ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών ΘΡΟΜΒΩΣΗ ΑΙΜΟΡΡΑΓΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΩΝ Διπλωματική Εργασία «ΖΩΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΣΤΗΝ ΕΡΕΥΝΑ ΑΙΜΟΡΡΑΓΙΚΩΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΠΗΞΗΣ» ΟΝΟΜΑ : Αδάμης Αθανάσιος Αριθμός Μητρώου: ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : Α. ΓΙΑΛΕΡΑΚΗ 1

2 Περίληψη Η παρατήρηση των ζώων, η μελέτη των φυσιολογικών και παθολογικών μηχανισμών σε αυτά και η αξιοποίηση ή/και δημιουργία ζωικών μοντέλων που να προσομοιάζουν ασθένειες που εμφανίζονται στον άνθρωπο έχουν αποτελέσει στόχο, αλλά και μέσο, για την κατανόηση περίπλοκων μηχανισμών και την εξέλιξη της επιστήμης γενικότερα. Όπως γίνεται σε όλο το φάσμα της ιατρικής επιστήμης, έτσι και σε αυτό των διαταραχών της πήξης του αίματος η επιστημονική κοινότητα και η φαρμακευτική βιομηχανία έχουν επενδύσει στη χρήση ζωικών μοντέλων προκειμένου να μελετηθούν ασθένειες, φάρμακα και τεχνικές με σκοπό την αντιμετώπιση ή ακόμα και την ίαση πολύπλοκων παθολογικών καταστάσεων. Τα μοντέλα αυτά αποτελούνται από ζώα διαφόρων ειδών (ανάμεσα σε αυτά μύες, σκύλοι, χοίροι, πρωτεύοντα, ιχθείς κ.α.) που φέρουν τυχαία τη διαταραχή, που είναι γενετικά τροποποιημένα ή γενετικά επεξεργασμένα προκειμένου να προκληθεί η διαταραχή σε αυτά. Τα ζωικά μοντέλα έχουν επίσης αξιοποιηθεί σε προ-κλινικές μελέτες για θεραπείες αντικατάστασης πρωτεϊνών όπως και στα πλαίσια γονιδιακής θεραπείας. Σύγχρονες τεχνικές επεξεργασίας του γονιδιώματος δίνουν τη δυνατότητα για πολύ εξειδικευμένες παρεμβάσεις τόσο σε επίπεδο ερευνητικό όσο και θεραπευτικό. Παράλληλα, στα πλαίσια της πρωτοβουλίας για την ενιαία υγεία, αναγνωρίζεται η αξία της μελέτης και ένταξης σε ερευνητικά πρωτόκολλα των κτηνιατρικών ασθενών που παρουσιάζουν πληθώρα ασθενειών και συνδρόμων όμοιων με των ανθρώπων. Ιδιαίτερα οι σκύλοι αποτελούν ένα εξαιρετικό ζωικό μοντέλο καθώς είναι μεγαλόσωμο, μακρόβιο, η πρωτοταγής του ακολουθία έχει χαρτογραφηθεί και παρουσιάζει ομολογία ως προς τον άνθρωπο σε μια πληθώρα διαταραχών. 2

3 Abstract The observation of animals, the study of both physiological and pathological mechanisms and the use and/or generation(?) of animal models that mimic human diseases are considered a goal as well as a means for the understanding of complicated pathways but also for the evolution of science in general. The scientific community and the pharmaceutical industry have invested in the use of animal models in order to study disorders, medicines and techniques with the goal of treating diseases of complicated pathophysiological background throughout the prism of medical science and more specifically, in our case, in that of bleeding disorders. These models are comprised of animals of several species (such as mice, dogs, swine, primates, fish etc) that bear the mutation naturally, are genetically manipulated or are genetically engineered. Animal models have been used to generate new insights into the pathophysiology of each bleeding disorder and also to perform pre-clinical assessments of standard protein replacement therapies as well as novel gene transfer technology. Both the differences between species and differences in underlying causative mutations must be considered in choosing the best animal for a specific scientific study. Furthermore, through the One Health initiative, the role of veterinary patients that exhibit bleeding disorders highly homologous to those presented in humans has been appreciated. 3

4 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια Κα Ωραιάνθη Τραυλού για την ένταξή μου στο πρόγραμμα σπουδών αυτό καθώς και την καθηγήτρια Κα Μαριάννα Πολίτου για την οργάνωσή του και τις υψηλού επιπέδου γνώσεις που αποκόμισα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την επιβλέπουσα καθηγήτρια Κα Αργυρή Γιαλεράκη για την ουσιαστική της βοήθεια καθώς και την υπομονή που επέδειξε σε όλο το διάστημα της προετοιμασίας της εργασίας αυτής. Επίσης, να εκφράσω τις θερμότερες ευχαριστίες προς την οικογένειά μου για την υποστήριξη και την ώθηση που μου έδωσε για να την ολοκληρώσω. 4

5 Περιεχόμενα Εισαγωγή σελ.7 Ζωικά μοντέλα ανά ασθένεια Αιμορροφιλία Α Αιμορροφιλία Β Έλλειψη FXI Νόσος V.Willerbrand Θρομβασθένια Glanzmann Συγγενείς (constitutional) θρομβοκυτταροπενίες Σύνδρομο Bernard Soulier Έλλειψη ινωδογόνου σελ.9-49 σελ.9 σελ.22 σελ.31 σελ.32 σελ.35 σελ.40 σελ.45 σελ.47 Ανάπτυξη εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων σε αιμορραγικές διαταραχές σελ Χοίριος παράγοντας VIII σελ.49 Αξιοποίηση φυτών σαν πλατφόρμα παραγωγής πρωτεϊνών φαρμακευτικής χρήσης σελ.50 Εξανθρωποιημένο διειδικό αντίσωμα των παραγόντων FIXa και FX σελ.50 Consizumab Γονιδιακή θεραπεία σελ.51 σελ.51 Αντιμετώπιση αιμορραγικών διαταραχών σε ζώα σελ.56 Περιστατικό Αιμορροφιλίας-Α σε οικόσιτο σκύλο σελ.57 5

6 Επίλογος σελ.68 Βιβλιογραφία σελ.70 6

7 Εισαγωγή Ο Αριστοτέλης, μεταξύ 347 και 335 π.χ., στην πραγματεία: «Περί ζώων μορίων» παρουσιάζει τις σκέψεις του για τη μέθοδο της έρευνας, και διαπιστώνει τη συνάφεια της λειτουργίας των οργανισμών διαφορετικών ειδών. «Σχετικά με κάθε θεωρία και μέθοδο, από την ταπεινότερη μέχρι την ευγενέστερη, φαίνεται πως υπάρχουν δύο τρόποι προσέγγισης: ο ένας είναι αυτός που, σωστά, ονομάζουμε επιστημονική γνώση του θέματος και ο άλλος ένα είδος γενικής μόρφωσης.( ) Έτσι, λοιπόν, είναι φανερό ότι και στην έρευνα της φύσης πρέπει να υπάρχουν κάποιοι συγκεκριμένοι κανόνες, μέσω των οποίων να ελέγχεται η δυνατότητα αποδοχής της μεθόδου με την οποία συγκεντρώθηκαν τα παρουσιαζόμενα στοιχεία. Εννοώ, λοιπόν, το αν, για παράδειγμα, θα πρέπει να πάρουμε το κάθε είδος ξεχωριστά με τη σειρά, όπως τον άνθρωπο ή το λιοντάρι ή το βόδι ή οτιδήποτε άλλο, και να ορίσουμε αυτά που έχουμε να πούμε για το καθένα, ή αν θα πρέπει πρώτα να θέσουμε ως βάση μας τα κοινά γνωρίσματα όλων, λόγω κάποιου κοινού χαρακτήρα που κατέχουν. Διότι, υπάρχουν πολλά χαρακτηριστικά που είναι όμοια σε πολλά είδη, τα οποία (είδη) είναι διαφορετικά μεταξύ τους. Το θέτω ως ερωτημα, γιατί προς το παρόν η συζήτηση αυτών των θεμάτων είναι ασαφής και χωρίς συγκεκριμένο σχήμα. Εκείνο, όμως, που είναι ξεκάθαρο είναι ότι ακόμα και αν συζητήσουμε ξεχωριστά το κάθε είδος, θα πούμε τα ίδια πράγματα πολλές φορές για πολλά είδη, αφού το καθένα από τα γνωρίσματα που ανέφερα, υπάρχει το ίδιο και στα άλογα και στους σκύλους και στον άνθρωπο. Ίσως, μάλιστα, να υπάρχουν και άλλα γνωρίσματα τα οποία αν και μπαινουν στην ίδια κατηγορία, παρουσιάζουν ειδικές διαφορές.» Θα μπορούσε κανείς να πει ότι είναι μια πρόταση που περιλαμβάνει τη μελέτη ενός είδους για την κατανόηση μιας λειτουργίας και που η γνώση που προκύπτει εφαρμόζεται, υπό προυποθέσεις, γενικώς. Ο Αριστοτέλης όμως, έχει την οξυδέρκεια να παρατηρήσει ότι δεν πρέπει κανείς να γενικεύσει καθώς αναγνωρίζει, ή υποθέτει πως ακόμα και σε φαινομενικά 7

8 όμοιες λειτουργίες είναι πιθανόν να υπάρχουν ειδικές μικροδιαφορές που θα πρέπει ο μελετητής να λάβει υπ όψιν του. Αν δεν είναι η πρώτη, σίγουρα αποτελεί μία από τις πρώτες γραπτές αναφορές στη μεθοδολογία της έρευνας που περιλαμβάνει τη μελέτη των ζώων και την κατ επέκταση εφαρμογή των αποτελεσμάτων ακόμα και στον άνθρωπο. Περισσότερα από χρόνια αργότερα και αφού η σκέψη αυτή εξελίχθηκε και εμπλουτίστηκε από μεγάλους διανοούμενους, ο August Krogh, Δανός καθηγητής στο τμήμα Ζωοφυσιολογίας της Κοπεγχάγης, κάτοχος βραβείου Νομπέλ Ιατρικής και Φυσιολογίας, σε άρθρο του στο περιοδικό Science το 1929, διαπιστώνει την προοπτική της συμβολής των ζώων που παρουσιάζουν ασθένειες παρόμοιες με τον άνθρωπο ως μοντέλα για τη μελέτη και κατανόησή των ανθρώπινων ασθενειών. Αργότερα, η αρχική διαπίστωση συνοψίστηκε σε αυτό που έχει μείνει ως η αρχή του Krogh, μία από τις 4 αρχές της φυσιολογίας: «Για ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών φαινομένων θα υπάρχει ένα η και περισσότερα ζώα επιλογής τα οποία θα είναι κατάλληλα για να μελετηθούν»(1). Τα ζωικά μοντέλα που προσομοιάζουν ανθρώπινες ασθένειες αποτελούν σημαντικό μέσο τόσο για την κατανόηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών όσο και για την ανάπτυξη θεραπευτικών πρωτοκόλλων λειτουργώντας σαν εργαλείο στην απαιτούμενη προ-κλινική εκτίμηση της ασφάλειας φαρμακευτικών ουσιών πριν τη δοκιμή τους σε ανθρώπους. Πραγματοποιώντας δοκιμές σε ζώα, τα οποία έχουν ασθένειες ανάλογες με τον άνθρωπο, μπορεί να καθοριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια η αρχική δοσολογία και η ανταπόκριση σε αυτή (φαρμακοκινητική) καθώς επίσης να εκτιμηθεί η δραστικότητα (φαρμακοδυναμική) των φαρμάκων προοριζόμενων για δοκιμή σε ανθρώπους. Υπάρχουν αρκετά δυνητικά μειονεκτήματα και περιορισμοί που προκύπτουν από τη χρήση ζωικών μοντέλων ανθρώπινων ασθενειών όπως οι ανοσολογικές αντιδράσεις σε ανθρώπινες πρωτεΐνες, διαφορές στο μεταβολισμό ανθρώπινων πρωτεϊνών ανάμεσα στα διαφορετικά είδη ζώων, και ο ποικίλος τροπισμός σε ιστούς που εμφανίζουν οι ιοί-φορείς σε ζώα, σε σύγκριση με τον άνθρωπο(2). Η σημασία της χρήσης μεγαλόσωμων ζώων ως μοντέλα ανθρώπινων γενετικών ασθενειών γίνεται όλο και πιο εμφανής. Οι προ-κλινικές μελέτες γονιδιακής θεραπείας απαιτούν μεγαλόσωμα ζωικά μοντέλα τα οποία να είναι συγκρίσιμα με τον άνθρωπο σε επίπεδο γονιδιώματος και φυσιολογίας. Η χρήση του σκύλου ενδείκνυται καθώς η πρωτοταγής 8

9 ακολουθία του γονιδιώματός του έχει βρεθεί (sequenced), είναι μεγαλόσωμος και μακρόβιος και περισσότερο από το 60% των κληρονομικών ασθενειών του παρουσιάζουν ομολογία με τις αντίστοιχες του ανθρώπου. Ζωικά μοντέλα ανά ασθένεια Αιμορροφιλία Α Οι εξελίξεις στην αντιμετώπιση της αιμορροφιλίας συνθέτουν μία αξιοσημείωτη ιστορία. Σε ένα διάστημα 60 ετών έχει καταγραφεί πολύ μεγάλη πρόοδος στην κάθαρση (purification) πρωτεινών, τον έλεγχο των δοτών αίματος, την απενεργοποίηση ιών, τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος, την κλωνοποίηση γονιδίων και την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεινών που έχουν βελτιώσει την απόδοση των θεραπειών και την ποιότητα ζωής των ασθενών σε σημαντικό βαθμό. Παράλληλα, γίνεται προσπάθεια να τυποποιηθούν νέοι τρόποι χορήγησης των φαρμάκων για να μειωθεί η συχνή ενδοφλέβια χορήγηση, να βρεθούν πιο αποτελεσματικές ουσίες με μεγαλύτερη διάρκεια δράσης και να ελεγθεί το φαινόμενο των ανασταλτών, έχοντας ως τελικό στόχο την οριστική ίαση αυτής της γενετικής διαταραχής. Αυτή η πορεία έχει, σε πολύ μεγάλο βαθμό, βασιστεί στη χρήση ζώων που παρουσιάζουν τη διαταραχή. Η αιμορροφιλία Α είναι μία κληρονομική, Χ-φυλοσύνδετη, υπολειπόμενη, σοβαρή διαταραχή της πήξης του αίματος που οφείλεται σε μεταλλάξεις στο γονίδιο του παράγοντα VIII (FVIII) και παρουσιάζεται με συχνότητα 1 ανά γεννήσεις αρρένων (1/ γεννήσεις γενικού πληθυσμού)(3). Ο FVIII είναι μία γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος αποτελούμενη από 6 domains Α1-Α2-Β-Α3-C1-C2 (εικόνα 1). Πρόκειται για ένα έτεροδιμερές που αποτελείται από μία βαριά αλυσίδα (90-200kDa) που περιλαμβάνει τα Α1-Α2-Β και μία ελαφριά αλυσίδα (80kDa) που περιλαμβάνει τα Α3-C1-C2. Το περισσότερο μέρος του FVIII φαίνεται να παράγεται από τα κολποειδή κύτταρα του ήπατος(4). 9

10 Εικόνα 1. Δομή του FVIII.(4) Τo γονίδιo που κωδικοπεί τον FVIII βρίσκεται στο μακρύ σκέλος του Χ χρωμοσώματος(xq28) και περιλαμβάνει 26 εξόνια (185kb). Πολλές μεταλλάξεις που οδηγούν σε αιμορροφιλία Α έχουν βρεθεί στο γονίδιο του FVIII. Από αυτές, οι πιο συχνές προκαλούν αναστροφή και μετατόπιση των ιντρονίων 1-22 διαταράσσοντάς το πλήρως και αφορούν σχεδόν το 50% των ασθενών με βαρειά νόσο. Ασθενείς που εμφανίζουν μεταλλάξεις που είτε αποδυναμώνουν είτε διακόπτουν την παραγωγή FVIII (αναστροφές ιντρονίων 1 και 22, μεγάλες ελλείψεις και non-sense μεταλλάξεις) παρουσιάζονται πιο επιρρεπείς στην παραγωγή αλλοαντισωμάτων κατά του FVIII από ότι εκείνοι που εμφανίζουν σημειακές (point) μεταλλάξεις και μικρές ελλείψεις ή εισδοχές (insertions).(5) Το σύνολο των αναγνωρισμένων και καταγεγραμμένων μεταλλάξεων που προκαλούν Αιμορροφιλία Α και Β μπορούν να αναζητηθούν στη βάση δεδομένων (Human Gene mutation Database. Η διάγνωση της αιμορροφιλίας Α, που θα πρέπει να είναι πάντα στη διαφορική διάγνωση άρρενος ασθενούς με επίμονη αιμορραγία, επιβεβαιώνεται με σαφή και συγκεκριμένα εργαστηριακά ευρήματα που περιλαμβάνουν αυξημένο χρόνο ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης, φυσιολογικό αριθμό και λειτουργικότητα αιμοπεταλίων, φυσιολογικό χρόνο προθρομβίνης και μέτρηση χαμηλής δραστικότητας του FVIII στο πλάσμα. Η βαρύτητα της ασθένειας σχετίζεται με τη δραστικότητα του παράγοντα VIII στο πλάσμα του ασθενούς και κατατάσσεται σε «βαρειά» ( 1%), «μέτρια» (1-5%) και 10

11 «ήπια» (5-40%). Η αιμορραγική διάθεση γενικώς αντικατοπτρίζει τη βαρύτητα της νόσου.(3) Σε ασθενείς με βαρειάς μορφής Αιμορροφιλία Α παρατηρούνται επαναλαμβανόμενα επεισόδια αιμάρθρων, αιματωμάτων του υποδόριου ιστού και των μυών και αιματουρία. Το 1/3 των θανάτων-λόγω αιμορραγίας στους ασθενείς αυτούς οφείλεται στην ενδοκράνιο αιμορραγία. Η θεραπεία συνίσταται σε ενδοφλέβια χορήγηση ανασυνδυασμένου FVIII προφυλακτικά ή κατά περίσταση. Παρά το γεγονός ότι τα θεραπευτικά αυτά σχήματα προσφέρουν αδιαμφισβήτητη αναβάθμιση στην ποιότητα ζωής των αιμορροφιλικών ασθενών αρκετά μειονεκτήματα παραμένουν, όπως η ανάγκη για εφ όρου ζωής επαναλαμβανόμενες εγχύσεις, το υψηλό κόστος και η παραγωγή αλλοαντισωμάτων (ανασταλτών) κατά του FVIII σε μεγάλο ποσοστό(6). Οι περιορισμοί αυτοί έχουν καταστήσει την έρευνα πάνω στην ανάπτυξη νέων θεραπειών ιδιαιτέρως δυναμική. Τέτοιες θεραπείες περιλαμβάνουν την ανάπτυξη παραγόντων μακράς διάρκειας δράσης, νέα πρωτόκολλα αντιμετώπισης του φαινομένου της παραγωγής ανασταλτών, μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων και γονιδιακές θεραπείες, με σκοπό τη μακρύτερη δράση του σκευάσματος, την αντιμετώπιση επιπλοκών ή ακόμα και την πλήρη ίαση. Οι γονιδιακές θεραπείες με στόχευση τη μακροπρόθεσμη διόρθωση της αιμορροφιλίας ειδικότερα, με βάση τα αποτελέσματα των προ-κλινικών και κλινικών δοκιμών, παρουσιάζονται πολλά υποσχόμενες. Η πρόοδος της μοριακής ιατρικής, όπως και της έρευνας τόσο σε θεραπευτική κατεύθυνση όσο και σε βασική έρευνα κατανόησης παθοφυσιολογικών μηχανισμών βασίζεται, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, σε πολύ μεγάλο βαθμό, σε καλά χαρακτηρισμένα ζωικά μοντέλα αιμορροφιλίας, κατά κύριο λόγο αιμορροφιλικούς σκύλους και μύες(7). Τα ζωικά μοντέλα που αξιοποιούνται στη έρευνα για την αιμορροφιλία χωρίζονται σε τρεις βασικές κατηγορίες: Τα ζώα που έχουν αυτόματες μεταλλάξεις, αυτά που είναι γενετικά τροποποιημένα και αυτά που είναι γενετικά επεξεργασμένα με τη τεχνολογία CRISPR/Cas9 και τη χρήση άλλων νουκλεασών. 11

