ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Ευάγγελος Κωλέττας, Ph.D.(LON) Αναπληρωτής Καθηγητής Μοριακής Κυτταρικής Βιολογίας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Ιωάννινα 2018

2 ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ Το πεδίο της μεταφραστικής έρευνας συνδέει τη βασική εργαστηριακή έρευνα με την κλινική πράξη, και στοχεύει στην αξιοποίηση των ερευνητικών δεδομένων και των τεχνολογιών αιχμής των μοριακών βιοεπιστημών για την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών μεθόδων, θεραπευτικών μέσων και προσεγγίσεων. Μεταφραστική Έρευνα: Συστράτευση της Βιολογίας και της Ιατρικής για την αποτελεσματική αντιμετώπιση Πολυπαραγοντικών Νοσημάτων Ανάλυση του γονιδιώματος Έκφραση των γονιδίων και πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα Ανάλυση βιολογικών δεικτών Ανάπτυξη νέων φαρμάκων Ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών τεχνικών

3 Extrinsic Mechanisms of Resistance to Immunotherapy Cancer cells that constitutively express immunosuppressive cell surface ligands like PDL1 may actively inhibit anti-tumor T cell responses. The interferon-γ pathway is emerging as a key player in primary, adaptive, and acquired resistance to checkpoint blockade therapy This includes CTLA-4, PD1, and other immune checkpoints, T cell exhaustion and phenotype change, immune suppressive cell populations (Tregs, MDSC, type II macrophages), and cytokine and metabolite release in the tumor microenvironment (CSF-1, tryptophan metabolites, TGF-b, adenosine). Abbreviations: APC, antigen-presenting cells; MHC, major histocompatibility complex; TCR, T cell receptor; Treg, regulatory T cell; MDSC, myeloid-derived suppressor cell; Mɸ II, type II macrophage.

4

5

6

7 ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Γονιδιωματική (Genomics): Τομέας της γενετικής που εφαρμόζει την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, μεθόδους αλληλούχισης νουκλεϊκών οξέων (DNA & RNA sequencing methods) και βιοπληροφορικής (bioinformatics) για την αλληλούχιση, την οργάνωση και ανάλυση της δομής και της λειτουργίας γονιδιωμάτων. Η γονιδιωματική εστιάζεται σε διαφορετικά πεδία έρευνας: 1. Λειτουργική γονιδιωματική (Functional Genomics): Έκφραση, λειτουργία και ρόλος γονιδίων και αλληλεπιδράσεων τους στη ρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών. 2. Επιγονιδιωματική (Epigenomics): Ανάλυση των αναστρέψιμων επιγενετικών τροποποιήσεων του DNA (μεθυλίωση του DNA) ή των ιστονών (μεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση) ενός κυττάρου που αναφέρεται ως επιγένωμα ή επιγονιδίωμα, και οι οποίες επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων, χωρίς να μεταβάλλουν την αλληλουχία του DNA. 3. Μεταγονιδιωματική (Metagenomics): Μελέτη μεταγονιδιωμάτων, δηλαδή γενετικού υλικού που προκύπτει από δείγματα που ανευρίσκονται στο περιβάλλον. 4. Δομική Γονιδιωματική (Structural Genomics): Μελέτη της δομής των γονιδίων και της θέσης τους στα χρωμοσώματα Μπορεί να προβλεφθεί η τρισδιάστατης δομή (3D) κάθε μιας πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από ένα συγκεκριμένο γονιδίωμα. Ασχολείται επίσης με: (α) Την ανάλυση της έκφρασης, δομής και λειτουργίας των πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα, που αναφέρεται ως πρωτεομική (proteomics), και (β) Τη μελέτη βιοχημικών διαδικασιών και των μεταβολιτών τους σε ένα κύτταρο, πληθυσμό κυττάρων, ενός ιστού, ενός οργάνου ή και ενός οργανισμού, που αναφέρεται ως μεταβολωμική (metabolomics).

