ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΨΗΛΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΟΝΤΕΛΩΝ in vivo Δρ. Γεώργιος Μαρκόπουλος, Ph.D. Βιολόγος, Μεταδιδακτορικός Ερευνητής και Ευάγγελος Κωλέττας, Ph.D.(LON) Αναπληρωτής Καθηγητής Εργαστήριο Βιολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

2 ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Η γονιδιωματική (Genomics): Τομέας της γενετικής που εφαρμόζει την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, μεθόδους αλληλούχισης DNA (DNA sequencing methods) και βιοπληροφορικής (bioinformatics) για την αλληλούχιση, την οργάνωση ανάλυση της δομής και της λειτουργίας γονιδιωμάτων. Η γονιδιωματική εστιάζεται σε διαφορετικά πεδία έρευνας: 1. Λειτουργική γονιδιωματική (Functional Genomics): Έκφραση και λειτουργία γονιδίων (και πρωτεϊνών) και τις αλληλεπιδράσεις τους. 2. Δομική Γονιδιωματική (Structural Genomics): Καθορισμός της τρισδιάστατης δομής (3D) κάθε μιας πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από ένα συγκεκριμένο γονιδίωμα. 3. Επιγονιδιωματική (Epigenomics): Ανάλυση των αναστρέψιμων επιγενετικών τροποποιήσεων του DNA (μεθυλίωση του DNA) ή των ιστονών (μεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση) ενός κυττάρου που αναφέρεται ως επιγένωμα ή επιγονιδίωμα, και οι οποίες επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων, χωρίς να μεταβάλλουν την αλληλουχία του DNA. 4. Μεταγονιδιωματική (Metagenomics): Μελέτη μεταγονιδιωμάτων, δηλαδή γενετικού υλικού που προκύπτει από δείγματα που ανευρίσκονται στο περιβάλλον.

3 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Έκφραση και λειτουργία γονιδίων (και πρωτεϊνών) και τις αλληλεπιδράσεις τους. Μικροσυστοιχία DNA (DNA microarray ή DNA Chip ή Biochip) Κύριο χαρακτηριστικό: Η εφαρμογή μεθόδων γονιδιωματικής υψηλής απόδοσης και ανάλυσης (genome-wide approach involving high-throughput methods), αντί μιας προσέγγισης σε επίπεδο απλών γονιδίων ('gene-by-gene' approach) για τη μελέτη προτύπων γονιδιακής έκφρασης σε διάφορες συνθήκες. Τέτοιες προσεγγίσεις αποτελούν οι μικροσυστοιχίες DNA σε συνδυασμό με τη βιοπληροφορική. Η μελέτη των μεταγραφικών προτύπων αναφέρεται στο σύνολο των μορίων RNA - mrna, rrna, trna, και μη-κωδικών (non-coding) RNA (transcriptome) που μεταγράφονται σε ένα κύτταρο ή σε έναν πληθυσμό κυττάρων (transcriptomics). Η αλληλούχιση αυτών των μεταγραφημάτων είναι δυνατή με την τεχνολογία RNA-seq.

4 Σκοπός της λειτουργικής γονιδιωματικής είναι η κατανόηση της σχέσης μεταξύ του γονιδιώματος ενός οργανισμού και του φαινοτύπου. Επομένως, εκτός από την έκφραση γονιδίων, η λειτουργική γονιδιωματική ασχολείται και με τις επιπτώσεις των μεταλλάξεων και μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (single nucleotide polymorphism; SNP) στο φαινότυπο. Ασχολείται επίσης με: (α) Την ανάλυση της έκφρασης, δομής και λειτουργίας των πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα, που αναφέρεται ως πρωτεομική (proteomics), και (β) Τη μελέτη βιοχημικών διαδικασιών και των μεταβολιτών τους σε ένα κύτταρο, πληθυσμό κυττάρων, ενός ιστού, ενός οργάνου ή και ενός οργανισμού, που αναφέρεται ως μεταβολωμική (metabolomics). Η λειτουργική γονιδιωματική εφαρμόζεται και στο επίπεδο DNA για: (α) Τη χαρτογράφηση γενετικών αλληλεπιδράσεων (β) Την ταυτοποίηση λειτουργικών στοιχείων σε κωδικές και μη-κωδικές περιοχές του γονιδιωματικού DNA [The ENCODE (Encyclopedia of DNA elements) project]. Επομένως, άλλες τεχνικές της λειτουργικής γονιδιωματικές που αποσκοπούν στην απώλεια της λειτουργίας γονιδίων, συμπεριλαμβάνουν: - Την μεταλλαξιγένεση (mutagenesis) που αναφέρεται στην απάλειψη ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (gene knockout), ή στη διάρρηξη της συνέχειας ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (gene disruption), και - Την παρεμβολή με RNAi (RNA interference) που αναφέρεται στην αποσιώπηση ή τη μειρρύθμιση της έκφρασης ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (sirna ή ShRNA).