12 Ζωικά μοντέλα με αυτόματες μεταλλάξεις Σκύλοι Η πρώτη ομάδα αιμορροφιλικών σκύλων δημιουργήθηκε στo Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill το 1947 με την αναπαραγωγή ενός σκύλου, φυλής Ιρλανδικού Σέττερ, που παρουσίαζε παρατεταμένη αιμορραγία μετά από κοπή νυχιών και αφού επιβεβαιώθηκε η αιμορροφιλία Α. Όπως στον άνθρωπο, η βαρειά έκφραση της νόσου σχετίζεται με ποσοστά δραστικότητας του FVIII μικρότερα του 1%. Η διαθεσιμότητά των ζώων αυτών έπαιξε πολύ σημαντικό ρόλο στην κατανόηση της διαταραχής και είχε ως αποτέλεσμα τη εγκαθίδρυση των σύγχρονων μεθόδων για τη διάγνωση και τη θεραπεία, περιλαμβανομένων των εξετάσεων του χρόνου ενεργοποίησης μερικής θρομβοπλαστίνης (APTt) και του one stage factor assay system για τον FVIII.(8) Ο φαινότυπος των σκύλων αυτών προσομοιάζει εκείνο των ανθρώπων, με αυτόματες αιμορραγίες μαλακών ιστών, αίμαρθρα και αιμορραγίες από τους βλεννογόνους. Επί του παρόντος, δύο ομάδες σκύλων με αιμορροφιλία Α αξιοποιούνται σε ερευνητικό επίπεδο, η προαναφερθείσα στο Chapel Hill καθώς και μία στο Πανεπιστήμιο Queens στο Τορόντο του Καναδά (2). Και οι δύο ομάδες παρουσιάζουν έλλειψη του FVIII λόγω αυτόματης μετάλλαξης αναστροφής του γονιδίου που εκφράζει τον FVIII στο ιντρόνιο 22(9). Στην ομάδα του Chapel Hill, μία ανώμαλη ακολουθία (ch8-canine hemophilia 8) εμφανίζεται μετά τα εξόνια 1-22 του γονιδίου του παράγοντα VIII αντικαθιστώντας τα εξόνια Η ύπαρξη ενός παράδοξου στοιχείου γονιδιακής ακολουθίας (ch8) στο τέλος του παρεκκλίνοντος αντιγράφου του FVIII καταδεικνύει την αντικατάσταση των εξονίων με το ch8. Η συγκεκριμένη ομάδα πειραματοζώων αντικατοπτρίζει την αντιστροφή στο γονίδιο του FVIII (gene inversion) που συναντάται πολύ συχνά σε ανθρώπους με βαρειάς μορφής αιμορροφιλία Α(9). Το συγκεκριμένο σημείο στο γονίδιο Χ του σκύλου είναι συντενικό με εκείνο του παράγοντα VIII στο Xq28 στον άνθρωπο(10). Το πλήθος των διαφόρων μεταλλάξεων που εντοπίζονται μετά το ιντρόνιο 22 τόσο στον 12

13 άνθρωπο όσο και το σκύλο καταδεικνύουν την περιοχή αυτή του DNA ως εγγενώς ασταθή, διειδικώς. Στην ομάδα του Ontario, η οποία εγκαταστάθηκε το 1980 και περιλαμβάνει διαφορετικής φυλής σκύλους (miniature schnautzer και Ιρλανδικό σέττερ) παρατηρείται μία σχεδόν πανομοιότυπη μετάλλαξη με αυτή της ομάδας του Chapel Hill. Παρουσιάζει ενδιαφέρον το γεγονός ότι στην ομάδα του Οντάριο εμφανίζεται πολυμορφισμός (ως προς αυτή του Chapel Hill) σε 5 σημεία εντός των πρώτων 22 εξονίων, ενώ οι μετάλλαξη που παρουσιάζεται μετά το εξόνιο 22 είναι όμοια. Η ανακάλυψη ενός όμοιου ανώμαλου αντιγράφου σε διαφορετικές ομάδες ζώων με αιμορριφιλία Α αντικατοπτρίζει τη συχνή αντιστροφή του εξονίου 22 του γονιδίου FVIII που παρατηρείται σε πολλά περιστατικά αιμορροφιλίας Α στον άνθρωπο. Τα ευρήματα αυτά συνιστούν ότι οι αντιστροφές που εντοπίζονται στο γονίδιο του παράγοντα VIII, βρίσκονται και σε άλλα είδη ζώων στο γονιδίωμα των οποίων παρατηρείται διπλή F8A ακολουθία μέσα ή κοντά στο γονίδιο VIII. Από αυτή την άποψη, είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι στους μύες, καθώς δεν έχουν πολλαπλά αντιγραφα του F8A αλλά μόνο ένα, δεν έχουν εντοπιστεί αυτόματες μεταλλάξεις του γονιδίου FVIII(10). Εικόνα 2. Παράταξη των FVIII σκύλου και ανθρώπου. a) Βαρειά άλυσος, b) Ελαφριά άλυσος. Μεγαλύτερες διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των βαρειών αλύσων όπου κατάλοιπα (residues) αμινοξέων μεταξύ 81-85, , και του ανθρώπινου FVIII συντάσσουν πιο οργανωμένη δευτερογενή δομή (κίτρινη επισήμανση). Υπάρχουν μόνο λίγες διαφορές μεταξύ των δομών των ελαφριών αλύσων με κυριότερες στα , (κίτρινη επισήμανση) και (κόκκινη). Gene Ther 2016 Jul.23(7): , fig.8. 13

14 Οι ομάδες αυτές έχουν αξιοποιηθεί εκτενώς εδώ και περίπου 7 δεκαετίες τόσο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου στον άνθρωπο όσο και σε προ-κλινικές δοκιμές παραγόντων ανθρώπινου FVIII, μελέτες πάνω στην ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα της χρήσης αδενοσχετιζόμενων-ιών (AAV) ως φορέων σε δοκιμές γονιδιακής θεραπείας (2). Επιπλέον, έχουν προσφέρει πολύτιμα στοιχεία για την αντιμετώπιση του φαινομένου της παραγωγής ανασταλτών. Η παραγωγή ανασταλτών κατά του FVIII αποτελεί την πιο σοβαρή επιπλοκή της αγωγής με ανθρώπινης προέλευσης ή/και ανασυνδυασμένο παράγοντα FVIII. Ένα ποσοστό των ζώων αυτών παράγει αλλοαντισώματα μετά τη χορήγηση FVIII σκύλου, κάτι που συμβαίνει πιο συχνά στην ομάδα του Πανεπιστημίου Queens. Έτσι, δίνεται η δυνατότητα να μελετηθούν τόσο οι μηχανισμοί όσο και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις καθώς υπάρχει, σε μεγάλο βαθμό, ομολογία μεταξύ του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος με αυτό του σκύλου. Παρουσιάζει ενδιαφέρον το γεγονός ότι οι αιμορροφιλικοί σκύλοι του Πανεπιστημίου Queens του Καναδά εμφανίζουν πολυμορφισμό σε δύο θέσεις αμινοξέων: 909(Gly/Ser) και 1184 (Leu/Pro) σε σύγκριση με τους υγιείς σκύλους που χρησιμοποιούνται γiα την παρaγωγή προιόντων αντικατάστασης FVIII. Η παρατήρηση αυτή θέτει την υποψία πως τα διαφορετικά πεπτίδια στις θέσεις αυτές του FVIII αναγνωρίζονται ως ξένα και πυροδοτούν την παραγωγή αντισωμάτων. Μία παραπλήσια ερμηνεία έχει δοθεί για τα αυξημένα ποσοστά παρουσίας ανασταλτών σε αιμορροφιλικούς ασθενείς Αφρικανικής καταγωγής στους οποίους παρατηρείται συχνότερη παρουσία σπανίων πολυμορφισμών του FVIII(11). Αμνοί Φαινότυποι, αντίστοιχοι αυτών που εμφανίζουν οι άνθρωποι που πάσχουν από αιμοροφιλία Α, συμπεριλαμβανομένων των αυτόματων αιμορραγιών και δραστικότητας FVIII μικρότερης του 1%, έχουν εντοπιστεί και στους αμνούς(12). Με την χαρτογράφηση της πρωτοταγούς ακολουθίας (sequence mapping) αποκαλύφθηκε μία μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου (frame shift) στο γονίδιο FVIII η οποία προκαλλέι ένα πρόωρο stop codon στη θέση βάσης (base position) του εξονίου 14 και πέντε επί πλέον stop codons στη θέση βάσης 183. Αιμοροφιλικοί αμνοί έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες πάνω σε γονιδιακές και κυτταρικές θεραπείες, συμπεριλαμβανομένων ερευνών για προυπάρχουσα ανοσία σε AAV φορείς(13) και τη χρήση μεσενχυματικών κυττάρων ως κυτταρικούς μεταφορείς του γονιδίου για 14

15 τον FVIII(13). Θα πρέπει να σημειωθεί πως η δυσκολία παρασκευής FVIII αμνού αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για τη χρήση του είδους αυτού για ερευνητικούς σκοπούς. Επίμυες (Αρουραίοι) (Rats) Ερευνητές εντόπισαν ένα inbred strain WAG/RijYcb όπου παρουσίαζε αιμορραγική διάθεση, παρατεταμένο APTt και μεταλλαγμένο FVIII γονίδιο (λευκίνη στη θέση προλίνης του αμινοξέος 176 στο Α1 domain). Στους επίμυες, το FVIII γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 18. Έτσι, η αιμοροφιλία στους επίμυες είναι αυτοσωματική υπολοιπόμενη νόσος, σε αντίθεση με τον άνθρωπο και άλλα ζωικά μοντέλα όπου αποτελεί Χ- φυλοσύνδετη κληρονομική νόσο(14). Το μεταλλαγμένο τμήμα των WAG/RijYch επιμύων δεν περιλαμβάνει ανοσοεπικρατείς επιτόπους (immunodominant) και έτσι το μοντέλο αυτό πιθανώς δεν είναι κατάλληλο για την έρευνα της ανοσολογικής απάντησης σε θεραπεία με FVIII ή για την ανάπτυξη πρωτοκόλλων για την αντιμετώπιση του φαινομένου των ανασταλτών. Γενετικά επεξεργασμένα ζωικά μοντέλα Μύες (Mice) Η εκτροφή και διαχείριση των μικρών θηλαστικών καθώς και η διατήρηση πολυπληθών πληθυσμών είναι μια σχετικά οικονομική διαδικασία κι έτσι οι μύες αποτελούν δημοφιλή ζώα στην επιστημονική έρευνα και χρησιμοποιούνται σε προ-κλινικές δοκιμές παγκοσμίως. Παρόλο που οι μύες δεν παρουσιάζουν αυτόματες αιμορραγίες, με διάφορες τεχνικές επεξεργασίας του γονιδιώματος έχει καταστεί δυνατή η παραγωγή διάφορων μοντέλων αιμοροφιλικών μυών. Οι αιμορροφιλικοί μύες αποτελούν το καλύτερο αρχικό ζωικό μοντέλο για τη δοκιμή νέων θεραπευτικών ουσιών καθώς απαιτούνται πολύ μικρές δόσεις φαρμάκων(15). Τα πρώτα δύο μοντέλα αιμοροφιλίας Α σε μύες με γενετικό υπόβαθρο 129SV και C57BL/6 παρήχθησαν το Αυτές οι δύο σειρές FVIII knockout μυών δημιουργήθηκαν με μεθόδους στόχευσης γονιδίων (gene targeting) και επεξεργασίας βλαστοκυττάρων(15) μέσω εισαγωγής στο 3' άκρο του εξονίου 16 στη μία σειρά ζώων (Ε16) και διάρρηξης του εξονίου 17 στην άλλη σειρά (Ε17) με αποτέλεσμα δραστικότητα του FVIII στο πλάσμα μικρότερη του 1%. Σε αντίθεση με τους αιμοροφιλικούς ανθρώπους, τα ζωικά μοντέλα αυτά, δεν παρουσιάζουν αυτόματες αιμορραγίες, 15

16 ακρωτηριασμός όμως μέρους της ουράς προκαλλεί σοβαρή-δυνητικά θανατηφόρο αιμορραγία. Τα μοντέλα των μυών χρησιμοποιούνται ευρέως για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με χρήση ανασυνδυασμένου FVIII καθώς και των πρωτοκόλλων διαχείρισης του φαινομένου των ανασταλτών(16). Χοίροι Οι διαφορές μεταξύ του ανθρώπου και του μυ όσον αφορά στο μέγεθος, τη φυσιολογία, την ανατομία, και τη διάρκεια ζωής περιορίζουν την αξία της χρήσης των μυών ως ζωικά μοντέλα για προ-κλινικές μελέτες. Αντίθετα, οι μηχανισμοί πήξης των ανθρώπων και των χοίρων παρουσιάζουν πολύ υψηλή ομολογία. Επιπλέον, οι αιμοροφιλικοί χοίροι μπορεί να παρουσιάσουν αρθροπάθειες ως αποτέλεσμα επαναλαμβανόμενων αιμορραγιών, παραπλήσιες του ανθρώπου. Έτσι, χοίροι με αιμορροφιλία Α αποτελούν μία επιλογή ακόμα για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων νέων θεραπευτικών ουσιών(17). Με τη μέθοδο της πυρηνικής μεταφοράς (nuclear transfer) και κλονοποίησης από χοιρινούς εμβρυονικούς ινωδοβλάστες οι οποίοι έφεραν διαταραχή του εξονίου 16 του γονιδίου FVIII, παρήχθησαν χοίροι με αιμοροφιλία Α(18). Εικόνα 3. Σύγκριση δομών των C2 domain των FVIII του ανθρώπου και του χοίρου. Paul Clint Spiegel, Jr,Marc Jacquemin,Jean-Marie R. Saint- Remy,Barry L. Stoddard,Kathleen P. Pratt, Structure of a factor VIII C2 domain immunoglobulin G4κ Fab complex: identification of an inhibitory antibody epitope on the surface of factor VIII, Blood, 2001, Fig

17 Εξανθρωποιημένοι (Humanized) μύες με αιμοροφιλία Α για ανοσία στον FVIII Στην προσπάθεια να μελετηθούν και να κατανοηθούν καλύτερα οι ανοσολογικές αντιδράσεις κατά του FVIII στην αιμοροφιλία Α, οι ερευνητές τροποποίησαν το μοντέλο μυός με αιμοροφιλια Α ώστε να προσομοιάζει το ανθρώπινο HLA class II αντιγόνο διασταυρώνοντας Ε17 μύες με άλλους που εξέφραζαν χειμερικά ανθρώπινα με μυ HLA- DRB1*1501, που σχετίζονται με αυξημένη πιθανότητα παραγωγής ανασταλτών στους ανθρώπους(19). Η μελέτη αυτών των ζωικών μοντέλων αποκάλυψε ανοσο-επικρατή (immunodominant) πεπτίδια FVIII που πυροδοτούν την παραγωγή ανασταλτών καθώς και τη διάδραση μεταξύ υποδοχέων των Τ-κυττάρων με FVIII πεπτίδια και MHC class II μόρια(20). Μοντέλο κόνικλου προσωρινής αιμορροφιλίας Ενδιαφέρον παρουσιάζει και η χρήση προσωρινών μοντέλων αιμορροφιλίας όπως δημοσιεύτηκε από τους Erhardsen et al. Σε κόνικλους φυλής New Zeeland white χορηγήθηκαν 1000 RBU/kg (Rabbit Bethesda Units) αντι-fviii IgG. Ο χρόνος πήξης, μετά τη χορήγηση της αντι-fviii IgG, αυξήθηκε στα 23 λεπτά, από περίπου 5 που είναι στα φυσιολογικά ζώα του συγκεκριμένου είδους. Σε όλους τους κόνικλους που έλαβαν την αντι-fviii IgG η συγκέντρωση του FVIII στο πλάσμα μειώθηκε σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα(21). Πρωτεύοντα (Non human primates) Οι Kitasawa et al. δημιούργησαν ένα μοντέλο επίκτητης Αιμορροφιλίας Α στον πρωτεύοντα πίθηκο Μακάκα (macaca fascicularis) στα πλαίσια της έρευνάς τους πάνω σε ένα αντίσωμα κατά του παράγοντα ΙΧ και Χ. Αφού εντόπισαν ένα ουδετεροποιητικό (neutralizing) αντίσωμα (Consizumab) κατά του FVIII στο μυ (VIII-2236), το οποίο αντιδρά με τον FVIII του πρωτεύοντος, αλλά όχι του χοίρου, το ενέχυσαν στον πίθηκο αδρανοποιώντας τον FVIII του χωρίς να επηρεάζεται ο ανασυνδυασμένος παράγοντας χοίρου (rpofviii)(22). 17

18 Ο πίθηκος Μακάκα αποτελεί πρότυπο είδος για μελέτες τοξικότητας φαρμακευτικών ουσιών(23). Commented [m1]: Reference: Administration of rfvii to previously concizumab dosed monkeys is safe and concizumab does not affect the potency of rfvii in hemophilic rabbits Εικόνα 4. Γενικά χαρακτηριστικά διαφόρων ζωικών μοντέλων Αιμορροφιλίας Επεξεργασία γονιδίων (gene editing) Οι τεχνολογίες επεξεργασίας γονιδίων βασίζονται στην αξιοποίηση της φυσικής «επισκευαστικής τεχνολογίας» των κυττάρων για την τροποποίηση του DNA. Η επεξεργασία γονιδίων αποτελεί την εξέλιξη των τεχνικών αντικατάστασής τους, καθώς παρέχει τη δυνατότητα διόρθωσης των μεταλλαγμένων γονιδίων in situ, υπό τον έλεγχο του ενδογενούς προάγωντα (endogenous promoter), με επεξεργασία ακριβείας. Με την τεχνική αυτή μειώνεται και η πιθανότητα τυχαίας 18

19 εισδοχής γενετικού υλικού στο γονιδίωμα και, κατ επέκταση, ένθετης (insertional) ογκογέννεσης, Μετά τη διακοπή της διπλής αλύσου (double stranded break) από κάποια ενδονουκλεάση, η επισκευή περιλαμβάνει δύο οδούς: είτε non homologous end joining (NHEJ) είτε homology directed repair (HDR). Με τη μέθοδο NHEJ προκύπτουν εισδοχές και ελλείψεις διαφόρων μηκών ενώ η HDR προσφέρει αλλαγές με ακρίβεια σημείου, και ακολουθίες υψηλής ειδικότητας βασισμένες σε κάποιο πρότυπο. Ανάμεσα στις νουκλεάσες που προκαλλούν αυτού του είδους τις διακοπές του DNA, περιλαμβάνονται οι Zinc-finger nucleases(zfn), νουκλεάσες-προσομοιωτές των ενεργοποιητών μεταγραφής (Transcription-activator-like effector nucleases), και οι CRISPR/Cas9 (αναφορά παρακάτω). Ιστορικά, οι τεχνικές στόχευσης των γονιδίων περιορίζονταν στα εμβρυικά βλαστο-κύτταρα του μυ. Η ανακάλυψη των ZFN (Zinc Finger Νucleases) επέτρεψε την επεξεργασία του γονιδιώματος κυττάρων μεταγενέστερου σταδίου (transformed και primary cells), που μέχρι πρότινος θεωρούνταν απροσπέλαστα για τέτοιου είδους γενετικούς χειρισμούς. H χρήση των ZFNs in vitro έφερε αποτελεσματική επεξεργασία γονιδιώματος μέσω της HDR (homology directed repair) προκαλώντας διακοπή της διπλής αλύσου σε συγκεκριμένο-στοχευμένο τόπο. Νέες μελέτες αποδεικνύουν τη δυνατότητα αξιοποίησης των ZFNs για στοχευμένη επεξεργασία συγκεκριμένων τόπων στο γονιδίωμα in vivo με αποτελέσματα κλινικής σημασίας. Αν και η χρήση των ZFN και CRISPR/Cas9 σε ζωικά μοντέλα βελτίωσαν τον παθολογικό φαινότυπο, φαίνεται πως ακόμα πιο πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα μπορεί να αναμένονται από την εισαγωγή των γονιδίων F8/F9 στο γονίδιο αλβουμίνης χρησιμοποιώντας 2 Α πεπτίδια με ZFN στόχευση, με αποτέλεσμα την παραγωγή ολοκληρωμένων και λειτουργικών FVIII/FIX mrna, υπό τον έλεγχο του ενδογενούς προάγωντα αλβουμίνης (albumin promoter). Γενετικά επεξεργασμένοι μύες με τεχνολογία CRISPR/Cas9 Πρόσφατες εξελίξεις στη γενετική βιο-τεχνολογία προσφέρουν τη δυνατότητα, υψηλής ακρίβειας, επεξεργασίας και τροποποίησης του γονιδιώματος οποιουδήποτε ζωντανού οργανισμού(24), με τη χρήση της CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) RNA συνεδεμένης- στοχευμένης ενδονουκλεάσης Cas9(CRISPR 19