8 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Έκφραση, λειτουργία και ρόλος γονιδίων και αλληλεπιδράσεων τους στη ρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών. Κύριο χαρακτηριστικό: Η εφαρμογή μεθόδων γονιδιωματικής μεγάλης κλίμακας και υψηλής απόδοσης (genome-wide approach involving high-throughput methods), αντί μιας προσέγγισης σε επίπεδο απλών γονιδίων ('gene-by-gene' approach) για τη μελέτη προτύπων γονιδιακής έκφρασης σε διάφορες συνθήκες. Τέτοιες προσεγγίσεις αποτελούν οι μικροσυστοιχίες DNA σε συνδυασμό με τη βιοπληροφορική. Τρανσκριπτωμική & RNA-seq: Η μελέτη των μεταγραφικών προτύπων αναφέρεται στο σύνολο των μορίων RNA - mrna, rrna, trna και μη-κωδικών (non-coding) RNA (transcriptome) που μεταγράφονται σε ένα κύτταρο ή σε έναν πληθυσμό κυττάρων (transcriptomics). Η αλληλούχιση αυτών των μεταγραφημάτων είναι δυνατή με την τεχνολογία RNAseq.

9 Σκοπός της λειτουργικής γονιδιωματικής είναι η κατανόηση της σχέσης μεταξύ του γονιδιώματος ενός οργανισμού και του φαινοτύπου. Η λειτουργική γονιδιωματική εφαρμόζεται και στο επίπεδο DNA για: Την ταυτοποίηση λειτουργικών στοιχείων σε κωδικές και μη-κωδικές περιοχές του γονιδιωματικού DNA [The ENCODE (Encyclopedia of DNA elements) project]. Άλλες τεχνικές της λειτουργικής γονιδιωματικές που αποσκοπούν στην απώλεια της λειτουργίας γονιδίων, συμπεριλαμβάνουν: - Την μεταλλαξιγένεση (mutagenesis) που αναφέρεται στην απάλειψη ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (gene knockout), ή στη διάρρηξη της συνέχειας ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (gene disruption), και - Την παρεμβολή με RNAi (RNA interference) που αναφέρεται στην αποσιώπηση ή τη μειρρύθμιση της έκφρασης ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (sirna ή ShRNA).

10 Γονιδιωματική μεγάλης κλίμακας και υψηλής ανάλυσης οργανισμών μοντέλων in vivo Η γονιδιωματική υψηλής ανάλυσης οργανισμών-μοντέλων in vivo αναφέρεται στην εφαρμογή των αρχών της γονιδιωματικής προκειμένου να αναλυθεί η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ζωντανούς οργανισμούς. Πολλές μέθοδοι της γονιδιωματικής είναι προσαρμοσμένες για αναλύσεις σε κυτταρικές σειρές και καταστάσεις in vitro, επομένως, απαιτούνται εξειδικευμένες μέθοδοι γονιδιωματικής ανάλυσης in vivo. Tα ζώα και άλλοι πολυκύτταροι οργανισμοί έχουν μία απίστευτη ποικιλία κυτταρικών τύπων στο εσωτερικό τους: (Α) Ινοβλάστες (Β) Ενδοθηλιακά κύτταρα (Γ) Νευρώνες, και (Δ) Διαφορετικοί τύποι κυττάρων αίματος Καθένα από αυτά τα διαφορετικά είδη κυττάρων προκύπτει επειδή εκφράζουν διαφορετικά τμήματα του γονιδιώματος, και η εύρεση των διαφορών στην έκφραση γονιδίων ανά κυτταρικό τύπο είναι πραγματικά βασικές για την κατανόηση της διαφορετικής φυσιολογίας κάθε κυττάρου.