5 Γονιδιωματική υψηλής ανάλυσης οργανισμών μοντέλων in vivo Η γονιδιωματική υψηλής ανάλυσης οργανισμών οργανισμών-μοντέλων in vivo αναφέρεται στην εφαρμογή των αρχών της γονιδιωματικής προκειμένου να αναλυθεί η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ζωντανούς οργανισμούς. Πολλές μέθοδοι της γονιδιωματικής είναι προσαρμοσμένες για αναλύσεις σε κυτταρικές σειρές και καταστάσεις in vitro. Προκειμένου να αντλήσουμε πληροφορίες για το τι πραγματικά συμβαίνει στο εσωτερικό των ζωντανών οργανισμών, απαιτούνται εξειδικευμένες μέθοδοι γονιδιωματικής ανάλυσης in vivo. Tα ζώα και άλλοι πολυκύτταροι οργανισμοί έχουν μία απίστευτη ποικιλία κυτταρικών τύπων στο εσωτερικό τους: (Α) Ινοβλάστες (Β) Ενδοθηλιακά κύτταρα (Γ) Νευρώνες, και (Δ) Διαφορετικοί τύποι κυττάρων του αίματος Καθένα από αυτά τα διαφορετικά είδη κυττάρων προκύπτει επειδή εκφράζουν διαφορετικά τμήματα του γονιδιώματος, και η εύρεση των διαφορών στην έκφραση γονιδίων ανά κυτταρικό τύπο είναι πραγματικά βασικές για την κατανόηση της διαφορετικής φυσιολογίας κάθε κυττάρου.

6 Μέθοδοι ανάλυσης διαφορικής έκφρασης γονιδίων Περιορισμένη χωροταξική Μικροσυστοιχίες DNA/RNA-seq/Φασματοφωτομετρία μάζας διακριτικότητα, ευκολότερα για έκφραση RNA Αντιδραστήρια συγγένειας Υβριδισμός in situ (In situ hybridization) - μη-ειδικές αντιδράσεις αλληλεπιδράσεις Ανοσοιστοχημεία (Immunostaining) (subject to cross-reactivity), λιγότερο ειδοειδικές (less generic), απαιτούν μονιμοποίηση Γονίδια αναφοράς μεταγραφής γονιδίων (Transcriptional reporters) Γονίδια αναφοράς μετάφρασης γονιδίων (Translational reporters) Στελέχη γονιδίων αναφοράς - απαιτείται κατασκευή διαγονιδιακών οργανισμών - προσομοιάζουν κατά προσέγγιση τη φυσική έκφραση γονιδίων - η υπερέκφραση μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα - περιορίζεται σε οργανισμούς-μοντέλα Μικρά μόρια συζευγμένα με χρωστικές ουσίες (Dye-conjugated small molecules) π.χ. Phalloidin - Περιορισμένοι στόχοι Ορισμένες παραδοσιακές μέθοδοι ποσοτικοποίησης επέτρεψαν τη μέτρηση διαφορών στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ κυττάρων, οργανισμών, υπό διαφορετικές συνθήκες, κλπ. Τέτοιες μέθοδοι είναι μικροσυστοιχίες DNA, αλληλούχιση RNA (RNA-seq), φασματοφωτομετρία μαζών (Mass spectrometry), και εφαρμόζονται σε βιολογικά δείγματα για να διερευνηθεί η διαφορική έκφραση γονιδίων. Κάθε μέθοδος όμως μπορεί να έχει συγκεκριμένους περιορισμούς, όπως η χωροταξική διακριτικότητα. Οι μοντέρνες μέθοδοι όπως o φθορίζων υβριδισμός RNA in situ (RNA FISH; FISH, Fluorescence in situ hybridisation) ή η χρώση με αντισώματα, μπορούν να αναλύσουν τη γονιδιακή έκφραση σε επίπεδο οργανισμού, αλλά και αυτές έχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Μια τρίτη προσέγγιση είναι η χρήση φορέων έκφρασης που φέρουν γονίδια αναφοράς, όπως η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP.