20 associated) (25). Η ανακάλυψη των δυνατοτήτων της χρήσης της ενδονουκλεάσης Cas9 στην επεξεργασία του γονιδιώματος είναι αποτέλεσμα βασικής έρευνας, διάρκειας περίπου μίας δεκαετίας, πάνω στη βιολογική δράση των «μυστηριωδών», επαναλαμβανόμενων στοιχείων γνωστών ως CRSPR που ανεβρίσκονται σε όλη τη δομή των βακτηρίων και των archeae. Οι τόποι (loci) των CRISPR συνήθως περιλαμβάνουν ένα συμπλεγμα CRISPR-σχετιζόμενων γονιδίων και τη μοναδική παράταξη CRISPR- μία σειρά από επαναλαμβανόμενες ακολουθίες (direct sequences) διακοπτόμενες από spacers που αντιστοιχούν σε ακολουθίες που βρίσκονται σε ξένα γενετικά στοιχεία (foreign genetic sequences). Αν και τα γονίδια που συνδέονται με το CRISPR, (Cas genes) μεταφράζονται σε πρωτεΐνες, οι πιο πολλές παρατάξεις CRISPR αρχικά μεταγράφονται ως μονές αλυσίδες RNA προτού υποστούν περαιτέρω επεξεργασία και μετατροπή σε αλυσίδες μικρότερου μήκους CRISPR-RNA οι οποίες κατευθύνουν τη νουκλεοτιδιο-λυτική δράση συγκεκριμένων Cas ενζύμων για την εξουδετέρωση στοχευμένων νουκλεικών οξέων(24). Στη μοριακή βιολογία, το trans-activating crrna (tracrrna) είναι ένα μικρό trans κωδικοποιημένο RNA. Πρωτο-ανακαλύφθηκε στο παθογόνο Staphylococcus pyogenes και, όπως προαναφέρθηκε, εντοπίζεται σε βακτήρια και archaea. Ο μηχανισμός CRISPR/Cas αποτελεί ένα RNA ελεγχόμενο, αμυντικό σύστημα που προστατεύει από ιούς και πλασμίδια. Η δράση του συνοψίζεται σε 3 στάδια. Αρχικά, ένα αντίγραφο του εισβάλοντος νουκλεϊκού οξέος εισέρχεται στον τόπο του CRISPR (CRISPR locus). Στη συνέχεια, CRISPR RNAs (crrnas) μεταγράφονται από αυτόν τον τόπο. Τα crrnas ενσωματώνονται σε effector σύμπλοκα, τα οποία υπό την κατεύθυνση του crrna «επιτίθενται» στο ξένο γενετικό υλικό και οι νουκλεάσες Cas το αποδομούν. 20

21 Εικόνα 5. Αρχή γενετικής τροποποίησης CRISPR/Cas Ο ακρογωνιαίος λίθος των δράσεων του φυσικού μηχανισμού CRISPR είναι η εγγενής δυνατότητα να διασπά (cleave) αποτελεσματικά πολλαπλές ακολουθίες σε συγκεκριμένες-στοχευμένες θέσεις παράλληλα. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μετατροπή ενός pre-crrna transcript, που περιλαμβλανει πολλούς spacers, σε μεμονωμένα guide RNA duplexes (mature crrna και tracrrna) μέσω υβριδοποίησης με tracrrna. Η αξιοποίηση αυτής της δυναμικής του μηχανισμού CRISPR θα επέτρεπε επεξεργασία ευρείας κλίμακας και μεγάλης ακρίβειας. Στην πράξη, συνέκφραση μιάς CRISPR παράταξης που περιλαμβάνει πολλαπλούς spacers που στοχεύουν διαφορετικά γονίδια ή μία συστοιχία αρκετών sgrnas με SpCas9 νουκλεάση οδήγησε σε αποτελεσματική πολλαπλή, ταυτόχρονη επεξεργασία σε κύτταρα θηλαστικών(24). Τελευταία, δημιουργήθηκε ένα αξιόπιστο ζωικό μοντέλο με σκοπό να διαφωτίσει τη χημική και κυτταρική ανοσολογική αντίδραση ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία με FVIII/FIX. Το σύστημα CRISPR/Cas9 χρησιμοποιήθηκε σε ανοσοανεπαρκεις NSG (Non Obese Diabeteic Scid Gamma) μύες. Με τη μετάλλαξη των γονιδίων FVIII και FIX δημιουργήθηκαν μύες με αιμοροφιλία Α/Β με NSG υπόβαθρο (HemoA/B-NSG mice). Οι NSG μύες είναι πιο κατάλληλοι για μεταμόσχευση ανθρώπινων αιμοποιητικών κυττάρων από ότι οι 21

22 NOD(Non Obese Diabetic)/SCID(Severe Combined ImmunoDefficient) μύες κι έτσι μπορούν να αξιοποιηθούν για άμεση αξιολόγηση της ανθρώπινης ανοσολογικής αντίδρασης σε θεραπεία με FVIII/FIX(26). Ολιγονουκλεοτίδια 20 residues χρησιμοποιήθηκαν σαν πρότυπα RNAs (guiding RNAs) για τη στόχευση του εξονίου 1 των γονιδίων FVIII και FIX. Τα grnas και CRISPR/Cas9 RNA εγχύθηκαν σε NSG mouse zygotes για την παραγωγή ιδρυτικών στελεχών (founders). Παρήχθησαν 4 αρσενικοί μύες «ιδρυτές», ο κάθε ένας εκφράζοντας μία έλλειψη στα σημεία 1,2 ή 5 του εξονίου 1 του γονιδίου FVIII, με αποτέλεσμα ένα πρόωρο stop codon. Το ηπατικό FVIII mrna των μυών αυτών ήταν 50% λιγότερο από αυτό των NSG μυών, ενώ η δραστικότητα του FVIII στο πλάσμα ήταν εξαιρετικά μειωμένη, συγκρίσιμη με αυτή των χρακτηρισμένων με αιμορροφιλία Α μυών που έχουν το 129SV/C57BL/6 γενετικό υπόστρωμα. Δύο από τους αρσενικούς μύες (founders) εξέφραζαν την ίδια μετάλλαξη, μία έλλειψη 8 νουκλεοτιδίων στο εξόνιο 1 του γονιδίου FIX, η οποία προκαλλούσε ένα πρόωρο stop codon. Οι NSG μύες είναι καλύτεροι υποψήφιοι για μεταμόσχευση ανθρώπινων αιμοποιητικών κυττάρων από ότι οι NOD/SCID μύες καθώς είναι ανοσοκατεσταλμένοι σε τόσο μεγάλο βαθμό που δεν έχουν T-cells, B- cells, και Natural killer cells και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της ανθρώπινης ανοσολογικής αντίδρασης σε προϊόντα FVIII και FIX(26). Η τεχνική, μεχρι σήμερα, περιλαμβάνει την έγχυση του Cas9 mrna σε ζυγώτες (γονιμοποιημένα έμβρυα στο στάδιο ενός κυττάρου - single cell stage). Commented [ΘΑ2]: Να διευκρινίσω τι σημαίνουν NSG, NOD, SCID Αν και οι προσδοκίες από την προοπτική της χρήσης των τεχνικών επεξεργασίας γονιδίων στη αιμοροφιλία είναι μεγάλες, στη σημερινή τους μορφή απαιτούν τη χρήση του φορέα-ιού AAV για τη μεταφορά και απόδοση της νουκλεάσης ή του transgene. Συνεπώς, οι ίδιοι περιορισμοί που διέπουν τη χρήση των AAV στη γονιδιακή θεραπεία υφίστανται και στην προσέγγιση της επεξεργασίας του γονιδίου και επιπλέον, πιθανώς να προκύψουν και άλλες επιπλοκές από την πληθώρα των φορέων που χρειάζονται. Τέλος, περιορισμένα στοιχεία παρουσιάζουν επιπτώσεις σε σημεία εκτός στόχου, από τη χρήση τέτοιας τεχνολόγίας, εμποδίζοντας, για την ώρα, την πιο ευρεία κλινική εφαρμογή της (27). 22

23 Αιμοροφιλία Β Αρχικά, η αιμοροφιλία θεωρείτο ένα αιμορραγικό σύνδρομο που οφείλετο σε έλλειψη του «αντι-αιμοροφιλικού παράγοντα». Το 1947 ο Pavlovsky παρατήρησε ότι η διαταραχή της πήξης στο πλάσμα ενός αιμοροφιλικού ασθενή είναι δυνατόν να διορθωθεί με την ανάμειξή του με πλάσμα ένος άλλου αιμοροφιλικού ασθενούς(28). Μέχρι το 1952 ήταν πια σαφές ότι η έλλειψη ενός διαφορετικού παράγοντα πήξης (αρχικά ονομάστηκε Christmas factor και αργότερα μετονομάστηκε σε παράγοντα ΙΧ) προκαλλεί αιμοροφιλία σε ένα ποσοστό 20% των περιστατικών (αιμοροφιλία Β), ενώ για το υπόλοιπο 80% υπεύθυνη ήταν η έλλειψη του παράγοντα VIII (αιμοροφιλία Α). Η αιμοροφιλία Β (νόσος Christmas, έλλειψη παράγοντα FIX) είναι μία διαταραχή της πήξης που κληρονομείται με φυλοσύνδετο (Χσυνδεδεμένο) υπολειπόμενο τρόπο. Η νόσος εμφανίζεται με συχνότητα περίπου 1/30,000 άρρενες και οι ασθενείς κατανέμονται ισομερώς στις διάφορες εθνοτικές ομάδες. Η κλινική εμφάνιση της νόσου μπορεί να είναι ήπια, μέση ή βαρειά και κλινικά δεν διαφέρει άπο την αιμοροφιλία Α. Η αιμοροφιλία Β εμφανίζεται ως αποτέλεσμα ανεπάρκειας του παράγοντα IX (FIX), μία πρωτεάση σερίνης το πλάσματος, δράση της οποίας είναι η ενεργοποίηση του παράγοντα Χ. Ο FIX παράγεται στο ήπαρ και ενεργοποιείται μετά από μια αλληλουχία μετά-μεταφραστικών τροποποιήσεων, εκ των οποίων, η πιο σημαντική περιλαμβάνει την καρβοξυλίωση των 12 καταλοίπων (residues) γλουταμικού οξέος στο Ν-τελικό τμήμα της ώριμης πρωτεΐνης (FIX Gla domain). Η διαδικασία αυτή εξαρτάται από την παρουσία της Βιταμίνης Κ(29). Ο FIX κυκλοφορεί στο αίμα ως μια ανενεργός πρωτεΐνη και ενεργοποιείται με την αποκοπη του πεπτιδίου ενεργοποίησης του FIX (VIIa/Ιστικός παράγοντας ή FXIa) με αποτέλεσμα μια πρωτεΐνη που αποτελείται από μια ελαφρά και μια βαρειά άλυσσο. Commented [ΘΑ3]: 23

24 Εικόνα 6. Σχηματική αναπαράσταση της δομής του FIX Από τις μεταλλάξεις που προκαλούν την κλινική νόσο στον άνθρωπο (εικόνα 6), περίπου το 96% εμφανίζεται στην 2.2-kb ακολουθία του γονιδίου του FIX που κωδικοποιεί τις περιοχές του εκκινητή και την κωδικοποιούσα πρωτεΐνη (30). Οι ασθενείς λαμβάνουν αγωγή που περιλαμβάνει ανθρώπινο παράγοντα ΙΧ πλάσματος, ή ανασυνδυασμένο FIX. Commented [m4]: metafrasi Εικόνα 7. Μεταλλάξεις του γονιδίου FIX που προκαλλούν Αιμορροφιλία Β 24

25 Μύες Τα γονίδια FΙΧ του ανθρώπου και του μυός παρουσιάζουν ομολογία κατά 80%(31). Όπως και στον άνθρωπο, έτσι και στο μυ το γονίδιο FΙΧ βρίκεται επί του χρωμοσώματος Χ και κληροδοτείται και στα δύο είδη με φυλοσύνδετο τρόπο. Η δομή της πρωτεΐνης καθώς και οι βασικές της διαδράσεις στη διαδικασία της αιμόστασης είναι ίδιες στον άνθρωπο και το μυ και οι τυποποιημένες εργαστηριακές μέθοδοι για την αξιολόγηση της πήξης όπως και οι εξειδικευμένες μετρήσεις μεμονωμένων παραγόντων πήξης που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια για τον άνθρωπο έχουν εφαρμογή και στο μυ(29). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι μεταξύ του ανθρώπου και του μυ παρατηρούνται και αρκετές διαφορές στην αιμόσταση όπως και στη θρόμβωση, όπως διαφορές υπάρχουν και μεταξύ διαφορετικών υποειδών του μυ, οι οποίες θα πρέπει να λαμβάνονται υπ όψιν κατά το σχεδιασμό της έρευνας. Συγκριτικές αναφορές πάνω στη διαδικασία της αιμόστασης του ανθρώπου και του μυ είναι διαθέσιμες στη βιβλιογραφία(32) όπως και φυσιολογικές τιμές για τον έλεγχο της πήξης σε ειδικές βάσεις δεδομένων ( q=cblood%20hematologyqqqcoagulation). Ενώ δεν έχουν ταυτοποιηθεί μύες που να εκφράζουν αυτόματη έλλειψη FIX, μία σειρά από FIX knockout μύες έχουν δημιουργηθεί μετά από ομόλογο ανασυνδυασμό σε εμβρυονικά βλαστοκύτταρα. Αρχικά το αποτέλεσμα ήταν ένας μυς χωρίς ανιχνεύσιμο mrna ή έκφραση FIX στο πλάσμα. Τα ζωικά αυτά μοντέλα δημιουργήθηκαν μετά από διαγραφή του εκκινητή (promoter) καθώς και ενός τμήματος του γονιδίου FIX με αποτέλεσμα να μη παράγουν καθόλου FIX. Σε αντίθεση με το ζωικό μοντέλο που προαναφέρθηκε, στην κυκλοφορία κάποιων ασθενών με αιμορροφιλία Β παρατηρείται FIX ο οποίος αν και βιολογικά ανενεργός παρουσιάζει επαρκή αντιγονική δράση. Έτσι, το συγκεκριμένο ζωικό μοντέλο των μυών με αιμοροφιλία Β δεν προσομοιάζει κάποιες πολύ σημαντικές παραμέτρους της ανθρώπινης νόσου. Συγκεκριμένα, όταν τα μοντέλα λαμβάνουν εξωγενή FIX ή γονιδιακή θεραπεία ενδομυικά, συνήθως, παράγουν αντισώματα αδρανοποίησης σε αντίθεση με τους αιμοροφιλικούς (Β) ανθρώπους που σπανίως παράγουν τέτοιου είδους αντισώματα(33). Επί πλέον των μυών με πλήρη έλλειψη FIX, οι ερευνητές έχουν δημιουργήσει knock in μύες που εκφράζουν ανθρώπινο FIX (missense mutation R333Q-hFIX)(30). Η συγκεκριμένη μετάλλαξη έχει εντοπιστεί 25

26 σε αρκετούς ασθενείς με βαρειά αιμοροφιλία Β. Στους R333Q-hFIX μύες ανιχνεύεται μεταλλαγμένος ανθρώπινος FIX και η δραστικότητά του στο πλάσμα είναι μικρότερη του 1%(30). Όπως και οι μύες με αιμοροφιλία Α έτσι και με την αιμοροφιλία Β δεν παρουσιάζουν αυτόματες αιμορραγίες, αλλά ακρωτηριασμός της ουράς προκαλεί δυνητικά θανατηφόρο αιμορραγία. Τα ζωικά αυτά μοντέλα έχουν αξιοποιηθεί στη μελέτη της δραστικότητας των σκευασμάτων FVIII και FIX, όπως και στην εκτίμηση της ανοσολογικής απάντησης και της ασφάλειας στη γονιδιακή θεραπεία(34). In vivo γονιδιακή επεξεργασία σε μοντέλο μυ Αιμορροφιλίας Β Η μεταφορά ενός λειτουργικού αντιγράφου ενός δυσλειτουργικού γονιδίου (γονιδιακή θεραπεία) μέσω ιού-φορέα πραγματοποιείται σε ζωικά μοντέλα και ανθρώπους με σχετική επιτυχία. Τα μειονεκτήματα της τεχνικής αυτής περιλαμβάνουν τον κίνδυνο ογκογέννεσης, λόγω της εισδοχής καινούριου γενετικού υλικού, και της απώλειας του ενδογενούς μηχανισμού ελέγχου της έκφρασης του γονδίου(35). Με την τεχνική στόχευσης συγκεκριμένων γονιδίων των ipsss σε μοντέλα μυών ex-vivo δίνεται η προοπτική να υπερκεραστούν οι συκεκριμενοι περιορισμοί. Δυστυχώς, τα περισσότερα γενετικά νοσήματα επηρεάζουν λειτουργίες οργάνων, των οποίων τα κύτταρα δεν υπάρχει δυνατότητα να υποστούν κάποια επεξεργασία ex vivo. Ένα τέτοιο όργανο είναι το ήπαρ όπου παράγονται, σε μεγαλύτερο ποσοστό, οι παράγοντες πήξης. Ένα μοντέλο γενετικού νοσήματος όπου εφαρμόζεται η γονιδιακή θεραπεία με στόχο το ήπαρ είναι η αιμορροφιλία Β. Όπως αναφέρεται παρακάτω, οι μεταλλάξεις στο γονίδιο του παράγοντα ΙΧ εντοπίζονται εντός των αλληλουχιών των εξονίων 2-8 (εικόνα 6). Έτσι, η στοχευμένη επεξεργασία ενός mutant allele δεν θα επέτρεπε την πλήρη κάλυψη του εύρους των μεταλλάξεων που παρουσιάζονται στον ανθρώπινο πληθυσμό. Είναι αξιοσημείωτο ότι με τη χρήση των ZFN νουκλεασών δίνεται η δυνατότητα να εγκατασταθεί ένα τμήμα cdna στο πρώτο ιντρόνιο του γονιδίου του F9 που θα επέτρεπε τη σύνδεσή του με το εξόνιο 1 για παραγωγή λειτουργικού παράγοντα ΙΧ και θα εξάλλειφε τις δυσλειτουργίες που προκαλλούν οι περισσότερες γνωστές μεταλλάξεις. Οι Hojun et al. περιέγραψαν το σχεδιασμό ZFN νουκλεασών που στοχεύουν το ιντρόνιο 1 του ανθρώπινου γονιδίου F9 και επιβεβαίωσαν τη δυνατότητα να προκαλλέσουν διακοπή της διπλής αλύσου (Double stranded break) σε συγκεκριμένο στόχο και να πυροδοτήσουν γονιδιακή 26

27 επεξεργασία μέσω της φυσικής οδού του μηχανισμού του HDR (Homology directed repair) σε ανθρώπινα κύτταρα ερυθρολευχαιμίας Κ Για εκτίμηση in vivo, δημιούργησαν ένα εξανθρωποιημένο μοντέλο μυός με αιμορροφιλία Β. Ο λόγος που επέλεξαν το εξανθρωποιημένο μοντέλο είναι ότι οι F9 ZFN νουκλεάσες στοχεύουν ένα συγκεκριμένο σημείο στο ιντρόνιο 1 του ανθρώπινου F9 (hf9) που λείπει από το γονίδιο του μυός. Κατασκέυασαν ένα hf9 mini-gene, υπό τον έλεγχο ενός ενισχυτή και εκκινιτή με τροπισμό στο ήπαρ, που μιμείται μία γνωστή μετάλλαξη (Y155stop) με αποτέλεσμα την πλήρη έλλειψη παράγοντα ΙΧ από την κυκλοφορία. Εισήγαγαν το γονίδιο αυτό στον τόπο (locus) ROSA26 του μυός και επιβεβαίωσαν τόσο το γονότυπο όσο και το γεγονός ότι τα επεξεργασμένα, εξανθρωποιημένα μοντέλα δεν είχαν παράγοντα ΙΧ στην κυκλοφορία τους. Στη συνέχεια ανέμειξαν τους μύες αυτούς (hf9mut) με μύες υπάρχοντος μοντέλου αιμορροφιλίας Β με έλλειψη γονιδίου F9 μυός (hemophilia B-HB) με αποτέλεσμα μύες hf9mut/hb προκειμένου να μελετήσουν σε αυτούς τη γονιδιακή «διόρθωση» με τη χρήση ZFN νουκλεασών in vivo. Για τη εισαγωγή των F9 ZFN νουκλεασών στο ήπαρ δημιουργήθηκε ο ηπατοτρόπος ιός AAV, serotype 8 (AAV8-ZFN) εκφράζοντας τις F9 ZFN νουκλεάσες μέσω ενός enhancer and promoter με τροπισμό στο ήπαρ. O AAV8-ZFN εισήχθη στους hf9mut μύες με έγχυση μέσω της φλέβας της ουράς και την έβδομη μέρα μετά την έγχυση απομονώθηκε ηπάτικό DNA προκειμένου να επιβεβαιωθεί η διασπαστική δράση των ZFN νουκλεασών (cleavage activity). Για τη διόρθωση του μεταλλαγμένου γονιδίου hf9 in situ, δημιούργησαν ένα AAV ιό που φέρει το διορθωτικό πρότυπο (AAV8-donor) το οποίο στα άκρα του φέρει ομόλογα συνδετικά στοιχεία και περιλαμβάνει ένα τμήμα cdna που περιέχει τα εξόνια 2-8 του γονιδίου hf9. Έχοντας εξασφαλίσει τη δυνατότητα ανίχνευσης HDR in vitro ενέχυσαν ενδοπεριτονεϊκά, κατά τη δεύτερη ημέρα της ζωής τους, AAV8-ZFN+AAV8- donor, AAV8-mock+AAV8-donor ή μόνο AAV8-ZFN σε hf9mut/hb μύες. Η ενδο-περιτονεϊκή έγχυση αντί της ενδοφλεβίου έγινε καθώς η τεχνική προκαλλεί λιγότερες επιπλοκές. Τη δέκατη εβδομάδα της ζωής των ζώων ελήφθησαν δείγματα ηπατικού DNA για τη διερεύνηση της αντικατάστασης του γονιδίου στον hf9 τόπο 27

