ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΨΗΛΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΟΝΤΕΛΩΝ in vivo Δρ. Γεώργιος Μαρκόπουλος, Ph.D. Βιολόγος, Μεταδιδακτορικός Ερευνητής και Ευάγγελος Κωλέττας, Ph.D.(LON) Αναπληρωτής Καθηγητής Εργαστήριο Βιολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

2 ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Η γονιδιωματική (Genomics): Τομέας της γενετικής που εφαρμόζει την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, μεθόδους αλληλούχισης DNA (DNA sequencing methods) και βιοπληροφορικής (bioinformatics) για την αλληλούχιση, την οργάνωση και ανάλυση της δομής και της λειτουργίας γονιδιωμάτων. Η γονιδιωματική εστιάζεται σε διαφορετικά πεδία έρευνας: 1. Λειτουργική γονιδιωματική (Functional Genomics): Έκφραση και λειτουργία γονιδίων (και πρωτεϊνών) και τις αλληλεπιδράσεις τους. 2. Δομική Γονιδιωματική (Structural Genomics): Καθορισμός της τρισδιάστατης δομής (3D) κάθε μιας πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από ένα συγκεκριμένο γονιδίωμα. 3. Επιγονιδιωματική (Epigenomics): Ανάλυση των αναστρέψιμων επιγενετικών τροποποιήσεων του DNA (μεθυλίωση του DNA) ή των ιστονών (μεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση) ενός κυττάρου που αναφέρεται ως επιγένωμα ή επιγονιδίωμα, και οι οποίες επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων, χωρίς να μεταβάλλουν την αλληλουχία του DNA. 4. Μεταγονιδιωματική (Metagenomics): Μελέτη μεταγονιδιωμάτων, δηλαδή γενετικού υλικού που προκύπτει από δείγματα που ανευρίσκονται στο περιβάλλον. Ασχολείται επίσης με: (α) Την ανάλυση της έκφρασης, δομής και λειτουργίας των πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα, που αναφέρεται ως πρωτεομική (proteomics), και (β) Τη μελέτη βιοχημικών διαδικασιών και των μεταβολιτών τους σε ένα κύτταρο, πληθυσμό κυττάρων, ενός ιστού, ενός οργάνου ή και ενός οργανισμού, που αναφέρεται ως μεταβολωμική (metabolomics).

3 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ Έκφραση και λειτουργία γονιδίων (και πρωτεϊνών) και τις αλληλεπιδράσεις τους. Κύριο χαρακτηριστικό: Η εφαρμογή μεθόδων γονιδιωματικής υψηλής απόδοσης και ανάλυσης (genome-wide approach involving high-throughput methods), αντί μιας προσέγγισης σε επίπεδο απλών γονιδίων ('gene-by-gene' approach) για τη μελέτη προτύπων γονιδιακής έκφρασης σε διάφορες συνθήκες. Τέτοιες προσεγγίσεις αποτελούν οι μικροσυστοιχίες DNA σε συνδυασμό με τη βιοπληροφορική. Η μελέτη των μεταγραφικών προτύπων αναφέρεται στο σύνολο των μορίων RNA - mrna, rrna, trna, και μη-κωδικών (non-coding) RNA (transcriptome) που μεταγράφονται σε ένα κύτταρο ή σε έναν πληθυσμό κυττάρων (transcriptomics). Η αλληλούχιση αυτών των μεταγραφημάτων είναι δυνατή με την τεχνολογία RNAseq.

