ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΦΥΤΟ Sideritis raeseri ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΚΥΜΑΤΩΝ

Transcript

1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΦΥΤΟ Sideritis raeseri ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΚΥΜΑΤΩΝ Ι. Σαρακατσιάνος 1,2, Κ. Αδαμόπουλος 1, Β. Σαμανίδου 3, Α. Γούλα 4 1. Εργαστήριο Τεχνολογίας Βιομηχανιών Τροφίμων και Αγροτικών Βιομηχανιών - Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πολυτεχνική Σχολή ΑΠΘ, Θεσσαλονίκη 2. Γ Στρατιωτικό Κτηνιατρικό Νοσοκομείο, Θέρμη Θεσσαλονίκης 3. Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας - Τμήμα Χημείας, Σχολή Θετικών Επιστημών ΑΠΘ, Θεσσαλονίκη 4. Εργαστήριο Επεξεργασίας και Μηχανικής Τροφίμων, Τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Γεωπονική Σχολή ΑΠΘ, Θεσσαλονίκη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην εργασία αυτή μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες εκχύλισης των φαινολικών συστατικών του φυτού Sideritis raeseri με τη βοήθεια μικροκυμάτων. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου εφαρμογής των μικροκυμάτων, της αναλογίας διαλύτη και φυτικού υλικού, της συγκέντρωσης και της φύσης του διαλύτη. Από τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής βρέθηκε ότι ο χρόνος εφαρμογής των μικροκυμάτων για 10 min θεωρείται αρκετός για τη μέγιστη παραλαβή των φαινολικών συστατικών. Η αναλογία μάζας ξηρής δρόγης προς διαλύτη είχε σχετικά μικρή επίδραση στα επίπεδα που μελετήθηκε. Σε ό,τι αφορά στην εκχυλιστική ικανότητα των διαφόρων μέσων, η σειρά αυξανόμενης ανάκτησης φαινολικών συστατικών βρέθηκε να είναι η ακόλουθη: EtOH<MeOH<H 2 O<MeOH:H 2 O (75:25, v/v)<etoh:h 2 O (75:25, v/v). ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια παρουσιάζεται ένα αλματώδες ενδιαφέρον για τη συστηματική και σε βάθος έρευνα των φαρμακολογικά δραστικών ουσιών των ειδών του γένους Sideritis, με απώτερο στόχο τη χρήση τους στον τομέα των τροφίμων, των φαρμάκων και των καλλυντικών. Σύμφωνα με επιστημονικές μελέτες, η χημική σύσταση του φυτού είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη: πολυφαινόλες, διτερπένια, αλκαλοειδή, στερόλες, αμινοξέα, υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, χλωροφύλλες, πτητικές ενώσεις, ιχνοστοιχεία, μέταλλα και άλλες μη ταυτοποιημένες ενώσεις απαρτίζουν τη σύσταση αυτού του βοτάνου. Ανάμεσα σε όλες αυτές τις διαφορετικές ουσίες, την πιο ενδιαφέρουσα χημική ομάδα απαρτίζουν οι ενώσεις που παρουσιάζουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Οι ενώσεις αυτές προστατεύουν τον οργανισμό από το οξειδωτικό στρες, το οποίο εκτιμάται ότι συμβάλλει στην ανάπτυξη ενός ευρέος φάσματος ασθενειών, όπως για παράδειγμα τη νόσο του Αλτσχάιμερ, τη νόσο του Πάρκινσον, τα καρδιαγγειακά νοσήματα, τη ρευματοειδή αρθρίτιδα κ.α. Σύμφωνα με τις σύγχρονες τάσεις στη διατροφή, η αυξημένη κατανάλωση των αντιοξειδωτικών συμβάλλει στην καλή υγεία, στην ευεξία και στην καθυστέρηση των φαινομένων του γήρατος [1]. Οι σημαντικότερες αντιοξειδωτικές ενώσεις που έχουν εντοπιστεί είναι φλαβονοειδή, όπως 5- και 8- διυποκατεστημένες φλαβόνες [2], φλαβονοειδή γλυκοζίδια [3], φλαβονοειδείς αγλυκόνες και πολυ-υδροξυ-φλαβόνες [4], φαινυλοπροπανοειδή και παρόμοιες ενώσεις με αντιοξειδωτική δράση [5]. Σύμφωνα με τις παραπάνω μελέτες, το τσάι του γένους Sideritis παρουσιάζει μέτρια ως ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, ανάλογα με το είδος του φυτού, την εποχή συγκομιδής, τον τύπο και τη μεθοδολογία εκχύλισης. Το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο σε είδη του γένους Sideritis, κυμαίνεται από mg ισοδύναμα γαλλικού οξέος/g εκχυλίσματος [6,7]. Τα φαινολικά στοιχεία που χαρακτηρίζουν το γένος Sideritis είναι το χλωρογενικό οξύ, η μυρικετίνη, η ισοσκουτελλαρεΐνη, η κατεχίνη, η απιγενίνη, η μυρικετίνη, το βανιλικό οξύ και ο γαλλικός εστέρας της επικατεχίνης [4].