28 (locus) μέσω του φυσικού μηχανισμού HDR. Χρησιμοποιώντας ειδικούς εναρκτήρες (primers) κατάφεραν να εντοπίσουν αλλαγές μέσω HDR μόνο σε εκείνα τα ζώα στα οποία είχαν εγχύσει AAV8-ZFN+AAV8- donor αποδεικνύοντας έτσι ότι η συνδυαστική χρήση των ZFN νουκλεασών με το πρότυπο υγιούς δότη (donor template) μέσω AAV8 φορέων οδηγεί σε HDR (Homology Directed Repair) in vivo (Εικόνα 7). Εικόνα 8. Σχηματική αναπαράσταση επεξεργασίας γονιδίου μέσω ZFN νουκλεασών. Για τη διερεύνηση του κατά πόσον η επεξεργασία του γονιδίου μέσω νουκλεασών ZFN έχει ως αποτέλεσμα και την έναρξη παραγωγής 28

29 ανθρώπινου παράγοντα FIX, ενέχυσαν ενδο-περιτονεϊκά σε hf9mut μύες ηλικίας 2 ημερών AAV8-ZFN, AAV8-mock+AAV8-donor ή AAV8- ZFN+AAV8-donor. Τα επίπεδα του ανθρώπινου παράγοντα FIX στους μύες που έλαβαν ZFN μόνο ή mock+donor υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε 15ng/ml, ενώ στους μύες που έλαβαν ZFN+donor υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε ng/ml (που αντιστοιχεί σε 2-3% των φυσιολογικών επιπέδων). Για να επιβεβαιώσουν τη σταθερή διόρθωση του γονιδιώματος, διενέργησαν στους μύες μερική ηπατεκτομή. Τα επίπεδα του ανθρώπινου παράγοντα FIX στην κυκλοφορία των μυών αυτών παρέμειναν σταθερά και μετά την ηπατεκτομή(36). Σκύλοι με αιμοροφιλία Β Οι αιμοροφιλικοί σκύλοι έχουν αξιοποιηθεί εδώ και δεκαετίες για την προ-κλινική δοκιμή παραγόντων αντικατάστασης καθώς η φυσιολογία των παραγόντων FVIII, FIX και FVIIa προσομοιάζουν σε πολύ μεγάλο βαθμό εκείνη του ανθρώπου(37). Τα τελευταία χρόνια υπάρχει πολύ μεγάλο ενδιαφέρον στη διερεύνηση της γενετικής ή/και χημικής επεξεργασίας των πρωτεινών της πήξης με σκοπό τη βελτίωση της θεραπευτικής τους προοπτικής(38), με κύριο στόχο την επιμύκηνση της διάρκειας ζωής των πρωτεινών ή/και της αύξησης συγκεκριμένων δράσεών τους. Όπως η ανθρώπινη αιμοροφιλία Β, έτσι και η αιμοροφιλία Β του σκύλου κληρονομείται με φυλοσύνδετο υπολειπόμενο τρόπο και εκφράζεται με έλλειψη του FIX στο πλάσμα. Πραγματοποιείται έρευνα σε τουλάχιστον τρεις ομάδες σκύλων με αιμοροφιλία Β με αυτόματη μετάλλαξη, η κάθε μία από τις οποίες έχει μία μοναδική διαταραχή. Μία από αυτές διατηρείται στο Chapel Hill από το Οι σκύλοι αυτοί ανήκουν στη φυλή Cairn terrier και παρουσιάζουν μία σημειακή μετάλλαξη με αντικατάσταση του γλουταμικού οξέος από γλυκίνη (glycine) στη θέση ΑΑ377(39). Η δεύτερη διατηρείται στο Όμπερν της Αλαμπάμα και περιλαμβάνει σκύλους φυλής Lhasa Apso οι οποίοι φέρουν μία 5-bp διαγραφή στα νουκλεοτίδια και μία μετάβαση από C σε T στο γονίδιο FIX με αποτέλεσμα a premature stop-codon at AA146(40). Η τρίτη διατηρείται στο πανεπιστήμιο Cornell της Νέας Υόρκης και περιλαμβάνει σκύλους φυλής Λαμπραντόρ οι οποίοι φέρουν πλήρη διαγραφή του γονιδίου FIX(41). Οι ομάδες του Chapel Hill και του 29

30 Όμπερν έχουν αξιοποιηθεί εκτενώς στη δοκιμή προιόντων FIX και στην έρευνα πάνω στη γονιδιακή θεραπεία. Πρωτεύοντα (Non human primates) Το 2001 ανακοινώθηκε από τους Tomokiyo et al. το πρώτο μοντέλο αιμορροφιλίας σε πίθηκο (macacus fascicularis) μετά από ανοσοποίηση (immunizing) με χορήγηση ανθρώπινου FIX (hfix) μέσω ανοσοενισχυτικών(42). Η δραστικότητα του FIX στα τρία πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μειώθηκε σταδιακά σε ποσοστό μικρότερο του 10%. Στη συνέχεια χορηγήθηκε ανθρώπινος FVII (hfviia) στο ζώο που εμφάνισε το μεγαλύτερο τίτλο ανασταλτών κατά του FIX για να διερευνηθεί η χρησιμότητά του ως μοντέλο αιμορροφιλίας με ανασταλτές. Τα αποτελέσματα της θρομβοελαστογραφίας που διενεργήθηκε μετά από τη χορήγηση του hfviia έδειξαν ότι η αιμοστατική δράση του FVII σε αυτό το μοντέλο ήταν παραπλήσια με αυτή που παρατηρείται σε αιμορροφιλικούς ασθενείς με ανασταλτές(42). Commented [m5]: τσεκ για εικόνα Έλλειψη FXI Ο παράγοντας XI (FXI) είναι μία πρωτεάση σερίνης που παράγεται κατά κύριο λόγο στο ήπαρ. Ενεργοποιείται από τον FXIIa και τη Θρομβίνη και συμμετέχει τόσο στην αιμόσταση όσο και τη θρόμβωση στον άνθρωπο ενισχύοντας την παραγωγή θρομβίνης και τη δημιουργία ινικής. Τα περισσότερα δεδομένα συγκλίνουν στην άποψη ότι ο FXIIa παίζει σημαντικότερο ρόλο στη θρόμβωση από ότι στην αιμόσταση(43). Η έλλειψη FXI στον άνθρωπο είναι μία σπάνια διαταραχή της πήξης που ονομάζεται και αιμοροφιλία C. Πρόκειται για μία υπολειπόμενη αυτοσωματική διαταραχή με αυξημενη παρουσία στην κοινότητα των Εβραίων Εσκενάζυ. Οι ασθενείς αυτοί σπάνια εμφανίζουν αυτόματες αιμορραγίες αλλά παρουσιάζουν εκτεταμένη αιμορραγία μετά από πρόκληση (χειρουργικές επεμβάσεις/τραύμα). Είναι αξιοσημείωτο ότι η σχετιζόμενη με έλλειψη FXI αιμορραγία εντοπίζεται συνήθως σε ιστούς 30

31 με αυξημένη ινωδολυτική δραστηριότητα όπως το ουροποιητικό σύστημα και ο οροφάρυγκας(44). Το γεγονός αυτό μπορεί να σχετίζεται με το δεδομένο ότι οι θρόμβοι που σχηματίζονται ελλείψει FXI είναι πιο ευάλωτοι στην ινωδόλυση(44). Επί πλέον, στον άνθρωπο, ο κλινικός αιμορραγικός φαινότυπος ασθενών με έλλειψη FXI ποικίλει σε μεγάλο βαθμό και δεν αντιστοιχεί απαραίτητα με τα επίπεδα του FXI στο πλάσμα(45). Στο ένα τρίτο των ασθενών με βαρειάς μορφής έλλειψη FXI αναπτύσσονται ανασταλτές μετά από έκθεση σε προιόντα αίματος. Για τη πρόληψη της αιμορραγίας σε ασθενείς με βαρειάς μορφής έλλειψη FXI χορηγείται πλάσμα, συμπυκνωμένος FXI, και αντι-ινωδολυτικά σκευάσματα. Μύες με έλλειψη FXI Οι FXI του ανθρώπου και του μυός είναι ομοδιμερή μεγέθους 160kDa αποτελούμενοι από δύο πολυπεπτίδια 80kDa συνδεδεμένα με δισουλφιδικό δεσμό. Η ομολογία σε επίπεδο πρωτεΐνης μεταξύ των δύο είναι στο 78%. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν διαφορές μεταξύ των δύο FXI. Η πρωτεΐνη στο μυ παράγεται κατά κύριο λόγο, αν όχι αποκλειστικά, στο ήπαρ ενώ στον άνθρωπο παράγεται, εκτός του ήπατος, και στο πάγκρεας και τους νεφρούς. Με τη μεθόδο ομόλογου ανασυνδυασμού (homologous recombination -based approach) στοχοποιήθηκε το FXI γονίδιο το οποίο και διεγράφη με αποτέλεσμα FXI-/- μύες οι οποίοι είναι υγιείς, γόνιμοι, και φαινοτυπικά πανομοιότυποι με wild type μύες. Η αναπαραγωγή μεταξύ ετεροζυγωτικών FXI+/- μυών ακολούθησε τη Μεντελιανή αναλογία (Mendelian ratio) καταρρίπτοντας την υπόθεση ότι έλλειψη FXI συνδέεται με αποβολή(). Αντίστοιχα με τον άνθρωπο, το πλάσμα των FXI-/- μυών παρουσιάζει πολύ εκτεταμένο aptt σε σύγκριση με τους wild type μύες, ενώ οι ετεροζυγώτες FXI+/- μύες έχουν περίπου 50% των επιπέδων FXI των wild type μυών και ο χρόνος aptt κυμαίνεται κάπου ενδιάμεσα. Οι χρόνοι ροής σε ενήλικους FXI-/- μύες, με τεχνητό τραύμα στην ουρά ήταν αδιαφοροποίητοι ως προς αυτούς σε wild type μύες καταδεικνύοντας ότι ο FXI δεν συνδράμει ουσιαστικά στη δημιουργία ινικής σε τέτοιου είδους τραύμα, όπως δεν παρατηρήθηκε ανωμαλία στην αιμόσταση κατά τη διάρκεια ή μετά από χειρουργικές επεμβάσεις και τραυματισμό διαφόρων αγγείων και ιστών, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου(46). 31 Commented [m6]: reference Commented [m7]: συμπέρασμα?

32 Νόσος von Willebrand Η νόσος von Willebrand οφείλεται σε ποσοτικές ή ποιοτικές διαταραχές του παράγοντα von Willebrand και θεωρείται η πιο κοινή κληρονομούμενη διαταραχή πήξης στον άνθρωπο. Ήπιας και βαρειάς μορφής ποσοτικές διαταραχές προκαλούν αντίστοιχα VWD τύπο 1 και 3, ενώ ποιοτικές παρατηρούνται στον τύπο 2. Η νόσος VWD έχει εντοπιστεί και σε αρκετά είδη ζώων, συμπεριλαμβανομένων των σκύλων, των χοίρων, των γατών και των ίππων ως αποτέλεσμα αυτόματων μεταλλάξεων. Πιο πρόσφατα, η δημιουργία μοντέλων μυών έχει προκαλέσει ζωηρό ενδιαφέρον καθώς το μικρό μέγεθός τους, σε συνδυασμό με το καλά χαρακτηρισμένο γενετικό τους υπόβαθρο, τους καθιστά ιδανικό μέσο για τη μελέτη της λειτουργίας του παράγοντα VWF in vivo. Το πιο διαδεδομένο μοντέλο είναι ένας μυς με έλλειψη VWF ο οποίος έχει δημιουργηθεί μετά από ομόλογο ανασυνδυασμό (homologous recombination). Επιπλέον, έχουν περιγραφεί μοντέλα που έχουν προκύψει από αλλάγές σε τροποποιητικά γονίδια που επηρρεάζουν έμμεσα τον VWF και μέσω των οποίων έχει μελετηθεί εκτενώς η βιολογία του VWF. Η νόσος von Willebrand χαρακτηρίζεται από αιμορραγίες του βλεννογόνου και του δέρματος, παρατεταμένο χρόνο πήξης και κληρονομείται με αυτοσωματικό άλλοτε υπολειπόμενο και άλλοτε επικρατή χαρακτήρα(47). Ο παράγοντας vw είναι μία πολυμερής γλυκοπρωτεΐνη το μέγεθος της οποίας ποικίλει μεταξύ kDa και παράγεται στα μεγακαρυοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο VWF που παράγεται στα μεγακαρυοκύτταρα αποθηκεύεται στα άλφακοκκία των αιμοπεταλίων ενώ ο VWF που παράγεται από τα ενδοθηλιάκα κύτταρα εκκρίνεται απ ευθείας στην κυκλοφορία. Στην περίπτωση αγγειακής βλάβης, ο VWF παίζει ρόλο κλειδί στη σύνδεση Commented [m8]: Συχνότητα? 32

33 των αιμοπεταλίων στο ενδοθήλιο. Επιπλέον, ο VWF μεταφέρει τον FVIII. Υπάρχουν δύο βασικές κατηγορίες ζωικών μοντέλων για τη νόσο του von Willebrand: των ζώων που φέρουν αυτόματες μεταλλάξεις και τα γενετικά τροποποιημένα. Μοντέλα που φέρουν τυχαία μετάλλαξη Σειρά RIIIS/J. Τα επίπεδα του VWF μεταξύ των μυών ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό. Αρχικά παρατηρηθηκε παρατεταμένος χρόνος ροής (>15 λεπτά) στους μύες που ανήκουν στη RIII/J σειρά. Περεταίρω ανάλυση έδειξε ότι το πολυμερές του VWF ήταν φυσιολογικής δομής αλλά η δραστικότητα του αντιγόνου ήταν στο 33-55% του φυσιολογικού πλάσματος του μυ. Ο παράγων Ριστοσετίνης και η δραστικότητα του FVIII ήταν επίσης μειωμένα. Κατά τη μελέτη της πρωτοταγούς ακολουθίας εντοπίστηκε διαταραχή σε διαφορετικό σημείο από το γονίδιο VWF του μυ. Αυτό οδήγησε στην ανακάλυψη του πρώτου τροποποιητηκού γονιδίου (modifier gene) του VWF στο μυ που ονομάστηκε Mvwf1(Modifier of VWF1)(48). Ως προέλευση του Mwvf1 ταυτοποιήθηκε το γονίδιο B4galnt2 που εκφράζει μία N-ακετυλογαλακτοζαμινυλτρανσφεράση. Μετάλλαξη στο γονίδιο B4galnt2 της σειράς RIIIS/J προκαλέι μία μεταφορά της έκφρασής του από το εντερικό επιθήλιο στο αγγειακό. Αγγειακή έκφραση του B4galnt2 οδηγεί σε ανώμαλη γλυκοζυλίωση του VWF με αποτέλεσμα την ταχεία κάθαρση του VWF από το πλάσμα μέσω του υποδοχέα ασιαλογλυκοπρωτεΐνης (ASGPR). Το τροποποιητικό γονίδιο Mvwf1 εντοπίστηκε και σε άλλες σειρές μυών (συμπεριλαμβανομένων και wild type). Ένας τέτοιος μηχανισμός είναι πιθανό να συμβάλλει στην υψηλή συχνότητα της νόσου VW στον άθρωπο. Σειρά CASA/Rkj. Στη σειρά CASA/Rkj παράγεται 8 φορές περισσότερος VWF από τη σειρά A/J. Αυτή η διαφορά σχετίζεται σε σημαντικό βαθμό με το Mvwf2 τροποιητικό γονίδιο, το οποίο στη σειρά CASA/RKJ προκαλεί αυξημένη βιοσύνθεση του VWF(49). Η παρατήρηση αυτή έρχεται να δείξει τη 33

34 διαφορά που προκύπτει από τη δράση των τροποποιητικών γονιδίων 1 και 2. Γενετικά τροποποιημένοι μύες Μύες με πλήρη έλλειψη VWF Ζωικά μοντέλα μυός με πλήρη έλλειψη VWF (VWF-/-) είναι διαθέσιμα εδώ και περίπου δύο δεκαετίες και αποτελούν ένα χρήσιμο υλικό για τη μελέτη της νόσου von Willebrand τύπου 3. Διάρρηξη του γονιδίου με εισαγωγή ενός γονιδίου ανθεκτικού στη νεομυκίνη (neomycin resistant gene-nsg) είχε ως αποτέλεσμα την απουσία ανιχνεύσιμου VWF ή VWF προπεπτιδίου καθώς και μείωση των επιπέδων του FVIII κατά 80% σε σχέση με μύες wild type. VWF-/- μύες παρουσιάζουν πολύ παρατεταμένο χρόνο ροής. Οι ετερόζυγοι μύες εκφράζουν επίπεδα αντιγόνου κόντά στο 50% και επίπεδα FVIII στο 60% των wild type μυών και έχουν φυσιολογικό χρόνο ροής. VWF-/- μύες χρησιμοποιήθηκαν ως βάση για τη δημιουργία μεταβατικών (transient) μοντέλων που εκφράζουν VWF μετά από υδροδυναμική έγχυση. Σε αυτό το μοντέλο, χορηγήθηκε VWFcDNA μυός με ενδοφλέβια έγχυση υψηλής πίεσης με αποτέλεσμα τη κατάληξη του γονιδίου στα ηπατικά κύτταρα και την έκλυση δραστικού VWF στην κυκλοφορία(50). Άλλα μοντέλα γονιδιακά επεξεργασμένων μυών. Φαινοτυπική ανάλυση διαφόρων μοντέλων μυών που χρησιμοποιούνται σε ερευνητικούς σκοπούς άσχετους με τον VWF αποκάλυψε την ύπαρξη και άλλων VWF τροποποιητικών γονιδίων. Η χρήση των μοντέλων μυών με VWD στη δοκιμή νέων θεραπευτικών ουσιών δεν έχει υπάρξει τόσο εκτεταμένη καθώς παρατηρήθηκε πως ο ανθρώπινος VWF δεν αλληλεπιδρά με τη γλυκοπρωτεΐνη GPIb του μυ. Επίσης, η δεσμοπρεσσίνη που χορηγείται συχνά σε ασθενείς με VWD τύπου1 δεν αποδίδει τόσο αποτελεσματικά στους μύες. Commented [m9]: reference Χοίροι Το γονίδιο του VWF στο χοίρο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5q21, ένα σημείο που παρουσιάζει ομολογία με το ανθρώπινο χρωμόσωμα 12p

35 Η πλήρης αλληλουχία του cdna του VWF του χοίρου συνθέτει μία πρωτεΐνη 2807 αμινοξέων, 6 αμινοξέων λιγότερων από τον ανθρώπινο VWF. Ο VWF του ανθρώπου και του χοίρου παρουσιάζουν 84,3% ομολογία(51). Καθώς ο χοίρος, σε αντίθεση με το σκύλο, μπορεί να παρουσιάσει αθηρωμάτωση, η επίδραση του VWF τόσο στην πρόκληση της νόσου όσο και στις επιπλοκές της (θρόμβωση) έχει μελετηθεί σε χοίρια μοντέλα (51). Σκύλοι Το VWF γονίδιο του σκύλου έχει εντοπιστεί στο χρωμόσωμα 27 σε σημείο ομόλογο ως προς το ανθρώπινο χρωμόσωμα 12π13.2. Όπως στον άνθρωπο, έτσι και στο σκύλο η νόσος von Willebrand αποτελεί την πιο συχνή κληρονομούμενη διαταραχή της πήξης. Σειρές τέτοιων σκύλων είναι ιδιαιτέρως χρήσιμες για τη μελέτη της παθοφυσιολογίας της νόσου, αλλά και τη δοκιμή νεων θεραπευτικών δοκιμών. Το 1978 ιδρύθηκε στο Chapel Hill μία σειρά σκύλων φυλής Scottish Terrier από ένα ετεροζυγώτη σκύλο. Η πλήρης αλληλουχία του cdna του VWF του σκύλου συνθέτει μία πρωτεΐνη 2813 αμινοξέων, ομοίου αριθμού με τον άνθρωπινο VWF. Στο πλήρες μήκος τους, οι VWF του ανθρώπου και του σκύλου παρουσιάζουν ομοιότητα σε ποσοστό 87.1% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και 86.2% σε επίπεδο πρωτεΐνης. Το προπεπτίδιο και οι ενεργές μορφές του VWF του σκύλου παρουσιάζουν ομολογία με την αλληλουχία του ανθρώπου κατά 87.3% και 92.8% αντίστοιχα(51). Ο VWF του σκύλου δεν αντιδρά με η Ριστοσετίνη. Αντίθετα, η βοτροσετίνη είναι ένας αξιόπιστος ενεργοποιητής του VWF και υποστηρίζει τη συγκόληση των αιμοπεταλίων του σκύλου από VWF σκύλου και ανθρώπου. Commented [ΘΑ10]: 35