7 ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ 1. Μέθοδοι ποσοτικοποίησης - Μικροσυστοιχίες (microarray) - Αλληλούχιση RNA (RNA-seq) - Συνολικό πρωτέωμα, όπως η φασματοσκοπία μάζας (Mass spectrometry) 2. Μέθοδοι in situ χωροταξικής ανάλυσης μέσω χρώσης αντισωμάτων ή RNA - Φθορίζων υβριδισμός RNA in situ (RNA FISH) για την αναγνώριση μεμονωμένων μεταγράφων - Ανοσοφθορισμός με χρήση αντισωμάτων για την αναγνώριση συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Μ αυτές τις τεχνικές μπορεί να γίνει χρώση τμημάτων ολόκληρου ιστού, ή σε ορισμένες περιπτώσεις να αναλυθούν ολόκληροι οργανισμοί. 3. Μέθοδοι γονιδίων αναφοράς που επιτρέπουν να αναλυθεί ένας υποκινητής γονιδίου ή να ιχνηθετηθεί ένα γονίδιο. Για παράδειγμα, ένα γονίδιο αναφοράς είναι η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein; GFP) ή μία πρωτεΐνη σε σύντηξη με την GFP, επιτρέπουν την ανάλυση του υποκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης. Η μέθοδος απαιτεί την κατασκευή ενός διαγονιδίου (με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA) και την εισαγωγή του σε κύτταρα ή σε οργανισμό υπό μελέτη. Προφανώς, δεν μπορούν να γίνουν διαγονιδιακοί άνθρωποι για να δούμε που εκφράζεται ένα ανθρώπινο γονίδιο. Για αυτό το λόγο οι διαγονιδιακοί οργανισμοί-μοντέλα, δίνουν μία αναλογία για την φυσιολογία/παθολογία ανθρώπινων ή συγγενών γονιδίων.

8 Αντίθετα, οι πιο απλοί οργανισμοί επιτρέπουν τη δημιουργία πραγματικών ζωικών μοντέλων, όπως κάποια είδη ψαριών [π.χ. ψάρι ζέβρα (zebrafish)] και η φρουτόμυγα (Drosophila melanogaster). Για παράδειγμα, στις φρουτόμυγες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια συσκευή για την έγχυση DNA σε ωοκύτταρα προς παραγωγή σκουληκιών. Μπορεί αντίστοιχα, να γίνει κάτι παρόμοιο με ένεση ή με βομβαρδισμό σωματιδίων. Σε κάθε περίπτωση, το κόστος είναι εκατοντάδων ευρώ, ενώ στην περίπτωση του ποντικού το κόστος παραγωγής διαγονιδιακών ζώων ανέρχεται σε χιλιάδες ευρώ ανά ζώο ή ανά στέλεχος, ενώ τα είδη των πειραμάτων που μπορεί γίνουν είναι πολύ πιο περιορισμένα.

9 Αν πρόκειται να γίνουν αναλύσεις στο επίπεδο του γονιδιώματος με τεχνικές υψηλής κλίμακας (high throughput), με διαφορετικές κατασκευές φορέων έκφρασης γονιδίων αναφοράς, θα πρέπει ο τρόπος σύνθεσης αυτών των κατασκευών να εμφανίζει υψηλή απόδοση. Βέβαια, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και οι παραδοσιακές μεθόδους κλωνοποίησης, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για συγκεκριμένη περιοχή γονιδίου και ένζυμα περιορισμού για την εκτομή (αποκοπή) των άκρων και κλωνοποίηση τους σε πλασμίδιο/φορέα κλωνοποίησης. Παρόλα αυτά υπάρχουν μοντέρνες προσεγγίσεις κατασκευής με υψηλή απόδοση: 1. Κλωνοποίηση τύπου Gateway (Gateway cloning) 2. PCR σύντηξης (Fusion PCR) 3. Μηχανική ανασυνδυασμού (Recombineering) Αυτές οι μέθοδοι υπερτερούν των παραδοσιακών μεθόδων κλωνοποίησης σε μεγάλης κλίμακας προσεγγίσεις σαν αυτές που απεικονίζονται παρακάτω.

10 1. Κλωνοποίηση τύπου Gateway (Gateway cloning) Η κλωνοποίηση τύπου Gateway βασίζεται στον ανασυνδυασμό μεταξύ ειδικών θέσεων του βακτηριοφάγου λάμδα (λ) για τη μεταφορά αλληλουχιών μεταξύ πλασμιδίων που φέρουν εκατέρωθεν συμβατές θέσεις ανασυνδυασμού, att [recombination attachment (att) sites]. Περιλαμβάνει τη λήψη του γονιδίου ενδιαφέροντος για τη δημιουργία ενός γονιδίουαναφοράς μέσω PCR με τη χρήση ειδικών εκκινητών. Οι εκκινητές φέρουν εκτός από την αλληλουχία αναγνώρισης του γονιδίου, ειδικά άκρα που αναγνωρίζονται από ένα συγκεκριμένο ένζυμο τη ρεκομπινάση (recombinase). Το σύστημα απαιτεί το ένζυμο ιντεγκράση (ή ενσωματάση (Int) του βακτηριοφάγου λ που δρα ως ρεκομπινάση και τον παράγοντα ενσωμάτωσης του βακτηρίου E. coli, IHF (Integration Host Factor) που μαζί αναφέρονται ως BP clonase. Η ρεκομπινάση μπορεί να ανασυνδυάζει το προϊόν PCR με ένα πλασμίδιο (βέλος) που έχει τις αντίστοιχες συγγενείς (cognate) θέσεις ανασυνδυασμού, και αντικαθιστά την αλληλουχία ccdb (δεξιά μπλε κύκλος), η οποία είναι ο δείκτης ότι το γονίδιο ενδιαφέροντος έχει μεταφερθεί, καθώς μπορεί να επιλέγεται αρνητικά.