4 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ: Έκφραση και λειτουργία γονιδίων (και πρωτεϊνών) και τις αλληλεπιδράσεις τους Μικροσυστοιχία DNA (DNA microarray ή DNA Chip ή Biochip)

5

6 Σκοπός της λειτουργικής γονιδιωματικής είναι η κατανόηση της σχέσης μεταξύ του γονιδιώματος ενός οργανισμού και του φαινοτύπου. Η λειτουργική γονιδιωματική εφαρμόζεται και στο επίπεδο DNA για: (α) Τη χαρτογράφηση γενετικών αλληλεπιδράσεων (β) Την ταυτοποίηση λειτουργικών στοιχείων σε κωδικές και μη-κωδικές περιοχές του γονιδιωματικού DNA [The ENCODE (Encyclopedia of DNA elements) project]. Άλλες τεχνικές της λειτουργικής γονιδιωματικές που αποσκοπούν στην απώλεια της λειτουργίας γονιδίων, συμπεριλαμβάνουν: - Την μεταλλαξιγένεση (mutagenesis) που αναφέρεται στην απάλειψη ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (gene knockout), ή στη διάρρηξη της συνέχειας ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (gene disruption), και - Την παρεμβολή με RNAi (RNA interference) που αναφέρεται στην αποσιώπηση ή τη μειρρύθμιση της έκφρασης ενός ή περισσοτέρων γονιδίων (sirna ή ShRNA).

7 Γονιδιωματική υψηλής ανάλυσης οργανισμών μοντέλων in vivo Η γονιδιωματική υψηλής ανάλυσης οργανισμών-μοντέλων in vivo αναφέρεται στην εφαρμογή των αρχών της γονιδιωματικής προκειμένου να αναλυθεί η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ζωντανούς οργανισμούς. Πολλές μέθοδοι της γονιδιωματικής είναι προσαρμοσμένες για αναλύσεις σε κυτταρικές σειρές και καταστάσεις in vitro, επομένως, απαιτούνται εξειδικευμένες μέθοδοι γονιδιωματικής ανάλυσης in vivo. Tα ζώα και άλλοι πολυκύτταροι οργανισμοί έχουν μία απίστευτη ποικιλία κυτταρικών τύπων στο εσωτερικό τους: (Α) Ινοβλάστες (Β) Ενδοθηλιακά κύτταρα (Γ) Νευρώνες, και (Δ) Διαφορετικοί τύποι κυττάρων αίματος Καθένα από αυτά τα διαφορετικά είδη κυττάρων προκύπτει επειδή εκφράζουν διαφορετικά τμήματα του γονιδιώματος, και η εύρεση των διαφορών στην έκφραση γονιδίων ανά κυτταρικό τύπο είναι πραγματικά βασικές για την κατανόηση της διαφορετικής φυσιολογίας κάθε κυττάρου.

8 ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ 1. Μέθοδοι ποσοτικοποίησης - Εφαρμόζονται σε βιολογικά δείγματα για να διερευνηθεί η διαφορική έκφραση γονιδίων; Έχουν περιορισμένη χωροταξική διακριτικότητα. Μικροσυστοιχίες (microarray) Αλληλούχιση RNA (RNA-seq) Συνολικό πρωτέωμα, σε συνάρτηση με φασματοσκοπία μάζας (Mass spectrometry) 2. Μέθοδοι in situ χωροταξικής ανάλυσης μέσω χρώσης αντισωμάτων ή RNA Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε επίπεδο ιστού ή οργανισμού με αντιδραστήρια συγγένειας; μη-ειδικές αντιδράσεις (cross-reactivity), απαιτούν μονιμοποίηση Φθορίζων υβριδισμός RNA in situ (RNA FISH) για την αναγνώριση μεμονωμένων μεταγράφων Ανοσοφθορισμός με χρήση αντισωμάτων για την αναγνώριση συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 3. Μέθοδοι γονιδίων αναφοράς - Επιτρέπουν να αναλυθεί ένας υποκινητής γονιδίου ή να ιχνηθετηθεί ένα γονίδιο; απαιτείται κατασκευή διαγονιδιακών οργανισμών; προσομοιάζουν κατά προσέγγιση τη φυσική έκφραση γονιδίων; περιορίζεται σε οργανισμούς-μοντέλα Γονίδια αναφοράς μεταγραφής γονιδίων (Transcriptional reporters) Γονίδια αναφοράς μετάφρασης γονιδίων (Translational reporters) Για παράδειγμα, ένα γονίδιο αναφοράς είναι η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein; GFP) ή μία πρωτεΐνη σε σύντηξη με την GFP, επιτρέπουν την ανάλυση του υποκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης.