36 Θρομβασθένεια Glanzmann Η θρομβασθένεια Glanzmann είναι η πιο συχνή και η πιο εκτενώς μελετημένη κληρονομική διαταραχή της λειτουργίας των αιμοπεταλίων. Τα αιμοπετάλια δεν συσσωματώνονται φυσιολογικά λόγω ποσοτικών ή ποιοτικών διαταρχών της aiiβb3 ιντεγκρίνης (παλαιότερα γνωστή ως GPIIb-IIIa). Η θρομβασθένεια Glanzmann κληρονομείται με αυτοσωματικό υπολειπόμενο τρόπο και οφείλεται σε μεταλλάξεις στα γονίδια ITGA2B ή ITGB3 που κωδικοποιούν την ιντεγκρίνη IIb και 3 αντίστοιχα. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται σε μικρή απόσταση μεταξύ τους στο χρωμόσωμα 17q αλλά εκφράζονται ανεξάρτητα(52). Η ενδογαμία συμβάλλει στη συχνότητα της θρομβασθένιας Glanzmann (Εβραικές κοινότητες στο Ιράκ, Παλαιστίνιοι Άραβες, Γάλλοι Ρομά). Όσον αφορά στους τύπους των μεταλλάξεων, οι μεγάλες ελλείψεις (large deletions) είναι σχετικά σπάνιες ενώ οι nonsense μεταλλάξεις είναι άφθονες όπως είναι και οι out-of-frame και in-frame μικρές ελλείψεις. Αυτές έχουν ως αποτέλεσμα παραμορφωμένες πρωτεΐνες ή/και ασταθές mrna. Παρόλο που μεταλλάξεις τυχαίνουν και στα δύο γονίδια, το υψηλότερο ποσοστό συμβαίνει στο, μικρότερο σε μέγεθος, ITGA2B πίθανώς λόγω της παρουσίας σε αυτό μεγαλύτερου αριθμού εξονίων(53). Η βιοσύνθεση της IIb 3 λαμβάνει χώρα στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (hematopoιetic stem cells) και συνεχίζει καθ όλη τη διαδικασία της ωρίμανσης των Μεγακαρυοκυττάρων με βιολογικές διαδικασίες που εντοπίζονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και το σύστημα Golgi. Κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων η αιbβ3 υπόκειται μορφολογικές αλλαγές αποτέλεσμα των οποίων είναι η αποκάλυψη των υποδοχέων του ινοδωγόνου για τη διασύνδεση των αιμοπεταλίων μεταξύ τους. Μεταλλάξεις στη θρομβασθένεια Glanzmann εμποδίζουν την παραγωγή των προ-iib 3 πρωτεινών. Εάν η πολύπλοκη αυτή διαδικασία διακοπεί σε κάποιο σημείο τότε η υπολειπόμενη IIb 3 υπόκειται πρωτεοσωματική αποδόμηση. Ιστορικά, οι ασθενείς κατατάσσονται σε 3 κατηγορίες. Η συχνότερη είναι η Θρομβασθένεια Glanzmann τύπου Ι όπου τα αιμοπετάλια περιέχουν ιντεγκρίνη αιιbβ3 λιγότερη από 5% των φυσιολογικών επιπέδων. Στον τύπο ΙΙ η υπολειπόμενη αιιbβ3 (συνήθως μεταξύ 5-15%)μπορεί να είναι λειτουργική ή όχι, ενώ στον τύπο ΙΙΙ η νόσος περιγράφεται και ως μεταβλητού τυπου (variant type) όπου η Commented [m11]: Διόρθωση δεν κάνει νόημα 36

37 αιιbβ3 είναι μεταξύ % των φυσιολογικών επιπέδων αλλά έιναι μη λειτουργική. Διαχρονικά, και μετά από μελέτη μεγάλου αριθμού περιστατικών, δεν έχει αποδειχθεί αναλογία μεταξύ της έντασης της αιμορραγικής διάθεσης και του τύπου της Θρομβασθένειας Glanzmann(53),(52). Ο κλασσικός φαινότυπος της θρομβασθένειας Glanzmann περιλαμβάνει μέτρια προς σοβαρή αιμορραγία στους βλεννογόνους και το δέρμα, συμπεριλαμβανομένων της πορφύρας, της επίσταξης, των εύκολων μολώπων, της αιμορραγίας από τα ούλα, της μενορραγίας και αιμορραγίας από το γαστρεντερικό. Σοβαρή απώλεια αίματος μπορεί να προκύψει μετά από τραύμα η χειρουργική επέμβαση και συχνα αποτελεί επιπλοκή τοκετού. Τα αιμοπετάλια ετεροζυγωτών παρουσιάζουν ενδιάμεσα επίπεδα αιιbβ3, αλλά γενικώς οι φορείς της GT δεν παρουσιάζουν εκτεταμένες αιμορραγίες(54). Ζωικά μοντέλα GT Σκύλοι Στην κτηνιατρική, τα πρώτα περιστατικά με διαταραχή των αιμοπεταλίων που προσομοίαζε στη θρομβασθένεια Glanzmann περιγράφηκαν σε σκύλους φυλής Otterhound (εικόνα 8). Στην πορεία, διαταραχές των αιμοπεταλίων, που συνέτειναν σε πιθανή θρομβασθένεια Glanzmann, εντοπίστηκαν σε σκύλους φυλής Basset hound και Ποιμενικούς Πυρηναίων. Μοριακή ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η διαταραχή των Otterhound και των Ποιμενικών ήταν πανομοιότυπη με τη Θρομβασθένεια Glanzmann τύπου Ι στον άνθρωπο(55). Στην περίπτωση των σκύλων φυλής Basset hound, η μοριακή μελέτη δεν επιβεβαίωσε τη θρομβασθένεια G. Η μελέτη των ζώων αυτών τόσο σε μοριακό όσο και σε βιοχημικό επίπεδο βελτίωσε την αντίληψη πάνω στην παθοφυσιολογία της νόσου αλλά και στη σχέση μεταξύ της δομής και της λειτουργίας των ιντεγκρινών αλλά κυρίως της ιντεγκρίνης β3. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών επέκτειναν τις δυνατότητες πάνω σε τομείς όπως τα διαγνωστικά, η φαρμακολογία, θεραπευτικές προσεγγίσεις και πρόληψη 37

38 ασθενειών. Ιδιαίτερα στην καρδιολογία, όπου σημαντικό κομμάτι της έρευνας εστιάζει στη αναστολή της δραστηριότητας των αιμοπεταλίων μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου, διάφορα σκευάσματα έχουν σχεδιαστεί στοχεύοντας στην ιντεγκρίνη β3. Πολλά από αυτά δοκιμάστηκαν σε σκύλους πριν χορηγηθούν σε ανθρώπους αν και, σε μοριακό επίπεδο, υπήρχαν σχετικά λίγα συγκριτικά δεδομένα. Με τη συλλογή νέων δεδομένων αναμένεται να διελευκανθούν και οι λόγοι που κάποια σκευάσματα, αν και είχαν κριθεί αποτελεσματικά στη χρήση τους στα ζωικά μοντέλα σκύλου, τα αποτελέσματά τους στους ανθρώπους δεν ήταν αντίστοιχα. Εικόνα 9. Σκύλοι φυλής Otterhound Μοντέλα μυ με έλλειψη IIb 3 και v 3 Οι ακολουθίες των γονιδίων που κωδικοποιούν τις ΙΙβ και 3 υπομονάδες έχουν προσδιοριστεί στους μύες. 3 τύποι knockout μυών έχουν αναπτυχθεί που παρουσιάζουν κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα χαρακτηριστικά της Θρομβασθένειας Glanzmann, συμπεριλαμβανομένων αιμορραγιών από βλεννογόνους, φτωχή συστολή (retraction) θρόμβου και μειωμένη συσσωμάτωση αιμοπεταλίων. Ένα εύρημα που έχει θέσει ερωτηματικά στη χρήση των μυών ως μοντέλα 38

39 θρομβασθένειας Glanzmann του ανθρώπου είναι ότι παρουσιάζουν οστεοσκλήρηνση (osteosclerosis) ως αποτέλεσμα διαταραχών της β3 ιντεγκρίνης, ένα σύνδρομο που δεν περιγράφεται σε ανθρώπους που νοσούν από ΘG(56). ΙΙb knockout μύες έχουν επίσης αναπτυχθεί με την εισαγωγή του γονιδίου θυμιδίνης κινάσης ερπητο-ιού στο ΙΙb σημείο(57). Οι μύες αυτοί έχουν χαρακτηριστικά της θρομβασθένειας Glanzmann, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης συγκέντρωσης ινωδογόνου στα α- κοκκία (α granules) των αιμοπεταλίων, γεγονός που επιβεβαιώνει τη συμμετοχή της ιντεγκρίνης IIb3 στην πρόσληψη και την αποθήκευση του ινωδογόνου(57). Διαγονιδιακά μοντέλα μυ προσφέρουν μία σε βάθος εικόνα της επίδρασης της έλλειψης ιντεγκρίνης σε μη-αιμοστατικές διαδικασίες. Αν και υπάρχουν διαφορές μεταξύ της φυσιολογίας αλλά και της κλινικής έκφρασης τέτοιων διαταραχών μεταξύ του μυ και του ανθρώπου, οι μελέτες πάνω σε μύες με έλλειψη -3 και IIb έχουν αποκαλύψει ενδιαφέρουσες πληροφορίες (εικόνα 9). Σε μία από αυτές, οι μύες παρουσίαζαν διαταραχές της κύησης με αποτέλεσμα υψηλή θνητότητα των εμβρύων, διαταραχή για την οποία υπάρχει υποψία ότι σχετίζεται με τη GT στον άνθρωπο χωρίς να έχει ακόμα αποδειχθεί(58). Ένα απροσδόκητο εύρημα σε μύες β3 -/- ήταν η ογκογέννεση, η οποία σχετιζόταν με έντονη αγγιογέννεση αποτέλεσμα αυξημένης μετανάστευσης και αναπαραγωγής (proliferation) ενδοθηλιακών κυττάρων(59). Το τελευταίο εύρημα στα μοντέλα αυτά συνδέθηκε με αυξημένα επίπεδα VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) στα αιμοπετάλιά τους καθώς και αυξημένα επίπεδα υποδοχέων VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα(59). Ένα ακόμα ενδιαφέρον εύρημα στους αρσενικούς β3-/- μύες ήταν η μη ανάπτυξη των στεφανιαίων αγγείων, κάτι που δεν παρατηρήθηκε στα θηλυκά, όπως επίσης, υπερτροφία του μυοκαρδίου (με συστολική και διαστολική δυσλειτουργία) και αρτηριοσκλήρωση(60). Αν και τα ζώα αυτά αποτελούν πολύ καλά μοντέλα, το μικρό τους μέγεθος περιορίζει τη χρήση τους κυρίως λόγω της ανάγκης για συχνές αιμοληψίες. 39

40 ED MANUSCRIPT Εικόνα 10. Συσχέτιση κλινικών παρατηρήσεων σε μοντέλα μυός με GT με ανθρώπινο φαινότυπο. Συγγενείς (Constitutional) Θρομβοκυτταροπενίες Οι, γενετικού υποβάθρου, διαταραχές στην παραγωγή των αιμοπεταλίων ονομάζονται Constitutional θρομβοκυτταροπενίες. Η διάγνωση της Αυτοάνοσης Θρομβοκυτταροπενίας τίθεται συχνά, λανθασμένα, με αποτέλεσμα τη μη αποτελεσματική θεραπεία των ασθενών οι οποίοι συχνά υπόκεινται ακόμα και σε περιττή σπληνεκτομή(61). Οι γνώσεις μας πάνω σε αυτές τις σπάνιες και υποδιεγνωσμένες ασθένειες έχουν εμπλουτιστεί σημαντικά τα τελευταία είκοσι χρόνια λόγω των τεχνολογικών εξελίξεων και την ταυτοποίηση των μεταλλάξεων, όπως και της βελτίωσης της τεχνικής καλλιέργειας μεγακαρυοκυττάρων από τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα των ασθενών. Η διάγνωση των συγγενών 40

41 θρομβοκυτταροπενιών απαιτεί κυτταρολογική και λειτουργική ανάλυση και πραγματοποιείται σχεδόν αποκλειστικά σε ερευνητικά εργαστήρια. Στις περιπτώσεις που οι μελέτες αυτές κατευθύνουν τη διάγνωση προς μία γνωστή ασθένεια, η επιβεβαίωση έρχεται με τον εντοπισμό των συγκεκριμένων, γνωστών μεταλλάξεων Παράλληλα, οι δυνατότητες επεξεργασίας των γονιδίων του μυ (transgenesis, total/conditional inactivation, introduction of point mutations, random chemical mutagenesis) έχουν συμβάλλει στη δημιουργία ζωικών μοντέλων των διαταραχών και κατ επέκταση στη μελέτη των κλινικών και εργαστηριακών ευρημάτων. Για τις περισσότερες θρομβοκυτταροπενίες, για τις οποίες έχει ταυτοποιηθεί η μετάλλαξη, υπάρχει πια και το αντίστοιχο ζωικό μοντέλο. Σε όλη αυτή την πορεία η μελέτη των ζωικών μοντέλων μυ έχει προσφέρει καινούριες γνώσεις σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο και έχει βελτιώσει την κατανόηση των μηχανισμών της θρομβοκυτταροποίησης. Τα μοντέλα έχουν χρησιμοποιηθεί στη μελέτη και ανάπτυξη φαρμακευτικών προιόντων και φυσικά αποτελούν ένα ανεκτίμητο εργαλείο σε προ-κλινικές δοκιμές νέων φαρμάκων και γονιδιακών θεραπειών. Για ένα πολύ μεγάλο ποσοστό των θρομβοκυταροπενιών το γενετικό υπόβαθρο παραμένει άγνωστο. Με τις τεχνολογικές εξελίξεις και τη διαθεσιμότητα νέων τεχνικών sequencing υψηλής ταχύτητας θα αναγνωριστούν νέα υποψήφια γονίδια βάσει των οποίων θα δημιουργηθούν νέα ζωικά μοντέλα με τη μελέτη των οποίων θα επιβεβαιωθεί και θα αναλυθεί περαιτέρω ο παθολογικός φαινότυπος. Η στοχευμένη πρόκληση μετάλλαξης (targeted mutagenesis) και trangenesis προσφέρουν μία ευρεια γκάμα ζωικών μοντέλων. Total knock-out μύες παράγονται με την απενεργοποίηση του γονιδίου σε ολόκληρο τον οργανισμό. Στους Conditional knock-out μύες επιτυγχάνεται η απενεργοποίηση ενός γονιδίου στον ιστό της σειράς των μεγακαρυοκυττάρων ή σε ένα συγκεκριμένο σημείο της εξέλιξής τους μέσω ειδικής επεξεργασίας και τεχνολογίας. Τέλος, στους knock-in μύες εισάγονται σημειακές μεταλλάξεις ή εισδοχές/ελλείψεις στα σημεία ενδιαφέροντος. Στα μοντέλα knock-in, εφ όσον τα συγκεκριμένα γονίδια και η λειτουργία τους εκφράζονται με τον ίδιο τρόπο σε άνθρωπο και μυ, αναπαράγονται οι ανθρώπινοι φαινότυποι με μεγαλύτερη αξιοπιστία και αποτελούν την καλύτερη προσέγγιση της ανθρώπινης παθολογίας. Πρόσφατες εξελίξεις στη δημιουργία Πολυδύναμων αρχέγονων 41

42 κυττάρων (induced Pluripotent stem cells (ips) δίνουν τη δυνατότητα παραγωγής μεταλλαγμένων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από ινοδοβλάστες του ασθενούς. Η μεταμόσχευση των κυττάρων αυτών σε ανοσοκατεσταλμένους (NOD/SCID) μύες αναμένεται να μιμηθεί ή και να αναπαράξει την ανθρώπινη παθολογία ακόμα και όταν το υπεύθυνο γονίδιο δεν είναι γνωστό. Η τεχνική αυτή, που ήδη έχει εφαρμογή στη διαχείριση αιματολογικών κακοηθειών, θα επιτρέψει τόσο τη, σε βάθος, μελέτη των παθολογικών μηχανισμών των κυττάρων ενδιαφέροντος (μεγακαρυοκύτταρα, αιμοπετάλια) όσο και την αξιολόγηση των θεραπευτικών προσεγγίσεων. Καθώς, όμως, τα ζωικά μοντέλα δεν αναπαράγουν πάντα, πλήρως τον ανθρώπινο φαινότυπο, γίνεται επιτακτική η αντιπαράθεση των ευρημάτων στον άνθρωπο και το μυ τόσο in vitro όσο και in vivo(61). Η μεγακαρυοποίηση ρυθμίζεται από ένα συνδυασμό παραγόντων και λαμβάνει χώρα ακολουθώντας μία αλληλουχία εξελικτικών σταδίων από τα πρόδρομα κύτταρα στα ώριμα μεγακαρυοκύτταρα και την απεπευθέρωση των αιμοπεταλίων. Σε αυτή τη διαδικασία συμμετέχουν κυτταροκίνες και αναπτυξιακοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της θρομβοποιητίνης (TPO) που κατέχει κεντρικό ρόλο, και ένα σύνολο μεταγραφικών παραγόντων (transcription factors). Μεταλλάξεις στα σημεία που είναι υπεύθυνα για τους παράγοντες αυτούς ευθύνονται συχνά για τη θρομβοκυτταροπενία. Στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 1) συνοψίζονται οι διάφορες γνωστές μεταλλάξεις και τα αντίστοιχα μοντέλα και οι φαινότυποι στο μυ. Σε αυτά θα πρέπει να προστεθεί και το πρώτο μοντέλο συγγενούς αμεγακαρυωτικής θρομβοκυτταροπενίας ιχθύος Ζέβρα (Zebrafish) που δημοσιεύτηκε από τους Lin et al μετά από στοχευμένη διάρρηξη του γονιδίου mpl(62). 42

43 Ασθένεια Τρόπος μετάδοσης Ανωμαλίες του κυτταροσκελετού MYH9 διαταραχές σχετικές Bernard Soulier Syndr. -Biallelic -Monoallelic Γονίδιο (Χρωμόσωμα) Συμπτώματα στον άνθρωπο αρ. Αιμοπεταλίων ΑΕ MYH9 (22q12-13) Γιγαντοαιμοπετάλια, inclusions λευκοκυττάρων, νεφροπάθεια, κατταράκτης, απώλεια ακοής -AY -AE GP1BA (17p13) GP1BB (22q11) GP9 (3q21) Γιγαντο-ΑΜΠ (41±34.6) Μεγάλα (87±30.2) ΑΜΠ Wiscot-Aldrich Syndr. X-linked WAS(Xp11) Μικρά ΑΜΠ (61±64.7) Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με τη Φιλαμίνη-Α Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με την Τουμπουλίνη 1 Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με α- Ακτινίνη Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με DIAPH1 Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με PRCASG Βαρειά ανοσοκαταστολή X-linked FLNA (Xq28) Μεγάλα ΑΜΠ (34±12.7) ΑΕ TUBB1 (6p21.3) Γιγαντο-ΑΜΠ (82±44.7) Μοντέλο μυ 1.Ολική διαγραφή 2.tissue specific inactivation 3.Knock-in 1.Total inactivation GP1BA 2.Total inactivation GP1BB 3.Knock-in GP1BA with IL4R 1.Total inactivation 2.Knock-in Y293 Tissue specific inactivation Total inactivation ΑΕ ACTN1 (14q24.1) Μεγάλα ΑΜΠ No mouse model ΑΕ DIAPH1 (5q31) Μεγάλα ΑΜΠ Μεταλλάξεις του TPO-cMPL μηχανισμού (pathway) Ήπια ουδετεροπενία Κόφωση ΑΥ PRKACG (9q21.11) Θρομβοκυτταροπενί α με γιαγντο-αμπ Μειωμένα FLNA επίπεδα Μειωμένη ενεργοποίηση ΑΜΠ Total inactivation No mouse model Φαινότυπος μυ 1. Εμβρυικός θάνατος 2. Ελλατωματικά μεγακαρυοκύτταρα/μακροθρομβοκυτταροπενία 3. Προσομοίωση ανθρώπινου φαινοτύπου 1. Ελλατωματικά προ-αμπ και 2. Μακροθρομβοκυτταροπενία 3. Μερική recovery of the WT phenotype 1. Θρομβοκυτταροπενία φυσιολογικού μεγέθους 2. Αναπαριστά τα περισσότερα συμπτώματα πλήρους έλλειψης WAS Μακροθρομβοκυτταροπενία Αυξημένη clearance ΑΜΠ Μακροθρομβοκυτταροπενία με ελλατωματικό marginal band - Όχι θρομβοκυτταροπενία Φυσιολογικά ΑΜΠ - Συγγενής αμεγακαρυωτική θρομβοκυτταροπενία ΑΥ MPL (1p34) Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ Εξέλιξη σε απλασία μυελού Total inactivation Specific tissue inactivation Σοβαρή θρομβοκυτταροπενία 43

