εφαρμογή Μέγεθος Διαπερατότητας Διαχωριστική ικανότητα : μέτρια Χωρητικότητα: μικρή Ταχύτητα: αργή Στα τελικά στάδια Φορτίο Ιοντοανταλλαγής Διαχωριστική ικανότητα: υψηλή Χωρητικότητα: υψηλή Ταχύτητα: υψηλή Στα αρχικά στάδια Βιολογική συγγένεια Συγγένειας Διαχωριστική ικανότητα : πολύ υψηλή Χωρητικότητα: εξαρτάται από το δεσμευτή Ταχύτητα: υψηλή Κυρίως στα αρχικά στάδια Η χρωματογραφία διαπερατότητας εφαρμόζεται κυρίως σε εργαστηριακή κλίμακα και πολύ λιγότερο σε βιομηχανική. Ο περιορισμός αυτός είναι απόρροια κυρίως του γεγονότος ότι ο όγκος του προς ανάλυση πρωτεϊνικού διαλύματος δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερος από το 1-5% του συνολικού όγκου του υλικού της χρωματογραφικής στήλης, ενώ η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυμα δεν μπορεί να είναι πολύ υψηλή (10-30 mg/ml). Παρ όλα αυτά, η τεχνική εφαρμόζεται σε βιομηχανική κλίμακα για τη γρήγορη απομάκρυνση μικρομοριακών ενώσεων (άλατα, συνένζυμα, μέταλλα) από το πρωτεϊνικό διάλυμα, όπως για παράδειγμα στον καθαρισμό των πρωτεϊνών γάλακτος από λακτόζη και διάφορα άλατα. Η χρωματογραφία διαπερατότητας έχει βρει εφαρμογή σε ευρείας κλίμακας διεργασίες, όπως είναι ο διαχωρισμό της ινσουλίνης από την προϊνσουλίνη, αλλά και ο καθαρισμός νουκλεασών περιορισμού και άλλων ενζύμων σε χρωματογραφικές στήλες όγκου λίτρων. 322

331 Αγαρόζη Πίνακας Oρισμένα βασικά υλικά υγρής χρωματογραφίας στήλης που χρησιμοποιούνται στον καθαρισμό πρωτεϊνών σε ευρεία κλίμακα. Υλικό Εμπορική ονομασία Βio-Gel Ηi Trap Sepharose CL Sepharose HP Ultrogel A Supercose Χρωματογραφική τεχνική Συγγένειας και ιοντοανταλλαγής Δεξτράνη Sephadex Διαπερατότητας Κυτταρίνη Sephacel Whatman TM Cellufine Cellex Ιοντοανταλλαγής Πολυακρυλαμίδιο BioGel P Διαπερατότητας Συμπολυμερές Sephacryl Διαπερατότητας πολυακρυλαμιδίου/δεξτράνης Συμπολυμερές Superdex Διαπερατότητας αγαρόζης/δεξτράνης Συμπολυμερές UltrogelAcA Δαπερατότητας αγαρόζης/πολυακρυλαμιδίου Πολυσακχαριτικό πήκτωμα HyperD Συγγένειας και ιοντοανταλλαγής Αρωματικοί πυρήνες Πολυστυρένιο/διβινυλοβενζένιο Poros Συγγένειας και ιοντοανταλλαγής Διοξείδιοτου πυριτου/δεξτράνη Spherodex Iοντοανταλλαγής β) Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (ion exchange chromatography). Η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι η τεχνική που χρησιμοποιείται περισσότερο στον καθαρισμό πρωτεϊνών σε βιομηχανική κλίμακα. Η τεχνική βασίζεται στην ιδιότητα των πρωτεϊνών να προσροφούνται με αντιστρέψιμο τρόπο σε κάποιον ιοντοανταλλάκτη. Η σύνδεση του πρωτεϊνικού μορίου στον ιοντοανταλλάκτη επιτυγχάνεται μέσω των ελκτικών ηλεκτροστατικών δυνάμεων που αναπτύσσονται μεταξύ των πρωτεϊνικών μορίων και των αρνητικά ή θετικά φορτισμένων ομάδων (καρβοξυλομάδες ή τριτοταγείς αμινομάδες) που είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένες στο πολυμερές υλικό πλήρωσης της χρωματογραφικής στήλης. Τα κυριότερα είδη ομάδων ιοντοανταλλακτών που χρησιμοποιούνται εμφανίζονται στον πίνακα Η έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη επιτυγχάνεται είτε με αύξηση της ιοντικής ισχύς του διαλύματος έκλουσης(μειώνοντας με τον τρόπο αυτό τις ηλεκτροστατικές 323