11 ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ 1. Μέθοδοι ποσοτικοποίησης - Εφαρμόζονται σε βιολογικά δείγματα για να διερευνηθεί η διαφορική έκφραση γονιδίων; Έχουν περιορισμένη χωροταξική διακριτικότητα. Μικροσυστοιχίες (microarray) Αλληλούχιση RNA (RNA-seq) Συνολικό πρωτέωμα, σε συνάρτηση με φασματοσκοπία μάζας (Mass spectrometry) 2. Μέθοδοι in situ χωροταξικής ανάλυσης μέσω χρώσης αντισωμάτων ή RNA Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε επίπεδο ιστού ή οργανισμού με αντιδραστήρια συγγένειας; μη-ειδικές αντιδράσεις (cross-reactivity), απαιτούν μονιμοποίηση Φθορίζων υβριδισμός RNA in situ (RNA FISH) για την αναγνώριση μεμονωμένων μεταγράφων Ανοσοφθορισμός με χρήση αντισωμάτων για την αναγνώριση συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 3. Μέθοδοι γονιδίων αναφοράς - Επιτρέπουν να αναλυθεί ένας υποκινητής γονιδίου ή να ιχνηθετηθεί ένα γονίδιο; απαιτείται κατασκευή διαγονιδιακών οργανισμών; προσομοιάζουν κατά προσέγγιση τη φυσική έκφραση γονιδίων; περιορίζεται σε οργανισμούς-μοντέλα Γονίδια αναφοράς μεταγραφής γονιδίων (Transcriptional reporters) Γονίδια αναφοράς μετάφρασης γονιδίων (Translational reporters) Για παράδειγμα, ένα γονίδιο αναφοράς είναι η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein; GFP) ή μία πρωτεΐνη σε σύντηξη με την GFP, επιτρέπουν την ανάλυση του υποκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης.

12 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ: Μικροσυστοιχίες DNA Έκφραση και λειτουργία γονιδίων (και πρωτεϊνών) και τις αλληλεπιδράσεις τους Μικροσυστοιχία DNA (DNA microarray ή DNA Chip ή Biochip)

13 Arraylt Green540 and Arraylt Red640 of amine-reactive fluorescent dyes for a wide range of DNA and protein microarray applications. Aminoallyl groups are added to DNA and RNA by incorporation of modified nucleotides containing aminoallyl groups attached to the DNA or RNA base. Proteins and peptides label naturally by virtue of containing primary amines on the surfaces as side chains of lysine and arginine residues. Arrayit Green540 uses green laser light (532 or 543 nm) for excitation, and Arrayit Red640 uses red laser light (633 or 635 nm) for excitation.

14 Γονιδιακή ενίσχυση: Το Ογκογονίδιο N-myc Ενίσχυση του πρωτο-ογκογονιδίου N-myc ανιχνεύεται σε περίπου 1/4 των πρωτοπαθών νευροβλαστωμάτων παιδιών. Η ενίσχυση είναι πολύ συχνότερη σε ασθενείς σε προχωρημένο στάδιο της ασθένειας και συσχετίζεται δραματικά με την επιβίωση. Η γονιδιακή ενίσχυση σημαίνει περισσότερα αντίγραφα του πρωτο-ογκογινιδίου N-myc με έχει σαν αποτέλεσμα τη σύνθεση περισσοτέρων μεταγράφων και περισσότερης ποσότητας πρωτεΐνης Genetics of Neuroblastoma by J. Maris

15 Χρωμοσωμικές Μεταθέσεις: Υπερέκφραση του Ογκογονίδιου c-myc Το πρωτο-ογογονίδιο c-myc κωδικοποιεί έναν TF, και αρχικά ανακαλύφθηκε ως το κυτταρικό ομόλογο του ογκογονιδίου v-myc του ρετροϊού Avian Myelocytomatosis retrovirus, MC29. Μετατόπιση του c-myc. Στο λέμφωμα του Burkitt, το πρωτο-ογκογονίδιο cmyc μετατοπίζεται από το χρωμόσωμα 8 στον γονιδιακό τόπο της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (IgH) στο χρωμόσωμα 14, με συνέπεια τη μη φυσιολογική έκφραση του c-myc Αυτές οι μετατοπίσεις διαχωρίζουν το πρωτο-ογκογονίδιο c-myc από το φυσιολογικό του υποκινητή και το τοποθετούν υπό τον έλεγχο ενός εκ των τριών, πολύ δραστικών ενισχυτών, που βρίσκονται στα γονίδια ανοσοσφαιρινών Ig (στα χρωμοσώματα 2, 14 & 22). Μετατοπίσεις που περιλαμβάνουν τις ελαφριές αλυσίδες κ, λ των Ig στα χρωμοσώματα 2 & 22, αντίστοιχα, ή τη βαριά αλυσίδα της IgH στο χρωμόσωμα 14, απαντούν στο 9%, 16% και 75% των BL (Burkitt lymphοma), αντίστοιχα.