44 Μεταλλάξεις μεταφραστικών παραγόντων GATA-1 related diseases X-linked GATA1 (Xp11) Μεγάλα ΑΜΠ (24±9) Συγγενής θρομβοκυτταροπενία με συνοστέωση κερκίδαςωλένης (CTRUS) Familial διαταρχή ΑΜΠ και προδιάθεση για Οξεία Μυελογενή λευχαιμία Θρομβοκυτταροπενία Paris-Troussau Σύνδρομο Jacobsen Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με GFI1B Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με ETV6 ; THC5 Άλλες μεταλλάξεις Αναιμία ΑΕ HOXA11 (7p15-14) Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ (30) Συνοστέωση κερκίδας-ωλένης ΑΕ RUNX1 (21q22) Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ (103±35) ΑΕ Διαγραφή (11q23- ter) συμπελιλαμβανομέν ου του FLI-1 Κίνδυνος λευχαιμίας και Μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ (49±9) ΑΕ GFI1B (9q34.13) Μεγάλα ΑΜΠ (97±24) Μειωμένος αριθμός α-granules ΑΕ ETV6 (12p13.2) Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ (44-143) Μακροκυττάρωση ερυθρών Προδιάθεση λευχαιμία για Total inactivation Knock-in in the promoter region Total inactivation 1.Total inactivation 2.Conditio nal inactivation (Mx-Cre) 3.Conditio nal inactivation (Pf4-Cre) Total inactivation FLi-1 Knock-in with truncated FLi-1 1.Total inactivation 2.Conditio nal inactivation (Mx-Cre) 3.Conditio nal inactivation (inducible by doxycyclin e) Total inactivation 1.Εμβρυικός θάνατος 2.Σοβαρή θρομβοκυτταροπενία λόγω μειωμένης ωρίμανσης Μεγακαρυοκυττάρων Παθολογικό 1.Εμβρυικός θάνατος 2.Ελλατωματική ωρίμανση Μεγακαρυοκυττάρων και λεμφοκυττάρων 3.Ελλατωματική Μεγακαρυοκυττάρων 1.Εμβρυικός θάνατος 2.Μειωμένη επιβίωση Θρομβοκυτταροπενία Μειωμένη λειτουργικότητα ΑΜΠ 1.Εμβρυικός θάνατος Θάνατος εντός 3 εβδομάδων ωρίμανση Μειωμένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης και ΑΜΠ Εμβρυικός θάνατος Gray platelet syndrome ΑΥ NBEAL2 (3p21.1) Θρομβοκυτταροπενία επιδεινούμενη με Total inactivation Μακροθρομβοκυτταροπενία Έλλειψη α-granules από ΑΜΠ 44

45 Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με ANKRD26/familial θρομβοκυτταροπενία Θρομβοκυτταροπενία με έλλειψη κερκίδας (TAR) Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με CYCS Θρομβοκυτταροπενία σχετιζόμενη με ITGA2B/ITGB3 την ηλικία Ίνωση μυελού Σπληνομεγαλία ΑΕ ANKRD26 (10p2) Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ (43±23) Κίνδυνος λευχαιμίας ή ΜΔΣ ΑΥ RBM8A (1q21.1) Θρομβοκυτταροπενία που ιάται με την ενηλικίωση Φυσιολογικού μεγέθους ΑΜΠ Απλασία Κερκίδας άμφο και άλλες παραμορφώσεις ΑΕ CYCS(7p15.3) Θρομβοκυτταροπενία (108) AE ITG2B/ITGB3 (17q21.31/17q21.32) ΑΕ: Αυτοσωματικό Επικρατές ΑΥ: Αυτοσωματικό Υπολειπόμενο Μακροθρομβοκυτταροπενία MPL: Myeloproliferative leukemia protein Πίνακας 1.(62) Total inactivation Knock-in εκφράζοντ ας ένα μεταλλαγμ ένο Cyt c No mouse model Παχυαρκία, γιγαντισμός λόγω πολυφαγίας Όχι θρομβοκυτταροπενία No mouse model Εμβρυικός ή περιγεννητικός θάνατος - Σύνδρομο Bernard Soulier Στα πλαίσια των constitutional θρομβοκυτταροπενιών ένα από τα πιο γνωστά και μελετημένα σύνδρομα είναι το σύνδρομο Bernard Soulier (BSS). To BSS είναι μία σπάνια κληρονομική διαταραχή της πήξης που χαρακτηρίζεται από υπερμεγέθη αιμοπετάλια, ο συνολικός αριθμός των οποίων είναι χαμηλός (μακρο-θρομβο-κυτταροπενία). Η διαταραχή οφείλεται σε προβληματική έκφραση του συμπλέγματος γλυκοπρωτεινών GPIb-IX-V. Το σύμπλεγμα αυτό είναι ένας εξειδικευμένος υποδοχέας της μεμβράνης των αιμοπεταλίων που έχει σημαντικό ρόλο στην αιμόσταση καθώς συνδέει τα αιμοπετάλια με το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο μέσω του παράγοντα Von Willebrand. Commented [m12]: Σχηματική αναπαράσταση? 45

46 Το σύμπλεγμα GPIb-IX-V αποτελείται από μία υπομονάδα GPIb α και δύο υπομονάδες GPIb β, με τη GPIb β να συνδέεται με τις GPIX και GPV. H GPIb α αποτελεί τη βασική συνδετική υπομονάδα του συμπλέγματος GPIb-IX-V. Η Ν-τελική περιοχή συνδέεται με τον παράγοντα VWF, με υποδοχείς ενδοθηλιακών κυττάρων (P selectin) ή λευκών αιμοσφαιρίων (Integrin αμβ2), και με παράγοντες πήξης (θρομβίνη, παράγοντες ΧΙ και ΧΙΙ, υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνο) σε συγκεκριμένες θέσεις ή overlapping (αλληλοκαλυπτόμενα) σημεία(63). Οι δεσμοί μπορούν να διακοπούν από αντί-gpib α μονοκλωνικά αντισώματα, όπως έχει καταγραφεί με τη χρήση χειμερικών GPIb α (64). Ο ανασυνδυασμένος παράγοντας VIIa (rfviia), ο οποίος μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη διαχείριση αιμορραγικών επεισοδίων τόσο στο BSS όσο και σε άλλες θρομβοκυτταροπενίες συνδέεται με τη σιαλομυκίνη (sialomucin domain), και προωθεί την παραγωγή θρομβίνης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων μέσω του ιστικού παράγοντα. Η GPIb α, επίσης, συνδέεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων με τον μείζονα υποδοχέα κολλαγόνου (major platelet collagen receptor) GPVI. Η ακριβής δράση της GPV δεν έχει ακόμα πλήρως αποσαφηνιστεί, υπάρχουν όμως ενδείξεις πως συμμετέχει στη ρύθμιση της σύνδεσης των αιμοπεταλίων με το κολλαγόνο και/ή ρυθμίζει τη διάδραση μεταξύ της θρομβίνης και της GPVIb α. Το τμήμα του συμπλέγματος GPIb-IX-V που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα διαδρά με διάφορες ενδοκυττάριες ουσίες και επηρεάζει το μέγεθος και το σχήμα των αιμοπεταλίων και, επίσης, λειτουργεί ως μεταφορέας σημάτων (signal transduction). Αρχικά, το GPIb-IX-V διαδρά με την πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού φιλαμίνη-α και έτσι επιδρά στη διαμόρφωση του σχήματος και μεγέθους των αιμοπεταλίων. Επίσης, διαδρά με δομικές πρωτεΐνες όπως η καλμοντουλίνη, η ζ, και η υπομονάδα P85 της φωσφοινοσιτίδης- 3-κινάσης. Το σύμπλεγμα GPIb-IX-V συνδέεται άμεσα με την πρωτεΐνη ΤRAF4 που συμμετέχει στο σύμπλεγμα NOX2. Η σύνδεση της GPIb με το τμήμα Α1 του παράγοντα VonWillebrand ενεργοποιεί το ενδοκυττάριο σήμα που οδηγεί στην ενεργοποίηση της ιντεγρίνης των αιμοπεταλίων αιιιβ3 (GPIIb-IIIa) που συνδέει με το ινοδωγόνο ή με τον VWF και δρομολογεί τη συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων και τη δημιουργία θρόμβου. H GPIb α συνδέεται επίσης με την ιντεγρίνη αμ β2 (CD11b/CD18, Mac- 1) σε ενεγοποιημένα λευκά αιμοσφαίρια. Η σύνδεση αυτή πιθανώς Commented [ΘΑ13]: Citation, check article update for BSS 46

47 προωθεί διαδράσεις μεταξύ αιμοπεταλίων και λευκοκυττάρων σε φλεγμονώδη αντίδραση. Η πληθώρα των πιθανών ρόλων του συμπλεγματος GPIb-IX-V στη ρύθμιση του φυσιολογικού μεγέθους/σχήματος των αιμοπεταλίων, τη συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων και τη δημιουργία θρόμβου, την πήξη, και τις διαδράσεις μεταξύ αιμοπεταλίων-ενδοθηλίου και αιμοπεταλίωνλευκών αιμοσφαιρίων στη φλεγμονή και άλλες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις των αγγείων, δικαιολογεί τη σημασία της έλλειψης ή διαταραχής του GPIb-IX-V. Και στην περίπτωση αυτή, τα ζωικά μοντέλα έχουν παίξει σημαντικό ρόλο τόσο στη μελέτη της φυσιολογίας του συμπλέγματος GPIb-IX-V όσο και των επιπλοκών των διαταραχών του. Η δημιουργία ενός ζωικού μοντέλου του συνδρόμου Bernard-Soulier σε μυ απέδειξε ότι η αιμορραγική διάθεση και η μακροθρομβοκυτταροπενία είναι αποτέλεσμα διαταρχής του συμπλέγματος GPIb-IX-V. Η διαταραχή στο ζωικό μοντέλο αυτό μπορεί να ανατραπεί με την έκφραση transgenic expression ανθρώπινης υπο-μονάδας GPIb α, θέτοντας έτσι τη βάση για in vivo επέμβαση στα μεγακαρυοκυττάρα και τα αιμοπεταλία του μυ(65). Το 2012, οι Kanaij et al χρησιμποίησαν το μοντέλο μυός συνδρόμου Bernard Soulier, με έλλειψη GPIb α για να αξιολογήσουν τη γονιδιακή θεραπεία ως πιθανή θεραπεία του συνδρόμου Bernard-Soulier. Η προσέγγισή τους είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση GPIb α, διόρθωση του χρόνου ροής σε τραύμα της βάσης της ουράς του μυός και μερική ανατροπή της μακροθρομβοκυτταροπενίας(66). Έλλειψη ινωδογόνου Η έλλειψη ινωδογόνου (ανινωδογοναιμία) ορίζεται ως μη ανιχνεύσιμη συγκέντρωση ινωδογόνου στη κυκλοφορία που οδηγεί σε μια πληθώρα αιμορραγικών και θρομβωτικών επιπλοκών. Το ινωδογόνο, πρόδρομη, διαλυτή μορφή του ινώδους, αποτελείται από 3 αλύσους πολυπεπτιδίων (Α, Β, G) και ελέγχεται στον άνθρωπο από 3 γονίδια: FGA, FGB και FGG. Μεταλλάξεις σε κάποιο από τα γονίδια αυτά μπορεί να προκαλλέσει ανινωδογοναιμία αλλά τα περισσότερα περιστατικά έχουν συνδεθεί με μεταλλάξεις του FGA. Η ανινωδογοναιμία είναι σπάνια, επηρρεάζοντας περίπου 1/10n6 και αντιμετωπίζεται με θεραπεία αντικατάστασης. Αν και υπάρχουν μοντέλα ανινωδογοναιμίας στο μυ με 47

48 στοχευμένη disruption του FGA, πρόσφατα, οι Fish et al δημοσίευσαν τη δημιουργία μοντέλου συγγενούς ανινοδωγοναιμίας με αιμορραγικό φαινότυπο σε ιχθύ Ζέβρα (zebrafish) μετά από στοχευμένη μετάλλαξη του γονιδίου FGA(67). Ιχθύς Ζέβρα (Zebrafish) Ο ιχθύς Ζέβρα (Danio rerio) χρησιμοποιείται σαν σπονδυλωτό μοντέλο στην εξελικτική βιολογία (developmental biology) και στην προσομοίωση ανθρωπίνων νοσημάτων (εικόνα 10). Παρόλο που τα μοντέλα μυός αναπαράγουν σαφώς τη διαταραχή, η διερεύνηση των αρχικών αναπτυξιακών σταδίων στο έμβρυο είναι πρακτικά πολύ δύσκολη καθώς το έμβρυο αναπτύσσεται εντός της μήτρας. Ο μεγάλος αριθμός των απογόνων που παράγουν οι ιχθείς και το γεγονός ότι η ανάπτυξη του εμβρύου γίνεται εκτός του σώματος της μητέρας διευκολύνουν την έρευνα. Επίσης, οι παράγοντες πήξης έχουν ανιχνευθεί και μελετηθεί στους ιχθείς ζέβρα, τα γονίδιά τους είναι αναγνωρίσιμα και εργαστηριακές εξετάσεις πήξης έχουν προσαρμοστεί στο μοντέλο αυτό. Commented [ΘΑ14]: Φωτογραφίες από το άρθρο με αιμορραγίες στα ψάρια 48

49 Εικόνα 11. Αιμορραγικός φαινότυπος σε ιχθύ Ζέβρα με έλλειψη ινωδογόνου μετά από στοχευμένη μετάλλαξη του γονιδίου FGA.(67) Ανάπτυξη εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων Επί του παρόντος δεν επιτυγχάνεται ίαση στις διάφορες διαταραχές πήξης και η θεραπεία περιορίζεται σε αγωγή αντικατάστασης των ελαττωματικών πρωτεϊνών. Η θεραπεία, όπως έχει προαναφερθεί, μπορεί να περιορίζεται σε αγωγή κατά περίσταση (σε ένα αιμορραγικό επεισόδιο) ή προφυλακτικά (συστηματική αγωγή για την πρόληψη της αιμορραγίας). Το μέσο ετήσιο κόστος της αγωγής για ασθενείς με ήπια και μέση Αιμορροφιλία Β στις ΗΠΑ ανήλθε το 2017 σε $/ασθενή και σε $ για ασθενείς με βαρειά νόσο. Αν και η προφυλακτική 49

50 αγωγή βελτιώνει την ποιόητα ζωής των ασθενών, το κόστος αυξάνεται κατακόρυφα. Αντίστοιχα, το ετήσιο κόστος για τους ασθενείς με βαρειάς μορφής Αιμορροφιλία Α ήταν κατά μέσο όρο $ στην αγωγή κατά περίσταση και $ σε προφυλακτική αγωγή. Η παγκόσμια αγορά ανασυνδυασμένων παραγόντων πήξης το 2017 πλησίασε τα 8.5 δισεκατομμύρια δολάρια(68). Ο χοίριος FVIII (πράγων που συγκεντρώνεται από χοίριο πλάσμα pdpfviii) όπως το Hyate C, πρωτοχρησιμοποιήθηκε τη δεκαετία του 1950 στη διαχείρηση της συγγενούς Αιμορροφιλίας. Το πλεονέκτημα του pd-pfviii είναι ότι παρουσιάζει ομολογία ως προς τον ανθρώπινο παράγοντα σε αρκετά μεγάλο βαθμό για να έχει αιμοστατική δράση αλλά και η μη απόλυτη ομολογία τον καθιστά δραστικό ακόμα και στην παρουσία αλλοαντισωμάτων έναντι του ανθρώπινου FVIII. Το Obizur (OBI-1) είναι μία μορφή ανασυνδυασμένου χοίριου FVIII στον οποίο έχει αφαιρεθεί το Β domain. Παράγεται με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA σε νεφρικά κύτταρα χάμστερ τα οποία έχεουν αναπτυχθεί σε serum free μέσο. Περιλαμβάνει την ίδια ακολουθία και δομή με τον ανθρώπινο παράγοντα και περιέχει ένα δεσμό 24 αμινοξέων, των αντίστοιχων πρώτων και τελευταίων 12 αμινοξέων του B domain. Παρά την κοντινή ομολογία, η σημαντική απόκλιση που παρατηρείται στην ακολουθία των αμινοξέων των ανοσο-επικρατών επιτοπίων στα Α2 και C2 domains πιθανώς δικαιολογεί την χαμηλού βαθμού αντιδραστικότητα των περισσότερων ανθρώπινων αντι-fviii αντισωμάτων με τον ανασυνδυασμένο χοίριο FVIII. To ΟΒΙ-1 υπόκειται επεξεργασία σε δύο στάδια (διαλυτικά μέσα και νανοφιλτράρισμα) και το προϊόν δεν περιλαμβάνει στοιχεία ζωικής προέλευσης. Σε αντίθεση με το Hyate:C, αυτό το ανασυνδυασμένο προϊόν δεν περιλαμβάνει VWF, έτσι αποκλείοντας τον κίνδυνο της θρομβοκυτταροπενίας. Το OBI-1 κυκλοφορεί σε ποσοστό 98% σαν ετεροδιμερές, συνδέεται με τον ανθρώπινο VWF και ενεργοποιείται από τη Θρομβίνη. Η ιδέα της χρήσης των φυτών σαν πλατφόρμα παραγωγής πρωτεϊνών φαρμακευτικής χρήσης παρουσιάζει μια προοδευτική ανάπτυξη τις τελευτάιες δύο δεκαετίες. Η πρώτη εμπορεύσιμη πρωτεΐνη παραγόμενη από κύτταρα καρότου δημιουργήθηκε από τις Pfizer/Protalix Biotherapeutics και έλαβε έγκριση από τον Αμερικάνικό Οργανισμό Φαρμάκων και Τροφών (FDA) το Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη ήταν η Ταλιγλουκεράση άλφα με δράση κατά της νόσου Gaucher. Τα 50

51 πλεονεκτήματα των φυτικών συστημάτων (plant systems) περιλαμβάνουν αφ ενός χαμηλό κόστος και διαβαθμήσιμη παραγωγή βιομάζας έναντι των συστημάτων ζύμωσης (fermentation systems), αφ ετέρου μεγαλύτερη ασφάλεια έναντι άλλων συστημάτων έκφρασης (expression systems) καθώς τα φυτικά συστήματα δεν παράγουν ενδοτοξίνες, και τέλος η δυνατότητα να πραγματοποιήσουν πολύπλοκες ευκαρυωτικές μετα-μεταφραστικές μετατροπές, όπως η Ν-γλυκοσυλίωση. Αν και οι διαταραχές της πήξης αφορούν ένα μικρό ποσοστό του παγκόσμιου πληθυσμού, το κόστος των συμπυκνωμένων ανασυνδυασμένων παραγόντων αποτελεί ένα πολύ υψηλό βάρος για τους ασθενείς και τα συστήματα υγείας. Η πλειονότητα των ασθενών, το 75% στην περίπτωση της αιμορροφιλίας, δεν έχουν πρόσβαση στην ενδεδειγμένη αγωγή. Η ανάγκη για παραγωγή ικανών ποσοτήτων ανθρώπινων παραγόντων πήξης χαμηλού κόστους, ιδιαιτέρως εκείνων που αφορούν σε σπάνιες διαταραχές θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός κλάδος για τη χρήση των φυτικών συστημάτων καθώς η παραγωγή παραγόντων πήξης δεν συγκαταλέγεται στα προϊόντα επιλογής της φαρμακοβιομηχανίας. Η έκφραση FVIII πλήρους μήκους επετεύχθη για πρώτη φορά από τους Hooker et al. το 1999 σε καπνά. Τα επίπεδα FVIII έφτασαν μέχρι και 0.002% της διαλυτής πρωτεΐνης των φύλλων του φυτού. Η δραστικότητα του FVIII παραγόμενου από φύλλα καπνών σύμφωνα με χρωμογονικές μεθόδους (chromogenic assays) ήταν 14,85 IU/mg διαλυτής πρωτεΐνης φύλλων. Η συνήθης δραστικότητα του FVIII που παράγεται από CHO (Chinese Hamster Ovary) σειρά κυττάρων, σύμφωνα με τους Orlowa et al. είναι 0.5-2IU/ml διαλύματος καλλιέργειας. Επιπλέον των καπνών, FVIII παρήχθη και σε φυτό πατάτας. Το 2014, FVIII domains, παρήχθησαν σε χλωροπλάστες καπνών και βιοεγκαψώθηκαν (bioencapsulated) σε φυτικά κύτταρα για από του στόματος χορήγηση σε αιμορροφιλικούς ασθενείς που έφεραν ανασταλτές. Η per os χορήγηση κυττάρων καπνού που έφεραν FVIII domains, σε ζωικό μοντέλο μυός Αιμορροφιλίας Α με ανασταλτές περιόρισε την παραγωγή ανασταλτών με την προώθηση παραγωγής πληθυσμών ειδικών Τ-regulatory κυττάρων (CD4+, CD25+)(69). Πρόσφατα, τα επίπεδα FVIII που παρήχθη σε χλωροπλάστες μαρουλιού έφθασαν τα 852μg/g λυοφιλοποιημένων φυτικών κυττάρων και η από του στόματος χορήγηση σε μοντέλο μυός αιμορροφιλίας Α περιόρισε την παραγωγή ανασταλτών (Kwon et al., 2018). 51