332 δυνάμεις), είτε με μεταβολή του ph του διαλύματος (οπότε μεταβάλλεται το ηλεκτρικό φορτίο της πρωτεΐνης). Σχήμα Διαχωρισμός πρωτεϊνών με χρωματογραφία μοριακού ηθμού. 324 Σχήμα Διαχωρισμός πρωτεϊνών με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής.

333 Πίνακας Ιοντοανταλλακτικές ρητίνες με εφαρμογή στον καθαρισμό πρωτεϊνών Χαρακτηριστική ομάδα Χημικός τύπος (συμβολισμός) Κατιοντοανταλλάκτης Μεθυλοκαρβοξυλική (CM) -ΟCH2COO - Oρθοφωσφορική (P) -O-PO3H - Mεθυλοσουλφονική (S) -ΟCH2SO3 - Προπυλοσουλφονική (SP) -Ο(CH2)3SO3 - Ανιοντοανταλλάκτης Αιθυλαμίνη (ΑΕ) -OCH2CH2NH3 + Διαιθυλοαιθυλαμίνη (DEAE) -OCH2CH2NH + (CH2CH3)2 Διαιθυλο(2-υδροξυπρόπυλο) -CH2CH2N + (CH2CH3)2CH2CH(OH)CH3 αιθυλαμίνη (QAE) γ) Χρωματογραφία συγγένειας Με την χρωματογραφία συγγένειας επιτυγχάνεται ο υψηλός βαθμός καθαρότητας των ενζύμων και πρωτεϊνών. Ο διαχωρισμός με την τεχνική αυτή βασίζεται στην τάση για ειδική μη ομοιοπολική αντιστρέψιμη σύνδεση μεταξύ της ουσίας που θέλουμε να απομονώσουμε (πρωτεΐνη) και ενός μορίου που ονομάζεται δεσμευτής ή πρόσδεμα (ligand). Ο δεσμευτής στη χρωματογραφία συγγένειας μπορεί να είναι ενζυμικό υπόστρωμα, αναστολέας, συνένζυμο, μέταλλο ή αντίσωμα. Στον πίνακα 13.6 παρουσιάζονται οι κυριότεροι δεσμευτές που χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία συγγένειας. Ο δεσμευτής ακινητοποιείται ή συνδέεται μέσω ενός άλλου μορίου (που ονομάζεται βραχίονας) με κάποιον στερεό φορέα. Ο φορέας αυτός είναι ένα κατάλληλο πολυμερές υλικό, το οποίο μετά την πρόσδεση του δεσμευτή εγκιβωτίζεται στη χρωματογραφική στήλη. Κατά τη διέλευση από τη στήλη, η πρωτεΐνη-στόχος συνδέεται με τον δεσμευτή ενώ τα άλλα μόρια που δεν εμφανίζουν αντίστοιχη συγγένεια δεν αναγνωρίζονται και περνούν αδέσμευτα (βλ. σχήμα 13.10). Η εκρόφηση της πρωτεΐνης επιτυγχάνεται είτε μη εκλεκτικά, με μεταβολή της ιοντικής ισχύς ή του ph του διαλύματος έκλουσης, είτε εκλεκτικά με τη χρήση μορίων που αλληλεπιδρούν με τη προσροφημένη πρωτεΐνη. δ) Υδρόφοβη χρωματογραφία Η χρωματογραφική αυτή τεχνική βρίσκει εφαρμογή τόσο για τη συμπύκνωση όσο και τον καθαρισμό βιομορίων. Η μέθοδος βασίζεται στις ασθενείς αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ υδρόφοβων ομάδων του χρωματογραφικού φορέα (κυρίως αρυλο- και ακυλο-ομάδων) με υδρόφοβες περιοχές 325