11 2. PCR σύντηξης (Fusion PCR) Χρησιμοποιείται κυρίως σε νηματώδεις σκώληκες C. elegans, και συμπεριλαμβάνει αντίδραση PCR για το επιθυμητό γονίδιο (gene of interest), και επίσης του γονιδίου αναφοράς όπως η GFP που πραγματοποιείται έτσι ώστε μια μικρή ουρά στο άκρο του εκκινητή g (μπλε κύκλος), είναι συμπληρωματικό με το άλλο προϊόν της PCR (μπλε βέλος). Συνδυάζοντας τις δύο αντιδράσεις και στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μόνο τους εξωτερικούς εκκινητές (υποδεικνύεται από 2 μπλε βέλη) προκύπτουν υβριδικά προϊόντα PCR που συντήκουν το επιθυμητό γονίδιο με ένα γονίδιο αναφοράς. Έτσι, δεν χρειάζεται να κλωνοποιηθεί τίποτα στην πραγματικότητα, γιατί έχοντας ένα γραμμικό μόριο DNA είναι αρκετό και λειτουργεί αρκετά καλά.

12 3. Μηχανική ανασυνδυασμού (Recombineering) Στην πραγματικότητα έχει παρόμοια προσέγγιση με τη μέθοδο Gateway, όπου υπάρχουν άκρα με ομολογία (μπλε κύκλοι). Σ αυτή την τεχνική, οι αλληλουχίες είναι ομόλογες με το πλασμίδιο-στόχο, και μπορεί να χρησιμοποιηθούν από ένα λάμδα (λ) φορέα. Οι αλληλουχίες αναγνωρίζονται από μια συγκεκριμένη ρεκομπινάση, που ουσιαστικά προκαλεί τον ανασυνδυασμό του προϊόντος της PCR με το πλασμίδιο-στόχο παράγοντας ένα συντηγμένο γονίδιο με συγκεκριμένο τρόπο σε αυτό το πλασμίδιο-στόχο.

13 Τι πειράματα μπορούν να διεξαχθούν με φθηνό υλικό (π.χ. μικρόβια, κυτταρικές σειρές) με υψηλής απόδοσης τεχνικές; Διαλογή μέσω μιας βιβλιοθήκης με πλασμίδια έκφρασης - Η υπερέκφραση ενός γονιδίου προκαλεί ένα φαινότυπο - Χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) για ανίχνευση της έκφρασης Μετασχηματισμός με πολλές κατασκευές παράλληλα - π.χ. Γονίδια αναφοράς (reporters) για όλα τα γονίδια σε ζυμομύκητες - Δημιουργία δεικτών για άλλα είδη (BAC, φοσμίδιο, πλασμίδιο) Στην περίπτωση μικροβιακών συστημάτων μπορούν να δημιουργηθούν βιβλιοθήκες υψηλής πολυπλοκότητας διαφόρων διαγονιδίων. Θα πρέπει όμως να έχουμε υπ όψιν ότι αρκετά γονίδια μπορεί να είναι επιζήμια ή να μην εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα φυσιολογικά. Έτσι, άλλη μία προσέγγιση είναι ο ταυτόχρονος μετασχηματισμός με πολλές κατασκευές. Κάτι τέτοιο μπορεί να πραγματοποιηθεί για όλα τα γονίδια σε ένα είδος. Ήδη υπάρχουν διαθέσιμες βιβλιοθήκες με γονίδια αναφοράς συντηγμένα με GFP για σχεδόν κάθε γονίδιο στον σκώληκα C. elegans, έτσι ώστε ανεξάρτητες ερευνητές μπορούν να χρησιμοποιήσουν.