52 Η μελέτη και κατανόηση των συνδρόμων που εκφράζουν αιμορραγική διάθεση σε συνδυασμό με εντυπωσιακές εξελίξεις σε βιο-τεχνολογικό επίπεδο έχουν φέρει την έρευνα κοντά σε ιστορικές ανακαλύψεις. Οι πρόσφατες προτάσεις νεων θεραπευτικών προσεγγίσεων στην αιμορροφιλία με τη χορήγηση παραγόντων επαυξημένης ημισείας ζωής (Enhanced half life Factors), βιολογικών ουσιών που στοχεύουν πρωτεΐνες που αναστέλουν τη διαδικασία της πήξης (TFPI), καθώς και ένα διειδικό αντίσωμα (bispecific ab) φαίνονται πολλά υποσχόμενα στην κατεύθυνση αυτή. Η πλέον υποσχόμενη προσέγγιση, για την ώρα, παραμένει η γονιδιακή θεραπεία. Τέλος, εναλλακτικές γονιδιακές θεραπείες με στόχευση των αιμοποιητικών βλαστο-κυττάρων αποτελούν ένα καινούριο πεδίο. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η έρευνα πάνω στη γονιδιακή θεραπεία περιορίζεται στις αιμορροφιλίες Α και Β καθώς είναι και οι πιο συχνές διαταραχές. Η χορήγηση εξωγενούς FVIII σε ασθενείς με βαρειάς μορφής αιμορροφιλία Α μειώνει δραστικά τις αιμορραγικές επιπλοκές. Δυστυχώς, σε ένα ποσοστό 30% των ασθενών ο ανασυνδυασμένος παράγοντας προκαλλεί την παραγωγή ανασταλτικών αντισωμάτων (ανασταλτών), από το ανοσοποιητικό του ασθενούς, περιπλέκοντας τη θεραπεία. Επι πλέον, η φτωχή φαρμακοκινητική του θεραπευτικού FVIII, με μικρή βιο-διαθεσιμότητα (bio-availability) σε υποδόρια έγχυσή του και σύντομη ημίσεια ζωή (0.5d), υποχρεώνει τους ασθενείς σε συχνές ενδοφλέβιες εγχύσεις. Οι ασθενείς με ανασταλτές λαμβάνουν ειδικά θεραπευτικά σχήματα με χορήγηση του ανασυνδυασμένου παράγοντα σε υψηλές δόσεις και μεγάλη συχνότητα, ή με παρακαμπτήριους παράγοντες όπως ο rfvii ή συμπυκνωμένο ενεργοποιημένo σύμπλεγμα προθρομβίνης (apcc). Παρά ταύτα, χωρίς πρόσβαση σε προφυλακτική θεραπεία αντικατάστασης, οι ασθενείς αυτοί διατρέχουν υψηλό κίνδυνο αιμορραγικών επεισοδίων(6). Στην προσπάθεια να ξεπεραστούν τα παραπάνω εμπόδια οι Kitazawa et al. δημοσίευσαν τη δημιουργία ενός εξανθρωποιημένου διειδικού αντισώματος (humanized bispecific ab) των παραγόντων FIXa και FX, υπό την ονομασία hbs23, το οποίο τοποθετεί τους δύο αυτούς παράγοντες σε κατάλληλες θέσεις και μιμείται τη δράση του FVIII. Πρωτόκολλο υποδόριας έγχυσης του hbs23 προήγαγε την αιμόσταση σε έλλειψη FVIII, ακόμα με την παρουσία αναταλτών in vitro και έδειξε αντίστοιχα αποτελέσματα σε in vivo δοκιμή σε ζωικά μοντέλα επίκτητης αιμορροφιλίας Α σε πιθήκους(22). 52

53 Το Consizumab είναι ένα εξανθρωποιημένο μονοκλωνικό IgG-αντίσωμα που στοχεύει τον αναστολέα της οδού του ιστικού παράγοντα - Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)(70). O TFPI ρυθμίζει περιοριστικά τη φάση έναρξης της διαδικασίας της πήξης. Εν συντομία, μετά από βλάβη του τοιχώματος του αγγείου, ο Ιστικός παράγοντας (TF) συνδέεται με τον ενεργοποιημένο παράγοντα FVIIa και ενεργοποιεί τους παράγοντες FIX και FX. Ο TFPI συνδέεται στο σύμπλεγμα TF/FVIIa με το τμήμα, τύπου Kunitz-1, του αναστολέα πρωτεάσης (KPI-1) και στον FXa με το τμήμα KPI-2 ρυθμίζοντας έτσι την έναρξη της διαδικασίας πήξης. Το Consizumab στοχεύει απ ευθείας το τμήμα KPI-2 του TFPI διακόπτοντας έτσι τη σύνδεσή του στον FXa. Καθώς η σύνδεση με τον FXa αποτελεί το βασικό βήμα της ανασταλτικής δράσης του TFPI επί του συμπλέγματος TF/FVIIa, το consizumab αποτρέπει την αναστολή της δράσης τόσο του συμπλέγματος TF/FVIIa όσο και του FXa. Έτσι, επιτυγχάνεται η παραγωγή θρομβίνης σε δείγματα αίματος ασθενών με αιμορροφιλία (με ή χωρίς ανασταλτές) in vitro και μειώνεται ο χρόνος ροής σε ζωικό μοντέλο αιμορροφιλίας σε κόνικλο μετά από ενδοφλέβια ή υποδόρια έγχυση(23). Στη γονιδιακή θεραπεία, εισάγεται στον οργανισμό του ασθενούς ένα επεξεργασμένο, λειτουργικό αντίγραφο του ελλατωματικού ή απόντος γονιδίου που προκαλλεί τη νόσο. Η τεχνική αυτή αποδεικνύεται ιδιαιτέρως αποτελεσματική στη θεραπεία μονο-γονιδιακών ασθενειών όπως η αιμορροφιλία. Στην πράξη, το αρχικό εμπόδιο, που ήταν ο τρόπος εισαγωγής του ιικού φορέα στους ιστούς και τα κύτταρα επιλογής, παρακάμφθηκε με τη χρήση γενετικών οχημάτων και την αξιοποίηση της φυσικής τους ιδιότητας να εισάγουν γενετικό υλικό στους ιστούς που προσβάλλουν. Οι ιοί αυτοί περιέχουν ελάχιστες ακολουθίες (viral sequences) σε σύγκριση με τους wild-type, και τα παθογόνα, αναπαραγωγικά και δομικά γονίδια έχουν αντικατασταθει από το θεραπευτικό γενετικό υλικό. Με την έρευνα, η χρήση του Αδενο-ιού adeno-associated-virus (AAV) για in vivo γονιδιακή μεταφορά σε κύτταρα του ήπατος έχει δείξει τα καλύτερα αποτελέσματα σε αρκετές προ-κλινικές και κλινικές μελέτες. Δύο ξεχωριστές κλινικές δοκιμές, φάσεων Ι/ΙΙ, γονιδιακής θεραπείας της αιμορροφιλίας Α με χρήση ΑΑV φορέα ιού, έδειξαν σταθερά επίπεδα FVIII μετά από μία μοναδική έγχυση φορέα ιού, καταδυκνύοντας ότι η Commented [m15]: Reference: administration of rfvii to consizumab dosed monkeys is safe Commented [m16]: Αρθρο gene therapy for hemophiliawhat does the future hold ανάπτυξη. 53

54 γονιδιακή θεραπεία αποτελεί την πιο αποτελεσματική ερευνητική θεραπεία για ενήλικες ασθενείς αιμορροφιλίας Α. Στην αιμορροφιλία Β, αν και παράγωγα FIX επαυξημένης ημισείας ζωής έχουν προσφέρει μία αισθητή βελτίωση στην ποιότητα ζωής των ασθενών, πολλάπλές κλινικές δοκιμές, φάσης Ι/ΙΙ, γονιδιακής θεραπείας με χρήση φορέα ιού AAV παρουσιάζουν σταθερά επίπεδα FIX στο πλάσμα των ασθενών μετά από μία μοναδική έγχυση βιολογικού υλικού. Οι πρώτες δύο κλινικές δοκιμές, σταδίου ΙΙ, γονιδιακής θεραπείας με χρήση φορέα ιού AAV σε ανθρώπους με βαρειάς μορφής αιμορροφιλία Β ήταν ασφαλείς και ολοκληρώθηκαν επιτυχώς αφού είχαν πρώτα εγκριθεί, βασισμένες στα αποτελέσματα μελετών πάνω σε ζωικά μοντέλα περιλαμβανομένων των σκύλων με αιμοροφιλία Β (71). Οι τελικές δοσολογίες του raav στις οποίες κατέληξαν ήταν βασισμένες στα δεδομένα που συλλέχθηκαν από τις έρευνες σε αιμοροφιλικούς σκύλους(72). Επιλέχθηκαν ασθενείς που έφεραν missense μετάλλαξη, και όπως και στους σκύλους όπου έγιναν οι δοκιμές, έτσι και σε αυτούς δεν προέκυψαν ανασταλτές ή κάποια άλλη επιπλοκή(73). Με δεδομένη τη σταθερότητα που παρουσιάζουν ασθενείς σε συστηματική ιατρική παρακολούθηση έξι χρόνια μετά την έγχυση, η γονιδιακή θεραπεία για την αιμορρφιλία Β φαίνεται πως, εφ όσον εγκριθεί η χρήση της από τoν Αμερικανικό Οργανισμό Φαρμάκων και Τροφών (FDA), θα αποτελεί σύντομα επιλογή για τους ασθενείς. Αν και τα δεδομένα για τη γονιδιακή θεραπεία της αιμορροφιλίας είναι ιδιαιτέρως ενθαρυντικά, η χρήση της στη θεραπεία του γενικού πληθυσμού των αιμορροφιλικών θα πρέπει να γίνει με μεγάλη προσοχή καθώς ακόμα δεν είναι σαφές πόσο δραστική θα είναι σε μικρά παιδιά όσον αφορά στη δημιουργία ανασταλτών και την πιθανότητα σταδιακής μείωσης της παραγωγής παραγόντων στην πορεία της ζωής τους λόγω της αραίωσης των ηπατοκυττάρων που έχουν «προσβληθεί» από τον AAV κατά την ανάπτυξη του οργάνου. Η αξιοποίηση των φορέων ιών Lenti ενδεχομένως να προσφέρει ένα εναλλακτικό μέσο για χρήση σε παιδιά. Μένει ακόμα να αποδειχθεί κατά πόσον τα αποτελέσματα που έχουν καταγραφεί στα αντίστοιχα ζωικά μοντέλα θα μεταφραστούν και σε παιδιτρικούς και ενήλικες ασθενείς που φέρουν μεταλλάξεις υψηλού κινδυνου για παραγωγή ανασταλτών,έχουν ιστορικό ανασταλτών, ή παρουσιάζουν ανασταλτές στη φάση της θεραπείας. Γίνεται κατανοητό ότι παράλληλα με αυτές τις μελέτες, θα πρέπει να συνεχιστεί η 54

55 προσπάθεια για παραγωγή βελτιωμένων παραγόντων πήξης και παρακαμπτήριων ουσιών. Σε κάθε περίπτωση, με τις διαφαινόμενες εξελίξεις που προκύπτουν από την έρευνα, η γονιδιακή θεραπεία με χρήση φορέα ιού AAV πιθανώς να αντικαταστήσει τη θεραπεία με χρήση υποκατάστατων των παραγόντων προσφέροντας, δυνητικά, οριστική ίαση. Όπως προαναφέρθηκε, τα δεδομένα από τις κλινικές μελέτες Ι/ΙΙ, γονιδιακής θεραπείας με χρήση AAV είναι πολύ ενθαρρυντικά. Όμως, ασθενείς που πάσχουν από σοβαρές ηπατοπάθειες, έχουν ήδη αντισώματα κατά του AAV ή έχουν ιστορικό FVIII ανασταλτών αποκλείονται από το πρωτόκολλο. Εναλλακτικά, η στόχευση στην έκφραση των FVIII και FIX και η αποθήκευσή τους στα αιμοπετάλια είναι μια υποσχόμενη στρατηγική για τη γονιδιακή θεραπεία της αιμορροφιλίας με προοπτική όχι μόνο τη βελτίωση της αιμόστασης αλλά και την ανοσο-ανοχή (immune tolerance). Καθώς τα αιμοπετάλια ρέουν άφθονα στην κυκλοφορία, έχουν τη δυνατότητα αποθήκευσης και μεταφοράς και συμμετέχουν ουσιωδώς στην αιμόσταση και την ανοσία, θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα κύτταρο-στόχο για γονιδιακή θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι εκτοπική έκφραση του FVIII στα αιμοπετάλια (εικόνα 11), υπό τον έλεγχο εξειδικευμένου προαγωγού αιμοπεταλίων (platelet promoter) έχει ως αποτέλεσμα την αποθήκευση FVIII σε συνδυασμό με την πρωτεΐνη- μεταφορέα von Willebrand (VWF) στα α-κοκκία (αgranules) και τη διόρθωση του φαινοτύπου στην αιμορροφιλία Α. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η αποθήκευση και λίμναση του FVIII στα αιμοπετάλια αποκαθιστά αποτελεσματικά την αιμόσταση ακόμα και σε παρουσία ανασταλτών(74). 55

56 Εικόνα 12. Σχηματικό διάγραμμα γονιδιακής θεραπείας της αιμορροφιλίας Α με στόχευση στα Αιμοπετάλια.(74) Σε ένα κλινικό σενάριο, αιμοποιητικά βλαστο-κύτταρα από το περιφερικό αίμα ή το ομφαλοπλακουντιακό αίμα του ασθενούς θα συλλέγονται και θα υπόκεινται επεξεργασία ex vivo με σκοπό την εισαγωγή ενός διορθωμένου FVIII ή FIX γονιδίου μέσω ενός προαγωγού εξειδικευμένου στα αιμοπετάλια (platelet specific promoter). Ακολούθως, αυτά θα μεταμοσχεύονται πίσω στον ασθενή (αυτόλογη μεταμόσχευση). Αυτή θα μπορούσε να είναι μια στρατηγική για τη θεραπεία της αιμορροφιλίας σε ασθενείς με ανασταλτές, καθώς επίσης, και σε μη αιμορροφιλικούς ασθενείς με επίκτητα ανασταλτικά αντισώματα που δυνητικά μπορεί να αντιμετωπίσουν επικίνδυνα αιμορραγικά επεισόδια η διαχείριση των οποίων ενέχει σημαντικές δυσκολίες με τα τρέχοντα θεραπευτικά σχήματα. Ένας προβληματισμός που προκύπτει σε σχέση με τη γονιδιακή θεραπεία είναι η πιθανότητα ανοσολογικής αντίδρασης στο διαγονιδιακό προιόν ή/και σε πρωτεΐνες του φορέα ιού. Οι ανοσολογικές αντιδράσεις μπορεί να περιλαμβάνουν φαγοκυττάρωση των επεξεργασμένων κυττάρων ή χημική αντίδραση έναντι των νέο-πρωτεινών και αδρανοποίησή τους. Μια επιπλέον ανησυχία επιφέρει η πιθανή τοξικότητα (genotoxicity) με πρόκληση τοπικής μετάλλαξης και ενδεχόμενη ογκογέννεση. Commented [m17]: Πως γίνεται να διαρκεί αφού τα αιμοπετάλια έχουν σύντομο χ ρονο ζωής? Commented [m18]: Αν απτυξη πάνω στις επιπλοκές 56

57 Αντιμετώπιση αιμορραγικών διαταραχών σε ζώα Ο August Krogh, Δανός καθηγητής στο τμήμα Ζωοφυσιολογίας της Κοπεγχάγης, κάτοχος βραβείου Νομπέλ Ιατρικής και Φυσιολογίας, σε άρθρο του στο περιοδικό Science το 1929, διαπιστώνει την προοπτική της συμβολής των ζώων, που παρουσιάζουν ασθένειες παρόμοιες με τον άνθρωπο, ως μοντέλα στη μελέτη και κατανόησή των ανθρώπινων ασθενειών. Αργότερα, η αρχική διαπίστωση συνοψίστηκε σε αυτό που έχει μείνει ως η αρχή του Krogh, μία από τις 4 αρχές της φυσιολογίας: «Για ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών φαινομένων θα υπάρχει ένα η και περισσότερα ζώα επιλογής τα οποία θα είναι κατάλληλα για να μελετηθούν». Τριάντα χρόνια μετά το όραμα αυτό πραγματοποιήθηκε όταν διενεργήθηκαν κλινικές δοκιμές σε δεσποζόμενους σκύλους που έπασχαν από κάποιας μορφής καρκίνου, και τώρα, περίπου 90 χρόνια μετά, οι κλινικές μελέτες σε κατοικίδια ζώα (σκύλους και γάτες) αποτελούν σημαντικό σκέλος της έρευνας και ανάπτυξης αντικαρκινικών θεραπευτικών ουσιών. Η πολύτιμη εμπειρία που έχει προκύψει από τη μελέτη των καρκινοπαθών σκύλων έχει εμπνεύσει και άλλους κλάδους της έρευνας σε τομείς όπως η αναγεννητική ιατρική (regenerative medicine) και η μηχανική ιστών (tissue engineering). Με την προσέγγιση αυτή η χρήση νέων φαρμάκων, πρωτότυπων ιατρικών συσκευών, βιο-υλικών, και η εφαρμογή νέων ιατρικών διαδικασιών γίνεται πιο αποτελεσματική και άμμεση με τελικούς αποδέκτες τόσο τους ανθρώπους όσο και τους κτηνιατρικούς ασθενείς. Η πρωτοβουλία ενιαίας υγείας (One Health initiative) αναγνωρίζει την άρρηκτα συνδεδεμένη υγεία των ανθρώπων, οικόσιτων ζώων και του περιβάλλοντος. Όπως του ανθρώπου και του μυ, έτσι και τα γονιδιώματα του αλόγου, του σκύλου και της γάτας έχουν ταυτοποιηθεί, προσφέροντας ένα εξαιρετικά χρήσιμο εργαλείο στη μελέτη γενετικών προδιαθέσεων και μοτίβων γενετικής έκφρασης σε ασθένειες που προκύπτουν τυχαία σε αυτά τα είδη. Επίσης, το προσδόκιμο ζωής στα είδη αυτά, όπως και στον άνθρωπο, παρουσιάζει ανοδική πορεία και πολλά ζώα πια λαμβάνουν μακροχρόνιες θεραπείες για χρόνιες ασθένειες. Οι ασθένειες που προκύπτουν με φυσικό τρόπο (και όχι στο εργαστήριο), πιθανώς να αντικατοπτρίζουν καλύτερα τη γενετική, περιβαλλοντική, και φυσιολογική πολυπλοκότητα του ανθρώπινου πληθυσμόυ. Πλέον, κτηνιατρικά Πανεπιστήμια αλλά και κάποια μεγάλα 57

58 κτηνιατρικά κέντρα μπορούν να ακολουθήσουν και να υποστηρίξουν βιοιατρική έρευνα έχοντας βελτιώσει το επίπεδό τους κατακόρυφα και έχοντας φτάσει τις απαιτήσεις της διεθνούς ερευνητικής κοινότητας. Τεχνολογία αιχμής, όπως η ανοσοιστοχημεία, μοριακά διαγνωστικά, αξονική-μαγνητική τομογραφία, PET scan, ηχο-καρδιογραφία κ.α., αποτελούν πια εργαλεία καθημερινής χρήσης στην περίθαλψη των κτηνιατρικών ασθενών. Επίσης, στις κτηνιατρικές υπηρεσίες συμπεριλαμβάνονται πλέον θεραπευτικές μέθοδοι υψηλού επιπέδου, όπως μεταμοσχεύσεις, μεταγγίσεις, μικρο-χειρουργική και χημειοθεραπεία. Tέλος, θα πρέπει να αναφερθεί και η σημαντική εξέλιξη που έφερε τα τελευτάια 20 χρόνια η ακαδημαϊκή κτηνιατρική κοινότητα με τη δημιουργία προγραμμάτων ειδικοτήτων τα οποία έχουν οργανωθεί χρησιμοποιώντας ως πρότυπο τα αντίστοιχα των ιατρικών σχολών. Δεν υπαρχει αμφιβολία, ότι με τη γενετική επεξεργασία των ζώων εργαστηρίου, τις τεχνολογικές εξελίξεις και τη δυνατότητα που δίνεται στους ερευνητές να προκαλλέσουν κάποια ασθένεια με προβλέψιμο τρόπο έχουν δημιουργηθεί πολύ αξιόλογα πεδία για τη μελέτη των ασθενειών και της αντιμετώπισής τους. Ταυτόχρονα όμως, οι προκλινικές μελέτες σε μύες έχουν συχνά αποδειχθεί περιορισμένης προγνωστικής αξίας καθώς τα αποτελέσματαά τους διέφεραν σημαντικά από τα αντίστοιχα στους ανθρώπους. Η σχετικότητα μεταξύ των προκλινικών μοντέλων τρωκτικών και των αποτελεσμάτων των κλινικών δοκιμών αμφιβητείται και πιθανώς συμβάλλει στο μεγάλο ποσοστό των αποτυχημένων κλινικών δοκιμών στους ανθρώπους. Η συνεργασία μεταξύ ερευνητών διαφορετικών ειδικοτήτων (βασική, μεταφραστική, τεχνολογική, κλινική έρευνα) έχει δρομολογήσει μεταφραστικές μελέτες με σκοπό να αξιοποιηθούν οι φυσικά προερχόμενες ασθένειες σε οικόσιτα ζώα με σκοπό την επιτάχυνση και βελτίωση των νέων φαρμάκων και μέσων. Οι φυσικά προερχόμενες ασθένειες σε οικόσιτα ζώα αντικατοπτρίζουν, σε μεγάλο βαθμό, την πληθώρα των πολύπλοκων γενετικών, περιβαλλοντικών, και φυσιολογικών παραγόντων που επηρρεάζουν αντίσοιχα τους ανθρώπινους ασθενείς. Παράλληλα, οι ιδιοκτήτες ζώων πια επιζητούν υψηλού επιπέδου κτηνιατρικές υπηρεσίες και συχνά συγκαταθέτουν για τη συμμετοχή των ασθενών ζώων τους σε πολύπλοκα, μακροχρόνια πρωτόκολλα. Έτσι, τα οικόσιτα ζώα δυνητικά μπορούν να αξιοποιηθούν ως σχετικά μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών και να αποτελέσουν το 58