334 στην επιφάνεια του βιομορίου. Η ακυλιωμένη αγαρόζη αποτελεί έναν από τους σπουδαιότερους φορείς της υδρόφοβης χρωματογραφίας. Η διαφοροποίηση ως προς το περιεχόμενο των υδρόφοβων περιοχών στις πρωτεΐνες αποτελεί τη βάση για το διαχωρισμό τους με την τεχνική αυτή. Η σύνδεση της πρωτεΐνης με το χρωματογραφικό υλικό επιτελείται σε μέσο που προάγει την ανάπτυξη υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, όπως για παράδειγμα σε διάλυμα υψηλής περιεκτικότητας σε άλας. Αντίθετα, η έκλουση προϋποθέτει τη μείωση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, η οποία επιτυγχάνεται με μείωση της συγκέντρωσης του άλατος στο διάλυμα, μείωση της θερμοκρασίας, καθώς και μείωση της πολικότητας του διαλύματος έκλουσης με την προσθήκη διαλυτών όπως η αλκοόλη και η αιθυλενική γλυκόλη. Σχήμα Διαχωρισμός πρωτεϊνών με χρωματογραφία συγγένειας. Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται ορισμένοι σημαντικοί παράγοντες που είναι δυνατόν να προκαλέσουν μετουσίωση και αδρανοποίηση των ενζύμων και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη στο σχεδιασμό ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου κάθετης επεξεργασίας πρωτεϊνών. 326

335 Παράγοντες που είναι δυνατόν να προκαλέσουν μετουσίωση και αδρανοποίηση των ενζύμων κατά τη διαδικασία καθαρισμού τους Παράγοντας Επίδραση Θερμότητα Ισχυρές δυνάμεις μηχανικής φύσης Πρωτεάσες ph Χημικά Οξείδωση Αφρισμός Τοξικότητα από βαρέα μέταλλα Όλες οι μηχανικές μέθοδοι διάρρηξης των κυττάρων παράγουν σημαντικά ποσά θερμότητας. Κατά συνέπεια η ψύξη είναι απαραίτητη κατά την εφαρμογή αυτών των τεχνικών. Η παρουσία υποστρωμάτων ή αναλόγων τους καθώς και η χρησιμοποίηση πολυαλκοολών μπορεί να μειώσει την αρνητική επίδραση της θερμότητας και να αυξήσει τη σταθερότητα των ενζύμων. Οι μηχανικές δυνάμεις (τριβή κλπ) που ασκούνται κατά τη διάρρηξη των κυττάρων με τεχνικές όπως η εφαρμογή υπερήχων, ή υψηλής πίεσης, η ομογενοποίηση, ή η λυοτρίβηση μπορεί να απενεργοποιήσουν τα ένζυμα, ιδιαίτερα παρουσία βαρέων μετάλλων ή/και κατά την επαφή των πρωτεϊνικών μορίων με τον αέρα Η διάσπαση των κυττάρων θα απελευθερώσει αναπόφευκτα υδρολυτικά ένζυμα (πρωτεάσες) γεγονός που μπορεί να προκαλέσει σοβαρή απώλεια ενζυμικής δραστικότητας. Η ανεπιθύμητη αυτή δράση των πρωτεασών μπορεί να μειωθεί μέσω της επιτάχυνσης της διαδικασίας ή της εφαρμογής χαμηλής θερμοκρασίας κατά τη διαδικασία απομόνωσης των ενζύμων. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια άλλη πρωτεΐνη χαμηλού κόστους (η οποία θα αποτελέσει υπόστρωμα για τις πρωτεάσες) ή ακόμη και αναστολείς πρωτεασών Καθώς οι ακραίες τιμές ph οδηγούν σε μετουσίωση των ενζύμων, η χρησιμοποίηση ρυθμιστικών διαλυμμάτων είναι απαραίτητη Η παρουσία υποστρωμάτων ή αναλόγων τους καθώς και η χρησιμοποίηση πολυαλκοολών μπορεί να αυξήσει τη σταθερότητα των ενζύμων. Μερικά ένζυμα μπορούν να υποστούν μετουσίωση παρουσία επιφανειοενεργών ή και οργανικών διαλυτών. Παράλληλα οι πολυφαινολικές ενώσεις που προέρχονται από φυτά είναι ισχυροί ανασταλτικοί παράγοντες των ενζύμων. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να αντιμετωπισθεί με τη χρήση προσροφητών (π.χ polyvinylpyrrolidone) ή τη χρήση του ασκορβικού οξέος που μπορεί να μειώσει τη δράση των οξειδασών πολυφαινολών Η χρησιμοποίηση αναγωγικών αντιδραστηρίων (π.χ ασκορβικό οξύ, μερκαπτοαιθανόλη, διθειοθρεϊτόλη) είναι συχνά αναγκαία Η επιφάνεια επαφής υγρής-αέριας φάσης που είναι παρούσα στον αφρό μπορεί να οδηγήσει σε μετουσίωση των ενζύμων. Κατά συνέπεια η ανάδευση διαλύματος ενζύμων πρέπει να γίνεται ήπια Ιόντα βαρέων μετάλλων (π.χ Fe, Cu, Ni) μπορεί να οδηγήσουν σε μετουσίωση των ενζύμων. Η χρησιμοποίηση χηλικών παραγόντων όπως το EDTA στο ρυθμιστικό διάλυμα οδηγεί στη δημιουργία συμπλόκων με τα ιόντα αυτά και έτσι τα απομακρύνουν από το διάλυμα. 327