14 Συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές υποκινητών Σε κυτταρικές σειρές και σε μικροβιακά συστήματα όπως στο E. coli, έχει πραγματοποιηθεί συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές υποκινητών που μπορούν να επηρεάζουν την γονιδιακή έκφραση, ώστε να προσδιοριστούν ποιά νουκλεοτίδια μίας ακολουθίας είναι πραγματικά σημαντικά στη γονιδιακή ρύθμιση. Το συγκεκριμένο παράδειγμα αναφέρεται στην πορεία μεταβολισμού της λακτόζης στο Ε. coli. Στη μελέτη, κλωνοποιήθηκε η αλληλουχία που αντιστοιχεί στον υποκινητή λακτόζης, μήκους ~75 βάσεων (bp), και πραγματοποιήθηκε μια υψηλής απόδοσης μεταλλαξιγένεση της αλληλουχίας, ώστε κάθε επιμέρους αλληλουχία DNA να έχει ~10 μεταλλάξεις. Tα τμήματα που προέκυψαν κλωνοποιήθηκαν ως μια βιβλιοθήκη ανοδικά ενός γονιδίου αναφοράς GFP, που στη συνέχεια εισήχθησαν σε κύτταρα. Έτσι, κάποια κύτταρα είχαν μία μετάλλαξη, άλλα κύτταρα είχαν άλλη μετάλλαξη, έτσι ώστε εντός του πληθυσμού, υπήρχαν κύτταρα, που είχαν όλες τις πιθανές μεταλλάξεις. Συστηματική μεταλλαξιγένεσης στη ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή lac του E. coli. (Α) Mεταλλαγμένοι υποκινητές lac στην περιοχή [-75: -1] προάγουν την έκφραση της GFP. (Β) Τα πλασμίδια που περιέχουν μεταλλαγμένο υποκινητή lac-gfp μετασχηματίστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα Ε. coli, και στη συνέχεια τα κύτταρα επάχθηκαν και επιλέχθηκαν μέσω κυτταρομετρία ροής (ανάλυση με FACS; Fluorescence Activated Cell Sorting). Αλληλούχιση των μεταλλαγμένων υποκινητών σε κάθε FACS έδωσε μια μακρά λίστα των αλληλουχιών σ με αντίστοιχες μετρήσεις έκφρασεις GFP, μ.

15 Ρυθμιστικά αποτυπώματα στον υποκινητή του οπερονίου lac του E. coli Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα κυτταρόμετρο/διαλογέας κυττάρων (cell sorter) που διαχώρισε κύτταρα που είχαν υψηλή έκφραση, μέση έκφραση και χαμηλή έκφραση GFP. Στη συνέχεια, με αλληλούχιση DNA έγινε συστηματική ταξινόμηση αλληλουχιών των υποκινητών με τα επίπεδα έκφρασης, ώστε να βρεθεί ο αντίκτυπος που έχουν μεταλλάξεις στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων, και στην προκειμένη περίπτωση, τη δράση τους στα δύο ρυθμιστικά του στοιχεία, δεδομένου ότι γνωρίζουμε καλά τη βιολογία του υποκινητή lac. Η CRP και η RNA πολυμεράση προσδένονται στο DNA σε ειδικές θέσεις που είναι εντόνως διατηρημένες, δημιουργώντας ένα ρυθμιστικό αποτύπωμα. Το πείραμα μπορεί να επαναληφθεί παρουσία και απουσία της CRP και να βρεθεί το ρυθμιστικό αποτύπωμα από θέσεις πρόσδεσης και για τις δύο πρωτεΐνες. Ρυθμιστικά αποτυπώματα. (Α) Αποτύπωμα από τις γνωστές θέσεις επαφής πρωτεΐνης-dna (φωτισμένο). Παρουσιάζονται δύο μεγεθύνσεις και οι ράβδοι σφαλμάτων από διαφορετικά πειράματα. (Β) Πλήρες αποτύπωμα στο οποίο η ενδοκυτταρική CRP ήταν ανενεργή.

16 Αναπτυξιακά δυναμική γονιδιακή έκφραση σε ζώα Η εικόνα καταδεικνύει το απίστευτα ευρύ φάσμα προτύπων έκφρασης που ανιχνεύονται στα αναπτυσσόμενα ζώα. Απεικονίζονται μερικά από τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης στη Drosophila, όπου η σκοτεινή χρώση είναι η έκφραση ενός συγκεκριμένου γονιδίου, και κάθε ένα από τα πάνελ αναφέρεται στην έκφραση ενός διαφορετικού γονιδίου. Απεικονίζονται τα απίστευτα μοτίβα/ζώνες και τα διάφορα όργανα που σχηματίζονται. Το ίδιο μπορεί να γίνει στο σλώληκα και το ποντίκι.