59 σύνδεσμο μεταξύ βασικής και προκλινικής έρευνας και κλινικών δοκιμών σε ανθρώπους με ένα αποτέλεσμα αμφίδρομης αξίας. Περιστατικό αιμορροφιλίας Α σε οικόσιτο σκύλο Σε συνέχεια των παραπάνω, αξίζει να γίνει αναφορά σε ένα περιστατικό αιμορροφιλίας Α σε οικόσιτο σκύλο στην Αθήνα το 2011, και στην αντιμετώπισή του μέσα από την ένταξή του σε διεθνές ερευνητικό πρόγραμμα. Σκύλος φυλής Stafforshire Bull terrier, αρσενικός, ηλικίας 8 εβδομάδων προσκομίστηκε με ιστορικό παραμόρφωσης του κρανίου και κατάπτωσης μίας εβδομάδας (εικόνα 13). Εικόνα 13. Ο σκύλος σε ηλικία 6 εβδομάδων 59

60 Εικόνα 14. Ο σκύλος κατά την προσκόμιση σε ηλικία 8 εβδομάδων Στο ιστορικό αναφέρθηκε παρατεταμένη αιμορραγία από τον ομφάλιο λώρο κατά την πρώτη εβδομάδα της ζωής του, κάτι που στο θηλυκό εκ της τοκετο-ομάδας δεν παρατηρήθηκε. Κατά την κλινική εξέταση διαπιστώθηκε υποδόριο, κλυδάζον μόρφωμα στην περιοχή των βραγματικών και μετωπιαίων λοβών. Στο σημείο φλεβοκέντησης για τη λήψη δείγματος αίματος (αριστερή σφαγίτιδα) παρατηρήθηκε έντονη αιμορραγία και δημιουργήθηκε εκτεταμένο αιμάτωμα. Στο σημείο παρακέντησης του μορφώματος προκλήθηκε, επίσης, έντονη αιμορραγία. Στη γενική αίματος διαπιστώθηκε αναγεννητική αναιμία, λευκοκυττάρωση και θρομβοκυτταροπενία. Ο έλεγχος πηκτικότητας του αίματος έδειξε φυσιολογικό χρόνο προθρομβίνης (PT) και παρατεταμένο χρόνο μερικής ενεργοποιημένης θρομβοπλαστίνης (APTt). Το αποτέλεσμα της κυτταρολογικής εξέτασης του επιχρίσματος του υλικού από την παρακέντηση του μορφώματος ήταν συμβατό με αιμάτωμα. Παράλληλα, διενεργήθηκε μέτρηση δραστικότητας των παραγόντων 60

61 VIII, ΙΧ και VonWillebrand σε ειδικό κτηνιατρικό εργαστήριο στην Ιταλία όπου και εστάλησαν δείγματα κατεψυγμένου πλάσματος (Citrated plasma) με τα αποτελέσματα να είναι 1%, 52% (50-150%) και 259% (70-180%) αντίστοιχα. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά και σε συνδυασμό με το ιστορικό και τη συμπτωματολογία του σκύλου τέθηκε η διάγνωση της αιμορροφιλίας Α και αντιμετωπίστηκε άμεσα με μετάγγιση φρέσκου ολικού αίματος και αργότερα και φρέσκου κατεψυγμένου πλάσματος. Ηλικία Αιμορραγικά επεισόδια/αιτιολογία και αντιμετώπιση προ γονιδιακής θεραπείας Αιμορραγικό επεισόδιο Αυτόματη/Τραυματικής αιτιολογίας Αντιμετώπιση 8 εβδ Αιμάτωμα κεφαλής Αυτόματη Μετάγγιση Φ.Ο.Α. 10 εβδ Αιμάτωμα μηρού Αυτόματη Μετάγγιση Φ.Κ.Π 23 εβδ Αιμάτωμα μηρού/επίσταξη/αναιμία 11 μην Μέλαινα μετά από χορήγηση κορτικοστεροειδών για αντιμετώπιση αλλεργικής αντίδρασης 11,5 μην Αιμάτωμα σε πρόσθιο άκρο 12-14μην Επαναλαμβανόμενα αιματώματα στο μηρό 17 μην Αιμορραγία στο σημείο συρραφής (Conjuctival flap) για αντιμετώπιση έλκους κερατοειδούς Αυτόματη Αυτόματη Αυτόματη Αυτόματη Τραυματική Μετάγγιση Φ.Ο.Α. Μετάγγιση Φ.Ο.Α. Μετάγγιση Φ.Κ.Π. Μετάγγιση Φ.Ο.Α. Μετάγγιση Φ.Κ.Π 19 μην Αίμαρθρο γόνατος Αυτόματη Μετάγγιση Φ.Κ.Π 20 μην Επίσταξη και αιμορραγία βλενογόνων Αυτόματη Μετάγγιση Φ.Κ.Π 61

62 21 μην Επίσταξη και αιμορραγία βλενογόνων Αυτόματη Μετάγγιση Φ.Κ.Π 23 μην Αιμάτωμα στο μηρό Αυτόματη Μετάγγιση Φ.Ο.Α. 24 μην Αιμάτωμα μετά την τοποθέτηση microchip Τραυματική Καμμία 25 μην Αιμάτωμα στο οπίσθιο άκρο Αυτόματη Καμμία Φ.Κ.Π: Φρέσκο Κατεψυγμένο Πλάσμα Φ.Ο.Α: Φρέσκο Ολικό Αίμα Πίνακας 2. Αιμορραγικά επεισόδια/αιτιολογία και αντιμετώπιση προ γονιδιακής θεραπείας. Μετά από προσωπική επικοινωνία με την καθηγήτρια εσωτερικής παθολογίας της κτηνιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Pennsylvania State University στις ΗΠΑ, Mary Beth Callan, ο σκύλος εντάχθηκε σε ερευνητικό πρόγραμμα πάνω στη γονιδιακή θεραπεία για την αιμορροφιλία Α και Β με τη συνεργασία της κτηνιατρικής και της ιατρικής σχολής και του παιδιατρικού νοσοκομείου της Pennsylvania. Ο σκύλος ταξίδεψε στις ΗΠΑ και αποτέλεσε έναν εκ των δύο οικόσιτων (και όχι ζωικών μοντέλων) αιμορροφιλικών σκύλων που έλαβαν γονιδιακή θεραπεία παγκοσμίως. Η μελέτη είχε την έγκριση της επιτροπής για τη χρήση και περίθαλψη των ιδρυματοποιημένων ζώων (Institutional Animal Care and Use Committee) της Κτηνιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου της Pennsylvania και τoυ Παιδιατρικού Νοσοκομείου της Philadelphia (Children s Hospital of Philadelphia). Μετά τη γραπτή συγκατάθεση των ιδιοκτητών, και την επιβεβαίωση των εργαστηριακών ευρημάτων, ο σκύλος εντάχθηκε στο πρωτόκολλο ερευνητικής γονιδιακής θεραπείας για την αιμορροφιλία Α. Η μελέτη δημοσιεύτηκε το 2016 στο περιοδικό PLOS ONE από τους Callan MB et al. υπό τον τίτλο: Successful Phenotype Improvement Following Gene Therapy for Severe Hemophilia A in Two Privately Owned Dogs. 62

63 H χωρητικότητα των AAV φορέων (4,5Kb) για την έκφραση του cfviii- BDD (canine FVIII- B Domain Deleted) μεμονωμένα, χωρίς προάγοντα, ακολουθίες ιντρονίων και σταθεροποιητικούς παράγοντες, είναι περιορισμένη. Με σκοπό να παρακαμφθει η παράμετρος αυτή, χρησιμοποιήθηκαν 2 ξεχωριστοί φορείς, από ένας για την έκφραση της ελαφριάς αλύσου (Light Chain LC) και της βαρειάς αλύσου (Heavy Chain HC) αντίστοιχα. Και τα δύο transgenes ελέγχονταν από έναν προάγοντα εξειδικευμένο στα ηπατοκύτταρα (Hepatocyte-specific promoter) και ένα προάγοντα/ενισχυτή γονιδίου σφαιρίνης συνδεδεμένο με θυροξίνη (thyroxine-binding globulin gene promoter/enhancer)(75). Οι ανασυνδυασμένοι AAV φορείς παρήχθησαν με βάση το πρωτόκολλο τριπλής μεταμόσχευσης (transfection), χρησιμοποιώντας πλασμίδια που εκφράζουν cfviii-bdd σε ξεχωριστούς φορείς, ένα δεύτερο πλασμίδιο που παρείχε δράσεις-βοηθητικές στον αδενοιό, και ένα τρίτο πλασμίδιο που περιείχε το AAV2 rep γονίδιο και τα AAV8 γονίδια. Οι φορείς καθάρθηκαν (purification) με επαναλαμβανόμενη φυγοκέντρηση κλμακούμενης έντασης (repeated cesium chloride density gradient centrifugation). Για τη διερεύνηση της παρουσίας εξουδετερωτικών αντισωμάτων (neutralizing antibodies) έναντι των πρωτεϊνών του περιβλημματος του AAV8 στους υποψήφιους λήπτες, ελήφθησαν δείγματα ορού προ- και μετά- θεραπείας. Χορηγήθηκαν 2.5x10 13 vg/kg AAV8-cFVIII-BDD μέσω της σαφηνής φλέβας με συνολικό όγκο 10ml/kg σωματικού βάρους. Η ανασυνδυασμένη cfviii-bdd πρωτεΐνη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ίδια που είχε δοκιμαστεί με ασφάλεια και εξαιρετικά αποτελέσματα σε ζωικά μοντέλα σκύλων με αιμορροφιλία Α. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη χορηγήθηκε σε δόσεις των 50IU/kg ακριβώς πριν την έγχυση του φορέα. Ο σκύλος μετά τη χορήγηση, νοσηλεύτηκε για δύο ημέρες υπό παρακολούθηση. Τόσο προ-έγχυσης όσο και σε τακτά χρονικά διαστήματα πριν, κατά τη διάρκεια της νοσηλείας αλλά και μετά, πραγματοποιήθηκαν πλήρεις κλινικές και ενδελεχείς εργαστηριακές εξετάσεις. Μοριακός χαρακτηρισμός της αιμορροφιλίας Α 63

64 Η σύγκριση των ακολουθιών DNA του συνόλου της περιοχής κωδικοποίησης (coding region), και των ορίων μεταξύ ιντρονίων-εξονίων του γονιδίου F8 των δύο σκύλων, με τη γνωστή γονιδιακή ακολουθία του φυσιολογικού σκύλου αποκάλυψε την αντικατάσταση ενός μοναδικού νουκλεοτιδίου στο εξόνιο 2, 185C>T, με αποτέλεσμα την αντικατάσταση της θρεονίνης 62 από μεθιονίνη (Thr62Met) στο σκύλο 1. Στο σκύλο 2 (το περιστατικό που παραπέμφθηκε από το γράφοντα) δεν εντοπίστηκε κάποια μετάλλαξη στο γονίδιο F8, συμπεριλαμβανομένης της αναστροφής του ιντρονίου 22. Παγκοσμίως έχουν εντοπιστεί και καταγραφεί περισσότερες από μεταλλάξεις του F8, με την αντιστροφή του ιντρονίου 22,όπως έχει προαναφeρθεί, να είναι η συχνότερη σε ασθενείς με βαρειάς μορφής αιμορροφιλία Α. Οι τεχνολογικές εξελίξεις αναμένεται να αποκαλύψουν τις μεταλλάξεις στους ασθενείς εκείνους (πρίπου 4%) στους οποίους δεν εντοπίζεται κάποιο μοριακό ελλάτωμα στο γονίδιο F8(76). Λόγω της προηγούμενης έκθεσής τους σε προιόντα πλάσματος, οι σκύλοι ελέγχθηκαν, προ έγχυσης του AAV, για την παρουσία ουδετεροποιητικών και μη-ουδετεροποιητικών αντισωμάτων (neutralizing /non-neutralizing antibodies) στον cfviii και το αποτέλεσμα ήταν αρνητικό. Οι σκύλοι δεν είχαν ανιχνευσιμο cfviii- BDD σε δείγματα αίματος που λήφθησαν προ θεραπείας. Επίσης, μελέτες έχουν δείξει την επίδραση της προηγούμενης ανοσολογικής αντίδρασης έναντι συγκεκριμένου φορέα ιού στην αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της in vivo γονιδιακής θεραπείας και προτείνουν τη διερεύνησή τους στα υποψήφια υποκείμενα για γονιδιακή θεραπεία, προ έγχυσης. Έτσι, αν και βρέθηκαν πολύ χαμηλοί τίτλοι ουδετεροποιητικών αντισωμάτων έναντι του περιβλήματος του ιού AAV8 (τίτλος: 1/1-1/3) οι σκύλοι κρίθηκαν κατάλληλοι για ένταξη στο πρωτόκολλο καθώς κριτήριο αποκλεισμού αποτελούν τίτλοι άνω του 1/10 (77). Μετά τη χορήγηση του φορέα ιού δεν παρατηρήθηκαν παρενέργειες κατά τη διάρκεια των δύο ημερών που διήρκησε η νοσηλεία του. Επίσης, καμμία κλινική επιπλοκή δεν παρατηρήθηκε σε διάστημα 24 μηνών μετά τη θεραπεία. Τα ηπατικά ένζυμα (ALT, ALKP, AST και GGT) παρέμειναν εντός φυσιολογικών ορίων μετά τη γονιδιακή θεραπεία με εξαίρεση μία ήπια αύξηση στην παράμετρο ALT (215 U/L, φ.τ ) που παρατηρήθηκε μετά από διάστημα 18 μηνών, η οποία και 64

65 υποχωρήσε σε 58U/L σε επανεξέταση τον 22 ο μήνα και χωρίς κάποιο κλινικό σύμπτωμα. Μετά την έγχυση του AAV ο σκύλος έδειξε έντονη και παραμένουσα ανοσολογική αντίδραση έναντι του περιβλήμματος του φορέα ιού με αυξημένο τίτλο αντισωμάτων έναντι του περιβλήμματος του AAV (όπως φαίνεται και στο παρακάτω διάγραμμα (εικόνα 12). Εικόνα 15. Ανοσολογική αντίδραση στο περίβλημα του AAV8 σε σκύλους που πάσχουν από Αιμορροφιλλία Α προ- και μετά- ενδο-αγγειακή έγχυση AAV8- cfviii-bdd. Τα επίπεδα του cfviii-bdd παρέμειναν σταθερά στο 1% χωρίς να εντοπιστούν ανασταλτές έναντι του cfviii σε μετρήσεις 24 μήνες μετά τη θεραπεία. Ο σκύλος δεν παρουσίασε επεισόδια αυτόματης αιμορραγίας και δεν χρειάστηκε να λάβει αγωγή με παράγωγα αίματος ή cfviii πρωτεΐνης έκτοτε, ενώ τα καταγεγραμμένα επεισόδια προ αγωγής ήταν 13 σε διάστημα 25 μηνών. Αν και μικρή, η αύξηση στη δραστικότητα του FVIII ήταν αρκετή για τη σαφή βελτίωση του φαινοτύπου στο σκύλο. Καθώς και οι δύο σκύλοι ζούσαν σε σπίτι με τους ιδιοκτήτες τους και άλλα ζώα αντιμετώπιζαν περισσότερους κινδύνους για έκθεση σε τραύμα ή και άλλου είδους αιμοστατικές προκλήσεις από ότι οι σκύλοι που διαβιούν σε ερευνητικά κεντρα και σε συνθήκες ιδιάιτερης προστασίας. Έτσι, ο σκύλος είχε παρουσιάσει 12 αιμορραγικά επεισόδια προ της 65

66 υποβολής του σε γονιδιακή θεραπεία τα οποία ήταν περίπου τα διπλάσια από αυτά που παρουσιάζουν κατά μεσο όρο οι αιμορροφιλικοί σκύλοι σε συνθήκες διαβίωσης σε ερευνητικά κέντρα (5-6/ετος). Παρά ταύτα, η ανταπόκριση στη γονιδιακή θεραπεία τόσο στα ζώα που διαβιούν σε ερευνητικά κέντρα όσο και στα οικόσιτα ήταν παραπλήσια, με μείωση των επεισοδίων αυτών κατά περίπου 90%. Έκτοτε, ο σκύλος παρουσίασε κυστική υπερπλασία του προστάτη με μία παραπροστατική κύστη με αιμορραγικό περιεχόμενο. Η συχνή αυτή ορμονοεξαρτώμενη διαταραχή στο σκύλο αντιμετωπίζεται χειρουργικά με ορχεκτομή. Το χειρουργείο διενεργήθηκε υπο μετάγγιση κατεψυγμένου πλάσματος και μία μέρα μετά παρατηρήθηκε αιμάτωμα στο όσχεο (εικόνες 15, 16). Το αιμάτωμα απορροφήθηκε μετά από περίπου 30 ημέρες. 66

67 Εικόνα 16. Μετεγχειρητικό αιμάτωμα οσχέου. 67

68 Εικόνα 17. Μετεγχειρητικό αιμάτωμα οσχέου Η παρούσα κατάσταση του σκύλου παραμένει σταθερή. Παρουσιάζει χρόνια χωλότητα του οπισθίου δεξιού άκρου λόγω αρθρικών αλλοιώσεων αποτέλεσμα προηγούμενου αιμάρθρου του γόνατος (εικόνα 17). Ο σκύλος διαβιεί μία φυσιολογική ζωή και βρίσκεται στο 9ο έτος της ηλικίας του. Μετά από επικοινωνία με την Καθηγήτρια της Κτηνιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια, Mary Beth Callan, υπέυθυνη του ερευνητικού προγράμματος, πρόκειται να γίνουν επεναληπτικές εξετάσεις για σύγκριση με αυτές μετά τη γονιδιακή θεραπεία. Κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας τα αποτελέσματα δεν ήταν διαθέσιμα. 68

69 Εικόνα 19. Αιμορροφιλικός σκύλος 9 ετών, μειωμένη κινητικότητα δεξιού γόνατος λόγω οστεοαρθρίτιδας. Επίλογος Η επιστημονική έρευνα βασιζόμενη στην παρατήρηση ζώων καταγράφεται σαν μέθοδος εδώ και 2300 χρόνια και παρουσιάζει μία κατακόρυφη επιτάχυνση τις τελευταίες δεκαετίες, ανάλογη της εκρηκτικής εξέλιξης των τεχνολογικών μέσων και της διάδοσης των πληροφοριών. Τα ζωικά μοντέλα δίνουν τη δυνατότητα στους ερευνητές να μελετήσουν τις φυσιολογικές λειτουργίες και την παθοφυσιολογία πίσω από τις διάφορες διαταραχές (της πήξης εν προκειμένω). Γίνεται σαφές ότι η χρήση των ζωικών μοντέλων αποτελεί τη βάση της έρευνας, με τα έως τώρα δεδομένα. και για το σκοπό αυτό αξιοποιούνται ζώα διαφόρων ειδών (μύες, χοίροι, αμνοί, σκύλοι, ιχθείς κ.α.), επιλεγμένα κυρίως με βάση τη βιολογική τους συμπεριφορά και ομολογία ως προς τον άνθρωπο. Επίσης, πρακτικά ζητήματα όπως το μέγεθός τους, η διάρκεια ζωής τους, το κόστος, η επικινδυνότητά τους και αντίστοιχα η διαφύλαξη της ασφάλειας για το προσωπικό που τα χειρίζεται είναι παράμετροι που λαμβάνονται υπ όψιν στην επιλογή. Η βιο-τεχνολογία εξυπηρετεί στην άμεση και στοχευμένη τροποποίηση πολλών οργανισμών προκειμένου να μελετηθούν, σε λεπτομέρεια νουκλεοτιδίου, διαταραχές και θεραπείες. Όπως αναφέρεται παραπάνω 69