336 13.6. Ηλεκτροκινητικός διαχωρισμός Oι τεχνικές που βασίζονται στο φαινόμενο του ηλεκτροκινητικού διαχωρισμού βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή στη βιοτεχνολογία, τόσο για τον καθαρισμό όσο και το χαρακτηρισμό βιομορίων εμπορικής ή ερευνητικής αξίας. Tα ηλεκτροκινητικά φαινόμενα περιλαμβάνουν τη μετακίνηση ιόντων και φορτισμένων μορίων (βιομορίων) σε ένα ηλεκτρικό πεδίο. Οι διαφορές στην κινητικότητα των μορίων, είναι συνάρτηση του καθαρού φορτίου αλλά και του μεγέθους καθώς και του σχήματος των μορίων. Οι διαφορές αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το διαχωρισμό τους σε διάλυμα (ηλεκτροφόρηση) ή διαμέσου ημιστερεών υλικών, όπως πηκτή αμύλου ή πολυακρυλαμιδίου (ηλεκτροφόρηση σε πηκτή) ή ακόμη και διαμέσου τριχοειδών διαμέτρου μm και μήκους cm, στο εσωτερικό των οποίων εντοπίζεται ρυθμιστικό διάλυμα. Στο σχήμα παρουσιάζεται σχηματικά ο διαχωρισμός βιομορίων με ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδή (capillaryelectrophoresis). _ Ανιχνευτής Καταγραφή δεδομένων Σχήμα Διαχωρισμός βιομορίων με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδή. 328