17 Και γιατί γίνεται αυτό; Γιατί αν γνωρίζουμε που εκφράζεται ένα γονίδιο, αυτό μπορεί να είναι ένδειξη σχετικά με τη λειτουργία του και πώς ρυθμίζεται. Έκφραση των γονιδίων eve και FTZ, γονίδια του κανόνα-ζεύγους στη Drosophila. Τα γονίδια αυτά είναι υπεύθυνα για τον καθορισμό του πρότυπου τμηματικού σχεδίου του σώματος (segmental body plan) που έχει συσταθεί κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης. Εξετάζοντας αυτά τα πρότυπα έκφρασης, μπορεί να συμπεράνουμε ότι μπορεί να εμπλέκονται στην κατάτμηση (segments), δεδομένων των ριγέ μοτίβων.

18 Χάρτες μεγάλης κλίμακας αναπτυξιακής έκφρασης Χάρτες μεγάλης κλίμακας αναπτυξιακής έκφρασης έχουν συλλεχθεί για ένα ευρύ φάσμα οργανισμών. Αυτοί οι χάρτες μπορεί να παρουσιάζουν ένα συγκεκριμένο mrna μέσω ανιχνευτή που υβριδοποιείται σε αυτό το mrna ή μία πρωτεΐνη μέσω ανίχνευσής της με αντισώματα, συντήξεις GFP ή πρωτεΐνη αναφοράς lacz. Κάθε μία από τις ανωτέρω μεθόδους θα πρέπει να πραγματοποιηθεί με μεθόδους υψηλής απόδοσης. Η ερώτηση όμως είναι, πώς ερμηνεύονται τα αποτελέσματα; Αυτό είναι εφικτό με τη συλλογή τέτοιων εικόνων αλλά και την ανάλυση τους, ώστε να μπορούν να δώσουν ασφαλή συμπεράσματα. Ένας τρόπος, αναφορικά με τη μορφολογία του εμβρύου, είναι να έχουμε δύο έμβρυα του ίδιου σταδίου, και να μελετήσουμε αν αλληλεπικαλύπτεται η έκφραση δύο διαφορετικών γονιδίων. Λύσεις δίνονται με τη χρήση οροσήμων (landmarks) πάνω στο έμβρυο, για να γνωρίζουμε το σημείο που εκφράζεται κάθε βιομόριο και η χρώση διαφορετικών μορίων με διαφορετικά χρώματα.

19 Πρωτοπόρος στον τομέα αυτό ήταν το Berkeley Drosophila Genome Project, που πραγματοποίησε in situ υβριδισμό σε τρυβλία 96 φρεατίων Απεικονίζεται in situ υβριδισμό του γονιδίου gt (giant), του οποίου το πρότυπο έκφρασης μεταβάλλεται από το στάδιο 6 στο στάδιο 10. Παρουσιάζεται επίσης και το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου en (engrailed) στο στάδιο 10 που παρουσιάζει πολύ διαφορετικό μοτίβο. Έτσι, θα πρέπει να βρεθεί κάποιος τρόπος να συνδυαστούν όχι μόνο η χωροταξική αλλά και η χρονική διαφορά έκφρασης των αναπτυξιακών προτύπων έκφρασης. Η έκφραση σε ένα στάδιο μπορεί να μην είναι η ίδια όπως η έκφραση σε ένα άλλο στάδιο. Στην πραγματικότητα, συχνά δεν είναι. Επομένως, πως αναλύεται ένα σετ τέτοιων πληροφοριών? Στην περίπτωση μεγάλων μελετών όπως της Drosophila, υπάρχουν χιλιάδες διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης για διαφορετικά γονίδια σε διάφορα στάδια ανάπτυξης. Ένα σημαντικό πρόβλημα είναι η εύρεση κάποιων κοινών τρόπων περιγραφής των προτύπων έκφρασης στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Υπάρχει περίπτωση η έκφραση μερικών γονιδίων να επικαλύπτεται σε ένα σετ κυττάρων. Μια καλή λύση για αυτό είναι κάτι που ονομάζεται ελεγχόμενο λεξιλόγιο (controlled vocabulary), που στην πραγματικότητα χρησιμοποιείται συχνά στα πλαίσια της γονιδιωματικής, όπως για παράδειγμα την οντολογία γονιδίων (gene ontology), που ορίζει συγκεκριμένη ονοματολογία για τα διαφορετικά τμήματα που εντοπίζονται, για παράδειγμα στη φρουτόμυγα, το νηματώδη σκώληκα ή το ποντίκι. Έτσι καθορίζεται αυστηρά η περιοχή έκφρασης γονιδίων κατά την ανάπτυξη.