16 Μετατόπιση του πρωτο-ογκογονιδίου abl. Στη χρόνια μυελογενή λευχαιμία, το πρωτο-ογκογονίδιο abl μετατοπίζεται από το χρωμόσωμα 9 στο χρωμόσωμα 22, σχηματίζοντας το χρωμόσωμα Philadelphia. Το πρωτο-ογκογονίδιο abl, που περιέχει δύο εναλλακτικά πρώτα εξόνια (το 1A και το 1B), συνδέεται στο μέσο του γονιδίου bcr στο χρωμόσωμα 22. Κατά τη μετατόπιση χάνεται το εξόνιο 1Β. Η μεταγραφή του χιμαιρικού γονιδίου αρχίζει από τον υποκινητή του bcr και συνεχίζεται μέσω του abl. Κατά το μάτισμα δημιουργείται ένα υβριδικό mrna (το mrna bcr/abl), από το οποίο έχουν αφαιρεθεί και οι αλληλουχίες του εξονίου 1Α του abl, αφού οι αλληλουχίες του bcr συρράπτονται με το εξόνιο 2 του abl. Κατά τη μετάφραση του mrna bcr/abl σχηματίζεται η ανασυνδυασμένη, υβριδική πρωτεΐνη Bcr/Abl.

17 RNA-seq Η μελέτη των μεταγραφικών προτύπων αναφέρεται στο σύνολο των μορίων RNA - mrna, rrna, trna, και μη-κωδικών (non-coding) RNA (transcriptome) που μεταγράφονται σε ένα κύτταρο ή σε έναν πληθυσμό κυττάρων (transcriptomics). Η αλληλούχιση αυτών των μεταγραφημάτων είναι δυνατή με την τεχνολογία RNA-seq, κατά την οποία πραγματοποιείται άμεση αλληλούχιση των cdnas, και αυτή είναι η διαφορά με τη τεχνολογία μικροσυστοιχιών Σύνθεση 1ης αλυσίδας: Oligo-dT για σύνδεση με ουρά πολυ-α με τυχαίους εκκινητές Σύνθεση 2ης αλυσίδας: DNA πολυμεράση

18 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ RNA-seq Απομονώνεται ολικό RNA ή πολύ-α+-rna (αντιπροσωπεύει τα mrna), και μετατρέπεται σε μια βιβλιοθήκη cdna με RT-PCR, στα οποία συνδέονται στο ένα ή και στα δύο άκρα τους, μικρά, προσαρμοστικά ολιγονουκλεοτίδια τα οποία ονομάζονται προσαρμοστές (adaptors). Σε αντίθεση με μικκά μόρια RNA (micrornas ή mirnas, Piwi-interacting RNAs ή pirnas, short interfering RNAs ή sirnas) τα οποία μπορούν άμεσα να αλληλουχιθούν, μεγαλύτερα μόρια RNA όπως τα mrna δεν μπορούν να αλληλουχιθούν, γι αυτό υφίστανται πρώτα ενζυματική επεξεργασία με την οποία δημιουργούνται μικρά τμήματα cdnas στα οποία συνδέονται στο ένα ή και στα δύο άκρα τους (5 & 3 ) προσαρμοστές (adaptors). Καθένα απ αυτά τα τμήματα cdna αλληλουχείται είτε από το ένα άκρο τους (single-end sequencing) ή και από τα δύο άκρα τους (pair-end sequencing) παράγοντας μια μικρή αλληλουχία, που τυπικά είναι μεταξύ bp, και αυτό εξαρτάται από τη μέθοδο αλληλούχισης του DNA, όπως η τεχνολογία Illumina IG, Applied Biosystems SOLiD και Roche_454 Life Science. Οι αλληλλουχίες (sequences ή reads) συγκρίνονται με το γονιδίωμα και ταξινομούνται σε 3 τύπους: εξονικές αλληλουχίες (εξόνια), αλληλουχίες σύνδεσης εξονίων/ιντρονίων (junction reads), και αλληλουχίες πολύ-α+ (poly-a end-reads). Αυτοί οι τύποι των αλληλουχιών χρησιμοποιούνται για την απόδοση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Η ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων σε διαφορετικά βιολογικά δείγματα γίνεται με τη βοήθεια βιοπληροφορικής η οποία επιτρέπει την ανάλυση πολλών δεδομένων ταυτόχρονα.