9 Αντίθετα, οι πιο απλοί οργανισμοί επιτρέπουν τη δημιουργία πραγματικών ζωικών μοντέλων, όπως κάποια είδη ψαριών [π.χ. ψάρι ζέβρα (zebrafish)] και η φρουτόμυγα (Drosophila melanogaster). Για παράδειγμα, στις φρουτόμυγες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια συσκευή για την έγχυση DNA σε ωοκύτταρα προς παραγωγή σκουληκιών. Μπορεί αντίστοιχα, να γίνει κάτι παρόμοιο με ένεση ή με βομβαρδισμό σωματιδίων. Σε κάθε περίπτωση, το κόστος είναι εκατοντάδων ευρώ, ενώ στην περίπτωση του ποντικού το κόστος παραγωγής διαγονιδιακών ζώων ανέρχεται σε χιλιάδες ευρώ ανά ζώο ή ανά στέλεχος, ενώ τα είδη των πειραμάτων που μπορεί γίνουν είναι πολύ πιο περιορισμένα.

10 Αν πρόκειται να γίνουν αναλύσεις στο επίπεδο του γονιδιώματος με τεχνικές υψηλής κλίμακας (highthroughput), με διαφορετικές κατασκευές φορέων έκφρασης γονιδίων αναφοράς, θα πρέπει ο τρόπος σύνθεσης αυτών των κατασκευών να εμφανίζει υψηλή απόδοση. Βέβαια, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και οι παραδοσιακές μεθόδους κλωνοποίησης, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για συγκεκριμένη περιοχή γονιδίου και ένζυμα περιορισμού για την εκτομή (αποκοπή) των άκρων και κλωνοποίηση τους σε πλασμίδιο/φορέα κλωνοποίησης. Παρόλα αυτά υπάρχουν μοντέρνες προσεγγίσεις κατασκευής με υψηλή απόδοση: 1. Κλωνοποίηση τύπου Gateway (Gateway cloning) 2. PCR σύντηξης (Fusion PCR) 3. Μηχανική ανασυνδυασμού (Recombineering) Αυτές οι μέθοδοι υπερτερούν των παραδοσιακών μεθόδων κλωνοποίησης σε μεγάλης κλίμακας προσεγγίσεις σαν αυτές που απεικονίζονται παρακάτω.

11 1. Κλωνοποίηση τύπου Gateway (Gateway cloning) Η κλωνοποίηση τύπου Gateway βασίζεται στον ανασυνδυασμό μεταξύ ειδικών θέσεων του βακτηριοφάγου λάμδα (λ) για τη μεταφορά αλληλουχιών μεταξύ πλασμιδίων που φέρουν εκατέρωθεν συμβατές θέσεις ανασυνδυασμού, att [recombination attachment (att) sites]. Κατασκευή γονιδίου-αναφοράς μέσω PCR με τη χρήση ειδικών εκκινητών. Οι εκκινητές φέρουν εκτός από την αλληλουχία αναγνώρισης του γονιδίου, ειδικά άκρα που αναγνωρίζονται από ένα συγκεκριμένο ένζυμο τη ρεκομπινάση (recombinase). Το σύστημα απαιτεί το ένζυμο ιντεγκράση (ή ενσωματάση (Int) του βακτηριοφάγου λ που δρα ως ρεκομπινάση και τον παράγοντα ενσωμάτωσης του βακτηρίου E. coli, IHF (Integration Host Factor) που μαζί αναφέρονται ως BP clonase. Η ρεκομπινάση μπορεί να ανασυνδυάζει το προϊόν PCR με ένα πλασμίδιο (βέλος) που έχει τις αντίστοιχες συγγενείς (cognate) θέσεις ανασυνδυασμού, και αντικαθιστά την αλληλουχία ccdb (δεξιά μπλε κύκλος), η οποία είναι ο δείκτης ότι το γονίδιο ενδιαφέροντος έχει μεταφερθεί, καθώς μπορεί να επιλέγεται αρνητικά.