20 Απεικονίζονται 2 περιοχές έκφρασης στον εγκέφαλο (2 spots in brain) για ένα συγκεκριμένο γονίδιο 1 (gene 1) (αριστερά), που με βάση το ελεγχόμενο λεξιλόγιο μπορούμε να πούμε ότι το γονίδιο 1 εκφράζεται στο προεγκεφαλικό εξώδερμα Α. Αν εστιάσουμε στην εικόνα στα δεξιά όπου απεικονίζεται η έκφραση ενός δεύτερου γονιδίου (gene 2), που με βάση το ελεγχόμενο λεξιλόγιο λέμε ότι το γονίδιο 2 εκφράζεται στο ουριαίο και ραχιαίο προεγκεφαλικό εξώδερμα Α. Αν χρησιμοποιηθεί ένας υπολογιστής για την ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου 1 και του γονιδίου 2, τότε θα ανιχνεύσει ότι η έκφραση των δύο αυτών γονιδίων επικαλύπτεται και ότι και τα δύο εντοπίζονται στην προεγκεφαλικό εξώδερμα Α.

21 Αριστερά: Δεδομένα από εκατοντάδες φωτογραφίες από διαφορετικά έμβρυα δημιουργούν ένα σύνθετο εικονικό έμβρυο. Κάθε επιμέρους έμβρυο βάφεται για πυρήνες, ένα κοινό γονίδιο δείκτη (κόκκινο) και ένα γονίδιο ενδιαφέροντος (2o χρώμα). Σε κάθε χρονική στιγμή, το γονίδιο δείκτης χρησιμοποιείται για να καθοδηγήσει χωρική εγγραφή σε ένα μορφολογικό πρότυπο. Αντιστοιχίες χρονικής φάσης μεταξύ ομάδων παρέχονται από ένα μοντέλο των τυπικών πυρηνικών κινήσεων. Αφού έχουν καθιερωθεί αντιστοιχίες σε όλα τα έμβρυα, οι μέσοι όροι από τις μετρήσεις έκφρασης συνθέτουν ένα μοντέλο Εικονικού Εμβρύου (Virtual Embryo) στην οποία μπορεί να αναλυθεί η έκφραση πολλών γονιδίων. Δεξιά: Σύνθεση τιμών έκφρασης. Η έκφραση του γονιδίου-δείκτη (κόκκινο) χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αντίστοιχων πυρήνων σε διαφορετικά έμβρυα. Κάθε άτομο στρεβλώνεται για να χωρέσει στα εξαχθέντα όρια του γονιδίου δείκτη (κόκκινες γραμμές) σε ευθυγράμμιση με ένα μορφολογικό πρότυπο (μαύρες γραμμές). Οι επιμέρους μετρήσεις ανά πυρήνα (κόκκινο & πράσινο) συντίθενται πάνω στο πρότυπο για να παράγουν μια εκτίμηση της μέσης έκφρασης. Χρησιμοποιήθηκαν 4 διαφορετικά γονίδια: τα knirps (Kni), hunchback (hb), Krüppel (Kr) και giant (gt), που επισημαίνονται με διαφορετικά χρώματα. Σε κόκκινο χρώμα, είναι το γονίδιο eve, ως μάρτυρας οριοθέτησης των τμημάτων (segments), και επομένως αν αυτές οι ζώνες έκφρασης του eve, επιτρέπει να γίνει ανάλυση, όχι πλέον στο επίπεδο ολόκληρου του εμβρύου, αλλά στο επίπεδο του κυττάρου, και να εκχωρηθεί σε κάθε κύτταρο μια θέση σε σχέση με ένα έμβρυο αναφοράς και να ευθυγραμμιστούν τα πρότυπα έκφρασης γονιδίων. Έτσι, αυτό επιτρέπει να χαρτογραφηθεί η έκφραση πάνω από 100 γονιδίων-ρυθμιστών των αρχικών σταδίων της εμβρυογένεσης

22 Μερικές από τις μεθόδους αυτές έχουν χρησιμοποιηθεί στο νηματώδη σκώληκα. Παρουσιάζονται μερικές πρώιμες in situ εικόνες σε σκώληκες. Το πλεονέκτημα των σκουληκιών είναι ότι έχουν αναλλοίωτη ανατομία και γενεαλογία, ενώ μειονεκτήματα για αυτό το είδος είναι ότι είναι μικρά σε μέγεθος και έτσι οι εικόνες in situ υβριδισμού είναι περιορισμένης ανάλυσης και ευαισθησίας, ιδιαίτερα αν χρησιμοποιηθούν παραδοσιακές τεχνικές σήμανσης ενζυμικής ενεργότητας (μπλε κύκλος, δεξιά). Έτσι, μόνο αν είστε ένας εμπειρογνώμονας της ανατομίας των σκωλήκων μπορείτε να πείτε που βρίσκεται το εκάστοτε δείγμα, όπως στο δείγμα στα αριστερά που εντοπίζεται στον φάρυγγα (μπλε κύκλος, αριστερά), ενώ δεν μπορούμε καν να πούμε που τελειώνει το ένα κύτταρο και που αρχίζει το επόμενο.