19 Wang Z et al (2009) RNA-seq. Nature Rev Genet

20 Ας υποθέσουμε ότι έχουμε μια βιβλιοθήκη cdna και επιθυμούμε να μελετήσουμε το ρόλο ενός ή περισσοτέρων γονιδίων στην ανάπτυξη ενός ιστού/οργάνου ή σε μια νόσο. Οι παραδοσιακές μεθόδους κλωνοποίησης χρησιμοποιούν τεχνικές όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για συγκεκριμένη περιοχή γονιδίου και ένζυμα περιορισμού για την εκτομή (κοπή) των άκρων και κλωνοποίηση τους σε πλασμίδιο/φορέα κλωνοποίησης. Αν πρόκειται να γίνουν αναλύσεις στο επίπεδο του γονιδιώματος με τεχνικές υψηλής κλίμακας και απόδοσης (high-throughput), με διαφορετικές κατασκευές φορέων έκφρασης γονιδίων, θα πρέπει ο τρόπος σύνθεσης αυτών των κατασκευών να εμφανίζει υψηλή απόδοση. Για το σκοπό αυτό υπάρχουν μοντέρνες προσεγγίσεις κατασκευής με υψηλή απόδοση: 1. Κλωνοποίηση τύπου Gateway (Gateway cloning) 2. PCR σύντηξης (Fusion PCR) 3. Μηχανική ανασυνδυασμού (Recombineering) Οι μέθοδοι κλωνοποίησης σε μεγάλη παραδοσιακών μεθόδων κλωνοποίησης. κλίμακα υπερτερούν των

21 The lambda (λ) Int system for use in Gateway cloning) (a) attp (the phage site) + attb (the bacterial site) results in the integration of lambda into the E. coli chromosome. Integrated lambda DNA is flanked by two hybrid att sites: attl (left) and attr (right) - each is derived from one half of attp and attb. This process requires the lambda Int protein and the bacterial protein IHF ( Integration host factor ). IHF is a heterodimer of two E. coli proteins. (b) attl + attr results in the excision of lambda (restoring attp and attb) during the induction of lambda prophage. This process requires Int, IHF, and lambda Xis ( for "excise") proteins. E. coli Fis protein stimulates the excision but is not required absolutely. (c) All att sites consist of a homologous 15 bp core region where the exchange takes place. Flanking the core are two Int binding sites in inverted orientation. The attp site is large, having 235 bp with complex series of binding sites for Xis, Int, IHF and Fis on either side of the core. The attb is much simpler at 30 bp in size and consists only of the core and the two core Int binding sites.