12 2. PCR σύντηξης (Fusion PCR) Χρησιμοποιείται κυρίως σε νηματώδεις σκώληκες C. elegans, και συμπεριλαμβάνει αντίδραση PCR για το επιθυμητό γονίδιο (gene of interest), και επίσης του γονιδίου αναφοράς όπως η GFP που πραγματοποιείται έτσι ώστε μια μικρή ουρά στο άκρο του εκκινητή g (μπλε κύκλος), είναι συμπληρωματικό με το άλλο προϊόν της PCR (μπλε βέλος). Συνδυάζοντας τις δύο αντιδράσεις και στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μόνο τους εξωτερικούς εκκινητές (υποδεικνύεται από 2 μπλε βέλη) προκύπτουν υβριδικά προϊόντα PCR που συντήκουν το επιθυμητό γονίδιο με ένα γονίδιο αναφοράς. Έτσι, δεν χρειάζεται να κλωνοποιηθεί τίποτα στην πραγματικότητα, γιατί έχοντας ένα γραμμικό μόριο DNA είναι αρκετό και λειτουργεί αρκετά καλά.

13 3. Μηχανική ανασυνδυασμού (Recombineering) Στην πραγματικότητα έχει παρόμοια προσέγγιση με τη μέθοδο Gateway, όπου υπάρχουν άκρα με ομολογία (μπλε κύκλοι). Σ αυτή την τεχνική, οι αλληλουχίες είναι ομόλογες με το πλασμίδιο-στόχο, και μπορεί να χρησιμοποιηθούν από ένα λάμδα (λ) φορέα. Οι αλληλουχίες αναγνωρίζονται από μια συγκεκριμένη ρεκομπινάση, που ουσιαστικά προκαλεί τον ανασυνδυασμό του προϊόντος της PCR με το πλασμίδιοστόχο παράγοντας ένα συντηγμένο γονίδιο με συγκεκριμένο τρόπο σε αυτό το πλασμίδιο-στόχο.

14 Πειράματα μπορούν να διεξαχθούν με φθηνό υλικό (π.χ. μικρόβια, κυτταρικές σειρές) με υψηλής απόδοσης τεχνικές; Διαλογή μέσω μιας βιβλιοθήκης με πλασμίδια/φορείς έκφρασης - Η υπερέκφραση ενός γονιδίου προκαλεί ένα φαινότυπο - Χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) για ανίχνευση της έκφρασης Μετασχηματισμός με πολλές κατασκευές παράλληλα - π.χ. Γονίδια αναφοράς (reporters) για όλα τα γονίδια σε ζυμομύκητες - Δημιουργία δεικτών για άλλα είδη (BAC, φοσμίδιο, πλασμίδιο) Στην περίπτωση μικροβιακών συστημάτων μπορούν να δημιουργηθούν βιβλιοθήκες υψηλής πολυπλοκότητας διαφόρων διαγονιδίων. Έτσι, άλλη μία προσέγγιση είναι ο ταυτόχρονος μετασχηματισμός με πολλές κατασκευές. Κάτι τέτοιο μπορεί να πραγματοποιηθεί για όλα τα γονίδια σε ένα είδος. Ήδη υπάρχουν διαθέσιμες βιβλιοθήκες με γονίδια αναφοράς συντηγμένα με GFP για σχεδόν κάθε γονίδιο στον σκώληκα C. Elegans.