337 Πίνακας Κύριοι δεσμευτές στη χρωματογραφία συγγένειας και βασικές εφαρμογές στον καθαρισμό πρωτεϊνών. Δεσμευτής Εφαρμογή Συνθετικοί δεσμευτές DNA Απομόνωση περιοριστικών ενδονουκλεασών εκλεκτικής ή πολυεκλεκτικής αλληλουχίας Συνθετικές τριαζινο-χρωστικές Βιομηχανική εφαρμογή σε ένζυμα (όπως το Cibacron blue 3GA) νουκλεοτιδίων, δεϋδρογονάσες, κινάσες κλπ. Συνθετικές βιομιμητικές χρωστικές Εξειδικευμένοι δεσμευτές Λεκτίνες (όπως η κονκαναβαλίνη Α) Αναγνωρίζουν την πολυσακχαριτική περιοχή γλυκοπρωτεϊνών ΙgG Αναγνωρίζει τμήμα της πρωτεΐνης Α.(από S. aureus) το οποίο έχει πρώτα συζευχθεί με την πρωτεΐνη στόχο Μεταλλοχηλικά σύμπλοκα Δέσμευση πρωτεϊνών μέσω του ιμιδαζολίου της ιστιδίνης Μορφοποίηση τελικού προϊόντος Το τελευταίο στάδιο στην κάθετη επεξεργασία αφορά στη μορφοποίηση του προϊόντος και στον ποιοτικό έλεγχο αυτού. Η εμπορική βιωσιμότητα ενός βιοτεχνολογικού προϊόντος εξαρτάται κατά κύριο λόγο από την δυνατότητα διατήρησης της σταθερότητας και την ενεργότητάς του κατά τη μεταφορά και την αποθήκευση. Προϊόντα μικρού μοριακού βάρους, όπως είναι οι οργανικοί διαλύτες, τα οργανικά οξέα κ.ά., βρίσκονται στην τελική τους μορφή ως πυκνά διαλύματα. Προϊόντα υψηλής καθαρότητας, όπως τα αντιβιοτικά, το κιτρικό οξύ κ.ά., υπόκεινται σε κρυστάλλωση από το διάλυμα στο οποίο βρίσκονται. Στη βιομηχανική παρασκευή ενζύμων και γενικότερα πρωτεϊνών η διαδικασία της τελικής μορφοποίησης περιλαμβάνει: α) την απομάκρυνση μικρομοριακών προσμίξεων του ενζυμικού παρασκευάσματος με τεχνικές όπως η υπερδιήθηση ή η χρωματογραφία διαπερατότητας, β) την προσθήκη κατάλληλων σταθεροποιητών της ενζυμικής δραστικότητας όπως υπόστρωμα, συνένζυμο, σάκχαρα, γλυκερόλη ή άλλες πολυόλες, καθώς επίσης άλατα αλλά και πρωτεΐνες όπως η αλβουμίνη. Στην 329