23 Μια λύση απεικόνισης σε έμβρυα σκουληκιών είναι η αυτοματοποιημένη στοίχιση, που περιγράφηκε για Drosophila. Σχηματική απεικόνιση της WSA. (Α) Εικόνα σκουληκιού σε καμπύλη (a, b) όπου εντοπίζονται οι πυρήνες των κυττάρων μετά από χρώση με DAPI. (b) Η ανιχνευθείσα ραχοκοκαλιά (κόκκινο), τα αντίστοιχα σημεία ελέγχου (κόκκινες κουκκίδες) και ορθογώνια επίπεδα κοπής (Ρ1 & Ρ2). Επίσης απεικονίζεται το όριο του σκουληκιού (μπλε). (c) Η ευθύγραμμη εικόνα του σκουληκιού. (B) Τα μυϊκά κύτταρα σημαίνονται με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Α) Εικόνα από έμβρυο σκώληκα (larva) L1 (a, b), που μπορεί να ευθυγραμμιστεί υπολογιστικά (c), και να σημανθούν με DAPI οι πυρήνες των κυττάρων του (a, c). (B) Όλα τα μυϊκά κύτταρα σημαίνονται με GFP, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν αυτά τα πράσινα μυϊκά κύτταρα με τους μπλε πυρήνες ως ορόσημα για να ευθυγραμμιστούν όλα τα άλλα κύτταρα. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μια κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη αναφοράς για την έκφραση ενός συγκεκριμένου γονιδίου, μπορεί να μελετηθεί ην έκφραση του σε όλα τα διαφορετικά κύτταρα. Αυτή η πρακτική επέτρεψε την ανάλυση της έκφρασης σχεδόν 100 διαφορετικών γονιδίων, κυρίως παραγόντων μεταγραφής. Έτσι, μπορούμε να κατασκευάσουμε ένα χάρτη έκφρασης πολλών διαφορετικών γονιδίων σε ολόκληρη την επικράτεια του εμβρύου, με διακριτική ικανότητα σε επίπεδο κυττάρου σε όλους τους ιστούς, με εξαίρεση το νευρικό δακτύλιο που είναι ένα είδος εγκεφάλου του σκώληκα καθώς η διακριτική ικανότητα της μικροσκοπίας δεν είναι επαρκής για αυτή την ανάλυση.

24 Άτλαντας Εγκεφάλου Allen (Allen Brain Atlas) Τέτοιου είδους προσεγγίσεις δεν θα μπορούσαν να αφήσουν εκτός ανώτερους οργανισμούς όπως το ποντίκι και ο άνθρωπος. Μια τέτοια προσέγγιση είναι ο Άτλαντας Εγκεφάλου Allen (Allen Brain Atlas), μια από τις μεγαλύτερες κλίμακας προσπάθειες οποιουδήποτε είδους σε αυτό το πεδίο. Ο Άτλαντας, αρχικά μόνο σε εγκέφαλο ποντικού, περιλαμβάνει φωτογραφίες από τομές εγκεφάλου όπου παρουσιάζεται επί τόπου (in situ) η έκφραση όλων των γονιδίων του ποντικιού. Ο χρήστης μπορεί να περιηγηθεί σε εικόνες εγκεφάλου, κάνοντας αναζήτηση για γονίδια που συνεκφράζονται σε διαφορετικές περιοχές. Η ίδια προσέγγιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση προτύπων γονιδίων του ανθρώπινου εγκεφάλου. Παρουσιάζεται ο Allen Brain Explorer. Από τον υπολογιστή σας, μπορείτε να αναγνωρίσετε συγκεκριμένες περιοχές, ή την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων, και το πώς αυτά σχετίζονται με διάφορες περιοχές του εγκεφάλου και αν συνεκφράζονται. Σε αυτή την προσέγγιση χρησιμοποιούνται παρόμοιες μέθοδοι ευθυγράμμισης με βάση θέσεις-ορόσημα. Ο Άτλαντας Εγκεφάλου Allen είναι πραγματικά μια απίστευτη πηγή από όπου μπορούμε να αναλύσουμε τα γονίδια που εκφράζονται κατά μήκος του εγκεφάλου. Εξακολουθεί να υπάρχει το ίδιο θέμα ανάλυσης, καθώς αν έχουμε δύο γονίδια που εκφράζεται σε μία συγκεκριμένη περιοχή, δεν μπορούμε να πούμε αν εκφράζονται σε ίδια ή διαφορετικά κύτταρα. Και έτσι αυτή είναι μια συνεχιζόμενη πρόκληση σε αυτό το είδος των προσεγγίσεων.