15 Συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές υποκινητών Σε κυτταρικές σειρές και σε μικροβιακά συστήματα όπως στο E. coli, έχει πραγματοποιηθεί συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές υποκινητών που μπορούν να επηρεάζουν την γονιδιακή έκφραση, ώστε να προσδιοριστούν ποιά νουκλεοτίδια μίας ακολουθίας είναι πραγματικά σημαντικά στη γονιδιακή ρύθμιση. Το συγκεκριμένο παράδειγμα αναφέρεται στην πορεία μεταβολισμού της λακτόζης στο Ε. coli. Κλωνοποιήθηκε η αλληλουχία που αντιστοιχεί στον υποκινητή λακτόζης, μήκους ~75 bp, και πραγματοποιήθηκε μια υψηλής απόδοσης μεταλλαξιγένεση της αλληλουχίας, ώστε κάθε επιμέρους αλληλουχία DNA να έχει ~10 μεταλλάξεις. Tα τμήματα που προέκυψαν κλωνοποιήθηκαν ως μια βιβλιοθήκη ανοδικά ενός γονιδίου αναφοράς GFP, που στη συνέχεια εισήχθησαν σε κύτταρα. Έτσι, κάποια κύτταρα είχαν μία μετάλλαξη, άλλα κύτταρα είχαν άλλη μετάλλαξη, έτσι ώστε εντός του πληθυσμού, υπήρχαν κύτταρα, που είχαν όλες τις πιθανές μεταλλάξεις.

16 Το οπερόνιο lac

17 Το οπερόνιο lac, το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να μεταβολίζουν λακτόζη διατηρείται φυσιολογικά κατασταλμένο από την κατασταλτική πρωτεΐνη laci που δεσμεύεται στο χειριστή lac (laco). Υπό την παρουσία λακτόζης, ο καταστολέας δεν προσδένεται στο DNA (laco). Υπάρχει όμως και μια δεύτερη πορεία, όπου δεν μεταβολίζεται λακτόζη, εκτός αν υπάρχουν, επίσης, χαμηλά επίπεδα γλυκόζης. Και έτσι, απουσία του καταστολέα laci, υπάρχουν βασικά δύο κύρια συστατικά που ρυθμίζουν την έκφραση αυτού του οπερονίου: η RNA πολυμεράση και η CRP (cyclic AMP Receptor Protein) που είναι μια ενεργοποιούσα πρωτεΐνη (ενεργοποιητής) που αποκρίνεται στη συγκέντρωση γλυκόζης. Μεταβολική καταστολή του οπερονίου lac: Η λακτόζη δεν είναι η προτιμητέα πηγή υδατάνθρακα του E. coli. Αν το βακτήριο καλλιεργηθεί παρουσία λακτόζης και γλυκόζης, τότε τα βακτηριακά κύτταρα θα μεταβολίσουν τη γλυκόζη, πριν την ενεργοποίηση του οπερονίου της λακτόζης (lac). Αυτό ο τύπος ελέγχου της έκφρασης του οπερονίου lac ονομάζεται μεταβολική καταστολή. Για να παρεμποδιστεί ο μεταβολισμός της λακτόζης, υπάρχει ένας δεύτερος τύπος ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Ο υποκινητής του οπερονίου lac φέρει δύο θέσεις δέσμευσης πρωτεϊνικών παραγόντων. Στη μια θέση δεσμεύεται η RNA πολυμεράση, ενώ στην άλλη θέση δεσμεύεται ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από την CRP και το κυκλικό AMP (camp). Η δέσμευση του συμπλόκου CRP-cAMP στον υποκινητή απαιτείται για τη μεταγραφή του οπερονίου lac, και εξαρτάται από την παρουσία γλυκόζης. Καθώς η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξάνεται, η συγκέντρωση του camp μειώνεται. Καθώς η συγκέντρωση του camp μειώνεται, η συγκέντρωση του συμπλόκου CRP-cAMP μειώνεται. Αυτή η μείωση της συγκέντρωσης του συμπλόκου έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση της ενεργότητας του υποκινήτή, και επομένως το οπερόνιο lac απενεργοποιείται. Επειδή, το σύμπλοκο CRPcAMP απαιτείται για τη μεταγραφή του οπερονίου lac, σημαίνει ότι το σύμπλοκο ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση του οπερονίου lac.