338 περίπτωση που το ένζυμο, όταν βρίσκεται σε διάλυμα, χάνει με την πάροδο του χρόνου την καταλυτική του δραστικότητα, τότε απαιτείται η εφαρμογή κατάλληλων τεχνικών για την απομάκρυνση του διαλύτη. Η συνηθέστερη τεχνική που εφαρμόζεται είναι αυτή της λυοφιλίωσης. Η τεχνική βασίζεται στην απομάκρυνση του νερού (ή άλλων διαλυτών) από το ενζυμικό διάλυμα το οποίο έχει πρώτα καταψυχθεί σε θερμοκρασία μικρότερη από -40 ο C. Η απομάκρυνση του νερού από τη στερεά κατάσταση επιτυγχάνεται με την εφαρμογή χαμηλής πίεσης σε θερμοκρασία υπό το μηδέν Η εφαρμογή που μπορεί να έχει το ενζυμικό παρασκεύασμα καθορίζει τα κριτήρια και τις τεχνικές του ποιοτικού ελέγχου των ενζύμων και γενικότερα των πρωτεϊνών. Στην περίπτωση αναλυτικών και διαγνωστικών ενζύμων τα παρασκευάσματα πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας. Ιδιαίτερα στην περίπτωση θεραπευτικών πρωτεϊνών και ενζύμων, εφαρμόζονται αυστηρότατες διεργασίες ποιοτικού ελέγχου βασιζόμενες κυρίως σε βιολογικές μετρήσεις και μεθόδους για την ανίχνευση ανεπιθύμητων προσμίξεων που μπορεί να προκαλέσουν ανοσολογικές ή ανοσοδιεγερτικές επιπλοκές. Αντίθετα, τα βιομηχανικά ένζυμα είναι παρασκευάσματα περιορισμένης καθαρότητας. Ο ποιοτικός έλεγχος των βιομηχανικών ενζύμων αποσκοπεί στη διασφάλιση συγκεκριμένης καταλυτικής δραστικότητας ανά μονάδα βάρους του παρασκευάσματος. Τέλος, η εφαρμογή των ενζύμων για την κατάλυση αντιδράσεων βιομηχανικού ενδιαφέροντος δεν απαιτεί πολύ μεγάλου βαθμού καθαρότητας ενζυμικά παρασκευάσματα, προϋποθέτει όμως τον καθαρισμό του τελικού προϊόντος και βέβαια τον αυστηρό ποιοτικό έλεγχο αυτού Ενσωμάτωση διεργασιών κάθετης επεξεργασίας στη βιοτεχνολογία Η χαμηλή παραγωγικότητα και το υψηλό κόστος των παραγόμενων βιομορίων και άλλων βιοτεχνολογικών προϊόντων αποτελούν τους κυριότερους περιοριστικούς παράγοντες στην ανάπτυξη βιοτεχνολογικών διαδικασιών. Καθώς τα στάδια απομόνωσης και καθαρισμού συνεισφέρουν τόσο στην αύξηση του κόστους όσο και στην απώλεια προϊόντος, η ενσωμάτωση διεργασιών σε όσο δυνατόν λιγότερα στάδια αναμένεται να περιορίσει τους περιοριστικούς αυτούς παράγοντες. Έτσι, η ενσωμάτωση σταδίων απομόνωσης του προϊόντος με τη διαδικασία της ζύμωσης 330

339 είναι σήμερα δυνατή και βρίσκει εφαρμογή στην ανάκτηση τόσο προϊόντων μικρού μοριακού βάρους όσο και βιομορίων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα προς την κατεύθυνση αυτή, αποτελεί η in situ προσρόφηση του προϊόντος από το υγρή φάση της ζύμωσης. Η ενσωμάτωση της διαδικασίας εκχύλισης με αυτή της ζύμωσης σε ένα στάδιο έχει διερευνηθεί για την in situ ανάκτηση υδρόφοβων προϊόντων μικρού μοριακού βάρους. Σημαντικό περιορισμό προς την ολοκλήρωση της παραπάνω διαδικασίας αποτελεί η τοξική επίδραση των οργανικών διαλυτών στα κύτταρα. Η τεχνική της υπερεκχύλισης (βλ. &13.4) φαίνεται ότι μπορεί να άρει τον παραπάνω περιορισμό αν και η διεργασία δεν έχει ακόμη βρει εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα. Με σκοπό τέλος τη μείωση των σταδίων της κάθετης επεξεργασίας, σημαντικές προσπάθειες επιτελούνται σήμερα προς την ανάπτυξη διαδικασιών που συνδυάζουν την εξειδίκευση που προσφέρουν οι αλληλεπιδράσεις συγγένειας με τεχνικές που εφαρμόζονται στα αρχικά στάδια καθαρισμού, όπως η διήθηση με τη χρήση μεμβρανικών προσροφητών και η κατακρήμνιση συγγένειας (βλ. &13.4). 331