2 Για την παραλαβή των φαινολικών συστατικών από φυσικά προϊόντα μπορούν να εφαρμοστούν διαφορετικά συστήματα εκχύλισης με μικροκύματα, συμπεριλαμβανομένων των φούρνων μικροκυμάτων που λειτουργούν σε ατμοσφαιρική πίεση (π.χ. οικιακού τύπου) ή εξοπλισμένων με κλειστά δοχεία υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης [8,9]. Η χρήση οικιακών φούρνων χωρίς τεχνικές τροποποιήσεις θα πρέπει να αποφεύγεται, λόγω της χαμηλής αξιοπιστίας, επαναληψιμότητας και επιπέδου ασφάλειας που χαρακτηρίζουν αυτές τις συσκευές [8]. Κατά τη μελέτη της εκχύλισης φυτικών συστατικών με τη βοήθεια μικροκυμάτων πρέπει να λαμβάνονται υπόψη διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν τη διαδικασία, όπως ο διαλύτης, η συγκέντρωση και ο όγκος του διαλύτη, η ισχύς των μικροκυμάτων, ο χρόνος εκχύλισης κτλ [10]. Στην παρούσα εργασία μελετάται η επίδραση του χρόνου, της αναλογίας μάζας σε συνδυασμό με διάφορα συστήματα διαλυτών στο πλαίσιο της βελτιστοποίησης της εκχύλισης με μικροκύματα με στόχο την παραλαβή του μέγιστου ποσοστού φαινολικών συστατικών του φυτού Sideritis raeseri, το οποίο καλλιεργείται συστηματικά στην Ελλάδα. Το σύνολο των φαινολικών συστατικών προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά με τη μέθοδο Folin - Ciocalteu. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εξοπλισμός και αντιδραστήρια Για την εκχύλιση με μικροκύματα χρησιμοποιήθηκε σύστημα πέψης μικροκυμάτων, μοντέλο START D του οίκου Milestone (Sorisole, Ιταλίας), με δοχεία υψηλής πίεσης χωρητικότητας 100 ml, κατασκευασμένα από υψηλής καθαρότητας πολυμερές υλικό Teflon (TFM), με αισθητήρα παρακολούθησης και ρύθμισης της θερμοκρασίας. Για το φασματοσκοπικό προσδιορισμό των πολυφαινολών χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους ορατού (UV-Vis) της σειράς Helios, μοντέλο Gamma, του οίκου Τhermo Spectronic (Madison, USA). Οι διηθήσεις πραγματοποιήθηκαν με χάρτινους ηθμούς 34/Ν του οίκου Munktell (Bärenstein, Γερμανίας). Μεθανόλη και απόλυτη αιθανόλη του οίκου Merck (Darmstadt, Γερμανίας), καθώς και απιονισμένο νερό χρησιμοποιήθηκαν ως διαλύτες εκχύλισης, ενώ για τον προσδιορισμό των πολυφαινολών χρησιμοποιήθηκαν άνυδρο ανθρακικό νάτριο του οίκου Merck και αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu s phenol reagent 2N και μονοένυδρο γαλλικό οξύ του οίκου Sigma-aldrich (St. Luis, USA). Όλοι οι διαλύτες και τα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής καθαρότητας. Φυτικό υλικό Για την εκτέλεση της πειραματικής διαδικασίας χρησιμοποιήθηκε ξηρή δρόγη (αποξηραμένο φυτό) του είδους Sideritis raeseri συγκομιδής 2012, αγορασμένο από την τοπική αγορά. Χρησιμοποιήθηκε μόνο το ανθοφόρο τμήμα της δρόγης, καθώς και τμήματα πλούσια σε φύλλωμα μετά από μικροτεμαχισμό με κατάλληλο κοπτικό μέσο.