22 1. Κλωνοποίηση τύπου Gateway (Gateway cloning) Η κλωνοποίηση τύπου Gateway βασίζεται στον ανασυνδυασμό μεταξύ ειδικών θέσεων του βακτηριοφάγου λ για τη μεταφορά αλληλουχιών μεταξύ πλασμιδίων που φέρουν εκατέρωθεν συμβατές θέσεις ανασυνδυασμού, attl1 & L2 [recombination attachment (att) sites]. Κατασκευή γονιδίου μέσω PCR με τη χρήση ειδικών εκκινητών ώστε να φέρει στο 5 & 3 άκρα του θέσεις attb1 & attb2. Το προϊόν αυτό της PCR (attb1-γονίδιοattb2) αναμιγνύεται με πλασμίδια-δότες (Donor plasmids) και το ένζυμο BP ρεκομπινάση (BP clonase), που καταλύει τον ανασυνδυασμό και την ενσωμάτωση του προϊόντος PCR με τις θέσεις attb1 & attb2 στις θέσεις ανασυνδυασμού του πλασμιδίου-δότη, P1 & P2. Η ρεκομπινάση αντικαθιστά την αλληλουχία ccdb (δεξιά μπλε κύκλος), που είναι ο δείκτης ότι το γονίδιο ενδιαφέροντος έχει μεταφερθεί. Οι νέες θέσεις ανασυνδυασμού που προκύπτουν μετά την ενσωμάτωση του προϊόντος PCR με τις θέσεις attb1 & attb2 στις θέσεις του πλασμιδίου-δότη, P1 & P2, ονομάζονται θέσεις ανασυνδυασμού, attl1 & L2. Το πλασμίδιο που προκύπτει στα ονομάζεται κλώνος ή φορέας εισαγωγής (entry clone) ο οποίος εισάγεται σε βακτήρια και επιλέγεται σε καναμυκίνη.

23

24 1.Στη συνέχεια το γονίδιο μπορεί να μεταφερθεί από τον κλώνο εισαγωγής (entry clone) σε οποιοδήποτε φορέα προορισμού (Destination vector). Το γονίδιο κλωνοποιείται σε ένα φορέα εισαγωγής όπου οριοθετείται αμφίπλευρα με 2 θέσεις ανασυνδυασμού attl1 και attl2, ενώ ο φορέας είναι μεταγραφικά ανενεργός και όταν εισαχθεί σε βακτήρια (βακτηριακός μετασχηματισμός) επιφέρει ανθεκτικότητα σε καναμυκίνη (Kmr). 2.Το γονίδιο μπορεί να μεταφερθεί σε ένα φορέα προορισμού ο οποίος θα περιέχει όλες τις ρυθμιστικές περιοχές που απαιτούνται για την έκφραση του γονιδίου και θα επιφέρει σε βακτήρια ανθεκτικότητα σε αμπικυλίνη (Apr). Το πλασμίδιο-φορέας προορισμού θα περιέχει επιπλέον 2 θέσεις ανασυνδυασμού, attr1 & attr2, που βρίσκεται αμφίπλευρα του γονιδίου ccdb για αρνητική επιλογή. 3.Τα δύο πλασμίδια (φορέας εισαγωγής και φορέας προορισμού) αναμιγνύονται μεταξύ τους και προστίθεται η LR ρεκομπινάση (LR Clonase), η οποία αποτελείται από το ένζυμο ιντεγκράση ή ενσωματάση (Int) του βακτηριοφάγου λ που δρα ως ρεκομπινάση και τον παράγοντα ενσωμάτωσης του βακτηρίου E. coli, IHF (Integration Host Factor) καθώς επίσης και τον παράγοντα εκτομής Xis. 4.Οι θέσεις att1 και att2 επιφέρουν κατεύθυνση, έτσι ώστε μόνον η θέση attl1 θα αντιδράσει με την attr1, και η attl2 με την attr2. 5.Οι δύο γενετικοί ανασυνδυασμοί είναι απαραίτητοι ώστε να προκύψει ο φορέας έκφρασης, ένας ανασυνδυασμός μεταξύ των θέσεων attl1 και attr1, και ο άλλος μεταξύ των attl2 και attr2. 6. Το τελικό προϊόν αυτών των 2 ανασυνδυασμών είναι ο φορέας έκφρασης που φέρει το επιθυμητό γονίδιο και ένα παραπροϊόν που στην ουσία είναι ο φορέας-δότης (donor vector). Το επιθυμητό πλασμίδιο επιλέγεται με βάση την Apr και το ccdb, το οποίο είναι γονίδιο αρνητικής επιλογής (κωδικοποιεί μια τοξίνη-αναστολέα τοποισομεράσης).