340 332

341 14. ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ - ΒΙΟΗΘΙΚΗ Η υπερπαραγωγή ορισμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα ή η παραγωγή μη λειτουργικών πρωτεϊνών προκαλεί δυσλειτουργία του κυττάρου που μπορεί να το οδηγήσει στον θάνατο ή ακόμη και σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό. Ο στόχος της γονιδιακής θεραπείας είναι ο κατάλληλος γονιδιακός χειρισμός για τη σύνθεση φυσιολογικών γονιδιακών προϊόντων ή την απενεργοποίηση γονιδίων που παράγουν ανεπιθύμητα ποσά προϊόντων Η γονιδιακή θεραπεία έχει ως στόχο να διορθώσει τη γενετική βλάβη εισάγοντας στους ασθενείς φυσιολογικά αλληλόμορφα του μεταλλαγμένου γονιδίου. Απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας είναι, εκτός από την κλωνοποίηση του υπεύθυνου γονιδίου, και ο προσδιορισμός των κυττάρων που εμφανίζουν τη βλάβη από την ασθένεια. Με τις μεθόδους της γονιδιακής θεραπείας δε γίνεται αντικατάσταση του μεταλλαγμένου γονιδίου στα κύτταρα του οργανισμού αλλά ενσωμάτωση του φυσιολογικού αντιγράφου του στο γονιδίωμα συγκεκριμένων σωματικών κυττάρων. Συνεπώς δε μεταβιβάζεται στους απογόνους. Στόχοι της γονιδιακής θεραπείας: Σήμερα δοκιμάζονται πάνω από 300 πρωτόκολλα γονιδιακής θεραπείας που αφορούν ποικίλες ασθένειες, όπως λ.χ. αιμοφιλία, AIDS, κυστική ίνωση, διάφορους καρκίνους, Πάρκινσον, Αλτσχάιμερ, Χορεία του Χάντινγκτον, και πολλές άλλες διαταραχές, όπως η οικογενής υπερχοληστεριναιμία κ.ά. Η μεταφορά των γονιδίων διακρίνεται σε : 333

342 Εξωσωματική μεταφορά γονιδίων (ex vivo). Στην περίπτωση αυτή απομονώνονται κύτταρα του ιστού που πάσχει και σε αυτά εισάγεται το γονίδιο (Σχήμα 14.1α) Ενδοσωματική μεταφορά (in vivo). Κατά την ενδοσωματική γονιδιακή θεραπεία το θεραπευτικό φυσιολογικό γονίδιο εισάγεται μέσω φορέων απευθείας στα κύτταρα του ιστού-στόχου του αρρώστου (Σχήμα 14.1β). Η χρησιμοποίηση, λ.χ., ρετροϊών ως τέτοιων φορέων αφορά μόνο τα κύτταρα που μπορούν να διαιρεθούν. Για τον λόγο αυτόν χρησιμοποιούνται και άλλοι ιοί ως φορείς (π.χ. αδενοϊοί, ιός του έρπητα), που όμως και αυτοί παρουσιάζουν προβλήματα επειδή οι πρωτεΐνες τους μπορεί να προκαλέσουν φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Χρησιμοποιούνται επίσης και μη ιικοί φορείς, όπως λ.χ. DNA που καλύπτεται μέσα σε έναν φάκελο λιπιδίων (λιπόσωμα) ή ακόμη και ένεση με καθαρό DNA Φορείς που χρησιμοποιούνται στη γονιδιακή θεραπεία 334

343 Α) Β) Σχήμα 14.1 α) Εξωσωματική και β) ενδοσωματική μεταφορά γονιδίων 335

344 Η προηγηθείσα προσέγγιση αφορά καθαρά τη γονιδιακή θεραπεία σωματικών κυττάρων τα οποία δεν μεταβιβάζουν γενετική πληροφορία στην επόμενη γενιά. Ως τώρα η προσέγγιση γονιδιακής θεραπείας γεννητικών κυττάρων θεωρείται απαγορευτική για βιοηθικούς αλλά και τεχνικούς λόγους Στον Πίνακα που ακολουθεί συνοψίζονται οι κυριότεροι περιορισμοί που μπορεί να συναντήσει η γονιδιακή θεραπεία Αλλα ζητήματα που θα πρέπει να επιλυθούν για την αποτελεσματική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας Ηθικά Ζητήματα Ένα σημαντικό ηθικό ζήτημα που μπορεί να προκύψει αφορά στην περίπτωση όπου η γενετική τροποποίηση - «η γενετική θεραπεία» - προχωρήσει και στη βελτίωση φυσιολογικών χαρακτηριστικών του ανθρώπου και να πυροδοτήσει την 336