18 Συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές του Υποκινητή του οπερονίου lac ΟΠΕΡΟΝΙΟ lac: Μεταβολισμός λακτόζης Συστηματική μεταλλαξιγένεσης στη ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή lac του E. coli. (Α) Mεταλλαγμένοι υποκινητές lac στην περιοχή [-75: -1] προάγουν την έκφραση της GFP. (Β) Τα πλασμίδια που περιέχουν ένα μεταλλαγμένο υποκινητή lac-gfp μετασχηματίστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα Ε. coli, και στη συνέχεια τα κύτταρα επάχθηκαν και επιλέχθηκαν μέσω κυτταρομετρία ροής (ανάλυση με FACS; Fluorescence Activated Cell Sorting). Αλληλούχιση των μεταλλαγμένων υποκινητών σε κάθε FACS έδωσε μια μακρά λίστα των αλληλουχιών σ με αντίστοιχες μετρήσεις έκφρασεις GFP, μ.

19 Ρυθμιστικά αποτυπώματα στον υποκινητή του οπερονίου lac του E. coli Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα κυτταρόμετρο/διαλογέας κυττάρων (cell sorter) που διαχώρισε κύτταρα που είχαν υψηλή έκφραση, μέση έκφραση και χαμηλή έκφραση GFP. Στη συνέχεια, με αλληλούχιση DNA έγινε συστηματική ταξινόμηση αλληλουχιών των υποκινητών με τα επίπεδα έκφρασης, ώστε να βρεθεί ο αντίκτυπος που έχουν μεταλλάξεις στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων, και στην προκειμένη περίπτωση, τη δράση τους στα δύο ρυθμιστικά του στοιχεία, δεδομένου ότι γνωρίζουμε καλά τη βιολογία του υποκινητή lac. Η CRP και η RNA πολυμεράση προσδένονται στο DNA σε ειδικές θέσεις που είναι εντόνως διατηρημένες, δημιουργώντας ένα ρυθμιστικό αποτύπωμα. Το πείραμα μπορεί να επαναληφθεί παρουσία και απουσία της CRP και να βρεθεί το ρυθμιστικό αποτύπωμα από θέσεις πρόσδεσης και για τις δύο πρωτεΐνες. Ρυθμιστικά αποτυπώματα. (Α) Αποτύπωμα από τις γνωστές θέσεις επαφής πρωτεΐνης-dna (φωτισμένο). Παρουσιάζονται δύο μεγεθύνσεις και οι ράβδοι σφαλμάτων από διαφορετικά πειράματα. (Β) Πλήρες αποτύπωμα στο οποίο η ενδοκυτταρική CRP ήταν ανενεργή.

20 Ρυθμιστικά αποτυπώματα στον υποκινητή του οπερονίου lac του E. coli Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα κυτταρόμετρο/διαλογέας κυττάρων (cell sorter) που διαχώρισε κύτταρα που είχαν υψηλή έκφραση, μέση έκφραση και χαμηλή έκφραση GFP. Στη συνέχεια, με αλληλούχιση DNA έγινε συστηματική ταξινόμηση αλληλουχιών των υποκινητών με τα επίπεδα έκφρασης, ώστε να βρεθεί ο αντίκτυπος που έχουν μεταλλάξεις στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων, και στην προκειμένη περίπτωση, τη δράση τους στα δύο ρυθμιστικά του στοιχεία, δεδομένου ότι γνωρίζουμε καλά τη βιολογία του υποκινητή lac. Η CRP και η RNA πολυμεράση προσδένονται στο DNA σε ειδικές θέσεις που είναι εντόνως διατηρημένες, δημιουργώντας ένα ρυθμιστικό αποτύπωμα. Το πείραμα μπορεί να επαναληφθεί παρουσία και απουσία της CRP και να βρεθεί το ρυθμιστικό αποτύπωμα από θέσεις πρόσδεσης και για τις δύο πρωτεΐνες. Ρυθμιστικά αποτυπώματα. (Α) Αποτύπωμα από τις γνωστές θέσεις επαφής πρωτεΐνης-dna (φωτισμένο). Παρουσιάζονται δύο μεγεθύνσεις και οι ράβδοι σφαλμάτων από διαφορετικά πειράματα. (Β) Πλήρες αποτύπωμα στο οποίο η ενδοκυτταρική CRP ήταν ανενεργή.