3 Εκχύλιση με μικροκύματα Για τη διαδικασία της εκχύλισης χρησιμοποιήθηκαν μεθανόλη, αιθανόλη, απιονισμένο νερό, μίγματα μεθανόλης-νερού και αιθανόλης-νερού σε διάφορες αναλογίες όγκων. Κάθε πρόγραμμα ελεγχόμενης θερμοκρασίας εκχύλισης είχε ένα στάδιο 5 min, όπου η θερμοκρασία ανέβαινε ομαλά μέχρι το σημείο ζέσης των διαλυτών εκχύλισης (64 ο C για τη μεθανόλη και τα μίγματά της, 78 ο C για την αιθανόλη και τα μίγματά της και 100 ο C για το νερό). Η μέγιστη ενέργεια κατά τη ρύθμιση του φούρνου μικροκυμάτων ήταν 1000 W, αλλά η πραγματική απορροφώμενη ενέργεια ρυθμιζόταν από το λογισμικό του, σύμφωνα με τη θερμοκρασία που είχε καθοριστεί. Σε ένα δεύτερο στάδιο η θερμοκρασία παρέμενε σταθερή για 10, 15 ή 20 min. Τέλος ακολουθούσε πρόγραμμα ψύξης 5 min. Οι μάζες φυτικού υλικού που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0,5-1,0-1,5 και 2,0 g, ενώ ο όγκος του διαλύτη ήταν 30 ml. Προσδιορισμός πολυφαινολών Για τον προσδιορισμό των πολυφαινολών εφαρμόστηκε τροποποιημένη η πρότυπη μέθοδος ISO Determination of substances characteristic of green and black tea Part 1: Content of total polyphenols in tea Colorimetric method using Folin-Ciocalteu reagent, με φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό των πολυφαινολών, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu και μέτρηση στα 765 nm [11]. Για το σκοπό αυτό, μετά την παραλαβή του εκχυλίσματος με διήθηση με χάρτινο ηθμό, ακολουθούσε αραίωση 1:50 με απιονισμένο νερό, μεταφορά 1 ml του αραιωμένου διαλύματος σε δοκιμαστικό σωλήνα, προσθήκη 5 ml αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu 0,2Ν και μετά από 5 min, προσθήκη 4 ml υδατικού διαλύματος ανθρακικού νατρίου 7,5% (w/v). Μετά από παραμονή 1 ώρας και την αναγωγή του φωσφορομολυβδαινικού και βολφραμικού οξέος του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu από τις πολυφαινόλες και το σχηματισμό συμπλόκων κυανού χρώματος, ακολουθούσε η μέτρηση της απορρόφησης σε υάλινη κυψελίδα 10 mm στα 765 nm. Ο υπολογισμός σε ισοδύναμα μάζας γαλλικού οξέος ανά γραμμάριο ξηρής ουσίας του φυτικού υλικού έγινε με βάση καμπύλη αναφοράς που κατασκευάστηκε με πρότυπα διαλύματα γαλλικού οξέος. Η ξηρή ουσία των δειγμάτων Sideritis raeseri υπολογίστηκε σύμφωνα με την πρότυπη μέθοδο ISO 7513 Instant tea in solid form - Determination of moisture content (loss in mass at 103 degrees C) [12]. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επίδραση του χρόνου εφαρμογής των μικροκυμάτων Στο Σχήμα 1 παρουσιάζεται η επίδραση στην απόδοση της εκχύλισης (εκφρασμένη σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος) του χρόνου εφαρμογής των μικροκυμάτων και με τους τρεις διαλύτες. Οι χρόνοι επιλογής ήταν 10, 15 και 20 min και γίνεται φανερό ότι καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρείται στην απόδοση της εκχύλισης στους χρόνους που έχουν επιλεγεί. Επίδραση της αναλογίας διαλύτη και φυτικού υλικού Οι μάζες του φυτικού υλικού που επιλέχθηκαν για τη μελέτη ήταν 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 g και ο όγκος του διαλύτη 30 ml. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 1, για τους διαλύτες MeOH και Η 2 Ο δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές, αλλά η μάζα του 0,5 g παρουσιάζει ελαφρώς καλύτερη