25

26 2. PCR σύντηξης (Fusion PCR) Χρησιμοποιείται κυρίως σε νηματώδεις σκώληκες C. elegans, και συμπεριλαμβάνει αντίδραση PCR για το επιθυμητό γονίδιο (gene of interest), και επίσης του γονιδίου αναφοράς όπως GFP που πραγματοποιείται έτσι ώστε μια μικρή ουρά στο άκρο του εκκινητή g (μπλε κύκλος), είναι συμπληρωματικό με το άλλο προϊόν της PCR (C, μπλε βέλος). Συνδυάζοντας τις δύο αντιδράσεις και στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μόνο τους εξωτερικούς εκκινητές Α & D (υποδεικνύεται από 2 μπλε βέλη) προκύπτουν υβριδικά προϊόντα PCR που συντήκουν το επιθυμητό γονίδιο με ένα γονίδιο αναφοράς. Έτσι, δεν χρειάζεται να κλωνοποιηθεί τίποτα στην πραγματικότητα, γιατί έχοντας ένα γραμμικό μόριο DNA είναι αρκετό και λειτουργεί αρκετά καλά.

27 Η μέθοδος με γονίδια αναφοράς απαιτεί την κατασκευή ενός διαγονιδίου (με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA) και την εισαγωγή του σε κύτταρα ή σε οργανισμό. Δεν μπορούν να γίνουν διαγονιδιακοί άνθρωποι για να δούμε που εκφράζεται ένα ανθρώπινο γονίδιο. Για αυτό το λόγο οι διαγονιδιακοί οργανισμοί-μοντέλα, δίνουν μία αναλογία για τη φυσιολογία / παθολογία ανθρώπινων ή συγγενών γονιδίων. Οι πιο απλοί οργανισμοί επιτρέπουν τη δημιουργία πραγματικών ζωικών μοντέλων, όπως κάποια είδη ψαριών [π.χ. ψάρι ζέβρα (zebrafish)] και η φρουτόμυγα (Drosophila melanogaster). Π.χ., στις φρουτόμυγες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια συσκευή για την έγχυση DNA σε ωοκύτταρα προς παραγωγή σκουληκιών. Μπορεί αντίστοιχα, να γίνει κάτι παρόμοιο με ένεση ή με βομβαρδισμό σωματιδίων. Σε κάθε περίπτωση, το κόστος είναι εκατοντάδων ευρώ, ενώ στην περίπτωση του ποντικού το κόστος παραγωγής διαγονιδιακών ζώων ανέρχεται σε χιλιάδες ευρώ ανά ζώο ή ανά στέλεχος, ενώ τα είδη των πειραμάτων που μπορεί γίνουν είναι πολύ πιο περιορισμένα.

28 Πειράματα που μπορούν να διεξαχθούν με υψηλής απόδοσης τεχνικές; - Χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) για ανίχνευση της έκφρασης - Η υπερέκφραση ή η ιδιοστατική ενεργοποίηση ενός γονιδίου προκαλεί ένα φαινότυπο, π.χ. ανθρώπινα σύνδρομα, Τύποι καρκίνου

29 ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) για ανίχνευση της έκφρασης

30 Καρκίνος του Πνεύμονα Μικροκυτταρικός καρκίνος (Small Cell; SCLC) ~12% Μη Μικροκυτταρικός καρκίνος (Non-Small Cell; NSCLC) ~87% Υγιής πνεύμονας: Οι μικρές μαύρες κουκίδες οφείλονται σε εναποθέσεις άνθρακα από την περιβαλλοντική μόλυνση. Πνεύμονας με καρκίνο: Τα λευκά στίγματα αντιπροσωπεύουν τις καρκινικές περιοχές, ενώ οι μαύρες περιοχές οφείλονται στις εναποθέσεις πίσσας, χαρακτηριστικό των καπνιστών. Πνεύμονες από διαγονιδιακά ποντίκια KRas: Καρκίνος του πνεύμονα διαγινιδιακώ ζώων που υπερεκφράζουν το μεταλλαγμένο ογκογονίδιο K-Ras στους πνεύμονες ματά από (a) 30, και (b) 150 ημέρες ενεργοποίησης του K-Ras.

31 Απομόνωση πολύ-α mrna Τα μόρια mrna των ευκαρυωτικών οργανισμών φέρουν στο 3 άκρο τους μια ουρά πολυ-α που χρησιμοποείται για την απομόνωση του από συνολικό κυτταρικό RNA. Συνολικό κυτταρικό RNA περνά διαμέσου μιας στήλης που φέρει σφαιρίδια κυτταρίνης ή αγαρόζης στα οποία έχουν προσκολληθεί ολιγο(dt). Οι ουρές πολύ-α των μορίων mrna υβριδοποιούνται με τα ολιγο-dt, με αποτέλεσμα το mrna να συγκρατείται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα RNA περνούν διαμέσου της στήλης. Μετά από εκτενή πλύση της στήλης, προκειμένου να απαομακρυνθούν υπολείματα RNA πλην mrna, γίνεται έκλουση των mrna με ένα ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής ιοντικής ισχύος. Κάτω απ αυτές τις συνθήκες, τα υβρίδια πολύ(α)-ολιγο(dt) διαχωρίζονται και το καθαρισμένο mrna αποκολλάται από τη στήλη και συλλέγεται.

32 Σύνθεση cdna: Το mrna επωάζεται με ολιγο-dt το οποίο υβριδοποιείται με τις ουρές πολύ-α και λειτουργεί ως εκκινητής για να αρχίσει η σύνθεση DNA από την αντίστροφη μεταγραφάση (RT). Σε περίπτωση που το cdna πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή βιβλιοθήκης (κλωνοποίηση σε φορέα), τα ολιγονουκλεοτίδια-εκκινητές σχεδιάζονται να περιέχουν μια θέση περιορισμού, όπως η XhoI, προκειμένου να δημιουργηθούν κολλώδη άκρα για τη σύνδεση με το φορέα. Σο mrna προστίθενται εκτός από το ολιγο-dt, RT, και τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps) εκ των οποίων μεθυλιωμένη τριφωσφορική δεοξυκυτοσίνη (medctp) αντί της μη μεθυλιωμένης μορφής που περιέχουν τα κύτταρα. Έτσι συντίθενται μόρια cdna πάνω στα mrna-μήτρες. Στη συνέχεια οι κλώνοι RNA θα πρέπει να αποδομηθούν και να αντικατασταθούν από DNA. Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση της RNAάσης H που δημιουργεί εγκοπές στο RNA. Από το ελέυθερο 3 -ΟΗ των εγκοπών αρχίζει τον πολυμερισμό δεοξυνουκλεοτιδίων η DNA πολυμεράση της E. Coli, που με τη δράση εξωνουκλεάσης 5 προς 3 που διαθέτει, παράλληλα με τη σύνθεση DNA, απομακρύνει τα τμήματα RNA που βρίσκονται μπροστά της. Αυτό το στάδιο σύνθεσης πραγματοποιείται με τη χρήση μη μεθυλιωμένης dctp ώστε να εξασφαλιστεί ότι η θέση Xho I που βρίσκεται στα άκρα των cdna θα παραμένει αμεθυλίωτη. Τελικά, τα περισσότερα τμήματα RNA αντικαθίστανται από DNA. Με τη χρήση DNA λιγάσης εξαλείφονται οι εγκοπές και ολοκληρώνεται ο σχηματισμός του δίκλωνου cdna. Αν επωάσουμε το cdna με Xho I θα κοπεί μόνον η ακραία θέση αναγνώρισης του ενζύμου και όχι τυχόν άλλες εσωτερικές θέσεις Xho I, καθώς αυτές θα φέρουν medctp. Στον ένα κλώνο cdna.