4 απόδοση. Αντίθετα για την EtOH, οι διαφορές είναι εντονότερες και οι μάζες των 1,0 και 1,5 g παρουσιάζουν τις ελάχιστες αποδόσεις, ενώ η μάζα του 0,5 g παρουσιάζει ελαφρώς καλύτερη απόδοση από αυτή των 2,0 g. Επίδραση της συγκέντρωσης του διαλύτη Για τη μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης των οργανικών διαλυτών, κατασκευάστηκαν διαλύματα MeOH:H 2 O και EtOH:H 2 O σε αναλογίες 20:80, 40:60, 60:40, 80:20 και 100% (v/v) και για τους δύο οργανικούς διαλύτες, σε χρόνο 10 min και με μάζα φυτικού υλικού 0,5 g, συνθήκες που προέκυψαν από το προηγούμενο πείραμα. Από τα Σχήματα 2 και 3, προκύπτει ότι η βέλτιστη αναλογία MeOH:H 2 O και EtOH:H 2 O είναι στην περιοχή του 75% (v/v) περίπου. Σχήμα 1. Επίδραση του χρόνου εφαρμογής των μικροκυμάτων και της αναλογίας φυτικού υλικού προς διαλύτη στην εκχύλιση των πολυφαινολών. Επίδραση του διαλύτη Συγκρίνοντας τέλος τα εκχυλιστικά συστήματα που μελετήθηκαν σε χρόνο 10 min και για μάζα φυτικού υλικού 0,5 g, είναι σαφής η διαφορά στην απόδοση της εκχύλισης, με βέλτιστο διαλύτη το μίγμα EtOH:H 2 O, στην αναλογία 75:25 (v/v) περίπου.

5 Σχήμα 2. Επίδραση της συγκέντρωσης της MeOH στην εκχύλιση των πολυφαινολών. Σχήμα 3. Επίδραση της συγκέντρωσης της EtOH στην εκχύλιση των πολυφαινολών.

6 Σχήμα 4. Επίδραση των διαφόρων εκχυλιστικών μέσων στην εκχύλιση των πολυφαινολών. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην εργασία αυτή μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες εκχύλισης των φαινολικών συστατικών του φυτού Sideritis raeseri με τη βοήθεια μικροκυμάτων. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου εφαρμογής των μικροκυμάτων, της αναλογίας διαλύτη και φυτικού υλικού, της συγκέντρωσης και της φύσης του διαλύτη. Από τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής βρέθηκε ότι το βέλτιστο ποσοστό ανάκτησης των φαινολικών συστατικών από το φυτικό υλικό επιτυγχάνεται όταν ως εκχυλιστικό μέσο χρησιμοποιείται μίγμα αιθανόλης-νερού σε αναλογία όγκων 75:25. Μικρή επίδραση παρατηρήθηκε σε ό,τι αφορά στην αναλογία μάζας φυτού/διαλύτη, ενώ τέλος ο χρόνος εφαρμογής των μικροκυμάτων για 10 min θεωρείται αρκετός για τη μέγιστη παραλαβή των φαινολικών συστατικών. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Finkel T. and Holbrook N. J., Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, 48: (2000). [2] Gabrieli, C. N., Kefalas, P. G., & Kokkalou, E. L. Antioxidant activity of flavonoids from Sideritis raeseri. Journal of Ethnopharmacology, 96: (2005). [3] Charami M.T., Lazari D., Karioti A., Skaltsa H., Hadjipavlou-Litina D., and Souleles C., Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Sideritis perfoliata subsp. Perfoliata (Lamiaceae). Phytotherapy Research, 22: (2008). [4] Janeska B., Stefova M., Alipieva K., Assay of flavonoid aglycones from the species of genus Sideritis (Lamiaceae) from Macedonia with HPLC-UV DAD. Acta Pharm., 57: (2007).

7 [5] Armata M., Gabrieli C., Termentzi A., Zervou M., and Kokkalou E., Constituents of Sideritis syriaca. ssp. Syriaca (Lamiaceae) and their antioxidant activity. Food Chemistry, 111: (2008). [6] Pljevljakušić D., Šavikin K., Janković T., Zdunić G., Ristić M., Godjevac D., and Konić- Ristić A., Chemical properties of the cultivated Sideritis raeseri Boiss. & Heldr. subsp. raeseri. Food Chemistry, 124: (2011). [7] Tunalier Z., Kosar M., Ozturk N., and Baser K.H.C., Antioxidant properties and phenolic composition of Sideritis species. Chemistry of natural compounds, 40(4): (2004). [8] H.F. Zhang, X.H. Yang, Y. Wang. Microwave assisted extraction of secondary metabolites from plants: current status and future directions, Trends Food Sci. Technol., 22: (2011). [9] W. Routray, V. Orsat. Microwave-assisted extraction of flavonoids: a review, Food Bioprocess Technol., 5: (2012). [10] Afoakwah A.N., Owusu, J., Adomako, C. & Teye E Microwave assisted extraction (MAE) of antioxidant constituents in plant materials, review article, Gl. J. of bio-science & biotechnology, 1(2): (2012). [11] ISO , Content of total polyphenols in tea - Colorimetric method using Folin - Ciocalteu reagent, (2005). [12] ISO 7513, Instant tea in solid form - Determination of moisture content (loss in mass at 103 degrees C), (2012).